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com

6.5 Cromatografía impulsada por potencial (electrocromatografía – CEC) yo145

fin de año

propia movilidad micelar

Movilidad neta micelar

fin de año

micela

analito neutro
ventana de migración

Figura 6.11Movilidades de analitos neutros en un sistema de separación MEKC con EOF.

6.5
Cromatografía basada en potencial (electrocromatografía – CEC)

6.5.1
Instrumentación

La diferencia básica entre la cromatografía líquida y la electrocromatografía capilar (CEC) es que la

bomba mecánica utilizada en la cromatografía líquida se reemplaza por una fuente de alto voltaje que
proporciona un voltaje aplicado de 10 a 30 kV. El voltaje aplicado genera un flujo electroosmótico a
través de la columna, sin caída de presión en la columna. Debido al perfil de flujo plano de la
cromatografía capilar, se produce un menor ensanchamiento de banda y se pueden obtener mayores
eficiencias.
Para obtener un EOF, el material de la columna debe contener funciones superficiales
cargadas, silanoles u otros.
Para evitar la formación de burbujas, se puede conseguir una sobrepresión de unos 5 bares
mediante la incorporación de una bomba mecánica. Esta bomba también se utiliza para el cambio
rápido de fase móvil y el lavado de la columna.
InyecciónSe realiza mediante inyección electrocinética a 5-10 kV como en CE o mediante inyecciones
de gran volumen con enfoque como en LC.
DetecciónSe puede realizar mediante detección UV, fluorescencia o MS, como en CE, pero la
detección normalmente se lleva a cabo en un capilar conectado al extremo de salida de la
columna.

6.5.2
Fases móviles

La fase móvil en CEC generalmente consiste en agua.þmodificador orgánicoþTampón

(electrolito). El electrolito debe tener una fuerza iónica baja para reducir el calentamiento.
146yo6 Electroforesis y cromatografía impulsada por potencial
Dependiendo del material de la columna y del pH de la fase móvil, el EOF varía, pero
normalmente es de 0,2 a 1 mm.1.
También son posibles sistemas no acuosos, pero el disolvente debe tener una constante dieléctrica
suficiente.NORTE-La metilformamida se ha utilizado en CEC no acuosa, y dichos sistemas permiten el
uso de diámetros de columna más grandes (hasta 200metrom) debido a corrientes más pequeñas y, por
lo tanto, a un menor calentamiento.
La retención en CEC depende de la concentración del modificador, que afecta la fuerza de
elución. La elución en gradiente del modificador orgánico es posible, pero requiere una
instrumentación más complicada. El potencial aplicado influye en el EOF (caudal), al igual que el
pH y la fuerza iónica del electrolito. La temperatura también se puede utilizar para controlar la
retención.

6.5.3
Columnas y fases estacionarias

En la CEC se utilizan tres tipos principales de columnas: columnas capilares empaquetadas,

monolíticas y columnas tubulares abiertas, todas ellas fabricadas con capilares de sílice fundida.
Columnas capilares empaquetadasse preparan en 50–100metroCapilares de 20 a 50 cm de
diámetro interior. Están rellenos con partículas a base de sílice con el mismo diámetro de
partícula o menor que en la LC, pero sin fritas metálicas. Las fritas causan perturbaciones por la
falta de homogeneidad del campo y la formación de burbujas. Se pueden utilizar partículas más
pequeñas que las de la LC porque no hay caída de presión con el flujo impulsado por el
potencial. Las columnas rellenas de sílice fundida se pueden preparar rellenando primero la
columna contra una frita. Posteriormente, la columna se sinteriza en el medio y luego se lava
para eliminar las partículas en la segunda parte de la columna. La sinterización se realiza
mediante el calentamiento local del material de relleno de sílice. El siguiente paso es sinterizar la
entrada. Antes de su uso, se retira el revestimiento de poliimida en la ventana de detección y se
lava la columna con fase móvil mediante una bomba mecánica.
Debido a la superposición de la doble capa eléctrica, puede que no haya EOF dentro de las partículas,
dependiendo del tamaño de poro. Con partículas muy pequeñas, también existe la posibilidad de que se
superponga la doble capa eléctrica entre partículas, lo que da como resultado un EOF muy bajo en la
columna.
MonolitosSe fabrican mediante polimerización de monómeros (por ejemplo, acrilatos) en presencia de
reticulante, porógenos e inhibidor de polimerización en una proporción de 50 a 100.metroCapilares de sílice
fundida de identificación m.
Columnas tubulares abiertasSe preparan con recubrimientos superficiales cargados positiva o
negativamente. La mejor eficiencia se obtiene con <25metrom ID capilares.

6.5.4
CEC en la ciencia de la separación

La CEC tiene el potencial de generar mayores números de placas que la LC, puede proporcionar alta
selectividad y tiene mayor capacidad de muestra en comparación con la CE.
A pesar de estos hechos, la CEC no se ha convertido en un método muy utilizado. Una de las
razones es que no se encuentran disponibles instrumentos comerciales dedicados a la CEC.
 Referencias yo147

Las separaciones se llevan a cabo utilizando instrumentos CE modificados o instrumentación

ensamblada internamente. Otra razón es que la CEC aún no ha encontrado una "aplicación
clave" y que se ha encontrado difícil hacer columnas reproducibles. En principio, la CEC puede
utilizar el mismo tipo de fase estacionaria que en la LC, pero la fase estacionaria debe
seleccionarse con más cuidado ya que debe ayudar a generar el EOF. Otro problema con la CEC
es que el EOF puede cambiar con el tiempo como una función de la materia adsorbida de las
muestras complejas inyectadas.
En la actualidad, ningún fabricante comercial fabrica columnas de CEC dedicadas. Sin
embargo, se han demostrado varias aplicaciones que utilizan CEC, utilizando fases móviles tanto
acuosas como no acuosas, y la técnica tiene un gran potencial para la separación de muestras
complejas, como en proteómica y metabolómica debido a las altas eficiencias que se pueden
obtener.

Referencias

1Righetti, PG (2005) Electroforesis: Técnica avanzada ortogonal a LC-MS para

la marcha de los centavos, la marcha de las separación de alta resolución e identificación
monedas de diez centavos.Revista de precisa de moléculas.http://www
cromatografía A, 1079,24. . chromographytoday.com/article_read/
2Burnette, WN (1981) Transferencia Western: 833/. (consultado en diciembre de 2010).
Transferencia electroforética de proteínas desde 6Wang, Y., Fonslow, BR, Wong, CC,
geles de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio a Nakorchevsky, A., y Yates, JR, 3.º (2012)
nitrocelulosa no modificada y Mejora de la exhaustividad y la sensibilidad
Detección radiográfica con anticuerpos y de los capilares sin vaina
proteína A radioyodada.Bioquímica Electroforesis-espectrometría de masas en tándem
Analítica,112,195. para análisis proteómico.Química Analítica,
3Weinberger, R., y Cazes, J. (ed.) (2010) 84,8505.
Técnicas de inyección para CE.Enciclopedia de 7Britz-McKibbin, P. (2011) Capilar
cromatografía,Taylor y Francis, 3ª ed., vol. 2, metabolómica basada en espectrometría de masas por
pág. 1198. ionización por electroforesis y electrospray (CE-ESI-MS).
4Hempel, G. (2000) Estrategias para mejorar la Métodos en Biología Molecular,
Sensibilidad en electroforesis capilar para el 708,229.
análisis de fármacos en fluidos biológicos. 8Righetti, PG, Sebastiano, R. y Citterio,
Electroforesis,21,691. A. (2013) Electroforesis capilar y enfoque
5Greiner, M. (2010) Electroforesis capilar isoeléctrico en el análisis de péptidos y
acoplamiento a la espectrometría de masas (CE-MS), una proteínas.Proteómica,13,325.
 yo149

7
Cromatografía en un chip

7.1
Introducción

Aunque se desarrolló antes, el uso más común de la cromatografía en este formato

miniaturizado no se produjo hasta 2005. Existen varios modos, en su mayoría de
fabricación propia, de realizar cromatografía en un chip. Sin embargo, en los últimos años,
también se han puesto a disposición sistemas más desarrollados comercialmente. Este
capítulo describe brevemente varios aspectos generales de este tipo de dispositivos de
separación. Al igual que con la cromatografía líquida convencional, la cromatografía en un
chip se enfrenta a las siguientes preocupaciones: ¿cómo crear flujo?, ¿cómo inyectar una
muestra?, ¿qué fase estacionaria utilizar (y cómo se produce) y ¿cómo se detectan los
analitos?
Como ya se ha mencionado, existen numerosos dispositivos que pueden realizar cromatografía en
un chip. La figura 7.1 ofrece una idea de cómo puede ser un dispositivo de este tipo.

7.2
Ejemplo de introducción

La introducción de la muestra se realiza principalmente mediante inyección electrocinética. El

principio general de este tipo de inyección se muestra en la Figura 7.2. En esta representación
esquemática del sistema de inyección, hay cuatro depósitos: el depósito de muestra, el depósito
de desechos de muestra, el depósito de fase móvil y el depósito de desechos de fase móvil. Cada
uno de ellos está conectado a electrodos.
Durante la inyección, el campo eléctrico aplicado hace que la muestra fluya desde el
depósito de muestra hacia los desechos de muestra. Cuando la muestra ha pasado la
sección transversal con el microcanal que conecta el depósito de fase móvil y la columna/
desechos de fase móvil, el campo eléctrico cambia para dirigir el flujo desde el depósito de
fase móvil hacia los desechos de fase móvil. De esta manera, se introduce una cantidad
medida de la muestra en la columna.

Cromatografía: principios básicos, preparación de muestras y métodos relacionados,Primera

edición. Elsa Lundanes, L-eon Reubsaet y Tyge Greibrokk.
- 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Publicado en 2014 por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
 150 yo7 Cromatografía en un chip

depósito de amortiguación
Muestra de residuos

depósito de muestra

electrodo electrodo
residuos de amortiguación

electrodo

capilar de separación

electrodo
capa de vidrio 1
capa de vidrio 2

Figura 7.1Dispositivo de cromatografía en chip. Se introduce en el capilar de separación y se puede

Mediante diferentes ajustes de potencia, el líquido en generar un flujo de fase móvil o tampón de lavado. La
los capilares del chip puede transportarse entre las parte que está encerrada se llena con material de
distintas entradas y salidas. fase estacionaria (HPLC) o puede servir como capilar
conexiones. De esta manera, la muestra puede ser abierto para CE.

+
+ ES + ES ES
SR SUDOESTE SR SUDOESTE SR S Yo
fin de año

fin de año fin de año

Blanco y negro Blanco y negro Blanco y negro

(a) (b) (do)

Figura 7.2Introducción de la muestra en el dispositivo Se aplica entre BR y SR y se inyecta una pequeña

de chip. Cuando se aplica voltaje entre SR y SW, la sección de la muestra en el capilar de separación (c).
muestra (en rojo) se transportará al capilar a través del SR: depósito de muestra, SW: residuo de muestra, BR:
EOF. Después de un tiempo de inyección suficiente, la tampón del depósito de fase móvil, BW: tampón o
muestra pasará por la entrada del capilar de residuo de fase móvil.
separación (a y b). Luego se aplica voltaje.
 yo151
7.3 Columnas y fases estacionarias

7.3
Columnas y fases estacionarias

Materiales como vidrio, cuarzo, polidimetilsiloxano (PDMS), poliimida y copolímero de olefina

cíclica (COC) se han utilizado para fabricar el chip. A menudo se ensamblan varias capas en un
dispositivo (Figura 7.1). La microestructura de las capas se mecaniza mediante grabado
únicamente o mediante grabado y fundición. En la Figura 7.3 se muestra un ejemplo de
mecanizado de la microestructura en el vidrio. La capa inicial consta de vidrio cubierto con una
película de Cr y Au, que a su vez está cubierta con una película fotorresistente. Esta capa se
expone a la luz ultravioleta a través de una máscara (en la que se talla la microestructura) (Figura
7.3a). La parte expuesta de la fotorresistencia se revela y se retira (Figura 7.3b). Por lo tanto, solo
puede haber contacto entre la película de Cr y Au y los reactivos de grabado en la
microestructura. Primero, se graba la película de Cr y Au y, en el segundo paso, se graba el vidrio
(Figura 7.3c). Al eliminar tanto los restos de la fotorresistencia como las capas de Cr y Au (que no
quedaron expuestas), queda una capa de vidrio con un conjunto de microcanales bien grabados
(Figura 7.3d).

Cuadro de información 7.1

La columna en sí puede fabricarse como un único canal abierto o como un sistema

ramificado de canales que comienza en un microcanal y termina en otro microcanal. Este
último tipo se suele denominar COMOSS (estructura de soporte monolítico colocada). Con
algunos de los materiales mencionados, los canales pueden servir como fase estacionaria en
sí mismos o pueden funcionalizarse mediante recubrimiento, empaquetamiento o
polimerización en columna con fases cromatográficas adecuadas.

Luz ultravioleta

Máscara UV
(a)
fotoresistente
máscara de metal

vaso
(b)

(do)

(d)

Figura 7.3Representación esquemática de la fabricación de canales en un chip. (a–d): Varios estados

después del grabado (ver texto).
152yo7 Cromatografía en un chip
7.3.1
Columnas de canal abierto

Las dimensiones típicas para una columna de canal abierto son 20metrom-60metrom-10–15 cm.
La desventaja de las columnas de canal abierto es que solo existe una superficie de tamaño
limitado en la que pueden tener lugar las interacciones cromatográficas, lo que a su vez limita la
capacidad de la columna. Esto se puede evitar en parte recubriendo las paredes con partículas
porosas.

7.3.2
Columnas empaquetadas

El relleno de canales abiertos con partículas funcionalizadas, como en la cromatografía líquida

convencional, es un desafío debido a problemas de reproducibilidad y a la difícil inmovilización
de las partículas. Sin embargo, en la actualidad, existen excelentes dispositivos de cromatografía
en chip disponibles comercialmente con columnas rellenas con una gran variedad de fases
estacionarias.

7.3.3
Columnas monolíticas

Al realizaren el lugarAdemás de la polimerización, también se pueden producir columnas monolíticas.

Esto también mejora en gran medida el área superficial en comparación con las columnas de canal
abierto. Estos monolitos se pueden funcionalizar durante la polimerización o después.

7.3.4
COMOSS

Otra forma demejorar la superficieEl área es una ramificación de los microcanales desde un canal hasta
un laberinto regular de microcanales. Este laberinto de microcanales está generado por pequeños
pilares de forma uniforme (las dimensiones típicas pueden ser de 4metrom ancho-8metrom de
longitud- 5metrom de profundidad) colocados en un patrón regular con 2metrom de separación entre sí
(Figura 7.4). Estos pilares se pueden fabricar de manera que su superficie sea porosa. La superficie se
puede funcionalizar mediante modificación química, por ejemplo, nanotubos de carbono (tubos de
carbono grafítico a escala molecular). Esto produce una capa que tiene buenas propiedades de
retención de fase inversa y presenta un área superficial aumentada.

7.4
Gestión de flujo

Para producir un flujo robusto para la cromatografía en un chip, y que se encuentre en el rango bajo de
nanolitros por minuto, existen varios enfoques posibles. El flujo se produce mediante dispositivos
impulsados por presión (denominados sistemas de arriba hacia abajo) o mediante dispositivos
impulsados por electroósmosis (denominados sistemas de abajo hacia arriba).
 yo153
7.5 Detección

pilar

fluir

Figura 7.4COMOSS. Microcanales a través de un laberinto de pilares.

Bombas HPLC convencionales,En ausencia de nanobombas robustas, se utilizan con una

división para crear un nanoflujo. Aunque se pueden obtener flujos robustos, las desventajas son
un consumo relativamente alto de disolvente y que los gradientes pueden sufrir volúmenes de
retardo largos (a menos que la cámara de mezcla de gradientes esté cerca del chip o sobre él).
Bombas electroquímicasCrear una electrólisis de flujo continuo de la fase móvil en un
depósito cerrado en el chip. Este proceso conduce a la formación de gas, que a su vez puede
causar un flujo hidrodinámico de hasta 80 nl min-1.
Elflujo electroosmótico (El flujo electroósmosis (EOF) se genera a través de la atracción de los
iones cargados positivamente en la fase móvil cerca de la superficie cargada negativamente
hacia el electrodo negativo (ver también la Figura 6.2) o, en el caso de una superficie cargada
positivamente, hacia el electrodo positivo, ya que se crea una doble capa de iones cargados
negativamente. La ventaja del flujo generado por electroósmosis es que la velocidad de la fase
móvil es idéntica dentro y fuera de la estructura porosa. Para utilizar la electroósmosis, es
necesario que la superficie del canal esté cargada.

