UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Escuela Profesional de Ciencias Biológicas
BIOQUÍMICA
Informe de Laboratorio N°6
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA - PARTE 2
Docentes:
GIOVANNA ELIZABETH SOTIL CAYCHO
Grupo y Horario:
PG:5 - Jueves 17:00 a 21:00 hrs
Estudiantes de Mesa N°1
1. Alejo Reyes Joel Wilfredo 23100077
2. Barreto Machuca Arturo Nicolas 23100078
3. Churampi Perez Cesar Augusto 23100083
4. Marcio Omar Carrasco Gutierrez 23100005
5. Taipe Castillo, Jose Daniel 23100106
6. Velasquez Sulca Homero Jesus 23100031
2024-1
Resumen:
En esta práctica experimental se estudia la actividad de la enzima beta
galactosidasa, también conocida como lactasa. Esta enzima cataliza la
hidrólisis de sustratos que contienen enlaces glucosídicos, siendo la lactosa
su sustrato natural. Emplearemos o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG)
como sustrato sintético, el cual, al ser hidrolizado, produce galactosa y
o-nitrofenol (ONP), este último con una intensificación de color amarillo en
medio alcalino, detectable por espectrofotometría. En este caso para hallar el
efecto del tiempo de reacción sobre la actividad enzimática se prepararon
cinco tubos de reacción con diferentes condiciones de incubación, y se midió
la absorbancia del ONP producido a diferentes tiempos. Esto permitió
determinar la velocidad inicial de la reacción que fue de
0. 0000099 𝑛𝑀/𝑚𝑖𝑛. Al igual que para el efecto de la concentración del
sustrato se prepararon varios tubos con diferentes concentraciones de ONPG,
y se midió la absorbancia del ONP producido. Utilizando la cinética de
Michaelis-Menten, se obtuvieron los parámetros Km y Vmax de la enzima.
𝑚𝑀
Que fueron de 1.169377𝑚𝑀 y 0. 00000370 𝑚𝑖𝑛 respectivamente. Ambos
experimentos permiten comprender la cinética enzimática y la relación entre
la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.
Introducción:
Las reacciones químicas en un organismo vivo están intrínsecamente
interconectadas y son reguladas por catalizadores específicos, conocidos
como enzimas, que controlan tanto la naturaleza como la velocidad de estas
reacciones. Sin embargo, la actividad enzimática está sujeta a la influencia de
diversos factores. El tiempo de reacción emerge como un factor crítico, ya
que garantiza alcanzar la velocidad inicial de la reacción, evitando así la
disminución del sustrato. A medida que el tiempo de incubación se
incrementa, se observa un aumento en la formación de producto, aunque esta
tasa de aumento no es lineal debido al proceso de desnaturalización
enzimática. Por otro lado, la concentración del sustrato ejerce una influencia
significativa en la velocidad de la reacción, siguiendo los principios de la
cinética de Michaelis-Menten, donde la velocidad está determinada por la
constante Km, que representa la concentración de sustrato a la mitad de la
velocidad máxima (Vmax). La utilización del gráfico de Lineweaver-Burk
permite calcular con precisión estas constantes cinéticas. Además, los
inhibidores enzimáticos pueden modular la actividad enzimática de manera
específica, siendo competitivos, no competitivos o competitivos. Estos
conocimientos no solo proporcionan una comprensión fundamental de la
actividad enzimática, sino que también ofrecen la capacidad de manipularla
de manera precisa en diversos contextos experimentales.
Objetivos:
- Observar el efecto del tiempo, el efecto de la concentración de sustrato y el
efecto de un inhibidor sobre la actividad enzimática.
- Hallar el Km y Vmax de una enzima usando datos experimentales.
- Identificar cómo varían los parámetros de Km y Vmax según los tipos de
inhibición.
Experiencia 4: Efecto del tiempo de reacción sobre la actividad enzimática
a. Obtener la tabla de valores y la gráfica para el tiempo de incubación
.
