MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA: NUTRICIÓN Y DIETETICA
PRACTICA N°2
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS: TINCIÓN DE GRAM
I. OBJETIVO
Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram la existencia de dos grupos
principales de bacterias.
II. FUNDAMENTO
Christian Gram, científico Danés descubrió en 1884, una tinción que permitía diferenciar dos
grandes grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas. La tinción de Gram es
considerada, todavía hoy, una técnica muy utilizada para la identificación bacteriana. El
resultado de la tinción Gram se corresponde con diferencias en la composición química y
ultraestructuras de las paredes celulares de las eubacterias. Las bacterias Gram positivas poseen
una membrana plasmática y gran cantidad de peptidoglucano en su exterior y las Gram
negativas poseen membrana plasmática en menor cantidad de peptidoglucano y una membrana
externa rodeándola.
Una tinción diferencial típicamente consiste en tres pasos principales: primero un colorante
primario, el cual se utiliza para teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de
decoloración, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un
colorante de contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas, pero no tiene efecto sobre las
células que aún retienen el colorante primario.
La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en
las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de
peptidoglucano, las cuales, a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico
reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las
moléculas cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de
las células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram
positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la célula
Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol también disuelve mucho de
la capa exterior de lipopolosacárido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera
la remoción del colorante primario cristal violeta de estas células.
Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram positivas siguen de
color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al
final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán del color del cristal violeta,
o colorante primario, y las células Gram negativas serán del color de la safranina que es el
colorante de contraste.
III. EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS E INSUMOS
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EQUIPOS MATERIALES REACTIVOS INSUMOS
Microscopio Laminas porta y Aceite de inmersión Cultivos jóvenes de: Bacillus
cubre objetos sp.
Staphylococcus sp.
Escherichia coli
Bacillus subtilis.
Salmonella sp.
Soporte para tinción Asa/aguja de kolle Kit de Col. Gram:
en aro Cristal violeta
Mechero Bunsen Safranina
Lugol
Alcohol acetona
IV. PROCEDIMIENTO
Fijación de muestras
1. Coloque una gota pequeña de suero fisiológico sobre una lámina porta objeto completamente
limpia. Con ayuda del asa de Kölle coloque sobre la gota una pequeña porción de la muestra
a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es líquida, puede aplicarse directamente
sin la gota de suero fisiológico.
2. Distribuya la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película delgada.
3. Seque la lámina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.
4. Cuando la película esté seca, pase la lámina a través de la llama del mechero unas tres veces,
cuidando que la película esté hacia arriba y que la lámina no se recaliente. La sobreexposición
al calor puede alterar la forma y estructura del microorganismo.
Tinción de Gram
1. Prepare una lámina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados.
2. Coloque cada preparación a teñir sobre el soporte para tinción.
3. Agregue cristal violeta y deje que actúe por 1 minuto.
4. Enjuague con agua
5. Cubra la película teñida con lugol y deje que actúe por 1 minuto.
6. Enjuague con agua.
7. Decolore con alcohol-acetona. Para una película delgada, la exposición al decolorante por 10-
20 segundos es suficiente.
8. Enjuague con agua.
9. Aplique el colorante de contraste safranina por 30 segundos.
10. Enjuague con agua y seque la lámina al aire o dentro de papel toalla sin frotar.
11. Aplicar una gota de aceite de inmersión a la muestra coloreada.
12. Examine cada muestra bajo el objetivo de inmersión.
13. Elabore los esquemas correspondientes.
V. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué razón, la pared de una bacteria Gram positiva retiene el colorante primario?
¿qué papel cumple el lugol en la tinción de Gram?
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2. ¿Cuáles son las estructuras celulares o moleculares responsables de las tinciones realizadas
en la práctica? ¿De ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse?
3. Mencione cuales son las precauciones que se debe de tener a la hora de realizar una
coloración
4. Mencione otros tipos de coloraciones utilizadas para observar estructuras celulares como
cápsula, flagelos, esporas, etc.
5. Mencione bacterias que no es útil la coloración gram y explique ¿Por qué?
VI. BIBLIOGRAFIA
• LOCQUIN, M; LANGERON, M. Manual de microscopia. Editorial Labor SA Barcelona 1985.
• ARRAIZA, N.; VIGURIA, P M.; NAVARRO, J.; AINCIBURU, A. Manual de microscopia. AUXILAB
SL. España. 2019
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NOMBRE DEL ALUMNO: ……………………………………………………………………..
GRAFICOS DE LA PRACTICA 02:
Coloración gram
Gram positivos: Gram negativos:
Observaciones:………………………………………………………………………………………………………
Coloración gram
Gram positivos: Gram negativos:
Observaciones:………………………………………………………………………………………………………………
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