Curso: Biologa Celular y Molecular
Oscar Nolasco Crdenas MSc.
[email protected]Noviembre 2012
DNA - historia
1866 Gregor Mendel Publico sus resultados sobre los factores de la herencia.
1868 descubrimiento de la nucleina (DNA) Friedrich Miescher
1902 Walter Sutton Interrelaciona la citologa y el Mendelismo (morfologa & herencia). Cromosomas son unidades hereditarias. Esta teora tambin fue desarrollada por Theodor Boveri
1928 Fred Griffith Propuso la existencia de un principio transformante en sus ensayos con diplococos.
1944 Oswald Avery,Colin MacLeod,Maclyn McCarty. Reportaron que el principio transformante de Griffith era el DNA.
Oswald Avery Colin McLeod
Neumococos R vivos inoculados junto con neumococos S inactivados por calor producan la muerte del ratn
Maclyn McCarty
live S strain
1950 Erwin Chargaff Determino que los organismos vivos presentan una razon constante entre Adeninas con Timinas y Guaninas con Citocinas.
1951 Rosalind Franklin Obtuvo las fotografias de difraccion de rayos X del DNA
Rosalind Franklin
Maurice Wilkins
1952 Martha Chase y Alfred Hershey empleando bacteriofagos marcados con 35S y 32P demostraron que el DNA es una molcula hereditaria
1953 Francis Crick y James Watson resolvieron la estructura tridimensional del DNA.
1958 Matthew Meselson y Frank Stahl empleando isotopos demostraron la propiedad semiconservativa de la replicacin del DNA.
1958 Arthur Kornberg Purifico la DNA polimerasa I de E. coli, La primera enzima que sintetisa DNA en un tubo de ensayo 1966 Marshall Nirenberg, H. Gobind Khorana Led descifran el cdigo gentico determinan que los codones (tripletes de nucleotidos de mRNA) son especficos para un aminocido. 1970 Hamilton Smith Kent Wilcox Aislo la primera enzima de restriccin, HindII: que corta el DNA en un sitio de reconocimiento especifico. 1977 Fred Sanger Desarrolla el mtodo del nucleotido terminador para el secuenciamiento de DNA. 1978 Somatostatin es la primera hormona humana en producirse por la tecnologia del DNA recombinante. 1983 Kary B. Mullis Propuso el mtodo de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar DNA 1988 - 2003 Se desarrolla el proyecto genoma Humano 2007 DNA de J Watson secuenciado en 2 meses 454 Life sciences (ROCHE)
EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
DNA
.
Replicacin
CCTGAGCCAACTATTGATGAA
transcripcin Reversa RNA CCUGAGCCAACUAUUGAUGAA traduccin Protena
PEPTIDE
Acido Nuclico: polmero de nucletidos
Componentes de un nucletido:
base N + pentosa + fosfato
Componentes de un nuclesido:
base N + pentosa
Azcares de los cidos nuclicos
DNA
Bases nitrogenadas de los cidos nuclicos
RNA
(DNA)
(RNA)
Nomenclatura de nucletidos y nuclesidos BASE Purinas Adenina Adenosina Desoxiadenosina Guanina Guanosina Desoxiguanosina Adenilato RNA Nuclesido Nucletido Acido nucleico
Desoxiadenilato DNA Guanilato RNA
Desoxiguanilato DNA
Pirimidinas
Citocina Timina Uracilo Citidina Deoxicitidina Timidina o deoxitimidina Uridina Citidilato Deoxicitidilato Timidilato o deoxitimidilato Uridilato DNA DNA DNA RNA
Caractersticas de los Nucletidos
Las bases nitrogenadas se unen al azcar por enlace B glucosidico
Los nucletidos en el DNA se unen mediante enlace fosfodiester
Apareamiento de bases en el DNA: Puentes de hidrogeno
A
C
T
G
DNA: Dos hebras antiparalelas forman la doble hlice de DNA
A Vista del enlace de las bases B Vista de inicio a fin de las cadenas
Formas de DNA
Forma A
Forma B
Forma Z
Sentido de la helice Diametro Bases por torcion
Hacia la derecha aprox 26 11
Hacia la derecha aprox 20 10.5 3.4
Hacia la izquierda aprox 18 12 3.7
Distancia entre pares de bases 2.6
La forma B es referida a la de Watson Crick Z alternancia de G y C, presente como segmentos en eucariotes y procariotes, con funcion quizas regulatoria de expresin
El DNA puede disociarse o asociarse por la complementaridad de su secuencia nucleotidica: Denaturacin reversible del DNA
La renaturacin permite hacer anlisis de hibridacin cuando se mezclan dos hebras de DNA que comparten cierto grado de similaridad en su secuencia
La denaturacin esta relacionada al % de GC.
