Centro de Investigación en Alimentación y

Desarrollo A.C.

CARVACROL INHIBE EL PROCESO DE FORMACIÓN DE

BIOPELÍCULAS Y PRODUCCIÓN DE EXOENZIMAS DE
Pectobacterium carotovorum
_______________________________________

Por:

María Melissa Gutiérrez Pacheco

TESIS APROBADA POR LA

COORDINACIÓN DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL

Como requisito parcial para obtener el grado de

DOCTORADO EN CIENCIAS

Hermosillo, Sonora Agosto 2019

2
 DECLARACIÓN INSTITUCIONAL

La información generada en la tesis “Carvacrol Inhibe el Proceso de Formación de

Biopelículas y Producción de Exoenzimas de Pectobacterium carotovorum” es propiedad
intelectual del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD). Se permiten y
agradecen las citas breves del material contenido en esta tesis sin permiso especial de la autora
María Melissa Gutiérrez Pacheco, siempre y cuando se dé crédito correspondiente. Para la
reproducción parcial o total de la tesis con fines académicos, se deberá contar con la autorización
escrita de quien ocupe la titularidad de la Dirección General del CIAD.

La publicación en comunicaciones científicas o de divulgación popular de los datos contenidos en

esta tesis, deberá dar los créditos al CIAD, previa autorización escrita del manuscrito en cuestión
del o la director(a) de tesis.

3
 AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el apoyo económico

brindado durante la realización de mis estudios de posgrado.
Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. por permitirme realizar mis estudios
de maestría y ahora de doctorado, logrando así alcanzar una meta importante en mi formación
profesional y personal.
Al proyecto CB-2013-01-222691 denominado “Caracterización y evolución de carbohidratos y
metabolitos señal en biopelículas de bacterias patógenas expuestas a antimicrobianos de origen
vegetal” financiado por el fondo de Ciencia Básica del CONACYT.
A la Coordinación de Vegetales (CTAOV), por darme la oportunidad de realizar mí proyecto de
investigación en esta área y facilitarme equipo e instalaciones. Les agradezco todo el apoyo y
consejos durante los seminarios, los cuales nutrieron este trabajo.
A mi director de tesis Dr. Jesús Fernando Ayala Zavala por todo su apoyo, guía y consejos en la
realización de este trabajo. Por sus infinitas enseñanzas que me permitieron crecer como persona
y profesionista. Le agradezco por hacer sacar lo mejor de mí siempre y por su amistad.
A mi comité de tesis: Dr. Gustavo González, Dr. Miguel Ángel Martínez, Dr. Tomás Madera y Dr.
Jaime Lizardi, gracias por todo su apoyo y consejos.
Al Laboratorio de Tecnologías Emergentes, M. C. Brenda Silva y M. C. Reynaldo Cruz, gracias
por su guía, apoyo y amistad durante este largo camino. A mis amigos Thalía, Melvin, Pancho,
Kechu, Karen, Patty y Toño, gracias por todo su apoyo y cariño a lo largo de todos estos años. Por
volver más llevaderos los días con su compañía y risas.
A mis amigas Anna, Thaly, Stephanie, Chio, Karen y Andrea, por estar ahí en todo momento y
compartir tantas experiencias juntas.
A la Dras. Filomena Nazzaro y Florinda Fratianni por sus atenciones y apoyo durante la realización
de mi estancia de investigación en el Istituto di Sziense dell’ Alimentazione en Avellino, Italia.
Gracias por hacer muy amena mi estadía en su laboratorio.
Al Dr. Alonso López Zavala por su ayuda en la realización de parte de mis experimentos en el
Laboratorio de Bioquímica de Proteínas, así como a los demás integrantes del laboratorio que me

4
recibieron y apoyaron en todo momento: M. C. Luis Morado, Dra. María de Jesús Moreno y M. C.
Cesar Otero.
A las personas que contribuyeron en la realización de este trabajo con apoyo técnico y consejos:
M. C. Mónica Villegas, M. C. Emmanuel Aispuro, Q. B. María del Carmen Granados, Q. B. Blanca
Olivia Briceño, Q. A. Thalia Islava, M. C. Alejandra Preciado y a todos los integrantes del Lab. de
Antioxidantes y Alimentos Funcionales.

5
 DEDICATORIAS

A Dios

Por estar siempre a mi lado en cada momento y llenarme de bendiciones.

A mis padres Olga y Juan José

Por estar a mi lado en cada momento y enseñarme a ser una persona de bien y a superarme día
con día. Siempre les estaré eternamente agradecida por la confianza y el gran amor puro y sincero
que me han brindado.

A mi hermano Juanito y Sthefan

Por su amor y apoyo incondicional, porque aunque estemos lejos, estamos juntos en corazón y
pensamiento.

A mis sobrinos Luna y Alan

¡Porque son mi felicidad! y a pesar de la distancia los llevo siempre conmigo.

A mi hermana Lisdeth

Por estar a mi lado en todo momento y siempre buscar la manera de animarme con tus
ocurrencias. Por tu amor incondicional y por compartir toda una vida conmigo. No pude tener
una mejor compañera que tú en esta vida

A mi esposo Luis Alberto

Por ser mi compañero de vida, por tu amor, por ser mi hogar y por nuestra hermosa pequeña
familia. Siempre buscaste la manera de hacerme ver lo mejor de las cosas y a sacar lo mejor de
mí. Gracias por el apoyo y amor incondicional que siempre me has brindado,
te amo.

6
 CONTENIDO

APROBACIÓN............................................................................ ...................................................2
DECLARACIÓN INSTITUCIONAL ......................................................................................... 3
AGRADECIMIENTOS .............................................................. ...................................................4
DEDICATORIAS .......................................................................................................................... 6
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................... 9
LISTA DE CUADROS................................................................................................................ 11
RESUMEN ................................................................................................................................... 12
ABSTRACT ................................................................................. .................................................13
1.INTRODUCCIÓN ................................................................... ..................................................14
2.ANTECEDENTES .................................................................. ..................................................17
2.1. Enfermedades y Contaminación Causada por Bacterias Patógenas de Plantas...................17
2.2. Factores de Virulencia de Pectobacterium carotovorum .................................................. 20
2.3. Regulación de la Formación de Biopelículas y Producción de Exoenzimas de P.
carotovorum Mediante el Quorum Sensing ...................... .................................................24
2.4. Extractos de Plantas y Sus Principales Compuestos Atenúan la Virulencia de
Bacterias Fitopatógenas ..................................................................................................... 30
2.5. Carvacrol como Inhibidor de la Comunicación Intercelular, Formación de
Biopelículas y Síntesis de Exoenzimas ............................................................................. 32
3.HIPÓTESIS ............................................................................. ..................................................35
4.OBJETIVOS ............................................................................ .................................................36
4.1. Objetivo General................................................................ ..................................................36
4.2. Objetivos Específicos ........................................................ ..................................................36
5.MATERIALES Y MÉTODOS............................................... ...................................................37
5.1. Etapa 1: Evaluación del Efecto del Carvacrol Sobre el Proceso de Formación de
Biopelículas de P. carotovorum. ....................................... ...................................................37
5.1.1. Determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI), Bactericidas
(CMB) y de Formación (CMIB) y Erradicación (CMEB) de Biopelículas de
Pectobacterium carotovorum Expuestas a Carvacrol .................................................37
5.1.2. Efecto del Carvacrol Sobre la Motilidad de P. carotovorum .................................... 38
5.1.3. Carga Superficial Bacteriana de P. carotovorum Expuesta a Carvacrol. .................. 38
5.1.4. Energía Libre de Adhesión de P. carotovorum Expuesta a Carvacrol. ..................... 39
5.1.5. Efecto del Carvacrol Sobre la Formación de Biopelículas y Secreción de SPE de P.
carotovorum. .............................................................................................................. 41
5.1.6. Análisis Estadístico. ................................................................................................... 42
5.2. Etapa 2: Efecto del Carvacrol Sobre la Producción de Exoenzimas de P. carotovorum....42

7
 CONTENIDO (Continuación)

5.2.1. Inhibición de la Actividad de Exoenzimas de P. carotovorum Expuesta a. ..................

Carvacrol .................................................................... ................................................42
5.2.2. Análisis de Modelaje Molecular Entre el Carvacrol y las Exoenzimas de P.
carotovorum. .............................................................................................................. 43
5.2.3. Efecto del Carvacrol Sobre la Patogenicidad In Vivo de P. carotovorum en
Tejidos de Papa. ......................................................................................................... 44
5.2.4. Análisis Estadístico. ................................................................................................... 44
5.3. Etapa 3: Efecto del Carvacrol Sobre el QS de P. carotovorum..........................................45
5.3.1. Producción de AHLs por P. carotovorum Expuesta a Carvacrol...............................45
5.3.2. Análisis de Modelaje Molecular Entre Carvacrol y ExpI de P. carotovorum............46
5.2.3. Análisis Estadístico................................................................................................46
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN........................................................................................ .....47
6.1. Etapa 1: Evaluación del Efecto del Carvacrol Sobre el Proceso de Formación de
Biopelículas de P. carotovorum ........................................................................................ 47
6.1.1. Determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI),
Bactericidas (CMB) y de Formación (CMIB) y Erradicación de Biopelículas
de P. carotovorum Expuestas a Carvacrol. ................................................................ 47
6.1.2. Efecto del Carvacrol Sobre la Motilidad de P. carotovorum. ................................... 48
6.1.3. Carga Superficial Bacteriana de P. carotovorum Expuesto a Carvacrol. ...................50
6.1.4. Energía Superficial y Potencial de Adhesión de P. carotovorum Expuesta a
Carvacrol. ................................................................................................................... 51
6.1.5. Efecto del Carvacrol Sobre la Formación de Biopelículas y Secreción de
SPE de P. carotovorum. ............................................................................................. 54
6.2. Etapa 2: Efecto del Carvacrol Sobre la Producción de Exoenzimas de P.
carotovorum. ..................................................................................................................... 60
6.2.1. Inhibición de la Actividad de Exoenzimas de P. carotovorum Expuesta a
Carvacrol .................................................................................................................... 60
6.2.2. Efecto del Carvacrol Sobre la Maceración de Tejidos de Papa causada por
P. carotovorum ........................................................................................................... 62
6.3. Etapa 3: Efecto del Carvacrol Sobre el QS de P. carotovorum. ........................................ 67
6.3.1. Producción de AHLs por P. carotovorum Expuesta a Carvacrol .............................. 67
6.3.2. Modelaje Molecular Entre Carvacrol y ExpI de P. carotovorum .............................. 70
7. CONCLUSIÓN ........................................................................................................................ 74
8. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 75

8
 LISTA DE FIGURAS

Figura Página
1. El proceso de formación de biopelículas consiste en 5 etapas: 1) adhesión
reversible, 2) adhesión irreversible, 3) formación de microcolonias, 4) maduración
de la biopelícula y 5) dispersión de las células embebidas en la biopelícula para
colonizar otras superficies…………............................................. 22
2. Estructuras abreviadas de stewartan, amilovoran, celulosa y levan, principales
carbohidratos presentes en biopelículas de patógenos de plantas………………… 23
3. ExpI sintetiza AHL a partir de los sustratos SAM y acil-ACP mediante un
proceso de acilación y lactonización……………………………………………… 25
4. ExpR1 y ExpR2 regulan negativamente la síntesis de exoenzimas en P.
carotovorum a través de la activación de RsmA...................................................... 28
5. El QS regula la síntesis de polisacáridos en P. stewartii a través de la activación
de la expresión de genes cps.................................................................................... 29
6. Cavidad hidrofóbica de ExpI donde se lleva a cabo el reconocimiento de la cadena
de acilo transportada por ACP y el proceso de N-acilación mediante el ataque
nucleofílico entre el grupo amino desprotonado de SAM y el 1-carbono carbonilo
de la cadena de acilo………... ……………………................................ 34
7. Curvas de crecimiento de P. carotovorum expuesta a concentraciones sub-
inhibitorias de carvacrol…………………………………………………………... 49
8. Energía superficial de P. carotovorum no expuesta (A) y expuesta a carvacrol
(B)……………………………………………………………………………….... 52
9. Efecto del carvacrol en la formación de biopelículas de P. carotovorum en
cupones de polipropileno incubados a 28 ºC por 48 h……………………………. 55
10. Imágenes de microscopía de biopelículas de P. carotovorum no tratadas y tratadas
con carvacrol, incubadas a 28 ºC por 24 h.………………………………. 56
11 Efecto del carvacrol en la síntesis de SPE durante la formación de biopelículas de
P. carotovorum en cupones de polipropileno a 28 ºC por 48 h………………... 57
12. Actividad poligalacturonasa (A) y pectato liasa (B) en sobrenadantes de cultivos
de P. carotovorum no expuestos (control) y expuestos a 0.66 mM de carvacrol
durante 24 h a 28 ºC………………………………………...…………………...... 61
13. Análisis de modelaje molecular del carvacrol con las proteínas poligalacturonasa
(A) y pectato liasa (B) de P. carotovorum………………….………………………. 63
14. Efecto del carvacrol sobre el daño a tejido de papa causado por P. carotovorum
durante 48 h a 28 ºC…..…………………………………………………………... 64

9
 LISTA DE FIGURAS (Continuación)

Figura Página
15. Efecto del carvacrol sobre el daño a tejido de papa causado por P. carotovorum
durante 96 h a 28 ºC (A). El tratamiento no afectó la carga bacteriana durante el
ensayo (B)………………………………………................................................ 65
16. Producción de 3-oxo-C6-AHL de P. carotovorum expuesta a carvacrol (0.66 mM)
durante 24 h de incubación a 28 ºC.………………………………………… 68
17. Homología del modelo estructural de ExpI de P. carotovorum con la estructura
cristalográfica de EsaI (PDB 1KZF) de P. stewartii……………………………… 70
18. Modelaje molecular de SAM (A) y carvacrol (B) en el sitio de unión a acil-ACP
de ExpI………………………………………….………………………………… 72

10
 LISTA DE CUADROS

Cuadro Página
1. Producción mundial y pérdidas de los principales cultivos básicos.………......... 18
2 Virulencia de bacterias fitopatógenas: sistemas QS, moléculas señal y factores
de virulencia………………………………………………………………..…… 27
3. Motilidad tipo swimming de P. carotovorum expuesta a carvacrol durante 24 h
de incubación a 28 °C……………………………………………………….…... 49
4. Carga superficial de P. carotovorum expuesta a carvacrol durante 24 h de
incubación a 28 °C…………………………......................................................... 51
5. Potencial de adhesión (ΔGadh) entre P. carotovorum expuesta a carvacrol y la
superficie de polipropileno.................................................................................... 53
6. Energía de afinidad e interacciones principales obtenidas del modelaje molecular
entre SAM, carvacrol y ExpI………………………………………… 73

11
 RESUMEN

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum es una bacteria causante de la pudrición

blanda en tejidos vegetales debido a su capacidad para formar biopelículas y exoenzimas. La
virulencia de P. carotovorum está regulada por quorum sensing (QS), a través de la síntesis y
reconocimiento de acil homoserina lactonas (AHLs), por medio de las proteínas ExpI/ExpR. Por
lo que una estrategia para su control sería interrumpir el QS aplicando carvacrol, un terpenoide
antibacteriano del aceite esencial de orégano que ha afectado el QS en otras bacterias. Por esta
razón, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del carvacrol sobre la síntesis de AHL
para inhibir la formación de biopelículas y síntesis de exoenzimas de P. carotovorum. Las
concentraciones mínimas inhibitorias y bactericidas del carvacrol fueron de 2.66 y 3.99 mM,
respectivamente; mientras que concentraciones de 1.33 y 3.99 mM fueron necesarias para inhibir
y erradicar biopelículas, respectivamente. Se eligió la concentración de 0.66 mM de carvacrol para
evaluar su efecto sobre las variables de respuesta de interés, sin afectar la viabilidad celular y poder
tener un acercamiento sobre su posible mecanismo de acción. A esta concentración, se redujo la
carga superficial bacteriana (-2.15 mV), potencial de adhesión (-1.5 mJ/m2), motilidad (48.2 mm)
y síntesis de polisacáridos (13.83 EG/cm2) de P. carotovorum comparado con el control.
Adicionalmente, el carvacrol afectó la síntesis de exoenzimas, mostrando una reducción en la
actividad poligalacturonasa (38.76%) y pectato liasa (50.19%) e incidencia de la enfermedad
causada por esta bacteria en un 70-90% en tejidos de papa con respecto al control. La disminución
de los factores de virulencia mencionados anteriormente se relacionó con una posible interacción
entre carvacrol y la proteína ExpI, causando una reducción (8.93%) en la síntesis 3-oxo-C6-AHL,
molécula implicada en la regulación de estos procesos. Esto se evidenció en el análisis de modelaje
molecular el cual mostró interacciones hidrofóbicas en el sitio de unión a la cadena de acilos (-4.7
kcal/mol) de ExpI. En conclusión, el carvacrol afectó el proceso de formación de biopelículas y
síntesis de exoenzimas de P. carotovorum y dicho efecto se relacionó con una reducción de AHLs.

