LABORATORIO N°3
Tinción de Gram.
La tinción Gram es uno de los métodos más usados en Microbiología es
considerada una tinción diferencial porque clasifica a las bacterias en dos clases
Gram positivas y Gram negativas.
Procedimiento:
1. Se transfieren células de un cultivo líquido fresco a un portaobjetos limpio y
se les deja secar si las células han sido cultivadas en un medio sólido
deberán ser transferidas a un medio líquido o a una solución se debe
obtener una capa muy delgada de células esto se puede lograr esparciendo
las células obtenidas del medio de cultivo sólido o del cultivo líquido
Se deben emplear cultivos frescos porque las células envejecidas
pueden perder su habilidad para retener la coloración
Nota: Para confirmar que el frotis no fue muy grueso se coloca la placa sobre un
pedazo de papel periódico y se verifica que pueden leer las letras que están detrás del
frotis
2. Para fijar las células al portaobjetos se puede pasar ligeramente por encima
de la flama del mechero Bunsen.
Nota: Otras formas de fijar el frotis son:
o Se coloca en una placa calentada a 60°C por pocos minutos.
o Se cubre con metanol al 95% hasta que se evapore
3. Después de pasar por la flama, el portaobjetos se sentirá caliente si lo
pones en el dorso de tu mano, pero no deberá ser tan caliente por eso la
ponemos en una como rejilla.
4. las células fijadas serán teñidas con el colorante básico Cristal Violeta por
30 a 40 segundos.
5. El portaobjetos es enjuagado con agua para remover el exceso de
colorante, en este punto todas las células se verán de color morado bajo el
microscopio.
6. luego una solución de Iodo Gram es añadida y se deja por 1 minuto el Iodo
se une con el Cristal Violeta para formar un complejo di-iodine su unión
disminuye su solubilidad dentro las células en este punto las células aún se
ven moradas.
7. Las células se decolorean al lavarlas con etanol o acetona este es el paso
diferencial las bacterias Gram positivas retienen el Cristal Violeta mientras
que las Gram negativas no el etanol o la acetona deben añadirse por goteo
con el portaobjetos inclinado en un ángulo hasta que la gota que caiga del
portaobjetos por un lado salga incolora. Las células Gram positivas también
pueden perder el complejo Cristal Violeta-Iodo si se prolonga la exposición
al decolorante.
8. El exceso de etanol es removido con agua al microscopio las células Gram
positivas se ven moradas y las Gram negativas estarán incoloras
NOTA: También se pueden usar en combinación: etanol + acetona.
9. Finalmente, las células que fueron enjuagadas se cubren con la
contratinción Safranina por 20 a 30 segundos esto tiñe a las Gram negativas
de color rosado después de enjaguar con agua, el portaobjetos se seca con
papel filtro.
NOTA: Las bacterias Gram positivas también se colorean con la safranina pero su color
morado predomina y no se nota una diferencia significativa en su coloración después
de este paso.
Al ver al microscopio las bacterias Gram positivas son moradas y las
bacterias Gram negativas son rosadas generalmente, la coloración
Gram se correlaciona con la estructura de la pared celular de las
bacterias.
NOTA: La estructura de la membrana de las Gram positivas consiste en una membrana
biológica interna y varias capas de peptidoglucano
El etanol deshidrata y compacta la gruesa capa de peptidoglucano
en las células Gram positivas y así retiene el colorante.
La gruesa capa de peptidoglucano deshidratada de las bacterias
Gram positivas, forma una barrera impermeable, que evita la
pérdida del complejo Cristal Violeta-Iodo Gram.
NOTA: La estructura de la membrana de las Gram negativas tiene dos membranas
biológicas: una interna y otra externa, y una delgada capa intermedia de
peptudoglucano.
En contraste, el peptidoglucano de las bacterias Gram negativas es
muy delgado y tiene grandes poros el etanol puede extraer lípidos e
incrementa la porosidad que permite que el complejo Cristal Violeta-
Iodo Gram sea removido
Tinción Ziehl Nielsen.
Una vez realizado el frotis y después de fijarlos, se inicia la técnica de tinción, es el
proceso en el cual se aplican dos colorantes un mordente (Fucsina fenicada) y un
decolorante (Alcohol-ácido Ziehl Neelsen) permiten diferenciar la composición de la
compasión de la pared celular bacteriana.