7.5
Detección

Fluorescencia inducida por láser (El LIF es especialmente adecuado para la detección en el
microchip. Es fácil enfocar el haz de luz en la trayectoria óptica del sistema y es poco
susceptible al ruido de fondo debido a su especificidad. Además de esto, la combinación
del LIF con tubos fotomultiplicadores sensibles (PMT) lo hace muy sensible. El LIF
154yo7 Cromatografía en un chip
El sistema de detección puede ser una parte externa del chip o, junto con el PMT, integrarse
mediante fibras ópticas. Otras fuentes de luz para la detección de fluorescencia son las lámparas
de xenón y mercurio y los diodos emisores de luz (LED).
Detección de los analitos separados medianteAbsorbancia UV-VisTiene un uso limitado. Esto se debe
a la corta longitud del recorrido óptico, que normalmente es la profundidad del microcanal. Las células
en forma de Z se han explorado con éxito en los laboratorios de investigación, pero aún son menos
aplicables que la detección de fluorescencia.
Detección espectrométrica de masasSe puede realizar mediante interfaces ESI. Como se describe en el
Capítulo 3, los dispositivos de nanopulverización muestran un rendimiento excepcional cuando se combinan con
la espectrometría de masas. Para evitar volúmenes muertos, la punta de electropulverización debe estar
integrada en el chip. Dado que los caudales son bajos, no se necesitan gases adicionales para crear una
electropulverización que funcione bien. En la actualidad, existe un enfoque creciente en el uso de la
espectrometría de masas como detección para la cromatografía en un chip.
Además de las técnicas de detección mencionadas anteriormente, se pueden utilizar
quimioluminiscencia, detección electroquímica y dispersión Raman; sin embargo, su área de
aplicación es limitada.

Cuadro de información 7.2

Para obtener más información, consulte la referencia [1].

Referencia

1Desmet, G. y Eeltink, S. (2013)

Fundamentos de la miniaturización de
LC. Química Analítica,85,543.
 yo155

8
Fraccionamiento de flujo de campo

8.1
Introducción

El fraccionamiento por flujo de campo (FFF) fue introducido por Calvin Giddings en 1966. El FFF
es una técnica similar a la cromatografía para la separación de macromoléculas, agregados y
partículas en el rango nanométrico-micrométrico, pero sin una fase estacionaria. Los
componentes de la muestra son transportados por una fase líquida móvil en un canal, que
puede tener forma rectangular, estar hecho de vidrio o metales, cubierto por una placa superior
o en una fibra semipermeable hueca. Un canal rectangular común tiene una profundidad de 0,1
a 0,5 mm, aproximadamente 50 a 500metrom de ancho y aproximadamente 1 m de largo.
Cuando se aplica una fuerza (un campo externo) perpendicular a la dirección del flujo, algunos o
todos los componentes de la muestra no solo migrarán hacia una pared en el canal, sino que
también tenderán a alejarse de la pared debido a la difusión. Dependiendo del tipo de campo, el
tipo de componentes de la muestra y sus constantes de difusión individuales, se formarán zonas
concentradas de los componentes a cierta distancia de la pared. Los componentes de la muestra
que se ven poco afectados por el campo se concentrarán en el centro del flujo, mientras que los
componentes fuertemente afectados estarán cerca de la pared de acumulación. Debido al perfil
de flujo parabólico en el canal y al impacto del campo, los componentes centrales se moverán
más rápido que los componentes más cercanos a la pared y se obtendrá una separación (Figura
8.1).
El tiempo de retención se puede dar como

aR¼aMETROReemplazar=6kT-en-tono; d8:1Þ

donde tMETROes tiempo de retención cero,Fes la fuerza (intensidad del campo),eles el

espesor del canal,aes la constante de Boltzmann, yyoes la temperatura absoluta.
Esta ecuación nos dice que la retención es una función de la intensidad del campo, las
dimensiones del canal y la temperatura. La magnitud de la intensidad del campo está
relacionada con el tipo de campo y con las propiedades de los componentes.
La fuerza puede ser un campo eléctrico, un campo magnético, un campo térmico,
centrifugación o un flujo cruzado de disolvente. Este último es el modo más común. Existen
instrumentos disponibles comercialmente para los modos de flujo cruzado [flujo FFF (FFFF)],
sedimentación/centrifugación (SdFFF) y térmico (ThFFF).

Cromatografía: principios básicos, preparación de muestras y métodos relacionados,Primera

edición. Elsa Lundanes, L-eon Reubsaet y Tyge Greibrokk.
- 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Publicado en 2014 por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
156yo8 Fraccionamiento de flujo de campo

Campo

Figura 8.1Separación de partículas con FFF.

Al final del canal se encuentra un detector. Los más habituales son un detector de rayos ultravioleta y
un detector de dispersión de luz láser, este último también para determinar el tamaño de las partículas.
Otra alternativa es la detección fuera de línea.
La señal del detector en función del tiempo de retención se denomina fractograma,
similar al cromatograma y al electroferograma.
En general, para partículas más pequeñas que aproximadamente 1metrom, la retención de partículas
pequeñas es menor que la de las más grandes. Sin embargo, para partículas mayores de
aproximadamente 1metrom, el orden de elución puede invertirse debido a coeficientes de difusión
pequeños. Esto se denomina modo de elución estérica (Figura 8.2).
La elución estérica FFF se basa de hecho en el mismo principio que otra técnica de
separación:cromatografía hidrodinámica.

8.2
Tipos de FFF

8.2.1
Flujo FFF

La FFF de flujo se obtiene mediante un flujo cruzado de la fase móvil, generalmente a

través de una membrana semipermeable. Esto se puede realizar con un canal simétrico
con dos paredes semipermeables, con un canal asimétrico con una sola pared permeable
o con un canal de fibra hueca. La FFFF es la técnica de FFF más universal.
 8.2 Tipos de FFF yo157

Campo

Figura 8.2Elución estérica FFF.

Aplicable a todas las especies. La fuerza motrizFse puede escribir como

F¼kTu=D¼3pág.o; d8:2Þ

dóndetúes la velocidad del flujo cruzado,Des el coeficiente de difusión,gramoes la viscosidad, y d

es el diámetro hidrodinámico de los componentes.
Esta ecuación, combinada con la Ecuación 8.1, nos dice que las partículas pequeñas son menos
retenidas que las partículas más grandes en FFFF, siempre que los diámetros de las partículas sean
mucho más pequeños que el diámetro del canal.

8.2.2
FFF térmica

La FFF térmica (ThFFF) se obtiene colocando el canal entre dos bloques conductores de
calor cuya temperatura está controlada. Un bloque suele contener un elemento calefactor
y el otro un refrigerante circulante. Una diferencia de temperatura de 100 K en un bloque
de 100metroEl canal de m de ancho es igual a 103kmm-1.
La fuerza motriz es

kTDyo dyo
F¼ - ; d8:3Þ
D Dx
dóndeDyoes el coeficiente de difusión térmica ydT/dxes el gradiente de temperatura
aplicado.
158yo8 Fraccionamiento de flujo de campo

0,43
0,33 µm 0,60 µm
0,23 micras
micras

Vacío 0,87 µm
cima
Respuesta del detector

0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min)

Figura 8.3 Separación de perlas de látex monodispersas mediante SdFFF.

Esta ecuación, combinada con la ecuación 8.1, nos dice que la retención de las partículas más
pequeñas es menor que la de las más grandes y que la intensidad del campo es una función de
la diferencia de temperatura. Sin embargo, los tiempos de retención son difíciles de calcular
porqueDyoLos valores no están fácilmente disponibles.

8.2.3
Sedimentación FFF

La FFF de sedimentación (SdFFF) contiene un canal conectado a una centrífuga giratoria.

La fuerza impulsora es la diferencia de masa efectiva (flotante):

F¼metromien2a; d8:4Þ

dóndemetromi¼metro(1-r/rpag) es la masa efectiva,enes la velocidad angular,aes el

radio centrífugo,aes la densidad de la fase móvil, yapages la densidad de partículas.
En la Figura 8.3 se muestra un ejemplo de separación SdFFF.

8.3
Aplicaciones

Debido a su diseño con canales de 50 a 500metroLa FFF es una técnica que se ha aplicado
principalmente a las macromoléculas. En comparación con las separaciones cromatográficas (en
SEC), el cizallamiento de las macromoléculas es un problema mucho menor en la FFF, lo que
reduce la posibilidad de degradar polímeros grandes.
SdFFF es particularmente útil para determinar la masa de nanopartículas con
moléculas unidas, como polímeros o proteínas.
 yo159
Referencia

La FFFF se ha utilizado para separar barras de nanopartículas de oro, que se utilizan en técnicas de
bioimagen. Dependiendo de su tamaño, estas barras de oro tienen diferentes máximos de absorción.
Por otra parte, la FFF se ha utilizado para separar agregados de proteínas (como los que se encuentran
en las enfermedades de Parkinson y Alzheimer), liposomas, coloides, diferentes partículas subcelulares,
nanotubos de carbono, fulerenos y puntos cuánticos.
Durante mucho tiempo se consideró que la FFF como técnica de separación era un método reservado
a intereses especiales. Recientemente, los diferentes modos de FFF han experimentado un renacimiento
tanto en las ciencias de la vida como en la ciencia de los materiales. La expansión futura probablemente
incluirá separaciones a escala preparativa y miniaturización para un mejor uso diagnóstico.

Cuadro de información 8.1

Más información sobre SFF está disponible en la Ref. [1].

Referencia

1Messaud, agente libre, Sanderson, RD, Runyon, Aplicaciones en la separación y caracterización

JR, Otte, T., Pasch, H. y Williams, SK de polímeros.Progreso en la ciencia de los
R. (2009) Una descripción general de las técnicas polímeros,34,351
de fraccionamiento de flujo de campo y sus
 yo161

9
Preparación de la muestra

9.1
Introducción

Aunque los métodos de separación analizados permiten separar y cuantificar analitos en

mezclas complejas, no todas las muestras pueden analizarse como tales. Esto puede
deberse a varias razones:

1) La muestra contiene componentes que pueden interferir en la determinación de

los analitos de interés.
2) La concentración de los analitos de interés es tan baja que no pueden detectarse en un
tamaño de muestra compatible con el sistema de separación.
3) La muestra contiene componentes que son perjudiciales para el sistema de separación.

En estos casos, se necesita un paso de preparación de la muestra. Los objetivos de la

preparación de la muestra son eliminar los compuestos que interfieren en la muestra,
aislar los analitos, enriquecerlos o mejorar sus propiedades de detección mediante la
derivatización.
Cabe señalar que la preparación de muestras a menudo es el cuello de botella en la
química analítica moderna y que se invierte mucho esfuerzo de investigación en
establecer nuevos principios y técnicas y en mejorar y automatizar las técnicas existentes.
Este capítulo incluye las siguientes técnicas para preparar muestras para análisis con
HPLC, GC y CE: extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida (SPE), microextracción
en fase sólida, preparación de muestras basada en membrana, espacio de cabeza y
precipitación de proteínas.

Cuadro de información 9.1

Para limitar el tamaño de este capítulo, no se han incluido técnicas de extracción como
la extracción Soxhlet, la extracción asistida por microondas, la extracción con fluidos
presurizados, la extracción con fluidos supercríticos y otras.
Para una descripción más completa, consulte la referencia [1].

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edición. Elsa Lundanes, L-eon Reubsaet y Tyge Greibrokk.
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 yo9 Preparación de la muestra
162

9.1.1
Recuperación

Una propiedad importante de un método de preparación de muestras es la capacidad de

recuperar el analito de la muestra. Esto no debe confundirse con el enriquecimiento (como se
analizará más adelante). La recuperación se define como la cantidad relativa de analito medida
en el extracto final en comparación con la cantidad en la muestra original. Se necesitan las
siguientes ecuaciones para describir la recuperación:

doextracto-Vextracto- 100%; do
Recuperación¼ muestra-V d9:1aÞ
muestra

doETS- Aextracto;
doextracto¼ d9:1bÞ
AETS

dóndedoextractoes la concentración de analito en el extracto final ydomuestraes la

concentración de analito en la muestra original.Vextractoes el volumen del extracto
final yVmuestraes el volumen de la muestra original.doETSes la concentración del analito
en un “extracto en blanco” al que se añade el analito.AextractoyAETSson las áreas de los
picos del analito en el extracto y del analito en la muestra en blanco fortificada,
respectivamente.
Desde un punto de vista práctico, la recuperación se puede medir de la siguiente manera.
Se deben preparar dos tipos de muestras: la muestra A es una muestra cruda fortificada con
una cantidad conocida de analito (estándar), preparada con el método de preparación de
muestra elegido, y la muestra B es una muestra cruda en la que el analito está ausente, pero que
también se prepara con el método de preparación de muestra elegido. A esta muestra B
preparada, se le agrega uncantidad conocidaSe añade del analito.
Las muestras preparadas A y B se inyectan por separado en el sistema cromatográfico y
se miden las áreas de sus picos de analito.
Los métodos de preparación de muestras fiables pueden tener recuperaciones típicas que varían
entre el 5 y casi el 100 %. Factores como la pérdida de muestra y analito, que a su vez son causados por
varias razones, reducen la recuperación. Una recuperación baja no significa necesariamente que el
método de preparación de muestras elegido no sea adecuado. Algunas técnicas de preparación pueden
dar lugar a grandes factores de enriquecimiento. En el caso de un método de preparación de muestras
con una recuperación del 10 %, un factor de enriquecimiento del 50 daría lugar a una intensidad
máxima en la muestra preparada que es cinco veces superior a la de la muestra bruta. Siempre que la
preparación de la muestra sea robusta y tenga una buena repetibilidad, recuperaciones tan bajas no
deberían ser problemáticas.

9.1.2
Enriquecimiento

El factor de enriquecimiento de una técnica de preparación de muestras se define de la siguiente manera:

do
Enriquecimiento¼extracto-; d9:2Þ
domuestra
 yo163
9.1 Introducción

Cuadro de información 9.2

Ejemplo de cálculo de recuperación:

Se preparan dos muestras, muestra A y muestra B, y se supone que el tamaño de la
muestra es 0,5 ml.
La muestra A en este ejemplo se prepara de la siguiente manera: 0,5 ml de plasma blanco
al que se agregó el analito de interés (por ejemplo, concentración final en elSin extraer La
muestra es 10metrogml-1) que rinde 0,1 ml de extracto.
La muestra B se preparó de la siguiente manera: se extrajeron 0,5 ml de plasma blanco, obteniéndose
0,1 ml.extracto en blanco.A este extracto en blanco se le añadió una cantidad conocida de analito (por
ejemplo, hasta una concentración final de 2metrogml-1).
Las muestras A y B se analizan por separado y se miden las áreas de pico (por ejemplo, las
áreas de pico para las muestras A y B son 350 000 y 25 000, respectivamente).
Primero,doextractoEs necesario calcular (Ecuación 9.1b):

doextracto¼concentración del analito en el extracto de la muestra A

¼desconocido;

doETS¼concentración del analito en el extracto de la muestra B

¼2 mg/ml-1;

AETS¼Intensidad máxima generada por el analito en la muestra B¼25 000;

Aextracto¼Intensidad máxima generada por el analito en la muestra A¼350 000;

2metrog-350 000
doextracto¼ ¼28 mg/ml-1:
25 000

Luego, la recuperación se puede calcular (Ecuación 9.1a):

R¼La recuperación¼desconocido;

doextracto¼de la ecuación 9:1b¼28 mg/ml-1;

Vextracto¼volumen del extracto¼0,1 ml;

domuestra¼Concentración del analito en la muestra A antes de la extracción.

¼10 mg/ml-1;

Vmuestra¼volumen de la muestra inicial¼0,5 ml;

28 mg/ml-1- 0,1 ml
Recuperación¼ - 100¼56%:
10 mg ml-1- 0,5 ml

Las ecuaciones 9.1a y 9.1b permiten determinar la recuperación utilizando todo tipo de
concentraciones, siempre que se conozcan.
 yo9 Preparación de la muestra
164

dóndedoextractoes la concentración en el extracto final ydomuestraes la concentración en

la muestra original.
El enriquecimiento es una propiedad relacionada con laconcentracióndel analito en la muestra.
cantidad absolutaEl enriquecimiento del analito siempre será el mismo o menor (según la recuperación)
en la muestra preparada. El enriquecimiento y la recuperación están relacionados entre sí en la
siguiente ecuación:

V - Recuperación
Enriquecimiento¼muestra : d9:3Þ
Vextracto- 100

Cuando el factor de enriquecimiento es inferior a 1, el analito preparado en la muestra

se diluye, mientras que un factor superior a 1 significa que el analito se enriquece. El
enriquecimiento se puede obtener simplemente reduciendo el tamaño de la muestra
utilizando temperatura o vacío para evaporar el disolvente. En este caso, el analito no
debe ser termolábil. Otras técnicas más elegantes que enriquecen el analito y eliminan los
componentes de la matriz son la extracción en fase sólida y las extracciones con
membrana.

