UNIVERSIDAD DE NARIÑO FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y
NATURALES
PROGRAMA DE BIOLOGÍA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA No 3. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN EL SUERO
SANGUÍNEO
DOCENTE: Juan Carlos Zambrano Arteaga
AUTORES: Xiomara Stefania Escobar Bastidas 221095065
Lisbeth Damarys Landeta Villarreal 221095061
Cielo Alejandra Hurtado Carreño 221095018
Juan Pablo España Alvarado 221095030
INTRODUCCIÓN
La detección, cuantificación y análisis de proteínas son cruciales para investigar gran
variedad de procesos biológicos. La cuantificación de proteínas es la medición de la
concentración de proteína total en una muestra, estas se pueden cuantificar directamente
mediante absorbancia a 280 nm, indirectamente mediante métodos colorimétricos (BCA,
Bradford, etc.) o fluorimétricos que ofrecen ventajas como una mayor sensibilidad.
Para identificar y medir una proteína específica dentro de una muestra compleja, por
ejemplo, suero o lisado celular, puede utilizarse un ensayo de inmunoadsorción ligado a
enzima (ELISA).
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de
estos métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para
absorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos, o la
capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes
Análisis de proteínas totales: Mide el conjunto de las distintas proteínas presentes en la
sangre, suelen dividirse en albúmina y globulinas:
● Albúmina: proteína principal de la sangre, representa aproximadamente el 60 % del
total de proteínas. Se fabrica principalmente en el hígado. Ayuda al mantenimiento
de la sangre dentro de los vasos sanguíneos evitando filtraciones hacia los
tejidos,entre otros. se cuantifica para comprobar el funcionamiento del hígado y de
los riñones, valorar el contenido proteico de la dieta, ayudar a diagnosticar la causa
de hinchazón en tobillos (edema) o abdomen (ascitis), o de la presencia de líquido
en los pulmones (edema pulmonar).
● Globulinas: formadas por cientos de diferentes proteínas, representan el 40 % del
total. Algunas son fabricadas por el hígado y otras sintetizadas por el sistema
inmune. Se cuantifican para valorar la posibilidad de desarrollar una infección,
diagnosticar determinadas enfermedades de la sangre como el mieloma múltiple o la
macroglobulinemia.
Medición de absorbancia de las soluciones de proteína: Análisis de cuantificación de
proteínas relativamente sencillo. Los aminoácidos con cadenas laterales aromáticas
proporcionan a las proteínas su absorbancia UV distintiva a 280 nm. Dado que estos
aminoácidos absorben la luz UV a 280 nm, puede obtenerse la absorbancia a esta longitud
de onda concreta a través de un espectrofotómetro y utilizarse para estimar las
concentraciones proteicas de las muestras. Este análisis se utiliza con frecuencia en los
laboratorios y el método Warburg-Christian suele realizarse para la estimación de la
concentración de proteínas. Sin embargo, la utilización de la absorbancia UV para
determinar la concentración de proteínas puede tener una gran variabilidad porque los
componentes no proteicos de la muestra pueden interferir en las mediciones de
absorbancia. Además, las mezclas con diferentes proteínas en una muestra pueden
provocar diversas lecturas de absorbancia debido a la diferencia en la composición de
aminoácidos.
Curva de calibración Curva de referencia construida con cantidades conocidas de una
sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas) presente
en una muestra incógnita. En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional
entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la
provoca.
OBJETIVOS
● Separar las globulinas presentes en el suero sanguíneo humano mediante
precipitación con solución salina.
● Determinar la concentración de proteínas totales, de globulinas y de albúmina
en el suero sanguíneo mediante fotocolorimetría.
METODOLOGÍA
Se realizaron cuatro procesos complementarios para la cuantificación de proteínas
en el suero sanguíneo.
Primero se realizó la separación de las globulinas del suero, vertiendo en un tubo de
centrífuga 1 ml de suero sanguíneo y 4 ml de agua destilada luego se agregó
lentamente con un gotero un solución saturada de (NH4)2SO4 de concentración
750 gr/L y seguido se agito por inmersión. Se dejó reposar la solución de proteínas
durante 5 minutos y se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos. finalmente se
desechó el líquido sobrenadante sin perder el precipitado y se rotuló el tubo como
“solución de globulinas”.
