PRACTICA N6
PROTEÍNAS TOTALES Y SUS SUFRACCION (ALBUMINA, GLOBULINA)
INTRODUCCION
Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares de estructura compleja
(fig.1), ampliamente distribuidos en el organismo, actúan como elementos
estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas,
anticuerpos, factores de coagulación, etc. Se sintetizan principalmente en el hígado,
además de las células plasmáticas, bazo, médula espinal y ganglios linfáticos. Las
proteínas totales son el resultado de sumar los distintos componentes proteicos
presentes en el organismo tales como Albumina, Alfa 1, alfa 2, beta gamma globulina
tienen un papel significativo en la contribución a mantener la presión osmótica dentro
del espacio vascular conservándola constante y reduciendo al mínimo la efusión del
líquido.
FIG. 6.1 ESTRUCTURA PROTÉICA (FUENTE:
http://1.bp.blogspot.com/_ZY7jvxGDsGI/ShnmdKfZ5QI/AAAAAAAAABE/BUl_vX3IoiY
/s320/mioglobina2.png)
La albumina es la principal proteína plasmática y es sintetizada y secretada por el
hígado, supone alrededor del 50 a 60% de la producción proteica hepática total, tiene
una semivida en plasma de alrededor de 20 días, es la fracción de proteína que
contribuye mayormente a la presión oncótica del plasma es por eso que si se
presenta descenso marcado en la concentración, el resultado será la presencia de
edema también existe una relación directa entre un descenso significativo de la
concentración de albumina en el plasma y una síntesis reducida por el hígado.
Entre otras funciones de la albumina sérica y algunas globulinas se incluye la de ser
parámetros indicadores de la nutrición, también transportan sustancias como Ca ++,
bilirrubina, ácidos grasos, drogas y esteroides. La albúmina tiene carga eléctrica
negativa. La membrana basal del glomérulo renal también está cargada
negativamente, lo que impide la filtración glomerular de la albumina a la orina.
Son tres las causas principales para que se produzca una disminución de la
concentración de albumina en el plasma:
La síntesis disminuida que puede deberse a mal nutrición o mala absorción, es
también un signo de enfermedad hepática crónica avanzada.
Distribución o dilución alterada en este caso la hipoalbuminemia puedes ser
inducida por la hiperhidratación o por una permeabilidad capilar aumentada
como en la septicemia.
Excreción o degradación alterada por síndrome nefrótico, hemorragias,
quemaduras y enteropatías con pérdidas de proteínas.
En estos casos puede ocurrir que la concentración de proteínas totales este
ligeramente disminuida o normal debido a la concentración aumentada de
globulina, estos cambios se pueden detectar si se mide la relación
albumina/globulina (RA/G) por métodos colorimétricos rápidos. La electroforesis de
proteínas séricas puede separar los componentes de las proteínas sanguíneas en
bandas o zonas de acuerdo con su carga eléctrica esta técnica es una de las más
sensibles y específicas. Ambas determinaciones, proteínas totales y fracciones por
métodos colorimétricos y la electroforesis, son útiles a la hora de determinar
estados anormales y enfermedades que pueden afectar a nuestro organismo.
La proporción d e las fracciones proteicas individuales permite identificar un amplio
espectro de enfermedades por que la cuantificación de las mismas sea de valor
considerable en el diagnóstico clínico, las técnicas más utilizadas son:
1. Turbidimetría y nefelometría
2. Inmunodifusión
3. Electroforesis
4. Inmunoelectroforesis
5. Inmunofijación
6. Cromatografía
Mediante la electroforesis y en función de la movilidad electroforética las proteínas
plasmáticas se fraccionan en seis grupos (fig.2) distintos, que en orden decreciente de
movilidad son las siguientes:
Albumina constituye entre el 50 a 60% de las proteínas totales ofrece
información sobre la mal nutrición proteica y disfunción hepática, su concentración
normal es de 3.5 a 5,4 g/dl.
Alfa1 -globulinas: su concentración normal es de 0,1 a 0,31 g/dl.
Alfa 2-globulinas: su concentración normal es de 0,6 a 1.0 g/dl.
Beta-globulinas: Se encuentran en este grupo gran número de proteínas,
enzimas y hormonas. La concentración normal es de 0,7 a 1.1 g/dl y son de
síntesis hepática.
Gamma-globulinas: Esta fracción está constituida por proteínas químicamente
muy homogéneas, aunque electroforéticamente presentan una gran
heterogeneidad. Desde el punto de vista fisiológico están relacionadas con la
función de inmunidad humoral, por lo que se las denomina inmunoglobulinas (Ig).
su concentración normal se encuentra entre 0,5 a 1,4 g/dl.
