Determinación de la capacidad antioxidante de
un alimento mediante el método 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH)
Apellidos, nombre
3B Cervera Chiner, Lourdes ([email protected])
4B
Ortolá, Ortolá, María Dolores (
[email protected])
Departamento
1B Departamento de Tecnología de Alimentos
5B
Centro
2B Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del
0B
Medio Natural (ETSIAMN)
Universitat Politècnica de València
Resumen de las ideas clave
El análisis de la capacidad antioxidante (CA) de un alimento es de interés para conocer sus
propiedades beneficiosas para la salud en cuanto a la protección frente a los radicales libres y,
con ello, la prevención de numerosas enfermedades asociadas a éstos como el cáncer,
enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Especialmente, las frutas y hortalizas
son ricas en compuestos antioxidantes. Existen diferentes métodos para determinar la
capacidad antioxidante de un alimento, basados en diversos principios. En este artículo docente
se expone el método DPPH, que es un método espectrofotométrico, basado en la reacción de
reducción del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), que cambia de color violeta a amarillo,
en presencia de compuestos antioxidantes presentes en la muestra. Este cambio de color se
determina espectrofotométricamente a 515 nm y es proporcional a la capacidad antioxidante
de la muestra. La cuantificación de la capacidad antioxidante del alimento se determina
realizando una recta de calibración con un antioxidante de referencia, en este caso el Trolox,
para poder expresar los resultados como mg de Trolox equivalente por gramo de muestra.
Objetivos
Con este objeto de aprendizaje se pretende que el estudiantado sea capaz de:
- Aplicar el método de DPPH para determinar la capacidad antioxidante (CA) de un alimento.
- Realizar una recta de calibración con Trolox para expresar los resultados como capacidad
antioxidante equivalente de Trolox (TEAC).
Introducción
Algunos alimentos como las frutas y hortalizas poseen distintos compuestos bioactivos, entre
los que destacan los antioxidantes, compuestos de distinta naturaleza química, como pueden
ser las vitaminas C y E, polifenoles, carotenoides y terpenoides, entre otros. Los antioxidantes
son considerados moléculas que ayudan a prevenir la oxidación de moléculas producidas por
radicales libres.
Un radical libre es cualquier especie química capaz de existir de forma independiente y que
presenta uno o más electrones desapareados en su estructura. Esto hace que sean muy
inestables y altamente reactivos teniendo una vida media del orden de milisegundos (Halliwell,
1992). Los radicales libres también son conocidos como especies reactivas del oxígeno (ROS, del
inglés reactive oxygen species) y especies reactivas del nitrógeno (RNS). Los radicales libres son
responsables del daño oxidativo de macromoléculas biológicas como el ADN, lípidos,
carbohidratos y proteínas, lo que puede causar algunos tipos de cáncer, diabetes,
enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas (Saavedra et al., 2010).
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Pero, ¿cómo podemos evitar qué los radicales libres nos afecten a nuestra salud? Numerosos
estudios han relacionado la ingesta de antioxidantes con la prevención de diferentes
enfermedades cardiovasculares, neurológicas, inflamatorias y con la prevención del cáncer
(Riccioni et al., 2007; Stanner et al., 2004). Puesto que algunos alimentos pueden tener actividad
antioxidante su medición supone la cuantificación de todas las moléculas antioxidantes
presentes en este. También es importante destacar que como la capacidad antioxidante total
de una muestra viene determinada por interacciones sinérgicas entre diferentes compuestos,
así como por el modo de acción concreto de cada uno de ellos, es necesario combinar más de
un método para evaluar de manera correcta la capacidad antioxidante de una muestra.
Pero, realmente ¿qué se mide cuando se determina la actividad antioxidante de un
alimento?. Los métodos para determinar la CA se basan en comprobar cómo un agente
oxidante induce daño oxidativo a un sustrato oxidable, daño que es inhibido o reducido en
presencia de un antioxidante.
En general, los métodos para determinar la capacidad antioxidante o antirradical se dividen en
dos grandes grupos:
-Ensayos basados en las reacciones de transferencia de electrones (SET: single electron
transfer), que se traducen en un cambio de color a medida que el compuesto oxidante es
reducido. Dentro de este grupo se encuentran los ensayos de capacidad antioxidante TEAC
(Trolox Equivalent Antioxidante Capacity), FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma), DPPH y
capacidad de reducción del cobre (II).
-Ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrogeno (HAT: hydrogen atom transfer)
que miden la actividad de los compuestos antioxidantes para neutralizar radicales peroxilo
(Huang, Ou & Prior, 2005). Dentro de este grupo se encuentran los ensayos ORAC (oxygen
radical absorbance capacity), TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) y de inhibición
de la oxidación del ácido linoénico (Huang et al., 2005).
