Universidad de Oriente – Núcleo de Sucre – Escuela de Ciencias – Departamento de Bioanálisis – Bioquímica General
(200 - 2645) II – 2024
PRÁCTICA 7
TECNICAS PARA LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: LA ELECTROFORESIS
INTRODUCCIÓN
Las proteínas se mueven en un campo eléctrico como consecuencia de su carga eléctrica. En este proceso,
que se denomina electroforesis, las moléculas se separan unas de otras debido a las diferencias de su carga neta.
Por ejemplo, las moléculas con carga neta positiva migran hacia el electrodo con carga negativa (cátodo),
mientras que las moléculas con carga neta positiva se mueven hacia el electrodo con carga positiva (ánodo). Las
moléculas sin carga neta no se desplazan.
La electroforesis, una de las técnicas que más se utilizan en bioquímica, se realiza casi siempre utilizando
geles como los de poliacrilamida o de agarosa. El gel, que actúa de forma semejante a como lo hace en la
cromatografía de filtración en geles, también actúa para separar a las proteínas según su peso molecular y su
forma. Por consiguiente, la electroforesis en gel es muy eficaz para separar mezclas complejas de proteínas o de
otras moléculas.
Las bandas que se producen en una separación electroforética en gel pueden tratarse de varias formas. Pueden
cortarse las bandas específicas del gel después de observarlas con luz ultravioleta. Cada corte que contiene la
proteína se eluye con el amortiguador y se prepara para el paso siguiente. Debido a su elevado poder de
resolución, la electroforesis en gel suele utilizarse para valorar la pureza de las muestras dc proteínas. La tinción
de los geles con un colorante, como el azul brillante de Coomassie, es un método que se emplea mucho para
valorar de forma rápida el éxito de un paso de purificación.
Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en:
1. Separación electroforética mediante un campo eléctrico
2. Fijación de las proteínas sobre el soporte
3. Revelado de las proteínas para identificar su presencia y separación. Se realiza mediante colorantes
ácidos, negro amido, rojo Ponceau... que se fijan sobre las funciones básicas de las proteínas. El exceso
de colorante se arrastra con mezclas acético-agua, o metanol-acético, según el colorante utilizado con tal
de que se decolore el soporte sin elución del colorante fijado a las proteínas.
PRÁCTICA 7: Electroforesis – Profa. Lic. Hellen Bruzual, MSc.
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4. Cuantificación de las fracciones electroforéticas mediante fotómetros especiales (densitómetros) que
permiten cuantificar el colorante fijado a diferentes distancias del punto de aplicación, y con ello la
representación gráfica de la separación (proteinograma: gráfica que representa las fracciones proteícas del
suero sanguíneo).
La electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) resulta una variación ampliamente usada de
la electroforesis, que puede emplearse para determinar el peso molecular. El SDS (dodecilsulfato de sodio), un
detergente con carga negativa, se une a las regiones hidrófobas de las moléculas de proteína, lo cual hace que las
proteínas se desnaturalicen y asuman forma de varillas. Debido a que la mayoría de las moléculas se unen al
SDS de manera casi proporcional a sus pesos moleculares, durante la electroforesis las proteínas tratadas con
SDS migran hacia el ánodo (polo +) sólo en relación con su peso molecular.
Figura 1: Electroforesis en gel
Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo electroforético es de “acetato de celulosa” las
principales fracciones proteícas son
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· La fracción de albúmina (aprox. 64.5%): la que más migra respecto al punto de aplicación de la muestra
(cátodo).
· Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1 (a-1 globulinas, aprox. 3,6%), alfa 2
(a-2 globulinas, aprox. 6,5%), beta (ß-globulinas, aprox. 12,6%), y gamma (γ globulinas,
inmunoglobulinas o anticuerpos, aprox. 7,9%, es la banda que menos se desplaza y en sueros no
patológicos es la banda más ancha).