Palabras clave: terpenoide, comunicación intercelular, agregados bacterianos, enzimas

extracelulares, anti-virulencia.

12
 ABSTRACT

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum is a bacterium that causes soft in plant

tissues due to its capacity to form biofilms and exoenzymes. P. carotovorum virulence is regulated
by quorum sensing (QS), through the synthesis and recognition of acyl homoserine lactones
(AHLs) by means of the ExpI/ExpR proteins. So, a strategy for its control would be to interrupt the
QS applying carvacrol, an antibacterial terpenoid of oregano essential oil, that has affected the QS
in other bacteria. For this reason, the objective of this work was to determine the effect of carvacrol
on AHL synthesis to inhibit biofilm formation and exoenzymes synthesis of P. carotovorum. The
minimum inhibitory and bactericidal concentrations of carvacrol were 2.66 and 3.99 mM,
respectively; while concentrations of 1.33 and 3.99 mM were necessary to inhibit and eradicate
biofilms, respectively. The concentration of 0.66 mM of carvacrol was chosen to evaluate its effect
on the response variables of interest, without affecting cell viability and having an approach on its
possible mechanism of action. At this concentration, the bacterial surface charge (-2.15 mV),
adhesion potential (-1.5 mJ/m2), motility (48.2 mm) and polysaccharide synthesis (13.83 GE/cm2)
of P. carotovorum were reduced, compared to the control. Additionally, carvacrol affected the
synthesis of exoenzymes, showing a reduction in polygalacturonase (38.76%) and pectate lyase
(50.19%) activities and the incidence of the disease caused by this bacterium in 70-90% in potato
tissues with respect to the control. The reduction of the afore mentioned virulence factors was
related with a possible interaction between carvacrol and ExpI protein, causing a reduction (8.93%)
in the synthesis of 3-oxo-C6-AHL, molecule implicated in the regulation of these processes. This
was evidenced in the molecular docking analysis which showed hydrophobic interactions at the
acyl chain binding site (-4.7 kcal/mol) of ExpI. In conclusion, carvacrol affected the biofilm
formation process and exoenzymes synthesis of P. carotovorum and this effect was related to a
reduction of AHLs.

Keywords: terpenoid, intercellular communication, bacterial aggregates, extracellular enzymes,

anti-virulence.

13
 1. INTRODUCCIÓN

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum es una bacteria Gram-negativa de gran

importancia económica debido a que causa la enfermedad “pudrición blanda o bacteriana” en
diversos cultivos como la papa, repollo, cebolla, rábano, coles de bruselas y pepino, entre otros,
durante su cultivo, transporte y almacenamiento, resultando en altas pérdidas cada año y un
considerable daño económico (Toth et al. 2003). La capacidad de P. carotovorum para adherirse y
formar biopelículas es un factor importante que contribuye a su capacidad para infectar los tejidos
de las plantas, así como a su resistencia y persistencia en diferentes ambientes, especialmente en el
campo. Sin embargo, esta bacteria también puede estar presente en las superficies durante el
manejo posterior a la cosecha, ya que causa contaminación cruzada y descomposición posterior a
la cosecha (Czajkowski et al. 2011).
Las biopelículas son un consorcio de microorganismos embebidos en una matriz de sustancias
poliméricas extracelulares (SPE) de síntesis propia compuesta por carbohidratos, proteínas, lípidos
y material genético, cuya composición varía entre microorganismos, siendo para P. carotovorum
aún desconocida. El proceso de formación de biopelículas se ha generalizado que consiste en 5
etapas principales: 1) adhesión reversible, 2) adhesión irreversible, 3) microcolonias 4) maduración
y 5) dispersión (Stoodley et al. 2002). Aunado a su capacidad para formar biopelículas, esta
bacteria sintetiza otros factores de virulencia como lo son las exoenzimas pectato liasas,
poligalacturonasas y pectin metil esterasas que degradan principalmente los componentes pécticos
de la pared celular liberando nutrientes para su crecimiento (Pérombelon 2002). En general, la
patogenicidad de P. carotovorum es atribuida a su capacidad de expresar diversos factores de
virulencia como la motilidad, SPE, biopelículas y exoenzimas, los cuales en conjunto favorecen el
desarrollo de la enfermedad.
La expresión de los factores de virulencia se produce a través del proceso de comunicación
intercelular “quorum sensing” (QS) (Mole et al. 2007). El QS permite que las bacterias controlen
su densidad poblacional a través de la secreción y detección de moléculas señal llamadas acil
homoserina lactonas (AHL). En P. carotovorum, las AHL son sintetizadas por la proteína acil
homoserina lactona sintasa (ExpI) a partir de S-adenosil metionina y una cadena de acilo
transportada por la proteína acarreadora de acilo (ACP por sus siglas en inglés) mediante un

14
proceso de acilación y lactonización (Watson et al. 2002). En la mayoría de las bacterias Gram-
negativas, cuando la concentración de AHL alcanza un nivel umbral, estas interaccionan con
proteínas receptoras (tipo LuxR) y forman un complejo activo con afinidad a regiones promotoras
de genes que activan la expresión de factores de virulencia (von Bodman et al. 2003).
Se ha reportado que la presencia de AHL determina la activación de la síntesis de factores de
virulencia; tal es el caso de Lee et al. (2013) quienes reportaron que cepas mutantes del gen expI
que codifica para la proteína ExpI encargada de la síntesis de AHL, no produjeron exoenzimas y
se redujo la formación de biopelículas en un 77%. De manera similar, en P. atroscepticum la
supresión del gen expI provocó una disminución de la abundancia de transcritos de las exoenzimas
(pnl, pel, peh, pme, cel y prt). Por otra parte, von Bodman et al. (2003) encontraron que la supresión
de este gen en P. carotovorum eliminaba la síntesis de AHL y la producción de SPE, lo cual se
reflejó directamente en una reducción de la virulencia. Por lo tanto, se han buscado compuestos
que afecten la comunicación intercelular a través de la reducción o inhibición de la síntesis de AHL
con la finalidad de afectar la virulencia bacteriana.
Los aceites esenciales y sus principales constituyentes han demostrado potencial para inhibir las
células bacterianas en estado planctónico y en biopelículas (Ortega‐Ramirez et al. 2014, Tapia-
Rodriguez et al. 2017). El carvacrol, un terpenoide hidrofóbico presente en el aceite esencial de
orégano, ha mostrado un alto potencial antibacteriano y se ha propuesto como un inhibidor
potencial de la formación de biopelículas y otros factores de virulencia de diversas bacterias,
incluida P. carotovorum (Joshi et al. 2016, Tapia-Rodriguez et al. 2019). Burt et al. (2014)
reportaron que el carvacrol (a concentraciones subinhibitorias, <0.5 mM) inhibió la formación de
biopelículas de Chromobacterium violaceum, Salmonella Typhimurium y Staphylococcus aureus.
Tapia-Rodriguez et al. (2017) observaron que este compuesto (a 3.9 y 0.7 mM) redujo la síntesis
de piocianina y la formación de biopelículas, factores de virulencia regulados por el sistema QS en
Pseudomonas aeruginosa, y dicho efecto fue atribuido a una reducción en la síntesis de AHL.
A pesar de que existen estudios previos sobre el efecto del carvacrol sobre los factores de virulencia
en fitopatógenos, es importante resaltar que se desconoce cómo es que se lleva a cabo el proceso
de formación de biopelículas y su composición, síntesis de exoenzimas y otros factores de
virulencia de P. carotovorum subsp. carotovorum al ser expuestos a carvacrol y como se relaciona
esto con una inhibición de la síntesis de AHL por su posible interacción con la proteína ExpI. Por

15
lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del carvacrol sobre el proceso de formación
de biopelículas, síntesis de exoenzimas y comunicación intercelular de P. carotovorum.

16
 2. ANTECEDENTES

2.1. Enfermedades y Contaminación Causada por Bacterias Patógenas de Plantas

La contaminación bacteriana de las superficies de tejidos vegetales o en contacto con estos es un

grave problema que compromete la seguridad alimentaria, favorece la contaminación cruzada y
propaga enfermedades (Stepanović et al. 2004, Van Houdt y Michiels 2010). En las plantas, la
colonización bacteriana es un fenómeno natural que ocurre en una amplia gama de condiciones,
como la disponibilidad de nutrientes, humedad y pH cercano al neutro. Las enfermedades de las
plantas son responsables de la pérdida de muchos cultivos, causando una reducción en la cantidad
y calidad de los productos cosechados. Al menos el 10% de la producción mundial de vegetales se
pierde debido a enfermedades bacterianas adquiridas durante los periodos de pre- y post-cosecha.
Durante la pre-cosecha, se pueden establecer bacterias patógenas y después éstas pueden crecer y
desarrollar la infección durante la post-cosecha (Din et al. 2011). Este proceso se ha relacionado
con el uso de agua contaminada durante el riego en la pre-cosecha (Hamilton et al. 2006), así como
el lavado de superficies e instalaciones de almacenamiento y procesamiento pos-cosecha. Ésta
contaminación cruzada aumenta a través de las superficies de contacto, como el acero inoxidable,
cajas de cartón y polipropileno, incrementando el riesgo de infección y la necesidad de
desinfectantes. En este sentido, el ciclo de infección de los fitopatógenos puede comenzar no sólo
en el campo, sino también durante el manejo posterior a la cosecha cuando las condiciones
ambientales son favorables.
Los tejidos vegetales representan más del 80% de la dieta humana y son esenciales para garantizar
la seguridad alimentaria (FAO 2015). Por lo tanto, las enfermedades bacterianas de las plantas son
un problema que debe ser controlado (Strange y Scott 2005). La mayoría de los seres humanos
viven con una dieta basada en cultivos básicos y su producción y conservación están
comprometidas por el ataque bacteriano. El Cuadro 1 lista las principales fuentes vegetales para la
nutrición humana; pero que al mismo tiempo, son susceptibles a varias enfermedades. Hoy en día,
no hay estadísticas recientes sobre las pérdidas de cultivos básicos causadas particularmente por

17
bacterias, lo cual representa un problema considerando los datos pasados y la prerrogativa
internacional para garantizar la seguridad alimentaria.

Cuadro 1. Producción mundial y pérdidas de los principales cultivos básicos.

Cultivo Producción (ton)1 Pérdidas (%)2
Maíz 1,060,107,470 8.5
Arroz 740,961,445 10.8
Trigo 749,460,077 10.2
Papa 376,826,967 14.5
Soya 334,894,085 8.9
Vegetales 290,130,864 -
Sorgo 63,930,558 -
Raíces y tubérculos 10,455,162 -
1
Produccion mundial de cultivos básicos al 2016 (FAOSTAT 2016).
2
Pérdidas de cultivos (%) atribuidas a enfermedades de plantas alrededor del mundo entre 2001-
2003 (Oerke 2006).
- Estadísticas no reportadas.

Se ha reportado que las enfermedades bacterianas causan pérdidas del 20 al 40% de la producción
mundial de alimentos (FAO 2015), y se han relacionado con la presencia de fitopatógenos como
Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Ralstonia solanacearum, Agrobacterium
tumefaciens, Xanthomonas oryzae, Pectobacterium amylovorum, Xylella fastidiosa, Dickeya
dadantii y Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Mansfield et al. 2012). Estas
bacterias causan diferentes tipos de enfermedades en una gran variedad de productos vegetales; por
ejemplo, P. syringae coloniza las hojas de frijol y promueve la aparición de la enfermedad de “la
mancha marrón” causando la agregación celular (Danhorn y Fuqua 2007). A. tumefaciens causa el
“tumor del cuello”, una de las enfermedades de las plantas más graves del mundo. En la naturaleza,
esta bacteria induce crecimiento neoplásico en la planta infectada, reduciendo el vigor y el
rendimiento del cultivo (Mansfield et al. 2012).

18
Por otro lado, R. solanacearum causa la enfermedad de “marchitamiento vascular” en papa, tomate,
tabaco y bananas; caracterizada por la síntesis de exopolisacáridos que reducen el flujo de agua en
los vasos del xilema, así como por la colonización de los frutos, que aparecen como síntomas
durante su almacenamiento pos-cosecha (Kumar et al. 2016). En general, los síntomas causados
por estos patógenos están asociados con la interferencia con las funciones vitales de la planta,
incluida la regulación hormonal, la reproducción, la captación de agua y su transporte, así como la
calidad de sus frutos (Vidaver 2001). Dentro de los patógenos que más causan daño a los cultivos
se encuentra P. carotovorum subsp. carotovorum, un bacilo Gram-negativo perteneciente a la
familia Enterobacteriaceae, de gran importancia económica debido a que causa la enfermedad de
“pudrición blanda o bacteriana” en diversos cultivos como repollo, papa, cebolla, rábano, entre
otros productos (Toth et al. 2003).
Se ha reportado que éste microorganismo puede establecerse y multiplicarse durante el cultivo,
transporte y almacenamiento tanto en superficies bióticas o abióticas (Lee et al. 2013). P.
carotovorum puede encontrarse en la superficie de las plantas, en los frutos, suelo y puede entrar
en la planta a través de heridas o aberturas naturales de la superficie (Toth et al. 2003). Una vez
dentro de la planta, permanece en el tejido vascular o espacios intercelulares de los tejidos
parenquimatosos donde permanece hasta que las condiciones ambientales, incluyendo el agua libre,
disponibilidad de oxígeno y temperatura se vuelven adecuadas para el desarrollo de la enfermedad
(Toth et al. 2003).
La enfermedad de pudrición blanda causada por P. carotovorum ha sido más estudiada en
tubérculos y se favorece en condiciones húmedas provocando la maceración de la pared celular a
una consistencia cremosa que se vuelve oscura en presencia de aire, desarrollando un olor
desagradable cuando es invadido por microorganismos secundarios (Czajkowski et al. 2011).
Durante el almacenamiento en almacenes con ventilación inadecuada, la pudrición se puede
propagar a tubérculos adyacentes a medida que el líquido de tejidos en descomposición se filtra
sobre otros, conduciendo a las pérdidas económicas mencionadas anteriormente (Czajkowski et al.
2011). La maceración de los tejidos se da por la capacidad de esta bacteria para sintetizar de manera
coordinada altos niveles de múltiples exoenzimas, incluyendo pectinasas, celulasas y proteasas que
degradan a diferentes niveles la pared celular liberando nutrientes para el crecimiento bacteriano
(Pérombelon 2002). En general, la patogenicidad de este microorganismo es atribuida a su
capacidad para sintetizar diversos factores de virulencia como la motilidad, sustancias poliméricas

19
extracelulares (SPE), formación de biopelículas y exoenzimas, las cuales en conjunto favorecen el
desarrollo de la enfermedad.

