Curvas de crecimiento bacteriano

Autores: Barrera, Ursula Karina.

Roca, Martina.
Volpini, Sofia.

Comisión: CUDI Turno Mañana.

Fecha: 27 de octubre de 2023.

Profesora a cargo: María de la Paz Paglilla

INTRODUCCIÓN

El crecimiento bacteriano es la multiplicación e incremento del número de células

mediante fisión binaria, donde todos los componentes estructurales de la célula se
duplican. El aumento del número de células en relación al tiempo se llama velocidad de
crecimiento; esta velocidad es específica de cada microorganismo. En el caso de la
Escherichia Coli, el tiempo de duplicación de las células es de 40 minutos. Este incremento
se puede ver representado en un gráfico llamado “Curva de crecimiento”, el cual se divide
en cuatro etapas o fases:
-Fase de latencia:donde las bacterias se acostumbran al medio.
-Fase exponencial: duplicación veloz de la cantidad de microorganismos.
-Fase estacionaria: etapa donde el número de bacterias se mantiene constante.
No aumenta ni disminuye la cantidad de bacterias.
-Fase de muerte: la cantidad de bacterias o microorganismos comienzan a
disminuir.

Para realizar este gráfico debemos hacer un recuento de bacterias.Esto se puede llevar
a cabo mediante la observación macro o microscópica, entre otros métodos. Es importante
tener varios métodos de recuento porque no todos los microorganismos se pueden observar
con un microscopio, solamente los microorganismos visibles o los que se distinguen
mediante tinciones, tampoco se distinguen las células vivas de las muertas. Aquellos que no
se pueden observar mediante microscopía, se observan por recuento en placas y hay varios
métodos: extensión en placas o siembra vertida en placas.

Este trabajo tiene como objetivo el entrenamiento del manejo de cultivos, medios de
cultivo y el sembrado de Escherichia Coli en diferentes condiciones para poder evaluar el
crecimiento de la bacteria bajo diversos factores y así determinar cuál será el más propicio y
cuál afectará su crecimiento de manera negativa.
MATERIALES Y MÉTODOS

El dia que se realizó el trabajo práctico en el laboratorio se organizó un recuento

teórico sobre la cantidad de diluciones que se tenían que hacer, la cantidad de muestras
que se debía tomar para los diferentes tiempos (45´, 90´ y 135´); Se prepararon las
gradillas: con los tubos eppendorf, y una segunda gradilla de tubos cónicos de plástico con
tapa a rosca, una pipeta y su micropipeta para medir la cantidad de caldo (medio de
cultivo) a utilizar, que fue preparada con anterioridad. Se prepararon también dos
micropipetas electrónicas de 20 a 200 microlitros y una de 100 a 1000 microlitros, cada una
con sus respectivos tips para luego poder tomar las muestras y hacer las diluciones
correspondientes y hacer los sembrados necesarios de cada dilución. Se utilizaron 11
placas de petri con medio de cultivo agar EMB para sembrar las diluciones.
Se realizó el rotulado de todo el material de trabajo en 2 condiciones de crecimiento.
La premisa original eran 3 condiciones de crecimiento pero la falta de volumen para llenar
los 66 tubos eppendorf y la escasez de fluido necesario para las muestra en los 9 tubos
cónicos se toma la decisión en conjunto de realizar solo 2 condiciones: a 37°C Sin
agitación y Temp. Ambiente con agitación.
Posteriormente se prepararon todos los materiales, se acondicionó el flujo laminar
vertical(marca Biobase BBS); Se realizó la limpieza de la mesada de trabajo del flujo
laminar con alcohol al 70%, para luego colocar todos los materiales a utilizar dentro del
flujo. Se encendió por 20 minutos para permitir que por medio de la radiación UV se
esterilice todo el material a utilizar menos la muestra que permanece en la estufa hasta el
momento de hacer las diluciones. Se tuvo en cuenta que al momento de iniciar la
esterilización se abrieran las placas de petri para eliminar el vapor.
Luego de 20 minutos de esterilización con UV, se encendió la ventilación y abrió la
ventana del flujo laminar tomando los recaudos de seguridad necesarios para no
contaminar las muestras y con las medidas de bioseguridad para las alumnas (Uso de
Guantes, protección facial a través del vidrio del flujo laminar).
Se procedió a colocar 6 ml en cada uno de los tubos cónicos, para luego realizar la
medición de OD en el espectrofotómetro de UV vis. Se necesitan 3 ml para realizar dicha
medición por cada medición y tiempo empleado. Se llevó a la estufa los 3 tubos, el 1° se
retira a los 45 minutos para realizar las diluciones y sembrados, los otros 2 se mantienen
en la condición hasta cumplir con los tiempos estipulados (90 y 135 minutos).
Al cabo de 45 minutos se retiró de la estufa el tubo cónico N°1 para comenzar con las
diluciones. Se colocó 250 ul de caldo en cada uno de los 11 tubos eppendorf, luego con
una micropipeta se toma 25ul de la muestra original para diluir 1/10 en el 1° tubo
Eppendorf; con el mismo tip mezclar varias veces para homogeneizar la dilución. Se repitió
la operación con los 11 tubos eppendorf. Una vez que se terminó la dilución n°11, se inició
la siembra con el mismo tip. Se colocó una alícuota de la dilución N°11 en la placa de petri
y se realizó la 1° siembra, con la lanza previamente esterilizada al rojo vivo se toma la
alícuota y se barrió por el agar agar en forma aleatoria y con movimientos zigzagueantes.
Se repitió el procedimiento de sembrado en las 7 placas anteriores.
Una vez realizadas las 5 siembras de la misma condición ( 37°C sin agitación), con el
resto de la muestra que hay en los tubos cónicos se procede a medir el OD en el
espectrofotómetro de UV-Vis a 600 nm. Se tomó el tubo n°1 rotulado para leer a los 45´ y
se midió el OD. Se repitió el procedimiento con los tubos a los 90´y a los 135´.
Luego de 48hs de sembrado en estufa para la condición a 37°, se procedió a colocar
las placas de Petri en heladera y así detener el crecimiento bacteriano excesivo. Luego de
24hs más se realizó el recuento de unidades formadoras de colonia de cada placa de
forma manual.
 RESULTADOS

Tabla 1: OD de Condición 1 y 2.