Es muy importante tener en cuenta que cada fracción está formada por un conjunto de proteínas con una
movilidad electroforética semejante aunque muy distintas en cuanto a su estructura y función. Además, excepto
la albúmina, el resto de las fracciones corresponden a grupos de proteínas, por ello, aunque el resultado de la
fracción sea normal, puede existir variación porcentual en sus componentes. Conviene corroborar los resultados
del proteinograma con ensayos inmunológicos más específicos como la inmunodifusión radial o la
inmunoelectroforesis.
PREGUNTAS A DESARROLLAR EN EL INFORME:
1. En un campo eléctrico, una molécula cargada positivamente migra hacia el:
a) Ánodo
b) Cátodo
c) Polo negativo
d) Polo positivo
e) a y d
2. ¿Qué factores afectan a la movilidad de una partícula en el seno de un campo eléctrico?
a) pH del tampón
b) Fuerza iónica del tampón.
c) Tamaño y forma de la partícula.
d) Potencial del campo.
e) Todos
3. ¿Cuál es el medio de soporte más empleado en electroforesis?
4. ¿Cuál es el método de elección para la lectura de un espectro electroforético?
a) Nefelometría
b) Turbidimetría
c) Elusión
d) Fotodensitometría
5. Hemos sometido una muestra de suero a una separación electroforética, a pH 7,9 sobre acetato de
celulosa
a) ¿Qué componentes se nos han separado en el proceso?
b) ¿A qué cambios en el proceso recurriremos según queramos cuantificar proteínas o
lipoproteínas?
6. ¿Sería conveniente llevar a cabo la electroforesis de proteínas a pH 6? ¿Por qué?
7. Para las siguientes mezclas de aminoácidos, prediga la dirección y la velocidad relativa de migración de
cada componente:
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(a) valina, ácido glutámico e histidina a pH= 7,6
(b) glicina, fenilalanina y serina a pH= 4,7
(c) glicina, fenilalanina y serina a pH= 5,2
(d) glicina, fenilalanina y serina a pH= 6,0
8. La glicina, al igual que la alanina tiene un punto isoeléctrico de 6,0. Trace estructuras de las formas
predominantes de la glicina a pH= 3,0; 6,0 y 12,0.
9. ¿Cómo podría explicar el hecho de que el triptófano tenga menor punto isoeléctrico que la histidina, pese
a que ambos tienen átomos de nitrógeno en el anillo de cinco miembros? ¿Cuál nitrógeno del anillo de
cinco miembros de la histidina es más básico?
10. Considérese el siguiente tripéptido: Gly-Glu-Val
a) ¿Cuál es el punto isoeléctrico aproximado?
b) ¿En qué dirección se moverá el tripéptido cuando se coloque en un campo eléctrico a pH 1, 5, 10 y
12?
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PRÁCTICA 8
TECNICAS PARA LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: CROMATOGRAFIA
INTRODUCCIÓN
La cromatografía que se diseñó para separar sustancias de peso molecular· bajo, como los azúcares y los
aminoácidos, se ha convertido en una herramienta invaluable en la purificación de proteínas. Existe una extensa
variedad de técnicas cromatográficas, que pueden utilizarse para separar mezclas de proteínas según las
propiedades moleculares, como el tamaño, la forma y el peso, o determinadas afinidades de unión. Con
frecuencia para obtener una proteína con una pureza demostrada deben emplearse varias técnicas de forma
secuencial. En todos los métodos cromatográficos, la mezcla proteínica se disuelve en un líquido conocido como
fase móvil. Al pasar las proteínas a través de la fase estacionaria (una matriz sólida), se separan unas de otras
debido a su distribución diferente entre las dos fases. El movimiento relativo de cada molécula es consecuencia
de su capacidad para permanecer asociada con la fase estacionaria mientras que continúa fluyendo la fase móvil.
Los tres métodos cromatográficos que se emplean de forma habitual en la purificación de proteínas son la
cromatografía de filtración en geles, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía por afinidad.
Figura 1: Cromatografía de columna
La cromatografía de filtración en geles es una forma de cromatografía por exclusión de tamaños en la cual
una columna empaquetada con un polímero gelatinoso separa a las moléculas según su tamaño y su forma. Las
moléculas que son mayores que los poros del gel quedan excluidas y por lo tanto se mueven con rapidez a través
de la columna. Las moléculas que son más pequeñas que los poros del gel se difunden dentro y fuera de los
poros, de forma que se retrasa su movimiento a través de la columna. Las diferencias de estas velocidades
separan la mezcla de proteínas en bandas, que se recogen separadas.