2.2. Factores de Virulencia de Pectobacterium carotovorum

Las plantas son ricas en agua y nutrientes y ofrecen un entorno óptimo para la supervivencia y
proliferación bacteriana (Speth et al. 2007). Para cumplir con este reto los patógenos expresan
varios factores de virulencia que permiten su ciclo de infección. Un factor de virulencia es una
respuesta molecular del patógeno que influye específicamente en las funciones vitales del huésped
para permitir el crecimiento del patógeno y la colonización. P. carotovorum sintetiza un arsenal de
exoenzimas como principal factor de virulencia (Liu et al. 2008). Estas son proteínas extracelulares
que atacan la pared celular de hojas, frutos y vegetales, degradando principalmente los
componentes pécticos para exitosamente establecer una infección (Pérombelon 2002).
Las exoenzimas que produce P. carotovorum incluyen pectato liasa, pectin liasa, pectin metil
esterasa, celulasa, poligalacturonasa y proteasas. Estas son secretadas a través de los sistemas de
secreción Tipo I (T1SS) (proteasa) y Tipo II (T2SS) (pectinasas y celulasas) los cuales translocan
macromoléculas a través de la membrana hacia el medio extracelular y en algunos casos dentro del
hospedero (Pieretti et al. 2012). Se ha reportado que el sistema de secreción tipo II es requerido
para la secreción de diversos factores de virulencia en patógenos como Klebsiella, Pseudomonas
aeruginosa, Vibrio cholerae y algunas especies de Pectobacterium (Liu et al. 2008). Se ha
reportado que la síntesis de exoenzimas en Pectobacterium se lleva a cabo cuando la densidad
poblacional es alta con la finalidad de evadir el sistema de defensa de la planta (von Bodman et al.
2003).
Aunado a su capacidad de sintetizar exoenzimas, P. carotovorum también forma biopelículas, las
cuales son un consorcio de bacterias embebidas en una matriz de SPE de síntesis propia compuesta
principalmente de carbohidratos, proteínas, lipopolisacáridos y material genético (Flemming y
Wingender 2010). La formación de biopelículas es una característica importante en la colonización
de fitopatógenos sobre superficies bióticas y abióticas; esta provee protección contra estrés
ambiental y antibióticos. Se ha generalizado que este proceso consiste en 5 etapas principales: 1)

20
adhesion reversible, 2) adhesion irreversible, 3) formación de microcolonias, 4) maduración y 5)
dispersión (Stoodley et al. 2002). La etapa inicial es la adhesión de células planctónicas a una
superficie (Figura 1); para ello, las bacterias deben viajar ayudadas por la presencia de flagelos,
fimbrias tipo I, IV y curli, dependiendo de la especie. Para que se lleve a cabo el proceso de
adhesión, la bacteria debe vencer las fuerzas electrostáticas que le impiden adherirse a la superficie
(Garrett et al. 2008). Dentro de algunas características fisicoquímicas que influencian este proceso
están las características de la superficie como la hidrofobicidad y la carga, así como las
características superficiales de la bacteria como la energía, la carga, presencia de apéndices
celulares y SPE (Yaron y Römling 2014).
Se ha reportado que la motilidad en Pectobacterium spp. es determinante para su virulencia ya que
favorece la colonización, formación de biopelículas y progresión de la enfermedad. Existen dos
tipos de motilidad flagelar, la “swimming” y “swarming”, y la no flagelar “twitching”. En la
swimming, las bacterias se trasladan individualmente a través de un medio líquido homogéneo, sin
necesidad de una interfaz para ejercer empuje; mientras que la swarming es el movimiento de varias
bacterias en conjunto sobre un sustrato. Por otra parte, la motilidad tipo twitching se da por la
extensión, anclaje y retracción del pili polar tipo IV (Mattick 2002, Kearns 2010). Hossain et al.
(2005) reportaron que mutantes no motiles produjeron exoenzimas al mismo nivel que cepas
silvestres; sin embargo, el grado de patogenicidad fue significativamente menor. En general, la
motilidad proporciona acceso a sitios de unión e impulsa la adhesión bacteriana inicial ya que
ayuda a contrarrestar las fuerzas de repulsión entre las células y la superficie (Stoodley et al. 2002).
Durante la etapa 2, se lleva a cabo un aumento en el proceso de comunicación intercelular que da
pie a la síntesis de SPE que promueve una adhesión más fuerte e irreversible y cuya función es
proteger las células bacterianas y otorgar estabilidad al agregado (Czaczyk y Myszka 2007). Se ha
reportado que la síntesis de SPE es el principal factor que contribuye a la formación de biopelículas
y favorece el crecimiento, supervivencia y virulencia bacteriana (von Bodman et al. 2003). La
composición de SPE de las biopelículas varía entre microorganismos, siendo para los fitopatógenos
principalmente compuesta de carbohidratos. Por ejemplo, las biopelículas de P. stewartii y P.
amylovorum están compuestas por stewartan, amilovoran y levan, mientras que D. dadantii
produce principalmente celulosa (Langlotz et al. 2011) (Figura 2). Sin embargo, la composición de
las biopelículas de P. carotovorum es aún desconocida.

21
Figura 1. El proceso de formación de biopelículas consiste en 5 etapas: 1) adhesión reversible, 2) adhesión irreversible, 3) formación de
microcolonias, 4) maduración de la biopelícula y 5) dispersión de las células embebidas en la biopelícula para colonizar otras superficies.

22
Figura 2. Estructuras abreviadas de stewartan, amilovoran, celulosa y levan, principales
carbohidratos presentes en las SPE de biopelículas de fitopatógenos.

Uno de los síntomas de algunas enfermedades causadas por fitopatógenos es el bloqueo de la

adquisición y transporte de agua y se ha propuesto que las SPE bacterianas secretadas son
responsables de esto. Cuando se establecen las microcolonias bacterianas (etapa 3 del desarrollo
de la biopelícula), éstas continúan creciendo creando una estructura tridimensional para contener
grupos de células y canales que distribuyen de manera efectiva nutrientes moléculas de
señalización (Srey et al. 2013). Durante la etapa 4, se coloniza completamente la superficie y en
este punto es posible que Pectobacterium sintetice enzimas extracelulares para promover la
infección (Czaczyk y Myszka 2007). Finalmente, en la etapa 5, las células embebidas en las
biopelículas se separan para dispersarse y colonizar otras superficies (Figura 1) (Stoodley et al.
2002). La síntesis de factores de virulencia de P. carotovorum está regulado por el proceso de
comunicación intercelular “quorum sensing” (QS).

23
2.3. Regulación de la Formación de Biopelículas y Producción de Exoenzimas de P. carotovorum
Mediante el Quorum Sensing

La expresión de los factores de virulencia se produce a través de una red reguladora compleja que
involucra el sistema QS (Mole et al. 2007). El QS permite que las bacterias controlen su densidad
poblacional a través de la secreción y detección de pequeñas moléculas señal llamadas acil
homoserina lactonas (AHL). La proteína acil homoserina lactona sintasa (ExpI) de P. carotovorum
es una acil transferasa que cataliza la reacción entre la S-adenosil metionina y una cadena de acilo
transportada por la proteína acarreadora de acilo (ACP por sus siglas en inglés). En esta reacción,
la cadena de acilo es presentada a la AHL sintasa como un tioéster del grupo prostético
fosfopanteteína-ACP, lo que resulta en un ataque nucleofílico en el carbono 1-carbonilo por la
amina de la SAM en la reacción de acilación. La lactonización se produce mediante otro ataque
nucleofílico en el carbono γ de la SAM por su propio oxígeno carboxílico para producir las AHL
3-oxo-C6-AHL y 3-oxo-C8-AHL, así como los subproductos 5-metil-tioadenosina y holo-ACP
(Watson et al. 2002, von Bodman et al. 2003) (Figura 3).
A la fecha no existe la estructura cristalina de ExpI; sin embargo, se demostró previamente que la
mayoría de los residuos homólogos en secuencias de AHL sintasas se encuentran en la misma cara
de la enzima y se localizan en una hendidura del sitio activo aparente o en el extremo N
desordenado. El resto de los residuos conservados Asp45, Asp48, Arg68, Glu97 y Arg100, se
agrupan en una red de pares de iones que estabilizan la interacción del dominio N-terminal. Se ha
reportado que Ser99 es un residuo clave en el centro de este grupo e interactúa con Arg68 y una
molécula de agua que sirve como puente de unión con Glu97. Ser99 es un aminoácido conservado
en las AHL sintasas tipo Lux y su importancia radica en su capacidad de abstracción de protones
de la amina protonada de SAM mediante la estabilización del ion hidronio putativo lo que provoca
que SAM a su vez interaccione con acil-ACP, dándose el proceso de acilación (Watson et al. 2002).

24
Figura 3. ExpI sintetiza AHL a partir de los sustratos SAM y acil-ACP mediante un proceso de acilación y lactonización.

25
Normalmente, en la mayoría de las bacterias Gram-negativas que utilizan este sistema de
comunicación celular, cuando la concentración de AHL alcanza un nivel umbral, estas interactúan
con proteínas receptoras tipo LuxR para formar un complejo activo con alta afinidad a secuencias
de ADN específicas llamadas "lux boxes". Estas secuencias se encuentran en las regiones
promotoras de varios genes en el regulón del QS y activan la expresión de sus respectivos factores
de virulencia (von Bodman et al. 2003). El factor de virulencia expresado será dependiente del
fitopatógeno y de las características estructurales de la molécula señal sensada ya que hay algunos
fitopatógenos que presentan moléculas señal que difieren significativamente de las AHL (Cuadro
2).
En el caso de P. carotovorum, la proteína receptora (ExpR) no activa la expresión de factores de
virulencia del mismo modo que otras baterías fitopatógenas ya que funciona como un regulador
negativo. ExpR1 y ExpR2 directamente inhiben la virulencia en ausencia de niveles umbral de
AHL por regular positivamente rsmA. RsmA es una proteína que desestabiliza los transcritos de
ARNm que codifican para las exoenzimas celulasa, pectato liasa y proteasa. A una alta
concentración, 3-oxo-C8-AHL se une a ExpR1, mientras que 3-oxo-C6-AHL a ExpR2 y dicha
unión inactiva ambas proteínas receptoras, inhibiendo la expresión de rsmA y dejando libres los
transcritos de ARNm que codifican para las exoenzimas (Põllumaa et al. 2012) (Figura 4). A la
fecha, la mayoría de los estudios se ha enfocado a estudiar como el QS regula la síntesis de
exoenzimas de P. carotovorum así como otros factores de virulencia como producción de
antibióticos y motilidad.
Se sabe que este microorganismo forma biopelículas; sin embargo, no hay estudios que describan
exactamente como es la ruta de regulación. Considerando que varias bacterias patógenas comparten
similitudes genéticas, fisiológicas y de mecanismos de infección es posible hipotetizar como el QS
regula la síntesis de SPE y por lo tanto la formación de biopelículas. En Pantoea stewartii, bacteria
similar a P. carotovorum (en su proceso de infección y regulación de la virulencia), a bajas
concentraciones de AHL (baja densidad celular) EsaR funge como un agente de unión al ADN y
actúa como un represor directo de la transcripción de rcsA, obteniéndose niveles basales de la
proteína RcsA que es sujeta a degradación por la proteasa “Lon”, previniendo la formación
significativa del complejo de activación RcsA/RcsB.

26
 Cuadro 2. Virulencia de bacterias fitopatógenas: sistemas QS, moléculas señal y factores de virulencia.

Sistema
Fitopatógeno Molécula señal QS Factores de virulencia Referencias
QS
Ácido 12-metil-tetradecanoico,
Xylella fastidiosa RpfF/C Motilidad “twitching” y formación de biopelículas Ionescu et al. (2013)
DSF
Agrobacterium
TraI/R 3-oxo-C8-homoserina lactona Conjugación plásmido Ti Gohlke y Deeken (2014)
tumefasciens
Burkholderia
TofI/R Octanoil-homoserina lactona Toxoflavina, lipase y efectores tipo III Kim et al. (2004)
glumae
Pectobacterium ExpI/R, 3-oxo-C6-homoserina lactona,
Exoenzimas y producción de antibióticos Crépin et al. (2012)
carotovorum CarI/R 3-oxo-C8-homoserina lactona
Pectobacterium Venturi et al. (2004);
EamI/R 3-oxo-C6-homoserina lactona Síntesis de levan
amylovorum Koczan et al. (2009)
Pantoea stewartii EsaI/R 3-oxo-C6-homoserina lactona Síntesis de exopolisacáridos Koutsoudis et al. (2006)
Dickeya dadantii ExpI/R 3-oxo-C6-homoserina lactona Producción de exoenzimas y exopolisacáridos Nasser et al. (2013)
Producción de exopolisacáridos, elicitors de
Pseudomonas respuesta hipersensible, productos de genes
AhlI/R 3-oxo-C6-homoserina lactona Quiñones et al. (2005)
syringae antivirulencia, hormonas de crecimiento y
fitotoxinas
Regulacion de respuesta hipersensible, motilidad
Pseudomonas
PcoI/R C6-homoserina lactona “swarming”, fitotoxinas y compuestos Licciardello et al. (2007)
corrugata
antimicrobianos (corpetina A y B y cormicina)
C10 y C12-homoserina
Pseudomonas PfsI/R,
lactona, 3-oxo-C10 y 3-oxo- Fitotoxinas Mattiuzzo et al. (2011)
fuscovaginae PfvI/R
C12-homoserina lactona
Ralstonia Exopolisacáridos , motilidad y formación de
PhcB/A Ácido 3-hydroxi palmítico Wang et al. (2016)
solanacearum biopelículas
Xanthomonas Ácido cis-11-metil-
RpfF/G Síntesis de endoglucanasa, protease y xantana von Bodman et al. (2003)
campestris dodecenoico, DSF
Exopolisacáridos , enzimas extracelulares
Xanthomonas Ácido cis, cis-11-metil-dodeca- Vidaver (2001); He et al.
RpfF/G sideroforos queladores de hierro y efectores de
oryzae 2,5-dienoico, CDSF (2010)
T3SS

27
Figura 4. ExpR1 y ExpR2 regulan negativamente la síntesis de exoenzimas en P. carotovorum a
través de la activación de RsmA.

Contrariamente, a una alta densidad celular, la actividad represora de EsaR se afecta lo que permite
la expresión rápida del gen rcsA y por lo tanto, los niveles de RcsA superan la capacidad de
degradación de “Lon”. RcsA recluta a RcsB para formar un complejo de activación para la
regulación por retroalimentación positiva de rcsA y la activación del grupo de genes cps,
relacionados con la síntesis de exopolisacáridos (Minogue et al. 2005) (Figura 5). Como se puede
observar, la presencia de AHL determina la activación de la síntesis de factores de virulencia a
través del efecto regulador de EsaR; es por esto que la proteína sintasa, encargada de la síntesis de
AHL, es una enzima clave en el desarrollo de virulencia de P. carotovorum. Esto ha sido
confirmado por Lee et al. (2013) quienes reportaron que cepas mutantes del gen expI no produjeron
exoenzimas y se redujo la formación de biopelículas en un 77%. De manera similar, en P.
atroscepticum la supresión del gen expI provocó una disminución de la abundancia de transcritos
de las exoenzimas (pnl, pel, peh, pme, cel y prt).

28
Figura 5. El QS regula la síntesis de polisacáridos en P. stewartii a través de la activación de la
expresión de genes cps.

Por otra parte, von Bodman et al. (2003) encontraron que la supresión de este gen en P.
carotovorum eliminaba la síntesis de AHL y la producción de SPE, lo cual se reflejó directamente
en una reducción de la virulencia debido a que estos bloquean los xilemas de las plantas y causan
marchitamiento. Por lo tanto, se han buscado compuestos que inhiban la síntesis de AHL a través
de la afectación de la proteína sintasa. Esto ha sido confirmado por Lee et al. (2013) quienes
reportaron que cepas mutantes del gen expI no produjeron exoenzimas y se redujo la formación de
biopelículas en un 77%. De manera similar, en P. atroscepticum la supresión del gen expI provocó

29
una disminución de la abundancia de transcritos de las exoenzimas (pnl, pel, peh, pme, cel y prt).
Por otra parte, von Bodman et al. (2003) encontraron que la supresión de este gen en P.
carotovorum eliminaba la síntesis de AHL y la producción de SPE, lo cual se reflejó directamente
en una reducción de la virulencia debido a que estos bloquean los xilemas de las plantas y causan
marchitamiento. Por lo tanto, se han buscado compuestos que inhiban la síntesis de AHL a través
de la afectación de la proteína sintasa.

