Medios de cultivo en
microbiología
Índice
1. Los medios de cultivo en microbiología.
2. Condiciones generales para el cultivo de microorganismos.
3. Tipos básicos de medios de cultivo.
4. Preparación de medios de cultivo
5. Siembra en medios de cultivo
1. Los medios de cultivo en microbiología
Uno de los sistemas más importantes para la
identificación de microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales
preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos
es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
más de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares
en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene
efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en él
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis,
etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar,
por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en
pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram
positivas).
2. Condiciones generales para el
cultivo de microorganismos
1- disponibilidad de nutrientes adecuados
2- consistencia adecuada del medio
3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
4- condiciones adecuadas de humedad
5- Luz ambiental
6- pH
7- Temperatura
8- Esterilidad del medio
1- Disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de
contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas.
En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras
del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para
ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que
tengan lugar.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es
utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos
colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por
sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2- Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios
en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el
gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan
adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este
solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los
medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero
hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente
extendido en el laboratorio.
3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de
oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto
intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones
atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse
a cualquiera de las citadas condiciones.
4- Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando
una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad
que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el
caso de los microorganismos fotosintéticos.
6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento
de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios
con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos.
No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no
impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso
alterar sus procesos metabólicos normales.
7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre
15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o
incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los
patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos,
alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para
evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o
incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los
especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para
esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de
agua a presión como agente esterilizante)
4. Tipos básicos de medios de cultivo
ATENDIENDO A SU ESTADO FÍSICO:
Medios de cultivo: Sólido y Líquido
La forma más sencilla de clasificar los medios de cultivo es por su
consistencia…entonces aparecen los medios de cultivo sólidos y los medios de
cultivo líquidos o también llamados caldos. En ambos medios debe haber una
buena cantidad de nutrientes que faciliten el crecimiento bacteriano… y
entonces cual es la diferencia?….pues la diferencia radica en la presencia de
una sustancia que se llama Agar o “Agar-Agar”
La ventaja fundamental de usar un medio de cultivo líquido, es que permite
que crezcan bacterias que se encuentran en muy poca cantidad, es decir, cuya
concentración es muy baja en la muestra que estemos analizando.
Para el caso del medio de cultivo sólido, la ventaja radica en que permite
detectar los diferentes tipos de bacterias que puedan encontrarse en una sola
muestra..….entonces el usar uno u otro medio de cultivo dependerá de lo
que busquemos o queramos: aislar una bacteria que se encuentre en
cantidades muy pequeñas (medio líquido) o todas las bacterias que
puedan haber en una muestra (medio sólido)
Medios semisólidos
Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente
solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos.
Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias.
SEGÚN SU UTILIZACIÓN:
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que
pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos
especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común,
que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este
grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por
adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis,
etc.) que aportan dichos factores. El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y
cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada
adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de
ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento
de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una
población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo
selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el
del resto de enterobacterias.
4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo
impiden el desarrollo de una población microbiana, se denomina inhibidor.
Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más
restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen
habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra
que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un
medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes
Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia característica
diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un
sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un
medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la
lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa
+/lactosa hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc
6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad
específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un
microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para
asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya
a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler,
el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido
un elemento diferencial de un microorganismo
7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un
microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la
industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-
infusión cerebro-corazón (BHI), es medios.
8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos
interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y
reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las
cepas de tres formas:
a) haciendo pases periódicos de placa a placa,
b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden
sembrarse inmediatamente. Suutilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se
obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de
este grupo los medios de Stuart Amies,Cary-Blair, etc
SEGÚN SU ORIGEN:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias
naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o
infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición
química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS: son los sintéticos a los que se les añaden
factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico
complejo, como por ejemplo extracto de levadura
PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO
SIEMBRA EN MEDIOS DE
CULTIVO
Siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo)
en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su
desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a
una temperatura adecuada para el crecimiento. Las reglas fundamentales para
efectuar la siembra exigen:
Que se efectúen asépticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los
requerimientos del microorganismo a estudiar.
Técnicas de cultivo en placa:
Técnica de siembra por estría en placa
Técnicas de siembra (tubo)
Siembra por inoculación o agitación:
Con un asa bacteriológica, esterilizada, se toma cantidad
de inoculo, se intorduce en el centro del medio liquido,
agitándose, no tocando la pared del tubo.
Siembra por estría ( en tubos de agar inclinado):
Muestra de material en asa de siembra, deslizar en
zigzag, empezar por superficie mas profunda
Siembra por picadura:
Asa recta, tomar la muestra, sembrar en agar semisólido,
en el tubo de ensayo hasta que la muestra quede bien
impregnada al agar.
