REPUBLIQUE DE CÔTE D’IVOIRE

Union-Discipline-Travail

Ministère de l’Enseignement Supérieur et

UFR AGROFORESTERIE
de la Recherche Scientifique

ANNEE :
N° D’ORDRE : THESE DE DOCTORAT
078
……………………….
Mention : Agriculture et Foresterie Tropicale

Spécialité : Biotechnologie et Nutrition

CANDIDAT VALORISATION NUTRITIONNELLE, FONCTIONNELLE ET

Nom : MIAN BIOTECHNOLOGIQUE DU JUS DE MUCILAGE DE CACAO

Prénom : Tano Marie-Ange (Theobroma cacao)

Sakia PRODUIT EN COTE D’IVOIRE

JURY
Présidente : Madame TIDOU Abiba Sanogo épse KONE, Professeur
Titulaire, Université Jean Lorougnon Guédé.
Directeurs : Monsieur BEUGRE Grah Avit Maxwell, Professeur
Titulaire,Université Jean LOROUGNON GUEDE
Madame CAMARA Fatoumata épouse FADIKA, Maître de
Conférences, Université Nangui ABROGOUA
Rapporteur :Monsieur ANGAMAN Djédoux Maxime, Professeur
Titulaire, Université Jean Lorougnon Guédé.
Examinateur 1 : Monsieur BOUATENIN Koffi Maïzan Jean-Paul, Maître
de Recherche, Université Nangui ABROGOUA
Examinateur 2 : Monsieur DIOMANDE Massé, Maître de Conférences,
Université Jean LOROUGNON GUEDE

Soutenue publiquement
le :31 Juillet 2023 1
 DEDICACE

Je dédie cette thèse

A mon époux, COULIBALY Wahauwouélé Hermann

Pour son soutien indéfectible, sa compréhension, ses réconforts et ses encouragements dans
mes moments de doute.

A mon père MIAN Tano Joseph et à ma mère LE Jeanine,

vous m’avez enseigné l’amour du travail bien fait, la patience et la persévérance. Que Dieu
vous bénisse et vous garde longtemps à mes côtés !

A mes enfants Lamifihi Marie-Kenneth et Gninlfang Christ Paul-Kyliam,

vous m’avez rempli d’amour et de joie dans mes moments difficiles. Que Dieu demeure votre
guide !

i
 REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au sein des laboratoires d’agro-valorisation de l’UFR Agroforesterie de

l’Université Jean Lorougnon GUEDE et du laboratoire central de l’Université Nangui
ABROGOUA.

Une thèse, tant nominative soit-elle, est avant tout un travail de réflexion collective. Ainsi, au
terme de ce travail, il est pour nous un plaisir et un devoir de remercier sincèrement toutes les
personnes qui ont participé à sa réalisation.

En premier lieu, je remercie les autorités académiques de l’Université Jean Lorougnon GUEDE
et de l’Université Nangui ABROGOUA en l’occurrence les Professeurs titulaires ADOHI
Krou Adjo Viviane et TANO Yao, respectivement Présidente et Président de nous avoir
acceptés dans leur institution.

Nous tenons à remercier Monsieur KONE Tidiani, Professseur titulaire, Vice-Pésident chargé
de la Pédagogie, de la Vie Universitaire et de l’Innovation Technologique de l’Université Jean
Lorougnon GUEDE qui a toujours été disponible pour répondre aux préoccupations des
étudiants au plan académique.

Nous tenons à dire également merci à Monsieur AKAFFOU Doffou Sélastique, Professeur
titulaire, Vice-Président chargé de la Planification, de la Programmation et des Relations
Extérieures de l’Université Jean Lorougnon GUEDE pour son implication au bien-être des
étudiants.

Nous remercions Monsieur BEUGRE Grah Avit Maxwell, Professeur titulaire à l’Unité de
Formation et de Recherche d’Agroforesterie de l’Université Jean Lorougnon GUEDE (Daloa)
et Madame CAMARA Fatoumata épse FADIKA, Maître de Conférences à l’Unité de
Formation et de Recherche des Sciences et Technologies des Aliments de l’Université Nangui
ABROGOUA qui n’ont ménagé aucun effort pour superviser ce travail.

Nos remerciements s’adressent également à Madame TONESSIA Dolou Charlotte, Maître de

Conférences, Directrice de l’Unité de Formation et de Recherche d’Agroforesterie de
l’Université Jean Lorougnon GUEDE, à qui nous exprimons toute notre reconnaissance pour sa
disponibilité et son dynamisme à la tête de l’Unité de Formation et de Recherche
d’Agroforesterie.

ii
AUX MEMBRES DE NOTRE JURY

Pour le grand honneur qu’ils nous font en acceptant de juger ce travail.

A MON MAÎTRE ET PRESIDENTE DU JURY DE THESE, PROFESSEUR TIDOU

ABIBA SANOGO EPSE

Nous vous remercions de l’honneur que vous nous avez fait en acceptant de présider notre jury.
Nous vous remercions de votre enseignement et nous vous sommes très reconnaissants de bien
vouloir porter intérêt à ce travail. Nous avons bénéficié, au cours de nos études, de votre
enseignement clair et précis. Votre gentillesse, vos qualités humaines, votre modestie n’ont rien
d’égal que votre compétence. Veuillez trouver ici, professeur, l’expression de nos sincères
remerciements.

A MES MAÎTRES ET ENCADREURS DE THÈSE PROFESSEUR BEUGRE GRAH

AVIT MAXWELL ET DOCTEUR CAMARA FATOUMATA EPOUSE FADIKA

Vous nous avez fait un grand honneur en acceptant de me confier ce travail. Je vous remercie
de votre patience, votre disponibilité, de vos encouragements et de vos précieux conseils dans
la réalisation de cette thèse. Votre compétence, votre dynamisme et votre rigueur ont suscité
une grande admiration et un profond respect. Vos qualités professionnelles et humaines me
servent d’exemple. Veuillez croire à l’expression de ma profonde reconnaissance et de mon
grand respect.

A MON MAÎTRE ET RAPPORTEUR DE THÈSE PROFESSEUR ANGAMAN DJEDOUX

MAXIME

Votre présence au sein de notre jury constitue pour moi un grand honneur. Par votre modestie,
vous m’avez montré la signification morale de notre profession. Nous vous remercions de votre
enseignement et gentillesse. Qu’il me soit permis de vous présenter à travers ce travail le
témoignage de mon grand respect et l’expression de ma profonde reconnaissance.

A MON MAÎTRE ET EXAMINATEUR DE THÈSE BOUATENIN KOFFI MAÏZAN

JEAN-PAUL

Nous sommes infiniment sensibles à l’honneur que vous nous faites en acceptant de siéger
parmi notre jury de thèse. Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude pour votre

iv
 TABLE DES MATIERES

bienveillance et votre simplicité avec lesquelles vous nous avez accueillis. Veuillez trouver ici,
cher Maître, le témoignage de notre grande estime et de notre sincère reconnaissance.

A MON MATRE ET EXAMINATEUR DE THÈSE DOCTEUR DIOMANDE MASSE

Nous vous remercions de nous avoir honorés par votre présence. Nous vous remercions de votre
enseignement et nous vous sommes très reconnaissants de bien vouloir porter intérêt à ce travail.
Vous avez accepté aimablement de juger cette thèse. Cet honneur nous touche infiniment et
nous tenons à vous exprimer notre profonde reconnaissance. Veuillez accepter, cher maître,
dans ce travail l’assurance de notre estime et notre profond respect.

Nous remercions les grandes familles MIAN et COULIBALY de leur soutien spirituel, moral
et financier.

