CULTIVOS CELULARES E INGENIERÍA DE TEJIDOS

TEMA 1B. CITOMETRÍA DE FLUJO. FUNDAMENTOS TEÓRICOS Y APLICACIONES PRÁCTICAS

LA CITOMETRÍA DE FLUJO es un método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y la
dispersión de la luz de células o partículas microscópicas que se encuentran en suspensión en un flujo continuo, al
incidir sobre ellas uno o varios laser.

Nos sirve para medir:

 Propiedades físicas
 Propiedades biológicas

A pesar de ser una técnica con un gran potencial (nos ofrece una gran cantidad de información) presenta la limitación
de presentar las células en suspensión, cosa sencilla en un cultivo celular.

La citometría de flujo es una técnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de salud para el diagnóstico y
seguimiento de muchas enfermedades tales como las leucemias, granulomatosis crónica, y SIDA; sin embargo, tiene
muchísimas otras aplicaciones en investigación básica, práctica y ensayos clínicos. Una variante común de esta técnica
es la separación física de partículas según sus propiedades, empleándose por ejemplo para purificar poblaciones de
interés.

La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser, empleada en el recuento y
clasificación de células según sus características morfológicas, presencia de biomarcadores, y en la ingeniería de
proteínas. En los citómetros de flujo, las células suspendidas en un fluido atraviesan un finísimo tubo transparente
sobre el que incide un delgado rayo de luz láser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las células a través del
tubo se recoge por medio de unos dispositivos de detección, permitiendo hacer inferencias en cuanto a tamaño y
complejidad de las células.

1. BREVE HISTORIA DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Técnica descrita por Wallace Coulter en 1950, pero se desarrolla en la década de los 60 (65-70) en EE. UU. y Alemania.

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A partir del 72 se empiezan a comercializar citómetros de flujo al “gran” publico, es decir, se hicieron ya modelos
comerciales disponibles. Posteriormente, en 1992, ya hay más de 6000 equipos en institutos de investigación y clínicos
de más de 65 países. Actualmente existen citómetros de flujos clínicos instalados en la práctica totalidad de hospitales
de los países desarrollados.

Resulta de la integración del desarrollo de otras técnicas fundamentales:

 El principio es muy parecido a la microscopia

 Tinciones citoquímicas o marcaje de anticuerpos que a su vez están unido a fluorocromos.

 Tinciones fluorescentes (1880).

 Anticuerpos conjugados (1950)
 Anticuerpos monoclonales (1975)

 Electrónica que detecten esos fotones y lo conviertan en pulsos que se puedan analizar con un ordenador.

 Fotomultiplicador: conversión de fotones en pulsos eléctricos, 1945.

 Informática

2. PARAMETROS BIOLÓGICOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

Se pueden medir parámetros de superficie celular, parámetros nucleares, parámetros extracelulares, parámetros
citoplasmáticos… así como actividades enzimáticas, cantidad de DNA en el núcleo de una célula, actividad mitocondrial,
vesículas y células…

Se pueden dividir en parámetros estructurales y funcionales:

Parámetros estructurales:

a. Tamaño y forma celular

b. Rugosidad de la membrana y granulosidad del citoplasma

c. Contenido en pigmentos

d. Contenido en DNA y RNA

e. Proteínas, lípidos y azucares de superficie y citoplasmáticos

Parámetros funcionales:

a. Viabilidad celular

b. Receptores de superficie

c. Permeabilidad celular

d. Actividades enzimáticas del citoplasma

e. Potencial de membrana mitocondrial

f. Estado de oxidación

g. Ca2+ intracelular

(MÁS EJEMPLOS EN LA TABLA 2 – DIAPOSITIVA 6)

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3. ¿CÓMO FUNCIONA UN CITÓMETRO DE FLUJO?- BASES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Los citómetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles de partículas por segundo, en tiempo real, y
pueden separar y aislar activamente partículas de acuerdo a propiedades específicas. Un citómetro de flujo es en cierta
forma similar a un microscopio, salvo que, en vez de producir imágenes de las células, los citómetros de flujo ofrecen
una cuantificación automática de una serie de parámetros con altísima calidad. Para analizar tejidos sólidos es posible
preparar en primera instancia una suspensión de células.

En un citómetro de flujo podemos encontrar tres partes principales:

Sistema de fluidos encargado de introducir las células en suspensión en la cámara de flujo y alinearlas individualmente
de modo que pasen a través del rayo de luz de a una y en fila.