Tabla 1. Valores de absorbancia del producto (ONP) en distintos tiempos de
incubación de la enzima, en este caso se medirá la velocidad de actividad
enzimática a través de cuanto producto se forma.
tiempo(min) abs ONP concentración ONP
0 0 0
10 0.389 2.35 × 10^-5
15 0.552 3.34 × 10^-5
20 0.591 ^
3.58 × 10 -5
Una vez obtenidos los datos de la absorbancia del ONP, esto gracias al uso
del espectrofotómetro, se obtuvieron los siguientes resultados: En el tubo 1
es de 0; en el tubo 2, la absorbancia es 0.389; en el tubo 3, es 0.552; y en el
tubo 4, es de 0.591. Calcular la concentración de ONP se logra usando la
fórmula de la Ley de Beer–Lambert (A = εlc), donde el coeficiente de
extinción molar del o-nitrofenol (ONP) es 1.65 × 10^4 M^−1 · cm^−1 y l es
igual a la longitud de la celda usada en el espectrofotómetro, con un valor de
1 cm. Cabe aclarar que para lograr todas las mediciones de absorbancia se
debe esperar a que la enzima que usamos actúe durante un tiempo diferente
para cada tubo: en el tubo 2 es de 10 minutos, en el tubo 3 es de 15 minutos
y en el cuarto es de 20 minutos.
Gráficas:
Figura 1. Relación entre la concentración de ONP y el tiempo de incubación
de la enzima beta galactosidasa. Se observa una relación directa en un inicio
hasta que llega a un límite, mientras más pasa el tiempo la enzima se va
desnaturalizando, por lo que la actividad enzimática no aumenta más. En el
caso de la gráfica, a mayor tiempo se reduce el aumento de concentración de
ONP.
b. Identificar en la curva, la velocidad de reacción (pendiente
equivalente a la velocidad inicial), utilizando la ecuación de la recta
(considere los valores obtenidos en la tabla)
.
Figura 2.En la gráfica resultante que obtuvimos a partir de los datos de
absorbancia y tiempo (medido en minutos), se logra observar cómo la línea
azul es muy semejante a la gráfica y recta que teóricamente se observaría en
una gráfica de concentración vs. tiempo. Las diferencias que se presentan son
causadas por errores de pipeteo, tanto en la técnica como en la medición de la
cantidad de sustrato y enzima vertida en cada tubo de ensayo. Además, cabe
resaltar que durante el experimento en el laboratorio, las mediciones de los
tiempos (10 minutos, 15 minutos y 20 minutos) no fueron exactamente
precisas; sino, por el contrario, hubo periodos de tiempo (segundos) que no se
llegaron a contabilizar. Otro motivo por el cual existe un margen de error en la
gráfica fue la confusión de tubos de ensayo, es decir, que hubo un equívoco en
la marca que se puso a los tubos de ensayo para diferenciarlos uno del otro. A
partir de la recta o línea de medición, se pudo calcular la ecuación de la recta.
Estos cálculos fueron realizados en Excel, para obtener mayor precisión.
Usando los datos proporcionados de la ecuación de la recta y el gráfico, se
puede llegar a calcular la pendiente (m) que representaría, en este caso, a la
velocidad inicial.
𝑌2−𝑌1 3.34 × 10^−5 −2.35 × 10^−5
m= 𝑋2−𝑋1 = 5
= 0. 0000099 𝑛𝑀/𝑚𝑖𝑛
c. Determine cuál sería el rango de tiempo de incubación de su enzima
en la cual se encuentra en velocidad inicial.
Según la gráfica proporcionada el rango donde se ubicaría la velocidad inicial
en la gráfica de concentración vs tiempo es el del tiempo 0 hasta los 10
minutos iniciales .
d. Explique cuál sería la importancia de conocer la velocidad inicial de la
enzima.
