Elaboró: Dra. Aida M.
Zamora Contreras
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
Unidad de Aprendizaje: Ingeniería Molecular
Carrera: Ingeniería Ambiental
Plantel: UPIBI-IPN
Fecha de elaboración: Diciembre 2020
Versión: 1.0
Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
REPLICACIÓN DEL ADN:
-Cada vez que una célula se va a dividir para formar una nueva generación de células, es necesario copiar
todo su genoma para pasarle una copia exacta a la nueva célula. A esto se le llama REPLICACIÓN.
-La replicación dentro de la célula es un proceso muy complejo y usa varias proteínas y enzimas para
llevarlo a cabo.
-Para poder replicar el ADN se requiere de forma general:
-Abrir la doble hélice
-Mantener las dos cadenas abiertas
-Quitar el superenrrollamiento
-Leer la secuencia de la hebra molde
-A partir del molde generar una nueva cadena
-Volver a cerrar la cadena
-De todas estas, la enzima ADN polimerasa (pol) es la que lleva a cabo la lectura de la
secuencia y la generación de la nueva cadena.
RECORDEMOS SOBRE LA REPLICACIÓN Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
DEL ADN:
1. Para iniciar la replicación la 2. La nueva cadena crece al
ADN polimerasa necesita una adicionar las moléculas
cadena corta llamada cebador fundamentales del ADN llamadas
(iniciador o primer) desoxiribonucleótidos trifosfato o
dNTPs (A,T,G,C). La polimerización
se da en sentido 5’-3’.
3. La ADNpol lee el molde
(templado) y adiciona el dNTP
complementario. La lectura de
la cadena molde se realiza en
sentido 3’-5’.
5. Los dos fosfatos restan-
4. Durante la adición del dNTP tes PPi (pirofosfato)
entrante a la cadena, se realiza quedan como “desecho”
un enlace entre el extremo 3’OH de la reacción y un nuevo
y un fosfato (P) del dNTP. dNTP se adiciona.
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
replicación in vitro
-La PCR fue desarrollada en 1986 por Kary Mullis, con el objetivo de realizar millones de copias
in vitro de un fragmento de ADN de interés.
30-40 ciclos, 3 pasos:
-El proceso de obtener millones de copias de una secuencia específica de ADN mediante PCR
se llama AMPLIFICACIÓN.
Paso 1:
Desnaturalización
-El producto amplificado mediante PCR se denomina AMPLICÓN.
-Para realizar una PCR sólo se usa sólo una enzima del total que usa la célula y es una ADN
polimerasa.
-El resto de los pasos necesarios para poder replicar el ADN in vitro se logra con variaciones de
temperatura y tiempo en ciclos repetitivos.
Paso 2:
-La sección que será amplificada se delimita con la ayuda de dos cebadores específicos que Hibridación
flanquean dicha sección.
La ADN polimerasa requiere necesariamente un extremo 3’OH para adicionar nuevos
nucleótidos y polimerizarlos cuando lee la cadena molde; al contrario de una ARN polimerasa ¡¡¡Depende de la
que sólo requiere leer un molde para polimerizar una cadena. secuencia de los
cebadores!!!
-Por lo tanto, los cebadores, además de delimitar la región a amplificar, proporcionan el
extremo 3’OH para iniciar la polimerización (de ahí el nombre cebador, iniciador, “primer”).
Paso 3:
El cebador que dará origen a la cadena que tiene la secuencia de interés se denomina sentido, Extensión
5’ forward (término en inglés).
-El cebador que dará origen a la cadena complementaria se denomina antisentido, 3’, reverso
(reverse/backward en inglés).
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
replicación in vitro Bu
ffe
r dN
M
g2
+
TP
’s
AD
-El equipo en donde la reacción se lleva a cabo se N
po AD Prim
denomina TERMOCICLADOR y es un equipo que l mo N ers
lde
permite controlar con precisión temperaturas y
tiempos.
-En la reacción se requieren de los siguientes
elementos:
-El ADN a copiar (molde o templado)
-La enzima ADN polimerasa
-Un par de cebadores
-dNTP’s (A,T,G,C)
-Buffer específico para que la enzima
funcione óptimamente
-Mg2+ que le da mejor afinidad a la enzima al
ADN
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): replicación in vitro
Si la reacción es satisfactoria, en teoría se pueden obtener billones de copias en un periodo relativamente
corto (algunas horas), dependiendo de la longitud del amplicón y del número de ciclos que se realicen.