Cuadro de información 9.3

Hay que tener presente que al discutir laconcentración de un analito en una muestra,
Siempre se refiere a laconcentración en la muestra cruda, antesSe ha realizado algún
pretratamiento de muestra.

9.2
Extracción líquido-líquido

La extracción líquido-líquido (LLE) es una técnica de preparación de muestras sencilla y

exhaustiva, basada en la partición de los analitos entre dos disolventes inmiscibles. En la mayoría
de los casos, la muestra que contiene los analitos de interés es una solución acuosa, mientras
que la fase de extracción es un disolvente orgánico. El coeficiente de particiónKLLEviene dada por
la siguiente ecuación:

½analitoorgánico
K LLE¼ : d9:4Þ
½analitoacuoso

En esta ecuación, [analito]acuosoy [analito]orgánicoson las concentraciones de analito

en las fases inmiscibles. El coeficiente de partición de un determinado compuesto
está influenciado por la temperatura, el pH, la fuerza iónica y la naturaleza de la
 9.2 Extracción líquido-líquidoyo165
fases. En caso de valores altos paraKLLE, el analito se encuentra principalmente en la fase
orgánica, mientras que valores bajos paraKLLEsignifica que el analito permanece principalmente
en la fase acuosa.
La naturaleza del analito que se va a extraer se tiene en cuenta al elegir la fase orgánica. Los
compuestos no polares se extraen mejor en disolventes no polares, mientras que la polaridad de la fase
orgánica debe ser mayor para los compuestos polares. La capacidad de aceptar o donar protones es de
gran importancia cuando se extraen compuestos ácidos y básicos. Los ácidos (donadores de protones)
se extraen mejor utilizando un aceptor de protones como el éter dietílico, mientras que los compuestos
básicos (aceptores de protones) se extraen mejor utilizando un donador de protones como el
cloroformo.
Los compuestos cargados pueden ser difíciles de extraer (baja solubilidad en la fase orgánica) debido
ainteracciones iónicas.Estas interacciones son fuertes y ocurren únicamente en soluciones acuosas
entre ácidos y/o bases ionizados y agua. Las interacciones iónicas se pueden minimizar suprimiendo la
ionización de los analitos. Para ácidos/bases débiles, esto se hace fácilmente ajustando el pH de la fase
de muestra. Los ácidos carboxílicos están al menos en un 99 % sin carga a un pH de 2 unidades.abajosu
pKa, mientras que los compuestos básicos están al menos en un 99% libres de carga a un pH de 2
unidades.arribasu pKa.
Para LLE, las siguientes interacciones son importantes (en orden creciente de
fuerza) (Figura 9.1):

Interacciones hidrofóbicas (a) Interacciones de

dispersión (inducidas por dipolos) (b) Interacciones
dipolares (c)
Interacciones de enlaces de hidrógeno (d)

Interacciones hidrofóbicaso las interacciones lipofílicas son interacciones no polares

débiles entre el analito y el solvente (Figura 9.1a). Un ejemplo típico es la buena
solubilidad de los hidrocarburos alifáticos ennorte-hexano.
Interacciones de dispersiónSon interacciones electrostáticas de atracción débil
entre una molécula no polar, pero rica en electrones, y una molécula polar (o
cargada) (Figura 9.1b). La molécula polar provoca un cambio de densidad electrónica
en la molécula no polar original al hacerla ligeramente polar. Esto se denomina
dipolo inducido o dipolo temporal. Un ejemplo típico de un compuesto de este tipo
es el benceno.
Interacciones dipolaresSon interacciones electrostáticas atractivas entre dos moléculas con
dipolos permanentes (Figura 9.1c). Un ejemplo típico es la buena solubilidad de los compuestos
nitrados aromáticos en diclorometano.
Interacciones de enlaces de hidrógenoson otro tipo de interacciones dipolares (Figura 9.1d).
Este tipo de interacción ocurre entre el átomo de hidrógeno que forma parte de un enlace polar
y un átomo electronegativo con un par solitario de electrones como O y N. Las interacciones
entre donantes de protones y un aceptor de protones, que es el caso tanto de los ácidos
disueltos en éter dietílico como de las bases disueltas en cloroformo, son ejemplos típicos de
enlaces de hidrógeno.
La selección de disolventes orgánicos en LLE se puede guiar mediante el uso del triángulo de
Snyder (Figura 9.2). En este triángulo, los disolventes se clasifican según sus propiedades:
 yo9 Preparación de la muestra
166

(a) (b)
I II

del+ del- del0

gran distancia entre las moléculas I y II

molécula I dipolo permanente

molécula II sin dipolo permanente

I II

del+ del- del+ del-

interacción hidrofóbica
corta distancia entre las moléculas I y II

(do) III (d)

I

del+ del- del+ del-

atracción entre dos dipolos permanentes en las aceptador donante

moléculas I y III ambas moléculas tienen dipolo
permanente

Figura 9.1Cuatro tipos de interacciones en LLE.

propiedades aceptoras de protones (incógnitami), propiedades donadoras de protones (incógnitad) y propiedades

de interacción dipolar (incógnitanorte), y se agrupan en ocho grupos diferentes. La Tabla 9.1 muestra ejemplos de
algunos disolventes típicos, a qué grupo pertenecen y qué valores corresponden a incógnitami,incógnitad, y
incógnitanorteellos tienen.

2
1
incógnitad

3 incógnitami

8 6
5
7

incógnitanorte

Figura 9.2Triángulo del disolvente de Snyder.

 9.2 Extracción líquido-líquidoyo167
Tabla 9.1Disolventes típicos y susincógnitaivalores.

Solvente Grupo incógnitami incógnitad incógnitanorte

Éter etílico 1 0,53 0,13 0,34

octanol 2 0,56 0,18 0,25
Quinolina 3 0,41 0,23 0,36
Alcohol bencílico 4 0,40 0,30 0,30
Diclorometano 5 0,29 0,18 0,53
Acetonitrilo 6 0,31 0,27 0,42
Nitroetano 7 0,28 0,29 0,43
Cloroformo 8 0,25 0,41 0,33

incógnitami:propiedades aceptoras de protones,incógnitad:propiedades donadoras de protones,incógnitanorte: Propiedades de interacción dipolar.

Disolventes del grupo 1 (por ejemplo, metilt-éter butílico) tienen valores altos paraincógnitamiy son buenos
aceptores de protones, mientras que los solventes del grupo 8 (por ejemplo, cloroformo) son buenos donadores
de protones. El grupo 5 representa aquellos solventes (por ejemplo, dicloroetano) que pueden dar fuertes
interacciones dipolares.
Al realizar LLE, se deben tener en cuenta tanto la relación de fases como el número de
extracciones. La relación de fases es la relación entre el volumen de la fase orgánica y el volumen
de la fase acuosa (Vorgánico/Vacuoso). Una buena estimación de la relación de fases necesaria se
encuentra en la ecuación para la recuperación de extracción para LLE:

KLLE-Vorgánico
Recuperación de extracción¼ : d9:5Þ
KLLE-½VorgánicoþVacuoso
Esta ecuación muestra que una sustancia con unaKLLEde 1 necesita una relación de fase de al menos 10
para obtener recuperaciones del 90 % o más. En caso de unKLLEde 100, una relación de fase de sólo 0,1
es suficiente para obtener las mismas recuperaciones.

Cuadro de información 9.4

Una forma de evitar el uso de cantidades excesivas de disolventes orgánicos cuandoKLLE

Los valores bajos son para realizar extracciones repetitivas. Una única extracción de un compuesto
con unKLLEUna extracción de 4 ml de una muestra de 2 ml con 2 ml de disolvente orgánico dará una
recuperación del 80 %. Una única extracción con 6 ml de disolvente orgánico dará una recuperación
del 92 %. Realizar una extracción repetida del compuesto de una muestra de 2 ml con 2 ml tres
veces (un total de 6 ml) dará una recuperación del 99,2 %.

9.2.1
Extracción de espalda

Al extraer ácidos y bases de una fase acuosa, se ajusta el pH de manera que estos
compuestos no tengan carga. Durante la extracción, estos compuestos, junto con
 yo9 Preparación de la muestra
168

con otros compuestos neutros no polares, terminará en la fase orgánica. Aunque ya

existe una buena limpieza de la muestra con respecto a los compuestos de interés,
podría ser beneficioso hacer una limpieza adicional. Esto se puede realizar mediante
retroextracción. En este caso, la fase orgánica de la extracción se mezcla con una
nueva fase acuosa en la que el pH es tal que los ácidos o bases de interés están
cargados. Luego, los ácidos y bases cargados se extraen nuevamente en la fase
acuosa, dejando los compuestos neutros no polares en la fase orgánica.
Dependiendo del sistema de separación, los extractos pueden inyectarse directamente o someterse a
un pretratamiento adicional. Es obvio que los extractos orgánicos no pueden inyectarse directamente
en la HPLC o CE de fase reversa. En estos casos, los extractos deben evaporarse hasta secarse y
redisolverse en un disolvente compatible. Los extractos acuosos pueden inyectarse directamente en la
HPLC o CE de fase reversa. Los extractos orgánicos pueden inyectarse directamente en un GC siempre
que el disolvente orgánico sea compatible con el método de GC. Tanto la retroextracción a volúmenes
bajos como la evaporación y redisolución en volúmenes pequeños se utilizan para enriquecer el extracto
y aumentar la concentración del analito o analitos.

9.3
Extracción en fase sólida (SPE)

La SPE es una técnica de preparación de muestras exhaustiva y prácticamente sin disolventes.

Normalmente, se llena un tubo con un absorbente, que puede ser partículas porosas o un monolito
polimerizado. Se utilizan diversas interacciones para extraer analitos de muestras complejas. Muchos de
los sistemas de SPE disponibles comercialmente son de un solo uso, pero algunos, como los materiales
de acceso restringido (RAM) y los polímeros de impresión molecular (MIP), se obtienen normalmente
como dispositivos de extracción reutilizables. Como se analizará en detalle, los absorbentes de
extracción funcionan principalmente como fase normal, fase inversa, intercambio catiónico, intercambio
aniónico o una combinación de estos.
Una característica importante es la cantidad de analito que se puede extraer sin saturar
el sorbente, definido como lacapacidaddel sorbente. La capacidad depende, como en
todas las técnicas cromatográficas, del tipo de sorbente (con o sin fase ligada) y del área
superficial. Cuanto mayor sea el área superficial, mayor será la capacidad. Al probar la
capacidad, esto debe hacerse con una matriz de muestra realista, ya que la capacidad no
depende solo del analito, ya que otros compuestos también pueden ocupar grupos
funcionales (y, por lo tanto, reducir la capacidad para el analito).
Como regla general, para los cartuchos de fase normal y fase reversa con partículas empaquetadas,
la capacidad es de aproximadamente el 5 % de la masa del material empaquetado. Esto significa que no
se deben aplicar más de 5 mg de analitos en un cartucho de SPE con 100 mg empaquetado.
En el caso de los intercambiadores de iones fuertes, la capacidad se expresa en miliequivalentes
(mequiv) por gramo de sorbente. Un mequiv equivale a 1 mmol de un analito con una sola carga. La
capacidad de la mayoría de los intercambiadores de iones fuertes varía entre 0,2 y 0,5 mequiv g-1Esto
significa que un intercambiador de iones de cationes fuertes empaquetado en 100 mg con una
capacidad de 0,5 mequiv g-1Puede retener 0,05 mmol de un compuesto básico monocargado.
La capacidad de otros materiales, como los intercambiadores de iones débiles, debería determinarse
experimentalmente.
 9.3 Extracción en fase sólida (SPE) yo169
1 2 3 4 5

analito de interferencia
hidrofóbica, interferencia
hidrofílica

Figura 9.3Pasos típicos de la SPE en fase reversa. El sorbente primero (1) se activa (acondiciona) y luego
(2) se lava (enjuaga). Se aplica la muestra (3) y el sorbente se lava (4) nuevamente antes de eluir el
analito (5).

Aunque el procedimiento SPE puede variar, en general se lleva a cabo en los siguientes
pasos (Figura 9.3):

1) acondicionamiento del sorbente,

2) enjuagar el absorbente,
3) aplicación de la muestra,
4) enjuagar el sorbente con un solvente de concentración de elución adecuada, y
5) elución del analito con un disolvente de concentración de elución adecuada.

Aunque estos pasos son comunes para la mayoría de los procedimientos de SPE, la
naturaleza del analito, la muestra y el sorbente de SPE determinan qué solvente se debe
utilizar en cada paso.
La Tabla 9.2 muestra las propiedades típicas de cada uno de los pasos para cuatro absorbentes SPE
comúnmente utilizados.

Tabla 9.2Diversos sorbentes y pasos típicos a realizar durante el proceso SPE.

Absorbente

Fase inversa Fase normal Intercambio de cationes y aniones

Paso Condición con una Condición con una Acondicionar con un tampón de
1/2 disolvente no polar, entonces disolvente no polar suficiente fuerza iónica y
Enjuagar con agua con contraión apropiado, luego
pH adecuado. enjuagar con agua o tampón con
pH apropiado.

Paso 3 Aplicar la muestra

Paso 4 Enjuagar con un disolvente Enjuague con un Enjuagar con un tampón débil con
polar con pH adecuado. disolvente no polar un pH adecuado.
Paso 5 Eluir con un eluyente no Eluir con un eluyente Eluir con un tampón fuerte con
polar con concentración y polar con un pH apropiado.
pH adecuados. adecuado
fortaleza
 yo9 Preparación de la muestra
170

Durante la etapa de acondicionamiento, el sorbente se humedece (o se solvata).

Como se mencionó anteriormente, existen varios tipos de sorbentes SPE, ya sea
con o sin fase ligada. Los sorbentes más utilizados se analizan en la Sección 9.3.1.

Cuadro informativo 9.5

La SPE también se puede realizar en línea con HPLC en un sistema de cambio de columnas [2].

9.3.1
Fase normal

En la extracción en fase normal, los compuestos con grupos funcionales polares se

extraen de una muestra no acuosa. La retención se basa en interacciones polares, como
interacciones basadas en carga, enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo e
interacciones de dispersión entre el sorbente y el analito. Las interacciones basadas en
carga a menudo no son necesarias en la fase normal, ya que son muy fuertes y difíciles de
alterar (Figura 9.4).
Algunas de las otras interacciones ya se han analizado y se muestran en la Figura 9.1.
Los grupos funcionales típicos que pueden interactuar con el sorbente son hidroxilo,
amino, carbonilo, aromáticos, enlaces dobles y grupos que contienen heteroátomos como
oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo.
Los absorbentes típicos para SPE en fase normal sonsílice, ciano, diol, NH2(todo a base de
sílice), alúmina (Alabama2Oh3basado), yFlorisil (MgSiO3basado) (Tabla 9.3).
Dado que la SPE en fase normal suele basarse en interacciones polares, es importante que tanto la
matriz de muestra como el acondicionamiento, el equilibrio y el disolvente de lavado sean orgánicos no
polares. Esto es para garantizar que no haya elución del analito (y, por lo tanto, pérdida de analito)
durante la aplicación de la muestra y el lavado del sorbente. Los analitos se eluyen mediante

Figura 9.4El MDMA con carga positiva interactúa fuertemente con los grupos silanol con carga
negativa.
 9.3 Extracción en fase sólida (SPE) yo171
Tabla 9.3Nombre del absorbente, su estructura química y uso principal.

Nombre del absorbente Estructura química Usar

Silano notario público

Ciano NP/RP

Diol NP/RP

Aminoácido (NH2) notario público

C18 RP

C8 RP

C2 RP

Ciclohexilo RP

Fenilo RP

NP: fase normal, RP: fase revertida.

 yo9 Preparación de la muestra
172

aplicando un disolvente polar (orgánico) más fuerte, es decir, disolventes con alta fuerza
eluotrópica (mi0) (Tabla 3.2).

Cuadro de información 9.6

Muchas de las interacciones analizadas en este capítulo también se analizan en la

Sección 3.5.