Nos sincères remerciements au personnel de CARE International Côte d’Ivoire-Guinée en

particulier l’équipe des projets Cargill et Hershey pour leur encouragement.

v
 TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIÈRES

DEDICACE ................................................................................................................................. i

REMERCIEMENTS................................................................................................................... ii

TABLE DES MATIÈRES ......................................................................................................... vi

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ........................................................................... xiii

LISTE DES TABLEAUX .........................................................................................................xv

LISTE DES FIGURES ........................................................................................................... xvii

LISTE DES ANNEXES ...........................................................................................................xxi

INTRODUCTION .......................................................................................................................1

GÉNÉRALITÉS ..........................................................................................................................5

1- Généralités sur le cacao ...........................................................................................................6

1-1- Présentation du cacaoyer, de son fruit et sa graine ..........................................................6

1-1-1- Origine .......................................................................................................................6

1-1-2- Description botanique ...............................................................................................6
1-1-3- Habitat .......................................................................................................................7
1-1-4- Fruit ...........................................................................................................................7
1-1-5- Graine ou fève ...........................................................................................................8
1-2- Différents types de cacao .................................................................................................9

1-2-1- Variété Criollo ...........................................................................................................9

1-2-2- Variété Forastero .....................................................................................................10
1-2-3- Variété Trinitario .....................................................................................................11
1-3- Variétés hybrides de cacao .........................................................................................11
1-3-1- Cacao Mercedes ......................................................................................................11
1-3-2- Cacao brésilien ........................................................................................................12
1-3-3- Cacao "Nacional" ....................................................................................................13
1-3-4- Variété CCN-51 en Equateur ..................................................................................14
1-4- Production mondiale ......................................................................................................14

2- Récolte et étapes post-récolte dans le traitement du cacao ...................................................15

vi
 TABLE DES MATIERES
2-1- Récolte des cabosses ......................................................................................................15

2-2- Etapes post-récoltes dans le traitement du cacao ...........................................................16

2-2-1- Écabossage ..............................................................................................................16

2-2-2- Fermentation ............................................................................................................17
2-2-2-1- Fermentation en tas ..............................................................................................17
2-2-2-2- Fermentation en caisses .......................................................................................18
2-2-2-3- Fermentation en panier ........................................................................................18
2-2-2-4- Fermentation en plate-forme ................................................................................18
2-2-3- Réactions biochimiques impliquées dans la fermentation .......................................19
2-2-3-1-Fermentation alcoolique ........................................................................................19
2-2-3-2-Fermentation lactique............................................................................................19
2-2-3-3-Fermentation acétique ...........................................................................................19
2-3- Brassage .........................................................................................................................20

2-4- Séchage ..........................................................................................................................20

2-4-1- Séchage naturel........................................................................................................21

2-4-2- Séchage artificiel .....................................................................................................21
2-5- Stockage .........................................................................................................................22

3- Microorganismes impliqués dans la fermentation du cacao..................................................22

3-1- Levures ...........................................................................................................................22

3- 2- Bactéries lactiques .........................................................................................................23

3-3- Bactéries acétiques .........................................................................................................24

3-4- Moisissures et bactéries du genre Bacillus ....................................................................24

4- Jus de mucilage de cacao ......................................................................................................25

4-1- Transformation de la pulpe en jus..................................................................................25

4-2- Réactions biochimiques subies par le jus de mucilage de cacao ...................................26

4-3- Composition biochimique du jus de mucilage de cacao................................................27

4-4- Valeur nutritionnelle du jus de mucilage de cacao ........................................................27

4-5- Composés phénoliques de jus de mucilage de cacao ....................................................28

5- Valorisation des sous-produits du cacao ...............................................................................30

5-1- Coques ........................................................................................................................... 30

vii
 TABLE DES MATIERES
5-2- Jus de mucilage de cacao .............................................................................................. 31

6- Bioéthanol ............................................................................................................................ 31

6-1- Définition et propriétés ................................................................................................. 31

6-2- Production mondiale de bioéthanol............................................................................... 33

3- Matières premières utilisées pour la production du bioéthanol pour les biocarburants 34

6-4- Modes de consommation du bioéthanol ....................................................................... 35

6-4-1- Applications industrielles ....................................................................................... 35

6-4-2- Consommation pour le déplacement ...................................................................... 35
7- Pectinases ............................................................................................................................. 36

7-1-Différents groupes de pectinases.................................................................................... 36

7-1-1- Pectines méthylestérases......................................................................................... 36

7-1-2- Polygalacturonases ................................................................................................. 37
7-1-3-Pectines lyases ......................................................................................................... 38
7-2- Pectinases d’origine microbienne ................................................................................. 39

MATÉRIEL & MÉTHODES ................................................................................................... 40

1- Matériel ................................................................................................................................. 41

1-1-Matériel végétal.............................................................................................................. 41

1-2- Matériel technique ......................................................................................................... 41

2- Méthodes .............................................................................................................................. 42

2-1- Méthodes d’enquêtes ..................................................................................................... 42

2-1-1- Généralités sur les sites d’enquêtes et d’échantillonage ......................................... 42

2-1-2- Procédure d’enquête ............................................................................................... 43
2-1-3- Population d’étude et collecte des données ............................................................ 43
2-2- Echantillonnage ............................................................................................................. 44

2-3- Analyses biochimiques du jus de mucilage au cours de la conservation...................... 44

2-3-1-Détermination de la teneur en eau et matière sèche ................................................ 44

2-3-2-Détermination de la teneur en cendres .................................................................... 44
2-3-3-Détermination de la teneur en lipides totaux ........................................................... 45

2-3-4-Détermination de la teneur en protéines totales ...................................................... 46

2-3-5- Détermination de la teneur en fibres brutes............................................................ 46

viii
 TABLE DES MATIERES
2-3-6-Détermination de la teneur glucides totaux et valeur énergétique des jus de
mucilage ............................................................................................................................ 47
2-3-7-Dosage des acides organiques et des vitamines....................................................... 47
2-3-7-1-Dosage des acides organiques .............................................................................. 47
2-3-7-2-Dosage des vitamines ........................................................................................... 48
2-3-8-Dosage des polyphénols totaux ............................................................................... 49
2-3-9- Dosage des flavonoïdes totaux ............................................................................... 49
2-3-10- Tanins totaux ........................................................................................................ 49
2-3-4-Dosage des activités antioxydantes ......................................................................... 50
2-3-4-1- Activité antiradicalaire : DPPH (2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl) ..................... 50
2-3-4-2-Pouvoir réducteur-antioxydant du fer : FRAP (ferricyanure de potassium-
chlorure ferrique)............................................................................................................... 50
2-4- Analyses physico-chimiques et microbiologiques du jus de mucilage au cours de la
fermentation .......................................................................................................................... 51

2-4-1-Mesure du pH .......................................................................................................... 51
2-4-2- Détermination de l’acidité titrable .......................................................................... 51
2-4-3- Mesure de l’extrait sec réfractométrique ................................................................ 51
2-4-4-Dosage de l’éthanol ................................................................................................. 52
2-4-5- Détermination de la charge levurienne au cours de la fermentation ...................... 52
2-5-Isolement des levures ..................................................................................................... 53

2-5-1-Screening des isolats de levures producteurs de pectinase ...................................... 53

2-5-2-Optimisation de la production d'enzyme pectinase à partir d'isolats sélectionnés .. 54
2-5-2-1-Effet du temps d’incubation ................................................................................. 54
2-5-2-2- Effet du pH.......................................................................................................... 54
2-5-2-3-Effet de la température d’incubation .................................................................... 54
2-5-3-Dosage de l’activité pectinolytique ......................................................................... 55
2-6-Identification moléculaire des isolats de levures producteurs de pectinase et résistants à
l’éthanol ................................................................................................................................ 55

2-6-1- Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de la région ITS-5.8S rDNA .......... 55

2-6-2-Electrophorèse sur gel d’agarose ................................................................................ 56

2-6-3-Séquençage des fragments amplifiés .......................................................................... 56

3- Purification partielle de l’enzyme ......................................................................................... 57

3-1-Chromatographie d’échange d’anions sur le gel DEAE-sepharose Fast Flow ........... 57

ix
 TABLE DES MATIERES
3-2-Détermination des paramètres cinétiques ...................................................................... 57

4- Applications biotechnologiques des espèces identifiées productrices de pectinase et

résistantes à l’éthanol ................................................................................................................ 58

4-1-Essais de clarification enzymatique du jus d’orange (Citrus sinensis) et du jus d’ananas

(Ananas comosus) et d’extraction de composés phénoliques par l’extrait enzymatique
partiellement purifié des espèces de Yarrowia lipolytica ..................................................... 58

4-1-1-Analyses physico-chimiques des jus clarifiés ......................................................... 58

Le dosage des paramètres physico-chimiques des jus d’orange clarifiés à savoir le pH,
l’acidité titrable et l’extrait sec refractométique a été effectué comme définit aux sections
2-4-1 ; 2-4-2 ; 2-4-3........................................................................................................... 58
2-4-1-Mesure du pH .......................................................................................................... 58
2-4-2- Détermination de l’acidité titrable .......................................................................... 58
2-4-3- Mesure de l’extrait sec réfractométrique ................................................................ 59
4-1-2- Détermination de la clarté, la couleur et l’indice de brunissement ........................ 59
4-1-3- Dosage des composés phénoliques ......................................................................... 60
2-3-8-Dosage des polyphénols totaux ............................................................................... 60
2-3-9- Dosage des flavonoïdes totaux ............................................................................... 60
4-1-4-Détermination de la viscosité .................................................................................. 60
4-2-Production de bioéthanol par fermentation alcoolique du moût de sorgho (Sorghum
bicolor) par les espèces de levures Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula mucilaginosa,
Debaromyces hansenii, Pichia kudriavzevii résistantes à l’éthanol ..................................... 61