FIG. 6.2 PATRÓN NORMAL DE PROTEINAS Y SUS FRACCIONES POR
TECNICA DE ELECTROFORESIS (FUENTE: Wikipedia, la enciclopedia libre,
2020)
OBJETO DE ENSEÑANZA
El tema 3 de la asignatura práctica, tiene por objeto de enseñanza: que los
estudiantes realicen la determinación de la concentración de proteínas y sus
fracciones en sangre (suero o plasma) mediante la técnica espectrofotométrica
utilizando métodos colorimétricos tomando en cuenta precisión, exactitud y control de
calidad en los resultados. Efectúe además una correlación clínico patológica
tomando en cuenta estructura, función y métodos de determinación.
1.1 OBJETIVOS
Explicar la importancia de las proteínas y sus fracciones para el
mantenimiento de la homeostasis
Definir el fundamento de los métodos empleados para la determinación
en suero o plasma de proteínas, sus fracciones albumina, globulina y la
relación entre la concentración de albumina y globulina (RA/G ).
Realizar el análisis e interpretación de los resultados obtenidos, así
como la aplicación clínica de la R A/G, efectúe además una correlación
clínico- patológica de los resultados y casos clínicos presentados al final
de la práctica.
2. FUNDAMENTO O PRINCIPIO QUÍMICO
PRIMERA PARTE:
Aunque las mediciones de la concentración de proteínas totales, albumina y la
RA/G en el suero por métodos colorimétricos forman parte rutinaria de los
estudios regulares en los pacientes principalmente para monitorear la
respuesta al soporte nutricional a largo plazo , síndrome nefrótico y
enfermedades hepáticas que disminuyen su síntesis a pesar de ser poco
fiables por su sensibilidad disminuida aunque tengan una aceptable
especificidad diagnostica, continúan siendo utilizados por su sencillez y rápida
ejecución.
2.1. Determinación de Proteínas Totales:
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ion cúprico (Cu+2)
en solución alcalina dando un complejo de color purpureo que se cuantifica
espectrofotométricamente (540-545nm).
REACCIÓN DE BIURET
El SO4Cu reacciona con el enlace peptídico y el grupo amino :
PEPTIDO ROJO
SO4
Cu AMINO AZUL
Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)
El método fue optimizado agregando EDTA a la solución de cobre para producir
reacciones de quelación proporcionando estabilidad a la unión cobre-enlace
peptídico (estructuras proteicas con mínimo tres enlaces pepetidicos)., mejorando de
esta manera la sensibilidad y especificidad de la reacción, la adición de EDTA no
influye en el color.
PROCEDIMIENTO: PROTEÍNAS TOTALES
REACTIVO BLANCO ESTÁNDAR DESCONOCIDO
REACTIVO 1 ml 1ml 1 ml
EDTA-Cu
H2O 20 μL
ESTANDAR 20 μL
SUERO O 20 μL
PLASMA
Llevar a baño maría durante 5 minutos, posteriormente hacer lectura en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 540-545 nm. no se utiliza orina porque
se encuentra en poca cantidad.
3.- METODOLOGIA
3.1.- Determinación de proteínas totales y sus fracciones por la técnica
espectrofotométrica mediante el método colorimétrico optimizado de
Biuret/Cu/EDTA.
3.2.- Equipos y materiales
Espectrofotómetro
Baño María a 37°C
Gradillas
Tubos de boro silicato
Micro pipeta de 1ml, de 10 uL
Puntas de micro pipeta
Papel toalla
Papel absorbente
Agua destilada
Sol. Fisiológica
MUESTRA: Suero
3.3.- Procedimiento utilizando reactivos Comerciales (caja o kit).
Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en
la etiqueta si están los frascos bien cerrados a temperatura ambiente no
mayor a 25 grados °C, protegidos de la luz. No usar reactivos fuera de la fecha
de caducidad.
4.- PROCEDIMIENTO
4.1.- pipetear en tubos de boro silicato:
REACTIVO BLANCO ESTÁNDAR DESCONOCIDO
REACTIVO
1 ml 1ml 1 ml
EDTA-Cu
H2O 20 μL
STANDAR
COMERCIAL (5 20 μL
gr/dL)
SUERO O PLASMA
20μL
Llevar todos los tubos a baño maría durante 5 minutos, a temperatura ambiente por
10 minutos (opcional), posteriormente realizar las lecturas.
4.2.- Mezclar e incubar en baño maría cronometrar por 5 minutos a 37 °C, o dejar a
temperatura ambiente por 10 minutos (opcional), posteriormente realizar las
lecturas
4.3.- Ajustar el espectrofotómetro a cero frente al blanco
4.4.- Leer absorbancia del patrón(estándar) y las muestras frente al blanco de
reactivo a una longitud de onda de 540-545 nm.