Sin embargo, las reacciones no son 100% eficientes.
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TIPOS DE PCR
PCR Punto Final:
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4. Indica si existe o no
amplicón, el tamaño y la
concentración de forma
1. Es la más básica y se lleva a cabo cualitativa. (tiene más o
con los componentes principales y menos que un referente,
en termocicladores comunes. pero no indica
concentraciones exactas.
2. Al terminar la reacción es
necesario cargar una muestra
en un gel de electroforesis.
3. Se debe teñir el amplicón
con un agente que interactúe
con el ADN y que se pueda
excitar con luz UV o luz azul
(dependiendo de su naturaleza
química) para conocer el Se denomina punto final ya que hasta el final de la
resultado . reacción y de la electroforesis se conoce el resultado.
RETROTRANSCRIPCIÓN: Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
Retrotranscripción (o transcripción reversa) acoplada a PCR:
-Se utiliza para amplificar una secuencia que inicialmente era un ARN. La transcripción reversa NO AMPLIFICA al ARN!!!!
-Es una reacción que se utiliza para copiar una secuencia de ARN en ADN. Se debe acoplar a una PCR para AMPLIFICAR la
secuencia retro-transcrita.
-La retrotranscripción no aumenta el número de copias de cDNA, sólo genera cDNA a partir del mismo número de copias
de ARN que se encuentren en la reacción. La amplificación se da con la PCR acoplada.
-Se puede encontrar como RT-PCR que significa RetroTranscripción acoplada a PCR. PERO NO CONFUNDIR CON PCR EN
TIEMPO REAL QUE A VECES TAMBIÉN SE DENOMINA CON UNA RT AL INICIO.
La molécula inicial es un ARN
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5’ 3’ de cadena sencilla.
3’ Es necesario generar una cadena de ADN para que funcione como molde
5’
para una ADN polimerasa, por lo que es necesario usar un cebador. Si se trata
de un ARN mensajero, se sabe que al final contienen una cola de poliA por lo
que un cebador denominado oligo-dT (complementario a la poliA) se puede
3’ 5’ utilizar. Si se conoce una secuencia en específico, se puede usar un cebador
complementario a esa secuencia. Adicionalmente se puede usar un cebador
inespecífico para generar productos sin identificar y después analizarlos.
5’ 3’
La enzima que se encarga de leer una cadena molde de ARN y generar una
5’ cadena complementaria de ADN (cDNA) se llama retro-transcriptasa o
3’
transcriptasa reversa .
3’
5’
El producto es una doble cadena híbrida con el ARN original y el nuevo cDNA.
5’ Este se usará como molde para realizar una amplificación mediante PCR de la
3’ secuencia aislada originalmente como ARN.
3’
5’
En este punto, el ARN ya no es útil y puede ser degradado añadiendo a la
reacción una enzima RNAsaH que degrada ARN de un híbrido ARN-ADN o
dejarla en la mezcla ya que no interfiere con la función de la ADN polimerasa.
3’ 5’
En los siguientes pasos de PCR la elevada temperatura la degradará.
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Un OligodT hibrida con la cola de poliA de los ARNm. El resultado es que
se obtienen cDNAs de un gran número de ARNm.
Un primer específico hibrida contra la secuencia complementaria para
la cual se diseñó. El resultado es que se obtiene un cDNA único y
específico.
Un primer inespecífico hibrida contra una secuencia parcial o
totalmente complementaria desconocida. El resultado es que obtienen
cDNAs de un gran número de fragmentos parciales de muchos ARNm.
https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/microfluidic-pcr-qpcr-rtpcr/
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Las reacciones de retrotranscripción y PCR se pueden acoplar, colocando todos los componentes necesarios desde el
principio y programando el termociclador para que, después de terminar el programa de transcripción reversa, comience la
amplificación.
El buffer debe ser adecuado para que ambas enzimas
funcionen. Normalmente se trata de kits comerciales
diseñados para tal fin.