4-2-1-Préparation du moût ................................................................................................ 61

4-2-2-Conduite de la fermentation alcoolique................................................................... 61
4-2-3-Analyses physico-chimiques du moût au cours de la fermentation alcoolique 61
4-2-3-1-Détermination du pH, l’acidité titrable et de l’extrait sec refractométrique 61
2-4-1-Mesure du pH .......................................................................................................... 62
2-4-2- Détermination de l’acidité titrable .......................................................................... 62
2-4-3- Mesure de l’extrait sec réfractométrique ................................................................ 62
4-3-Production de CO2 durant la fermentation alcoolique par les espèces Rhodotorula
mucilaginosa, Debaromyces hansenii, Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae . 63
4-4-Distillation des moûts fermentés .................................................................................... 63

5- Analyses statistiques .............................................................................................................. 63

RÉSULTATS & DISCUSSION ............................................................................................... 65

x
 TABLE DES MATIERES
CHAPITRE I : ÉVALUATION DES PARAMÈTRES BIOCHIMIQUES,
PHYTOCHIMIQUES, NUTRITIONNELLES ET FONCTIONNELLES DU JUS DE
MUCILAGE DE CACAO AU COURS DE LA CONSERVATION À LA TEMPÉRATURE
AMBIANTE (28±2 °C) ............................................................................................................ 66

1- Résultats ................................................................................................................................ 66

1-1-Profil socio-démographique des personnes interrogées ................................................. 66

1-2-Niveau de connaissance du jus de mucilage de cacao par ocalité ................................. 68

1-3- Moment de consommation du jus de mucilage de cacao selon les localités ................... 68

1-4- Nature des effets bénéfiques du jus de mucilage de cacao ........................................... 69

1-5- Évolution des paramètres biochimiques des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation .......................................................................................................................... 71

I-5-1- Évolution des paramètres biochimiques des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation....................................................................................................................... 71
1-5-2- Évolution de la teneur en vitamines des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation....................................................................................................................... 74
1-5-3- Évolution de la teneur en acides organiques des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation .............................................................................................................. 75
1-5-4- Évolution de la valeur énergétique des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation....................................................................................................................... 78
1-6- Évolution de la teneur en composés phénoliques des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation à la température ambiante....................................................................... 78

1-6-1- Évolution de la teneur en polyphénols totaux des jus de mucilage de cacao au

cours de la conservation à la température ambiante .......................................................... 78
1-6-2- Évolution de la teneur en flavonoïdes totaux des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation .............................................................................................................. 79
1-6-3- Évolution de la teneur en tanins totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation....................................................................................................................... 80
1-7- Évolution de l’activité antioxydante des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation .......................................................................................................................... 81

1-7-1- Évolution de l’activité antioxydante des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation par la méthode de DPPH (1,1-diphényl -2- picrylhydrazyle) ...................... 81

1-7-2- Évolution de l’activité antioxydante des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation par la méthode FRAP (ferricyanure de potassium-chlorure ferrique) ......... 82
1-8- Analyse en composantes principales des caractéristiques phytochimiques et

xi
 TABLE DES MATIERES
antioxydantes ........................................................................................................................ 83

1-9- Analyse en composantes principales et classification hiérarchique ascendante des jus

de mucilage de cacao au cours de la conservation ............................................................... 89

1-9-1-En début de conservation (0 h)................................................................................ 89

1-9-2-A 24 h de conservation ............................................................................................ 91
1-9-3-A 48h de conservation ............................................................................................. 93
1-9-4-En fin de conservation (72 h) .................................................................................. 95
2- Discussion ............................................................................................................................. 98

Conclusion partielle ................................................................................................................ 101

CHAPITRE II : ÉTUDE DES PROPRIÉTÉS BIOTECHNOLOGIQUES ............................ 102

DES LEVURES DU JUS DE MUCILAGE DE CACAO EN FERMENTATION ............... 102

1- Résultats .............................................................................................................................. 102

1-1- Évolution des paramètres chimiques et microbiologiques (levures) du jus de mucilage

au cours de la fermentation spontanée du jus de mucilage de cacao ................................. 102

1-1-1-Évolution du pH et de l’acidité titrable (AT) ........................................................ 102

1-1-2- Évolution de la charge levurienne, de l’ESR et du taux d’éthanol au cours de
fermentation spontanée du jus de mucilage de cacao...................................................... 104
1-2- Identification moléculaire des isolats des levures résistants à l’éthanol..................... 107

1-3-Screening des isolats de levures producteurs de pectinases ........................................ 110

1-4- Détermination des conditions optimales de production de la pectinase par 6 isolats

sélectionnés ......................................................................................................................... 111

1-4-1-Détermination du temps optimal de production de la pectinase............................ 111

1-4-2-Effet du pH sur la production de la pectinase ....................................................... 112
1-4-3-Effet de la température d’incubation sur la production de la pectinase ................ 112
1-5- Identification moléculaire des isolats de levures producteurs de pectinase sélectionnés
............................................................................................................................................ 113

1-5-1- Amplification de la région 5.8S rDNA-ITS ......................................................... 113

1-5-2- Caractérisation moléculaire des 6 isolats de levures productrices de pectinase ... 114

sélectionnés ..................................................................................................................... 114

1-6- Purification et caractérisation partielles des pectinases des espèces Yarrowia lypolitica
............................................................................................................................................ 116

xii
 TABLE DES MATIERES
1-6 1- Chromatographie par échange d’anions avec le gel DEAE Sepharose Fast Flow116
1-6-2- Paramètres de la purification partielle des pectinases .......................................... 116
1-6-3- Caractéristiques physico-chimiques des pectinases partiellement purifiées 118
1-6-3-1-Effet du pH sur l’activité enzymatique .............................................................. 118
1-6-3-2-Effet de la température sur l’activité enzymatique............................................. 118
1-6-4- Constantes cinétiques des pectinases partiellement purifiées............................... 119
2- Discussion ........................................................................................................................... 121

Conclusion partielle ................................................................................................................ 128

CHAPITRE III : APPLICATIONS BIOTECHNOLOGIQUES : ESSAI DE PRODUCTION DE

BIOÉTHANOL PAR LES SOUCHES DE LEVURES RÉSISTANTES À L’ÉTHANOL,
CLARIFICATION DE JUS D’ORANGE (Citrus sinensis L.) ET D’ANANAS (Ananas
comosus) PAR LES SOUCHES DE LEVURES PRODUCTRICES DE PECTINASE 129

1- Production de bioéthanol par fermentation du moût sucré de sorgho par les souches de levures
résistantes à l’éthanol : Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces hansenii, Saccharomyces
cerevisiae, Pichia kurdiavzevii ............................................................................................... 129

1-1-Évolution des différents paramètres physico-chimiques au cours de la fermentation

alcoolique ............................................................................................................................ 129

1-1-1- Évolution du pH et de l’acidité titrable ................................................................ 129

1-1-2- Vitesse de consommation des sucres des espèces de levures au cours de la
fermentation..................................................................................................................... 130
1-2-Évolution la cinétique fermentaire des souches de levure au cours de la fermentation
alcoolique des moûts ........................................................................................................... 131

I-2-1-Évolution du volume CO2 (g/L) dégagé au cours de la fermentation des moûts 131
1-2-2-Évolution de la croissance levurienne au cours de la fermentation des moûts 131
1-3- Degré alcoolique des distillats provenant des différentes fermentations .................... 132

1-4-Clarification des jus d’orange et d’ananas par les pectinases produites par les espèces de
Yarrowia lipolytica ............................................................................................................. 134

1-4-1- Activités enzymatiques des extraits bruts et partiellement purifiés des espèces de
Yarrowia lipolytica Tias J0-6 ; YA J3-1 et Buy J2-1...................................................... 134

1-4-2- Paramètres physico-chimiques et phytochimiques des jus clarifiés........................ 135

1-4-2-1- Paramètres physico-chimiques des jus d’orange et ananas clarifiés ................. 135
1-4-2-2-Teneurs en composés phénoliques et activité antioxydante des jus clarifiés ..... 137

xiii
 TABLE DES MATIERES
1-5- Corrélation entre composés phénoliques et activité antioxydante des jus de fruits
clarifiés ............................................................................................................................ 139
2- Discussion ........................................................................................................................... 140

CONCLUSION ...................................................................................................................... 144

RÉFÉRENCES ....................................................................................................................... 147