Conocer la velocidad inicial de la enzima es importante, debido a que
proporciona información sobre los niveles de eficiencia que posee la
enzima para transformar a los sustratos en productos. Además, cabe
resaltar que esta reacción debe estar sometida a condiciones específicas
para la enzima y sustrato. En el experimento de Concentración vs Tiempo, la
velocidad inicial representa la tasa de catálisis enzimática en un sustrato
antes de que este último sufra variaciones de concentración. Por otro lado, la
medición de la velocidad inicial sirve para comprender y comparar los efectos
que afectan la actividad enzimática, como la concentración de inhibidores.
Experiencia 5: Efecto de la concentración del sustrato: determinación de la
Km y la Vmax
● Elabore una gráfica de Lineweaver-Burk y determine los valores de Km
y Vmax para la beta galactosidasa empleando la ecuación de la recta.
Para hallar la velocidad de la reacción, primero debe determinar la
concentración del producto usando la ecuación de Lambert-Beer
tomando los datos de Absorbancia y el coeficiente de absorción molar
indicado en la nota. La velocidad se expresa en M de producto/unidad
de tiempo.
Procedimiento:
El valor de Km constituye una característica para cada enzima, siendo
dependiente de la naturaleza de sustrato, pH, fuerza iónica, temperatura,
entre otras variables.
Tabla 2.Concentraciones de sustrato, agua destilada y enzima para cada
tubo de ensayo para el experimento.
Tubo B 1 2 3 4 5 6
Concentración de Sustrato 4 4 4 4 4 4 0
ONPG (mM)
Agua destilada (mL) 1.1 1.75 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0
Sustrato (4mM ONPG en 1.0 0.25 0.5 1 1.5 2 0
buffer fosfato pH 5,5) (mL)
Beta galactosidasa dilución 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0
1:200 (mL)
Se preparan 7 tubos de ensayo de 13x100 en una gradilla y se añade las
proporciones indicadas en la tabla . Posteriormente se pre incuba a 37
grados durante 2 minutos, para después añadir las siguientes proporciones
de enzima del tubo 6 hacia cada tubo con un intervalo de 30 segundos.
Tabla 3. Proporciones en mL de la enzima Beta galactosidasa diluida en el
tubo 6 que se pipetea hacia cada tubo.
Tubos B 1 2 3 4 5
Beta galactosidasa 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
dilución 1:200(mL)
Transcurridos 15 minutos en incubación, se añade 1 mL de carbonato de
sodio al 4% y se saca del baño maría. Posteriormente se lee la absorbancia
de cada tubo en el espectrofotómetro a 450 nm.
Para calcular la Concentración del Sustrato ONPG [S] se emplea la fórmula
de concentraciones:
𝐶1 𝑥 𝑉1 = 𝐶2 𝑥 𝑉2
Tenemos los datos de 𝐶1, 𝑉1 𝑦 𝑉2
Para el tubo 1:
𝐶1 = 4 𝑚𝑀
𝑉1 = 0. 25 𝑚𝐿
𝑉2 = 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 0. 25 𝑚𝐿 = 𝐶2 𝑥 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 0.25 𝑚𝐿
