FORMATO DE GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO / TALLERES / CENTROS DE
SIMULACIÓN – PARA DOCENTES
CARRERA: ODONTOLOGIA ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA
NRO. PRÁCTICA: 5 TÍTULO PRÁCTICA: TECNICAS DE TINCIÓN
OBJETIVOS
GENERAL
Determinar Procedimientos Aplicados A Las Tinciones Bacterianas, Para La Observación De Las Principales Estructuras.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Los estudiantes desarrollarán las metodologías de tinciones simples y compuestas aplicadas a las bacterias, reconociendo
la funcionalidad y finalidad de cada una.
Objetivos
Utilizar cultivo puro para saber qué
tipos de bacterias tenemos en la tinción.
Diferenciar tipo de bacteria
Saber realizar una tinción de Gram
Identificar cuando es Gram positivo
o Gram negativo.
- Utilizar cultivo puro para saber qué tipos de bacterias tenemos en la tinción.
- Diferenciar tipo de bacteria
- Saber realizar una tinción de Gram
- Identificar cuando es Gram positivo o Gram negativo.
- Conocer y aplicar las técnicas de tinción básicas más frecuentes.
MARCO TEÓRICO
En la mayoría de los casos, las bacterias se observan en frotis teñidos y no en estado vivo, ya que el tamaño, la
forma y la disposición de las células se aprecian mejor si estas se tiñen por medio de reacciones con ciertos
colorantes. Los colorantes pueden usarse como tinciones directas de material biológico, como indicadores de
desviaciones de pH en medios de cultivo, como indicadores de oxido – reducción para demostrar la presencia o
ausencia de condiciones anaerobias. Los colorantes biológicos son derivados del alquitrán mineral (o de hulla). La
estructura química básica de la mayoría de ellos es el anillo de benceno, en general pueden contener dos o más
anillos conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que se asocian con la producción de color. En
términos químicos los colorantes se denominan ácidos o básicos, lo cual no necesariamente indican una reacción de
pH en solución; un colorante básico es aquel constituido por un agrupamiento de átomos orgánicos con carga positiva
(catiónicos) que será la parte activa del colorante y que tendrá afinidad por los ácidos nucleicos que se encuentra
constituido por átomos orgánicos con carga negativas (aniónicos) y por lo cual reaccionan con sustancias básicas,
como estructura citoplasmáticas. Un colorante neutro es una sal compuesta de un colorante ácido y un colorante
básico.
CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES.
TINCIÓN SIMPLE:
Una tinción simple se lleva acabo cubriendo con un colorante un frotis seco y fijado al calor. Esta tinción es usada
para teñir una gran variedad de microorganismos. El colorante más utilizado para esta tinción es el azul de metileno
de Loeffler.
TINCIÓN DIFERENCIAL:
Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como químicamente, así su reacción con algunos colorantes
también es diferente, dando lugar a grupos que se caracterizan por sus propiedades tintoriales. Dentro de esta
clasificación encontramos a la tinción de Gram y a la tinción de Ziehl – Neelsen, que se describirán a continuación:
TINCION DE GRAM.
Esta tinción es una de las más comúnmente usadas en microbiología, el mecanismo de reacción de los colorantes de
Gram, actúan en la estructura y composición de la pared celular.
Las bacterias Gramnegativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias Grampositivas, la pared
celular de las Gramnegativas son también más delgadas que las
Grampositivas por lo que no retienen el colorante inicial cuando se les agrega el alcohol acetona.
Está tinción utiliza cuatro reactivos que son: Cristal Violeta, lugol o yodo de Gram, etanol – acetona al 95% y
safranina. El cristal violeta que es el colorante inicial tiñe a todos los microorganismos, a que es un colorante básico,
en segundo lugar está el yodo que actúa como mordiente para aumentar la afinidad entre el colorante inicial y la
célula. El etanol actúa como decolorante sobre el microorganismo, lavando el colorante inicial en caso de que no se
afín con este.
La safranina es el colorante usado como contraste que teñirá a los microorganismos que no se colorean con el cristal
violeta.
TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN.
