EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

ENZIMÁTICA

Universidad de Guanajuato
Lic. Médico Cirujano
Biología Celular y Bioquímica

EQUÍPO 13

Carpio Vallejo Sofía Brizeida 349641

Flores Espinosa Dulce María 382612

Gómez Fernández Alberto 614730

González Avalos Miguel 562843

Guzmán Salazar Andrea Elizabeth 350733

Maldonado Centeno Owen Alexis 395721

Vázquez Muñoz Betsabe Margarita 438183

Dra. Esmeralda Rodríguez Miranda

León, Guanajuato a 24 de octubre de 2024

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INTRODUCCIÓN

Una enzima es una proteína que actúa como biocatalizador, esto se refiere a que aceleran las
reacciones químicas en los sistemas biológicos. Al facilitar las reacciones, las enzimas disminuyen
la energía de activación necesaria y permiten que la reacción sea realizada a temperaturas mas
bajas, lo que se relaciona con el aumento de velocidad de las reacciones de procesos biológicos.
(Feduchi Canosa et al., 2014; Walsh, 2001)
La velocidad de reacción es la energía libre para iniciar la conversión de reactivos y productos.
Esta puede ser afectada por la concentración de reactivos, cambios en la temperatura, por uso de
catalizadores y por naturaleza química, como el estado de agregación.

Estas enzimas son esenciales para la vida y su correcto funcionamiento del organismo, ya que
regulan distintas vías metabólicas y procesos de los organismos; tales como la digestión, síntesis y
degradación de moléculas o la replicación de ADN.

Las enzimas se clasifican en distintas familias según su estructura y función molecular, la cual se
da por la capacidad de catalizar reacciones bioquímicas determinadas.
(MartínezCuesta et al., 2015)

El estudio de las reacciones bioquímicas que son catalizadas por enzimas se le conoce como
cinética enzimática, en la cual se analiza cada una de las etapas que se dan por la actividad de la
enzima, los mecanismos de acción enzimática de cada una, así como sus interacciones con los
inhibidores y sustratos específicos. La información obtenida en la cinética enzimática es
fundamental para comprender el comportamiento de las enzimas en distintas condiciones tanto
fisiológicas como patológicas. (Gatenby & Frieden, 2016; Robinson, 2015)
Con relación a los inhibidores, son moléculas que interfieren limitando o impidiendo la actividad de
las enzimas, así no logrado que funcionen de manera natural. Existen tres tipos principales de
inhibidores, los cuales son: competitivos, no competitivos y acompetitivos. Cada uno de ellos afecta
a la enzima de forma distinta. (Chen et al., 2022; CORTÉS et al., 2001)
En el ámbito de la cinética enzimática se utilizan modelos fundamentales que van a permitir
cuantificar la eficacia de acción de una enzima. En particular, se van encuentra el complejo enzima-
sustrato y la ecuación de Michaelis-Menten (Km), la cual es una fórmula fundamental en la cinética
enzimática que describe cómo la velocidad de una reacción enzimática depende de la
concentración del sustrato.; por lo que estos modelos se ven estrechamente relacionados con los
efectos de los inhibidores que pueden modificar tanto Km como Vmáx de distintas maneras.
En el contexto de la ecuación de Michaelis-Menten, se describe cómo la velocidad de una reacción
enzimática depende de la concentración del sustrato en condiciones saturables. Bajo condiciones
de saturación, la velocidad aumenta con la concentración del sustrato, pero existe un punto donde
la adición del sustrato ya no aumenta la velocidad de reacción, dando un máximo, conocido como
la velocidad máxima (Vmax). (Srinivasan, 2022; Wong et al., 2018)

donde:

• V0 es la velocidad de la reacción.

• Vmax es la velocidad máxima de la reacción cuando la enzima está saturada con el sustrato.

• [S] es la concentración del sustrato.

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• Km es la constante de Michaelis-Menten, que representa la concentración de sustrato a la cual la
velocidad de la reacción es la mitad de Vmax.

En la regulación enzimática, el valor de Km tiene importancia en la regulación metabólica, en el

diseño de fármacos, así como en el diagnóstico clínico. (Feduchi Canosa et al., 2014)

La ecuación de Lineweaver-Burk se representa mediante una recta de pendiente Km/Vmax.