2.1 𝑚𝐿
= 𝐶2
𝐶2 = 0. 476 𝑚𝑀
Para el tubo 2:
𝐶1 = 4 𝑚𝑀
𝑉1 = 0. 5 𝑚𝐿
𝑉2 = 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 0. 5 𝑚𝐿 = 𝐶2 𝑥 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 0.5 𝑚𝐿
2.1 𝑚𝐿
= 𝐶2
𝐶2 = 0. 952 𝑚𝑀
Para el tubo 3:
𝐶1 = 4 𝑚𝑀
𝑉1 = 1 𝑚𝐿
𝑉2 = 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 1 𝑚𝐿 = 𝐶2 𝑥 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 1 𝑚𝐿
2.1 𝑚𝐿
= 𝐶2
𝐶2 = 1. 904 𝑚𝑀
Para el tubo 4:
𝐶1 = 4 𝑚𝑀
𝑉1 = 1. 5 𝑚𝐿
𝑉2 = 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 1. 5 𝑚𝐿 = 𝐶2 𝑥 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 1.5 𝑚𝐿
2.1 𝑚𝐿
= 𝐶2
𝐶2 = 2. 857 𝑚𝑀
Para el tubo 5:
𝐶1 = 4 𝑚𝑀
𝑉1 = 2 𝑚𝐿
𝑉2 = 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 2 𝑚𝐿 = 𝐶2 𝑥 2. 1 𝑚𝐿
4 𝑚𝑀 𝑥 1.5 𝑚𝐿
2.1 𝑚𝐿
= 𝐶2
𝐶2 = 3. 809 𝑚𝑀
Para calcular la concentración del producto (ONP) empleamos las fórmula de
la Ecuación de Lambert-Beer expresa la relación entre la absorbancia de luz
monocromática (es decir, de una longitud de onda fija) y la concentración de
un cromóforo en solución:
𝐴 = ε·𝑐·𝑙
Para emplear esta ecuación necesitamos la absorbancia (A) previamente
calculada en el espectrofotómetro, el coeficiente de extinción molar (ε) que en
el caso del producto formado, osea el o-nitrofenol (ONP) es 1.65 × 10^4 M−1
· cm−1 y la distancia que recorre el haz de luz (I), en este caso es de 1 cm.
Calculamos los datos para el tubo 1:
𝐴 = 0. 280
ε = 1. 65 × 10^4 𝑀 − 1𝑐𝑚 − 1
𝑙 = 1 𝑐𝑚
0. 280 = 16500·𝑐·1
0.280
16500
= 𝑐
𝑐 = 0. 000016
Calculamos los datos para el tubo 2:
𝐴 = 0. 437
ε = 1. 65 × 10^4 𝑀 − 1𝑐𝑚 − 1
𝑙 = 1 𝑐𝑚
0. 437 = 16500·𝑐·1
0.437
16500
= 𝑐
𝑐 = 0. 000026
Calculamos los datos para el tubo 3:
𝐴 = 0. 573
ε = 1. 65 × 10^4 𝑀 − 1𝑐𝑚 − 1
𝑙 = 1 𝑐𝑚
0. 437 = 16500·𝑐·1
0.573
16500
= 𝑐
𝑐 = 0. 000034
Calculamos los datos para el tubo 4:
𝐴 = 0. 700
ε = 1. 65 × 10^4 𝑀 − 1𝑐𝑚 − 1
𝑙 = 1 𝑐𝑚
0. 437 = 16500·𝑐·1
0.700
16500
= 𝑐
𝑐 = 0. 000042
Calculamos los datos para el tubo 5:
𝐴 = 0. 664
ε = 1. 65 × 10^4 𝑀 − 1𝑐𝑚 − 1
𝑙 = 1 𝑐𝑚
0. 437 = 16500·𝑐·1
0.664
16500
= 𝑐
𝑐 = 0. 000040
Para Calcular V, dividiremos la concentración [P] del producto entre el tiempo
de actuación de la enzima, que es de 15 min:
0.000016 𝑚𝑀
Tubo 1: 15
= 0. 00000106 𝑚𝑖𝑛
0.000026 𝑚𝑀
Tubo 2: 15
= 0. 00000173 𝑚𝑖𝑛
0.000034 𝑚𝑀
Tubo 3: 15
= 0. 00000226 𝑚𝑖𝑛
0.000042 𝑚𝑀
Tubo 4: 15
= 0. 0000028 𝑚𝑖𝑛
0.000040 𝑚𝑀
Tubo 5: 15
= 0. 00000266 𝑚𝑖𝑛
Anotamos estos datos en la siguiente tabla:
Tabla 4. Resultados del experimento 5, en el que se observa la concentración
del sustrato, absorbancia del producto, concentración del producto y
velocidad de actividad enzimática. De la misma manera, calculamos la
inversa de la velocidad y concentración del sustrato Lineweaver-Burk y
determinamos los valores de Km y Vmax para la beta galactosidasa
empleando la ecuación de la recta.