9.3.2
Fase inversa

Las extracciones en fase reversa se utilizan para enriquecer compuestos no polares a partir de
una matriz de muestra polar. La extracción se basa en interacciones entre enlaces carbono-
hidrógeno del compuesto y el sorbente. Estas interacciones hidrofóbicas se muestran en la
Figura 9.1a y se han analizado en la Sección 3.5.2. La mayoría de los compuestos orgánicos
contienen grupos ricos en carbono-hidrógeno y, por lo tanto, se conservarán. Las excepciones
son los compuestos ionizados o los compuestos con relativamente muchos grupos funcionales
polares. Los materiales a base de sílice modificados con grupos C2, C4, C8, C18, ciclohexilo, fenilo
y ciano son ejemplos de sorbentes en fase reversa (consulte la Tabla 9.3 para conocer sus
estructuras).
Se debe tener especial cuidado para obtener una SPE de fase inversa robusta y
repetible. Todos los sorbentes hidrófobos deben activarse; esto se hace por solvatación
con un solvente orgánico polar (por ejemplo, acetonitrilo o metanol). El solvente orgánico
polar debe eliminarse con agua o un tampón; los restos de solvente orgánico polar,
debido a su fuerza de elución, pueden alterar la interacción analito-sorbente. La muestra,
una matriz polar, se aplica y el sorbente se lava con agua o un tampón para eliminar todos
los componentes polares. La elución del analito se lleva a cabo con una mezcla de tampón
acuoso y un solvente orgánico polar, que tenga la fuerza de elución adecuada, dejando
más componentes de muestra hidrófobos en el sorbente SPE.

9.3.3
Intercambio iónico

En la extracción por intercambio iónico, los compuestos con grupos funcionales cargados se extraen de
una muestra acuosa. La retención se basa en las interacciones de carga entre el sorbente y el analito.
Cuando es necesario extraer compuestos ácidos, se utilizan intercambiadores de aniones. En el caso de
la extracción de compuestos básicos, se utilizan intercambiadores de cationes. Tanto en el intercambio
aniónico como en el catiónico, se hace una diferencia entre intercambiadores de iones débiles y fuertes
(véase también la Sección 3.5.3). Un intercambiador débil contiene grupos funcionales como fase
enlazada en el sorbente en la que la carga puede verse influenciada por el pH del tampón utilizado
durante la extracción. Un ejemplo de un intercambiador de aniones débil es el sorbente NH2(pagKa
aprox. 9,8). Este material estará cargado positivamente por debajo de un pH de 7,8 (99 % protonado 2
unidades de pH por debajo de su pKavalor) y principalmente sin carga a valores de pH
 yo173
9.3 Extracción en fase sólida (SPE)

Sin interacción fuerte interacción

pH < pKa pH > pKa

Figura 9.5Interacción entre el sorbente de amonio cuaternario y el ácido benzoico a valores de pH inferiores y
superiores al pKavalor del ácido benzoico.

por encima de 11,8 (99% desprotonado 2 unidades de pH por encima de su pKa). Un analito
como el ácido benzoico con apKaUn valor de 4,2 tendrá una interacción mínima a pH 2, ya que no
tendrá carga. A pH 7, el ácido benzoico interactuará fuertemente con el intercambiador de
aniones, ya que el analito tiene carga negativa y el intercambiador de aniones tiene carga
positiva. A pH 12, habrá una interacción mínima, ya que el intercambiador de aniones no tiene
carga (Figura 9.5).
Un intercambiador de iones fuerte contiene grupos funcionales que están cargados en todo el
rango de pH. Un ejemplo de un intercambiador de cationes fuerte es un ácido sulfónico alifático
enlazado. Este ácido fuerte tiene unaKapor debajo de 1, lo que indica que está cargado
negativamente en todo momento. El único efecto que tendrá el pH en la interacción entre un
analito cargado positivamente y este intercambiador de cationes fuerte está relacionado con el p
KaValor de los grupos funcionales básicos del analito. El fármaco anestésico local lidocaína (pKa
7.9) interactuará con el intercambiador de cationes fuerte a pH 5 (tanto el intercambiador de
cationes como el analito están cargados), pero no tendrá interacción a pH 11 (solo el
intercambiador de cationes está cargado) (Figura 9.6).
Hay varios tipos de intercambiadores de iones y algunos de los más comunes se enumeran en la
Tabla 9.4.

fuerte interacción Sin interacción

pH < pKa pH > pKa

Figura 9.6Interacción entre el sorbente de ácido sulfónico y la lidocaína a un pH inferior y superior al pKavalor
de la lidocaína.
 yo9 Preparación de la muestra
174

Tabla 9.4Cuatro intercambiadores de iones diferentes con su estructura química.

Intercambiador de tipo/sorbente Superficie/pKa

Ácido propilsulfónico/SCX Ácido SiC2es2es2ENTONCES3-

carboxílico alifático/WCX Amina SiC2es2COOH/4,8SiC4H2
cuaternaria/SAX es2es2norteþ(ES3)3
Aminopropilo/cera SiC2es2es2NUEVA HAMPSHIRE2/9.8

WCX: intercambiador de cationes débil, SCX: intercambiador de cationes fuerte, WAX: intercambiador de aniones débil, SAX: intercambiador de

aniones fuerte.

Las condiciones de activación del sorbente de intercambio iónico, la aplicación de la muestra,

el lavado del sorbente y la elución dependen en gran medida de la naturaleza del analito y de las
fases enlazadas. La Tabla 9.5 muestra una descripción general específica de las condiciones de
estos pasos.

Cuadro informativo 9.7

Las interacciones iónicas en la SPE son interacciones muy fuertes. A menudo se requieren
condiciones fuertes para liberar completamente los analitos cuando estos se unen
electrostáticamente a los sorbentes de fase sólida.

Tabla 9.5 Diversos sorbentes y los pasos típicos a realizar durante el intercambio iónico.
proceso.

Acondicionamiento de absorbentes Aplicación de muestraa) Lavar Eluirb)

activacióna)

SCX Agua o Tampón con pH < Tampón con pH < pH del tampón >
pagKanalito pagKanalito pagKanalito
buffer a - 2 a - 2 a þ2
pH > 7
WCX Tampón con pH < Tampón con pH < pH del tampón >
pagKanalito pagKanalito
a - 2 pero a - 2 pagK
a analitoþ2 o tampón
Preferiblemente por encima de pH Preferiblemente arriba pH < pKsorbente
a - 2
7 en caso de WCX pH 7
SAXÓFONO Agua o Tampón con pH > Tampón con pH > pH del tampón <
pagKanalito pagKanalito
buffer a þ2 pH > pKanalito
a þ2 a - 2
pH < 7
CERA Tampón con pH > pKanalitoþ2 Tampón con pH > pH del tampón <
pagKanalito
preferiblemente
a por debajo a þ2 pagK
a analito- 2 o buffer
de pH 7 Preferiblemente debajo pH > pKsorbente
a þ2
pH 7

a)La fuerza de los iones debe mantenerse baja para permitir la retención del analito.

b)La fuerza iónica puede ser alta para eluir el analito.

 yo175
9.3 Extracción en fase sólida (SPE)

9.3.4
Intercambio iónico de modo mixto

El intercambio iónico en modo mixto (SPE) combina la fase inversa con el intercambio iónico. Con este modo de
SPE, se pueden obtener extractos muy limpios de analitos. El intercambio iónico en modo mixto retiene tanto los
compuestos neutros como los compuestos cargados. Un ejemplo típico de un intercambiador de cationes en
modo mixto es un ácido sulfónico aromático unido a un sorbente hidrófobo. Un intercambiador de aniones en
modo mixto típico es una amina cuaternaria unida a un sorbente hidrófobo. La gran ventaja de estos materiales
es que después de la aplicación de la muestra, la interacción de los analitos ionizables depende tanto de la carga
como de la hidrofobicidad. Después de la aplicación de la muestra, el sorbente se puede enjuagar en dos pasos.
El primer paso es el enjuague con un tampón acuoso con un pH bajo (en caso de extracción de un analito básico
en un intercambiador de cationes de modo mixto) para eliminar todas las sales y ácidos polares, o enjuague con
un tampón acuoso con un pH alto (en caso de extracción de un analito ácido en un intercambiador de aniones de
modo mixto) para eliminar todas las sales y bases polares. En el segundo paso, el disolvente de enjuague debe
ser un disolvente orgánico ácido (por ejemplo, ácido fórmico en metanol; en caso de un analito básico en un
intercambiador de cationes de modo mixto) o un disolvente orgánico básico (por ejemplo, amoníaco en metanol;
en caso de un analito ácido en un intercambiador de aniones de modo mixto). Durante el segundo paso, los
analitos permanecerán en el sorbente, pero los compuestos hidrófobos no cargados se eliminarán. La elución se
realiza con un disolvente orgánico básico en el caso de un analito básico en un intercambiador de cationes de
modo mixto o con un disolvente orgánico ácido en el caso de un analito ácido en un intercambiador de aniones
de modo mixto.

9.3.5
PMI

Los polímeros con impresión molecular son materiales hechos a medida para analitos
específicos. Se utiliza una plantilla (estructuralmente relacionada o idéntica al analito) para
generar un sorbente con la mayor selectividad de interacción hacia el analito de interés. La
Figura 9.7 muestra el proceso general de fabricación de materiales con impresión molecular.
Se mezclan uno o varios monómeros con capacidad de reticulación y la plantilla. Los
monómeros se eligen de forma que interactúen (enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas)
con la plantilla. Cuando los monómeros se disponen alrededor de la plantilla, se polimerizan. A
continuación, el producto polimerizado se muele y se tamiza para obtener partículas de un
tamaño determinado. Las partículas contienen ahora la plantilla capturada en la cavidad hecha a
medida. Después de rellenar los cartuchos o las columnas con el material MIP, es necesario lavar
la plantilla. Los materiales MIP suelen estar destinados a la reutilización. La impresión molecular
también se puede realizar con capas porosas/películas delgadas.

Cuadro de información 9.8

Si se utiliza el analito deseado como plantilla, suele ser difícil eliminarla por completo.
Por este motivo, se suelen utilizar plantillas con una estructura ligeramente diferente.
 yo9 Preparación de la muestra
176

(a) (b)
monómero
monómero

plantilla

monómero

(do) (d)

Figura 9.7Fabricación de material MIP. (a) Se Los monómeros se polimerizan en presencia

mezclan los monómeros y la plantilla. de la plantilla. (d) La plantilla se lava y deja
(b) A través de una interacción específica, los monómeros se una cavidad específica.
organizan alrededor de la plantilla. (c) La

9.3.6
RAM

Los materiales de acceso restringido (Figura 9.8) se utilizan principalmente en la limpieza y el

enriquecimiento de muestras biológicas ricas en proteínas en línea. Las muestras crudas, incluso
tan complejas como el suero o el plasma, se pueden inyectar sin ningún tratamiento previo. Los
cartuchos RAM disponibles comercialmente son reutilizables. Los sorbentes (alquil-diol sílice
ADS) son hidrófilos en el exterior, mientras que la superficie de los poros está modificada con
grupos hidrófobos (C4, C8 o C18).
Las biomoléculas de gran tamaño, demasiado grandes para entrar en los poros hidrófobos, no
interactúan (o interactúan poco) con los grupos hidrófilos fuera del sorbente y se eluyen en el vacío. Los
compuestos más pequeños, que pueden entrar en los poros, interactúan con la superficie del poro y
quedan retenidos.
Una desventaja de RAM es la posibilidad de perder analitos unidos a proteínas.

9.3.7
Equipos SPE

El uso generalizado de SPE ha dado lugar a varios formatos en los que se puede realizar
esta técnica de extracción.
CartuchosSon el formato más utilizado en SPE. Tienen un precio relativamente bajo, son en su
mayoría desechables y tienen pocas limitaciones de disolventes. Los cartuchos SPE se pueden obtener
para fase normal, fase reversa, intercambio iónico y modo mixto.
 9.3 Extracción en fase sólida (SPE) yo177
analito pequeño

proteína

alquilo diol

Figura 9.8El interior de los poros está cubierto con cadenas de alquilo hidrofóbicas, lo que permite la interacción entre los
analitos pequeños y el sorbente. El exterior de las partículas está cubierto con un diol hidrofílico que permite el paso de
biomoléculas más grandes.

Los cartuchos están llenos de absorbente, la cantidad varía desde unos pocos miligramos
hasta varios gramos. El volumen del cartucho puede variar de 500 a 1000 mg/ml.metrol hasta
más de 50 ml, dependiendo de la capacidad necesaria y del volumen de la muestra.
La aplicación en todos los pasos se realiza en la parte superior del lecho absorbente. El flujo continuo
del líquido se genera principalmente mediante presión reducida, que se crea desde la parte inferior. La
mayoría de los SPE comerciales basados en cartuchos se realizan en colectores de vacío que pueden
manejar varios cartuchos a la vez. Otras formas de generar un flujo continuo son la presión (desde
arriba) o la centrifugación. Hay sistemas SPE completamente automatizados disponibles
comercialmente.

9.3.7.1Discos
Un formato similar es el disco SPE. El disco en sí es desechable y se coloca en un soporte
reutilizable, como se muestra en la Figura 9.9.
Los discos SPE se prefieren a los cartuchos SPE cuando se deben procesar grandes volúmenes
de muestra o cuando la muestra contiene partículas (que podrían obstruir los cartuchos SPE).
Los discos están hechos de una matriz de fibra inerte en la que se incorpora el sorbente. El tipo
de sorbente puede variar desde fase reversa (divinilbenceno de poliestireno, C8 y C18) hasta
intercambio iónico. Cuando el disco se coloca en el soporte reutilizable, se utilizan como
cartuchos SPE empaquetados. Después de su uso, el disco se desecha.
A partir de los discos SPE, es muy fácil producir internamente dispositivos SPE de muestras pequeñas
perforando una serie de pequeños “cojines” que se colocan juntos en una punta de pipeta estrecha.
 yo9 Preparación de la muestra
178

filtrar
disco

Figura 9.9Cartucho SPE reutilizable con disco y vista microscópica del material del disco.

Cuadro de información 9.9

Los colectores de vacío, que pueden manipular varios cartuchos SPE simultáneamente,
reducen el tiempo de preparación de muestras para series de muestras más grandes.
Pueden surgir problemas si la velocidad de flujo durante la activación, la aplicación, el lavado
y la elución varía de un cartucho a otro. El flujo no debe ser demasiado rápido (lo que
provocaría la formación de burbujas en las muestras ricas en proteínas, como el plasma) y
los cartuchos no deben secarse (excepto en el paso de elución).

9.4
SEMPE

La microextracción en fase sólida (SPME) es una técnica de preparación de muestras sin

disolventes. El volumen de la fase de extracción es muy pequeño en comparación con el
volumen de la muestra. La extracción no es exhaustiva, sino que se basa en el equilibrio entre la
muestra y la fase de extracción, que se encuentra en una fibra. La SPME implica un paso de
adsorción del analito, desde un espacio de cabeza de gas o en una muestra líquida (inmersión
directa), y un paso de desorción, que a menudo se combina directamente con la inyección en el
sistema analítico. Aunque la SPME se utiliza principalmente en combinación con GC, también se
ha automatizado para HPLC. La Figura 9.10 muestra una representación esquemática de un
dispositivo SPME.

9.4.1
Adsorción/Extracción

La fibra SPME suele estar formada por sílice fundida recubierta de un polímero (fase estacionaria) que
está unido a un émbolo (acero inoxidable). Se coloca dentro de una aguja hueca con un diámetro que le
permite moverse libremente hacia dentro y hacia fuera. Los dispositivos SPME se parecen en gran
medida a una jeringa de microlitros. La fibra de extracción se mueve hacia fuera y hacia dentro de la
aguja utilizando el émbolo.
 9.4 EMP yo179

Figura 9.10La fibra recubierta que se sumerge en la solución de muestra contiene un sorbente que
interactúa y extrae así los analitos.

El muestreo se realiza introduciendo la aguja a través del septo de un vial de muestra y

luego empujando aproximadamente 1 cm de la fibra fuera de la aguja hacia la muestra.
Cuando se obtiene el equilibrio de adsorción, la fibra se retira de la muestra y se introduce
en la aguja. El equilibrio de adsorción varía de 2 a 30 minutos. El equilibrio alcanzado se
puede describir de la siguiente manera:

norte¼KporVFdo0:

Esta es una representación simplificada dondenortees la cantidad de analito extraído,Kpor

es el coeficiente de distribución del analito entre la fase estacionaria y la muestra,VF
es el volumen de la fase estacionaria, ydo0es la concentración inicial del analito en la muestra. El
volumen de la muestra no es importante en SPME, ya que depende del equilibrio (no exhaustivo)
y del hecho de que el volumen de la fase estacionaria es muy pequeño en comparación con el
volumen de la muestra. Esto hace que SPME sea una buena técnica de preparación de muestras
para el muestreo "en el campo". Tenga en cuenta que el equilibrio se obtiene mucho más rápido
cuando se realiza el muestreo del espacio de cabeza en comparación con el muestreo por
inmersión. Esto se debe al movimiento más rápido de los analitos en la fase gaseosa en
comparación con el de la fase líquida.
A diferencia del SPE, la fibra SPME se puede reutilizar hasta 100 extracciones y más,
dependiendo del tipo de muestra.