DENSIDAD ÓPTICA
ABSORBANCIA
TIEMPO Tiempo [min] T 37°C S/A T.Amb C/A
t0 0 0, 000 0, 000
t1 45 0, 203 0, 132
t2 90 0, 300 0, 164
t3 135 0, 360 0, 297

Según se puede observar, el coeficiente de regresión lineal (R2) que más se ajusta a la
recta es el de la condición de Temperatura Ambiente con agitación. Ambas muestras se
encuentran en fase exponencial, ya que crece la gráfica.

Tabla 2: Recuento de Unidades Formadoras de Colonias en placas de Petri. Condición 1 y

2. Placas con la muestra a 45 minutos.

UFC
PLACAS CONDICIONES
37°C S/A T. Amb C/A
10∧-7 177 300
10∧-8 170 300
10∧-9 84 108
10∧-10 32 48
10∧-11 114 2

Se puede observar una relación más lineal en la condición de Temperatura Ambiente con
agitación.
 Imagen 1: Colonias en placa de Petri, Imagen 2: Colonias en placa de Petri,
condición 37°C, dilución 10-7 condición 37°C, dilución 10-8

177 UFC 170 UFC

Imagen 3: Colonias en placa de Imagen 4: Colonias en placa de Imagen 5: Colonias en placa de

Petri, condición 37°C, dilución 10-9 Petri, condición 37°C, dilución 10-10 Petri, condición 37°C, dilución 10-11

84 UFC 32 UFC 114 UFC

Imágenes 1 a 5: Colonias de E.Coli en plaqueo.

Según lo observado, las colonias tienen forma circular, con una elevación convexa y un
margen entero. Esto se repite en todas las placas. Las colonias tienen color verde
iridiscente ya que las bacterias de E.Coli son capaces de degradar la enzima operón lac y
el medio agar EMB contiene lactosa en su composición.

Calculos: UFC/ml
DISCUSIÓN

En un principio se había estipulado trabajar con cuatro condiciones distintas:

-37°C con agitación
-37°C sin agitación
-Temperatura ambiente con agitación.
-Temperatura ambiente sin agitación.
A la hora de realizar la práctica solo se pudo llevar a cabo el procedimiento con dos
condiciones: “37°C sin agitación” y “Temperatura ambiente con agitación", debido que
el caldo no era suficiente para la realización de todas las condiciones. Tampoco se pudo
hacer la siembra del cultivo por duplicado y triplicado ya que no contábamos con todo el
material necesario para la práctica.
En cuanto a los resultados, con la condición 1(37°C s/a) en el recuento de UFC
−11
obtuvimos un error en la placa 11, dilución 10 , debido a que no se agitó y mezcló con el
vortex la dilución anterior y solo se agitó con la micropipeta, dándonos como resultado un
−10
recuento más elevado que en la placa 10 (10 ). Los resultados del recuento de UFC en
las placas son todos válidos ya que cumplen con la condición de 30 a 300 colonias.
Mientras que con la condición 2 (Temp.Amb c/a) algunos resultados no se tomaron como
válidos ya que dos quedan por encima del límite de 300 ufc placa 7 y 8, y un resultado
queda por debajo del límite 30 ufc, placa 11.
A pesar de los imprevistos, se pudo llevar a cabo la actividad sin problemas.
Cada 45 minutos se midió la densidad óptica de las dos condiciones sin problemas. En la
primera medición de OD de la condición 2 se obtuvo un error de medición ya que se colocó
la cubeta con el lado esmerilado donde incide el haz de luz del espectrofotómetro, pero al
notarlo se corrigió el error. Respecto a la condición 1 la turbidez del cultivo era mayor que
la turbidez del cultivo de la condición 2, el cual tenía oxígeno debido a la agitación.
Creemos que para mejorar la experiencia y poder analizar el crecimiento en todas
las condiciones, en otra oportunidad deberíamos contar con más caldo y cantidad de
materiales, como por ejemplo las placas de petri o asas adecuadas.

CONCLUSIONES

Concluimos este trabajo con el aprendizaje sobre el manejo de cultivos de

Escherichia Coli. Dependiendo de las condiciones de crecimiento, esta puede favorecer o
retrasar el desarrollo de los microorganismos.
Es importante destacar que el medio de cultivo fue el adecuado para la bacteria que
se analizó, en este caso el uso del medio agar EMB contiene lactosa, por lo que las
bacterias de E. Coli al ser capaces de degradarla, devuelven ese color verde iridiscente
característico de E. Coli, que otro microorganismo que no tiene esta capacidad quedaría
incoloro y se debería realizar una tinción para poder proceder al conteo de placas.
BIBLIOGRAFÍA

● Biología de los microorganismos. 14 ed., Madrid (España), Miguel Martín-Romo,

2015.- Capítulo 5- Unidad 3,

● “FORMAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO.” Microbiologia y Parasitologia 2_E Unpa, 13 May 2012,

https://grupoenfermeriaunpa.blogspot.com/2012/05/formas-de-crecimiento-bacteriano.html. Accessed 26 October

2023. - Gráfico de fases de crecimiento