[S] Abs [P] V = [P]/t 1/[S] 1/V
Conc. ONP Conc. (mM/min)
Sust Prod
ONPG ONP
(mM) (mM)
B 0 0.002 0 0 0 0
1 0.476 0.280 0.000016 0.00000106 2.100 943396.22
2 0.952 0.437 0.000026 0.00000173 1.050 578034.68
3 1.904 0.573 0.000034 0.00000226 0.525 442477.87
4 2.857 0.700 0.000042 0.00000280 0.350 357142.85
5 3.809 0.664 0.000040 0.00000266 0.262 381679.38
Graficamos según la ecuación de Michaelis-Menten entre la relación de
velocidad de actividad enzimática y concentración de sustrato.
Figura 3. Gráfico lineal que explica la relación de Actividad enzimática (V)
frente a Concentración de sustrato. Se ve en un inicio una relación directa
entre ambas variables pero luego este valor se va aproximando cada vez
más a un límite, que sería la velocidad máxima de actividad de la enzima. En
el caso de la enzima beta galactosidasa el valor máximo de Actividad
𝑚𝑀
enzimática que se registró fue de 0. 0000028 𝑚𝑖𝑛 ya a partir de ello, se satura
la enzima y los valores de velocidad ya no suben más, a pesar que se le
agregue más concentración de sustrato, se obtendrán valores iguales o muy
similares.
Ahora se elaborará la gráfica de Lineweaver-Burk y se determinarán los
valores de Km y Vmax.
1 𝐾𝑚 1 1
𝑉𝑜
= 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑥 [𝑆]
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥
L a forma inversa de la ecuación de Michaelis-Menten forma una ecuación de
la recta que emplearemos para calcular Km y Vmax:
𝑌 = 𝑚𝑋 + 𝑏
1
𝑌= 𝑉𝑜
𝐾𝑚
𝑚= 𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑋= [𝑠]
1
𝑏= 𝑉𝑚𝑎𝑥
Seguido de ello, la gráfica de Lineweaver-Burk.
Figura 4. Gráfica de de Lineweaver-Burk que refleja la velocidad en un
gráfico lineal, la línea roja expresa la inversa de la actividad enzimática (V), y
la línea gris refleja la tendencia de las gráficas con la ecuación de la recta.
Por la ecuación de la recta (316048*x + 269566) obtenemos que:
1
𝑏= 𝑉𝑚𝑎𝑥
1
269566 = 𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 269566
𝑚𝑀
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 0. 00000370 𝑚𝑖𝑛
𝐾𝑚
𝑚= 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
316048 = 0.00000370
𝐾𝑚 = 316048 𝑥 0. 00000370
𝐾𝑚 = 1. 169377𝑚𝑀
En conclusión, el valor Km de la enzima beta galactosidasa es de 1.169377
𝑚𝑀, que es el valor de concentración de sustrato que se necesita para llegar
a 1 ⁄ 2 de Vmax. De la misma manera la velocidad máxima de actividad
𝑚𝑀
enzimática es de 0.0000037 𝑚𝑖𝑛
Experiencia 6: Acción de un inhibidor
● a. Presente una tabla con los datos obtenidos con el simulador:
El presente trabajo fue realizado con la enzima 5. Los resultados del producto
formado por las dos enzimas son las siguientes:
Enzima A
Figura 5: La imagen presenta la cantidad de la formación de producto sin y
con presencia de inhibidor. Según la gráfica de Michaelis- Menten, se puede
observar, que pertenece a un IR competitivo, dado que el valor del Km
aumenta a medida que se alcanza la Vmax. Por otro lado, el Vmax se
mantiene constante.