Los bacilos Acido – resistentes se denominan así por que están rodeados por una envoltura cérea que es resistente a
la tinción. Por eso es necesario calor para que el colorante penetre en la cápsula, una vez teñidos los
microorganismos resisten a la decoloración. Esta tinción consta de tres reactivos: Carbolfucsina, alcohol ácido al 3% y
azul de metileno. Los carbolfucsina se utiliza para la tinción primaria ya que atraviesa el material céreo de los bacilos
ácido – resistentes. Se aplica calor con la llama de una lámpara de alcohol o de un mechero para que el colorante
penetre en la cápsula. El alcohol ácido se utiliza para decolorar; las bacterias ácido – resistentes no sufren
decoloración mientras que otras bacterias se destiñen. El azul de metileno sirve como colorante de contraste.
TINCIÓN NEGATIVA.
Los preparados con tinta china o nigrosina se usan para exámenes microscópicos directos de cápsulas de muchos
organismos, los finos gránulos de la tinta china dan un fondo semiopaco contra el cual pueden verse claramente las
cápsulas. Este método colorea fondo, dejando la célula incolora y transparente. Existe una variante de esta coloración
hecha por Bonifaz, donde se utiliza fucsina para dar coloración a las células dejando incoloras las cápsulas, dando la
imagen de un cielo estrellado. Esta tinción se utiliza para detectar el hongo Cryptococcus neoformans, a las cápsulas
de Klebsiellas y algunas veces también para identificar espiroquetas las cuales no se pueden teñir fácilmente con
colorantes básicos.
RECOMENDACIONES PARA LA ELABORACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO.
Para obtener un frotis bacteriano adecuadamente teñido que permita estudiar e identificar correctamente los
microorganismos, es necesario seguir ciertas recomendaciones.
1. Los portaobjetos para los frotis deben estar limpios, libres de grasa y polvo, sin ralladuras o despostillados. Un
portaobjetos sucio puede ocasionar pérdida de material y dificultad para la localización del microorganismo en
estudio. 2. Las muestras deben tomarse con el asa o la aguja de inoculación.
3. Un frotis de un caldo de cultivo, se aplica directamente al portaobjetos sin dilución. Cuando se prepara de un medio
sólido se debe colocar una gota solución salina isotónica, evitar tomar una gran cantidad de inóculo, si no se obtendrá
un frotis en el cual no se podrá hacer una buena observación. Se recomienda fijar el frotis con calor, ya que esto
ayuda a inactivar las enzimas y adherir las células al portaobjetos, evitando que se desprendan en el proceso de
tinción. Una vez seco el frotis este deberá tener un color blanquizco.
4. Cuando se lleva a cabo el proceso de tinción, se debe respetar el tiempo indicado para cada reactivo ya que en
caso contrario se obtendrá un frotis que puede tener características inadecuadas en la colaboración o en la
morfología de las células.
5. Al lavar el exceso de tinción del portaobjetos con agua corriente se debe mantener el portaobjetos en una posición
paralela al chorro de agua. De esta manera se pierden menos organismos que cuando el agua incide directamente.
6. Cuando un frotis está terminado se debe dejar secar antes de observarlo en el microscopio.
7. Los frotis mejor elaborados pueden escogerse para tomarlos como muestras permanentes. Para su conservación
es necesario que después de ser observados el frotis se lave con xilol para eliminar el aceite de inmersión. Secar al
aire. Se le añade al frotis una gota de bálsamo de Canadá o permount, con cuidado se coloca un cubreobjetos, se
hace presión alrededor de tres minutos, se guarda la preparación de manera horizontal por dos semanas. También se
puede utilizar en caso de no contar con bálsamo de Canadá el barniz de uñas transparente.
Tinción con azul de metileno o azul de lactofenol para hongos
1. Ponga una gota pequeña de azul de metileno o azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos.
2. Con un asa metálica de punta, tome una porción del micelio del hongo que le haya asignado el docente encargado.
3. Ubique el micelio sobre la gota de colorante, y empleando dos asas metálicas de punta (una con cada mano), abra
el micelio tanto como le sea posible, de manera que sus estructuras se desenreden por completo (Figura 3.10.).
4. Sobre este montaje, deje caer cuidadosamente un cubreobjetos, y limpie el exceso de colorante que quede en la
superficie del portaobjetos.
