MINISTERIO DE LA DEFENSA
UNIVERSIDAD NACIONAL REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
EXPERIMENTAL POLITÉCNICA DE LA FUERZA ARMADA
UNEFA – NÚCLEO YARACUY
PRACTICA DE LABORATORIO: 02. Aislamiento microbiano.
INTRODUCCIÓN.
Las aguas presentan una microbiota cuya composición refleja su origen y/o su nivel
de contaminación. En salud pública, la presencia de microorganismos tiene una
atención particular, ya que estos pueden ser indicadores de presencia de
microorganismos patogénicos que, a través de esta fuente, se propagan. La
elección de los métodos de laboratorio a utilizar para la detección de contaminación
microbiana debe privilegiar a aquellos métodos estandarizados y de alta
sensibilidad que hayan sido validados por organismos internacionales o nacionales
de referencia. El aislamiento es una etapa importante en el estudio de
microorganismos y comprende a la separación de aquél organismo de interés con
respecto a otros que pueden estar presentes en la misma muestra de alimento y/o
agua.
Sembrar o inocular consiste en introducir artificialmente una porción de
muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano
bajo condiciones de laboratorio controladas. La siembra puede realizarse en medio
líquido, sólido o semisólido, mediante asa en punta, recta o en aguja, hisopo o pipeta
estéril. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de
cultivos puros, facilitando el estudio, caracterización, aplicación y control de los
mismos. La determinación del número de células viables, es el método más utilizado
para la determinación del número de células viables o unidades formadoras de
colonias (U.F.C.) en un alimento. Los recuentos de microorganismos viables se
basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente
inoculadas con una cantidad conocida de alimento (dilución) e incubadas en unas
condiciones ambientales determinadas.
Realizado por: Ing. Jessica Dobobuto
Unidad curricular: Microbiología de los alimentos.
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UNEFA – NÚCLEO YARACUY
OBJETIVOS.
1. Preparar medios de cultivos sólidos (agares), líquidos, (Caldos).
2. Realizar diluciones seriadas hasta 10-3 de las muestras suministradas.
3. Aplicar técnicas de siembra en profundidad, estriado y superficial en medios
de cultivos sólidos.
4. Inocular caldos de cultivos.
5. Efectuar conteo de microorganismos en placas de Petri.
MATERIALES.
Agua peptonada.
Muestras de agua (Suministrada por los estudiantes)
Papel envoplast (Suministrada por los estudiantes)
Encendedor (Suministrada por los estudiantes)
Vela (Suministrada por los estudiantes)
Caldo bilis verde brillante
1 Desecador con tapa para vacío (Equipo)
2 Contador de colonia
28 tubos de ensayo
Agar Levine EMB
Agar extracto de levadura
28 placas de Petri (al menos 10 tamaño grande)
Alcohol para mecheros
Tapa bocas (Suministrada por los estudiantes)
1 matraz Erlenmeyer capacidad 500ml
4 matraz Erlenmeyer capacidad ≥ 250ml
5 varillas de agitación.
5 asas de inoculación.
Astas para asas de inoculación (Suministrada por los estudiantes)
Realizado por: Ing. Jessica Dobobuto
Unidad curricular: Microbiología de los alimentos.
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5 gradillas
Papel craf. (Suministrada por los estudiantes)
5 Mecheros de alcohol
5 pipetas capacidad ≥1ml
2 balanzas digitales
4 vidrio reloj
4 espátulas.
PROCEDIMIENTOS.
Preparación de medios de cultivos:
1. Agua peptonada: Según indicaciones de fabricante.
2. Caldo bilis verde brillante: Según indicaciones del fabricante.
3. Agar Levine EMB: Según indicaciones del fabricante.
4. Agar Extracto de levadura: Según indicaciones del fabricante.
Preparación de las diluciones seriadas:
1. Previa esterilización de los tubos de ensayo, disponer en gradillas tantos
tubos como sea necesario para lograr diluciones hasta 10-3 +1
2. Identificar cada tubo de ensayo, partiendo de la muestra problema.
3. Adicionar en el tubo previamente identificado la muestra problema.
4. Adicionar 9 ml de agua peptonada en 3 tubos de ensayo respectivamente.
5. Adicionar 1ml de muestra al tubo identificado como 10-1 y homogenizar.
6. Repita la operación anterior hasta alcanzar la dilución 10-3 tal como se
muestra en la figura.
