Métodos e Instrumentación de Laboratorio: Tema 4.

Electroforesis

TEMA 4

ELECTROFORESIS

Fundamentos generales

La electroforesis comprende a un grupo de técnicas que permiten la separación de moléculas bajo la

acción de un campo eléctrico. Un campo eléctrico es la región del espacio en cuyo seno una
partícula con carga eléctrica es impulsada a desplazarse. En un campo eléctrico se pueden
distinguir dos regiones o polos eléctricos: positivo (ánodo) y negativo (cátodo). Bajo la influencia de
un campo eléctrico, las moléculas con carga eléctrica positiva se van a desplazar hacia el cátodo
(polo negativo) y las de carga negativa hacia el ánodo (polo positivo).

Cuando una partícula cargada se sitúa en el seno de un campo eléctrico, se ejerce sobre ella una
fuerza eléctrica (Feléctrica) proporcional a la carga de la partícula (q, culombios) y a la magnitud del
campo eléctrico existente (E), que dirige a esa partícula hacia el polo de carga opuesta.

Feléctrica = E · q

Sin embargo, si la partícula se desplaza en el seno de un medio físico, va a friccionar con la materia
del medio, frenando su movimiento. Se impone entonces una fuerza de fricción (F fricción) de dirección
contraria a la fuerza eléctrica, proporcional a la velocidad de la partícula (v) y al coeficiente de
fricción (f), que es mayor cuanto mayor es el tamaño de la partícula.

Ffricción = f · v

En un proceso de electroforesis, se llegan a equilibrar las fuerzas eléctrica y de fricción.

qE=vf

Llegado a este punto, cada partícula cargada se mueve a una velocidad constante, proporcional a su
carga, a la magnitud del campo eléctrico e inversamente proporcional al coeficiente de fricción.

v=qE/f

Por tanto, de esta ecuación se deduce que:

 la velocidad de una molécula sometida a electroforesis es proporcional a la magnitud de su
carga eléctrica. No habrá movilidad en moléculas sin carga o carga neta neutra (tantas
cargas positivas como negativas).
 La velocidad de las moléculas sometidas a electroforesis será proporcional a la magnitud del
campo eléctrico.
 la velocidad de una molécula sometida a electroforesis es inversamente proporcional al
coeficiente de fricción con el medio. El coeficiente de fricción depende del tamaño y forma de
la molécula sometida a electroforesis.

Así pues, los principales factores que permiten la separación de partículas por electroforesis son sus
cargas y sus tamaños.

El desarrollo de una electroforesis depende de varios factores:

 Corriente eléctrica. La corriente o intensidad eléctrica (I) es el flujo de partículas cargadas
por unidad de tiempo a través de un material conductor. La intensidad está relacionada con
otros parámetros: el voltaje o diferencia de potencial (V) y la resistencia eléctrica (R), a través
de la ley de Ohm: I=V/R. La unidad de medida de la intensidad es el amperio (A), del voltaje
el voltio (V) y de la resistencia el ohmio (). En un sistema de electroforesis, el operador
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puede modular el voltaje y, generalmente, el amperaje. Cuanto mayor es el voltaje, mayor es