5. Observe en el microscopio.
.
INSTRUCCIONES RECURSOS UTILIZADOS
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
x Portaobjetos
x Asa bacteriológica
x Mechero Bunsen
x Microscopio
x Puente de tinción
REACTIVOS:
x Aceite de inmersión
x Solución salina
x Azul de metileno de Loeffler
x Aceite de inmersión
x Desinfectante
x Solución salina
x Metano
x Cristal violeta
x Lugol de Gram x Alcohol-acetona
x Safranina
Desinfectante
x Solución salina
x Fucsina fenicada
x Alcohol-ácido
x Azul de metileno
x Muestra en esputo sospechosa de Mycobacterium tuberculosis
MATERIAL BIOLÓGICO :
x Cepas: Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
PROCEDIMIENTO
METODOLOGÍA: TINCIÓN SIMPLE
1.- Preparar un frotis como se indica en la Figura No.13 dejándolo secar perfectamente.
2.- Cubrir el frotis con azul de metileno de Loeffler por un minuto.
3.- Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4.- Observar con el objetivo de inmersión.
TÉCNICA: tinción Gram
1.- Se preparan frotis de las cepas proporcionadas de la manera indicada en la figura 13.
2.- Se recomiendan fijar las muestras biológicas con metanol por un minuto.
3.- Los frotis se tiñen con cristal violeta durante un minuto.
4.- Lavar con agua corriente.
5.- Teñir con lugol 30 segundos.
6.- Lavar con agua corriente.
7.- Decolorar con alcohol – acetona 30 segundos.
8.- Lavar con agua corriente.
9.- Se tiñe con safranina de 25 a 30 segundos.
10.- Lavar con agua corriente y dejar secar.
11.- Observar con objetivo 10X para identificar el campo, e inmediatamente pasar a objetivo
100X, colocando una gota muy pequeña de aceite de inmersión.
INTERPRETACION
Microorganismos color violeta: Gram positivos.
Microorganismos color rosado: Gram negativos
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
1 Se prepara un frotis de la muestra, dejándola secar.
2.- Se cubre perfectamente con fucsina.
3.- colocar sobre un puente de vidrio el portaobjetos y con una lámpara de alcohol, calentar
hasta que haya emisión de vapores, durante 5 minutos, sin hervir, en caso de que el frotis
llegase a secarse se agrega más fuscina y se sigue el tiempo.
4.- Enjuagar con agua corriente.
5.- Decolorar con alcohol – ácido 30 segundos.
6.- Lavar con agua corriente.
7.- Teñir con Azul de metileno durante 30 segundos. Dejar secar el frotis.
8.- Observar con objetivo 10X para identificar el campo, e inmediatamente pasar a objetivo
100X, colocando una gota muy pequeña de aceite de inmersión, observar.
INTERPRETACIÓN: Microorganismos color rosa son conocidos como BAAR (Bacilos Ácido
Alcohol Resistentes). Esta tinción es utilizada principalmente para identificar el agente causal
de la tuberculosis.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR
Ejecute el proceso práctico.
Genere un informe de la práctica.
RESULTADO(S) OBTENIDO(S):
Para esta práctica en particular, se definirá un formato específico de informe y presentación de resultados, que se dará a conocer a
los estudiantes al iniciar el curso de microbiología.
CONCLUSIONES:
Es una técnica muy sencilla que se basa en el uso de un colorante (tinción) y que tiene una gran utilidad en medicina
y que permite observar las bacterias mejor que bajo el microscopio.
La gran aportación práctica de la tinción de gram es que permite determinar el tipo de antibiótico así como su
eficacia.
El proceso para realizar la tinción es muy sencillo.
RECOMENDACIONES:
BIBLIOGRAFIA
1. INGRAHAM JOHN, INGRAHAM CATHERINE. Introducción a la microbiología.Reverte, 1998
2. TORTORA GJ. Introduccion a la Microbiología. (9ª Ed.) Ed. Panamericana. 2007
3. KONEMAN W.F. Diagnóstico Microbiológico texto y atlas en color. 6ª Edición. Editorial Panamericana. 2008
4. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S; PFALLER, M. H.: Microbiología Médica. (6ª Ed.) Elsevier, 2009.