2. 4. Extractos de Plantas y sus Principales Compuestos Atenúan la Virulencia de Bacterias

Fitopatógenos

Los extractos de plantas han sido utilizados desde la antigüedad para el control de infecciones
causadas por patógenos y han atraído la atención por sus propiedades antimicrobianas y anti-QS
(Ortega‐Ramirez et al. 2014). Estos presentan un variado contenido de compuestos fitoquímicos
(compuestos fenólicos, flavonoides, terpenos, terpenoides, etc.) que actúan como antibióticos
naturales y muestran baja toxicidad. Los extractos de plantas se han estudiado extensamente debido
a su capacidad para afectar la virulencia de patógenos humanos (Ahmer 2004, Joshi et al. 2015);
sin embargo, se ha realizado poca investigación con patógenos de plantas. Los extractos de plantas
medicinales, hierbas y especias, así como sus constituyentes principales actúan como agentes
inhibidores del QS, lo que resulta en la inhibición de la motilidad, la adhesión, la síntesis y
secreción de SPE, la síntesis de toxinas y formación de biopelículas de fitopatógenos (Ahmer 2004,
Gutierrez-Pacheco et al. 2018). Estos compuestos presentan diferentes mecanismos de acción y
por lo tanto pueden atacar diferentes puntos del QS.
Se ha reportado que los flavonoides sintetizados por plantas de tomate después de la infección por
P. syringae reducen la motilidad y la expresión del T3SS relacionado con la liberación de factores
de virulencia o proteínas efectoras dentro de las células de las plantas (Vargas et al. 2013). Por otra
parte, la miel de castaño y su extracto acuoso a 200 mg/mL redujeron significativamente la
formación de biopelículas de P. carotovorum en un 53.2 y un 66.4%, respectivamente; además,
esta concentración redujo la producción de 3-oxo-C6-AHL en un 45-50% (Truchado et al. 2009).
Lagonenko et al. (2013) reportaron que el ácido salicílico inhibió la formación de biopelículas, la

30
motilidad y la síntesis de AHL de P. carotovorum y P. syringae a concentraciones de 25 y 50 mM,
respectivamente.
Pocos estudios se han centrado en el potencial de los aceites esenciales de plantas y sus
constituyentes principales para inhibir los mecanismos del QS y la síntesis de factores de virulencia
de fitopatógenos. Se reportó previamente que los aceites esenciales de canela, lavanda, eucalipto y
tomillo (0.25-1 ppm) redujeron significativamente la formación de biopelículas y la motilidad
(swimming, swarming y twitching) de R. solanacearum (Hosseinzadeh et al. 2013). El
cinamaldehído, principal terpeno del aceite esencial de canela, redujo la concentración de C6-AHL
en P. carotovorum a una concentración de 0.05 mg/mL (Truchado et al. 2012). Por otro lado, Joshi
et al. (2016) evaluaron el efecto de eugenol (250 µM) sobre P. carotovorum subsp. brasilense y
observaron una reducción en la formación de biopelículas y la expresión de genes de exoenzimas
(pel, peh, prt), reduciendo la infección de los tejidos de plantas. Zhang et al. (2018) informaron
que carvona, carvacrol, citral, geraniol, timol, eugenol y cinamaldehído a concentraciones de 0.1
mg/mL inhibieron significativamente la motilidad (swimming, swarming y twitching), síntesis de
SPE y formación de biopelículas de P. carotovorum. Además, estos autores hipotetizaron que el
efecto de los terpenoides podría atribuirse a una inhibición del QS, debido a la reducción de la
síntesis de violaceína en la cepa biosensora Chromobacterium violaceum (CV026) expuesta los
tratamientos.
Los mecanismos propuestos de estos compuestos naturales para interrumpir el QS se han
relacionado con una inhibición de la expresión génica y de la actividad de las enzimas productoras
y sensoras de moléculas señal, y con una interacción directa con la molécula señal. Sin embargo,
estos compuestos deben tener afinidad estérica y electroestática con las posibles dianas moleculares
antes mencionadas. Es bien sabido que en la mayoría de las bacterias Gram-negativas, las proteínas
sintasas y receptoras se encuentran en el citoplasma; por lo que los compuestos inhibidores deben
atravesar una serie de barreras para poder llegar a cumplir su acción.
Por lo tanto, los compuestos inhibidores deben tener un cierto tamaño y polaridad para atravesar la
membrana e interaccionar con estas proteínas. Además, se ha reportado que algunos compuestos
vegetales, debido a sus características moleculares como la anfipaticidad, pueden interactuar con
proteínas a través de interacciones hidrófobicas o puentes de hidrógeno (Chang et al. 2014). Hay
varias formas en las que compuestos de esta naturaleza podrían interaccionar con estas proteínas:
interacción con el sitio activo o en cualquier otro lugar que produzca cambios estructurales y afecte

31
su función. Como se mencionó anteriormente, un factor importante dentro del QS es la síntesis de
AHL por la sintasa ExpI; por lo tanto, los compuestos naturales pueden ser dirigidos a interferir
con el reconocimiento del sustrato por la enzima.

2.5. Carvacrol como Inhibidor de la Comunicación Intercelular, Formación de Biopelículas y

Síntesis de Exoenzimas

El carvacrol es un compuesto terpenoide presente en el aceite esencial de orégano al cual se le ha

atribuido un alto potencial antimicrobiano (Tapia-Rodriguez et al. 2017). Esto se ha relacionado a
sus características hidrofóbicas (Log P= 3.49) las cuales le permiten embeberse en la membrana
celular, provocando su desestabilización, pérdida de constituyentes celulares y la muerte celular
(Gutierrez-Pacheco et al. 2018). Se ha reportado que el carvacrol reduce la síntesis de factores de
virulencia de diversas bacterias patógenas; sin embargo, la información acerca de su efecto en
fitopatógenos es escasa. Burt et al. (2014) reportaron que el carvacrol redujo la formación de
biopelículas de C. violaceum, S. Typhimurium y S. aureus (a una concentración subinhibitoria <0.5
mM). Adicionalmente, el carvacrol redujo la expresión del gen cviI (que codifica para AHL
sintasa), producción de violaceína y actividad de quitinasa (regulados por el QS) a concentraciones
que coinciden con el efecto inhibidor del carvacrol sobre la formación de la biopelícula. Por otra
parte, Tapia-Rodriguez et al. (2017) observaron una reducción en la formación de biopelículas,
producción de piocianina y AHL en P. aeruginosa a concentraciones entre 0.9-3.9 mM y este efecto
fue atribuido a un posible efecto del carvacrol sobre la expresión del gen lasR y un efecto
postraduccional sobre la proteína sintasa LasI.
Aunque existe poca evidencia acerca del carvacrol sobre los patógenos de plantas y aún menos
sobre P. carotovorum, hay estudios donde se reporta que el carvacrol afecta la síntesis de algunos
factores de virulencia de P. carotovorum subsp. brasilense (Joshi et al. 2016). Estos autores
concluyen que el efecto inhibitorio del carvacrol podría ser atribuido a una afectación del sistema
QS, particularmente en las proteínas ExpI/ExpR. A la fecha no se ha purificado ni cristalizado la
proteína ExpI de P. carotovorum; sin embargo, en base a proteínas homólogas como EsaI de P.
stewartii ha sido posible hipotetizar sobre los posibles lugares de unión con el carvacrol. Algunos
puntos clave durante este proceso son el reconocimiento de la cadena de acilo, así como la presencia

32
del aminoácido Ser99 en el centro catalítico. Este es un residuo clave ya que interacciona
directamente con Arg68 y forma un puente con una molécula de agua directamente unida a Glu97,
además de ser un aminoácido conservado en la familia de las AHL sintasas. Previamente se reportó
que la cadena de acilo encaja perfectamente en una cavidad hidrofóbica en la estructura de EsaI e
interactúa con los residuos conservados Ser98, Met126, Thr140, Val142, Met146 y Leu176 que
alinean esta cavidad y la colocan en la orientación adecuada para la catálisis (Figura 6) (Watson et
al. 2002).
Se ha reportado que J8-C8 (N-(3-oxociclohex-1-enil) octanamida), compuesto estructuralmente
similar al carvacrol, inhibió la síntesis de AHL debido a su capacidad para interaccionar con la
proteína sintasa TofI del fitopatógeno Burkholderia glumae. El análisis de la estructura cristalina
de rayos X mostró que este compuesto se une a TofI y ocupa el sitio de unión de la cadena de acilo.
Por otra parte, mediante modelaje molecular se demostró que el trans-cinamaldehído interacciona
con Phe27 y Trp33 de la AHL sintasa LasI de P. aeruginosa y forma un enlace de hidrógeno con
Arg30 (Chang et al. 2014). Además, forma interacciones hidrofóbicas y Pi-Pi con Phe105 ubicado
en el túnel hidrofóbico abierto; mientras que en EsaI (de P. stewartii), se forman dos enlaces de
hidrógeno con Arg100 y Phe101 (Chang et al. 2014). Estos residuos se conservan entre la familia
LuxI, lo que sugiere que moléculas similares podrían interactuar con AHL sintasas de
fitopatógenos.
A pesar de que existen estudios previos sobre el efecto del carvacrol sobre los factores de virulencia
en diferentes bacterias patógenas, es importante resaltar que se desconoce cuál es su efecto en P.
carotovorum subsp. carotovorum. Por lo tanto surge la interrogante de ¿cuál es el efecto del
carvacrol sobre el proceso de formación de biopelículas, síntesis de exoenzimas y otros factores de
virulencia de P. carotovorum subsp. carotovorum? y como se relaciona esto con la reducción en la
síntesis de AHL. Basándonos en la importancia de las AHLs en la expresión de factores de P.
carotovorum y considerando la evidencia previa que muestra el efecto anti-QS del carvacrol, es
posible hipotetizar que dadas sus características químico-estructurales y actividad, este pueda
afectar la síntesis de AHL por una posible interacción con la proteína ExpI.

33
Figura 6. Cavidad hidrofóbica de ExpI donde se lleva a cabo el reconocimiento de la cadena de acilo transportada por ACP y el proceso
de N-acilación mediante el ataque nucleofílico entre el grupo amino desprotonado de SAM y el 1-carbono carbonilo de la cadena de
acilo. Los aminoácidos conservados e implicados en el reconocimiento a sustrato y catálisis se muestran en colores. Modificado de
Watson et al. (2002).

34
 3. HIPÓTESIS

El carvacrol presenta un efecto inhibitorio sobre la producción de exoenzimas y formación

de biopelículas de Pectobacterium carotovorum atribuido al bloqueo en la síntesis de AHL.

35
 4. OBJETIVOS

4. 1. Objetivo General

Evaluar el efecto del carvacrol sobre el proceso de formación de biopelículas, síntesis de

exoenzimas, motilidad y síntesis de acil homoserina lactonas de P. carotovorum.

4. 2. Objetivos Específicos

Analizar el efecto del carvacrol sobre el proceso de formación de biopelículas de P. carotovorum.

Determinar el efecto del carvacrol sobre la producción de exoenzimas de P. carotovorum.
Determinar el efecto del carvacrol sobre la síntesis de AHL de P. carotovorum.

36
 5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Etapa 1: Evaluación del Efecto del Carvacrol Sobre el Proceso de Formación de Biopelículas
de P. carotovorum.

5.1.1. Determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI), Bactericidas

(CMB) y de Formación (CMIB) y Erradicación (CMEB) de Biopelículas de Pectobacterium
carotovorum Expuestas a Carvacrol

La actividad antibacteriana del carvacrol (98% purity, Sigma Aldrich, EE. UU.) contra
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (ATCC 15713) se evaluó mediante la
determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y bactericida (CMB) (NCCLS 2001),
con algunas modificaciones. Para el ensayo, se disolvieron diferentes concentraciones de carvacrol
(0-6.65 mM) en caldo Luria Bertani (LB) con etanol (5%, para mejorar la disolución).
Posteriormente, se inocularon los tubos con P. carotovorum a una concentración de 1×106
UFC/mL, se mezclaron y se incubaron a 28 °C por 24 h. La CMI se determinó como la
concentración más baja de carvacrol que inhibió el crecimiento visual de las bacterias inoculadas.
De los tubos sin crecimiento visible, se colocaron 20 µL en placas de agar LB y la concentración
más baja con ausencia de viabilidad se consideró como la CMB. Adicionalmente, se determinó una
concentración de carvacrol (por debajo de la CMI) que no afectara la viabilidad celular (con la
finalidad de determinar su posible mecanismo de acción), midiendo la densidad óptica (DO) a 600
nm en un lector de microplacas FLUOstar OMEGA (BMG Labtech, Chicago, IL, EE. UU.) durante
24 h a 28 °C.
Por otro lado, las concentraciones de carvacrol necesarias para inhibir y erradicar las biopelículas
de P. carotovorum se clasificaron como CMIB y CMEB, respectivamente (Chamdit y Siripermpool
2012). Para la CMIB, se formaron biopelículas en cupones de polipropileno (1×1×0.1 cm)
(Wenco®) completamente sumergidos en 6 mL de caldo LB que contenía diferentes
concentraciones de carvacrol (0–2.66 mM) que no afectaron la viabilidad del inóculo. Los tubos se
inocularon con 1×106 CFU/mL de P. carotovorum y se incubaron a 28 °C durante 24 h.
Posteriormente, los cupones se retiraron, se lavaron con solución salina estéril (2 mL) y se

37
sonicaron durante 5 min (40 kHz, Branson 2510 sonicator, CT, EE.UU.) en 3 mL de solución salina
estéril. Se realizaron diluciones en serie, se inocularon en placas de agar LB y se incubaron a 28
°C por 24 h. La concentración mínima a la cual no se recuperaron células adheridas de los cupones
se consideró como el CMIB.
Para determinar la CMEB del carvacrol se formaron biopelículas como se mencionó anteriormente,
en caldo LB sin carvacrol durante 24 h, se lavaron los cupones con solución salina estéril para
eliminar las células débilmente adheridas y luego se expusieron (30 min) a diferentes
concentraciones de carvacrol (0–6.65 mM). Los cupones se sonicaron en 3 mL de solución salina
estéril, se diluyeron en serie, se sembraron en agar LB y se incubaron a 28 ºC por 24 h. La
concentración mínima donde no se detectaron células viables adheridas se consideró como la
CMEB. Los experimentos se realizaron por triplicado.

5.1.2. Efecto del Carvacrol sobre la Motilidad de P. carotovorum

Con el propósito de observar cambios en la motilidad de P. carotovorum por efecto del carvacrol,
se utilizó la concentración de 0.66 mM (concentración seleccionada en el ensayo antibacteriano
descrito en la sección 4.1.1.) y se determinó la motilidad tipo swimming en placas con agar LB
semisólido (Hossain, Shibata, Aizawa y Tsuyumu, 2005). Para esto, se inocularon 20 μL de 1×106
UFC/mL de P. carotovorum crecido en ausencia (control) y presencia de carvacrol (0.66 mM) en
el centro de una placa de agar LB semisólido (0.3%). Posteriormente, las placas se incubaron a 28
°C y se midió el área de motilidad después de 24 h de incubación, expresando los resultados en
mm. El experimento se realizó por triplicado.

5.1.3. Carga Superficial Bacteriana de P. carotovorum Expuesta a Carvacrol

Se llevaron a cabo experimentos de potencial zeta (Nano-ZS 90, Malvern instrument, Malvern,
UK) con la finalidad de evaluar cambios en la carga superficial bacteriana después de la exposición

38
a carvacrol. Para el ensayo, 1×106 UFC/mL de P. carotovorum se inocularon en tubos conteniendo
6 mL de caldo LB y carvacrol (0.66 mM) y se incubaron a 28 ºC por 24 h. Después, los cultivos se
centrifugaron a 6000 × g por 10 min, se lavaron dos veces y se re-suspendieron en agua estéril; la
suspensión de células no tratadas se usó como control y los resultados se expresaron como
milivoltios (mV). Todos los experimentos se realizaron por triplicado a 25 ºC.