la intensidad y mayor es la magnitud del campo eléctrico.
 Temperatura. El paso de una corriente eléctrica a través de un medio produce calor (efecto
Joule, Q = I2 R t). Este efecto será tanto mayor, cuanto mayor sea la diferencia de potencial y
la resistencia eléctrica. Por tanto, la temperatura es un elemento que conviene ser controlado
en una electroforesis, por lo que suele ser habitual que las electroforesis se desarrollen con
algún sistema de refrigeración acoplado.
 Características de las partículas sometidas a electroforesis. La carga, tamaño y forma
de las partículas condicionan su movilidad electroforética. La movilidad de una molécula es
tanto mayor cuanto mayor sea su carga, y disminuye según aumenta su tamaño, pues mayor
es el rozamiento de la molécula con el medio.
 Características del medio de electroforesis. Los medios en el que se desarrollan las
electroforesis son, por lo general, materiales sólidos porosos (soporte de electroforesis)
embebidos en una disolución acuosa (tampón de electroforesis) que contiene compuestos
iónicos o electrolitos, que son los que forman el flujo o corriente eléctrica. También, la
disolución suele contener un compuesto que actúa como sistema tampón, que permite
mantener el pH del sistema en torno a un determinado valor. Las moléculas biológicas que
son habitualmente analizadas por electroforesis, como proteínas y ácidos nucleicos, tienen
grupos ionizables pueden presentar o no carga eléctrica dependiendo del pH. Por ejemplo,
las proteínas, dependiendo del pH, pueden tener carga neta negativa o positiva. También
puede ocurrir que a un determinado valor de pH, una determinada proteína tenga tantas
cargas eléctricas positivas como negativas, por lo que tendría carga eléctrica neutra. En este
caso, dicha proteína no se desplazaría en un campo eléctrico y al valor de pH en el que se
cumple esta propiedad se denomina punto isoeléctrico (pI).

La modalidad más habitual de electroforesis es la electroforesis zonal, que se caracteriza porque

las moléculas se desplazan en el seno de un soporte poroso. La muestra se coloca inicialmente en
una zona concreta del soporte y al finalizar la electroforesis las moléculas, en función de sus
características químicas, se han repartido por diferentes zonas. Como los componentes de la
muestra tienen que viajar a través del entramado poroso puede ejercerse un efecto de cribado,
donde las partículas más pequeñas tienen más favorecido el avance que las grandes.

Para llevar a cabo una electroforesis zonal se necesita un equipo constituido por los siguientes
elementos:
 Una fuente de alimentación, que es un instrumento que genera un campo eléctrico. De ella
parten dos electrodos, el ánodo (polo positivo) y el cátodo (polo positivo) que se conectarán
al sistema de electroforesis. Por convenio, el ánodo (polo +) es marcado con color rojo y el
cátodo (polo -) con color negro. Generalmente, la fuente de alimentación permite regular la
intensidad de corriente (amperaje) y la diferencia de potencial (voltaje).
 Una cubeta de electroforesis, que es un recipiente en el que se distinguen dos
compartimentos separados, a cada uno de los cuales llega un electrodo procedente de la
fuente de alimentación. Entre ambos compartimentos se va a colocar el soporte de la
electroforesis, de tal manera que cuando se crea una diferencia de potencial, la corriente
eléctrica fluye de un compartimiento a otro atravesando el soporte. Los compartimentos se
rellenan con una disolución (tampón de electroforesis), que contiene los electrolitos que van
a constituir la corriente eléctrica. Las cubetas pueden estar diseñadas para el desarrollo en
vertical de la electroforesis o para el desarrollo en horizontal.
 Soporte de electroforesis. Es un material poroso formado por cadenas de polímeros
entrecruzadas que forman un entramado a través del cual discurre el tampón de
electroforesis y los componentes de la muestra sometida a electroforesis. Los soportes de
electroforesis suelen tener consistencia gelatinosa, por lo que se les suelen llamar geles de
electroforesis. La muestra se coloca inicialmente en unas cavidades o pocillos creados en el
soporte para tal fin. Cuando se crea una corriente eléctrica, la muestra penetra en el soporte
y sus constituyentes se van desplazando a través. Los espacios intersticiales del soporte de

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electroforesis deben ser adecuados para permitir el paso de las moléculas de la muestra a su
través, pero también que sean lo suficientemente ajustado para producir un efecto de criba
sobre los componentes de la muestra que se desean separar. En este sentido, se pueden
distinguir dos tipos de soportes electroforéticos:

o Soportes no restrictivos: No ponen mucha resistencia al paso de las moléculas a su

través porque tienen un tamaño de poro suficientemente grande. Por ejemplo, la
electroforesis en acetato de celulosa emplea soportes no restrictivos.