El segundo proceso fue la preparación de la solución de proteínas totales donde en
una probeta vacía de 25 ml se vertió 1 ml de suero sanguíneo y se agregó (NaCl al
0.85%) hasta completar 20 ml. Posteriormente se rotuló la probeta como “solución
de suero”.
El tercer proceso que se realizó fue la medición de la absorbancia de las soluciones
de proteínas; en este, en 4 tubos de ensayo rotulados como en la tabla y agregado
lo que allí se indicó, se agitó y dejó reposar cada tubo durante 20 minutos y luego en
el fotocolorímetro se seleccionó una longitud de onda y se llenó la celda con la
solución blanco (tubo No 1) con la cual se ajustó el equipo en absorbancia cero.
Posteriormente se midió las absorbancias para los tubos 2, 3 y 4, lavando la celda
entre cada medición con agua destilada y finalmente se registró las absorbancias en
la tabla
por último se realizó la curva de calibración de albúmina; para esto, se marcó 7
tubos de ensayo como lo indicaba la tabla y se adiciono a cada uno de ellos las
soluciones dadas en ella. Después se adiciono reactivo de Biuret, se mezcló por
inmersión y se dejó en reposo durante 20 minutos; seguido se seleccionó en el
fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia (540 nm) y se ajustó a
cero con el blanco. Finalmente se midió la absorbancia a las soluciones de los tubos
del 1 al 6 y se anotó cuidadosamente en la tabla.
RESULTADOS
Tabla 1.1 Medición de absorbancia de las soluciones de proteína
Tubo Rótulo Solución Solución Solución Solución Solución Abs
de
No. de NaCl patrón de de suero de Biuret
globulinas
0.85% Albúmina
1 Blanco 1.0 ml 4.0 ml 0
2 Patrón 1.0 ml 4.0 ml 0.140
3 Globulinas 1.0 ml 4.0 ml 0.238
4 Prot.Total. 1.0 ml 4.0 ml 0.283
5 4.0 ml 0.997
Ovoalbúmina
Tabla 1.2 preparación de la curva de titulación de la albúmina
Tubo Solución patrón Solución NaCl Solución de Concentració Abs
albúmina 0.85 % Biuret n
Blanco 2.0 mL 4 mL 0.000% 0.000
1 0.3 mL 1.7 mL 4 mL 0.022% 0.083
2 0.5 mL 1.5 mL 4 mL 0.037% 0.120
3 0.7 mL 1.3 mL 4 mL 0.052% 0.196
4 1.0 mL 1.0 mL 4 mL 0.075% 0.274
5 1.2 mL 0.8 mL 4 mL 0.090% 0.285
6 1.5 mL 0.5 mL 4 mL 0.112% 0.373
Ecuación: y = 0.0626x + 0.062
DISCUSIÓN
SEPARACIÓN DE LAS GLOBULINAS DEL SUERO.
Para la separación de las globulinas de las proteínas que se encuentran presentes
en el suero sanguíneo fue necesario agregar a la solución de proteínas 5 ml de
sulfato de amonio, con la finalidad de reducir la solubilidad de las globulinas para
que se precipiten, este efecto es causado por que los iones salinos desplazan una
gran cantidad de moléculas de agua para su hidratación provocando así la
desolvatación de las proteínas y de esta manera, acelerar el proceso de
sedimentación y obtener una mejor separación de las proteínas del suero llevamos
la solución a una centrífuga para lograr asentar el precipitado de globulinas,
posteriormente botamos el sobrenadante obteniendo así, solo las globulinas.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES.
Se diluyó una muestra de 1ml de suero hasta 20 ml con solución salina de NaCl y
posteriormente se uso para medir su absorbancia, los iones Na+ y Cl- causan un
incremento en la solubilidad de las proteínas ya que la concentración de iones
salinos disminuye la atracción entre las cargas opuestas de las proteínas logrando
un efecto de apantallamiento causados por estos iones en solución.