Organismos que presentan mayor % de GC en su secuencia genmica soportan temperaturas altas
Una secuencia con mayor % de GC presentara un tm mayor que una secuencia con alto contenido de AT (El tm es la Temperatura media de Melting o de disociacin en el que la denaturacion de las hebras de ADN es del 50%)
Debido a las bases nitrogenadas el DNA absorbe luz ultravioleta. El efecto denominado hipercromicidad se da al denaturar el DNA, as las bases estn expuestas y puede absorber mayor cantidad de luz ultravioleta
Replicacin de DNA
Replicacin del DNA segn Watson y Crick
La replicacin
Ocurre en un origen de replicacin nico en DNA circulares (plasmidos)
En eucariotes es complejo y se da en varios origenes de replicacin
La sntesis de la nueva hebra es en sentido 5
a 3
La sntesis de DNA en E. coli, Empieza con la unin de protenas dnaA a la secuencia de origen (ori)
Secuencia Ori 5 3
3 5
Unin de protenas de dnaA
La regin rica en A T es denaturada y hexameros de DnaB (helicasa) se unen al DNA en colaboracin con DnaA
Iniciacin de la sntesis de DNA en E. coli origen (ori)
Secuencia Ori
5 3
A A
3 5
Unin de protenas dnaA
A A
A
Induccin de la denaturacin del DNA por las protenas de dnaA
Las protenas dnaB y dnaC se unen al single-stranded DN
A
A A
A
A
B C
dnaB desenrrolla el DNA
Se une la dnaG (primase)
A
A A
B C
A
dnaB desenrrolla las hlices, desplazando a las dnaA
A
A A
...y se sintetiza un cebador RNA primer
A
A A
B C
RNA primer
G B C
Primasoma dna B (helicasa) dna C dna G (primasa)
DNA molde (template strand) 3 3 OH 5 RNA primer (~5 nucleotidos)
DNA girasa es una topoisomerasa II, que rompe el DNA e introduce
superocoil negativo a la cabeza de la horquilla de replicacin Fluoroquinolona inhibe DNA girasas en muchas bacteras gram-negativas: ciprofloxacina y levofloxacina (Levaquin)
Telomeros y edad
Metaphase chromosome
Telomeros son capuchones protectivoscaps sobre el extremo de los cromosomas y consisten de repeticiones cortas en tandem de 5-8 bp de una secuencia rica en GC, Previenen desde fusiones Cromosomas y rearreglos del kariotipo.
telomero
centromero
telomero <1 to >12 kb (TTAGGG)muchos Edad joven
telomero estructura
(TTAGGG)poco
Edad senil
telomerasa (una enzima) requerida para mantener la longitud de las clulas germinales La mayora de las clulas somaticas disminuye el nivel de la actividad de la telomerasaevels of telomerase y asi sus cromosomas se acortan en cada divisin
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Mecanismo de duplicacin en el DNA mitocondrial
La duplicacion se inicia en el loop D
Duplicacin en el proceso de conjugacin bacteriana. Transferencia del pili F (plasmido sexual)
Organizacin comn de las DNA polimerasa
Los nucletidos adicionados son nucletidos trifosfatos
El mecanismo involucra iones Mg que coordinan con el grupo fosfato y tres residuos Asp de La enzima DNA polimerasa
Las enzimas polimeras tienen un mecanismo de relectura o de proofreading (actividad exonucleasa 3 a 5) Evita la mala incorporacin de un nucleotido La DNA polimerasa controla la fidelidad de la replicacin
Sistemas de reparacin corrigen el dao en el DNA
El sistema de excision de nucleotido NER repara los daos provocados por radiacin ultravioleta: Puede ocurrir la reparacin en forma global o acoplada a la transcripcin
El sistema de reparacin excision de base BER, repara daos de deaminacion o rupturas en una sola cadena
El sistema de reparacin por recombinacin homologa HR y de unin de extremos EJ, reparan la ruptura de las cadenas de DNA
Sistema de reparacin de una mala incorporacin o mal apareamiento MMR
Cambios tautomricos durante la replicacin
Cromosomas
El DNA es altamente comprimido en todos los tipos de genomas
En el bacteriofago
En bacterias
En mamiferos
Los cromosomas estn divididos en distintas regiones. Un bandeo caracterstico se da por facilidad de coloracin de algunas regiones, se desconoce el porque solo se conoce que las regiones decoloradas contienen mas cantidad de GC
En eucariotas, el DNA se encuentra empaquetado con proteinas histonas dentro de la cromatina. Las unidades bsicas de la cromatina son los nucleosomas.
Organizacin del DNA en el cromosoma
Estructura de los nucleosomas
Nucleosoma
146 pb de DNA alrededor de 8 molculas de histonas Cinco tipos de histonas 2 x (H2A, H2B, H3, H4) forman el ncleo octamrico H1 interacciona con el DNA conector y delimita al nucleosoma 2 vueltas adicionales de DNA 200pb
Modificaciones covalentes de las histonas regulan la funcionalidad del DNA
Los eventos epigenticos son aquellas variaciones en la expresin de un gen que no se acompaan de cambios en la secuencia de DNA. Las cadenas laterales de las histonas sufren modificaciones. Modificaciones postraduccionales: Acetilacin Fosforilacin Metilacin(ms estable) Otras
HISTONAS
Acetilacin de histonas
Se produce en residuos de lisina y es reversible. Las histonas acetiladas estn asociadas a la cromatina transcripcionalmente activa y las histonas desacetiladas a la cromatina inactiva. La acetilacin neutraliza la carga positiva de las lisinas.
HATs
Histona acetiltransferasas. Estas modificaciones ocurren en el extremo amino terminal de las histonas. La primera familia de las HATs es la superfamilia GNAT, que incluye las protenas que envuelven, unen e inician la transcripcin como la Gcn5 y PCAF, elongacin como Elp3.
HDACs
Estn asociados a complejos proteicos. Se han encontrado deacetilasas en subunidades de complejos polipeptdicos que actan como correpresores y silenciadores de genes. La Rpd3 y Hda1eliminan grupos acetil crticos de las histonas, empaquetando la cromatina en una forma inactiva (heterocromatina).
La formacin de la heterocromatina es mediado por protenas Sir2, Sir3 y Sir4, estudios recientes han encontrado que Sir2 presentan un Nad dependiente de la actividad HDAC. Tambin se ha visto que la desacetilacin de la lisina 16 de H4 es importante para la interaccin de Sir3 y Sir4.
Metilacion de Histonas
Es uno de los mecanismos de regulacin que pta diversas funciones asociadas a la activacin o a la represin de un gen.
HMTs
