TECHNIQUES EN BIOLOGIE
GENERALE 8
Vanessa Arfi
1
Les virus :
Généralités
Un virus :
• ne se voit pas,
• ne se cultive pas,
• n’est pas retenu par le filtre Chamberland.
Organisme acellulaire simple.
Parasite intracellulaire obligatoire.
C’est donc une entité biologique qui nécessite une cellule hôte
(animale, végétale, bactérienne), dont il utilise les constituants
pour se multiplier (ribosomes, mitochondries…).
2
Les virus :
Généralités
Les virus existent sous une forme :
• intracellulaire : ce sont des éléments génétiques qui se
répliquent en utilisant le matériel génétique de la cellule hôte
(chromosome).
• extracellulaire : ce sont des objets particulaires, infectieux,
constitués au minimum d'un acide nucléique et de protéines.
3
Les virus :
Généralités
non visible au microscope optique
==> microscopie électronique
10 à 400 nm
Eléments obligatoires :
• nucléocapside = acide
nucléique (ADN ou ARN) +
capside
Eléments facultatifs :
• enveloppe
4
Les virus :
Généralités
enveloppés
complexes
hélicoïdales 5
icosaédriques
Les virus :
Généralités
Rôle des différents éléments composant un virus :
• Capside : protège le génome viral et porte les déterminants
nécessaires à la fixation du virus aux récepteurs cellulaires
dans le cas de virus nus
• Enveloppe : double couche lipidique qui supportent les
déterminants qui reconnaissent les récepteurs cellulaires
• Génome : code pour toutes les protéines virales qui vont
participer à la réplication du virus dans la cellule hôte
• Déterminants : protéine virale qui reconnaît un récepteur
cellulaire spécifique 6
Les virus :
Généralités
La multiplication des virus :
• Principales étapes utilisées lors de
la multiplication des virus dans une
cellules hôte
7
Production de virus
Soit sur des cellules en culture in vitro
Soit sur des cellules d’œufs embryonnés de 5 à 10 jours (œufs
fécondés)
Soit sur des cellules d’un animal entier et vivant
8
Production de virus
Sur cellules en culture :
• Infecter in vitro des cellules permissives au virus à une
certaine MOI (titre) calculée préalablement (variable)
• Récolter le surnageant après un temps d’infection (variable en
fonction des virus)
• Purifier les particules virales
• Congeler
• Titrer le virus
9
Production de virus
Formation de plages de lyse (zones localisées de lyse cellulaire) ou
effets cytopathiques (anomalies cellulaires).
Intérêt :
• Aucun recours à l’animal
• Facilité de mise en œuvre 10
Production de virus
Sur des cellules d’œufs :
• Infecter des œufs contenant des embryons de poulet
Des œufs fécondés de dix jours sont 11
inoculés avec des virus.
Production de virus
Sur des cellules d’un animal vivant :
• Utilisé si virus incultivables par les deux autres méthodes
Animaux utilisés :
• Chimpanzé
• Lapin
• Génisse (virus de la vaccine)
12
Production de virus Influenza
En cellules En œufs
Cellules MDCK
Infection : Utilisation d’un milieu dépourvu de
sérum + ajout de trypsine (favorise
l’attachement des particules virales)
Incubation des cellules pendant 1h sous
agitation (utilisation d’un milieu minimal,
recouvre seulement les cellules)
Ajouter du milieu frais dépourvu en sérum
Incuber à 37°C sous 5% d’O2 pendant le temps
nécessaire (variable selon les virus)
Récupération des surnageants et congélation
13
Titration
Purification de virus
Il existe cinq méthodologies principales :
• Centrifugation différentielle
• Centrifugation en gradient de densité
• Précipitation des virus
• Dénaturation des contaminants
• Digestion enzymatique des contaminants
14
Purification de virus
Centrifugation différentielle
Méthode la plus simple : une
suspension contenant des particules
virales est soumise par rotation à
une force centrifuge.
Suivant la force et le temps de
centrifugation, on peut clarifier une
suspension virale de ses débris
cellulaires laissant le virus en
suspension (10 000 x g, 15 min) ou
encore déposer au culot le virus
(100 000 x g, 60 min).
Obtention d’un virus semi-purifié
Toutefois, la sédimentation au culot des virus peut entraîner leur
15
inactivation, spécialement les virus enveloppés.
Purification de virus
Ultracentrifugation
Il est alors recommandé d'utiliser un coussin d'une solution plus
dense que le virus (chlorure de césium, saccharose, tartrate de
potassium… ) => gradient de densité à l’équilibre
La particule virale va flotter sur le coussin, l'empêchant d'être
écrasée et inactivée au fond du tube
Quand les virus n’atteignent pas la densité de flottaison :
centrifugation zonale.