Parte óptica: sistema de iluminación formado ya sea por lámparas de alta luminosidad (de mercurio, xenón) o láseres
(de alta potencia refrigerados por agua, láseres de baja potencia refrigerados por aire, láseres de diodo de baja
potencia…) que generan la señal luminosa que incide sobre las células y recoge la luz dispersada y la fluorescencia que
las células emiten.

Parte electrónica encargada de convertir las señales ópticas en señales eléctricas que son digitalizadas y analizadas en
un ordenador.

1.1. Sistema de fluidos:

Como bien hemos dicho anteriormente, las células deben pasar de forma alineada e individual. Para ello, la muestra es
inyectada a presión en el centro de un fluido envolvente, situado en el interior de la cámara de flujo, que se mueve a
gran velocidad ordenando a las células que circulan una a una frente a la fuente de excitación.

La introducción de un gran volumen de muestra en un pequeño canal hace que las células se organicen a lo largo de un
eje. Esto es llamado “Enfoque hidrodinámico”.

La diferencia de presiones evita la mezcla del líquido envolvente con la muestra, lo que derivaría en turbulencias, y que
los láseres no incidieran de forma óptima sobre las células. Esto es llamado “Flujo laminar”

1.2. Sistema óptico:

LUZ: radiación electromagnética perceptible por el ojo humano (400-750nm), compuesta por fotones que se propagan
como una onda electromagnética.

Normalmente utilizamos distintos tipos de láser, pero siempre nos solemos mover en el espectro visible, los
fluorocromos que se excitan en el ultravioleta se recogen en el visible.

Componentes ópticos

 Fuente de luz: láser (parte más cara del citómetro)

 Emisores de luz: células o partículas a analizar

 Discriminadores de luz: filtros

 Detectores de luz: tubos fotomultiplicadores

1.2.1. Fuentes de luz – Láser 1.2.2. Emisores de luz – Las células o

partículas en suspensión emiten
Línea de luz monocromática y unidireccional, generalmente de dos tipos de señales
una determinada longitud de onda.

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 Señales de dispersión
 Proporcionan una única longitud de onda
 Señales de fluorescencia
 Proporcionan intensidades desde el miliwatio al watio de luz

 Refrigerados por aire o agua.

 Coste muy variable.

Mientras mayor número de láser presente un citómetro más versátil será y mayor será su precio. Será
capaz de excitar a un mayor número de fluorocromos. Normalmente un citómetro básico suele tener
un láser azul y un láser rojo. Posteriormente en función del presupuesto se obtienen más o no láser.

A. Dispersión de la luz

El láser, al incidir sobre las células, produce varios fenómenos ópticos: (la luz incide sobre la célula y sobre cada gránulo
interno). La dispersión puede ser de dos tipos:

La dispersión frontal (FSC ó Forward Light Scatter) con desviación frontal de la luz es proporcional al tamaño de las
células.

La dispersión lateral (SSC ó Side Light Scatter) con desviación lateral de 90 o de la luz está relacionada con la granularidad
y complejidad celular.

 Los anticuerpos monoclonales unidos a sus correspondientes antígenos, son excitados por la luz láser y generan
fluorescencias que son recogidas por detectores y fotomultiplicadores que intensificarán la señal.

 Posteriormente la señal óptica es transformada en señal eléctrica. Toda la información es enviada al sistema
informático para su posterior análisis.

Sangre entera normal representada en gráfico de puntos.

FSC vs SSC. PMN: Neutrófilos. Mo: monocitos. Ly:
B. Fluorescencia

¿Cómo se produce? Los electrones son excitados a estados vibracionales y rotacionales más altos y cuando vuelven a su
estado fundamental emiten energía en forma de radiación.

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FLUORESCENCIA –DEFINICIONES

 Debido a la disipación interna de energía la luz emitida tiene siempre una longitud de onda mayor (menor energía)
que la luz de excitación.

 La cantidad de luz emitida es muy pequeña en comparación

con la cantidad de luz utilizada para la excitación.

 Los materiales que fluorescen lo hacen porque contienen

estructuras con configuraciones moleculares particulares
conocidas como fluoróforos o fluorocromos.

 Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y

emitir fotones de menor energía (mayor λ).

 Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de fluorescencia.

