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TEMA 9: ANÁLISIS CROMOSÓMICO. OBTENCIÓN DE
EXTENSIONES CROMOSÓMICAS. TINCIÓN Y BANDEADO.
1. Introducción y contextualización práctica
Una vez estudiados los cultivos celulares en la unidad anterior, vamos a profundizar en
cómo se obtienen los cromosomas y cómo se llevan a cabo las diferentes técnicas de
análisis cromosómico para la observación de posibles anomalías numéricas o estructurales
en el material genético que se debe estudiar, destacando la tinción, el bandeo o la
fluorescencia.
Cromosomas:
- Obtención
- Técnicas análisis: observación de anomalías
- Tinción
- Bandeo
- Fluorescencia
Resolución del caso práctico de la unidad
Lo primero que necesitamos preparar es el medio de cultivo, que contendrá sales,
nutrientes, hormonas, factores de crecimiento antimicrobianos y fitohemaglutinina, que es
un mitógeno, además de suero bovino fetal (habitualmente).
Para detener la mitosis, necesitaremos Colchicina o Colcemid. A continuación, una solución
hipotónica de cloruro potásico y un fijador, normalmente el fijador de Carnoy, elaborado con
etanol y ácido acético. Finalmente, solo necesitamos los reactivos para el bandeo, que
serán tripsina, una solución salina y la solución colorante.
2. Técnicas de análisis cromosómico
Normalmente, se clasifican en dos grandes categorías: anomalías estructurales, donde se
produce alteración del orden o la cantidad de los genes que portan, y anomalías
numéricas, cuando aparecen o desaparecen cromosomas de la célula.
Existen, a su vez, diferentes técnicas para estudiarlos, ya sea por tinciones, que les dan
color; por bandeo, dejando diferentes bandas de colores; o por fluorescencia,
resaltando estructuras marcadas con colorantes fluorescentes.Hay que recordar que, junto
a los cultivos celulares, el análisis cromosómico es la principal técnica que se realiza en los
laboratorios de citogenética destinados al diagnóstico de anomalías cromosómicas.
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3. Interés del estudio cromosómico
Ante las diferentes enfermedades que derivan de anomalías cromosómicas, a los seremos
humanos nos resulta interesante realizar este tipo de estudio. Se practica porque el médico
u otro trabajador sanitario advierte en el paciente anomalías que sugieren este tipo de
enfermedades.
En este sentido, el médico responsable realiza el estudio cuando advierte anomalías
congénitas en bebés, alteraciones del correcto desarrollo psicomotor de los niños,
problemas relacionados con el desarrollo sexual de los adolescentes o patologías similares
en adultos, además de infertilidad o problemas genéticos, como hijos con
malformaciones o alteraciones en los genes.
Estos signos indican que debería realizarse el idiograma o el cariograma.
4. Caso práctico 1: “Equipos cariotipadores”
Planteamiento: Cuando vemos en las imágenes de cariogramas los cromosomas
ordenados perfectamente según tamaño, el trabajo para evaluar que no presenten
anomalías es muy sencillo, ya que de un simple vistazo podemos ver todos los cromosomas
y su estado.
Nudo: Pero ¿cómo es posible esto? Ya que, cuando se observan al microscopio, están
desordenados. ¿De qué manera se consigue elaborar un informe con los cromosomas
ordenados?
Desenlace: Esto se lleva a cabo gracias a los cariotipadores automáticos.
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5. Técnicas de obtención de la muestra, sembrado y cultivo celular
Las extensiones cromosómicas las vamos a obtener a partir de muestras biológicas
tomadas en consulta o en quirófano. Recuerda que, una vez tomadas, se llevan al
laboratorio para realizar un cultivo celular de las mismas, lo cual permite aumentar la
densidad celular de la muestra para posibilitar el estudio cromosómico.
Como ya sabemos, se obtienen por venopunción, en el caso de la sangre periférica; por
amniocentesis para el líquido amniótico o por biopsia para las vellosidades coriales.
La siembra se realiza incorporando la muestra al medio de cultivo, que es un líquido
enriquecido con sustancias para la nutrición y desarrollo y reproducción celular. En el caso
de la sangre periférica, en proporción 1/5 o 1/10 (sangre/medio de cultivo). Es
recomendable sembrarla por duplicado y de manera independiente, para evitar
contaminaciones y pérdidas de material de estudio.
Es fundamental incubar las muestras con las condiciones óptimas de pH, osmolaridad,
temperatura, viscosidad, tensión superficial y tiempo de incubación.