o Soportes restrictivos: Ofrecen cierta resistencia al paso de las moléculas porque el

tamaño de sus poros es más ajustado al tamaño de dichas moléculas, por lo que se
produce un efecto de tamizado que contribuye a la discriminación de las moléculas
sometidas a electroforesis. Las moléculas con un tamaño mucho menor que los poros se
desplazarán con mayor libertad, pero las moléculas que tengan un tamaño similar al de los
poros tendrán mayor dificultad para desplazarse por el soporte y mostrarán un movimiento
más lento. Por ejemplo, las electroforesis en geles de poliacrilamida o en agarosa suele
emplear soportes restrictivos.

SISTEMAS COMUNES DE ELECTROFORESIS

Electroforesis en acetato de nitrocelulosa

Este tipo de electroforesis ha sido generalmente empleada en análisis clínicos, como el

análisis de proteínas sanguíneas.
El soporte electroforético compuesto de acetato de celulosa tiene el aspecto de una lámina
de papel. El acetato de celulosa se obtiene de la reacción del anhídrido acético con la celulosa. Por
lo general, este tipo de soporte no es fabricado por el usuario de laboratorio, sino que es adquirido
comercialmente. Este es un soporte no restrictivo, es decir, sus poros son tan anchos que permiten
prácticamente el paso libre de las moléculas sometidas a electroforesis.
En el momento de ser utilizadas, las láminas de acetato de celulosa han de impregnarse de
un tampón, por lo general, de pH básico, para que las proteínas (el tipo de moléculas que
habitualmente se emplean en este tipo de electroforesis) adquieran carga negativa. El tampón
impregnado en la lámina también contiene los electrolitos responsables de establecer la corriente
eléctrica a través del soporte. Habitualmente, se emplea el tampón Veronal o derivados que
contiene, entre otros, ácido barbitúrico, un compuesto farmacológico cuyo uso está restringido y, por
tanto, se requiere licencia de uso.
Los sistemas de electroforesis en acetato de celulosa están diseñados para el desarrollo del
proceso e horizontal.

Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE, Poly-Acrilamide Gel Electrophoresis)

La electroforesis en geles de poliacrilamida se utiliza generalmente para la separación de

proteínas y, en menor medida, de ácidos nucleicos. Los sistemas de electroforesis en geles de
acrilamida suelen estar diseñados para el desarrollo del proceso en vertical.
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de monómeros de acrilamida y de
N,N’metilenbisacrilamida. En el proceso de polimerización, los monómeros de acrilamida se unen
unos con otros dando lugar a largas cadenas lineales. Las moléculas de bis-acrilamida se intercalan
en las cadenas lineales, conectando unas con otras, lo que va a proporcionar al gel la consistencia
necesaria. La reacción de polimerización de la acrilamida se realiza a través de la propagación de
radicales libres. Un radical libre es una molécula con un número impar de electrones, por tanto tiene
un electrón desapareado que hace que la molécula sea muy reactiva. La reacción de polimerización
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se inicia al añadir a una disolución acuosa de acrilamida y bisacrilamida unos compuestos