MEDICION DE ABSORBANCIA DE LAS SOLUCIONES DE PROTEINA
La medición de la absorbancia para proteínas se hizo a 540nm, realizando la
medición de la absorbancia con cada una de las muestras de las soluciones patrón
de albúmina, solución de globulinas, solución de suero, y una solución blanco de
NaCl.
PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBÚMINA.
A 7 tubos de diferentes concentraciones de solución de albúmina se los sometió al
testeo con el fotocolorímetro para obtener su absorbancia y con esto realizar
cálculos de concentraciones desconocidas con la fórmula o ley de Lambert-Beer.
CUESTIONARIO
1. Consulte cuál es la función del sulfato de amonio concentrado (750g/L) en
el proceso de cuantificación de globulinas (Salting out). Explique por qué
esta solución solo precipita las globulinas?
El sulfato de amonio concentrado precipita de manera fraccionaria las globulinas
que no son solubles en agua esto con el fin de diferenciarlas de los glóbulos
rojos. esta técnica se utiliza mucho para la purificación y fraccionamiento de
proteínas. El sulfato de amonio es una sal que logra que la proteína comience a
ceder intercambios iónicos con los SO4 2- y NH4+, sustituyendo así los sitios de
intercambio que compartía con el agua, con esto se causa una disminución de su
solubilidad y esta precipita debido a las altas fuerzas iónicas causadas por el
sulfato de amonio. Ahora las únicas proteínas que se precipitan son las globulinas
que no son solubles en agua, ya que al estar en soluciones sobresaturadas de
sulfato de amonio el agua debe competir entre la disolución de esta sal o de la
proteína (formada por muchos grupos carboxilo y amonio), causando que precipite
la proteína como se puede apreciar en la imagen.
2. Consulte la función del cloruro de sodio de bajas concentraciones (<1%)
en el procedimiento de separación de proteína total y globulinas (Salting in).
Las sales neutras como el cloruro de sodio, tienen una influencia marcada en la
solubilidad de las proteínas, especialmente en las proteínas globulares. Tiene un
gran efecto para modificar la solubilidad de la proteína dependiendo de la
concentración y de su fuerza iónica, pues las sales modifican la estructura del agua
e influyen también en la conformación de las proteínas mediante interacciones
electrostáticas. Esto hace que, en función de la fuerza iónica, las sales logren
solubilizar o precipitar a las proteínas.
Tambien se dice que las sales de iones monovalentes como el NaCl, mencionado
anteriormente no son tan eficientes para la precipitación de proteínas debido a que
no causan una alta ionización, sin embargo, el cloruro de sodio alcanza a lograr que
la proteína presente una mayor solubilidad en el solvente debido a la interacción de
los grupos cargados de la proteína que se relacionan a su vez con los iones de la
sal incrementando la densidad de carga con una mayor repulsión intermolecular.
3. Determine la concentración final de proteínas en %p/v de la solución
patrón (Cpatrón.), teniendo en cuenta la dilución hecha a un volumen final
(V2) a 5 ml. Utilice la ecuación c1v1=c2v2.
C1= 0.45% V2= 5ml C2= C1V1/V2
V1= 1.0ml C2=? C2= 0.45% x 1.0 ml / 5ml = 0.09%
4. Determine la concentración en %p/v de globulinas (C globul) y de proteínas
totales (Cprot) que fueron medidas en el colorímetro empleando la siguiente
ecuación.
x= y-0.0623/0.0626
Globulinas Proteínas totales
x=0.238-0.0623/0.0626 = 2.81% x=0.283-0.0623/0,0626 = 3.5%
5. Con los datos obtenidos en el punto anterior de C globul y Cprot, calcule las
concentraciones originales (Ci ) de globulinas y proteínas totales en %(p/v)
de la muestra de suero sanguíneo empleando las siguientes ecuaciones.
2.81 x 5 x 5 = 70.25
3.5 x 20 x 5 = 350
6. Determine la concentración (Ci) de albúmina en %p/v de la muestra de suero,
como la diferencia entre Ci de proteínas totales y Ci de globulinas.