El punto de corte de esta recta con el eje X se corresponde con el valor de -1/K m y el punto de corte
con el eje Y con el valor de 1/Vmax Una vez representados los valores obtenidos experimentalmente,
se puede calcular el valor de Vmax que solo se podía obtener de forma aproximada en la
representación hiperbólica tradicional.
Es importante mencionar que hay inhibidores enzimáticos, estos inhibidores son moléculas que se
suelen unir a la enzima mediante enlaces covalentes o no covalentes muy estables.
Dependiendo del inhibidor estos pueden ser de forma reversible (3 tipos) o irreversible.
Las inhibiciones reversibles incluyen: Inhibición competitiva. Suele darse cuando hay una molécula
semejante al sustrato de la reacción, dando una competición de los ligandos por unirse al centro
activo. El inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato, impidiendo la formación del complejo ES y
la formación de producto; Inhibición No Competitiva. En esta reacción el inhibidor muestra afinidad
tanto por la enzima libre como por el complejo ES y la unión se realiza en un lugar distinto del
centro activo. Este efecto no se puede evitar, aumentando así la concentración de sustrato y se
produce una disminución de la Vmax; Inhibición Acompetitiva. Se unen exclusivamente al complejo
ES en un lugar diferente al centro activo. Esta inhibición implica la disminución de Vmax y Km.
La última inhibición es irreversible. Pueden unirse a la enzima mediante enlaces covalentes con los
residuos imprescindibles para la catálisis, impidiendo su función. Este tipo de inhibidores no tienen
un comportamiento cinético de Michaelis-Menten. (Feduchi Canosa et al., 2014)

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COMPETENCIAS
1. Explica el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción
enzimática.
2. Calcula por métodos gráficos la velocidad máxima y la constante de Michaelis de una
reacción enzimática.
3. Conoce los diferentes tipos de inhibidores enzimáticos que existen y estudiará su efecto
sobre la Km y la Vmax.
Para observar el efecto que tienen la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática, es
necesario realizar una curva con diferentes concentraciones del sustrato.
PROCEDIMIENTO

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RESULTADOS

Núm. de H2O (mL) Solución stock de Volumen de la Concentración

tubo glucosa (mM) solución stock de final de glucosa
glucosa (mL) (mM)
1. 4.00 mL 4 mM 0 mL 0 mM
2. 3.90 mL 4 mM 0.10 mL 0.10 mM
3. 3.75 mL 4 mM 0.25 mL 0.25 mM
4. 3.50 mL 4 mM 0.50 mL 0.50 mM
5. 3.90 mL 40 mM 0.10 mL 1 mM
6. 3.75 mL 40 mM 0.25 mL 2.5 mM
7. 3.50 mL 40 mM 0.50 mL 5 mM
8. 3.00 mL 40 mM 1 mL 10 mM

Núm. de [S] Velocidad de Velocidad de 1/V0 1/[S] 1/V0 del

tubo reacción la reacción inhibidor
con inhibidor
1. 0 mM 0 0 0 0 0
2. 0.10 mM 40 20 0.025 10 0.05
3. 0.25 mM 58 32 0.017 4 0.031
4. 0.50 mM 95 65 0.010 2 0.015
5. 1 mM 125 90 0.008 1 0.011
6. 2.5 mM 160 105 0.006 0.4 0.0095
7. 5 mM 185 140 0.0054 0.2 0.0071
8. 10 mM 200 162 0.005 0.1 0.0061

Operaciones

H 2O=Vfinal−Vstock Tubo #1

H 2O=4 mL−0 mL=4 mL

H 2O=4 mL−0.10 mL=3.9 mL
H 2O=4 mL−0.25 mL=3.75 mL
H 2O=4 mL−0.50 mL=3.5 mL
H 2O=4 mL−0.10 mL=3.9 mL
H 2O=4 mL−0.25 mL=3.75 mL
H 2O=4 mL−0.50 mL=3.5 mL
H 2O=4 mL−1.0 mL=3.0 mL