generadores de radicales libres, como pueden ser el persulfato amónico y TEMED (N,N,N’,N’-
tetrametildiamina). El anión persulfato se descompone espontáneamente formando radicales sulfato,
pero el TEMED cataliza este proceso y la formación de radicales sulfato es mayor. Entonces, tales
radicales reaccionan con las moléculas de acrilamida, que se radicalizan. Un radical de acrilamida
reacciona y se une covalentemente con otra molécula de acrilamida que, a su vez, se radicaliza y
puede volver a reaccionar con otra molécula de acrilamida. De esta manera se va propagando la
polimerización.
El tamaño medio de poro en los geles de PA viene determinado por las concentraciones de
acrilamida y bisacrilamida empleadas para fabricar el gel. En una disolución de acrilamida-
bisacrilamida se pueden distinguir dos parámetros que van a condicionar las características del gel
resultante. Un parámetro, denominado % T, hace referencia a la concentración total de monómeros
(% p/v acrilamida + bisacrilamida). Otro parámetro, denominado % C, hace referencia a la
proporción de biscrilamida con respecto al total de monómeros. Normalmente, %T es el parámetro
que se modula para conseguir un tamaño medio de poro mayor o menor, dentro de un rango entre 3
y 15%. En cuanto a %C se suele emplear un valor fijo, habitualmente el 5%.
La poliacrilamida adquiere la forma del recipiente donde se realiza la polimerización. Por
tanto se necesita un molde para formar el gel. La forma del gel puede ser tubular, formándose en
tubos de vidrio, o laminar, formados entre dos placas de vidrio. La forma más habitual de desarrollar
una electroforesis de proteínas es en geles laminares, porque permiten albergar varias muestras y,
así, someterlas a electroforesis en el mismo gel.
El gel de poliacrilamida puede ser fabricado de tal modo que la concentración de acrilamida
varíe gradualmente desde la parte superior a la parte inferior del gel. Esto hace que el tamaño de
poro vaya disminuyendo uniformemente desde la parte superior hasta el extremo inferior del gel. El
gradiente se forma con un mezclador de gradientes. Estos geles en gradiente de poliacrilamida se
suelen realizar con el propósito de conseguir un mayor rango de separación y una mayor resolución.
La acrilamida en polvo o en disolución es neurotóxica y se absorbe a través de la piel o por
inhalación. Por ello, es recomendable trabajar en una campana extractora, con guantes y mascarilla
cuando se fabrican los geles. La acrilamida polimerizada o poliacrilamida no es tóxica, pero se
recomienda que se usen guantes durante la manipulación de los geles, debido a la posible presencia
de monómeros libres.

Tipos de electroforesis en geles de poliacrilamida

Como hemos comentado anteriormente, las electroforesis en geles de poliacrilamida suelen

emplearse para análisis de muestras de proteínas. En base al análisis de proteínas, se han
desarrollado varias modalidades de PAGE, que revisaremos escuetamente a continuación.

Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE).

Es el método de análisis de muestras de proteínas más ampliamente utilizado. En esta

técnica las proteínas se someten a un proceso de desnaturalización, en el que las proteínas se
despliegan adoptando la forma de hebras extendidas. Para desnaturalizar las proteínas de una
muestra se añaden compuestos desnaturalizantes y se someten a altas temperaturas,
aproximadamente 100 ºC. Entre los compuestos desnaturalizantes se encuentra un detergente
iónico, el dodecilsulfato sódico o SDS. El SDS recubre a las proteínas dotándolas de cargas
negativas.
En condiciones desnaturalizantes, la movilidad electroforética de las proteínas a través del
gel de poliacrilamida va a depender del tamaño de cada proteína (relacionado con su peso
molecular). Por tanto, en una SDS-PAGE las proteínas se separan entre si en función
fundamentalmente de su peso molecular.

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Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas (native-PAGE).

Esta técnica es similar a la anterior excepto que las proteínas de la muestra mantienen sus
propiedades nativas (composición, estructura, carga eléctrica intrínseca, etc.) Por consiguiente
las proteínas de la muestra no van a ser expuestas a compuestos desnaturalizantes ni a altas
temperaturas. La separación entre proteínas se realiza en función de la carga eléctrica propia de
cada proteína (que recuerde depende del pH del medio) y por su tamaño. El tampón del sistema
electroforético va a condicionar la carga de las proteínas. Generalmente, el tampón de
electroforesis tiene pH básico (p.e. > 8), para que la mayoría de las proteínas tengan carga neta
negativa.