Desarrollo
1.1. Fundamento del método
El método de eliminación del radical 2,2-Difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), descrito por Brand-
Williams (1995) es uno de los ensayos más comunes y sencillos para evaluar la capacidad
antioxidante total de compuestos o extractos. El DPPH es un radical cromógeno estable de color
violeta. El método se basa en la donación de electrones por parte de los antioxidantes para
neutralizar el radical DPPH.
Cuando el DPPH entra en contacto con un compuesto antioxidante (una molécula donadora de
hidrógenos o electrones), el radical DPPH pierde su coloración violeta, pasando a una forma
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amarilla o incolora (DPPH-H). Esta inhibición es proporcional a la actividad antioxidante del
compuesto o de la muestra (Figura 1).
Figura 1. Reacción de reducción de la molécula de DPPH en presencia de antioxidantes (Fuente: BioValor, 2023)
Los resultados de este método pueden expresarse de muchas maneras; bien como el
porcentaje de inhibición de la muestra o empleando un estándar antioxidante, como es el
Trolox.
1.2. Material y reactivos
Material e instrumentación:
Espectrofotómetro UV-Visible.
Cubetas de plástico de 4 mL para espectrofotometría visible.
Balanza analítica
Centrífuga
Tubos FalconTM de 15 mL
Agitador de tubos (vórtex)
Agitador magnético
Homogeneizador de alimentos Ultra Turrax
Matraces aforados de 10 mL, 25 mL y 100 mL.
Vasos de precipitados de 25 mL y 50 mL
Pipetas de 1 mL y 5 mL
Tubos eppendorfs de 1,5 mL
Reactivos:
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
Metanol
Agua destilada
Trolox
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1.3. Procedimiento experimental
Preparación de los patrones de Trolox:
Realizaremos una recta de calibrado con concentraciones de Trolox comprendidas entre 750 y
25 µM. La curva Trolox se tiene que hacer con el mismo disolvente con el que se extraen las
muestras, en este caso metanol 80%.
En primer lugar, prepararemos una disolución concentrada de Trolox (disolución madre) de 5
mM. Para ello, se pesarán 12,5 mg de Trolox y se llevarán a 10 mL con metanol al 80% en un
matraz aforado de 10 mL. A continuación, se preparará la disolución de trabajo, que tendrá una
concentración de 1mM. Para ello, se tomarán 2 mL de la disolución madre y se llevarán a un
matraz de 10 mL con metanol al 80%, tal y como se muestra en la Figura 2. Seguidamente, se
prepararán los patrones de la curva de calibración colocando los volúmenes indicados en la
Figura 2 de metanol al 80% y de la disolución de trabajo de Trolox, en tubos Eppendorf de 1,5
mL. A continuación, se agitarán en vórtex y estarán listos para aplicarles el protocolo de DPPH
para medir su capacidad antioxidante.
Figura 2. Preparación de los patrones de Trolox para la recta de calibración.
Preparación del extracto de la muestra:
Se pesará en tubo Falcon 1 g del alimento del que queremos determinar la capacidad
antioxidante. A continuación, le añadiremos 10 mL de una disolución Metanol:Agua, 80:20 (v/v).
Luego, homogenizaremos la muestra en el Ultra Turrax durante 1 minuto, agitaremos la mezcla
en vórtex durante otro minuto. Seguidamente, centrifugaremos a 10.000 rpm durante 10
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minutos. El sobrenadante obtenido será el extracto de nuestra muestra, que posteriormente,
analizaremos.
Protocolo DPPH:
En primer lugar, preparemos una disolución de DPPH con una concentración de 0,025 mg/mL.
Para ello, pesaremos 2,5 mg de DPPH en un vaso de precipitados de 25 mL y añadiremos 10 mL
de metanol al 80%. Posteriormente, agitaremos la mezcla con un agitador magnético durante
10 minutos en oscuridad. Cubriremos el vaso de precipitados con Parafilm para evitar que se
evapore el metanol y también con papel de aluminio para mantenerlo en oscuridad. Una vez se
haya disuelto todo el DPPH se verterá a un matraz y se enrasará hasta 100 mL con metanol
80%, que también cubriremos con papel de aluminio para que no le dé la luz.