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 Cstock •Vstock
Cfinal=
Vfinal
4 mM • 0 mL
Cfinal= =0 mM
4 mL
4 mM • 0.1 mL
Cfinal= =0.1 mM
4 mL
4 mM • 0.25 mL
Cfinal= =0.25 mM
4 mL
4 mM • 0.50 mL
Cfinal= =0.50 mM
4 mL
40 mM •0.10 mL
Cfinal= =1 mM
4 mL
40 mM •0.25 mL
Cfinal= =2.5 mM
4 mL
40 mM •0.10 mL
Cfinal= =1 mM
4 mL
40 mM •0.25 mL
Cfinal= =2.5 mM
4 mL
40 mM •0.50 mL
Cfinal= =5 mM
4 mL
40 mM •1.0 mL
Cfinal= =10 mM
4 mL

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Eje Y: V0 (Velocidad inicial)

Eje X: [S] (Concentración de

sustrato)

Eje Y: 1/V0 (1/Velocidad inicial)

Pendiente:0.0047

Pendiente:0.0022
0.006

-2.18

0.0048

-1.27 Eje X: 1/[S] (1/Concentración de sustrato)

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Tipo de inhibición: Mixta, porque hay un aumento en la pendiente, el punto de intersección se da
en un cuadrante y el valor de Vmax se vio disminuido y la Km aumento, aunque puede aumentar
disminuir dependiendo la afinidad.
Valor de Vmax y Km

Vmax Km
Sin inhibidor 208.33333 0.4583333
Con inhibidor 166.66667 0.7833333

CONCLUSIONES
De acuerdo con los resultados obtenidos en las graficas, llegamos a la conclusión de que se trata
de una inhibición mixta, ya que afecta tanto a la afinidad de la enzima por el sustrato. En la gráfica
de Lineweaver-Burk se observa un aumento en la pendiente que tiene inhibidor, a su vez se
observa una disminución de la Vmax y un aumento de la Km, y el punto de intersección entre
ambas pendientes se da en un cuadrante y no en los ejes.
Este comportamiento sugiere que el inhibidor no puede ser desplazado por altas concentraciones
de sustrato, lo que nos indica que, aunque el inhibidor compite con el sustrato, también puede
unirse a la enzima cuando el sustrato ya está presente.

BIBLIOGRAFÍA
Chen, W.-Q., Yu, Y.-Q., Cao, L., Yin, M.-M., Liu, Y., & Jiang, F.-L. (2022). Design and
construction of competitive, noncompetitive and uncompetitive nano inhibitors of
enzymes. Chemical Communications, 58(100), 13911–13914.
https://doi.org/10.1039/D2CC05848K

CORTÉS, A., CASCANTE, M., CÁRDENAS, M. L., & CORNISH-BOWDEN, A. (2001).

Relationships between inhibition constants, inhibitor concentrations for 50%
inhibition and types of inhibition: new ways of analysing data. Biochemical Journal,
357(1), 263. https://doi.org/10.1042/0264-6021:3570263

Feduchi Canosa, E., Yáñez Conde, E., Romero, C., & García-Hoz Jiménez, C. (2014).
Bioquímica: Conceptos esenciales (Médica Panamericana, Ed.; 2a ed.). Ed. Médica
Panamericana.

Gatenby, R., & Frieden, B. R. (2016). Investigating Information Dynamics in Living

Systems through the Structure and Function of Enzymes. PLOS ONE, 11(5),
e0154867. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0154867

Martínez Cuesta, S., Rahman, S. A., Furnham, N., & Thornton, J. M. (2015). The
Classification and Evolution of Enzyme Function. Biophysical Journal, 109(6), 1082–
1086. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.04.020

Robinson, P. K. (2015). Enzymes: principles and biotechnological applications. Essays in

Biochemistry, 59, 1–41. https://doi.org/10.1042/bse0590001

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Srinivasan, B. (2022). A guide to the Michaelis–Menten equation: steady state and
beyond. The FEBS Journal, 289(20), 6086–6098.
https://doi.org/10.1111/febs.16124

Walsh, C. (2001). Enabling the chemistry of life. Nature, 409(6817), 226–231.

https://doi.org/10.1038/35051697

Wong, F., Dutta, A., Chowdhury, D., & Gunawardena, J. (2018). Structural conditions on
complex networks for the Michaelis–Menten input–output response. Proceedings of
the National Academy of Sciences, 115(39), 9738–9743.
https://doi.org/10.1073/pnas.1808053115