(Ci) Albúmina = 350 - 70.25
(Ci) Albúmina = 279.75
7. Registre en la siguiente tabla los datos de las concentraciones de proteína total,
globulinas y albúmina y realice con estos datos la conversión de %(p/v) a: g/dL,
mg/ml, g/L y g/ml. Igualmente registra los valores normales fisiológicos de estas
proteínas en el suero sanguíneo.
Concentración proteínas del suero
sanguíneo
Proteína Globulinas Albúmina
total
Concentraciones obtenidas (%p/v) 350 70.25 279.75
g/dl 3500 7025 27975
mg/ml 350000 70250 279750
g/L 350000 70250 279750
g/ml 350 70.25 279.75
Concentración fisiológica normal de 6 a 8 g/dl de 2,3 a 3,4 de 3,2 a 4,5
(%p/v) g/dl g/dl
8. Compare los porcentajes hallados para proteínas totales, albúmina y globulinas
determinados con las reportadas como normales para el suero. Si los datos que
usted obtuvo no están dentro del rango normal, de una explicación lógica de los
resultados.
Al comparar los resultados nos damos cuenta que no se encuentran dentro del
rango normal de concentración, lo que pudo haber pasado en la
experimentación es que no se agregó las cantidades adecuadas de las
diferentes muestras y reactivos o existió error al momento de anotar la
absorbancia reportada por el colorímetro.
9. Determine la concentración de proteína de la solución patrón en cada uno de los
tubos 1 al 6, de la tabla del punto 4.1 aplicando la fórmula de dilución c 1v1=c2v2.
Para esto tenga en cuenta que la c1 es la concentración de la solución patrón que
suministró el laboratorista, v1 es el volumen que se tomó de la solución patrón y v 2
es el volumen total de cada tubo (6ml) después de adicionar la solución de Biuret y
el NaCl 1%.
C1 V1=C2V2 C2= C1V1/V2
Tubo 1 Tubo 2
C2= 0.45% x 0.3ml/ 6mL C2= 0.45% x 0.5ml/ 6mL
C2= 0.0225 C2= 0.0375
Tubo 3 Tubo 4
C2= 0.45% x 0.7ml/ 6mL C2= 0.45% x 1ml/ 6mL
C2= 0.0525 C2= 0.075
Tubo 5 Tubo 6
C2= 0.45% x 1.2ml/ 6mL C2= 0.45% x 1.5/ 6mL
C2= 0.09 C2= 0.1125
CONCLUSIONES
● Los objetivos propuestos en las práctica se cumplieron en su totalidad y de
manera satisfactoria, dominando así los principios básicos de fotocolorimetría
y la realización de espectros de absorción y curvas de calibración, asimismo
como separación de globulinas y la cuantificación de proteínas en el suero
sanguíneo humano por medio de la fotocolorimetría
● Para la realización de una curva de calibración, los datos con los cuales se va
a graficar deben estar muy bien medidos, pues si un dato no es correcto
cambiaría por completo la relación de todos los otros datos provocando
errores al utilizar la fórmula que da la curva de calibración (ecuación de la
recta)
● El espectro de absorción debe de hacerse en forma de barrido, en este caso
en los intervalos de espectro visible para encontrar la longitud de onda
óptima, esto debido a que cada muestra tiene una longitud característica y
puede variar a lo largo del espectro, y con este dato poder realizar los
trabajos de manera óptima sin necesidad de mucha concentración de la
proteína.
BIBLIOGRAFÍA
1. Detección, cuantificación y análisis de proteínas.
2. Análisis de proteínas totales en sangre ¿para qué sirve? [Internet].
Redacción Médica. [citado el 14 de julio de 2022]. Disponible en:
https://www.redaccionmedica.com/recursos-salud/diccionario-
enfermedades/proteinas-totales-en-sangre
3. No title [Internet]. Sigmaaldrich.com. [citado el 14 de julio de 2022].
Disponible en:
https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/applications/protein-biology/prot
ein-quantitation
4. Cap�tulo 3 [Internet]. Uba.ar. [citado el 14 de julio de 2022].
Disponible en:
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibraci
on.htm
