UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS
ARMADAS-ESPE
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
Y VIROLOGÍA ( LABIV)
Laboratorio de Protocolo Versión 1
Inmunología - 13/04/18
Virología Extracción de ADN por kit comercial
INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN es un procedimiento fundamental en la biotecnología y biología molecular, esencial
para una variedad de aplicaciones, desde la investigación genética hasta el diagnóstico clínico (Almeida et
al., 2024). Los kits comerciales de extracción de ADN han revolucionado este proceso, proporcionando una
metodología estandarizada, eficiente y reproducible para aislar ADN de alta calidad a partir de diversas
muestras biológicas, como sangre, tejidos, células y plantas. (Koshy et al., 2017)
Estos kits están diseñados para simplificar el proceso de extracción, minimizando la variabilidad entre
experimentos y reduciendo el tiempo y los recursos necesarios. Generalmente, incluyen reactivos y columnas
de purificación que permiten la lisis celular, la eliminación de proteínas y otros contaminantes, y la
recuperación del ADN en una forma pura y concentrada.
Salmonella spp. es conocida por ser un patógeno común que causa infecciones gastrointestinales, mientras
que Escherichia coli incluye cepas tanto comensales como patógenas, siendo algunas responsables de
enfermedades graves (Choi et al., 2018). La extracción de ADN de estas bacterias permite la identificación y
caracterización de genes específicos, facilitando estudios de resistencia a antibióticos, virulencia y
epidemiología molecular.
El proceso de extracción de ADN de Salmonella y E. coli generalmente implican la lisis celular para liberar
el material genético, seguido de la purificación del ADN mediante métodos como la precipitación con
alcohol o el uso de kits comerciales que simplifican y estandarizan el procedimiento. La pureza y calidad del
ADN extraído son esenciales para asegurar la precisión en técnicas posteriores como la PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa) y la secuenciación.
FUNDAMENTO
La espectrofotometría es un mecanismo empleado para medir la densidad de la población bacteriana la cual
es determinada por la turbidez del cultivo y se expresa como densidad óptica en una longitud de onda
generalmente a 600 nm, la OD según la ley de Beer-Lambert es directamente proporcional a la concentración
de las partículas bacterianas de la solución, además permite determinar la tasa de crecimiento de cultivos
específicos (Mira et al., 2022). Teniendo en cuenta la curva de crecimiento de cada bacteria la cual determina
las fases del ciclo de vida de cada cultivo, se estima que el rango de densidad óptima en fase exponencial es
de 0.6 - 1.0 (Sezonov et al., 2007).
La importancia de la fase exponencial en los cultivos bacterianos se debe a que las células son robustas
generando una extracción de ADN más confiable, mientras que posterior a esta fase (fase estacionaria o
muerte), es decir un cultivo más envejecido, las células tienden a degradarse al igual que su material genético
provocando un ADN de menor calidad (Saxena, 2018).
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La extracción de ADN es el pilar para asegurar el éxito de una PCR y estudios posteriores (González de la
Cruz et al., 2011). El proceso inicialmente se basa en una lisis celular en donde se da lugar la ruptura de la
membrana plasmática y membrana nuclear para la liberación del ADN que se consigue generalmente por la
adición de soluciones tampón que poseen altas concentraciones de iones que actúan rompiendo la estructura
de las macromoléculas que forman parte de estas membranas, posterior las proteínas asociadas al ADN
deben precipitar por lo que se suele usar proteasas; seguido de ello se recupera en forma de pellet o
sedimento obtenido por centrifugación del ADN posterior a su precipitación con isopropanol debido a que el
mismo es insoluble en este compuesto, además este paso produce que las moléculas del ADN genómico
salgan de la solución de trabajo y permanezcan solubles los pequeños fragmentos de ARN (Tuya, 2016).
Para eliminar las sales restantes y mejorar la evaporación se realiza un lavado del pellet con etanol y
posterior se resuspende en un tampón acuoso para su posterior uso (Promega, 2016).
La medición a 260 nm se basa en la estructura química de las bases nitrogenadas que componen los ácidos
nucleicos (bases nitrogenadas aromáticas con dobles enlaces alternantes) los cuales absorben la luz uv debido
a los electrones π que poseen provocando una transición electrónica a un estado de mayor energía y
presentando una mayor absorción en este punto.Se debe determinar la pureza de la muestra usando la
relación de absorbancia de 260/280 nm en donde un valor de 1.8 es aceptado como muestra pura de ADN,
estas proporciones se usan para evaluar la presencia de contaminantes después del proceso de aislamiento de
ácido nucleico, ya que las proteínas (triptófano y tirosona) y fenol absorben a 280 nm (absorbancia < 1.6);
mientras si la relación es > 2.1, indica contaminación del ADN con ARN. Otra relación a tener en cuenta es
A260/230, que debería > 2.0. Si fuese inferior se debería a contaminación por compuestos orgánicos (Lucena
et al., 2016; Lee, 2017).