Espectros de excitación y emisión:

Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno representa un espectro de excitación y de
emisión característico y único.

 Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y
emisión.

Parámetros de fluorocromos: cada fluorocromo tiene su propio espectro de absorción y emisión.

¿Cómo elegir un fluorocromo?

 Debe tener capacidad de absorción de la luz láser del citómetro.

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 Debe emitir luz en un rango que pueda ser detectado por el sistema óptico del equipo.

 Es aconsejable utilizar fluorocromos brillantes para detectar moléculas de baja expresión.

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 Mejor fluorocromos débiles para antígenos que se expresan en alta densidad
en la célula

 En algunos casos si lo que queremos marcar es muy raro no hay anticuerpos

con todos los fluorocromos posibles y entonces debemos utilizar un anticuerpo
secundario

Debemos considerar los siguientes parámetros de los fluorocromos

1. Variación de Stokes: es la diferencia de longitud de onda entre la máxima de

excitación y la máxima de emisión.

2. Coeficiente de extinción: es la energía que absorbe un fluorocromo para

producir la fluorescencia a la λ determinada.

3. Rendimiento cuántico (Qf): es la proporción del número de fotones emitidos

sobre el número de fotones absorbidos. Son mejores fluorocromos aquellos
con mayores Qf, el máximo Qf es 1.
2
FOTONES EMITIDOS
QF =
FOTONES ABSORBIDOS

Podemos utilizar fluorocromos para marcar: proteínas mediante anticuerpos (Ac), ácidos nucleicos como el DAPI,
lípidos, iones, marcadores de estrés oxidativo, potencial de membrana (TMRM), específicos de orgánulos celulares…

Los fluorocromos más habituales son excitados con láser 488 λ.

Fluorocromos en tándem son fluorocromos que aprovechan la FRET (transferencia de energía de resonancia)  La
energía que procede de la fluorescencia del donador se utiliza para excitar al receptor, con lo cual no vemos la
fluorescencia de la primera molécula.

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Estos fluorocromos en tándem son muy útiles cuando nuestro citómetro no dispone de un gran número de láser ya que
la energia del primer fluoroforo excita al fluoroforo contiguo y por consiguiente acoplando unos con otros obtenemos
un gran abanico de fluorocromos.

 Minimiza el número de laser

 Maximiza el número de colores

 Emisión elevada de fluorescencia

 Necesaria la fotoestabilidad del tándem

3.2.3. Discriminadores de luz: filtros ópticos

La utilización de filtros intercambiables nos permite observar simultáneamente varios parámetros de fluorescencia.

TIPOS DE FILTROS:

Paso de banda (BP): son filtros de interferencia, pasa una banda de λ estrecha y
bloquean al resto.

630 Band-pass Filter

Paso largo (LP), permite el paso de fotones con λ por encima de su valor
nominal.

520nm Long-Pass Filter

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Paso corto (SP): permite el paso de fotones con λ por debajo de su valor
nominal.

575nm Short-Pass Filter

Dicroicos: se comportan como un espejo a una determinada λ y como filtros a

otras.

Filtro colcado a 450

https://www.youtube.com/watch?
annotation_id=annotation_1084606599&feat
ure=iv&src_vid=2P7YsJ0Zkio&v=EQXPJ7eeesQ
#t=5.7s
3.2.4. Detectores de luz: fotodiodo/tubos fotomultiplicadores

FOTODIODO: para señales muy intensas porque no es muy sensible. No se puede interferir en la señal que detectan

 El detector para FSC en un fotodiodo

 Un fotodiodo produce corriente cuando es expuesto a la luz.

 La luz dispersada frontalmente es muy intensa, por lo cual es suficiente con un fotodiodo.

TUBOS FOTOMULTIPLICADORES: para señales menos intensas porque son muy sensibles.

 Los detectores para SSC y para fluorescencia son fotomultiplicadores (PMTs) compuestos por un fotocátodo, un
dinodo y un ánodo.

 El fotocátodo es de un material fotosensible que emite electrones cuando recibe fotones de energía

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 El dinodo recibe los electrones y emite más electrones que pasan por la cadena de dinodos hasta el ánodo

 La cantidad de electrones para cada dinodo emite está determinada por el potencial entre los dínodos.

 La señal detectada depende del voltaje que apliquemos.