ANNEXES ............................................................................................................................. 182

xiv
 LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

°C : Degrés Celsius
ADNr : ADN ribosomique
AOAC : Association des chimistes agricoles officiels
AT : Acidité titrable
BET : Bromure d’éthidium
CLHP : Chromatographie liquide haute performance
CNRA : Centre National de Recherche Agronomique
CNUCED : Conférences des Nations Unies sur le Commerce et le Développement
CO2 : Dioxyde de Carbone
DNS : acide 3,5-dinitrosalicylique
DO : Densité Optique
DPPH : 2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
EDTA : Acide Ethylène diamine tétra-acétique
ESR : Extrait sec réfractométrique
FAO : Organisation pour l'alimentation et l'agriculture
FRAP : Ferricyanure de potassium-chlorure ferrique
FRAP : ferricyanure de potassium-chlorure ferrique
IRAD : Institut de Recherche Agricole pour le Développement
J.-C. : Jésus Christ
LAB : Bactéries lactiques
LDL : Low Density Lipoprotein
NaCl : Chlorure de Sodium
NaOH : Hydroxyde de Sodium
PCR : Réaction de polymérisation en chaîne
pH : Potentiel d’Hydrogène
Rpm : Rotation par minute
TBE : Tris/Borate/EDTA
UFC/g : Unité Formant colonie par gramme
UFC/mL : Unité formant colonie par millilitre
YPDA : Yeast peptone dextrose agar

xiii
 LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Composition biochimique du jus de mucilage de cacao ....................................... 27
Tableau II : Valeur nutritionnelle du jus de mucilage de cacao ............................................. 28
Tableau III : Propriétés physico-chimiques de l’essence et de l’éthanol ................................ 33
Tableau IV : Composition du mélange réactionnel (volume final : 50 µL) ............................ 56
Tableau V : Profil socio-démographique des personnes interrogées ...................................... 67
Tableau VI : Moment de consommation du jus de mucilage de cacao par localités .............. 69
Tableau VII : Nature des effets bénéfiques du jus de mucilage de cacao par localité ............ 69
Tableau VIII : Quantités de jus de mucilage de cacao consommées par localité ................... 70
Tableau IX : Temps de conservation du jus de mucilage de cacao dans les localités ............. 71
Tableau X : Teneur des paramètres biochimiques (%) des jus de cacao au cours de la
conservation .............................................................................................................................. 73
Tableau XI : Teneur en vitamines (g/L) des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation .............................................................................................................................. 75
Tableau XII : Teneur en acides organiques (g/L) des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation .............................................................................................................................. 77
Tableau XIII : Valeurs propres et variances expliquées des axes principaux à 0h de
conservation .............................................................................................................................. 84
Tableau XVII : Valeurs propres et variances expliquées des axes principaux à 48 h de
conservation .............................................................................................................................. 87
Tableau XVIII : Corrélation entre les activités antioxydantes et les teneurs en composés
phénoliques à 48 h de conservation .......................................................................................... 87
Tableau XXII : Distribution des espèces de levures identifiées ........................................... 109
Tableau XXIII : Identification des 6 isolats de levure sélectionnées .................................... 115
Tableau XXVII : Paramètres physico-chimiques des jus d’orange clarifiés......................... 136
Tableau XXVIII : Paramètres physico-chimiques des jus d’ananas clarifiés ....................... 136
Tableau XXIX : Teneurs en composés phénoliques et activité antioxydante des jus clarifiés
................................................................................................................................................ 138
Tableau XXX : Matrice de corrélation de Pearson entre les composés phénoliques et les
activités antioxydantes ............................................................................................................ 139

xv
 LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Cabosse de cacao ...................................................................................................... 8
Figure 2 : Graines de cacao avec et sans pulpe ......................................................................... 9
Figure 3 : Cabosse de la variété Criollo .................................................................................. 10
Figure 4 : Cabosse de la variété Forastero ............................................................................... 10
Figure 5 : Cabosse de la variété trinitario ................................................................................ 11
Figure 6 : Cabosse de la variété Mercedes .............................................................................. 12
Figure 7 : Cabosse de la variété Cacao brésilien .................................................................... 13
Figure 8 : Cabosse de la variété Nacional ............................................................................... 13
Figure 9 : Cabosse de la variété CCN-51 ................................................................................ 14
Figure 10 : Principaux pays producteurs de cacao .................................................................. 15
Figure 11 : Écabossage du cacao ............................................................................................. 16
Figure 12 : Fermentation en tas du cacao ................................................................................ 17
Figure 13 : Fermentation en caisse .......................................................................................... 18
Figure 14 : Techniques de brassage au cours de la fermentation du cacao ................. …...25
Figure 15 : Dispositif de collecte de jus de cacao par entassement des fèves ................... 25
Figure 16 : Production du jus de mucilage de cacao par activité pectinolytique des levures . 26
Figure 17 : Fermentation acétique se produisant dans le jus de mucilage ............................... 27
Figure 18 : Structure de l’épicatéchine .................................................................................... 29
Figure 19 : Polyphénols en fonction de l’origine du cacao ..................................................... 30
Figure 20 : Production d’aliment pour bétail à partir de coques de cacao................................ 31
Figure 21 : Production mondiale d’éthanol par zone géographique en 2019 .......................... 34
Figure 22 : Matières premières utilisées pour la production d’éthanol pour les
biocarburants............................................................................................................................. 34
Figure 23 : Déméthylestérification des pectines par les PME ................................................. 37
Figure 24 : Action des polygalacturonases sur l’acide polygalacturonique ......................... 38
Figure 25 : Réaction catalysée par les pectines lyases (PL) .................................................... 39
Figure 26 : Cabosse de cacao .................................................................................................. 41
Figure 27 : Jus de mucilage de cacao ...................................................................................... 41
Figure 28 : Site d’échantillonnage et enquête ......................................................................... 42
Figure 29 : Mesure de la viscosité ........................................................................................... 61
Figure 30 : Valeur énergétique des jus de mucilage cacao au cours de la conservation ......... 78

xvii
 LISTE DES FIGURES

Figure 31 : Teneur en polyphénols totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation .............................................................................................................................. 79
Figure 32 : Teneur en flavonoïdes totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation .............................................................................................................................. 80
Figure 33 : Teneur en tanins totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation .............................................................................................................................. 81
Figure 34 : Évolution de l’activité antioxydante (DPPH) des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation ..................................................................................................................... 82
Figure 35 : Évolution de l’activité antioxydante (FRAP) des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation ..................................................................................................................... 83
Figure 36 : Distribution (a) et projection (b) des caractéristiques phytochimiques et
antioxydants à partir de l’analyse en composante principale des jus de mucilage à 0h de
conservation .............................................................................................................................. 84
Figure 37 : Distribution (a) et projection (b) des caractéristiques phytochimiques et
antioxydants à partir de l’analyse en composante principale des jus de mucilage à 24 h de
conservation .............................................................................................................................. 85
Figure 38 : Distribution (a) et projection (b) des caractéristiques phytochimiques et
antioxydants à partir de l’analyse en composante principale des jus de mucilage à 48 h de
conservation .............................................................................................................................. 87
Figure 39 : Distribution (a) et projection (b) des caractéristiques phytochimiques et
antioxydants à partir de l’analyse en composante principale des jus de mucilage à 72 h de
conservation .............................................................................................................................. 88
Figure 40 : Projection des paramètres analysés et des jus de micilage de Akoupé, Yakassé-
Attobrou, Tiassalé, Taabo et Buyo dans le plan factoriel 1-2 de l’ACP à 0 h de conservation 90
Figure 41 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et
dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) en début de conservation ......................... 91
Figure 42 : Projection des paramètres analysés et des jus de micilage de Akoupé,
Yakassé-Attobrou, Tiassalé, Taabo et Buyo dans le plan factoriel 1-2 de l’ACP à 24 h de
conservation .............................................................................................................................. 92
Figure 43 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et
dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) à 24 h de conservation ............................. 93
Figure 44 : Projection des paramètres analysés et des jus de micilage de Akoupé, Yakassé-
Attobrou, Tiassalé, Taabo et Buyo dans le plan factoriel 1-2 de l’ACP à 48 h de conservation
.................................................................................................................................................. 94