Lorsque les virus atteignent leur densité de flottaison :
centrifugation isopycnique.
16
Purification de virus
Ultracentrifugation
Permet la séparation virus-impuretés
par propriétés physiques
Virus
Obtention d’un virus très purifié
17
Purification de virus
Précipitation
Par du polyéthylène-glycol et du sulfate d'ammonium
Utilisation d’une concentration juste inférieure à celle qui
précipitera les virus.
On enlève alors les contaminants qui sont précipités puis on ajoute
plus de composé précipitant (sulfate d’ammonium par exemple) et
on recueille les virus précipités par centrifugation
18
Purification de virus
Dénaturation des contaminants
Comme les virus sont généralement moins facilement dénaturés
que beaucoup de constituants cellulaires, on peut également
dénaturer les contaminants à l’aide de :
• chaleur,
• changement de pH,
• utilisation de solvants organiques (chloroforme...).
19
Purification de virus
Digestion enzymatique des
contaminants
Des enzymes (protéases et nucléases) peuvent être utilisées pour
dégrader les protéines et les acides nucléiques cellulaires car les
virus sont généralement plus résistants à ces enzymes.
La ribonucléase et la trypsine, par exemple, dégradent les acides
ribonucléiques et les protéines cellulaires tout en laissant souvent
les virions intacts.
20
Titrage des virus
Utilisé pour déterminer le nombre de virus présents dans un
échantillon.
Deux approches sont utilisées :
• Comptage direct des particules virales capables d’infecter des
cellules permissives.
• Indirectement par dénombrement des unités infectieuses. On
a apparition d’effets cytopathologiques (formation de syncytia
et lyse cellulaire).
21
Titrage des virus
Comptage direct
Utilisation d’un microscope électronique
Les particules virales sont comptées ainsi que des billes en latex
qui servent de référence (concentration connue).
22
Titrage des virus
Méthodes indirectes
Test d’hémagglutination :
• Détermine la dilution de virus la plus élevée qui entraîne une
hémagglutination de globules rouges du sang.
• Méthode rapide et précise pour déterminer la quantité relative
de certains virus tels que le virus de la grippe.
Ac anti-virus présent Ac anti-virus absent
Ac lie le virus
Liaison du virus au GR Virus lient GR
inhibée
Hémagglutination inhibée Hémagglutination
(culot de GR) (formation d’un réseau)
23
Titrage des virus
Méthodes indirectes
Méthode des plages :
• Différentes dilutions de virus sont étalées sur des cellules
hôtes appropriées.
• Dénombrement des plages de lyses.
• Les résultats sont exprimés par nombre de virus infectieux ou
d’unités formatrices de plages (UFP).
UFP/ml = (17UFP/0,1ml)x(106) = 1,7 x 108 24
Titrage des virus
Méthodes indirectes
Méthode des plages :
25
Titrage des virus
Méthodes indirectes
Méthode des dilutions :
• Utilisée quand les 2 autres ne permettent pas d’évaluer les
effets biologiques
• Détermine la dilution limite (plus petite quantité de virus
possible) à laquelle 50% des cellules ou des organismes hôtes
sont infectés ou détruits.
• Les résultats sont exprimés sous forme de dose létale DL50 et
de dose infectieuse DI50.
26
Titrage des virus
Méthodes indirectes
Méthode des dilutions :
50
Le point d’infectivité à 50% se situe entre 10-5 et 10-6 :
(64-50)/(64-7) = 0,25
Donc DI50 = 10-5,25 27
Titrage des virus
Méthodes indirectes
A partir d’un calcul de DI50 on déterminera la multiplicité
d’infection (MOI) en fonction du nombre de cellules utilisées
MOI : Rapport entre le nombre de particules infectieuses sur le
nombre de cellules soumises à l’infection.
108 cellules sont exposées à 104 virus
Quelle est la multiplicité d’infection?
104 / 108 = 10-4 Virus/cellule
28
Méthodes de détection de virus
Western blot avec un Ac dirigé contre une protéine virale :
exemple : Influenza
ELISA, IF avec un Ac dirigé contre une protéine virale
29
Méthodes de détection de virus
PCR en temps réel avec une gamme étalon de virus :
PCR conventionnelle, séquençage 30
Méthodes de détection de virus
Séroneutralisation : basée sur la capacité d’un Ac à empêcher le
virus d’infecter un tapis cellulaire
Etape 1 : mélange
du sérum à tester
avec une
suspension virale
Etape 2 : mise en
contact du
mélange avec un
tapis cellulaire
confluent
Etape 3 : lecture
du résultat au
microscope après
coloration
31