Se deben incluir ambos cebadores para lograr la amplificación una vez
que comience la PCR. El primer reverso puede servir para generar el
cDNA. Sin embargo, si se usa oligo-dT en la transcripción reversa, es
conveniente realizar las reacciones por separado.
https://geneticeducation.co.in/reverse-transcription-pcr-principle-procedure-applications-advantages-and-disadvantages/
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PCR Tiempo Real o Cuantitativa:
PCR Tiempo Real o Cuantitativa (RT-PCR/ qPCR): Se utiliza para cuantificar de forma indirecta la concentración inicial del ADN
molde. En este caso RT se refiere a PCR tiempo real, no confundir con retro-transcripción. Se le llama también “tiempo real”
porque, el resultado crudo, es decir sin tratamiento matemático o estadístico, se puede conocer en el momento de realizar la
amplificación. Lo anterior debido a que el termociclador para tiempo real está acomplado a una computadora y un monitor que
permite visualizar el progreso de la corrida y la creación y acumulación de amplicones. ES MÁS COMÚN ENCONTRARLA COMO
qPCR.
Además de los componentes
básicos, se requiere un agente
fluorescente como SYBR-Green o
sondas Taqman.
Cuando se está llevando a cabo la
elongación, el componente
adicional fluoresce al ser excitado
por un láser y es detectado en
tiempo real.
https://www.gene-quantification.de/chemistry.html
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Se requiere un termociclador especializado ya que debe tener un láser que excite al agente fluorescente y
un detector de la señal de fluorescencia.
https://goaleasysite.weebly.com/blog/downl https://americanlaboratorytrading.com/lab-equipment-products
oad-rotor-gene-6000-software-engineering /qiagen-rotor-gene-q-mdx_10268
En este diseño, los microtubos que contienen las reacciones se colocan en un carrusel que rota y la fuente de emisión
de luz se encuentra fija.
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Se requiere un termociclador especializado ya que debe tener un láser que excite al agente fluorescente y
un detector de la señal de fluorescencia.
https://www.the-scientist.com/uncategorized/how-it-works-real-time-pcr-46975 https://bio-equip.cn/eWebEditor/UploadFile/97636.jpg https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4376
600#/4376600
En este diseño, los microtubos que contienen las reacciones se colocan en una placa fija y la fuente de emisión de luz se
ajusta a una posición adecuada para incidir sobre los tubos o pocillos que contienen las reacciones en la placa.
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SYBR Green
-El compuesto intercalante como el SYBR Green se
intercala en estructuras de doble cadena, por lo que
cuando el cebador se hibrida a su secuencia blanco
y se elonga la cadena, el SYBR Green interactúa con
el ADN. En ese momento la fuente láser incide en
la muestra, excitando al SYBR Green.
-La ventaja de usar este compuesto es que hace
más barata la reacción ya que se puede usar con
cualquier secuencia de molde y cebadores y con
cualquier protocolo de amplificación.
-La desventaja es que, al ser inespecífico en cuanto
a la secuencia, si el diseño de cebadores no es
adecuado y se amplifican productos no deseados,
de cualquier forma, habrá señal de obtención de
productos.
https://www.gene-quantification.de/chemistry.html
Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
Sonda Taqman
-La sonda taqman es un oligo de desoxiribonucleotidos de cadena
sencilla que tiene en un extremo un fluoróforo y en el otro un
“secuestrador” o quencher.
-Cuando se encuentran unidos a través del oligo, el fluoróforo no
puede emitir señal.
-Para amplificar usando sondas taqman, ésta se adiciona además de
los dos cebadores que flanquean la secuencia a amplificar e hibrida
en algún punto entre ambos cebadores.
-En la reacción se usa una ADN polimerasa con función 5’
exonucleasa, lo que comienza a degradar la sonda desde su extremo
5’. Esto libera al fluoróforo del quencher y cuando se incide un láser,
se emite fluorescencia.
-La ventaja de usar una sonda taqman, es que hace muy específica la
detección de la secuencia en cuestión.