A continuación, procederemos a realizar el protocolo DPPH:
1º) Colocar 2,9 mL de la de la disolución de DPPH, que hemos preparado anteriormente, en una
cubeta y medir su absorbancia a 515 nm en el espectrofotómetro. Esta será la absorbancia
control (Abs control)
2º) Colocar 100 µL de extracto de la muestra o de los patrones de Trolox en cubetas
espectrofotométricas, añadir 2,9 mL de la disolución de DPPH y leer la absorbancia de las
cubetas a 515 nm en el espectrofotómetro transcurridos 30 minutos en oscuridad. Esta será la
absorbancia de la muestra (Abs muestra)
En la Figura 3 se puede observar el cambio de color que se produce en el DPPH de morado a
amarillo tras su inhibición por la acción de los antioxidantes.
Figura 3. Cubetas espectrofotométricas con patrones de Trolox tras aplicar el método de DPPH.
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1.4. Cuantificación e interpretación de los resultados
Una vez hayamos medido la absorbancia del control, de nuestra muestra y de los patrones de
Trolox, calcularemos el porcentaje de inhibición de cada uno de ellos con ecuación 1:
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 − 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
% 𝑖𝑖𝑖𝑖ℎ𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖ó𝑛𝑛 𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷 = 𝑥𝑥 100
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
Ecuación 1. Cálculo del porcentaje de inhibición del DPPH.
A continuación, se representará la recta de calibrado de Trolox como se muestra en la Figura 4,
colocando en el eje de ordenadas el % de inhibición y en el eje de abcisas la concentración de
Trolox.
Figura 4. Recta de calibrado de Trolox.
Esta recta de calibrado nos permitirá expresar los resultados de nuestra muestra en
equivalentes de Trolox, ya que nos relaciona el % de inhibición (Y) con la concentración de
Trolox (X). Por lo tanto, introduciendo en la ecuación el % de inhibición y despejando la X de la
ecuación, obtendremos la concentración de Trolox equivalente.
Veámoslo con un ejemplo: si nuestra muestra nos ha dado un valor de 55% de inhibición,
despejando la X, obtendríamos lo siguiente: X=(55+0,3914)/90,368=0,613 mM Trolox.
Ahora expresamos esta concentración como mg Trolox/L utilizando la masa molecular del
Trolox que es 250.29 g/mol:
0,613 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 1 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 250,29 𝑔𝑔 1000 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇
0,613 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 = 𝑥𝑥 𝑥𝑥 𝑥𝑥 = 153,4
𝐿𝐿 1000 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 1 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 1 𝑔𝑔 𝐿𝐿
Para poder expresar los resultados en mg de Trolox por gramo de muestra, hemos de tener en
cuenta la cantidad de disolvente empleado en la extracción y la cantidad de muestra que hemos
tomado para realizar el análisis.
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Por lo tanto, habrá que multiplicar por los litros de disolvente que hemos utilizado para hacer la
extracción y dividiremos entre los gramos de muestra que tomamos. En nuestro caso fueron 1
g de muestra y se emplearon 10 mL de metanol en la extracción, lo que es igual a 0,01 Litros.
153,4 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 0,01 𝐿𝐿 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇
𝑥𝑥 = 1,534
𝐿𝐿 1 𝑔𝑔 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑔𝑔 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
Por lo tanto, ya tendríamos nuestro resultado expresado como mg de Trolox equivalente por
gramo de muestra.
Cierre
En este objeto de aprendizaje se ha descrito el fundamento y la metodología para la
determinación de la capacidad antioxidante de un alimento por el método de reducción del
radical libre DPPH. También, se ha descrito el procedimiento para realizar una curva de
calibración de un antioxidante de referencia (Trolox) y cómo expresar los resultados como mg
de trolox equivalente por gramo de muestra.
Bibliografía
Biovalor (2023). Más métodos para evaluar la capacidad antioxidante de las especies Biovalor.
[en línea. Fecha de consulta: 29-4-25]. https://biovalor.es/node/33.
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evaluate antioxidant activity. LWT-Food science and Technology, 28(1), 25-30.
Halliwell, B. (1992). Reactive oxygen species and the central nervous system. Journal of
neurochemistry, 59(5), 1609-1623.
Stanner, S. A., Hughes, J., Kelly, C. N. M., & Buttriss, J. (2004). A review of the epidemiological
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Riccioni, G., Bucciarelli, T., Mancini, B., Di Ilio, C., Capra, V., & D’Orazio, N. (2007). The role of the
antioxidant vitamin supplementation in the prevention of cardiovascular diseases. Expert
Opinion on Investigational Drugs, 16(1), 25-32.
Saavedra, O. M., Vázquez, E. N. J., Vargas, M. R. B. G., & Reyes, G. M. C. (2010). Radicales libres y
su papel en las enfermedades crónico-degenerativas. Revista Médica de la Universidad
Veracruzana, 10(2), 32-39.
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