xviii
 LISTE DES FIGURES

Figure 45 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et

dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) au bout de 48 h de conservation .............. 95
Figure 46 : Projection des paramètres analysés et des jus de micilage de Akoupé, Yakassé-
Attobrou, Tiassalé, Taabo et Buyo dans le plan factoriel 1-2 de l’ACP à 72h de conservation
.................................................................................................................................................. 96
Figure 47 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et
dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) en fin de conservation (72 h)................... 97
Figure 48 : Évolution du pH et de l’acidité titrable au cours de la fermentation des jus de
mucilage de cacao ................................................................................................................... 103
Figure 49 : Courbes de croissance (cercle), évolution de l'éthanol (carré) et de ESR (losange)
au cours de la fermentation du jus de mucilage de cacao ....................................................... 106
Figure 50 : Révélation sur gélose pectine de production de pectinase par l’isolat TIAS J0-6
................................................................................................................................................ 110
Figure 51 : Diamètre des halos des isolats ............................................................................ 110
Figure 52 : Effet du temps d’incubation sur la production de pectinase par 6 isolats sélectionnés
................................................................................................................................................ 111
Figure 53 : Effet du pH du milieu sur la production de pectinase par 6 isolats sélectionnés 112
Figure 54 : Effet de la température d’incubation sur la production de pectinase par 6 isolats
sélectionnés ............................................................................................................................. 113
Figure 55 : Produits d’amplification par les amorces ITS 1 et ITS 4 de la région 5.8S-ITS de
l’ADNr des 6 isolats de levures productrices de pectinase sélectionnés ................................ 114
Figure 56 : Représentation graphique de la souche Yarrowia lipolytica TIAS J0-6 ............. 116
Figure 57: Effet du pH sur l’activité enzymatique ................................................................ 118
Figure 58 : Effet de la température sur l’activité enzymatique.............................................. 119
Figure 59 : Détermination graphique des constantes cinétiques Km et Vmax ...................... 120
Figure 60 : Évolution du pH et de l’acidité titrable des moûts en fermentation avec les
différentes espèces de levures ................................................................................................. 129
Figure 61 : Vitesse de consommation des sucres au cours de la fermentation alcoolique avec
les différentes espèces de levures ........................................................................................... 130
Figure 62 : Dégagement de CO2 au cours de la fermentation des moûts avec les
différentes ............................................................................................................................... 131
Figure 63 : Évolution de la densité optique des moûts ensemencés par les souches de levures
au cours de la fermentation ..................................................................................................... 132
Figure 64 : Degré alcoolique des différents distillats ............................................................ 133

xix
 LISTE DES FIGURES

Figure 65 : Flacons de bioéthanol produit les différentes espèces de levures après

distillation ............................................................................................................................... 133
Figure 66 : Activité totale des extraits brut et partiellement purifié ...................................... 134

xx
 LISTE DES ANNEXES
ANNEXE I : Fiche d’enquête

ANNEXE II : Séquences nucléotidiques

ANNEXE III : Matériel technique

xxi
INTRODUCTION
 Le cacaoyer (Theobroma cacao Linné) est principalement cultivé pour ses fèves dans
les plantations des régions tropicales du monde entier (Lopez & Dimick, 1995). Les principaux
producteurs sont la Côte d'Ivoire, le Ghana et le Cameroun avec plus de 70% de la production
mondiale. La production de la Côte d'Ivoire, seule représente pour plus de 35 % de la production
mondiale (ICCO, 2019). Le pays occupe le 1er rang au niveau mondial. La totalité de la
production ivoirienne était destinée à l'exportation dans les pays industriels (Europe et
Amérique) où les fèves de cacao fermentées rentaient principalement dans la préparation de
chocolat et de graisses utilisées dans les cosmétiques, les industries pharmaceutiques et les
produits alimentaires (Moscatto et al., 2004, Guehi et al., 2007). Lafermentation du cacao est
l'une des étapes de la transformation post-récolte qui influence la qualité finale du produit. Dans
les cabosses, les fèves de cacao sont noyées dans une masse de pulpe mucilagineuse. Après
avoir retiré les fèves entières, la pulpe mucilagineuse est dégradée par les enzymes
pectinolytiques pour produire un jus de mucilage communément appelé "eau de cacao" (Barel,
2013). Ainsi, le processus de fermentation des fèves de cacao génère des sous-produits qui sont
souvent abandonnés comme déchets.
En effet, lors du décorticage, plus de 300 millions de litres de jus de mucilage, produits
chaque année, sont abandonnés dans les champs (Anvoh, 2013). Le jus de mucilage est riche en
sucres fermentescibles tels que le glucose, (2,4-4,1 %), le fructose (4,2-6,2 %) et le saccharose
(2,1-3,2 %) et présente une concentration élevée, notamment en acide citrique (2,1- 2,4 %)
(Schwan, 1998 ; Ardhana & Fleet, 2003). Aussi d'autres acides organiques sont-ils également
présents en plus petites quantités, comme l'acide lactique (0,03 %) et l'acide acétique (0,04 %)
(Schwan, 1998 ; Ardhana & Fleet, 2003). Le pH du jus a été évalué à un peu moins de 4,0
(Sanchez et al., 1985). Les caractéristiques de ce jus sont propices à la prolifération de plusieurs
microorganismes, tels que les levures, les bactéries acétiques, les bactéries lactiques au cours de
la fermentation. L’activité de ces microorganismes conduit à la formation de divers produits
finaux métaboliques tels que les alcools, l'acide acétique et d'autres acides organiques. Plusieurs
études antérieures ont examiné la dynamique microbienne et les espèces impliquées dans la
fermentation spontanée des fèves de cacao (Roelofsen, 1958 ; Schwan et al., 1995 ; Ardhana,
2003 ; Jespersen et al., 2005 ; Nielsen et al., 2005 ; Nielsen et al., 2007 ; Camu et al., 2007 ;
Daniel et al., 2009 ; Garcia-Armisen et al., 2010 ; Lefeber et al., 2011 ; Papalexandratou et al.,
2011a, b ; Nielsen et al., 2012).
Aussi, le niveau élevé d'alcool obtenu après quelques jours de fermentation du jus
pourrait-il suggérer la présence de levures susceptibles d'avoir une résistance et une tolérance
relativement élevées à l'alcool. En effet, la forte teneur en éthanol du jus de mucilage de cacao
fermenté avait été déjà signalée par plusieurs auteurs. Ainsi, Anvoh (2013) a montré que les
concentrations en alcool du jus de mucilage sous fermentation contrôlée à 28 °C et 35 °C étaient
à 7,8±0,2 % et 8,4±0,3 % respectivement. Cocolin et al. (2016) ont rapporté que 38 % et 54 %
du total des isolats de la fermentation des fèves de cacao étaient capables de se développer
respectivement à 8, 10 et à 12 % (v/v) d'éthanol. Saccharomyces cerevisiae a montré la plus
forte croissance à 12 % d'éthanol. De plus, le jus de mucilage de cacao fermenté, par sa forte
teneur en éthanol, pourrait être utilisé pour la production de bioéthanol. Le bioéthanol a été
identifié comme le biocarburant le plus utilisé dans le monde, car il contribue de manière
significative à la réduction de la consommation de pétrole brut et de la pollution
environnementale. Il peut être produit à partir de différents types de matières premières telles
que le saccharose, l'amidon, la biomasse lignocellulosique et algale, par un processus de
fermentation par des microorganismes (Azhar et al., 2017). Ainsi, plusieurs études ont été
réalisées dans le but de produire du bioéthanol afin de l’utiliser comme biocarburant (Yan et al.,
2015 ; Ishola et al., 2015 ; Moon et al., 2012 ; Peng et al., 2011 ; Yu et al., 2007 ; Lu et al.,
2013).
Par ailleurs, le jus de mucilage contient une teneur importante en pectine (Baensch, 2000
; Barel, 2009 ; Anvoh, 2013) qui suggérerait la présence de levures productrices de pectinases.
Appartenant aux enzymes de la famille des hydrolases telles que, l’α-amylase, la cellulase, les
pectinases sont parmi les plus importantes enzymes à l’échelle industrielle, ce qui fait d’elles,
un des outils-clés des biotechnologies (Little, 2004). Les enzymes pectinolytiques occupent une
position centrale avec 25 % du marché global des enzymes (Ruiz et al., 2017). Une croissance
de 5,8 % est attendue pour la période de 2017 à 2022 (Industrial Enzyme Market, 2017). Dans
l’industrie agroalimentaire, les pectinases sont utilisées principalement dans la clarification des
jus de fruits (Alkorta et al., 1998 ; Kashap et al., 2001 ; Duvetter et al., 2005 ; Jayani et al.,
2005 ; Meryandini et al., 2017). Les enzymes d’origine microbienne présentent un large
domaine d’applications, tels que l’industrie alimentaire, les détergents pour lessives, l’industrie
des tanneries et l’industrie pharmaceutique. Environ 40 % des enzymes industrielles sont
d’origine fongique (Botton et al., 1990). En Côte d’Ivoire, l’industrie des enzymes est
totalement absente.
En Côte d’Ivoire, la majeure partie des études sur le cacao se sont articulées autour des
fèves (Guehi et al., 2010 ; Kedjebo, 2016 ; Oussou et al., 2022 ; Yao et al., 2022). Concernant
le jus de mucilage, seuls les travaux réalisés par Anvoh (2013) portant sur sa transformation en
vinaigre et en marmelade ont été rapportés. Bien que le cacao soit important dans l’actuelle
économie de la Côte d'Ivoire, les acteurs de la filière cacao et les industriels auraient davantage
intérêt à valoriser ses sous-produits, notamment le jus de mucilage de cacao.
C’est dans ce contexte que la présente étude a été réalisée. L’objectif est de valoriser le
jus de mucilage de cacao à travers la détermination des paramètres biochimiques,
phytochimiques, nutritionnelles, fonctionnelles et des propriétés biotechnologiques des levures
impliquées dans la fermentation spontanée. Il s’agira spécifiquement de :