5.1.4. Energía Libre de Adhesión de P. carotovorum Expuesta al Carvacrol

El proceso de adhesión bacteriana a superficies abióticas se puede predecir mediante un enfoque

termodinámico calculando el cambio en la energía libre de adhesión (ΔGadh) (Absolom et al. 1983).
Este se puede estimar a partir de la energía superficial de las bacterias (γbv), la superficie de
adhesión (γsv) y el entorno donde realizan este proceso (γlv) (el superíndice v representa la fase de
vapor en la que se determina la energía de la superficie), utilizando la siguiente fórmula (Kwok y
Neumann 1999):

𝑏𝑏𝑏𝑏 𝛾𝛾𝑙𝑙𝑙𝑙 )2 𝑠𝑠𝑠𝑠 𝛾𝛾𝑙𝑙𝑙𝑙 )2 𝑏𝑏𝑏𝑏 𝛾𝛾𝑠𝑠𝑠𝑠 )2

∆𝐺𝐺𝑎𝑎𝑎𝑎ℎ = 2�𝛾𝛾 𝑏𝑏𝑏𝑏 𝛾𝛾 𝑙𝑙𝑙𝑙 𝑒𝑒 −𝛽𝛽 (𝛾𝛾 + 2�𝛾𝛾 𝑠𝑠𝑠𝑠 𝛾𝛾 𝑙𝑙𝑙𝑙 𝑒𝑒 −𝛽𝛽 (𝛾𝛾 − 2�𝛾𝛾 𝑏𝑏𝑏𝑏 𝛾𝛾 𝑠𝑠𝑠𝑠 𝑒𝑒 −𝛽𝛽 (𝛾𝛾 − 2𝛾𝛾 𝑙𝑙𝑙𝑙

La energía superficial de la solución salina (γlv) y el polipropileno (γsv) utilizados en los

experimentos de adhesión fue de 65.3 y 48.17 mJ/m2, respectivamente. Estos se determinaron con
un tensiómetro (CSC-Du Nouy, No. 70535) y mediante el método de gota sésil usando un
goniómetro óptico CAM-Plus Micro, Tantec (Schaumburg, IL, EE. UU.), en conjunción con la
ecuación de estado de Neumann (Kwok y Neumann 2000), respectivamente.
La energía superficial de P. carotovorum (γbv) se determinó mediante el método
espectrofotométrico descrito por Vazquez-Armenta et al. (2018). Este método se basa en el análisis
de la estabilidad coloidal de las suspensiones bacterianas. El nivel de dispersión de las células en
el fluido se puede determinar midiendo la DO de la suspensión, ya que una mayor DO se relaciona

39
con menos sedimentación y mayor dispersión. Para el procedimiento experimental, se preparó un
inóculo de P. carotovorum a partir de un cultivo en fase exponencial (18 h a 28 °C). El cultivo se
centrifugó a 3600 x g durante 3 min y el sedimento se lavó con solución salina (3 veces). Luego,
las células bacterianas se resuspendieron en solución salina (1 mL), se agitaron por 1 min y se
sonicaron (1 min) para obtener una suspensión homogénea de aproximadamente 1x1010 UFC/mL.
Posteriormente, para observar el efecto del carvacrol sobre la energía de adhesión de P.
carotovorum, la suspensión bacteriana se puso en contacto con 0.66 mM de carvacrol durante 2 h,
se centrifugó a 3600 x g durante 3 min y también se resuspendió en solución salina (1 mL) para
obtener la misma concentración de inóculo. Por otro lado, se determinaron los valores de tensión
superficial de 11 mezclas binarias de etanol-agua (100: 0, 90:10, 70:30, 40:60, 20:80, 10.8:89.2,
7:93, 4:96, 1.8:98.2, 0.6:99.4 y 0:100 v/v) con un tensiómetro para obtener valores entre 23 y 76
mJ/m2. Posteriormente, se tomaron 100 µL de las suspensiones de P. carotovorum (no expuestas y
expuestas a carvacrol) y se mezclaron con 500 µL de cada solución, se agitaron en vórtex y se
mantuvieron a 25 ºC durante 20 min. Luego, las suspensiones se centrifugaron a 200 × g durante 6
min para eliminar los sedimentos del sobrenadante.
Finalmente, se tomaron 150 μL de cada suspensión y se transfirieron a una microplaca de
poliestireno de 96 pozos (COSTAR®, NY, EE. UU.) y se leyó la DO en un lector de microplacas
a una longitud de onda de 600 nm. La DO de las suspensiones se representó en función de sus
respectivos valores de tensión superficial y el valor máximo de dispersión se determinó mediante
un ajuste polinomial de tercer orden (Zhang et al. 2015). Las lecturas de absorbancia se realizaron
por triplicado, mientras que todo el experimento se repitió dos veces y los resultados se expresaron
como mJ/m2. A partir de la energía superficial de las bacterias (expuestas o no al carvacrol) (γbv),
la superficie de adhesión (polipropileno) (γsv) y el entorno en el que llevan a cabo este proceso
(solución salina) (γlv), se calculó el ΔGadh entre las bacterias y la superficie de polipropileno usando
la ecuación antes mencionada.

40
5.1.5. Efecto del Carvacrol sobre la Formación de Biopelículas y Secreción de SPE de P.
carotovorum

El efecto del carvacrol y el tiempo de incubación en la formación de biopelículas de P. carotovorum

se evaluó midiendo las células viables adheridas a cupones de polipropileno. Para el ensayo, se
inocularon 6 mL de caldo LB (conteniendo carvacrol a una concentración de 0.66 mM) con 1x106
UFC/mL de P. carotovorum y se incubaron a 28 °C por 24 h. Posteriormente, a diferentes tiempos
de incubación (0.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24 y 48 h), los cupones se retiraron, se lavaron con solución salina
estéril (2 mL) y se sonicaron (40 kHz) durante 5 min en 3 mL de solución salina estéril. Se
realizaron diluciones en serie, se cultivaron en agar LB incubando a 28 °C durante 24 h. El análisis
se realizó por triplicado y los resultados se expresaron como log UFC/cm2. Por otra parte, se
formaron biopelículas en placas de poliestireno para permitir el análisis de microscopía óptica a las
2, 6, 12 y 24 h de incubación a 28 °C; cada muestra se tiñó con una solución de cristal violeta al
0,1%, se fijó durante 10 min, se lavó para eliminar el exceso de tinte y se secó antes de la
observación a un aumento de 600x utilizando un microscopio invertido Axiovert (Carl Zeiss, NY,
EE. UU.).
Se evaluó el efecto del carvacrol y el tiempo de incubación en la síntesis de SPE durante la
formación de biopelícula. Se extrajeron las SPE después del lavado de las superficies de
polipropileno con solución salina estéril (2 mL) para eliminar las células adheridas débilmente.
Luego, las superficies se introdujeron en tubos que contenían 5 mL de agua destilada y se agregaron
30 μL de formaldehído y se dejaron a 4 °C durante 1 h. Posteriormente, se agregaron 2 ml de NaOH
(1 N) a los tubos, se sonicaron durante 10 min (40 kHz) y se almacenaron a 4 °C durante 3 h.
Finalmente, la solución de SPE se filtró a través de una membrana de 0.2 µm, se purificó con una
membrana de diálisis de celulosa (3500 Da) (Sigma Aldrich, Pierce, EE. UU.) a 4 °C durante 24 h
y la fracción > 3500 Da se liofilizó a -150 °C durante 48 h para su posterior análisis (Liu y Fang
2002).
El contenido de polisacáridos se determinó mediante el método de microplaca establecido por
Masuko et al. (2005) con algunas modificaciones. Para el ensayo, la muestra de SPE se disolvió en
50 μL de agua ultrapura (Milli-Q®), se mezcló con 150 μL de ácido sulfúrico concentrado y 30 μL
de fenol al 5% (p/v) en una microplaca de poliestireno de 96 pocillos. Posteriormente, la microplaca
se incubó durante 5 min a 90 °C en un baño de agua estático y se enfrió a temperatura ambiente
41
durante otros 5 min. La absorbancia se registró a 490 nm en un lector de microplacas y los
resultados se expresaron como μg de equivalentes de glucosa por cm2 (μg EG/cm2) en base a una
curva estándar de glucosa usando la ecuación y= 0.0091x-0.2688. Por otro lado, el contenido de
proteínas se determinó utilizando el método de Bradford (Bradford 1976). Para el ensayo, se
agregaron 120 μL de solución de SPE a una microplaca de 96 pocillos por triplicado y,
posteriormente, se agregaron 30 μL de reactivo de Bradford a cada pocillo. La DO se midió a 562
nm en un lector de microplacas y los resultados se expresaron en μg de equivalentes de albúmina
por cm2 (μg EA/cm2) en base a una curva estándar de albúmina de suero bovino usando la ecuación
y= 0.016232x-0.09231. Los experimentos se realizaron por duplicado.

5.1.6. Análisis Estadístico

Se utilizó un diseño por bloques completos al azar para evaluar el efecto del carvacrol y el tiempo
de incubación (0.5, 2, 4, 6, 12, 24 y 48 h, el cual se bloqueó para observar el efecto del carvacrol)
en la adhesión celular (log CFU/cm2), contenido de polisacáridos (μg EG/cm2) y proteínas (μg
AE/cm2) en las biopelículas. Por otra parte, se aplicó un diseño completo al azar para evaluar el
efecto del carvacrol sobre la motilidad (mm), la carga superficial bacteriana (mV), la energía
superficial (mJ/m2) y el potencial de adhesión (ΔGadh). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA)
(p≤0.05) para estimar las diferencias significativas y se aplicó la prueba de Tukey para la
comparación de medias (p≤0.05) utilizando el software estadístico NCSS 2007.

5.2. Etapa 2: Efecto del Carvacrol Sobre la Producción de Exoenzimas de P. carotovorum

5.2.1. Inhibición de la Actividad de Exoenzimas de P. carotovorum Expuesta a Carvacrol

Con la finalidad de evaluar si el carvacrol inhibe la producción de exoenzimas de P. carotovorum,

se determinó la actividad de pectato liasa, poligalacturonasa y pectin metil esterasa en el medio de
cultivo libre de células. La actividad poligalacturonasa se determinó midiendo la liberación de

42
azucares reductores por la hidrólisis del ácido poligalacturónico (PGA) usando el reactivo ácido
dinitrosalicílico (DNS) reportado por Miller (1959). Para esto, se hizo crecer P. carotovorum
(1x106 UFC/mL) en presencia de carvacrol (0.66 mM) por 24 h a 37 °C y después los cultivos se
centrifugaron a 10000 x g por 15 min a 4 ºC. Se tomaron 100 µL de los sobrenadantes y se
mezclaron con 200 µL de PGA (0.5% v/v) en Tris-HCl 50 mM (pH 8) y se incubaron a 40 °C por
30 min. La absorbancia del producto de reacción (azúcar reductor) se cuantificó a 540 nm usando
ácido D-galacturónico como estándar. Una unidad de actividad enzimática (U) se definió como la
cantidad de enzima requerida para liberar 1 µmol de ácido D-galacturónico por min.
La actividad pectato liasa se determinó midiendo los oligosacáridos insaturados liberados como
resultado de la rotura del PGA usando ácido tiobarbitúrico (TBA). Para esto, 100 µL de los
sobrenadantes se agregaron a 500 µL de PGA (0.5% v/v) en Tris-HCl 50 mM (pH 8) conteniendo
0.5 mM de CaCl2 y se incubaron a 50 °C por 1 h. La reacción de detuvo poniendo las muestras en
hielo y posteriormente se midió la absorbancia de la reacción con TBA a 550 nm. Una (U) se
definió como la cantidad de enzima que causa el cambio de 0.01 en la absorbancia (Shau-Ping et
al. 1985). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se cuantificó el contenido de
proteína por el método de Bradford (Bradford 1976), expresando los resultados como U/mg de
proteína.

5.2.2. Análisis de Modelaje Molecular Entre el Carvacrol y las Exoenzimas de P. carotovorum

Con la finalidad de poder atribuir el efecto inhibitorio del carvacrol a una reducción en la síntesis
de exoenzimas y no a una inhibición enzimática por interacción con las mismas, se determinó si
existen interacciones entre el carvacrol y el sitio catalítico de las enzimas poligalacturonasa y
pectato liasa. Para esto, se usaron las estructuras cristalográficas de la poligalacturonasa (PDB
1BHE) de P. carotovorum y un modelo estructural de pectato liasa (construido en el software
Homology/analogY Recognition Engine V. 2.0, Phyre2, a partir de la secuencia aminoacídica
reportada la proteína). El mejor modelo seleccionado fue el de pelC de D. chrysanthemi con la cual
mostró un 75% de identidad. El análisis de acoplamiento molecular se realizó utilizando la
aplicación AutoDock Vina para obtener la energía de afinidad (kcal/mol) utilizando el software
UCSF Chimera versión 11.2. Una vez obtenida la mejor pose (menor energía), se utilizó el software

43
Discovery Studio para identificar los aminoácidos y el tipo de interacción entre las proteínas y el
carvacrol (Pettersen et al. 2004).

5.2.3. Efecto del Carvacrol sobre la Patogenicidad In Vivo de P. carotovorum en Tejidos de

Papa

Con la finalidad de determinar el efecto del carvacrol en la incidencia de la enfermedad causada

por P. carotovorum, se llevó a cabo un ensayo de patogenicidad in vitro en base a la metodología
reportada por Dong et al. (2004), con algunas modificaciones. Para esto, se obtuvieron papas de
un mercado local, las cuales fueron desinfectadas sumergiéndolas por 30 min en una solución
clorada (200 ppm), enjuagadas con agua destilada estéril, rociadas con etanol al 70% y sacadas a
temperatura ambiente. Posteriormente, se cortaron en rebanadas de 4-5 mm de grosor y se les hizo
una pequeña incisión en el centro donde fueron inoculadas con 20 µL de 1x106 UFC/mL de P.
carotovorum (cultivado en ausencia y presencia de 0.66 mM de carvacrol). Además, se evaluó el
efecto del carvacrol en fase de vapor, colocando el compuesto en discos de papel de 0.5 cm de
diámetro. Los tejidos se colocaron en placas Petri conteniendo papel filtro humedecido con agua
destilada estéril para favorecer un ambiente húmedo y se incubaron a 28 ºC por 24, 48, 72 y 96 h.
Se determinó visualmente el % de tejido dañado y se cuantificó la carga bacteriana mediante conteo
en placa. El experimento se realizó por triplicado y los resultados se expresaron como % de tejido
dañado y log UFC/g de muestra.

5.2.4. Análisis Estadístico

Se realizó un diseño completo al azar para evaluar el efecto del carvacrol sobre la actividad
poligalacturonasa, pectato liasa y pectin metil esterasa expresada como U/mg de proteína, así como
sobre la maceración en tejidos de papa (%) y carga bacteriana (log UFC/g). Se realizó un análisis
de varianza (ANOVA) (p≤0.05) para estimar las diferencias significativas y se aplicó la prueba de
Tukey para la comparación de medias (p≤0.05) utilizando el software estadístico NCSS 2007.