Enzima B
Figura 5: La imagen presenta la cantidad de la formación de producto sin y
con presencia de inhibidor. Según la gráfica de Michaelis- Menten, se puede
observar, que pertenece a un IR no competitivo, dado que el valor del Km se
mantiene constante y el Vmax aumenta.
Tabla 5. Variación de producto formado con distintas concentraciones del
inhibidor A.
Tabla 6. Variación de producto formado con distintas concentraciones del
inhibidor B.
● b. Construya una gráfica de Lineweaver-Burk (eje Y = 1/V, eje X = 1/[S])
con las reacciones en presencia y en ausencia del inhibidor para
encontrar qué tipo de inhibidor es.
Enzima B
Para realizar la siguiente gráfica, trabajaremos con la concentración de
inhibidor de 125 mmol/L.
Tabla 7.Producto formado con distintas concentraciones de inhibidor, en este
caso graficamos la variación con 0.125 mM de concentración.
Concentración de 0.125
inhibidor Sin inhibidor mM 0.25 mM 0.5 mM 1mM
Tipo de Por cada subs Product Product Product Product Product
inhibidor 1000 mM o sin o 0.125 o 0.25 o 0.5 mM o 1 mM
mmol/L inhibidor mM mM
B 125 0 0.01 0.03 0.02 0.03 0.02
25 24.27 23.83 22.77 21.56 19.11
50 46.65 44.42 43.65 40.66 36.06
75 64.65 62.89 58.76 55.9 49.2
100 77.52 74.53 71.04 68.14 59.2
125 87.27 85.37 82.01 77.4 68.83
150 92.13 90.71 87.17 81.04 74.64
175 98.39 95.25 94.51 87.15 80.14
200 100.45 100.17 97.37 92.29 83.6
225 102.98 101.96 100.34 96.06 87.77
250 108.46 103.72 101.56 99.62 91.17
En base a la cantidad de producto formado, hallamos la 1/S y la 1/V de la
enzima actuando a determinada cantidad. Recordar que para hallar la
velocidad, se tiene que aplicar la siguiente fórmula: V=P/t.
Tabla 8. Inversa de la velocidad de actividad enzimática a distintas
concentraciones de inhibidor para poder realizar una gráfica de
Lineweaver-Burk.
SIN inhibidor CON inhibidor
1/S 0.125 1/V 1/V 1/V 1/V 1/V
Mm
1000.000 333.333 500.000 333.333 500.000
0.040 0.412 0.420 0.439 0.464 0.523
0.020 0.214 0.225 0.229 0.246 0.277
0.013 0.155 0.159 0.170 0.179 0.203
0.010 0.129 0.134 0.141 0.147 0.169
0.008 0.115 0.117 0.122 0.129 0.145
0.007 0.109 0.110 0.115 0.123 0.134
0.006 0.102 0.105 0.106 0.115 0.125
0.005 0.100 0.100 0.103 0.108 0.120
0.004 0.097 0.098 0.100 0.104 0.114
0.004 0.092 0.096 0.098 0.100 0.110
Figura 6. Gráfica de Lineweaver-Burk que emplearemos para definir el tipo de
inhibidor que simulamos.
● c. Interprete los resultados.
Los resultados hallados en la enzima B indican que se trata de un inhibidor
reversible (IR) no competitivo, porque a diferencia IR competitivo, en el IR no
competitivo no varía el Km; no obstante, se puede apreciar que su Vmax si
varía. Los IR no competitivos se caracterizan porque las enzimas que actúan
se unen a un sitio específico diferente al activo. La imagen permite hacer
énfasis en lo siguiente: Las rectas con o sin inhibidores interceptan en el eje x
(1/S), en el mismo punto, y de acuerdo a la ecuación de Michaelis- Menten,
ese punto equivale a -1/Km, por lo que se puede concluir que los inhibidores
no competitivos no afectan la Km de la enzima, es decir, no alteran la afinidad
de la enzima por el sustrato.