Una de las muestras más empleadas es la de sangre periférica, que requiere una
temperatura de 37 o C y un tiempo de 24 a 72 horas, al 5 % de CO2.
Es importante recordar que el medio de cultivo debe contener sales, aminoácidos
esenciales, vitaminas, glucosa, moléculas orgánicas con diversos fines como coenzimas,
hormonas y factores de crecimiento, antibióticos y fungicidas. Por supuesto, también
cuentan con mitógenos como la fitohemaglutinina para estimular la mitosis. En los medios
de cultivo se emplea mucho el suero bovino fetal (FBS), aunque también se emplea suero
de humanos.
6. Técnicas de sacrificio. Inhibidores de la mitosis
En este campo, al hablar de sacrificio, nos referimos a la detención de la mitosis en la
metafase. Para ello, emplearemos sustancias que detienen la mitosis, entre las cuales las
más populares son la colchicina y el Colcemid.
Sacrificio celular:
- Añadir la muestra al medio de cultivo.
- Incubación.
- 120-90 minutos previos a terminar la incubación añadir el inhibidor de la mitosis.
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- Incubación.
- Centrifugar y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el cultivo.
7. Técnicas de recogida, procesado y extensión de células
- Solución hipotónica: cloruro potásico (20 minutos).
- Centrifugar.
- Retirar el sobrenadante y resuspender.
- Fijar 5 mL de Carnoy (5 minutos).
- Centrifugar (retirar el sobrenadante).
- Extender el portaobjetos.
8. Métodos de tinción y bandeado cromosómico
1.Tinción simple:
- Giemsa
2.Tinción fluorescente:
- Fluorocromo
3.Bandeo:
- Bandeo G: carogramas.
- Bandeo R: opuesto al G.
- Bandeo Q: cromosoma Y.
- Bandeo C: regiones heterocromáticas.
- Bandeo NOR: organizadores nucleolares.
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9. Obtención de bandas G, C Y NOR
• Bandeo G
- Requiere el envejecimiento celular.
- Se añade tripsina.
- Se tiñe con Giemsa.
- Bandas claras y oscuras (A-T).
• Bandeo C
- Teñir zonas heterocromáticas (centrómeros).
- Se aplica calor o solución básica y se tiñe con Giemsa o fluorescente.
• Bandeo NOR
- Se tiñen genes del ARN ribosómico.
- Se encuentran en regiones tallo y satélite de los cromosomas acrocéntricos.
10. Protocolo de tinción de Giemsa
• Tinción de Giemsa:
1. Colocamos los portaobjetos en una bandeja de
tinción.
2. Añadir colorante.
3. Dejamos actuar el colorante durante 7-10
minutos.
4. Desechamos el colorante sobrante y lavamos
los portaobjetos.
5. Dejamos que los portaobjetos se sequen al
aire.
6. Preparamos los portaobjetos para su
observación al microscopio con medio de montaje
y un cubreobjetos.
Los cromosomas se ven de color rosa-fucsia.
• Protocolo de bandeo G:
1. Envejecimiento de los linfocitos: calentar
portaobjetos 140º 1/2 minutos.
2. Bandeo de prueba (5-7).
3. Eliminar el exceso de colorante.
4. Drenar y usar aire comprimido para eliminar
el agua.
5. Tratar con tripsina 45-90 minutos.
6. Enjuagar con solución salina.
7. Sumergir en solucion colorante 15-30 minutos
y enjuagar.
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12. Caso práctico 2: “Automatización del
análisis citogenético”
Planteamiento: En el caso práctico anterior, hemos
visto que existen cariotipadores automatizados.
Estos aparecen ante la necesidad de automatizar el
trabajo en el laboratorio de citogenética por la
elevada demanda de trabajo y la gran cantidad de
tiempo que implican estas técnicas.
Nudo: Atendiendo a lo visto en el caso práctico
uno, ¿qué equipo necesitaríamos para disponer de
un sistema automatizado de citogenética?
Desenlace:
- Microscopio
- Software y hardware: lectura y procesamiento de imagen.
- Cámara fotográfica.
- Base de datos.
13. Eliminación de la tinción de los portaobjetos
1. Retirar el aceite de inmersión con almohadillas y alcohol.
2. Eliminar el medio de montaje con agua destilada o con un sustituto del xileno.
3. Secar los portaobjetos.
4. Fijar ácido metanol-acético 3:1.
5. Secar el portaobjetos.
14. Ordenación de los cromosomas humanos
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