44
 5.3. Etapa 3: Efecto del carvacrol sobre la proteína ExpI encargada de la síntesis de AHL

5.3.1. Producción de AHLs por P. carotovorum expuesto a carvacrol

Con la finalidad de determinar el efecto del carvacrol sobre el QS de P. carotovorum se cuantificó

el contenido de AHLs en cultivos expuestos a carvacrol mediante cromatografía líquida de ultra
eficiencia acoplada a un detector de arreglo de diodos (UPLC-PDA por sus siglas en inglés). Para
esto, se partió de cultivos de P. carotovorum (18 h), de los cuales se inoculó 1x106 UFC/mL en
tubos con caldo LB (35 mL) adicionados con 0.66 mM de carvacrol, los cuales se incubaron a 28
ºC por 24 h. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron a 10000 x g por 15 min a 4 ºC en una
centrífuga Allegra 64R (Hettich, Tuttlingen, Alemania). Los sobrenadantes se filtraron (0.22 µm)
y las AHL se extrajeron dos veces (1:1) con etil acetato acidificado (0.1% de ácido fórmico). Las
fases orgánicas se juntaron y evaporaron a sequedad a 30 ºC. Posteriormente, los sólidos se
disolvieron en 1 mL de metanol para su posterior análisis.
El análisis de las AHLs se llevó a cabo en un cromatógrafo Waters UPLC (Milford, MA, EUA)
equipado con un detector de arreglo de diodos 2996 y una columna BEH C18 (1.7 µm, 100 mm x
3 mm). La temperatura del termostato de la columna y del muestreador automático se ajustó a 60
ºC y 27 ºC, respectivamente. El caudal fue de 0.5 mL/min y el volumen de inyección de 5 µL. Las
fases móviles (A y B) fueron agua y metanol acidificados al 0.1% con ácido acético glacial,
respectivamente. Se aplicó un gradiente lineal comenzando con B al 20%, el cual se incrementó a
100% en 5 min. La longitud de onda de detección se estableció en 198 nm. La identificación se
realizó comparando los tiempos de retención con los estándares 3-oxo-C6-AHL y 3-oxo-C8-AHL
y sus espectros de absorción UV; mientras que la cuantificación se realizó utilizando una curva
estándar de 10 puntos de las moléculas correspondientes. El experimento se realizó por triplicado
y los resultados se expresaron como µM de AHL.
5.3.2. Análisis de Modelaje Molecular de ExpI con Carvacrol

45
El modelo estructural de ExpI se construyó utilizando el software Protein Homology/analogY
Recognition Engine V 2.0 (Phyre2) a partir de la secuencia proteica depositada en la base de datos
UniProt (número de acceso: A8DB99). El mejor modelo seleccionado fue el de EsaI (homoserina
lactona sintasa) de P. stewartii (43% de identidad de secuencia; PDB 1KZF) como la estructura de
referencia. El análisis de acoplamiento molecular se realizó utilizando la aplicación AutoDock
Vina para obtener la energía de afinidad (kcal/mol) y la desviación de la raíz cuadrada de la media
(RMSD) entre ExpI y SAM (ligando natural) y carvacrol (inhibidor) utilizando el software UCSF
Chimera versión 11.2. Una vez obtenida la mejor pose (menor energía), se utilizó el software
Discovery Studio para identificar los aminoácidos y el tipo de interacción entre ExpI y carvacrol
(Pettersen et al. 2004).

5.3.3. Análisis Estadístico

Se realizó un diseño completo al azar para evaluar el efecto del carvacrol sobre la síntesis de AHL
(mM). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) (p≤0.05) para estimar las diferencias
significativas entre los tratamientos utilizando el software estadístico NCSS 2007.

46
 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Etapa 1: Evaluación del Efecto del Carvacrol sobre el Proceso de Formación de Biopelículas
de P. carotovorum.

6.1.1. Determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI), Bactericidas

(CMB) y de Formación (CMIB) y Erradicación de Biopelículas de Pectobacterium
carotovorum Expuestas a Carvacrol

Se evaluó el efecto antibacteriano del carvacrol contra células plantónicas de P. carotovorum y se

determinó que la CMI del crecimiento planctónico fue de 2.66, mientras que la concentración
mínima para matar las células fue de 3.99 mM. Se ha hipotetizado que el mecanismo antibacteriano
del carvacrol es atribuido a su naturaleza lipofílica (logP=3.49), la cual favorece su inclusión dentro
de la membrana bacteriana causando una expansión, alteración de sistemas enzimáticos y pérdida
de constituyentes celulares (Burt 2004). Tapia-Rodriguez et al. (2017) reportaron una CMI y CMB
de 3.9 y 8.6 mM de carvacrol contra P. aeruginosa; mientras que Olasupo et al. (2003) reportó que
el carvacrol a una concentración de 1.5 mM mostró mayor actividad antibacteriana contra E. coli
que compuestos menos hidrofóbicos como el ácido cinámico (5.0 mM) y eugenol (2.5 mM). La
efectividad antibacteriana del carvacrol con respecto a estos y otros compuestos fenólicos puede
estar relacionado con una menor lipofilicidad (logP de 2.13 y 2.4, respectivamente) comparado con
el carvacrol.
Por otro lado, se necesitó una concentración de carvacrol de 1.33 mM para inhibir el proceso de
formación de biopelículas, mientras que la concentración mínima para erradicar biopelículas
preformadas fue de 3.99 mM. Las diferencias observadas entre la CMI y CMIB es atribuida a que
en el caso de la CMI, son necesarias concentraciones más altas para afectar el crecimiento
bacteriano, mientras que para CMIB, es necesaria una dosis baja que no afecte el crecimiento
bacteriano sino solo los mecanismos por los cuales se da el proceso de formación de biopelículas.
Es por esto que la CMEB fue mayor que CMIB, ya que en este punto la biopelícula ya se encuentra
formada y por lo tanto se necesita una mayor dosis de carvacrol para poder erradicarla.

47
La habilidad para formar biopelículas es un factor importante para la infección exitosa de cualquier
bacteria, incluidas las especies de Pectobacterium (Jahn et al. 2011). Esto le permite a las bacterias
resistir a condiciones adversas como lo son las condiciones ambientales o la presencia de
compuestos antimicrobianos debido la red de SPE sintetizadas que pueden retardarlos o
inactivarlos. En este estudio, se observó que las concentraciones necesarias para eliminar las
células planctónicas y de biopelículas fueron iguales, lo que podría indicar que la matriz de
biopelículas de P. carotovorum es altamente porosa y permeable al carvacrol.
Joshi et al. (2016) reportaron que el carvacrol presenta un efecto inhibitorio contra P. carotovorum
subsp. brasilense a concentraciones de 0.25 mM. Sin embargo, es importante señalar que estos
autores no evaluaron las concentraciones mínimas necesarias para inhibir el desarrollo y para
erradicar las biopelículas como se hizo en el presente estudio, sino solo su efecto sobre la biomasa.
Hasta el momento, este es el primer reporte sobre las CMIB y CMEB del carvacrol contra P.
carotovorum. El efecto del carvacrol para inhibir la formación de biopelículas podría posiblemente
atribuirse a una interferencia del carvacrol con el proceso de adhesión de las bacterias a la
superficie. Algunos estudios han demostrado que los flagelos, fimbrias tipo I y curli están
implicados en los pasos de adhesión temprana y son controlados por mecanismos de comunicación
intercelular (Guttenplan y Kearns 2013). De igual manera, las características superficiales de las
bacterias y las superficies impactan en gran medida en el proceso de adhesión. En este sentido, es
posible que el carvacrol actúe en estos puntos inhibiendo la adhesión inicial y, por lo tanto, el
desarrollo de biopelículas.

6.1.2. Efecto del Carvacrol Sobre la Motilidad de P. carotovorum

Para que se lleve a cabo el proceso de adhesión a una superficie, las bacterias necesitan llegar a
ésta ayudadas por estructuras extracelulares como los flagelos; siendo la motilidad flagelar un
factor que ayuda a contrarrestar la repulsión hidrófobica entre las células bacterianas y la superficie
objetivo. Por esta razón se evaluó el efecto del carvacrol sobre la motilidad tipo swimming de P.
carotovorum incubada a 28 ºC por 24 h. En el Cuadro 3 se puede observar que el carvacrol a una
concentración de 0.66 mM redujo significativamente (p≤0.05) la motilidad sin afectar la viabilidad

48
celular (Figura 7), mostrando una zona de motilidad de 6.5 mm en comparación con la de las
bacterias no expuestas al carvacrol, las cuales se diseminaron por toda la superficie (54.7 mm).

Cuadro 3. Motilidad tipo swimming de P. carotovorum expuesta a carvacrol durante 24 h de

incubación a 28 °C.
Tratamiento Zona de motilidad (mm)

Control 54.7 ± 2.30

Carvacrol (0.66 mM) 6.5 ± 0.40

Los valores son expresados como medias ± desviación estándar (DE), n=3. (p≤ 0.05).

1.6
0 mM
1.4 0.08 mM
0.16 mM
0.33 mM
1.2
0.66 mM
1.33 mM
Absorbancia (u. a.)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Tiempo de incubación (h) a 28°C

Figura 7. Curvas de crecimiento de P. carotovorum expuesta a concentraciones sub-inhibitorias de

carvacrol. Los valores son expresados como medias de n= 3.

49
Se ha reportado que la motilidad es un factor de virulencia importante en muchas bacterias
fitopatógenas, incluyendo Pectobacterium y se ha correlacionado con la capacidad del
microorganismo para colonizar las superficies del huésped (Hossain et al. 2005, Duan et al. 2013).
Especialmente, la motilidad mediada por flagelos se ha asociado con la formación de biopelículas
favoreciendo la adhesión de P. aeruginosa y E. coli (Guttenplan y Kearns 2013), y desempeña un
papel clave en la virulencia. Por lo tanto, una interrupción en la motilidad podría inhibir el proceso
de formación de biopelículas. Es importante destacar el impacto puede tener la reducción de la
motilidad en la contaminación cruzada ya que para que una bacteria pueda migrar de una superficie
a otra, esta debe superar las fuerzas de repulsión e interactuar con la fase sólida o la película
acondicionadora de la otra superficie.
Dependiendo de la fuerza de los enlaces que puedan formarse, la motilidad es a menudo crucial
para que se lleve a cabo la unión. En las primeras etapas del proceso de adhesión, la interacción
entre la bacteria y la superficie se da por la combinación de enlaces químicos débiles, interacciones
dipolo e interacciones hidrófobas que se dan en parte por los componentes de la envoltura
bacteriana (Lejeune 2003). Por lo tanto, la ausencia de motilidad en P. carotovorum al ser expuesta
a carvacrol puede evitar que esta migre a otra superficie y por lo tanto, reducir las pérdidas
asociadas a la contaminación de otras superficies tanto bióticas como abióticas.Similar a este
estudio, Inamuco et al. (2012) reportaron que la motilidad de S. Typhimurium se redujo
ligeramente con carvacrol a 0.4 mM y se eliminó completamente a 1 mM. Burt et al. (2007)
reportaron una completa inhibición de la motilidad de E. coli expuesta a 1 mM de carvacrol. En
estos estudios, los autores observaron que la pérdida de motilidad se atribuyó a una inhibición de
la síntesis de flagelos, la cual está regulada por el QS dependiente de AHL en Pectobacterium spp.
(Sivaranjani et al. 2016). En este sentido, es posible que el efecto del carvacrol sobre la motilidad
tipo swimming en P. carotovorum pueda atribuirse a una interrupción de este proceso.

6.1.3. Carga Superficial Bacteriana de P. carotovorum Expuesta a Carvacrol

La adhesión bacteriana puede verse influida por cambios en la superficie de las bacterias y el
sustrato, así como en el entorno donde esto ocurre. Por esta razón, se evaluó el efecto de carvacrol

50
sobre la carga superficial de P. carotovorum, midiendo el potencial zeta. Se observó que el
carvacrol disminuyó (p≤0.05) el potencial zeta negativo de P. carotovorum en comparación con
las bacterias no tratadas (Cuadro 4). Muchas bacterias Gram-negativas presentan carga superficial
negativa; sin embargo, esto depende de la especie, serotipo o cepa, y puede cambiar con la variación
en las condiciones de crecimiento, el estado fisiológico de las células y la composición de los
medios de suspensión (Li y McLandsborough 1999). Una carga negativa más fuerte en la superficie
celular conduce a una repulsión electrostática pronunciada entre las bacterias y las superficies y,
por consiguiente, podría inhibir el paso crucial de la adhesión.

Cuadro 4. Carga superficial de P. carotovorum expuesta a carvacrol durante 24 h de incubación a

28 °C.
Tratamiento Potencial zeta (mV)

Control −9.85 ± 0.81

Carvacrol (0.66 mM) −12.00 ± 1.10

Los valores son expresados como medias ± DE, n= 3. (p≤ 0.05).

6.1.4. Energía Superficial y Potencial de Adhesión de P. carotovorum Expuesta a Carvacrol

La Figura 8 (A y B) muestra el efecto del carvacrol sobre la energía superficial de P. carotovorum

determinado espectrofotométricamente. Se puede observar que el carvacrol redujo (p≤0.05) la
energía superficial de P. carotovorum de 38.91 a 35.79 mJ/m2, considerando que la DO máxima
ocurre cuando la energía superficial de la bacteria es igual a la tensión superficial del líquido donde
están suspendidos (Vazquez-Armenta et al. 2018). La energía superficial se puede considerar como
una medida de la hidrofobicidad de la superficie bacteriana, donde una energía superficial más baja
indica una mayor hidrofobicidad (Briandet et al. 1999). En este sentido, es posible que el carvacrol
causara un cambio en las propiedades fisicoquímicas de la superficie de P. carotovorum haciéndola
más hidrofóbica.

51
 0.50
A)
0.45 39.8

0.40 38.02

0.35
DO (600 nm)

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

35.35 B)
0.35
36.24

0.30
DO (600 nm)

0.25

0.20

0.15

0.10
20 30 40 50 60 70 80
2
Tensión superficial de soluciones de etanol-agua (mJ/m )

Figura 8. Energía superficial de P. carotovorum control (A) y expuesta a carvacrol (0.66 mM) (B).
Nota: los círculos azules y morados representan los valores del primer y segundo experimento.

52
Estos resultados son similares a los reportados por Vazquez-Armenta et al. (2018), quienes
encontraron una disminución de los valores de energía superficial de Listeria monocytogenes de
37.49-31.32 y 32-30 mJ/m2 después de su exposición a extractos de tallo de uva Red Globe y
Carignan (ricos en compuestos fenólicos), respectivamente. La energía superficial de P.
carotovorum fue inferior a la reportada para S. Typhimurium, Staphylococcus epidermidis,
Enterococcus faecalis y E. coli (49.5, 59.3, 64.5 y 65.1 mJ/m2, respectivamente); considerados
hidrofílicos (Zhang et al. 2015). La adhesión de microorganismos a las superficies es un proceso
muy complejo, con muchas variables que afectan el resultado, como las propiedades superficiales,
no solo de las bacterias, sino también del sustrato y el medio. En general, la adhesión se producirá
más fácilmente en superficies más ásperas, más hidrófobas o recubiertas por películas de
acondicionamiento.
Por otro lado, el Cuadro 5 muestra el efecto del carvacrol en el potencial de adhesión (ΔGadh) entre
P. carotovorum y la superficie de polipropileno. Se encontró un ΔGadh de -15.69 ± 0.63 entre P.
carotovorum y el polipropileno, la cual se redujo significativamente (p≤0.05) por la exposición a
0.66 mM de carvacrol (-17.19 ± 0.29). De acuerdo con el enfoque termodinámico en el que las
interacciones fisicoquímicas son consideradas, la adherencia es favorable solo cuando la energía
es negativa. Debido a que la fase inicial del proceso de adhesión se rige por estas interacciones, el
valor negativo observado entre P. carotovorum y la superficie de polipropileno indica que la
adherencia es favorable entre ambos sustratos (Bayoudh et al. 2006).

Cuadro 5. Potencial de adhesión (ΔGadh) entre P. carotovorum expuesta a carvacrol y la superficie

de polipropileno.
Tratamiento ΔGadh (mJ/m2)
Control −15.69 ± 0.63

Carvacrol (0.66 mM) −17.19 ± 0.29

Los valores son expresados como medias ± DE, n= 3. (p≤ 0.05).