• Faire l’état des connaissances actuelles du jus de mucilage de cacao ;

• Déterminer l e s propriétés physico-chimiques, phytochimiques, nutritionnelles et

fonctionnelles au cours de la conservation à la température ambiante ;

• Réaliser le screening des isolats de levures résistantes à l’éthanol et productrices de

Pectinases et effectuer leur identification ;

• Procéder à des applications biotechnologiques, non seulement à travers la production de

bioéthanol mais aussi la clarification des jus de fruits en fonction des caractéristiques
des espèces de levures isolées

Les résultats obtenus dans cette étude ont été organisés en trois (03) chapitres :

Chapitre I : Évaluation des propriétés physicochimiques, nutritionnelles et fonctionnelles du jus

de mucilage de cacao au cours de la conservation à la température ambiante

Chapitre II : Etude des propriétés biotechnologiques des levures du jus de mucilage de cacao en
fermentation

Chapitre III : Essai de production de bioéthanol par les souches de levures résistantes à l’éthanol
; Essai clarification de jus d’orange (Citrus sinensis l.) et d’ananas (ananas comosus) par les
souches de levures productrices de pectinase

Ce mémoire de thèse est structuré en trois parties. Une revue bibliographique, qui
présente les généralités sur le cacao, la production, l’utilisation, et l’usage du bioéthanol et les
différents types de pectinases compose la première partie. La deuxième partie de ce manuscrit
décrit les principales méthodes appliquées pendant cette étude. Elle présente les protocoles, les
critères d’études retenus et les analyses statistiques réalisées. Les résultats obtenus sont
regroupés dans la troisième partie et sont discutés en trois chapitres différents. Une conclusion
générale permet de récapituler les principaux résultats de ce travail et de les analyser de façon
plus globale. Le manuscrit se conclut en présentant les principales perspectives envisagées pour
la poursuite de cette thématique de recherche.
PREMIÈRE PARTIE

GÉNÉRALITÉS
 GÉNÉRALITÉS

1- Généralités sur le cacao

1-1- Présentation du cacaoyer, de son fruit et sa graine

1-1-1- Origine

Les cacaoyers sont originaires d'Amérique du Sud. L'utilisation des fèves de cacao
remonte à au moins 1400 av. (Rosner, 1997). Les Aztèques et les Incas utilisaient les fèves de
cacao comme monnaie d'échange et utilisaient les fèves de cacao pour fabriquer du chocolat.
Le chocolat était des fèves de cacao torréfiées et moulues en une purée, souvent ajoutée à de
l'eau et mélangée à d'autres ingrédients tels que la vanille, les épices et le miel (Afoakwa, 2010).

1-1-2- Description botanique

C'est Linné en 1753 qui a appelé Theobroma cacao "le cacao aliment des dieux".
Connu sous le nom de cacaoyer, cet arbre appartient à la famille des Sterculiaceae et au genre
Theobroma. Seule 1 des 22 espèces du genre cacao est consommée sous forme de cacao
« Theobroma cacao » (Tixier, 2013).
Le cacaoyer est un arbre d'ombre d'environ 10 mètres de haut. Productif dès 4 ou 5
ans. Les fleurs du cacaoyer poussent à la fois sur le tronc et sur les branches principales
(Tixier, 2013), elles sont nombreuses et se succèdent tout au long de l'année. Une soixantaine
de fleurs produites par le cacaoyer ne sont pas pollinisées (pollinisation insectophile) et
tombent au bout de 48 heures. Environ 5% seulement des fleurs pollinisées se décortiquent et
forment le fruit du cacaoyer qui la cabosse (Braudeau, 1969). Ces derniers sont de gros fruits
ovales de 15 à 20 cm de long. Il contient des graines et est appelé fèves de cacao ou cacao
commercial après transformation. Le nombre de cabosses varie selon les espèces. Ces fèves
sont attachées à une tige centrale et sont entourées d'une pulpe appelée mucilage. Après avoir
traversé différentes étapes après la récolte, la fève de cacao résultante pèse environ 1 gramme
et est recouverte d'une fine membrane résistante appelée la croûte. Le chocolat est fabriqué à
partir de fèves de cacao décortiquées et de cotylédons (Braudeau, 1969).

6
 GÉNÉRALITÉS

La classification du cacaoyer se fait selon le schéma systématique suivant :

Règne : Plantae
Sous-règne : Viridaeplantae
Division : Magnoliophyta
Embranchement : Spermaphytes
Sous-embranchement : Angiospermes
Classe : Eudicotylédones
Sous-classe : Rosidées
Ordre : Malvales
Famille : Sterculiaceae
Genre : Theobroma
Mais la classification du cacaoyer n’est pas évidente ; en effet, selon la classification
phylogénétique, le Theobroma cacao appartient à la famille des Malvacées et à la sous-famille
des Sterculiacées (Gilet, 2006).

1-1-3- Habitat
Le cacaoyer est un arbre fragile qui a besoin de chaleur, d'humidité et d'ombre pour
pousser (Tixier, 2013). Les précipitations sont de l'ordre de 1500 à 2000 mm. De plus, les
cacaoyers ont besoin de sols profonds, peu perméables, riches en humus et en minéraux (Tixier,
2013).

1-1-4- Fruit
Le fruit est appelé "cherelle" pendant le développement et une gousse à maturité (Figure 1). Sa
croissance et sa maturité prennent 5 à 7 mois. La couleur des fruits est considérée comme un
indicateur de maturité, car les cabosses passent du vert ou du rouge au jaune ou à l'orange. Le
fruit est porté sur une tige ligneuse qui provient d'une tige charnue, dure et partiellement
ligneuse contenant du mucilage et de 30 à 60 graines appelées haricots. La taille et le poids des
cabosses varient de 10 à 35 cm et de 200 à 800 grammes (Mossu, 1990).

7
 GÉNÉRALITÉS

Figure 1 : Cabosse de cacao (Hamdouche, 2015)

1-1-5- Graine ou fève

Les graines ou fèves de cacao sont plus ou moins bombées en forme d'amande, de 2 à 4
cm de long, 1 à 17 cm de large et 0,7 à 1,2 cm d'épaisseur. La graine est entourée d'une pulpe
blanchâtre et collante qui est aigre-douce (figure 2A). Extérieurement, il se compose d'une
coquille rose mince et dure, striée d'une fine membrane brillante translucide et de deux
cotylédons (Figure 2B) (Mossu, 1990).

8
 GÉNÉRALITÉS

(A) Graines de Cacao avec la pulpe (B) Graines de Cacao sans la pulpe

Figure 2 : Graines de cacao avec et sans pulpe (Hamdouche, 2015)

1-2- Différents types de cacao

Le cacaoyer appartient à la superdivision des Spermatophyta, à la division des
Magnoliophyta, à la classe Theobroma. Le genre Theobroma compte plusieurs variétés, dont :
Theobroma bicolor, T. cacao, T. helania, T. grandiflora, T. microcarpa et T. speciosa
(Braudeau 1969 ; Kennedy, 1995).
Le cacaoyer Theobroma cacao L. est très diversifié. Cette diversité repose sur les
caractéristiques morphologiques des gousses ou des graines, qui présentent toutes une grande
variabilité (Hamdouche, 2015). Seules les fleurs changent peu morphologiquement. Les trois
variétés principales sont :"Criollo", "Amazonas Forastero" et "Trinitario". Des hybrides
prolifiques sont croisés à partir de ces trois groupes principaux pour former la majorité des
variétés utilisées dans les plantations.