4. ESQUEMA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO

Configuración de filtros: serían los distintos fotomultiplicadores, habría como dos grupos uno para el láser rojo y otro
para el láser azul. El haz de luz que ha llegado a las células se refleja en los espejos dicroicos y se capta en función de
estos filtros.

EJERCICIO: CULTIVO DE FIBROBLASTOS HUMANOS REPROGRAMADOS A IPSCs

Cultivo de fibroblastos humanos reprogramados para convertirlos en IPSCs. Nos venden un Kit para comprobar si
realmente tenemos estas células, si hemos conseguido reprogramarlas. En el Kit hay 3 Anticuerpos:

 1 anticuerpo unido a un fluorocromo, un tándem: PerCP-Cy5

 otro unido a Alexa Fluor 647
 otro unido a PE.

Teniendo en cuenta el equipo que tenemos, con los láseres y los filtros, ¿nos sirve este Kit?

 Cuando tenemos varios laser, este laser no incide en células en el mismo punto que el siguiente. Debido a la
complejidad del numero de laser que tenemos, existen aplicaciones que nos facilitan a la hora de elegir un
fluorocromo

https://www.thermofisher.com/es/es/
home/life-science/cell-analysis/labeling-
chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

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En nuestro equipo tenemos un láser a 488 y otro a 640nm, junto con tres filtros (530/30, 585/40 y 675/25). Los
fluoróforos unidos a los Ac que vienen en el Kit son excitados por los láseres del equipo:

El láser 488nm excita al fluoróforo en tándem en su máximo y a PE. No excita a ALEXA Fluor 647.

El láser rojo a 640 excita a Alexa y PerCP5.5 (en menor cantidad). No excita a PE.

5. GENERACIÓN DE DATOS
Cuando sabemos que podemos utilizar el Ac con el fluorocromo nos vamos al
citómetro y obtenemos unos datos que van a tener esta forma, normalmente se
utilizan histogramas monoparamétricos (con un tipo de fluorescencia y el número
de células). Tenemos células que no emiten o emiten muy poca fluorescencia a la
izquierda y otras que si emiten fluorescencia a la derecha.

Si hemos hecho un doble marcaje se puede representar la fluorescencia de un

fluoróforo en el eje X y la del otro en el eje Y. Cada punto que vemos es una
célula, y con esto podemos calcular el porcentaje de células positivas o negativas
para cada fluorescencia.

En el histograma monoparamétrico: counts/ FL 1 log  las células más próximas

a la derecha presentaran una intensidad de fluorescencia mayor que las que
estén más próximas a la izquierda

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Con el histograma biparamétrico la información cambia, en este caso cada punto es una partícula, en cada eje vemos la
fluorescencia de uno de los dos fluoróforos. Mucha fluorescencia correspondiente un fluoróforo se representarán en el
primer cuadrante. Si presenta fluorescencia para ambos se representarán en el segundo cuadrante.

Amplificación ¿lineal o logarítmica?

El tamaño y complejidad se miden normalmente en escala lineal

(sangre total, líneas celulares, células procedentes de tumores) – Las
células más grandes se representan en la derecha.

…A no ser que los eventos sean extremadamente pequeños (por

ejemplo, exoxomas) o que las diferencias que queremos detectar
sean muy pequeñas (ciclo celular).

La fluorescencia se mide en escala logarítmica.

La amplificación logarítmica expande las señales débiles y comprime

la escala para señales muy fuertes, para ver en la misma escala
negativos y positivos  Interesa cuando hay grandes variaciones de
la señal, por ejemplo, en inmunofenotipaje

6. INMUNOFENOTIPAJE (Marcaje con anticuerpos)

Consiste en el reconocimiento de proteínas en la superficie celular mediante anticuerpos específicos. Nos sirve para:

 Definir subpoblaciones celulares dentro de una población celular heterogénea en base a la expresión de proteínas
que se expresan en la membrana celular identificables para anticuerpos específicos.

 Esta información se combina con parámetros intrínsecos de la célula (forma y complejidad) y otras características
medibles para CF (DNA, RNA, funcionalidad).

Parámetros celulares: tamaño, complejidad y

fluorescencia asociada al reconocimiento de un
antígeno.