PRÁCTICA 8: Cromatografía – Profa. Lic. Hellen Bruzual, MSc.
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La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas según su carga. Las resinas de intercambio
aniónico, que están formadas por materiales con carga positiva, se unen de forma reversible con los grupos con
carga negativa de una proteína. De igual forma, las resinas de intercambio catiónico se unen a los grupos con
carga positiva. Tras eliminar las proteínas que no se han unido a la resina, se recupera la proteína de interés por
medio de un cambio adecuado del pH del solvente y de la concentración salina, o de ambos. (Un cambio de pH
altera la carga neta de la proteína).
La cromatografía por afinidad utiliza las singulares propiedades biológicas de cada proteína; es decir,
utiliza una afinidad de unión no covalente especial entre la proteína y una molécula especial, el ligando. Éste está
unido de forma covalente a una matriz insoluble, que se coloca en una columna. Tras pasar a través de la
columna las moléculas de proteína que no se unen, la proteína de interés se separa alterando las condiciones que
afectan a la unión (el pH o la concentración salina).
Figura 2: Cromatografía de filtración en geles
PRÁCTICA 8: Cromatografía – Profa. Lic. Hellen Bruzual, MSc.
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PREGUNTAS A DESARROLLAR EN EL INFORME:
1. A pH= 9,0, ¿Cuál será el orden de elución de una columna llena de polímero intercambiador de cationes
de los tres péptidos siguientes? Sus composiciones de aminoácidos son:
a) Péptido A: Ala (10%), Glu (5%), Ser (5%), Leu (10%), Arg (10%), His (5%), Ile (10%), Phe
(5%), Tyr (5%), Lys (10%), Gly (10%), Pro (5%) y Trp (10%)
b) Péptido B: Ala (5%), Val (5%), Gly (10%), Asp (5%), Leu (5%), Arg (5%), Ile (5%), Phe (5%),
Tyr (5%), Lys (5%), Trp (5%), Ser (5%), Thr (5%), Glu (5%), Asn (5%), Pro (10%), Met (5%) y
Cys (5%)
c) Péptido C: Ala (10%), Glu (10%), Gly (5%), Leu (5%), Asp (10%), Arg (5%), Met (5%), Cys
(5%), Tyr (5%), Phe (5%), His (5%), Val (5%), Pro (5%), Thr (5%), Ser (5%), Asn (5%) y Gln
(5%)
2. Un bioquímico quiere separar dos péptidos mediante cromatografía de intercambio iónico. Al pH de la
fase móvil que se va a utilizar en la columna, un péptido (A) tiene una carga neta de -3 debido a la
presencia de más residuos Glu y Asp que residuos Arg, Lys e His. El péptido B tiene una carga neta de
+1 ¿qué péptido eluirá antes en una resina de intercambio iónico? ¿Cuál de ellos eluirá primero en una
resina de intercambio aniónico?
3. Una mezcla contiene tres polipéptidos cuyas secuencias se muestran a continuación representadas
mediante el código de una sola letra para los aminoácidos:
Polipéptido 1: ATKNRASCLVPKHGALMFWRHKQLVSDPILQKRQHILLVCRNAAG
Polipéptido 2: PHLLSAWKGMEGVGKSQSFAALIVILA
Polipéptido 3: GPYFGDEPLDVHDEPEEG
De los tres ¿Cuál migrará más lentamente durante una cromatografía en:
a) una resina de intercambio iónico con las partículas recubiertas con grupos cargados
negativamente?
b) una resina de intercambio iónico con las partículas recubiertas con grupos cargados
positivamente?
c) una columna de exclusión molecular (filtración en gel) diseñada para separar péptidos pequeños
como éstos?
PRÁCTICA 8: Cromatografía – Profa. Lic. Hellen Bruzual, MSc.