Se observó que la presencia de carvacrol disminuyó el potencial de adhesión, haciéndolo más

negativo; en este sentido, el carvacrol posiblemente tuvo un efecto sobre las propiedades
fisicoquímicas de las bacterias que hicieron la adherencia termodinámicamente más favorable

53
(Vazquez-Armenta et al. 2018). Sin embargo, los recuentos de P. carotovorum en el ensayo de
formación de biopelículas se redujeron significativamente en presencia de carvacrol. Se ha
reportado que la adhesión bacteriana es un proceso complejo afectado por múltiples factores como
las propiedades fisicoquímicas de las células bacterianas, su energía libre superficial, potencial
zeta, producción de SPE y presencia de pilis y flagelos (Tuson y Weibel 2013). Estos y otros
parámetros afectan el inicio y progresión de la adhesión bacteriana a superficies sólidas. Sin
embargo, es importante mencionar que el carvacrol pudo haber interferido con otros mecanismos
moleculares como la comunicación intercelular que regula algunos de estos procesos.
Debido a que el ΔGadh solo indica la probabilidad termodinámica de la adhesión, Zhang et al.
(2015) propusieron que la adhesión bacteriana puede ser cuantitativamente predecida utilizando el
valor absoluto de la diferencia entre la energía superficial de las bacterias y la superficie de
adhesión (|γbv-γsv|). En este sentido, en base a lo reportado por Vazquez-Armenta et al. (2018) las
células adheridas se correlacionaron negativamente con el incremento en la diferencia de energía
superficial entre las bacterias y las superficies. Por lo tanto, es posible que el carvacrol hiciera más
grande la diferencia de energía superficial entre las células de P. carotovorum y las superficies de
polipropileno, causando una reducción en la adhesión bacteriana.

6.1.5. Efecto del Carvacrol Sobre la Formación de Biopelículas y Secreción de SPE de P.

carotovorum

La Figura 9 muestra el proceso de formación de biopelículas de P. carotovorum durante 48 h a 28

ºC. Se puede observar que al incrementar el tiempo de incubación, la densidad celular de P.
carotovorum aumentó, mostrando 4.90 log UFC/cm2 de células viables adheridas a las 0.5 h; las
cuales aumentaron a 5.84 log UFC/cm2 a las 6 h de incubación. A las 12 h, la población de las
biopelículas fue de 6.36 logs, alcanzando un densidad celular máxima de 6.97 log UFC/cm2 a las
48 h, sin cambios significativos (p≥0.05) con las 24 h (6.89 log UFC/cm2) de incubación a 28 ºC.
Sin embargo, en presencia de carvacrol (0.66 mM) se logró una reducción significativa (p≤0.05)
(3.02 log UFC/cm2) en las etapas tempranas del desarrollo de la biopelícula (0.5 h).

54
 8 Control
Células adheridas (log UFC/cm2)

Carvacrol (0.66 mM)

7

1
0.52 4 6 8 12 24 48
Tiempo de incubación (h) a 28°C
Figura 9. Efecto del carvacrol en la formación de biopelículas de P. carotovorum en cupones de
polipropileno incubados a 28 ºC por 48 h. Los valores son expresados como medias ± DE, n=3.
(p≤0.05).

Esta inhibición se mantuvo durante todo el desarrollo de la biopelícula, mostrando a las 6 h 3.42
log UFC/cm2 (equivalente a una reducción de 2.42 log UFC/cm2 en comparación con las bacterias
no tratadas). Al final del período de incubación, P. carotovorum expuesta a carvacrol mostró una
densidad celular máxima de 5.87 UFC/cm2. En base a los resultados antes mencionados, es posible
que la reducción de la adhesión bacteriana se atribuya a la disminución de la motilidad como se
observó anteriormente, ya que esta juega un papel importante en la colonización microbiana y
propagación de las bacterias a través de la superficie, así como en la formación de biopelículas
(Harshey 2003). Esto fue corroborado por el análisis de microscopia donde se pudo observar una
reducción en las células adheridas a medida que aumentó el tiempo de incubación comparado con
el control (Figura 10). En este sentido, la exposición continua de P. carotovorum a una
concentración no biocida de carvacrol interrumpió el desarrollo normal de la biopelícula.

55
 A)
2h 6h 12 h 24 h

50 µm 50 µm 50 µm
50 µm

B)
2h 6h 12 h 24 h

Figura 10. Imágenes de microscopía de biopelículas de P. carotovorum control (A) y expuestas a carvacrol (0.66 mM) (B), incubadas a
28 ºC por 24 h. Las biopelículas fueron teñidas con cristal violeta y la morfología se observó a 600x de magnitud en un microscopio
Axio-Vert (Carl Zeiss).

56
Aunque existen estudios sobre el efecto de compuestos naturales sobre la formación de biopelículas
de patógenos de plantas como P. carotovorum, estos se han enfocado en medir la formación de
biopelículas como agregados o biomasa, dejando de lado que la medición de la biomasa (cristal
violeta) puede brindar información inespecífica sobre una gran diversidad de componentes que
conforman las biopelículas. Es necesario hacer un análisis más profundo, contemplando este statu
quo precisamente como un sistema de múltiples componentes en el que cada uno de estos influye
grandemente en las características de la virulencia. Por lo tanto, se caracterizó la composición de
SPE durante el proceso de formación de biopelículas de P. carotovorum en presencia de carvacrol.
Se encontró que los polisacáridos son los principales constituyentes de la matriz de las biopelículas
de P. carotovorum, los cuales incrementan durante el tiempo de incubación (Figura 11).

30 30
Control (C)
28 28
Carbohidratos (C) (µg EG/cm2)

Carvacrol (0.66 mM) (C)

26 Control (P) 26

Proteína (P) (µg EA/cm2)

24 Carvacrol (0.66 mM) (P) 24
22 22
20 20
18 18
16 16
14 14
12 12
10 10
8 8
6 6
4 4
2 2
0.5 2 4 6 8 12 24 48
Tiempo de incubación (h) a 28°C

Figura 11. Efecto del carvacrol en la síntesis de SPE durante la formación de biopelículas de P.
carotovorum en cupones de polipropileno a 28 ºC por 48 h. Los valores son expresados como
medias ± DE, n=3.

57
Se observó que a las 0.5 h el contenido de polisacáridos fue de 9.45 EG/cm2, el cual disminuyó con
la presencia de carvacrol hasta 8.43 EG/cm2. Después de 2 h, éste permaneció constante hasta las
4 h (p≥ 0.05) y luego, aumentó (p≤0.05) a 11.73 y 8.83 EG/cm2 a las 12 h en P. carotovorum no
tratado y tratado con carvacrol, respectivamente. A las 24 h, el carvacrol provocó una reducción
(p≤0.05) en la síntesis de polisacáridos de 22.94 a 9.11 EG/cm2. Con respecto al contenido de
proteínas, la matriz de las biopelículas no tratadas mostró valores entre 4.15 y 11.07 EA/cm2 a lo
largo del periodo de incubación; mientras que el tratamiento con carvacrol causó una reducción
significativa, presentando valores entre 6.21 y 7.10 EA/cm2, los cuales permanecieron constantes
hasta las 48 h. De los resultados obtenidos, se observó que el carvacrol (0.66 mM) inhibió la
motilidad, síntesis de SPE y desarrollo de la biopelícula sin inhibir el crecimiento de las células
planctónicas. Por lo tanto, es posible que la reducción de la formación de biopelículas pueda
atribuirse a una inhibición de la síntesis de SPE, debido a una interferencia del carvacrol con el QS
y no por la inhibición del crecimiento de P. carotovorum. Hay estudios que han relacionado la
capacidad de algunos compuestos naturales para inhibir biopelículas con una interferencia en los
mecanismos del QS (Vattem et al. 2007).
Estudios previos con P. aeruginosa han demostrado que la síntesis de SPE es inducida por la unión
de bacterias a la superficie (Davies et al. 1993, Prigent-Combaret et al. 1999) y que el QS gobierna
este proceso en muchas bacterias (Koutsoudis et al. 2006, Garrett et al. 2008). Como resultado de
la alta densidad celular, las bacterias tienden a comunicarse con células vecinas a través de la
síntesis y recepción de AHL mediante las proteínas del QS ExpI/ExpR, cambiando sus patrones de
expresión génica. Se ha reportado que el QS conduce a una activación de genes de síntesis de
polisacáridos, particularmente, los sistemas de polimerización de azúcares tales como
glucosiltransferasas y sacarosa sintasas (Sakuragi y Kolter 2007). En este sentido, como se observó
anteriormente, el carvacrol causó una reducción en la síntesis de polisacáridos durante el desarrollo
de la biopelícula, lo cual puede atribuirse a una afectación del QS o a la inactivación directa de
glucosiltransferasas.
De manera similar, Joshi et al. (2016) observaron una reducción en la formación de biopelículas
de P. carotovorum subsp. brasilense al ser expuesta a carvacrol (0.25 mM) e hipotetizaron que éste
interfirió con el QS; sin embargo, estos autores no evaluaron el efecto del carvacrol en la síntesis
de SPE y su relación con el desarrollo de la biopelícula. Por otro lado, diversos estudios han
mostrado la eficacia del carvacrol (0.7 mM) para reducir biopelículas de Salmonella Saintpaul

58
formadas sobre superficies de acero inoxidable, logrando reducciones de 2 log UFC/cm2 (Uchida
et al. 2015). Tapia-Rodriguez et al. (2017) reportó que el carvacrol (0.9-7.9 mM) no solo afecta la
formación de biopelículas, sino que también inhibe otros factores de virulencia tales como la
síntesis de piocianina y violaceína en P. aeruginosa y C. violaceum, respectivmente. Es importante
mencionar que además de la bien documentada actividad antimicrobiana del carvacrol, éste
también ha sido designado como un inhibidor del QS. Este es el primer estudio sobre la
composición de SPE de las biopelículas de P. carotovorum.
Estudios previos han reportado que los polisacáridos son los constituyentes principales de la matriz
de biopelículas de algunos patógenos vegetales. Koczan et al. (2009) reportaron que la matriz de
las biopelículas de Pectobacterium amylovorum (Erwinia amylovora) está compuesta por
amilovoran y levan, los cuales son considerados factores de virulencia que contribuyen a su
patogenicidad y resistencia. Por otro lado, las biopelículas de Dickeya dadantii (Erwinia
chrysanthemi) y Agrobacterium tumefasciens están compuestas principalmente por celulosa
(Danhorn y Fuqua 2007, Jahn et al. 2011). Las diferencias en la composición de SPE incluso entre
especies del mismo género destaca la importancia de la caracterización de la composición y
formación de biopelículas y su influencia en la patogenicidad y resistencia. En este sentido, sería
interesante en estudios futuros el determinar la composición y tipo de polisacáridos presentes en la
matriz de biopelículas de P. carotovorum debido al papel que estos juegan en la resistencia contra
agentes antimicrobianos.
Se espera que los agentes antimicrobianos se puedan difundir a través de la matriz de SPE e
inactiven las bacterias dentro de la biopelícula. Sin embargo, las SPE retardan la difusión de estos
compuestos, ya sea por reaccionar químicamente con ellos; siendo los polisacáridos los
mayormente implicados en la resistencia contra antimicrobianos en comparación con las proteínas.
Sin embargo, en el presente estudio, la matriz de SPE no interfirió con el carvacrol ya que la CMEB
fue igual a la CMB. Estos hallazgos son motivo de preocupación ya que los materiales plásticos se
usan frecuentemente en los campos de cultivo para el almacenamiento y transporte de frutas y
vegetales. Se ha demostrado que algunas bacterias pueden adherirse más a las superficies
hidrofóbicas como plásticos que a superficies hidrofílicas como el vidrio y acero inoxidable (Tondo
et al. 2010). Esto podría explicar la habilidad de P. carotovorum para producir biopelículas en
superficies de plástico, considerando que la adhesión es el primer paso en el proceso de formación
de biopelículas (Steenackers et al. 2012).

59
 6.2. Etapa 2: Efecto del Carvacrol Sobre la Producción de Exoenzimas de P. carotovorum

6.2.1. Inhibición de la Actividad de Exoenzimas de P. carotovorum Expuesta a Carvacrol

El proceso de infección de P. carotovorum se caracteriza por la síntesis de un arsenal de

exoenzimas con la finalidad de degradar tejido vegetal y obtener nutrientes para su desarrollo. Es
por esto que se determinaron los niveles de exoenzimas secretadas por P. carotovorum al ser
expuesta a 0.66 mM de carvacrol durante 24 h, midiendo la actividad de las mismas en los
sobrenadantes libres de células. Se pudo observar que todas las actividades disminuyeron de
manera significativa (p≤0.05) al ser expuestas a carvacrol. Particularmente, la actividad
poligalacturonasa (Figura 12A) disminuyó de 17.65 a 10.81 U/mg de proteína, mientras que la
actividad pectato liasa (Figura 12B) disminuyó de 30.81 a 15.34 U/mg de proteína, con respecto al
control. La reducción en la síntesis de estas exoenzimas determina el desarrollo del proceso de
infección en P. carotovorum, ya que estudios previos han mostrado que cepas mutantes que carecen
de su habilidad para sintetizar o secretar exoenzimas muestran un fenotipo avirulento (Laasik et al.
2005).
Se ha reportado que la síntesis de exoenzimas en Pectobacterium está regulada por el QS; esto ha
sido evidenciado en estudios con mutantes, donde al eliminar el gen que codifica para la proteína
del QS ExpI, se reduce la síntesis de las mismas (Lee et al. 2013). La forma en la cual el QS este
proceso será abordado en la sección 6.3.1. Por lo tanto, el efecto del carvacrol en la disminución
de la actividad de las exoenzimas puede estar relacionado con una menor abundancia de las mismas
causada por una reducción en su síntesis por la afectación del QS. Sin embargo, es importante
mencionar que es posible que el carvacrol también haya tenido un efecto pos-traduccional, es decir,
afectado la actividad de las exoenzimas ya sintetizadas. En este sentido, se realizó un análisis de
modelaje molecular con la finalidad de determinar si existen interacciones entre el carvacrol y los
aminoácidos catalíticos de las enzimas poligalacturonasa y pectato liasa de P. carotovorum y poder
así, atribuir las respuestas observadas a un efecto anti-QS.

60
 22
A)
20

18
Actividad poligalacturonasa

16
(U/mg de proteína)

14

12

10

35
B)

30
Actividad pectato liasa
(U/mg de proteína)

25

20

15

10

0
Control Carvacrol (0.66 mM)
.
Figura 12. Efecto del carvacrol sobre la actividad poligalacturonasa (A) y pectato liasa (B) en
sobrenadantes de cultivos de P. carotovorum durante 24 h a 28 ºC. Los valores son expresados
como medias ± DE, n=3. p≤0.05.

61
En la Figura 13A se muestra el modelaje molecular del carvacrol con la poligalacturonasa en la
mejor pose (-4.5 kcal/mol), la cual se orienta a una cavidad donde se encuentra el sitio activo de la
enzima. En este sitio, se encuentran Asp202 y Asp223, residuos conservados implicados en la
actividad catalítica de la enzima, los cuales fungen como donadores de base y protón en el
mecanismo de inversión para la rotura de los enlaces glucosídicos del ácido poligalacturónico
(Creze et al. 2008). En este sentido, cualquier interacción en este sitio podría afectar la actividad
catalítica de la enzima. Sin embargo, el carvacrol no mostró interacción de ningún tipo con Asp202.
Por otra parte, para el caso de la enzima pectato liasa, el aminoácido Arg218 y Asp131 son los
aminoácidos implicados en el reconocimiento y abstracción de protones del ácido
poligalacturónico para llevar a cabo la escisión del enlace glucosídico por β-eliminación (Herron
et al. 2000). Sin embargo, para esta proteína el carvacrol mostró interacciones lejos de este sitio
(Figura 13B). Por lo tanto, basándonos en esta evidencia, es posible que el carvacrol no haya
afectado la actividad enzimática sino la síntesis de las mismas.
Estudios similares han reportado el efecto del carvacrol sobre la actividad de exoenzimas de P.
carotovorum subsp. brasilense, medida semi-cuantitativamente como halos de actividad (%) en
placa. Se pudo observar que el carvacrol a 0.25 mM reduce un 60 y 100% la actividad pectato liasa
y poligalacturonasa, respectivamente. Aceites esenciales ricos en carvacrol como el de Satureja
khuzistanica (49.4%) también fue efectivo para reducir la secreción de estas exoenzimas en un 60-
80% en dos cepas de P. carotovorum, la JX029052 y la ATCC 15713 (usada en este estudio)
(Hajian-Maleki et al. 2019).