9.4.2
Desorción/Inyección

La desorción de los analitos de la fibra SPME se lleva a cabo en el inyector del

sistema analítico.
 yo9 Preparación de la muestra
180

9.4.2.1SPME–GC
Dado que la fase estacionaria de la fibra SPME no se ve afectada por el aumento de temperatura,
la desorción suele integrarse con la inyección en una columna de cromatografía de gases.
Normalmente se utilizan inyectores splitless (véase el capítulo 2). La jeringa con la fibra en el
interior se coloca en el inyector. El diámetro interior del revestimiento del inyector debe ser
compatible con el diámetro exterior de la jeringa SPME. La temperatura alta en el inyector
provoca la desorción de los analitos de la fase estacionaria. De este modo, los analitos quedan
atrapados en la columna de cromatografía de gases (como se describe en el capítulo 2).

9.4.2.2SPME-HPLC (espectrometría de masas por centrifugación)

De manera similar al sistema de desorción/inyección SPME-GC, la desorción/inyección SPME y

HPLC se pueden combinar. La forma más común de hacerlo es usar una válvula de inyección de
seis puertos (como se describe en detalle en el Capítulo 3). En SPME-HPLC, el circuito de
inyección se reemplaza por una cámara de desorción.
La jeringa SPME se introduce en la cámara de desorción con la válvula de
inyección de seis puertos en la posición de carga. La fibra se coloca y se sella para
evitar fugas del sistema bajo presión. A este paso le sigue la válvula que se coloca en
la posición de inyección con la desorción en la fase móvil y la posterior transferencia
a la columna analítica.

9.4.3
Materiales de fibra SPME y parámetros de extracción

Existen varias fases estacionarias en uso para SPME. La Tabla 9.6 enumera las fases
estacionarias más comunes, así como su modo de interacción.
Además de la naturaleza de la fase estacionaria, el espesor del recubrimiento también juega un papel
clave. El espesor varía de 100 a 1500metrom hacia abajo a 7metroCuanto más fino sea el recubrimiento,
más corto será el tiempo de equilibrio necesario. Dependiendo de la volatilidad de los analitos, el
procedimiento SPME se puede optimizar eligiendo el espesor de fase estacionaria adecuado. Cuanto
más volátil sea el compuesto, más grueso será el recubrimiento. Los compuestos poco volátiles se
extraen utilizando un recubrimiento fino.
Otros factores, además de los ya mencionados, que afectan la adsorción durante la SPME son
el pH, la fuerza iónica, el uso de agua y disolventes orgánicos, la temperatura, la agitación y el
tiempo.

Tabla 9.6Fases estacionarias para SPME.

Fase estacionaria de SPME Interacción

Polidimetilsiloxano (PDMS) De no polar a moderadamente polar De

Poliacrilato (PA) polar moderado a polar De no polar a

Polidimetilsiloxano-divinilbenceno (PDMS-DVB) moderadamente polar De polar a

Carbowax-divinilbenceno (CW-DVB) moderadamente polar De no polar a

Polidimetilsiloxano-carboxeno moderadamente polar

 9.4 EMP yo181
9.4.3.1pH
Las mejores recuperaciones se obtienen cuando los analitos están en su estado no cargado. Esto
significa, al igual que con las otras técnicas de extracción analizadas, que el pH de la muestra
debe suprimir la ionización de los compuestos básicos y ácidos. Los compuestos neutros no se
ven afectados por el pH. Cabe señalar que, dado que las fibras SPME se pueden reutilizar hasta
100 veces, es importante que el rango de pH de la extracción esté entre 2 y 10 (en el caso de
SPME por inmersión).

9.4.3.2Fuerza iónica
Aumentar la fuerza iónica añadiendo sal, por ejemplo, NaCl o Na2ENTONCES4, disminuye la
solubilidad de los analitos en la muestra acuosa. Este efecto de salinización, causado por el
hecho de que las moléculas de agua son atraídas por los iones de sal y, por lo tanto, están
menos disponibles para solvatar los analitos, puede aumentar la recuperación de analitos. Esto
es especialmente útil en determinaciones de trazas. Sin embargo, el aumento de la fuerza iónica
casi siempre aumenta la recuperación y, por lo tanto, el efecto de la sal siempre debe
determinarse experimentalmente.

9.4.3.3Agua y disolventes orgánicos

La dilución de la muestra puede mejorar en gran medida las recuperaciones en SPME cuando se trabaja
con muestras complejas. Esto se debe a que se puede reducir la adsorción del analito a los
componentes de la matriz y aumentar la difusión mediante un simple paso de dilución con agua.
Por el contrario, se debe evitar el uso de disolventes orgánicos ya que tienen
una influencia negativa en la distribución del analito entre la fase estacionaria y
la muestra.

9.4.3.4Temperatura
Al desarrollar el método SPME para el analito de interés, la temperatura es un factor
importante a optimizar. El aumento de la temperatura conduce a una mayor tasa de
difusión y a una disminución del tiempo de equilibrio. Las temperaturas altas también
conducirán a una mayor concentración de analito en el espacio de cabeza. Sin embargo,
las recuperaciones de extracción disminuyen, ya que la distribución del analito entre la
fase estacionaria y la muestra se vuelve menos favorable. Por otro lado, la temperatura
baja dará como resultado un tiempo de equilibrio prolongado (menor difusión), pero una
mayor recuperación (distribución favorable). Cuando se necesitan alcanzar límites de
detección bajos, se debe elegir SPME a bajas temperaturas. En caso de acelerar el
procedimiento de extracción, las temperaturas altas son ventajosas. Además, los
compuestos de mayor masa molecular y los compuestos menos volátiles se extraen mejor
a temperaturas más altas.

9.4.3.5Agitación
El paso de adsorción en SPME se puede acelerar mediante agitación para reducir los tiempos de
equilibrio y, por lo tanto, el tiempo de extracción. La agitación se realiza mediante agitación magnética,
mezcla en vórtice o sonicación. Tenga en cuenta que la sonicación puede provocar un aumento de la
temperatura de la muestra y, por lo tanto, un cambio en la distribución del analito entre la fase
estacionaria y la matriz (consulte más arriba).
 yo9 Preparación de la muestra
182

9.4.3.6Tiempo de extracción
Como se mencionó anteriormente, el tiempo de extracción debe elegirse para determinar el equilibrio.
En este caso, se alcanzan los mejores límites de detección. Además, el aumento en el rendimiento de la
extracción es mayor en la primera parte de la extracción y se vuelve menor a medida que avanza el
tiempo. Cuando se toman muestras con tiempos de extracción cortos, la repetibilidad suele ser
deficiente, pero mejora cuando los tiempos de extracción están cerca del tiempo de equilibrio o en el
mismo. Sin embargo, cuando se exige un alto rendimiento (es decir, análisis de muchas muestras en un
lapso de tiempo relativamente corto) o cuando los tiempos de equilibrio son muy largos, no siempre se
eligen tiempos de extracción largos. En estos casos, la extracción de los analitos se lleva a cabo en
condiciones de no equilibrio, lo que tiene un efecto sobre la recuperación.

Cuadro de información 9.10

Una descripción más detallada de los conceptos de SPME así como consideraciones experimentales
se pueden encontrar en la Ref. [3].

9.5
Precipitación de proteínas

En muestras como el plasma y el suero, que son matrices complejas y muy ricas en proteínas, es
necesario determinar la presencia de sustancias endógenas y exógenas. El contenido de proteínas suele
dificultar la determinación y, a menudo, es necesario eliminar las proteínas, por ejemplo, mediante
precipitación de proteínas. Los agentes de precipitación de proteínas más utilizados son disolventes
orgánicos, sales y ácidos. La tabla 9.7 muestra algunos de los precipitantes más utilizados y la cantidad
necesaria para precipitar el 95 y el 99 % de todas las proteínas. Las proteínas precipitadas se eliminan
mediante centrifugación y el sobrenadante se utiliza para el análisis.
Cuando se añaden disolventes orgánicos miscibles a soluciones acuosas, la constante dieléctrica (mi0)
disminuye. Esto conduce a capas hidratadas comprimidas de las proteínas, lo que a su vez permite que
las proteínas interactúen entre sí. Cuanto menor sea la constante dieléctrica, más fácilmente se produce
esta interacción, lo que provoca agregación y precipitación.

Tabla 9.7Disolventes y soluciones utilizados para la precipitación de proteínas.

Precipitante Concentración final necesaria para precipitar

mi0 95% proteína 99% proteína

Acetonitrilo 0,65 50% 60%

Etanol 0,88 60% 75%
Metanol 0,95 60% 75%
Acetona 0,56 50% 60%
10% de TCA — 15%
6% HClO4 30% 45%
Saturado (NH4)2ENTONCES4 65% —
 9.6 Técnicas de preparación de muestras basadas en membranas yo183

Los ácidos reducen el pH de la solución y, por lo tanto, influyen en la carga de las proteínas.
Las proteínas tienen propiedades zwitteriónicas debido a sus fracciones ácidas y básicas. Un pH
bajo hará que las fracciones ácidas no tengan carga y las fracciones básicas tengan carga
positiva. Algunos ácidos, como el ácido tricloroacético (TCA), podrán formar pares de iones
neutros con los aminoácidos básicos, lo que dará como resultado proteínas sin carga que
pueden interactuar, agregarse y precipitar.
Las sales compiten por las moléculas de agua en la capa de solvatación que rodea a las
proteínas. Cuanto más sal hay en solución, más agua se asocia a los iones y, por lo tanto,
disminuye la capa de solvatación. Las partes hidrófobas de las proteínas quedan entonces más
expuestas, lo que provoca una mayor interacción entre las proteínas, lo que, a su vez, provoca
agregación y precipitación.
La precipitación de proteínas es una técnica de preparación de muestras muy sencilla, con la
desventaja de que la muestra resultante, aunque se le hayan quitado las proteínas, sigue siendo muy
compleja y no siempre compatible con el sistema de separación, por lo que requiere un paso de
limpieza adicional. Debe tenerse en cuenta que una muestra precipitada con el TCA puede ser
demasiado ácida para inyectarla directamente en un sistema HPLC y que un contenido de modificador
orgánico del 50 % puede provocar un ensanchamiento de banda grave. Además, las muestras se diluyen
más, lo que reduce la concentración de los analitos. El ajuste del pH puede evitar la incompatibilidad con
HPLC de las muestras precipitadas con ácido. La evaporación del disolvente puede provocar un menor
ensanchamiento de banda y un enriquecimiento del analito cuando se lleva a cabo la precipitación de
proteínas con disolventes orgánicos.

Cuadro informativo 9.11

Aunque la precipitación de proteínas requiere poco trabajo y es relativamente fácil de

realizar, debe tenerse en cuenta que el sobrenadante resultante a menudo necesita
algún tipo de tratamiento antes de su inyección en el HPLC (como la evaporación de
solventes orgánicos hasta sequedad seguida de reconstitución, ajuste de pH o
precipitación de reactivos ácidos).

9.6
Técnicas de preparación de muestras basadas en membranas

9.6.1
Microdiálisis

El principio de la diálisis se basa en el libre movimiento de pequeñas moléculas a través de una

membrana semipermeable (espesor 9-30metrom), mientras que las moléculas más grandes (por
ejemplo, las proteínas) no pueden atravesarla. Las moléculas pequeñas se mueven por difusión desde
una zona de alta concentración a una zona de baja concentración. La reducción de este proceso a
pequeñas membranas de fibra hueca se conoce como microdiálisis. Esta técnica de preparación de
muestras se puede utilizar para aislar compuestos de tejidos u otras muestras complejas. A diferencia
de la mayoría de las demás técnicas de preparación de muestras utilizadas para muestras biológicas, en
este método solo se aísla la fracción libre no unida del analito.
 yo9 Preparación de la muestra
184

Esto es de particular interés para la determinación de fármacos. La mayoría de los fármacos se unen a
las proteínas en cierta medida (hasta el 99 %) y solo la fracción no unida es biológicamente activa. En
tales casos, la microdiálisis proporciona una estimación de la concentración libre realista. Factores como
la velocidad de flujo del perfusado, el diámetro y la longitud de la membrana, el límite de masa
molecular y la composición de la membrana influyen en la microdiálisis.

9.6.1.1Tasa de flujo de perfusión

La microdiálisis se lleva a cabo normalmente utilizando un flujo que varía de 0,5 a 5metrol mín.-1
y por lo tanto se le denomina proceso dinámico. Caudales superiores a 10metrol mín.-1provocará
una contrapresión alta en la sonda de microdiálisis y, por lo tanto, un flujo neto que sale de la
membrana. Debido a que hay un flujo de líquido en el lumen de la membrana de fibra (este
líquido se llama perfusato), nunca se producirá el equilibrio entre la concentración del analito en
la muestra y el perfusato. Por lo tanto, la concentración del analito en el perfusato será menor
que en condiciones de equilibrio. En general, los caudales bajos en la sonda de microdiálisis dan
recuperaciones más altas que los caudales altos.

9.6.1.2Diámetro y longitud
El diámetro y la longitud de la sonda de microdiálisis se determinan en función del lugar de
muestreo (véase más abajo). En general, cuanto mayor sea el área de la membrana, mayor será
la recuperación del analito.

9.6.1.3Cierre
Aunque se utilizan principalmente membranas con un valor de corte entre 5 y 35 kDa, también
se encuentran disponibles comercialmente membranas con un valor de corte de masa molecular
más alto. Los valores dados sugieren que se pueden aislar analitos con una masa molecular
hasta el valor de corte. Sin embargo, este no es el caso, ya que estos valores reflejan la masa de
corte en equilibrio. El valor de corte durante la microdiálisis será considerablemente menor y,
por lo tanto, se recomienda no elegir un valor de corte demasiado cercano a la masa molecular
del analito. Para una membrana con un valor de corte de 5 kDa, la recuperación de compuestos
mayores de 1 kDa se reduce debido a una menor difusión.

9.6.1.4Química de membranas
Lo ideal es que la membrana sea de un material inerte. Sin embargo, dado que la estructura
química de la membrana puede contribuir a diversas interacciones, la recuperación de un
determinado analito puede variar según la membrana utilizada. En la Tabla 9.8 se enumeran
algunos de los polímeros utilizados en la microdiálisis.

Tabla 9.8Polímeros utilizados en microdiálisis.

Acetato de celulosa
Cuprofano (CUP)
Poliacrilonitrilo (PAN)
Policarbonato-poliéter (PCE)
Polietersulfona (PES)
 9.6 Técnicas de preparación de muestras basadas en membranas yo185
9.6.1.5Aplicación de la microdiálisis
La microdiálisis se realiza en el cerebro, el hígado, el corazón, el tejido cutáneo y la sangre. La toma de
muestras en el tejido es quizás el uso más interesante de la microdiálisis. La temperatura (en el caso de
in vitroLa recuperación se ve afectada por la difusión del analito en el tejido y la velocidad de flujo (por
ejemplo, en el caso de la sangre) en la muestra. El muestreo en el tejido se realiza utilizando una
pequeña sonda que contiene la membrana de fibra hueca. La pequeña sonda se inserta en el tejido de
interés y funciona como una especie de capilar sanguíneo. Una sonda concéntrica se utiliza para el
muestreo de tejido cerebral o sangre. Una sonda lineal se utiliza no solo para el muestreo en tejido
blando como el hígado o la piel, sino también para el muestreo de agua y suelo. La microdiálisis permite
en el lugarmuestreo así como muestreo continuo.

9.6.1.6¿Cómo analizar el dializado?

El perfusado obtenido tras la microdiálisis suele ser compatible con el análisis posterior
mediante cromatografía líquida y electroforesis capilar. En un sistema de separación fuera
de línea, primero se recogen las fracciones de microdializado y luego se analizan. El
análisis del microdializado también se puede realizar en línea. Para ello, es necesario
acoplar la microdiálisis y la unidad de separación.
El acoplamiento en línea de la microdiálisis a la HPLC implica válvulas de conmutación de seis
puertos. El flujo de la microdiálisis queda atrapado en un bucle o en una precolumna antes de ser
transferido a la columna analítica. Al utilizar un sistema de válvulas de conmutación de seis puertos
dobles, tanto el muestreo como el análisis se pueden realizar al mismo tiempo. Un desafío importante
con un sistema de este tipo es que el tiempo de muestreo y el tiempo de análisis deben ser compatibles.
Los análisis con HPLC son relativamente largos, lo que significa que se necesitan pasos de muestreo
bastante largos.
Al combinar la microdiálisis con la electroforesis capilar, se pueden utilizar tiempos de muestreo mucho más
cortos, ya que el paso de separación puede ser muy rápido. Como se mencionó en el Capítulo 6, los volúmenes
de inyección están en el rango de los nanolitros. Esto permite no solo tiempos de muestreo cortos, sino también
un caudal de perfusión bajo que brindará mejores límites de detección (Sección 9.6.1).