Realizado por: Ing. Jessica Dobobuto
Unidad curricular: Microbiología de los alimentos.
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2. Procedimiento para siembra en caldo de cultivo.
1. Adicionar a un tubo de ensayo previamente esterilizado, caldo bilis verde
brillante preparado según indicaciones e fabricante.
2. Con ayuda de un asa de inoculación, previamente esterilizada, tomar una
porción de la muestra problema SIN DILUIR e inocular el medio de cultivo
adicionado.
3. Homogenizar la muestra y el caldo.
4. Identificar la solución, esperar el tiempo indicado (24.48hrs).
5. Observar e identificar los cambios en los diferentes tiempos que se
indique.
6. Registrar y graficar los resultados.
3. Procedimiento para siembra superficial.
1. Servir el medio de cultivo (Extracto de levadura) en la placa de Petri.
2. Esterilizar una pipeta.
3. Tomar 1 ml de muestra problema SIN DILUIR.
4. Adicionar la porción de muestra al medio de cultivo solidificado.
5. Con ayuda de una varilla de agitación estéril, distribuir la muestra por la
totalidad de la superficie.
Realizado por: Ing. Jessica Dobobuto
Unidad curricular: Microbiología de los alimentos.
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6. Repetir la operación de la dilución 10-3
7. Identificar la placa y llevar a incubación
8. Transcurrida 24 horas, realizar conteo de colonia desarrolladas, repetir la
operación a las 48 horas.
9. Tomar nota de los resultados.
Procedimiento para siembra en profundidad.
1. En una placa previamente estéril, colocar 1ml de muestra problema SIN
DILUIR.
2. Adicionar el medio de cultivo (Extracto de levadura) SIN SOLIDIFICAR a la
muestra. Para este paso debe cuidar que la temperatura del medio no sea
superior al 45°C; siendo un indicativo de ello, la posibilidad de posicionar el
matraz sobre el dorso de la mano sin causar lesión por quemaduras.
3. Una vez adicionados ambas soluciones, homogenizar.
4. Colocar la mezcla en reposo hasta solidificar.
5. Identificar la muestra y llevar a incubación.
6. Transcurrida 24 horas, realizar conteo de colonia desarrolladas, repetir la
operación a las 48 horas.
7. Tomar nota de los resultados.
Procedimiento para siembra por estriado o agotamiento..
1. Servir el medio de cultivo (Extracto de levadura)
2. Esperar que solidifique.
3. Esterilizar por técnica de calor directo el asa de platino.
4. Tomar una porción de muestra SIN DILUIR y realizar el estriado de su
preferencia.
5. Identificar la muestra.
6. Llevar a incubación
7. Tomar nota a 24 y 48 horas.
Realizado por: Ing. Jessica Dobobuto
Unidad curricular: Microbiología de los alimentos.
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8. Registrar los resultados.
Procedimiento para siembra superficial en anaerobiosis.
1. Servir el medio de cultivo (Levine EMB) y esperar solidificar.
2. Siguiendo el procedimiento estándar para una siembre superficial inocule
una porción de muestra problema SIN diluir.
3. Identifique la muestra, lleve a la cámara de desecación al vacío.
4. Repita el procedimiento y una vez inoculado, envuelva en una película de
papel envoplast tanto como sea necesario para garantizar la anaerobiosis.
5. Transcurrida 24 horas, realizar conteo de colonia desarrolladas, repetir la
operación a las 48 horas.
6. Tomar nota de los resultados.
Procedimiento para siembra en agar inclinado.
1. Sirva el medio de cultivo (Extracto de levadura) en un tubo de ensayo.
2. ANTES de solidificar coloque el tubo de ensayo sobre un soporte que
garantice un 45° de inclinación, mantenga la posición hasta solidificar.
3. Esterilice un asa de inoculación, espere disminuir la temperatura.
4. Con la ayuda del asa previamente estéril, tome una porción de muestra.
5. Inocule sobre la superficie solidificada, dibujando un estriado por
agotamiento (Zig-zag).
6. Identifique la muestra, lleve a incubación.
7. Tome nota de lo observado en 24 y 48 horas.
Realizado por: Ing. Jessica Dobobuto
Unidad curricular: Microbiología de los alimentos.