6.2.2. Efecto del Carvacrol Sobre la Maceración de Tejidos de Papa causada por P.
carotovorum

En la Figura 14 se puede observar el efecto del carvacrol sobre la producción de exoenzimas de P.

carotovorum en tejidos de papa. Los resultados indican que el carvacrol, redujo de manera
significativa la patogenicidad de la bacteria, reflejado como un menor daño al tejido vegetal (Figura
14 B, C). Conforme aumenta el tiempo de incubación, se observa un mayor daño en tejido,
presentándose el inicio de este a partir de las 48 h y una maceración completa del tejido control a
las 72 h de incubación a 28 ºC (Figura 15A).

62
A) B)

Figura 13. Análisis de modelaje molecular del carvacrol con las proteínas poligalacturonasa (A) y pectato liasa (B) de P. carotovorum.
Se muestran interacciones entre el carvacrol y aminoácidos no catalíticos de ambas proteínas.

63
 A B

C D

Figura 14. Efecto del carvacrol sobre el daño a tejido de papa causado por P. carotovorum durante
48 h a 28 ºC. A= control (no tratado), B= carvacrol (0.66 mM, vapor), C= carvacrol (0.66 mM,
líquido) y D= testigo (no inoculado); n=3.

64
 110
Control A)
100
Carvacrol (0.66 mM, V)
90 Carvacrol (0.66 mM, L)
80
Tejido dañado (%)

70
60
50
40
30
20
10
0

B)
8 Control
Carvacrol (0.66 mM)
Carga bacteriana (log UFC/g)

0
24 48 72 96

Tiempo de incubación (h) a 28 ºC

Figura 15. Efecto del carvacrol sobre el daño a tejido de papa causado por P. carotovorum
durante 96 h a 28 ºC (A) (p≤0.05). El tratamiento no afectó la carga bacteriana durante el ensayo
(B) (p≥0.05). Los valores son expresados como medias ± DE, n=3.

65
Como se mencionó anteriormente, este microorganismo utiliza como principal factor de virulencia
las exoenzimas para degradar la pectina de la pared celular de plantas con el fin de obtener
nutrientes para su supervivencia y su producción se inicia hasta que la densidad poblacional es
elevada. Esto concuerda con el presente estudio y lo reportado por Smadja et al. (2004), quienes
observaron el inicio de la progresión de la enfermedad causada por P. atroscepticum a partir de las
48 h de incubación. Con la finalidad de poder atribuir este efecto a una interrupción de la síntesis
de exoenzimas y no a una disminución de la población bacteriana, se hizo un conteo de la misma
a los diferentes tiempos de incubación y se pudo observar que ambos tratamientos presentaron la
misma carga bacteriana, la cual osciló entre 6.7-7.2 log UFC/g (Figura 15B). Esto concuerda con
evidencia previa que menciona que la carga bacteriana en tejido usualmente no excede un nivel
crítico de aproximadamente 107 células/g, al cual la maceración del tejido ocurre (Pérombelon
2002).
Estudios previos han reportado la capacidad de este compuesto de reducir la incidencia de la
enfermedad causada por P. carotovorum; tal es el caso de Joshi et al. (2016) quienes reportaron
que el carvacrol (3 y 1.5 mM) redujo un 35% y 20% el daño a tejido de papa causado por P.
atroscepticum y P. carotovorum subsp. brasilense, respectivamente. Compuestos fenólicos
estructuralmente similares al carvacrol como el ácido cinámico (0.74 mg/mL) y el ácido salicílico
(0.42 mg/mL) también inhibieron completamente la maceración de tejido de papa y flor alcatraz
causada por estas bacterias (Joshi et al. 2015). Como se mencionó anteriormente, tanto P.
carotovorum como otras especies de Pectobacterium provocan la maceración de tejidos vegetales
debido a su capacidad para sintetizar exoenzimas como pectin liasas, pectin metil esterasas y
poligalacturonasas, las cuales son reguladas por el QS. Es por esto que es de vital importancia
analizar el posible efecto que el carvacrol esté teniendo en el proceso de comunicación bacteriana
con la finalidad de tener un acercamiento al posible mecanismo de acción anti-QS.

66
 6.3. Etapa 3: Efecto del Carvacrol Sobre el QS de P. carotovorum

6.3.1. Producción de AHLs por P. carotovorum expuesto a carvacrol

Con la finalidad de tener un acercamiento sobre el posible mecanismo de acción anti-QS del
carvacrol contra P. carotovorum, se determinó el efecto del compuesto sobre la síntesis de las
moléculas señal 3-oxo-C6-AHL y 3-oxo-C8-AHL, encargadas de regular la síntesis de factores de
virulencia en P. carotovorum. Se puede observar en la Figura 16 que el carvacrol redujo (p≤0.05)
la síntesis de 3-oxo-C6-AHL en cultivos de P. carotovorum incubados a 28 ºC por 24 h. Se pudo
observar una producción de 3-oxo-C6-AHL de 4.14 y 3.77 mM en los cultivos control y tratados
con carvacrol, respectivamente; mientras que 3-oxo-C8-AHL no fue detectada en ninguno de los
tratamientos bajo las condiciones experimentales utilizadas. Crépin et al. (2012) reportaron que
diferentes cepas de P. carotovorum (CFBP 2046, 98.1 y RNS 08.42.1A) producen
mayoritariamente la 3-oxo-C6-AHL (>90%) con respecto a la 3-oxo-C8-AHL (<4%). De manera
similar, Noel et al. (2010) reportaron la presencia de 3-oxo-C6-AHL en cultivos de P. carotovorum
SR38, mientras que 3-oxo-C8-AHL no fue detectada. Previamente se reportó que el carvacrol
redujo la síntesis de AHL de P. carotovorum subsp. brasilense y P. aroidearum a una
concentración de 0.25 mM (Joshi et al. 2016).
Sin embargo, no se llevó a cabo una cuantificación directa de las moléculas señal producidas por
el microorganismo sino una medición indirecta mediante la luminiscencia generada por la bacteria
biosensora Escherichia coli pSB401 en presencia de AHL exógenas. Si bien, el uso de cepas
biosensoras da información relevante acerca de la reducción en la síntesis de moléculas señal, es
necesario complementar estos estudios con análisis que permitan una cuantificación directa de la
misma como es el caso del presente estudio el cual no solo nos permitió cuantificar, sino detectar
que los efectos solo eran atribuidos a la presencia de 3-oxo-C6-AHL. De manera similar, Tapia-
Rodriguez et al. (2019) reportaron un 60% de reducción en las AHL sintetizadas por Pseudomonas
aeruginosa expuesta a 1.9 mM de carvacrol, lo cual se vio reflejado directamente en una reducción
de los factores de virulencia regulados por estas moléculas.

67
 4.5

4.0

3.5
3-oxo-C6-AHL (mM)

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
Control Carvacrol (0.66 mM)

Figura 16. Efecto del carvacrol sobre la producción de 3-oxo-C6-AHL de P. carotovorum durante
24 h de incubación a 28 ºC. Los valores son expresados como medias ± DE, n=3. (p≤0.05).

Estos resultados concuerdan con las respuestas observadas previamente como lo son la reducción
en la motilidad, formación de biopelículas, síntesis de SPE y exoenzimas. Como se mencionó
anteriormente, estos factores de virulencia están regulados por el QS dependiente de AHL en
Pectobacterium (Barnard et al. 2007); por lo tanto, una reducción en la síntesis de moléculas señal
por efecto del carvacrol, concomitantemente redujo su expresión. Haciendo un análisis más
detallado del efecto de la reducción de la AHL sobre los diferentes factores de virulencia,
particularmente en la formación de biopelículas, se sabe que este proceso comprende una serie de
etapas entre las cuales se destacan la adhesión de las bacterias a una superficie y la subsecuente
síntesis de SPE que cumplen un papel fundamental en la formación del agregado, estructura y
resistencia (Flemming y Wingender 2010).

68
Si bien, la forma en la que el QS regula dicho proceso no está bien esclarecido para P. carotovorum,
se sabe que en P. stewartii (bacteria similar a P. carotovorum), en presencia de niveles umbral de
AHL, el complejo RcsA/RcsB activa la expresión de genes cps relacionados con la síntesis de
exopolisacáridos (Minogue et al. 2005). Sin embargo, es posible que la reducción en la
concentración de 3-oxo-C6-AHL por efecto del carvacrol haya favorecido la actividad represora
de la proteína EsaR (como se observa en la Figura 5) inhibiendo la transcripción del gen rcsA que
codifica para la proteína RcsA, y por lo tanto, haya reducido la síntesis de SPE y la concomitante
formación de biopelículas.
Por otra parte, se sabe que el QS regula la síntesis de exoenzimas de manera dependiente de la
concentración de AHL en el medio. En P. carotovorum, a una densidad poblacional baja, las
proteínas receptoras ExpR inhiben la virulencia en ausencia de niveles umbral de AHLs por regular
positivamente rsmA, que codifica para RsmA, una proteína que desestabiliza los transcritos de las
exoenzimas. De manera normal, las AHLs interaccionan con las proteínas ExpR, impidiendo la
activación del gen rsmA y por lo tanto, las exoenzimas son sintetizadas (Põllumaa et al. 2012). Sin
embargo, es posible que en el presente estudio, la reducción en la concentración de 3-oxo-C6-AHL
haya dejado libres las proteínas ExpR para ejercer su efecto inhibidor y se haya reducido la síntesis
de exoenzimas. Es importante destacar, que la reducción en la concentración de 3-oxo-C6-AHL
puede ser atribuida a una inhibición de su síntesis y no a una menor densidad poblacional ya que
en el presente estudio se utilizó una concentración no biocida y que además no afectara el
crecimiento de la bacteria.
Estos resultados se pueden complementar con la evidencia previa que muestra el papel fundamental
de las AHL en estos procesos. Tal es el caso de von Bodman et al. (2003) quienes encontraron que
la supresión del gen expI en P. carotovorum eliminaba la síntesis de AHL y la producción de SPE,
lo cual se reflejó directamente en una reducción de la virulencia. De igual manera, Lee et al. (2013)
mostraron que en ausencia de AHL se redujo la formación de biopelículas y se suprimió la síntesis
de exoenzimas. Como se mencionó anteriormente, 3-oxo-C6-AHL es sintetizada por la proteína
ExpI y su acumulación activa la expresión del gen de virulencia dependiente del QS. En este
sentido, es posible que el carvacrol haya disminuido la síntesis de AHL por su interacción con la
proteína sintasa ExpI. Por lo tanto, se determinaron las posibles interacciones entre el carvacrol y
ExpI con la finalidad de tener un acercamiento al posible mecanismo de acción del carvacrol en
base a las respuestas observadas previamente.

69
6.3.2. Modelaje Molecular Entre Carvacrol y ExpI de P. carotovorum

El modelo estructural de ExpI se usó para su acoplamiento con SAM (ligando natural) y carvacrol
(inhibidor). Este modelo se obtuvo mediante el software Phyre2, basado en la estructura
cristalográfica de EsaI de P stewartii, con la cual mostró un 43% de homología. Este modelo se
superpuso sobre la estructura cristalográfica de EsaI, pudiéndose observar la similitud entre ambas
y la conservación de algunos de los aminoácidos implicados en la síntesis de AHL (Figura 17). Se
modelaron las estructuras de SAM y carvacrol con el fin de detectar las posibles interacciones entre
estos y ExpI y así, explicar las respuestas obtenidas previamente donde se observa la reducción de
factores de virulencia regulados por esta proteína.

Figura 17. Homología del modelo estructural de ExpI de P. carotovorum con la estructura
cristalográfica de EsaI (PDB 1KZF) de P. stewartii. Algunos aminoácidos importantes en la
actividad catalítica y reconocimiento de sustratos (Phe102, Phe123, Val104, Met146, Arg101,
Ser99) se muestran en barras mientras que ExpI y EsaI en listones amarillos y azules,
respectivamente.

70
El modelo de acoplamiento reflejó que ambos compuestos interaccionan de forma no covalente
con aminoácidos presentes en el sitio de unión a la cadena de acilo de ExpI y que participan en el
reconocimiento del sustrato y actividad enzimática. Específicamente, SAM mostró interacciones
hidrofóbicas (tipo alquil-pi) con Met77 y puentes de hidrógeno con Arg101, Ile142, Ser99, Ser100,
y Thr141 (Figura 18A); mientras que el carvacrol, dadas sus características hidrofóbicas
interaccionó predominantemente con Phe102 (pi-pi), Met147 (alquil), Val143 (alquil) y Leu177
(alquil), y por puentes de hidrógeno con Ser99 y Ser100 (Figura 18B). SAM presentó una mayor
energía de afinidad con respecto al carvacrol (Cuadro 6), lo cual era de esperarse considerando que
es el ligando natural.
Recordando un poco el mecanismo de síntesis de AHL mencionado anteriormente y basándonos
en el modelo de EsaI reportado por Watson et al. (2002), ExpI cataliza la reacción entre SAM y la
cadena de acilo transportada por ACP. La cadena 3-oxo-hexanoil del sustrato se acomoda en la
cavidad hidrofóbica de ExpI e interactúa con los residuos conservados que lo colocan en la
orientación adecuada para la catálisis. Ser99, Met126, Thr141, Val143, Met147 y Leu177 alinean
esta cavidad y la cadena hidrocarbonada es estabilizada por interacciones hidrofóbicas con Leu118,
Ser119 y Met147. Posteriormente, el proceso de acilación se da por el ataque nucleofílico del
carbono carbonilo de la cadena de acilo por los electrones libres del grupo amino de SAM (después
de la abstracción de uno de sus protones por una molécula de agua estabilizada por Ser99) (Watson
et al. 2002). En este sentido, es posible que al interaccionar el carvacrol con estos aminoácidos,
haya impedido el reconocimiento de la cadena de acilo por la enzima. De igual manera, la
interacción entre el carvacrol y Ser99 puede tener un impacto en la desprotonación de SAM
impidiendo el ataque nucleofílico y el proceso de acilación afectando la síntesis de AHL con la
concomitante reducción en los factores de virulencia observada previamente.

71
 A) SER99
THR141 PHE102

SER100

ILE142

ARG101

B)
LEU177
SER99

ARG68
VAL143

SER100

MET147 PHE102

Figura 18. Modelaje molecular de SAM (A) y carvacrol (B) en el sitio de unión a acil-ACP de ExpI. Se muestran interacciones
hidrofóbicas (líneas moradas) y puentes de hidrógeno (líneas verdes) entre el carvacrol y los aminoácidos del sitio catalítico de ExpI.

72
Cuadro 6. Energía de afinidad e interacciones principales obtenidas del modelaje molecular entre
SAM, carvacrol y ExpI.

Ligando Energía de afinidad Interacciones principales

(kcal/mol)
SAM -5.9 Hidrofóbicas: Met77

Puentes de hidrógeno: Arg101, Ile142, Ser99,

Ser100, Thr141

Carvacrol -4.7 Hidrofóbicas: Phe102, Met147, Val143,

Leu177

Puentes de hidrógeno: Ser99, Ser100

73
 7. CONCLUSIÓN

El carvacrol fue efectivo para inhibir la formación de biopelículas de P. carotovorum,

disminuyendo la motilidad, síntesis de SPE y adhesión celular. Adicionalmente, se observó un
efecto inhibitorio en la síntesis de exoenzimas e incidencia de la enfermedad causada por P.
carotovorum en tejidos de papa. La capacidad inhibitoria del carvacrol sobre los factores de
virulencia de P. carotovorum se atribuyó a una reducción de la síntesis de AHLs por su posible
interacción con la proteína sintasa ExpI. Estos resultados resaltan el potencial del carvacrol como
agente antibacteriano y anti-virulencia para ser usado como tratamiento desinfectante en
superficies bióticas y abióticas.

74
 8. BIBLIOGRAFIA

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