REACTIVOS:
● Agua destilada (H2Od)
● Àcido clorhídrico (HCl)
MATERIALES:
EQUIPOS:
● Micropipetas (1000 μL, 100 μL, 10 μL, 0.2 μL)
● Espectrofotómetro
● Termobloque
● Tubos Eppendorf de 1.5 mL
● Centrífuga
● Vórtex
MUESTRAS:
● Muestras de caldo de cultivo de 24 horas
METODOLOGÍA:
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Lectura con el espectrofotómetro:
1. Encender el espectrofotómetro y ajustar la longitud de onda a 600 nm para verificar la fase
exponencial del cultivo.
2. Limpiar las cubetas con agua destilada, evitando el contacto de los dedos con las zonas
transparentes.
3. Preparar un blanco utilizando 1 mL del medio de cultivo en una cubeta.
4. Añadir 1 mL del medio con bacterias a otra cubeta e introducirla en el espectrofotómetro.
5. La lectura de la absorbancia debería estar entre 0.6 y 1.
Extracción con kit:
1. Transferir 1 mL del cultivo líquido de 24 horas a un tubo Eppendorf de 1.5 mL.
2. Centrifugar a 8,000 rpm durante 5 minutos.
3. Descartar el sobrenadante cuidadosamente.
4. Repetir el proceso de centrifugación y descarte del sobrenadante un total de tres veces.
Lisis celular:
1. Añadir 600 μL de la solución de lisis nucleica y homogeneizar mediante pipeteo.
2. Incubar a 80°C durante 5 minutos.
3. Dejar que la muestra repose hasta alcanzar la temperatura ambiente.
4. Adicionar 3 μL de solución RNAsa y mezclar mediante inversión del tubo.
5. Incubar la mezcla a 37°C durante 30 minutos.
6. Permitir que la muestra vuelva a la temperatura ambiente.
Precipitación de proteínas:
1. Añadir 200 μL de solución de precipitación de proteínas a la muestra lisada.
2. Homogeneizar utilizando un vórtex durante 20 segundos.
3. Incubar la muestra en hielo durante 5 minutos.
4. Centrifugar a 13,000 rpm durante 4 minutos para precipitar las proteínas.
Precipitación y rehidratación de ADN:
1. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf estéril y añadir 600 μL de isopropanol.
2. Mezclar suavemente mediante inversión del tubo hasta observar la formación de un filamento
blanco.
3. Centrifugar a 13,000 rpm durante 3 minutos.
4. Descartar el sobrenadante y secar el tubo con papel absorbente.
5. Lavar el pellet de ADN con 600 μL de etanol al 70%.
6. Centrifugar nuevamente a 13,000 rpm durante 3 minutos y eliminar el sobrenadante.
7. Retirar el exceso de etanol con tiras de papel absorbente y dejar secar el pellet sobre papel durante 15
minutos.
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8. Añadir 50 μL de solución de rehidratación de ADN, ajustando el volumen según el tamaño del
pellet.
9. Incubar el tubo a 4°C durante 24 horas y almacenar a -20°C para su uso posterior
Nota:
● Se recomienda limpieza adecuada y blanqueo del equipo antes de usar.
1. Preparación de soluciones stock
Solución RNAsa A 20 mg/mL RNAsa A, 4 - 4 uL de RNAsa A
mg/mL solución de - 16 uL de solución de rehidratación de
rehidratación de ADN ADN
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD/ # MSDS:
● Según lo detallado en (CONICYT, 2018) antes de comenzar un protocolo se debe limpiar la
superficie de trabajo primeramente con savlón, seguido con alcohol al 70% para poder eliminar
contaminantes presentes y así también lavarse las manos. Se debe tener el área ordenada evitando la
acumulación de materiales no relaciones con el trabajo. Para la utilización de reactivos se debe
utilizar las cantidades y concentraciones indicadas en el protocolo del kit comercial para evitar
reacciones adversas al momento de realizar el mismo.
● Así también en (Flores Reyes et al., 2019) se especifica que el usar EPP como: guantes
preferiblemente de nitrilo, mandil y protección para ojos, sea minimiza la exposición de
contaminantes a las diferentes soluciones de trabajo y además, disminuir la exposición a sustancias
químicas y/o biológicas. Se deben colocar protocolos visibles para emergencias y accidentes en el
laboratorio.
● En este manual de trabajo se menciona un aspecto importante el mantener un registro detallado de
las muestras y procesos realizados, incluyendo nombre de la persona que realizó el trabajo, y
condiciones específicas del experimento realizado (Rodríguez Páez, 2022).