-La desventaja es que sólo se puede usar para identificar una sola
secuencia con un solo protocolo de amplificación por lo que eleva el
costo de usar dicha tecnología en el laboratorio que la aplica.
https://nl.sawakinome.com/articles/science/difference-between-pcr-and-qpcr.html
Elaboró: Dra. Aida M. Zamora Contreras
-El termociclador para tiempo real está conectado a una computadora que va procesando los datos de emisión de luz fluorescente en cada
ciclo.
-El resultado es que en tiempo real se puede observar la construcción de un gráfico que muestra el crecimiento de unidades de fluorescencia
en cada ciclo.
-Puesto que el agente fluorescente (SYBR Green o sonda Taqman) fluorescen cuando interactúan con doble cadena, el aumento en la señal de
fluorescencia es un indicativo directamente proporcional del aumento de la concentración de dobles cadenas de ADN (amplicones).
El resultado son una serie de gráficos exponenciales que aumentan conforme aumenta la fluorescencia a través de los ciclos, como se
muestra en la animación.
-La PCR tiempo real también se conoce como PCR cuantitativa ya que, se
puede cuantificar la concentración inicial del molde con ella. Si el molde se
encuentra más concentrado, habrá más dobles cadenas interactuando con
SYBR Green o sondas taqman, por lo que la señal aparecerá en ciclos
tempranos. Las muestras menos concentradas empezarán a tener señal en
ciclos más tardíos.
-Es muy utilizada para analizar la expresión de genes, obteniendo el ARNm,
retro-transcribiéndolo y después amplificándolo en un equipo de PCR tiempo
real.
-El resultado se puede comparar contra la expresión de un gen que se conozca
que se expresa mucho como los ARN ribosomales y entonces la cuantificación
se llama “relativa”. También se puede hacer una cuantificación absoluta
Click para cuando se compara el resultado contra una curva tipo de concentraciones
ver el video
conocidas.
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-Cuando se utiliza SYBR Green y una vez que ha terminado la corrida, es recomendable verificar si en cada tubo de reacción se produjeron productos inespecíficos realizando un “melting”.
-El equipo aumenta gradualmente la temperatura desde la Tm hasta la temperatura de desnaturalización mientras se incide el láser sobre las muestras.
-Puesto que, a la Tm la mayoría de las cadenas se encuentran cerradas, el SYBR Green estará interactuando con dobles cadenas por lo que se emitirá una señal fluorescente.
-Conforme aumenta la temperatura, las dobles cadenas comenzarán a desnaturalizarse y la interacción con SYBR Green será menos estable por lo que se irá perdiendo señal de
fluorescencia. Hasta que se alcanza la temperatura de desnaturalización total y por lo tanto de pérdida de señal fluorescente.
-Esto se puede verificar en tiempo real como se observa en la primera animación.
-Posteriormente, el equipo realiza un tratamiento matemático a las curvas del “melting” y se transforman obteniendo picos. Si en cada muestra se obtuvo sólo un amplicón, se observará
un solo pico por cada curva. Asi mismo, si en todas las muestras se obtuvo el mismo amplicón , se observará el mismo pico sobre la misma temperatura en todas las muestras. Esto
representa que se trata de la misma secuencia porque se desnaturalizó al mismo tiempo, a la misma temperatura. Si se tratara de un producto (secuencia) diferente, su temperatura de
desnaturalización sería distinta debido al contenido de GC’s.
Click para
ver el video https://www.genengnews.com/magazine/high-performance-melting-curve-analysis/
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-Si el amplicón es único en cada muestra, y el mismo en
todas las muestras que se amplificaron, entonces sólo se
obtendrá un único pico a la misma temperatura.
-Si se cargara un poco de cada reacción en un gel de
electroforesis, se podría constatar que sólo se cuenta
con un producto en cada muestra y el mismo en todas
las analizadas en una misma corrida.
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-Si el amplicón no es único y no es el mismo en todas las
muestras, entonces se obtendrán varios picos a distintas
temperaturas.
-Si se cargara un poco de cada reacción en un gel de
electroforesis, se podrían observar distintas bandas de
diferentes tamaños con patrones diferentes en todas las
muestras.
-Aquí se demuestra que la primera gráfica sólo es
indicativa de la obtención de amplicones pero no de su
identidad, por lo que es necesario realizar un “melting”
cuando se usa SYBR Green.