Conclusión:
- Con los datos de absorbancia, se calculó la concentración del producto
utilizando la ecuación de Lambert-Beer, y se determinó la velocidad de
actividad enzimática. Estos valores se registraron en una tabla y se utilizó la
ecuación de Lineweaver-Burk para construir una gráfica lineal que representa
la relación entre la velocidad y la concentración del sustrato. Ademas se hallo
la velocidad inicial de actividad enzimática, que fue de 0. 0000099 𝑛𝑀/𝑚𝑖𝑛.
- La gráfica de Lineweaver-Burk mostró una relación inversa entre la velocidad
y la concentración del sustrato, lo que permitió determinar los valores de Km y
Vmax. Mediante la ecuación de la recta obtenida a partir de la gráfica, se
calculó que Km, la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad
de la velocidad máxima, fue de 1.169377 mM. Además, se determinó que
Vmax, la velocidad máxima de actividad enzimática, fue de 0.0000037
mM/min.
III. CUESTIONARIO
● Utilice el siguiente link
http://biomodel.uah.es/metab/enzimas/graficas.htm para generar las
gráficas de Michaelis Menten, Gráfica de dobles recíprocos
(Lineweaver-Burk), Gráfica de Hanes y Woolf y también la Gráfica de
Eadie y Hofstee.
○ a) ¿Cómo varía cada una de las gráficas cuando se mantiene el valor
de la Vmax=20 μM min−1 y varía el Km cada 2 unidades desde 2mM
hasta 12mM. ? ¿Cómo interpreta los cambios en los gráficos cuando
altera el valor de Km?
■ En la gráfica de Michaelis-Menten, los valores del sustrato
permanecen estables, pues siempre llegan hasta casi el valor
de 30 al igual que la velocidad máxima y por ende el Km
también. Por lo tanto hay una menor afinidad del sustrato hacia
la enzima.
■ En la gráfica de Lineweaver-Burk, la velocidad de la reacción
aumenta constantemente hasta que las pendientes se acercan
al eje 1/V por lo que se aprecia un aumento en el Km mientras
que la velocidad máxima se ha visto ligeramente mermada y por
ende hay una disminución de la afinidad del sustrato a la
enzima.
■ En la gráfica de Hanes y Woolf se puede apreciar que el punto
de intersección de las líneas en el eje del sustrato no varían
mucho con la excepción de los casos de 2 y 10 mM mientras
que la velocidad máxima va en aumento por lo tanto hay una
mayor capacidad de la enzima para catalizar la reacción a una
velocidad mayor en condiciones saturantes de sustrato
■ En la gráfica de Eadie y Hofstee, la escala de la velocidad sobre
el sustrato (V/S) disminuye y de la misma manera la velocidad
máxima pero con menor notoriedad. Se puede notar que el
punto de intersección de las líneas en el eje de V se volvió
determinante en la recta debido al aumento del Km por lo que
hay una mayor afinidad en la enzima por el sustrato y
consecuentemente una mayor capacidad enzimática.
○ b) ¿Cómo varía cada una de las gráficas cuando se mantiene el valor
de la Km=12 mM y varía la Vmax cada 2 unidades desde 2 hasta 10
mM hasta 20mM? ¿Cómo interpreta los cambios en los gráficos
cuando altera el valor de Vmax?
■ Como se ve en la gráfica de Michaelis-Menten, la curva se
desplaza hacia el eje y por lo que la velocidad de la reacción es
alta a una determinada concentración de sustrato.
■ En la gráfica de Lineweaver-Burk se ve que la velocidad
máxima y el Km aumentan y descienden constantemente lo cual
refleja su capacidad para interactuar con el sustrato en
diferentes condiciones.
■ En la gráfica de Hanes y Woolf, la velocidad máxima ha
incrementado lo que obviamente revela que la reacción
enzimática está aumentando en velocidad hasta llegar a la
desnaturalización.