Material:
1. Portaobjetos.
2. Asa bacteriológica
3. Mechero
4. Bandeja de poco fondo
5. Puente de vidrio
6. Piseta con agua de la llave
7. Colorante primario que es la fuschina que da color rosa a las células
8. Decolorante (Alcohol-ácido Ziehl Neelsen)
9. Colorante de contraste azul de metileno de loeffler da color azul a las células
10. Fragmentos de papel filtro
11. Tripe con charola
12. Vaso e precipitados
13. Pinzas de punta ronda
14. Microscopio
15. Aceite de inmersión
16. Cultivo bacteriano
Procedimiento:
1. Debemos aplicar calor a la muestra, se puede hace con la flama del mechero o
con vapor, la decolarion con el colorante de contraste se realiza en frio
siguiendo los mismos pasos.
Calentamiento directo:
Colocamos el portaobjetos sobre el puente, colocamos encima un pedazo de papel
filtro y le agregamos el colorante que es la fuschina, hasta humedecer el papel y evitar
que escura el colorante, calentamos el frotis pasando el mechero en lapsos de 5-10
segundos durante un tiempo total de 10 min, hay que añadir unas gotas del colorante
para evitar que se seque, hierva o cristalice.
Durante el calentamiento el colórate tiñe a todas las células, trascurrido el tiempo
retiramos el papel filtro.
El portaobjetos se lava con agua hasta que esta salga incolora.
Calentamiento indirecto:
Aquí el papel tenido con la fuschina se coloca sobre un vaso de precipitaciones que se
encuentra hirviendo agua se mantiene por 10 min debemos añadir colorante para
evitar que se seque y se cristalice.
Transcurrido el tiempo de calentamiento se coloca el portaobjetos en el puente de
vidrio, se retira el papel y se limpia con agua hasta que estas salgan incoloras.
NOTA: el lavado retira exceso de colorante que no haya penetrado en las células.
Punto crítico:
Este es el paso diferencial de la tinción. Realizamos la decoloración. Aquí se establece
la diferencia entre las células acido alcoholes resistentes de las que no lo son.
Agregamos gotas de alcohol acido hasta que el reactivo salga incoloro, se lava el
exceso de reactivo con agua.
Con la decoración se arrastra a la fuschina al exterior de las bacterias no ácido
alcohol resistentes quedan incoloras
Las ácido alcohol resistentes el alcohol no sale de la célula por lo que quedan
de color rosa.
Una vez eliminado el exceso de alcohol ácido se vierten unas gotas del colorante de
contraste que es el azul de metileno de Loeffler, dejamos que actúe durante 3 min
NOTA: Este azul de metileno de loeffler le da color solo a las no ácido alcohol
resistentes a las bacterias que en la decoloración había queda incoloras dejándolas de
color AZUL.
Luego se lava con agua hasta que salga incolora y dejamos secar las muestras.
Interpretación:
Con las muestras secas las ponemos en el microscopio con el objetivo de 100X,
observamos su morfología, agrupación y color.
NOTA: El lente de 100x requiere un medio condensador de luz que es el aceite de
inmersión, como vez se le coloca sobre el portaobjetos y entra en contacto con el
lente. Luego de usarlo se debe retirar el aceite que haya quedado en el lente.
Ácido alcohol resistencia – ROSA
Ácido alcohol NO resistentes – AZUL
Debemos colocar el portaobjetos en una solución desinfectante par lavarla y limpiar el
aceite de inmersión del objetivo.
Fundamento:
La deferencia entre las bacterias es que las ácido alcohol resistentes se tiñen de color
ROSA y las ácido alcohol no resistentes de color AZUL. Esta diferencia se debe a que
las bacteria:
Bacterias ácido alcohol resistencia – ROSA: Presentan una pared celular con ácidos
micólicos y otros lípidos los cual no permiten el paso de los colorantes por lo cual se
calienta el frotis, durante el calentamiento las ceras se restablecen y permitan el paso
de fuschina pase que tiene una solubilidad mayor que el agente decolorante.
El decolorante no puede arrastrar al exterior la fuschina.
Bacterias ácido alcohol NO resistencia – AZUL: Estas bacterias tiene una pared
carecen de estos componentes y por lo cual el colorante si es arrastrado al exterior de
la célula y toma el color azul del colorante de contraste.
En resumen:
Al efectuar la Tinción Ziehl Nielsen podemos diferenciar las Bacterias ácido alcohol
resistencia – ROSA de las Bacterias ácido alcohol NO resistencia – AZUL, que tiene
una composición diferente en su pared celular.
Es importante mantener el calentamiento de los 10 min del procedimiento ya que si no
se realiza adecuadamente la tinción puede no llevarse a cabo.
Recomendaciones:
Cuanto se sospeche de tener mycobacterium tuberculosis se deben tener los
siguientes cuidados:
1. Poner al portaobjetos en una parrilla de calentamiento para evitar la formación
de aerosoles
2. Colocar el frotis por 30 min en una campana con luz ultravioleta antes de teñir