Electroforesis en geles de agarosa

La electroforesis en geles de agarosa se utiliza generalmente para la separación de ácidos

nucleicos. Los sistemas de electroforesis en geles de agarosa a suelen estar diseñados para el
desarrollo del proceso en horizontal.
La agarosa es un polisacárido de galactosa que se extrae de ciertas algas. Los geles se
preparan disolviendo a alta temperatura (> 65º C) polvo de agarosa deshidratada en un adecuado
tampón de electroforesis. La disolución se vierte en un molde y se deja enfriar hasta que la agarosa
gelifique (< 45º C). El gel de agarosa es homogéneo en su composición y se sumerge totalmente en
el tampón de electroforesis del sistema (por eso a este tipo de técnica se les denomina electroforesis
de inmersión). La concentración de agarosa va a determinar el tamaño de poro. Variando la
concentración de agarosa se puede modular el rango de tamaños de moléculas (por lo general
ácidos nucleicos) que el gel puede discriminar. A mayor concentración, menor tamaño de poro y
mayor poder de discriminación para moléculas pequeñas; y lo contrario.
Para comprender la electroforesis de ácidos nucleicos hay que tener presente algunos
fundamentos básicos sobre la composición y estructura de los ácidos nucleicos. Existen dos tipos
principales de ácidos nucleicos: ADN y ARN. Los ácidos nucleicos pueden formar estructuras de
doble cadena (doble hélice). A pH neutro y superior la carga eléctrica neta de los ácidos nucleicos es
negativa debido a los grupos fosfato. En tales condiciones, cuando actúa un campo eléctrico los
ácidos nucleicos se van a dirigir al polo positivo (ánodo) a través del gel de agarosa. La porosidad
del gel de agarosa va a imponer la separación de los ácidos nucleicos en base a su tamaño: cuanto
mayor sea su tamaño, mayor será la resistencia encontrada por la molécula al desplazarse por el gel
y menor su movilidad.

Revelado de geles

Tras el desarrollo de una electroforesis se tiene que llevar a cabo un proceso de tinción para
detectar las moléculas en el soporte eletroforético. Las diferentes moléculas que se han separado en
un soporte electroforético suelen manifestarse a modo de bandas tras un adecuado proceso de
tinción.
Como ya hemos dicho, las moléculas habitualmente tratadas por electroforesis son las
proteínas y los ácidos nucleicos.
Existen varios tratamientos de tinción inespecífica de proteínas en geles de poliacrilamida:
 Tinción con colorantes orgánicos, tales como, el azul Coomasie o el negro amido. El
tratamiento cosiste en sumergir el gel con una disolución del colorante y seguidamente
desteñir el gel con el disolvente, quedándose el colorante fijado en las zonas donde hay
proteínas.
 Tinción de plata. Es un tratamiento más sensible. El gel es sucesivamente sumergido en
diferentes disoluciones, una de las cuales contiene nitrato de plata.
 Tinción con compuestos fluorescentes. Esta técnica ha sido desarrollada recientemente y
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tiene un mayor poder de detección.

Para detectar en un gel de electroforesis ácidos nucleicos con estructura de doble hélice se
suele emplear un reactivo intercalante fluorescente, esto es, un reactivo que se sitúa entre los pares
la doble hélice de ácido nucleico y adquiere fluorescencia cuando se irradia con luz UV. Se suele
utilizar como agente intercalante el bromuro de etidio, no obstante, es un potente cancerígeno y
debe utilizarse con precaución, con guantes y en zonas del laboratorio destinadas para su uso.
Recientemente se han creado otros agentes intercalantes fluorescentes, como el SyBR Green™,
que no tienen los riesgos del bromuro de etidio. También hay que tener en cuenta que la exposición
a la luz UV es peligrosa, por eso se deben usar protectores oculares o mamparas de metacrilato. Si
las moléculas que hay que detectar son de cadena sencilla lógicamente no se pueden emplear
agentes intercalantes. En estos casos se tienen que emplear otros sistemas de detección.