9.6.2
LPME

En la microextracción en fase líquida (LPME), se utiliza una membrana líquida para enriquecer y
aislar los analitos de una muestra compleja. La membrana líquida, que es inmiscible con el agua
y la matriz de la muestra, se inmoviliza en los poros de una fibra hueca porosa. Este tipo de
membrana líquida se denomina membrana líquida soportada (SLM). La inmovilización de la SLM
se logra simplemente sumergiendo la fibra hueca en un disolvente orgánico que permite que los
poros se llenen. La figura 9.11 muestra una representación esquemática de la LPME.

Dependiendo de la naturaleza de los analitos y del sistema cromatográfico

necesario para analizar los extractos, la LPME puede realizarse en modo bifásico o
trifásico. En ambos casos, la difusión del analito en la matriz de la muestra y en el
SLM es de gran importancia. Una buena difusión y agitación (del dispositivo LPME)
conducen a una mejor extracción. Lo ideal es que la extracción finalice cuando se
alcanza un equilibrio general.
 yo9 Preparación de la muestra
186

guía de agujas

tapón de rosca

frasco de muestra

Solución aceptora

fibra porosa

muestra (solución donante)

Figura 9.11Equipo LPME. Fibra hueca con poros con una solución aceptora, que tras la
llenos de un disolvente orgánico (no miscible con extracción puede analizarse sin tratamiento
agua) colocado en una solución de muestra. El posterior.
interior de la fibra hueca está lleno

9.6.2.1LPME de dos fases

En la LPME de dos fases, tanto el SLM como la solución aceptora son el mismo disolvente
orgánico. Después de inmovilizar el SLM, el mismo disolvente se inyecta en el lumen de la fibra,
donde actúa como fase aceptora. La extracción se basa en la partición del analito sin carga entre
la matriz de la muestra (fase donante) y la fase orgánica. En general, los compuestos no polares
tendrán un coeficiente de partición alto. (Kaceptor/muestra), mientras que los compuestos polares
tendrán un coeficiente de partición pequeño. La LPME bifásica es totalmente compatible con la
cromatografía de gases, ya que la fase aceptora es un disolvente orgánico que se puede inyectar
directamente en el sistema cromatográfico.

9.6.2.2LPME trifásico
En la LPME trifásica, el SLM separa la matriz de muestra de la fase aceptora, que
se encuentra en el lumen de la fibra. La extracción no se basa únicamente en la
partición del analito sin carga entre la fase donante y el SLM. (KSLM/muestra) sino
también de la partición de los analitos entre el SLM y la fase aceptora (Kaceptor/SLM
). Como se discutirá más adelante, el ajuste del pH en la fase aceptora para
cargar los analitos mejora las recuperaciones de extracción, ya que influye en la
partición del analito entre el SLM y la fase aceptora.
El LPME trifásico puede ser totalmente compatible con HPLC cuando la fase aceptora
tiene un pH que no daña la columna (para columnas de fase reversa basadas en sílice,
entre pH 2 y 8). Al ser una solución acuosa, se puede inyectar directamente en el sistema
cromatográfico.

9.6.2.3Enriquecimiento en LPME
Una gran ventaja de la LPME es el gran factor de enriquecimiento que se puede alcanzar. La fase
aceptora tiene un volumen típico que varía de 2 a 30metrol. El volumen de la fase donante puede
variar desde tan solo 50metrol hasta mucho más de 1 l. Esto permite lograr un enriquecimiento
considerable del analito en la fase aceptora. En el caso de un 20metroCon una fase aceptora de
20 ml y una fase donante de 20 ml, el enriquecimiento puede ser teóricamente de hasta 1000
veces (con recuperación máxima).
 9.6 Técnicas de preparación de muestras basadas en membranas yo187

Esto no solo significa que se pueden alcanzar límites de detección mucho más bajos, sino que
también implica que, con recuperaciones bajas, se pueden realizar extracciones de buena calidad. En el
caso de una recuperación del 5 % y un factor de enriquecimiento de 1000, la fase aceptora aún contiene
una concentración 20 veces mayor del analito que la fase donante.
Los factores que afectan la recuperación de la extracción son el pH de la fase donante, el pH de la
fase aceptora (en el caso de un LPME trifásico), la composición del SLM y el tiempo de extracción.

9.6.2.4pH de la fase donante

Al igual que con otras técnicas de extracción basadas en la partición del analito entre una
fase acuosa y una fase no polar, es de suma importancia suprimir la ionización. El pH de la
fase donante debe ser básico, idealmente 2 unidades de pH más alto que su pHKavalor,
para desprotonar analitos básicos. El pH de la fase donante debe ser ácido, idealmente 2
unidades de pH más bajo que su pHKavalor, para protonar analitos ácidos.

9.6.2.5pH de la fase aceptora

Para mejorar las recuperaciones de extracción en un sistema LPME trifásico, la partición del
analito entre la fase SLM y la fase aceptora se puede influenciar en gran medida ajustando el pH
de manera que los analitos básicos y/o ácidos se carguen. De esta manera, el equilibrio de
partición cambia y la mayoría de los analitos se mueven de la fase orgánica (SLM) a la fase
aceptora acuosa. En la práctica, esto significa que el pH en la fase aceptora es idealmente 2
unidades de pH por debajo del pKavalor para una base y 2 unidades de pH por encima del pKa
valor para un ácido.

9.6.2.6Composición del SLM

En la actualidad, la LPME sigue siendo una técnica de microextracción no comercial y se
han utilizado muchas composiciones de SLM diferentes. En general, para los compuestos
no ionizados, el 1-octanol y el tolueno se han utilizado principalmente en la LPME de dos
fases, mientras que el 1-octanol y el éter dihexílico se han utilizado principalmente en la
LPME de tres fases. En algunos casos, se añaden portadores o reactivos de pares iónicos a
la fase de muestra para extraer analitos cargados. Un ejemplo de esto es la adición de
ácido sulfónico alifático a la fase donante a pH 7. A este pH, formará pares iónicos con
compuestos básicos cargados positivamente. El par iónico neutro se extrae en el SLM. En
la interfaz entre el SLM y la fase aceptora, que presenta un pH bajo, los analitos básicos se
liberan a través de la protonación del ácido sulfónico alifático (Figura 9.12).

Figura 9.12Transporte de péptidos mediado por pares iónicos a través de la membrana LPME.
 yo9 Preparación de la muestra
188

9.6.2.7Tiempo de extracción
El tiempo de extracción en LPME debe determinarse experimentalmente y depende del tamaño de la muestra.
Un tamaño de muestra pequeño conduce a un equilibrio rápido y, por lo tanto, a tiempos de extracción cortos,
mientras que las muestras grandes necesitan mucho más tiempo para alcanzar el equilibrio. En todos los casos,
la recuperación aumenta con el aumento del tiempo de extracción. El tiempo de extracción típico para una
muestra de 1 ml es de aproximadamente 10 a 20 minutos, mientras que las muestras de 4 ml necesitan al menos
45 minutos.

Cuadro de información 9.12

Una descripción más detallada del concepto LPME así como consideraciones experimentales
se pueden encontrar en la Ref. [4].

Referencias

1Pawliszyn, J. y Lord, HL (eds.) (2010) 3Pawliszyn, J. (1997)Fase sólida

Manual de preparación de muestras, Microextracción: teoría y práctica,Wiley-
Editorial Wiley-VCH. VCH Verlag GmbH, pág. 264.
2Malerod, H., Lundanes, E. y Greibrokk, T. 4Pedersen-Bjergaard, S. y Rasmussen,
(2010) Avances recientes en cromatografía KE (2008) Microextracción en fase líquida con
líquida multidimensional en línea. Métodos fibras huecas porosas, un formato
analíticos,2,110. miniaturizado y altamente flexible para la
extracción líquido-líquido.Revista de
cromatografía A, 1184,132.
 yo189

10
Cuantificación

10.1
Introducción

El término cuantificación se utiliza cuando se determina la concentración de uno o más

analitos en una muestra. La cuantificación se puede llevar a cabo de varias maneras según
el método de análisis. En los métodos de cromatografía en columna, la cuantificación se
basa en establecer la relación entre la cantidad o concentración de analito que pasa por el
detector y la respuesta del detector, utilizando la altura o el área del pico. En los métodos
de cromatografía planar, como la cromatografía en capa fina (TLC), la cuantificación se
puede realizar comparando visualmente las intensidades de los puntos o utilizando un
escáner, o determinando la concentración del compuesto en un disolvente después de la
elución de la capa.
Las alturas de los picos se miden desde la línea base hasta el pico máximo, como se muestra en la Figura 10.1.
La altura de los picos se puede medir manualmente con una regla o con un programa de procesamiento de
datos. Las áreas de los picos se determinan mediante el programa de procesamiento de datos utilizado.

Cuadro de información 10.1

Métodos de cuantificación anteriores

(su precisión se da entre paréntesis)
Medición manual de la altura del pico y del ancho del pico a la mitad de la altura del pico:
media pensión1/2yo(3%) – presupone una planimetría de pico triangular (3%) – mediante el
uso de un “integrador mecánico”
cortar y pesar (2%) – requiere mucho tiempo/requiere papel homogéneo
integrador (0,5%) – debe saber lo que hace el integrador

Para obtener una cuantificación fiable, el pico cromatográfico debe ser lo suficientemente grande en
comparación con el nivel de ruido, estar bien separado de los picos vecinos en el cromatograma y
también lo suficientemente estrecho. Pueden producirse errores tanto en las determinaciones de la
altura del pico como del área del pico si un compuesto no está lo suficientemente separado.

Cromatografía: principios básicos, preparación de muestras y métodos relacionados,Primera

edición. Elsa Lundanes, L-eon Reubsaet y Tyge Greibrokk.
- 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Publicado en 2014 por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
190yo10 Cuantificación

Altura máxima

Cima
área

Figura 10.1Cuantificación basada en mediciones de altura de pico o área de pico.

del disolvente, por ejemplo (pico 1 en la Figura 10.2) o se eluye como pico no resuelto
(picos 3 y 4 en la Figura 10.2).
También puede producirse un error en la cuantificación si cambia el caudal de la fase móvil en la
serie de análisis. La altura del pico puede variar con el caudal de la fase móvil tanto para los detectores
sensibles a la concentración como a la masa, mientras que el área del pico variará con el caudal de la
fase móvil solo para los detectores sensibles a la concentración. Por lo tanto, no se produce ningún
error con la variación del caudal si se utiliza el área del pico en la cuantificación con un detector sensible
a la masa, como el detector de ionización de llama (FID).
La altura del pico debe ser mayor que 10 veces el nivel de ruido para una cuantificación confiable. En
cromatografía, un pico se define comúnmente como detectable si la altura del pico es tres veces mayor
que el ruido (Figura 10.3); sin embargo, normalmente se requiere un pico más alto para la
cuantificación. La concentración de analito correspondiente a un pico con señal (S)-al ruido (nortepáginas)
La relación de 3 se denomina límite de concentración de detección (cLOD), mientras que una
concentración que da un pico con unNúmero de seriepáginasLa relación de 10 se denomina límite de
concentración de cuantificación (cLOQ). El ruidonortepáginasSe mide como se muestra en la Figura 10.3.

Figura 10.2Medición de alturas y áreas de picos en muestras complejas (solo se etiquetan los picos principales).
 yo191
10.1 Introducción

nortepáginas

Figura 10.3Medición de ruido,nortepáginas, y la altura del pico en cLOD donde la altura del pico (S)es tres
veces elnortepáginas.

El cLOD de un analito depende en gran medida de las condiciones cromatográficas. Las condiciones
que proporcionan picos estrechos brindan el mejor límite de detección, como se muestra en la Figura
10.4.
Un método de análisis cromatográfico suele constar de uno o más pasos de
preparación de la muestra, además de la separación y detección cromatográficas que se
utilizan para la cuantificación (Figura 10.5). Los tres pasos (preparación de la muestra
[Capítulo 9], separación cromatográfica y detección) contribuyen a la selectividad del
método.
Para obtener una cuantificación confiable, es necesario calibrar el método total.

Figura 10.4Cromatogramas del analito con la misma concentración en (a) y (b). La mejor eficiencia
cromatográfica en (a) proporciona un mejor límite de detección.

desconectado

o en línea

Muestra
separación detección
preparación

Figura 10.5Método total que implica preparación de muestra, separación cromatográfica y

detección.
192yo10 Cuantificación
10.2
Métodos de calibración

Se pueden utilizar cuatro métodos principales diferentes para la cuantificación. El más simple es
normalizando áreas de pico.En este método, se suma el área de todos los picos del cromatograma y se
calcula la cantidad de cada compuesto como porcentaje del área, asumiendo una respuesta del detector
igual:

área del pico

área%¼ - 100%:
Área total

Este método se puede utilizar para determinar la cantidad relativa de componentes en una
muestra, suponiendo que todos los componentes eluyen en las condiciones dadas. Cuando no
se conoce la respuesta relativa del detector de los componentes, solo se puede obtener la
semicuantificación relativa a un compuesto (suponiendo que los factores de respuesta son
idénticos). Si se conoce la respuesta relativa de los componentes, se puede encontrar su
proporción porcentual en la muestra. Su factor de respuesta se puede determinar estableciendo
una curva donde la respuesta del detector se representa gráficamente como una función de su
concentración. La pendiente de la curva representa el factor de respuesta.
Los otros tres métodos –adición estándar, estándar externo,yestándar interno –
Proporcionar una cuantificación más precisa.

10.2.1
Norma externa

En el método del estándar externo, se establece una curva de calibración para el/los analito(s)
analizando soluciones de calibración que contienen concentraciones precisas del estándar de
analito y graficando la respuesta del detector en función de la concentración (Figura 10.6).
Área o altura del pico del analito estándar

Concentración de analito estándar en muestras de calibración

Figura 10.6Curva de calibración para estándar externo.

 yo193
10.2 Métodos de calibración

Si el método analítico consiste únicamente en el paso de cuantificación cromatográfica,

bastan las soluciones de calibración que contienen el estándar de analito en el mismo disolvente
que la muestra. Cuando el método total también incluye uno o más pasos de preparación de la
muestra, las soluciones de calibración deben prepararse mediante adición (fortificación), es
decir, añadiendo el analito estándar a una muestra en blanco (que no contiene analito en
concentraciones superiores al cLOD) en diversas concentraciones. Estas muestras fortificadas
deben prepararse de la misma manera que las muestras y analizarse mediante el mismo método
cromatográfico. Debe mantenerse un estricto control del volumen en la preparación de la
muestra y el volumen de inyección. Por lo tanto, el método de estándar externo solo puede
utilizarse, por ejemplo, para análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero no
para análisis de cromatografía de gases (GC), ya que esta última carece de control de volumen
durante la inyección. Por la misma razón, la calibración con patrón externo se puede utilizar con
preparaciones de muestras simples como la precipitación de proteínas (porque el volumen se
puede controlar), mientras que no es adecuada para, por ejemplo, la extracción en fase sólida
(SPE) y la extracción líquido-líquido (LLE). La curva de calibración se establece trazando la
respuesta del detector (y) (altura del pico o área del pico) en función de las concentraciones (
incógnita)Se obtiene al añadir cantidades variables de analito estándar a muestras en blanco.
Cabe mencionar que la diferencia en la pendiente de las curvas de calibración obtenidas de esta
manera en comparación con las obtenidas utilizando soluciones de calibración en solvente
únicamente, refleja la recuperación de analito durante la preparación de la muestra.

Para determinar la concentración de un analito en la muestra analizada se mide el pico

del analito (altura o área). Este valor (y)se sustituye en la ecuación de calibracióny¼hachaþ
bpara encontrar la concentración, o este valor se utiliza en la curva de calibración trazada
para encontrar qué concentración tiene el analito.

10.2.2
Norma interna

En el método de estándar interno (IS), unacantidad conocidade uncompuesto conocidoSe añade

a la muestra y a todas las muestras/soluciones de calibración un estándar interno. El estándar
interno debe separarse cromatográficamente de los analitos, a menos que se utilice la detección
por espectrometría de masas (MS). Se establece una curva de calibración basada en muestras
fortificadas, donde se varía la concentración del analito, mientras que la cantidad de IS se
mantiene constante (Figura 10.7).
Los requisitos para la norma interna son los siguientes:
- debe separarse de otros compuestos en la muestra (excepto con detección
MS),
- debe tener un tiempo de retención cercano al de los analitos (pueden requerirse dos o más IS para la
cuantificación de múltiples analitos),
- debe comportarse como el/los analito(s) con respecto a la preparación de la muestra,
extracción, derivatización, etc.,
- debe agregarse en una concentración que proporcione una altura de pico o un área de pico
preferiblemente igual a la de la concentración esperada de analito,
194yo10 Cuantificación

relación área (o altura del pico) A/IS

+

Concentración A/concentración IS en muestras de calibración

Figura 10.7Curva de calibración para el método estándar interno donde A es analito e IS es estándar interno
en muestras de calibración.