MANEJO DE DESECHOS:
● En (CONICYT, 2018) se indica también que se debe disponer adecuadamente los residuos generados
durante el proceso, es decir, colocar cada uno de ellos en el recipiente correspondiente. Además,
almacenar los resultados obtenidos debidamente rotulados y a la temperatura adecuada, en este caso
a 4°C.
BIBIOGRAFÍA
● Almeida, H. L., Jr, Faria, E. C., Assis, T. M., Leite, I. G. C., & Gimenes, V. M. F. (2024). First report
of white piedra caused by Cutaneotrichosporon debeurmannianum. Revista do Instituto de Medicina
Tropical de Sao Paulo, 66, e60. https://doi.org/10.1590/S1678-9946202466060
● CONICYT. (2018, Junio). Manual de normas de bioseguridad y riesgos asociados. Conicyt.
https://www.conicyt.cl/fondecyt/files/2018/06/Manual-_Bioseguridad-_junio_2018.pdf
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● Flores Reyes, R., Galeno Araya, H., Jiménez Salgado, M., Parra Rivas, B., Ramírez Muñoz, V., &
Scappaticcio Bordón, A. (2019). Guía de bioseguridad para laboratorios clínicos. ISPCH.
https://www.ispch.cl/sites/default/files/GU%C3%8DA%20DE%20BIOSEGURIDAD%20PARA%20
LABORATORIOS%20CL%C3%8DNICOS.pdf
● Koshy, L., Anju, A. L., Harikrishnan, S., Kutty, V. R., Jissa, V. T., Kurikesu, I., Jayachandran, P.,
Jayakumaran Nair, A., Gangaprasad, A., Nair, G. M., & Sudhakaran, P. R. (2017). Evaluating
genomic DNA extraction methods from human whole blood using endpoint and real-time PCR
assays. Molecular biology reports, 44(1), 97–108. https://doi.org/10.1007/s11033-016-4085-9
● Rodríguez Páez, L. (2022). Manual de Prácticas de laboratorio. Universidad de Córdoba.
https://larguez.science/ManLabBMA.pdf
● Choi, Y., Lee, S., Kim, H. J., Lee, H., Kim, S., Lee, J., Ha, J., Oh, H., Choi, K. H., & Yoon, Y.
(2018). Pathogenic Escherichia coli and Salmonella Can Survive in Kimchi during Fermentation.
Journal of food protection, 81(6), 942–946. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-17-459
● González-de la Cruz, J. Ulises, Delfín-González, H., Cruz-Leyva, Ma. C. de la, Rojas-Herrera, R. A,
& Zamudio-Maya, M.. (2011). Protocolo para la extracción de ADN metagenómico bacteriano del
langostino Macrobrachium carcinus L. Tropical and subtropical agroecosystems, 14(3), 875-883.
Recuperado en 17 de octubre de 2024, de
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1870-04622011000300015&lng=es&t
lng=es.
● Tuya, F. (2016). Extracción de ADN. Prácticas de Biología General.
https://fernandotuya.org/wp-content/uploads/2010/10/Pr%C3%A1cticas-gen%C3%A9ticas.-Extraci
%C3%B3n-ADN.-Abril-2016.-Alumnos..pdf
● DNA Purification | DNA Extraction Methods | Promega. (2016). Promega.com.
https://worldwide.promega.com/resources/guides/nucleic-acid-analysis/dna-purification/#:~:text=Th
ere%20are%20five%20basic%20steps,to%20a%20purification%20matrix%2C%204)
● Mira, P., Yeh, P., & Hall, B. G. (2022). Estimating microbial population data from optical density.
PLoS ONE, 17(10), e0276040–e0276040. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0276040
● axena, S. (2018). La edad de un cultivo bacteriano tiene un impacto en el aislamiento de su ADN?.
S
ResearchGate.
https://www.researchgate.net/post/Does_age_of_a_bacterial_culture_have_an_impact_on_its_DNA_
isolation#:~:text=In%20early%20exponential%20growth%20phase,during%20their%20exponential
%20growth%20phase.
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Y VIROLOGÍA ( LABIV)
● Lucena-Aguilar, G., Sánchez-López, A. M., Barberán-Aceituno, C., José Antonio Carrillo-Ávila,
José Antonio López-Guerrero, & Rocío Aguilar-Quesada. (2016). DNA Source Selection for
Downstream Applications Based on DNA Quality Indicators Analysis. Biopreservation and
Biobanking, 14(4), 264–270. https://doi.org/10.1089/bio.2015.0064
● Lee, A., & Jain, A. (2017). DNA Concentration measurement at 260 nm using Photopette® Bio.
Realizado por: Arroba Josué, Galeas Samanta, Portero María, Proaño Denny
Aprobado por: Marbel Torres, Ph.D.
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