(Histograma biparamétrico para la complejidad y el

tamaño mientras que se emplea un histograma
monoparamétrico para la fluorescencia)

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ANTICUERPO

El fluorocromo siempre va unido a la fracción constante del anticuerpo en cuestión. Se puede realizar un marcaje:

 Marcaje directo: el anticuerpo primario, asociado por su fracción constante al fluorocromo, se une por su fracción
variable al antígeno celular específicamente. Normalmente se lleva a cabo el immnunofenotipaje directo pues nos
da mejores resultados.

 Marcaje indirecto: el anticuerpo primario se une por su fracción variable al antígeno celular específicamente y por
su fracción constante se une a un anticuerpo secundario, el cual lleva asociado el fluorocromo en su fracción
constante. Esto permite amplificar la señal. Señalar que ambos anticuerpos se obtienen de distintos organismos.

 Comarcaje: se utilizan dos anticuerpos contra antígenos celulares diferentes, asociados cada uno de ellos a un
fluorocromo diferente.

En la gráfica podemos divisar las respectivas fluorescencias: ninguna, CD4-FITC, CD8-PE o ambas.

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7. MARCAJE INTRACELULAR
Para ello surge la necesidad de acceder al interior celular, para lo cual se debe fijar las células y permeabilizar sus
membranas.

Fijación + Permeabilización

Barreras:

 Se induce la degradación y enmascaramiento de epítopos

 Los epítopos inmovilizados pierden afinidad de unión al anticuerpo

 Las moléculas del interior celular limitan la difusión del anticuerpo.

Un ejemplo es el de la inducción de la vía de la β-catenina en la línea celular de cáncer de colon LS17T. En esta línea se
puede inducir la expresión de β-catenina con doxociclina, y además estas células llevan el anticuerpo de MGMT, que es
una proteína de reparación del DNA, de forma que mediante citometría de flujo se puede observar si se ha inducido o
no la vía.

Los resultados que se muestran indican que la vía de la β-catenina inducía la expresión de MGMT, y que inhibiendo esta
vía se inhibe la reparación del DNA.

Doxocyclina 1,5ug/ml MGMT-PE

Human iPSCs – FIBROBLASTOS Humanos reprogramados

Si usamos el Kit visto en el ejemplo de la página web tenemos estos resultados

El procedimiento realizado consistió en analizar mediante citometría de flujo la complejidad y el tamaño celular, y por
otro lado la intensidad de fluorescencia de CD13 (marcador de fibroblastos maduros o diferenciados) de una población
homogénea de fibroblastos. Nuestro objetivo es reprogramarlos, para ello debemos implantar pluripotencia con el fin
de que nuestros fibroblastos dejen de expresar dicho marcador.

Aquellas células que presentan mayor fluorescencia y complejidad en CD13 serán fibroflastos (rojo) y la otra población
serán células madre (verde). Haciendo un “gate” se seleccionan esas células y se estudia en ellas la intensidad de
fluorescencia de SSEA-4 (Alexa Fluor 647) y TRA-1-60 (PE).

A los 21 días de la transducción de factores que inducen pluripotencia realizamos una citometría con 3 anticuerpos y lo
que observamos es la población de fibroblastos en función del tamaño y la complejidad. En la gráfica 2 podemos
visualizar aquellas células que presentarán una mayor cantidad de marcador CD13 (representadas en rojo). Mientras

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más arriba se encuentren en la gráfica más Ac se habrá unido, luego más marcadores CD13 presentarán nuestras
células.

 Cuadro arriba medio: la mayoría de las células son fluorescentes, gran expresión en CD13. Pequeña población
(puntitos dispersos por debajo)

Ahora bien, tenemos una población positiva para el marcador pero que no expresan CD13 (LA GRÁFICA 3 ES EL
CUADRADO DE LA GRÁFICA 2). A los 21 días de la transducción llevamos a cabo un SORTING, es decir, una separación
celular activada por fluorescencia, de la población doble positiva para detectar de esta forma aquellas células que
tienen marcador de pluripotencia y separarlas (dentro del cuadro de la GRÁFICA 3). Así enriquecemos el cultivo con
células madre pluripotentes.

Volvemos a hacer el análisis de citometría a los 35 días de la transducción. Volvemos a ver CD13. En la gráfica 5 vemos
una mayor población que no expresa CD13. Dentro de esta población vemos una gran población (azules) que son
pluripotentes, que han pasado de fibroblastos a células madre. Podemos volver a hacer un sorting y separarlas,
teniendo un cultivo mucho más enriquecido en células madre pluripotentes.