- no debe estar presente en la muestra,

- debe ser estable (es decir, no reaccionar con otros compuestos en la muestra, fase
estacionaria o fase móvil), y
- Debe estar disponible con alta pureza.

Tenga en cuenta que, en cuanto al método de estándar externo, debe estar disponible el
mismo tipo de muestra que la que se va a analizar sin que contenga analito por encima del cLOD
(muestra en blanco) para preparar las muestras de calibración. Las muestras de calibración se
preparan añadiendo muestras en blanco cantidades variables de analito(s) estándar y una
cantidad constante de estándar(es) interno(s). Las muestras de calibración se someten a la
misma preparación de muestra y cuantificación cromatográfica que las muestras, que se
fortifican con la misma cantidad de estándar(es) interno(s). La curva de calibración se establece
trazando la señal del analito frente a la señal del IS como una función de la relación de
concentración del analito y el IS. Si la concentración del IS se mantiene igual para las muestras
de calibración y las muestras, se puede utilizar la concentración del analito como laincógnita-eje
(Figura 10.7).
En la Tabla 10.1 se da un ejemplo de cuantificación estándar interna.
La curva de calibración se muestra en la Figura 10.8; mediante cálculos de regresión
lineal, se encontró que la concentración de A en la muestra era 0,36metrogml1
(s¼0,023metrogml1)

10.2.3
Adición estándar

El método de adición de patrón se utiliza relativamente poco en cromatografía,

principalmente porque se necesitan varios análisis por muestra, lo que requiere mucho
tiempo. En el método de adición de patrón, la muestra se divide en varias alícuotas para
 10.2 Métodos de calibración yo195
Tabla 10.1Ejemplo de calibración de estándar interno.

Concentración de A Concentración de IS Área de A Área de IS

(metrogml– 1) (metrogml– 1)

Muestras de calibración

1 0,0240 0.3000 5201 56146

2 0,0961 0.3000 16518 51438

3 0,3124 0.3000 52488 48592

4 0,6008 0.3000 108915 52622

5 0,9613 0.3000 165851 49503

6 1.2016 0.3000 241615 56496

Muestra

Replicar 1 0,3200 74555 59760

Replicar 2 0,3200 76321 69222

Replicar 3 0,3200 65348 53803

La concentración del analito A en una muestra se determina mediante un método cromatográfico. Se

realizan análisis de las muestras de calibración y de tres réplicas de la muestra.
Tenga en cuenta que en este ejemplo, la concentración de IS en la muestra y en las muestras de calibración es diferente.

4.5
4 y = 1,0617x - 0,0202

3.5
Área A/área IS

3
2.5
2
1.5
1
0,5
0
0 1 2 3 4 5
Concentración A/Concentración IS

Figura 10.8Curva de calibración para la cuantificación del analito A.

Se añaden cantidades variables de analito estándar. Las muestras resultantes se analizan y la

respuesta del detector se representa gráficamente en función de la concentración del analito
estándar añadido. La concentración de analito en la muestra se obtiene mediante la
extrapolación de la curva. La cantidad de muestras preparadas depende de la precisión y
exactitud necesarias. El método de adición de estándar se utiliza principalmente cuando no se
puede encontrar una muestra en blanco que contenga el analito en concentraciones inferiores a
cLOD.
196yo10 Cuantificación
10.3
Validación de métodos

Un método de cuantificación cromatográfica suele constar de un paso de preparación de

la muestra y del método cromatográfico analítico. Para comprobar que un método es
adecuado para el uso previsto, se lleva a cabo una validación del mismo.
Durante el desarrollo del método, es necesario examinar varios parámetros y tomar
decisiones. Se debe evaluar la necesidad de preconcentrar el analito antes de la
cuantificación, así como la necesidad de purificarlo (aislarlo). Los solventes utilizados
durante la preparación de la muestra deben seleccionarse cuidadosamente y el solvente
final debe ser compatible con el sistema cromatográfico utilizado para la cuantificación.
También debe considerarse la estabilidad del analito.
En el método cromatográfico, se debe elegir el método y el volumen de inyección. El
principio de separación, la fase estacionaria y la composición de la fase móvil deben
elegirse para obtener una separación de referencia del analito o analitos de otros
compuestos en la muestra. Se debe evitar la formación de colas en el pico cromatográfico,
así como la sobrecarga de la columna. Se requiere una separación cromatográfica con
tiempos de retención repetibles.
El tipo de detector debe seleccionarse con cuidado. Se puede utilizar un detector universal o
selectivo, según la tarea en cuestión. Un requisito del detector es que debe proporcionar
estabilidad de línea de base a largo plazo, tener un amplio rango lineal y ofrecer límites de
detección bajos.
Cuando el método se considera satisfactorio, se lleva a cabo una validación antes
de que se pueda poner en uso. Se utilizan diversas pautas de validación, según los
requisitos de las autoridades y los laboratorios. En la Sección 10.3.1 solo se incluyen
los parámetros más importantes y comunes.

10.3.1
Parámetros de validación

Se deben investigar los siguientes parámetros:

- Límite de concentración de detección (cLOD)
- Límite de concentración de cuantificación (cLOQ)
- Linealidad
- Rango
- Repetibilidad
– Ensayo intradiario (intradía)
– Entre ensayos (entre días)
- Exactitud
- Selectividad
- Robustez
- Estabilidad

El cLOD y el cLOQ deben determinarse mediante el análisis de una muestra que contenga el analito
en estas concentraciones. Debe evitarse la extrapolación utilizando concentraciones más altas.
 yo197
10.3 Validación del método

10.3.1.1Linealidad y rango
La linealidad es el rango de concentración en el que la respuesta del detector es directamente
proporcional a la concentración del analito, a partir del cLOD, y se puede examinar añadiendo a
una muestra en blanco concentraciones variables, desde el cLOD hasta concentraciones que dan
una respuesta no lineal o hasta el nivel de concentración que es de interés. El rango (lineal) es el
rango de concentración que, por lo general, va desde el cLOQ hasta la concentración superior
que se ha examinado para comprobar su precisión y exactitud (y linealidad). El rango del método
abarca las concentraciones que se espera encontrar en las muestras que se analizarán con el
método desarrollado.

10.3.1.2Repetibilidad
Las repetibilidades se determinan generalmente en tres niveles: en cLOQ, por ejemplo, a
50 veces cLOQ.¼domáximo, y a la 1/2domáximo, analizando varias réplicas de muestra (más de
cinco) en cada nivel dentro de un ensayo o un día, si es posible. Las repetibilidades entre
ensayos o entre días se determinan analizando una réplica de cada una de las tres
concentraciones varios días posteriores (>5).

10.3.1.3Exactitud
La precisión se puede determinar mejor mediante el análisis de un material de referencia.
Desafortunadamente, hay muy pocos materiales de referencia disponibles que contengan un
analito orgánico. El segundo mejor método es analizar la misma muestra utilizando el método
desarrollado y otro método establecido bastante diferente, si está disponible. Sin embargo, muy
a menudo el analista tiene que conformarse con otro enfoque. En tales casos, la curva de
calibración se construye como se describe en la Sección 10.2. Luego, se preparan las muestras
fortificando la matriz en blanco con analito estándar. Esto se hace en tres niveles de
concentración (bajo, medio y alto). Estas muestras se preparan exactamente de la misma
manera que las muestras de la curva de calibración. Luego, el contenido de analito se determina
utilizando la curva de calibración. Al dividir la concentración encontrada por la concentración
teórica, se encuentra un valor para la precisión. Este valor debe ser cercano al 100%.
La precisión también puede denominarse sesgo.

10.3.1.4Selectividad
Un método es específico si es completamente selectivo para un analito en particular o un grupo de
analitos. La selectividad de un método cromatográfico se define como su capacidad para medir con
precisión un analito en presencia de interferencias que probablemente estén presentes en la matriz de
la muestra. Para demostrar la selectividad del método, los compuestos que probablemente estén
presentes deben cromatografiarse en las mismas condiciones que el analito o los analitos para
demostrar que están suficientemente separados de ellos (o que no dan ninguna señal de detector que
interfiera) para permitir una cuantificación confiable del analito o los analitos.

10.3.1.5Robustez
Se realizan pruebas de robustez para examinar el efecto de los parámetros operativos en los
resultados del análisis. Los parámetros típicos para evaluar son el pH de la fase móvil, el caudal
de la fase móvil, el porcentaje de modificador orgánico y la temperatura de la columna. Para
examinar el efecto de la variación del pH cuando el pH de la fase móvil es, por ejemplo, 5,5, se
realizan análisis a, por ejemplo, pH 5,3 y 5,7. Si no hay cambios significativos en el pH,
198yo10 Cuantificación
Si se encuentran resultados del análisis, el pH de la fase móvil no es tan crítico; pero si los resultados del
análisis son diferentes, se requiere un control estricto del pH de la fase móvil.

10.3.1.6Estabilidad
Las pruebas de estabilidad se realizan para garantizar que la concentración del analito no cambie durante el
almacenamiento, la preparación y el análisis de la muestra. Se debe examinar la estabilidad del analito en la
matriz durante la congelación y la descongelación, así como la estabilidad a corto plazo del analito en la matriz a
temperatura ambiente. También se debe comprobar la estabilidad a largo plazo del analito en la matriz
almacenada en el congelador, así como la estabilidad de la solución madre y las soluciones de trabajo del analito
y el estándar interno. La estabilidad del analito (y del estándar interno) es satisfactoria cuando la concentración
determinada se encuentra dentro de los límites de precisión.

10.3.2
Procedimiento de validación: un ejemplo sencillo

No existe un método universal para la validación, pero se pueden encontrar varios

procedimientos operativos estándar para la validación de métodos en la literatura y en agencias
reguladoras como ISO/IEC 17025 y FDA CGMP.
A continuación se presenta un procedimiento de validación bastante simple, pero el lector

Cuadro de información 10.2

Para obtener más información sobre las pautas de validación en muestras biológicas, consulte la referencia [1].

Se debe tener en cuenta que los requisitos para la validación pueden ser diferentes según
los usuarios del método y su uso previsto (por ejemplo, consecuencias legales).

Ejemplo de validación de método

Se presenta un procedimiento muy simple para comprobar la linealidad y las precisiones
como repetibilidades dentro del ensayo (o dentro del día) y entre ensayos (o entre días) y
también la exactitud en tres niveles de concentración:

1) Establezca el cLOD del método total y calcule el cLOQ como tres veces el
cLOD.
2) Prepare muestras fortificadas (aditivas) con concentraciones del analito
correspondientes a cLOQ y, por ejemplo, 50 veces cLOQ.¼domáximo(dependiendo de los
métodos de uso previstos), y concentraciones intermedias de las siguientes maneras:

cLOQdnorte¼6 réplicasÞ;

1=4domáximodnorte¼1Þ;

1=2domáximodnorte¼6Þ;

3=4domáximodnorte¼1Þ;

domáximodnorte¼6Þ;
 Referencia yo199

dóndenorteIndicar el número de muestras replicadas preparadas. Normalmente se realiza

un análisis de cada una. A todas estas muestras se les debe añadir un patrón interno (si está
disponible) en una concentración que dé una señal que sea del 20 al 40 % de la del analito.
domáximoTodas estas muestras deben analizarse el mismo día (o en el mismo ensayo).
3) Elija un resultado replicado aleatoriamente de cada uno de cLOQ, 1/2domáximo, ydo
máximo, y úselos junto con los de 1/4domáximoy 3/4domáximopara investigar la

linealidad del método (en el rango seleccionado).

4) Calcule la precisión (repetibilidad dentro del ensayo) en cLOQ, 1/2domáximo, ydomáximo
utilizando los seis resultados replicados en cada concentración.
5) Para establecer las repetibilidades entre ensayos, prepare y analice una muestra fortificada a
niveles de concentración cLOQ, 1/2domáximo, ydomáximocada día durante 5 días subsiguientes.
Junto con una réplica seleccionada al azar de los mismos niveles de concentración del primer
día, el ensayo entre ensayos (norte¼6) se puede establecer para estos tres niveles de
concentración.
6) Para determinar la precisión, se toman muestras adicionales a niveles de concentración cLOQ, 1/2do
máximo, ydomáximoEs necesario prepararlos y analizarlos (norte¼6 para cada nivel de concentración).
Esto solo se realiza dentro del ensayo.

Referencia

1Guía sobre el método bioanalítico es_ES/biblioteca_de_documentos/

Validación. Agencia Europea de Medicamentos, Guía_científica/2011/08/
2011.http://www.ema.europa.eu/docs/ WC500109686.pdf.
 yo201

Índice

a do
acilación 44, 45 sulfato de calcio 106
cromatografía de afinidad 78 métodos de calibración 192.Véase tambiéncuantificación
materiales de afinidad 78 – Norma externa 192, 193
alifático/aromático, separación 42 detector de – patrón interno 193–195
ionización de llama alcalina (AFID) 30 alquilación – Normalización de las áreas de pico 192
44, 46 – suma estándar 194, 195
alúmina 65, 107, 170 detección columnas capilares 2, 11, 37, 54, 60, 62, 121,
amperométrica 98, 99 interacción 122, 124, 146
antígeno-anticuerpo 79 APPI,ver – abierto 11, 37
presión atmosférica – lleno 37
fotoionización (APPI) – Inyector split/splitless para
ionización química a presión atmosférica electroforesis capilar 21 (CE) 127, 135,
(APCI) 85, 86, 88, 89 fotoionización a 136, 185
presión atmosférica – capilares 136, 137
(API) 85, 86, 89 – Electroforesis de zona CE 140, 141
Detector de emisiones atómicas (DEA) 36 – detección 139, 140
autoinyectores 20, 47, 50, 51 – fuente de alimentación de alto voltaje 136
– instrumentación 136
b – Introducción de muestra 137–
ensanchamiento de banda 5, 6, 14, 22, 51, 53, 59, 139 Fuerzas capilares 2, 108–111
61, 63, 106, 114, 129, 130, 137, 145 Carboximetilcelulosa 106
– En la columna 8 gases portadores 3, 17, 19, 20, 21, 27, 28, 31, 32, 39
– coeficiente de difusión 9 – van Deemter parcela
– Velocidad de difusión de macromoléculas 58 19 aplicaciones CE 134
– difusión de remolinos 6 – Separaciones de proteínas 134, 135
– matrícula vigente número 11 – separación de ADN/ARN 135
– Distribución gaussiana 5 celulosa 78, 107
– Ecuación de Golay 8 ionización química (CI) 33 detector
– Moléculas grandes 133 quimioluminiscente 35 detector de nitrógeno
– difusión longitudinal 6, 7 quimioluminiscente 103 dispositivo con chip
– columna exterior 9
– Tamaño de partícula y espesor de capa 106 – cromatografía a 150
– procesos físicos 5 – Columnas y fases estacionarias 151
– altura de la placa 10, 11 – COMOSS 152, 153
– resistencia a la transferencia de masa 7, 8 – detección 153, 154
– tamaño de la celda de flujo 82 – Introducción de muestra en la
ácido benzoilbenzoico 113 detección de quiralidad 150 103
bioluminiscencia 113 Separaciones quirales en GC 38

Cromatografía: principios básicos, preparación de muestras y métodos relacionados,Primera

edición. Elsa Lundanes, Léon Reubsaet y Tyge Greibrokk.
- 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Publicado en 2014 por Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
 yoÍndice
202