■ En la gráfica de Eadie y Hofstee, tanto la velocidad máxima
como el Km están en aumento por lo tanto la enzima analizada
una alta capacidad catalítica pero una baja afinidad por el
sustrato o que la enzima es incapaz de unirse eficientemente al
sustrato.
● Investigar cuál es rol de la enzima convertidora de angiotensina y cuál
es su relación con la COVID-19.
Existen dos y pertenecen al sistema renina angiotensina aldosterona (SAAR) el cual
estabiliza la presión arterial y las concentraciones de sales y líquidos. Primero está
la enzima convertidora angiotensina I (ACE) la cual descompone a la angiotensina I
(1-10), un decapéptido derivado del angiotensinógeno, en angiotensina II que se une
a dos receptores (AT1 y AT2) para ejercer sus efectos fisiológicos, los cuales
incluyen la secreción de aldosterona, la retención de sales y agua y la
vasoconstricción arteriolar. Después se encuentra la enzima convertidora
angiotensina II (ACE2) la cual es una metalopeptidasa de la membrana plasmática
que hidroliza a la angiotensina II, convirtiéndola en angiotensina 1-7 y que se
encarga del mantenimiento del equilibrio de los efectos proinflamatorios,
proliferativos, profibróticos, oxidantes y vasoconstrictores del sistema SAAR al
estimular a los receptores de ensamblaje mitocondrial (MAS). (Carrillo, 2021)
(Lamas-Barreiro et al., 2020)
La relación que se ha descubierto entre estas enzimas y la SARS-CoV-2 consiste en
que cuando el virus entra en las células pulmonares, los miocitos ventriculares u
otras células, la ACE2 funciona como su receptor fundamental debido a que tiene en
su región extracelular al dominio metalopeptidasa (PD) que interacciona con el
dominio RBD de la proteína espiga (SPIKE) del virus para posteriormente replicarse
por el sistema circulatorio y trasladarse a los órganos que tienen ACE2. (Figura 1).
Según las investigaciones, las personas con condiciones patológicas como diabetes,
hipertensión u obesidad tienen los niveles más altos de ACE2 lo que explica el por
qué estas personas son tan vulnerables a la COVID-19. (Carrillo, 2021) (Ramírez &
Flores-Soto et al., 2020)
Figura 1. Estructura de SARS-CoV-2 y su interacción con ACE2
● ¿Cuál es la importancia del Km en la actividad enzimática a nivel del
metabolismo celular?
Debido a que mide la afinidad de la enzima con el sustrato de la siguiente
manera: La enzima se une con más fuerza al sustrato por lo que se necesita
menos Km para alcanzar la velocidad de reacción. Por lo tanto, saber este
valor puede ayudar a predecir en células vivas si necesitan más enzimas o
más sustrato para acelerar la reacción celular. (Aguas-Herazo, et al.)
Referencias bibliográficas
Aguas-Herazo, K., Chamorro-Martínez, Y., Leguía-Lozano, L., Luna-Serpa,
O., Muñoz-Geney, I., & Rojas-Méndez, Á. Determinación y evaluación de la
actividad enzimática y parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten
(Vmax y Km) para alfa-amilasa (EC 3.2. 1.1) en hidrolisis de almidón.
Carrillo, C. J. A. (2021). La enzima convertidora de angiotensina 2 en
hipertensión, diabetes y obesidad, y su participación en la vulnerabilidad ante
el virus SARS-COV-2. Revista de Educación Bioquímica, 39(4), 121-130.
Lamas-Barreiro, J. M., Alonso-Suárez, M., Fernández-Martín, J. J., &
Saavedra-Alonso, J. A. (2020). Supresión de angiotensina II en la infección
por el virus SARS-CoV-2: una propuesta terapéutica. nefrologia, 40(3), 213.
Ramírez, L. M. M., & Flores-Soto, E. (2020). COVID-19 y su asociación con
los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y los antagonistas
de los receptores para angiotensina II. Revista de la Facultad de Medicina
UNAM, 63(4), 30-34.