 FACS: separación celular activada por fluorescencia (SORTING). ESTE EQUIPO NOS SEPARARA EN UN TUBO
AQUELLAS CELULAS QUE ESPRESEN LOS FARMACOS DE PLURIPOTENCIA PARA POSTERIOREMETE PODER
CULTIVARLAS

 A LOS 21 DÍAS APENAS SE OBSERVAN CÉLULAS MADRE, MIENTRAS QUE A LOS 35 DÍAS SÍ SE OBSERVAN (AZUL).

Compensación de fluorescencias: solapamiento de espectros de emisión de los canales de distintas fluorescencias.

Puede pasar que haya solapamiento en los espectros de fluorocromos, y para trabajar con más de un Ac se hace una
compensación de fluorescencia. Podemos observar como parte de la fluorescencia (espectro de emisión) del verde
(FITC) se solapa con la fluorescencia del amarillo (PE).

En la foto de la derecha vemos como se vería en un clitómetro una muestra de células sin compensar marcada con
estos dos fluorocromos. Vemos la que es positiva de una manera alargada. Después de la compensación conseguimos
ver que realmente las células son positivas para una y no para la otra.

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La solución a este problema es realizar controles de un solo color (simples) también es útil cambiar el voltaje para evitar
que solapen.

EJEMPLO: 5-color T-cell panel

14-color analysis – T/B/NK-T/Mono/Dendritic cell subsets

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8. VARIABILIDAD CELULAR
Las células muertas unen anticuerpo inespecíficamente y enmascaran a las células viables, por esto es por lo que es
bueno hacer un marcaje de variabilidad.

Las células muertas son permeables al ioduro de Propidio, lo primero que vemos es tamaño y complejidad. en la
izquierda las muertas aparecen a la izquierda y son más pequeñas que las vivas, luego en la foto de la derecha las
muertas, rojas, aparecen a la derecha.

8.1. ANÁLISIS DEL CONTENIDO EN DNA:

Hay múltiples fluoróforos, pero dependiendo de para que lo necesitemos se usan unos u otros. Los principales son:

Excitables por el azul (laser 488nm). Excitables por luz UV (laser 355nm).
 Propidium iodide  DAPI
 Acridine Orange  Hoechst
 7AAD

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8.2. CICLO CELULAR

Para analizar el ciclo celular primero debemos saber qué es y que contenido celular presenta cada fase.

Ciclo celular: análisis de población quiescente vs población en división

 G0 –La célula está en reposo, el contenido de DNA es2N

 G1 –la célula entra en ciclo, el contenido de DNA es2N

 S –la célula empieza a replicar su DNA, el contenido de DNA es de 2N a 4N

 G2M –la célula se prepara para dividirse. 4N.

 M –la célula está en Mitosis, las dos células hijas siguen unidas, el contenido de cada célula es 4N

En el clitómetro el ciclo se ve de esta manera, en la foto de la izquierda, el cloruro de

Propidio marca células muertas. Tenemos que permeabilizar para que entre en todas
las células y podamos ver tanto las células vivas como las muertas.

Tenemos una población con dos picos, hay un pico con más concentración de células,
las que tienen 2N tienen menos fluorescencia que las de 4N, las que están en fase S
tienen una cantidad intermedia y las de 4N aparece otra población que tienen el doble
de DNA que las 2N.

Si incubamos las celulas en fase s con bromodesoxiuridina y las incubamos con un

anticuerpo anti–bromodesoxiuridina vemos que las celulas en fase s se situan arriba de
las celulas en fase G0/G1 y G2/M en la segunda grafica .si no hacemos este marcaje saldrían en medio de ambas y no
las podriamos diferenciar. Así cuantificamos de una forma más precisa.

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8.3. DETECCIÓN DE APOPTOSIS

1. Mitocondria (apoptosis temprana)

 Expresión de proteínas inducidas específicamente (apo2.7)

 Reducción del potencial de membrana mitocondrial

2. Citoplasma (apoptosis tardía)

 Activación de caspasas (análisis de actividad enzimática)

3. Membrana plasmática (apoptosis tardía)

 Perdida de asimetría (marcaje con Annexin V)

 Permeabilidad (Marcaje con anti-Tunulin).

4. Núcleo (fragmentación de DNA)

 Pico Sub G0, incorporación de yoduro de propidio, IP.