Separaciones quirales en HPLC 77, 78 – Floridafluorescencia 80, 95, 140

Cromatoenfoque 74, 75 – Transformada de Fourier infrarroja 36
cromatograma 3, 4 – GC 27, 35, 121, 125
– proteínas de la leche 75 – Dispersión de luz 100, 101
– picos parcialmente resueltos 12 – Detector de nitrógeno y fósforo (NPD) 30
– aminas poliméricas 4 – fotoionización 35
– para cuantificación 114 – radiactividad 102
– proteínas de levadura – espectrofotometría 83
56 pico cromatográfico – conductividad térmica 28, 29
– Medición de asimetría 12 – Detectores de UV 81, 156
– Anchos entre tangentes en la línea base 10 detector de matriz de diodos (DAD) 83, 84
técnicas cromatográficas, descripción general
2 cromóforos 82 mi
coeluyendo 13 difusión de remolinos 6
Eficiencia de la columna, medición 9 detección electroquímica 98
– asimetría 11 – detección amperométrica 98, 99
– columnas de acoplamiento 10 – detector coulométrico 99, 100
– altura de la placa 10, electrocromatografía (EC) 2, 78, 127, 145
11 columnas 54–64, 122 inyección electrocinética 149
– capilar 41, 42, 54, 62, 122, 146 detector de captura de electrones (ECD) 18, 29, 31, 32,
– quiral 103 45, 46
– Floridacromatografía de cenizas 63, 64 ionización electrónica (EI) 33
– GC 180 electroósmosis 129
– microchip 60, 61 electroforesis 127
– monolítico 59, 60 – Velocidad de migración, factores que influyen 128
– nanoflujo 54 – efectos secundarios 128, 129 separación
– calibre estrecho 88 electroforética,verelectroforesis técnicas
– abrir canal 152 electroforéticas 127
– tubular abierto 1, 6, 7, 8, 11, 25, 37, 61, 121, fuerza de elución
122, 146 – más alto 52, 53
– empaquetado 6, 7, 14, 18, 25, 36, 37, 40, 54–59, – 52, 53 inferiores
122–124, 146, 152 – disolvente orgánico 69
– control de temperatura 61–63 – Inyector de evaporación de fuerza de elución
relativa 51,vercolumna empaquetada
d inyector
densitómetros 113
detectores 26–28, 35, 49, 55, 59, 80, 81, 124, 125 F
– emisión atómica 36 DEFENSOR,ver flDetector de ionización de llama (FID)
– quimioluminiscente 35 Fraccionamiento de flujo de campo (FFF) 155–157
– nitrógeno quimioluminiscente 103 – aplicaciones 158, 159
– quiral 103 – detector 156
– conductividad 80, 102 – Floridaahora FFF 156, 157
– descarga de corona 80, 102 – Instrumentación 155
– coulométrica 98–100, 99, 100 – tiempo de retención 155, 156
– matriz de diodos 83, 84 – sedimentación FFF 158
– electroquímica 80, 98 – FFF térmica (ThFFF) 157, 158
– conductividad electrolítica 35 detector de ionización de llama (FID) 18, 28, 30, 31,
– captura de electrones 18, 29, 31, 32, 45, 46 118, 121, 122, 124, 125, 190
– dispersión de luz por evaporación 100 detección de fluorescencia 80, 95, 140
– esfiltro fotométrico 83 – detección de quimioluminiscencia 97
– Floridaionización de ame 28–30, 118, 121, – esFluorímetros de filtración 97
122, 124, 190 – espectrofluorímetros 97
– Floridaame fotométrico 35 – FloridaIntensidad de fluorescencia 97
 Índice yo203
– Fibras ópticas, detección de fluorescencia con elución en gradiente 3, 4, 10, 13, 56, 65, 67, 73, 74,
96 derivados fluorados 45 100, 102, 111, 120, 121, 122
hidrocarburos fluorados 118 – en HPLC 4, 48
Detector infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) 36 – en CEC 146
– en SFC 122
gramo Prueba de Grob 41

cromatografía de adsorción de gases

(SGC) 17, 26 yo
cromatografía de gases (GC) 1, 3, 17, 18, Técnicas de espacio mental
26, 33, 115 – Sistema de inyección GC 24
– detector de emisiones atómicas 35 – estática y dinámica 23
– detector quimioluminiscente 35 altura equivalente a placa teórica
– columnas 24 (HETP) 11
– – Dimensiones 24 cromatografía líquida de alto rendimiento
– – tubular abierto 25, 26 (CLAR) 2
– – empaquetado 25 – automatización 50
– derivatización 44–46 – columnas
– Detector de conductividad electrolítica 35 – – columnas de microchip 60
– detector de captura de electrones 31, 32 – – columnas monolíticas 59, 60
– FloridaDetector de ionización de llama 28–30 – – columnas tubulares abiertas 61
– Floridadetector fotométrico ame 35 – – columnas empaquetadas 54–59
– Detector infrarrojo por transformada de – detectores 81, 100
Fourier (FTIR) 36 – dilución 51–53
– sistemas de inyección 19–24 – – arrastre 52
– fase móvil/gas portador 17–19 – – Extractores de fase sólida (SPEs) 52, 53
– Detector de nitrógeno y fósforo (NPD) 30, 31 – – Fuerza de elución del disolvente 51, 52
– detector de fotoionización (PID) 35 – – inyección temporizada 52
– análisis cualitativos/cuantitativos 43, 44 – fases estacionarias 64–80 cromatografía en capa
– fases estacionarias fina de alto rendimiento (HPTLC) 105, 106 mezcla a alta
– – cromatografía de adsorción 36 presión 48, 49
– – cromatografía de partición 37–42 cromatografía hidrodinámica 156
– control de temperatura 41, 42 fases enlazadas hidrofílicas 107
– detector de conductividad térmica 28 interacción hidrofílica líquida
– Separaciones bidimensionales 42, 43 cromatografía (HILIC) 67, 68
cromatografía de gases-espectrometría de masas interacción hidrofóbica
(GC–MS) interconexión 33, 34 cromatografía (HIC) 73 interacciones
– Interfaz dividida 34 hidrofóbicas 70, 74, 107, 135,
cromatografía de gases y líquidos (GLC) 17, 25, 26, 165, 166, 172
36–39
– fases estacionarias, caracterización 39, 40 i
cromatografía gas-sólido (GSC) 3, 17, inmunodetección 113
26, 36, 44 ionización de plasma acoplado inductivamente
Distribución gaussiana 5, 6, 9 (ICP) 85
Picos gaussianos 9, 12 sistemas de inyección 17–19, 149, 180
Columna capilar GC (WCOT) 26 – columnas capilares 21–24
Detector GC, características 29 – Técnicas de espacio mental 23, 24
Separador de chorro GC-MS 34 – inyectores de gran volumen 23
GC·Sistema GC 43 – Inyección en columna 22, 23
electroforesis en gel (GE) 2, 14, 127, 130 – inyector de columna empaquetada 20
– geles 130, 131 – inyección dividida 21, 22
– instrumentación 131–133 GLC – – inyección sin división 22
cromatografía de partición 37 ecuación técnicas de inyección 22, 139
de Golay 8 – inyección de volumen constante 50
 yoÍndice
204

– Inyección de volumen variable 51 – – ionización por electrospray 86–88

– volúmenes y precisión 51 – – ionización de plasma acoplado
Volumen de inyección, relacionado con la elución del disolvente. inductivamente 90, 91
fuerza 51, 52 – Analizadores de trampa de iones 92
cromatografía iónica, para iones inorgánicos 75 – Analizadores de masas cuadrupolos 91, 92
cromatografía de intercambio iónico (IEC) 1, 67, 73 – analizadores de tiempo de vuelo 92, 93
materiales de intercambio iónico 73, 74 sistema McReynolds 39, 40 preparación de
– Elución en gradiente 74 muestras basada en membrana
– Propiedades de los intercambiadores de iones 73 técnicas 183
– Retención en intercambiadores de iones 74 – microextracción en fase líquida 185
Espectrometría de movilidad iónica 103 – microdiálisis 183–185 micelar
cromatografía de pares iónicos, en fase reversa electrocinética capilar
columnas 72, 73 cromatografía (MEKC) 2, 143–145
elución isocrática 3 sílice hidratada microamorfa 37
enfoque isoeléctrico 74, 130, 134, 135, 142, 143 microchips
separación isotérmica 19, 41 – columnas 60
microdiálisis 183–185
yo – aplicaciones 185
Separador de chorro 34 – corte 184
tasas de migración 108
yo cantidad mínima detectable (MD) 28–30, 34
fluorescencia inducida por láser (LIF) 140, 153
fases móviles 2–8, 17, 49, 53, 60, 67, 72, 77,
gas de la risa (N2O) 118 diodos emisores de
86, 107, 108, 111, 118, 146, 150, 197
luz (LED) 154 detectores de dispersión de luz
– pH 197, 198
80, 100
Absortividad molar 82
cromatografía líquida (LC, HPLC) 1–3, 14,
polímeros de impresión molecular (MIP) 168
47–107
tamices moleculares 36
Extracción líquido-líquido (LLE) 164–167
columnas monolíticas 59, 60
– Selección de disolventes orgánicos 165
– a base de sílice 60
– coeficiente de partición 164
monolitos en el año 146 d. C.
– Triángulo de disolventes de Snyder
166 cromatografía líquido-sólido 3 LLE, norte

verExtracción líquido-líquido (LLE) Cámara N 108

difusión longitudinal 6, 7 membrana de nitrocelulosa 132 detector de
mezcla a baja presión 48, 49 nitrógeno-fósforo (NPD) 29–31 materiales de
fase normal, para adsorción
metro
cromatografía 64
óxido de magnesio 107 – alúmina 65, 66
silicato de magnesio 107 – materiales de carbono 68
MALDI (desorción láser asistida por matriz) – Materiales HILIC 67, 68
interfase de ionización 114
– Principios de separación 64, 65
detector sensible a la masa 33 – sílice 65
espectrómetro de masas 32–34
– – con grupos funcionales polares enlazados 66, 67
– Interfaz GC 33, 34 – titanio 65, 66
– ionización negativa en GC-MS 33 – circonita 65, 66
– ionización positiva en GC-MS 33
detección espectrométrica de masas 3, 85, 114, 122 o
– fragmentación en espectrometría de masas 94 Técnicas de inyección en columna 19
– Analizadores FTMS 93–95 columnas tubulares abiertas (OTC) 1, 6–8, 11,
– Interfaces LC-MS 85, 86 24–26, 61, 121, 122, 146
– – ionización química a presión – tipos de 26
atmosférica 88, 89 rotación óptica 80
– – fotoionización a presión cromatografía en capa sobrepresurizada
atmosférica 89, 90 (OPLC) 111
 Índice yo205

pag – Métodos de calibración 192–195

columnas empaquetadas en GC 25 – Validación de métodos 196
– Tamaño de partícula 25 columnas – parámetros de validación 196
empaquetadas en HPLC – – precisión 197
– contrapresión 58 – – linealidad 197
– Dimensiones de la columna 54 – – rango 197
– – en HPLC 55 – – repetibilidades 197
– eficiencia de la columna 56 – – robustez 197, 198
– – enen las curvas van Deemter 56, 57 – – selectividad 197
– duración de la columna 57 – – estabilidad 198
– Material de la columna 54 detectores sensibles a la – procedimiento de validación 198, 199
concentración en HPLC 55
– Partículas núcleo-capa 58, 59 a
– formas de pico 57, 58 detectores de radiactividad 102
– Partículas porosas, HPLC convencional 58 radiofrecuencia (RF) 91, 92 detección del
– ahorro de disolvente 55 índice de refracción 100–102 detectores de
– Cromatografía líquida de ultraalta presión índice de refracción (RI) 80, 100 resolución 11
(UPLC/UPHLC) 59
Tamaño de partícula 6, 11, 54, 56–59, 65, 106, 122, 156
– bandas de elución 12
Tubo PEEK 47
– transferencia de masa
detector de fotoionización (PID) 35 polaridad 22,
– – En fase 7 móvil estancada
38–40, 67, 85, 86, 111, 116, 122,
– – en fase estacionaria 7
165, 172
– variables 12
poliamida 107
materiales de acceso restringido (RAM) 168
Polímeros de poliimida 25, 26, 136, 140,
limitadores 124
146, 151
factor de retardo (Rf) 111, 112 factor de
– copolímero de olefina cíclica (COC) 151
retención 3, 5, 10, 12, 53, 69, 71,
– hidrófilo lineal 142 112, 144
– Impronta molecular 168, 175, 188 espacio de retención 22, 23, 25, 121, 122 tiempo de
– materiales basados en polímeros orgánicos 72
retención 2, 6, 9, 10, 11, 13, 34, 37, 44–46,
– materiales a base de sílice polimérica 69 155, 156, 158, 193, 196
– Utilizado en microdiálisis 184 materiales de fase inversa 68
polisiloxanos 38
– Materiales híbridos y materiales
poliestireno-divinilbenceno (PS-DVB)
hidrosilados 72
materiales 1, 72
– materiales basados en polímeros orgánicos 72
alcohol polivinílico 106
– retención 69, 70
cromatografía impulsada por potencial 127, 145
– Principios de separación 68, 69
– Columnas y fases estacionarias 146
– materiales de fase inversa a base de sílice 71
– instrumentación 145 – modelo de parámetro de solvatación 70,
– fases móviles 145, 146 71 rodamina B 113
– En la ciencia de la separación 146, 147
vaporización a temperatura programada (PTV)
inyector 23 s
Precipitación de proteínas 182 Método de preparación de muestras 162
– modificador orgánico 183 – factor de enriquecimiento, definido 162, 164
– sales 183 – propiedad 162
– ácido tricloroacético (TCA) 183 – recuperación
– – cálculo 163
q – – ecuaciones, para describir 162 tamaño
Analizadores de masas cuadrupolos 91, de muestra 107, 161, 163, 164, 188 cámara
92 cuantificación 44, 189–191 S 108, 109
– Basado en mediciones de altura de siliconas 20, 38–40, 42
pico/área de pico 190 sililación 44, 45
 yoÍndice
206

cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) 1, 76, – – entrega 119, 120

77, 158 – limitador 124
materiales de exclusión de tamaño 76 Extracción con fluidos supercríticos (SFE) 116
– materiales 76, 77 fluidos supercríticos
– fases móviles 77 – densidades 116
– Principios de separación 76 Triángulo de – coeficientes de difusión 116
disolventes de Snyder 166 Extracción en fase – solubilidad 116
sólida (SPE) 168–170 – viscosidades 116
– intercambio iónico 172–174 soporte tubular abierto revestido (SCOT)
– – Intercambiadores de iones y estructura química 174 columnas 26, 37, 44
– – modo mixto 175
– polímeros de impronta molecular 175, 176 a
– Extracción en fase normal 170–172 TCD,verGradientes de temperatura del detector de
– materiales de acceso restringido 176 conductividad térmica (TCD) en HPLC 62
– fase inversa 172 separaciones programadas por temperatura 41
– Equipos SPE 176–178 programación de temperatura en GC 41 detector de
– Pasos típicos de SPE en fase inversa 169 conductividad térmica (TCD) 18, 28, 29
extractores de fase sólida en HPLC 52, 53 fraccionamiento de flujo de campo térmico
– Columna analítica, inyección de gran volumen 53 (ThFFF) 157, 158
microextracción en fase sólida (SPME) 178 cromatografía de capa fina (TLC) 1, 105
– adsorción/extracción 178, 179 – fases unidas químicamente 107
– Desorción/inyección 179 – detección 112–114
– – SPME–GC 180 – Elución y desarrollo 108–111
– – SPME-HPLC 180 – fases móviles 107, 108
– esMateriales de la fibra y parámetros – cromatografía en capa sobrepresurizada 111
de extracción 180 – RFvalor 111, 112
solubilidad 68, 77, 116, 118, 165, 181 disolvente – Ejemplo de aplicación 105, 106
20, 22, 23, 36, 45, 48, 51, 65, 67, 90, 108, – fases estacionarias 106, 107
129, 189 – Desarrollo bidimensional 110
– entrega 47–49 Derivados de TMS 45
– gradientes 68 Trimetilsililimidazol (TMSIM) 45
– no polar 165 cromatografía bidimensional (2D) 13
– orgánico 68, 69, 73, 167, 175, 182, 186 separaciones bidimensionales 14, 42–43, 134
– polares 169, 172
– embalses 48, 49
tú
– Triángulo del disolvente de Snyder 166
cromatografía líquida de ultraalta presión
– fuerza 13, 65
(UPLC/UPHLC) 48, 59
ESPECIAL,verDetectores espectrofotométricos
– Tiempo de análisis reducido/alturas de pico
de extracción en fase sólida (SPE) 83 Inyección
aumentadas 59
dividida 22
– vs.HPLC convencional 59 TLC
SEMPE,vermicroextracción en fase sólida (SPME) de
ultradelgada (UTLC) 107
escualano 39
Detectores UV 81
almidón 106
– Elegir la longitud de onda adecuada 82
Radio de Stokes 128
– cromóforos 82
amoniaco supercrítico 118
– límites de detección 82
fluido supercrítico 115
– esDetección fotométrica de ltros 83
cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) 115
– Floridacélulas ow 82
– columnas 122–124
– detectores 124, 125
– gradientes en 120, 121 en
– Inyección 121 parámetros de validación 196
– Configuraciones de instrumentos 116, 117 – precisión 197
– fases móviles 118 – linealidad 197
 Índice yo207
– rango 197 viscosidad 48, 58, 61, 62, 66, 115, 116, 128, 138,
– repetibilidades 197 143, 157
– robustez 197, 198
– selectividad 197 el
– estabilidad 198 Columnas tubulares abiertas con revestimiento de pared (WCOT) 26,

curva de van Deemter 14 37, 39, 40

ecuación de van Deemter 8
diagrama de van Deemter 19 el
sistemas de video 114 electroforesis de zona 133