1-2-1- Variété Criollo

Les cultivars Criollo sont couramment cultivés en raison de leur faible tolérance au
froid et de leur sensibilité aux maladies, aux insectes du cacaoyer et aux conditions
météorologiques défavorables (Figure 3) (Anvoh, 2013). Il produit de grosses fèves aux
cotylédons "clairs" très aromatiques et n'a qu'une légère amertume (Colonges, 2021). La
variété "Criollo" est principalement cultivée dans la zone mésoaméricaine (Mexique,
Nicaragua, Guatemala, Colombie, Venezuela, etc.), l'arc antillais, Madagascar, Sri Lanka,
Indonésie et Samoa. Cette variété ne représente que 1 à 5 % de la production mondiale de
cacao.

9
 GÉNÉRALITÉS

Figure 3 : Cabosse de la variété Criollo (Colonges, 2021)

1-2-2- Variété Forastero

La variété Forastero se localise à l'état sauvage dans la haute Amazonie. Il est très diversifié et
largement utilisé dans les plantations de tous les pays producteurs (Figure 4) (Lima et al., 2011).
Les cabosses de cacao sont vertes et de forme variable. Leurs fèves sont plates et ont des
cotylédons violet foncé qui leur donnent une saveur et une acidité de cacao amer. La variété «
Forastero » est aujourd'hui largement plantée dans les pays producteurs (principalement la Côte
d'Ivoire et le Ghana), fournissant plus de 80 % de la production mondiale de cacao. Les
cacaoyers Forastero sont considérés comme à haut rendement et modérément résistants aux
ravageurs et aux maladies (Lima et al., 2011).

Figure 4 : Cabosse de la variété Forastero (Lima et al., 2011)

10
 GÉNÉRALITÉS

1-2-3- Variété Trinitario

La variété "Trinitario" est un hybride de "Criollo" et "Forastero". Les Trinitario ont des
caractéristiques qui se situent entre les deux groupes. Les arbres de première génération
peuvent être vigoureux et productifs (Hamdouche, 2015).
La couleur des gousses se situe entre Criollo clair et Forastero foncé (Figure 5) (Lachenaud et
al., 1997). Aujourd'hui, les cacaoyers 'Trinitario' sont cultivés dans tous les pays où la variété
"Criollo" était autrefois cultivée, notamment au Mexique et en Amérique centrale. La variété
« Trinitario » représente 10 à 15 % de la production mondiale. Les cacaoyers Trinitario sont
également connus pour être les plus résistants aux maladies (Motamayor et al., 2003).

Figure 5 : Cabosse de la variété trinitario (Lachenaud et al., 1997)

1-3- Variétés hybrides de cacao

De ces trois grandes variétés sont nées par croisement des hybrides fertiles qui
constituent la majorité des cultivars utilisés en plantation.

1-3-1- Cacao Mercedes

Afin de maintenir sa position de leader mondial des fèves de cacao production, le Centre
National de Recherche Agronomique (CNRA) de Côte d’Ivoire a été chargé de renouveler le
verger avec un nouvel hybride. Ce nouvel hybride s'appelle « Cocoa Mercedes » (Figure 6). Il
est sélectionné en raison de ses principales caractéristiques : la précocité de sa

11
 GÉNÉRALITÉS

production (18 mois au lieu de 5 ans pour le cacao traditionnel) et la productivité (3 tonnes par
hectare par an au lieu de 0,3 tonnes pour cacao traditionnel). Il avait été massivement introduit
au cours des cinq (5) dernières années dans les champs par les agriculteurs parce que les graines
étaient gratuites (Carlier, 2016). Les plantes de cacao Mercedes ont été cultivées sous
conditions tropicales à la ferme expérimentale (Station) du Centre National de Recherche
Agronomique (CNRA) de Côte d'Ivoire. Les recherches antérieures ont augmenté la
productivité et amélioré davantage la connaissance de la physicochimie et composition
biologique de ce cacao. La plupart des études ont montré que la composition chimique et
moléculaire du cacao a un intérêt thérapeutique et nutritionnel (Carlier, 2016).

Figure 6 : Cabosse de la variété Mercedes (Carlier, 2016)

1-3-2- Cacao brésilien

La variété brésilienne de cacao, une nouvelle variété largement cultivée et développée
par l'Institut de développement agricole (IRAD) du Cameroun, a permis d'augmenter les
rendements à 2 tonnes/ha, contribuant à la prospérité des planteurs (Figure 7). En effet, cette
variété de semences de seconde génération développée par l'IRAD permet des rendements bien
meilleurs par rapport à la première génération développée dans les années 1970 et 1980
(environ 1 tonne par hectare). Des variétés de semences de cacao de meilleure qualité ont aidé
à résoudre le problème de l’exode rural (Tonye, 2020).

12
 GÉNÉRALITÉS

Figure 7 : Cabosse de la variété Cacao brésilien (Tonye, 2020)

1-3-3- Cacao "Nacional"

Le cacao "Nacional" ne poussent qu'en Equateur. En fait, c'était pratiquement la seule
variété cultivée jusqu'au début du XXe siècle (Loor, 2007). Il possède de grosses gousses très
rugueuses et de très grosses graines violettes (Figure 8) (Tixier, 2013). Le cacao "Nacional" ne
fournit qu'une petite fraction de la production mondiale de cacao. Les fèves des cacaoyers
domestiques ont un arôme délicat et sont des cacaos fins et parfumés très prisés. Cet hybride
est considéré comme la troisième variété de fèves de cacao (Chen-Yen-Su, 2020).

Figure 8 : Cabosse de la variété "Nacional" (Tixier, 2013)

13
 GÉNÉRALITÉS

1-3-4- Variété CCN-51 en Equateur

Le cultivar équatorien CCN-51 est connu comme un croisement entre Nacional et
Trinitario (Figure 9). Le nom "Ariba" a deux définitions : le premier fait référence à l'origine
de la production et le second au caractère aromatique et à la saveur qu'il produit. La fève se
caractérise par son arôme sucré d’où une faible acidité et faible amertume, générant lors de la
mastication un parfum floral comparable à la fleur d'oranger (Chen-Yen-Su, 2020).

Figure 9 : Cabosse de la variété CCN-51 (Chen-Yen-Su, 2020)

1-4- Production mondiale

L'importance du cacao est aujourd'hui si élevée qu'il se classe au troisième rang après le
sucre et le café sur le marché mondial des produits de base. Il existe trois principales régions
productrices de cacao dans le monde : Amérique du Sud, Afrique de l'Ouest et Asie du Sud-Est
(Owusu, 2010).
L'Afrique de l'Ouest produit environ 70 % du cacao mondial (Organisation internationale du
cacao, ICCO, 2019). Ensemble, la Côte d'Ivoire et le Ghana produisent 2,5 millions de tonnes
de cacao commercialisable sur les 4 millions de tonnes mondiales. Cette production mondiale
se répartit entre l'Indonésie (10%), le Nigeria (5%), le Brésil (4%), le Cameroun (5%) et
l'Equateur 4% (ICCO, 2019) (Figure 10).

14
 GÉNÉRALITÉS

La production mondiale est dominée par le cacao de type Forastero (près de 90%). Les Criollos
se font désormais rares (moins de 2,5 de la production mondiale, car c'est un cépage très fragile
mais prisé pour ses qualités aromatiques). Trinitario représente environ 5 % de la production
mondiale (Afoakwa, 2010). Cacao domestique, le cacao Grand Cru ne représente que 2% de la
production mondiale
Selon l'Accord international sur le cacao (2010), 15 pays sont des producteurs qui exportent
exclusivement ou partiellement du cacao aromatisé premium : Colombie, Costa Rica,
Dominique, République dominicaine, Papouasie-Nouvelle-Guinée, Pérou, Sainte-Lucie,
Équateur, Grenade, Indonésie, Jamaïque, Sao Tomé-et-Principe, Trinité-et-Tobago, Venezuela,
Madagascar.

Figure 10 : Principaux pays producteurs de cacao

(Conférences des Nations Unies sur le Commerce et le Développement, CNUCED,Juin
2010)

2- Récolte et étapes post-récolte dans le traitement du cacao

2-1- Récolte des cabosses

Normalement, les cabosses de cacao mûrissent toute l'année et la récolte a lieu presque
toute l'année, mais en pratique la grosse récolte a lieu d'octobre à décembre, principalement en
Afrique de l'Ouest. La récolte des cabosses est principalement effectuée par les hommes.
Séparer le fruit de l'arbre est une tâche laborieuse et délicate qui demande habileté et force
(Bouet et al., 1977). Les gaines autour du tronc sont coupées à la main ou à la machette, et les
gaines autour des branches supérieures nécessitent l'utilisation d'une petite faucille à double
tranchant au bout de la perche (Beckett, 2009).