A la izquierda sería un ciclo normal sin mucha apoptosis, las células que están
fragmentadas en la apoptosis tienen una cantidad de DNA menor y aparecen más a
la izquierda ya que son menos positivas, menos fluorescentes y se llama población
G0 y se puede cuantificar, pero no es muy específico.

8.4. DETECCIÓN DE APOPTOSIS CON ANEXINA V

Esta se une a los residuos de fosfatidol colina que en células apoptóticas se

encuentra en el exterior y al unirse esta se distingue de las células vivas y para
diferenciarlas de las células fragmentadas muertas se marcan también con IP

Las viables aparecen a la izquierda abajo son negativas para las dos, y las muertas
bien por apoptosis o bien porque se ha producido necrosis... las que aparecen
arriba derecha son dobles positivas. Y las apoptóticas están abajo a la derecha.

 En células viables, PS se encuentra en la cara interna de la MP.

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 En las células apoptóticas, la PS se localiza también en la cara externa de la MP.

 En presencia de Ca2+, Anexina V se une a la PS y detecta las células apoptóticas.

 Se tiñe simultáneamente con IP para distinguir células necróticas de apoptóticas*.

9. CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA CLINICA

 Diagnóstico de enfermedades hematológicas

 Identificación y seguimiento de leucemias

 Detección de enfermedad mínima residual

 Análisis de DNA y ciclo celular

 Análisis de eficacia de la quimioterapia en cáncer

 Análisis de la función plaquetaria

 Transfusiones

 Trasplantes

Los tejidos humanos de interés en Hemato-Oncología son suspensiones celulares donde la aplicación de la CF es directa

 Sangre periférica

 Aspirados de médula ósea

 Sangre de cordón umbilical

 Productos de aféresis

 Líquido cefalorraquídeo

10. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING, SEPARACIÓN CELULAR BASADA EN CITOMETRÍA DE
FLUJO “SPRTING”
“todo lo que se puede ver se puede separar”

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FACS es un citómetro con un láser y un detector o muchos y una cámara de flujo a través de la cual pasa las células y
son detectadas los distintos marcajes o fluorescencias pero esta técnica además separa mediante vibración primero y
separa en gotas este flujo para ello aplica la vibración y se puede hacer de tal forma que en cada gota haya una célula y
además aplicando un pulso podemos cargar esa gota positiva o negativamente y luego se pueden separar por dos
placas positivas y negativas para dividirlas ya que las positivas irán al polo positivo y viceversa y se separan en el tubo
que queramos.

Pulso eléctrico que marcará la superficie de las diversas gotas como + o – y en función de ese marcaje posteriormente
serán atraídas por uno y otro iman siendo clasificadas como positivas o negativas posteriormente en tubos

Se ven los hilillos de gotas y como hay 4 hilos continuos de fluidos y se separa en cuatro tubos

Si hemos hecho un marcaje con dos Ac tendremos cuatro poblaciones y las podemos separar en 4 tubos y si las
volvemos a pasar por el citómetro podemos ver si las ha separado bien o no.

Aplicaciones de sorting:

 Aislamiento de progenitores hematopoyéticos CD34+

 Asilamiento de células madre
 Aislamiento de poblaciones linfoides

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 Separación de células tumorales aneuploides por marcadores oncológicos

 Separación de espermatozoides X ó Y
 Aislamiento de cromosomas

CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIÓN

. Combinación de un citómetro con un microscopio de fluorescencia pues tiene una lámpara y una serie de filtros como
este, así se recoge la señal de fluorescencia cuando la lámpara excita a cada célula. A la vez que analiza la fluorescencia
de las células también va haciendo fotos a todas las células que van pasando.

Los resultados que se pueden obtener es de citometría normal y también de cada célula un contraste de fases (vemos
la célula y sus marcajes como la veríamos en un microscopio).

 Las células se centran hidrodinámicamente en una corriente principal y son iluminadas ortogonalmente tanto para
imágenes de campo oscuro como de fluorescencia. Las células son transiluminadas simultáneamente a través de
una fuente limitada espectralmente para obtener imágenes de campo claro.

 La luz se recoge de las células con lentes de imagen objetiva y se proyecta sobre un detector de carga acoplada
(CCD).
 Antes de la proyección sobre el CCD, la luz pasa a través de un sistema óptico de descomposición espectral que
dirige diferentes bandas espectrales a diferentes posiciones laterales a través del detector.

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