15
 GÉNÉRALITÉS

La récolte doit être effectuée toutes les 2 à 4 semaines, car une récolte fréquente réduit
les pertes pour les rongeurs, les écureuils, les singes, les papillons de nuit et diverses maladies
de flétrissement des gousses (Bouet et al., 1977). Lorsqu'elles ne sont pas mûres, la biosynthèse
de la graisse et de la pulpe n'est pas complète, de sorte que les cabosses doivent idéalement être
récoltées à maturité. Si les cabosses sont trop mûres, elles commencent à se dessécher et la pulpe
est sous-fermentée (Barel, 2013).

2-2- Etapes post-récoltes dans le traitement du cacao

Le traitement post-récolte du cacao représente l’ensemble des opérations technologiques
permettant d’obtenir le cacao marchand à partir des fèves de cabosses récoltées.

2-2-1- Écabossage
Après la récolte, les cabosses sont soit cassées immédiatement, soit stockées par certains
producteurs pendant plusieurs jours pour permettre aux cabosses immatures d'atteindre leur
pleine maturité (Barel, 2013). Le temps qui s'écoule entre la récolte et l'ouverture des cabosses
est appelé "temps de stockage". Le décorticage consiste à ouvrir les cabosses en les coupant
avec une machette, en frappant les cabosses au sol ou en les frappant avec une massue en bois
(Figure 11) pour ouvrir les cabosses et libérer les graines. L'utilisation d'une machette risque
d'abîmer la graine ou de créer une plaie qui facilite l'entrée des microbes. Pour cette raison, nous
recommandons de frapper le pod avec un gourdin en bois (Barel, 2013).

Figure 11 : Écabossage du cacao (Hamdouche, 2015)

16
 GÉNÉRALITÉS

2-2-2- Fermentation
La fermentation des fèves de cacao est une étape essentielle du traitement post-récolte.
Cela prend 2 à 8 jours, selon la variété de cacao et la méthode de culture (De Vuyst et al., 2010).
Il déclenche une série de réactions biochimiques qui se déroulent au centre de la pulpe et des
cotylédons sous l'action de microorganismes qui contaminent la pulpe et les fèves de cacao lors
de leur ouverture par simple contact des mains des agriculteurs ou par le matériel utilisé. Le
processus de fermentation a trois objectifs principaux. L'action microbienne élimine le mucus,
tue l'embryon, empêche la germination et finalement déclenche des réactions biochimiques dans
les cotylédons pour former les précurseurs de l'arôme (Schwan & Wheals, 2004). Il existe
plusieurs techniques de fermentation, les plus couramment utilisées sont réalisées en tas, caisses
ou paniers (Guehi et al., 2010 ; Papalexandratou et al., 2011a ; Bankoffi et al., 2014).

2-2-2-1- Fermentation en tas

Dans la fermentation en tas, les fèves de cacao sont placées et couvertes sur des feuilles
de bananier (Figure 12). Cette pratique concerne environ 60% du cacao produit. L'avantage de
cette technique est de réduire le nombre d'extractions car elle assure un bon échange gazeux
entre les fèves et le milieu extérieur, mais elle ne peut pas protéger les fèves des changements
de température (Barel, 2013).

Figure 12 : Fermentation en tas du cacao (Hamdouche, 2015)

17
 GÉNÉRALITÉS

2-2-2-2- Fermentation en caisses

La fermentation en caisses se déroule dans des caisses en bois ou en plastique (Figure 13) (Guehi
et al., 2010). La fermentation dans des boîtes en plastique est moins courante car elle produit
un volume plus élevé de fèves sous-fermentées par rapport aux deux autres méthodes
(fermentation en tas et en caisse). Le cacao fermenté en caisses perforées est généralement de
meilleure qualité car il possède une meilleure isolation, indispensable à une fermentation en
douceur (Barel, 2013).

Figure 13 : Fermentation en caisse (Hamdouche, 2015)

2-2-2-3- Fermentation en panier

La fermentation en paniers est une technique traditionnelle très pratiquée au Nigéria
(Hamdouche, 2015). La fermentation est effectuée dans des paniers en fibres végétales
contenant 10 à 150 kg de fèves, posés sur le sol et recouverts de feuilles de bananiers. Le
brassage est réalisé en transvasant les fèves d’un panier à un autre.

2-2-2-4- Fermentation en plate-forme

Bien que la fermentation sur plateforme soit considérée comme une méthode dépassée
(Doyle et al., 2001), elle est encore largement utilisée, par exemple en Afrique de l'Ouest, en
raison de son faible coût (Lainé, 2001). Cette technique se traduit par un taux de fermentation
plus faible, probablement pour cette raison. Il a été historiquement appliqué aux fèves Criollo.
En fait, les fèves Criollo nécessitent une courte période de fermentation (environ 2-3 jours). De
plus, cette technique est considérée comme inadaptée à la variété Forastero car elle nécessite un
temps de fermentation plus long (5-8 jours). La fermentation sur plate-forme favorise la

18
 GÉNÉRALITÉS

croissance de moisissures indésirables et le développement conséquent de saveurs indésirables

(Doyle et al., 2001).

2-2-3- Réactions biochimiques impliquées dans la fermentation

2-2-3-1-Fermentation alcoolique

La fermentation alcoolique a lieu dans les 48 premières heures et l'essentiel du travail

des levures s'effectue. Elle se déroule en anaérobie stricte produit par une pulpe visqueuse qui
réduit la diffusion de l'oxygène à travers la masse des fèves (Arana-Sanchez et al., 2015). Les
sucres de la pulpe sont convertis en alcool éthylique avec dégagement de dioxyde de carbone et
une très forte augmentation de la température. A ce stade, la plupart des précurseurs de
composés aromatiques sont formés.

Figure 14 : Réaction de fermentation alcoolique

2-2-3-2-Fermentation lactique
La fermentation lactique est consécutive à celle de la fermentation alcoolique
principalement sous l’action les bactéries lactiques. Ainsi, la liquéfaction de la pulpe induite par
les bactéries lactiques conduit à une micro-aération, la transformation des sucres en alcools et
l'augmentation du pH créent de nouvelles conditions favorables à leur développement.
Cependant, la fermentation lactique est indésirable dans le cacao à cause de la production
d’acide lactique qui est non-volatile (Mounjouenpou, 2008).

Figure 15 : Réaction de fermentation lactique

2-2-3-3-Fermentation acétique
Le stade aérobie est caractérisé par l'action de bactéries acétiques qui dégagent de la
chaleur et oxydent l'alcool éthylique en acide acétique (Kedjébo, 2016). Ceci est suivi par la
mort embryonnaire, le changement de couleur des cotylédons du violet au brun et la formation
de composés précurseurs d'odeurs spécifiques (Crafack et al., 2014).

19
 GÉNÉRALITÉS

Figure 16 : Réaction de fermentation acétique

2-3- Brassage
Le brassage consiste à développer un système d'aération des fèves de cacao pendant la
fermentation (Figures 14A et 14B) et est un facteur important pour le bon déroulement de celle-
ci. L'aération est également essentielle pour la croissance des microorganismes qui jouent un
rôle important dans la fermentation (Hamdouche, 2015).
Les temps de fermentation sont très variables. Cela dépend du type de cacaoyer, des conditions
climatiques, de la quantité de masse de cacao pendant la fermentation et de la méthode utilisée.
Évaluer le moment opportun pour arrêter la fermentation selon des critères subjectifs :
gonflement des fèves, odeur de touffe, couleur des cotylédons, baisse de température. Tout cela
exige de l'expérience et de la pratique. Cela prend en moyenne 5 à 7 jours.

(A) Brassage à la main (B) Brassage à l’aide d’une planche

Figure 17 : Brassage au cours de la fermentation

2-4- Séchage
Après l'étape de fermentation, les fèves de cacao sont séchées. Le séchage est la
deuxième opération la plus importante dans la transformation post-récolte du cacao (Barel,
2013). Le but du séchage est de réduire la teneur en humidité des fèves fermentées d'environ
50-60 % à 8 % (Djedjro et al., 2008), bloquant ainsi les réactions enzymatiques et empêchant
le développement de moisissures. Cette étape permet donc une bonne conservation du cacao

20
 GÉNÉRALITÉS

commercial obtenu. La température de séchage doit être inférieure à 60°C. Deux modes de
séchage ont été observés dans le monde du cacao qui sont le séchage solaire ou naturel et
séchage artificiel.

2-4-1- Séchage naturel

En général, le séchage au soleil est le procédé le plus couramment utilisé par les
producteurs qui fournissent la quasi-totalité de la production mondiale (Djedjro et al., 2008). Le
temps de séchage moyen est de 8 à 15 jours. Cette opération est réalisée avec divers dispositifs
(bois, tôle, bâche, surfaces adhésives, bitume). Un cacao plus propre peut être obtenu en utilisant
le râtelier comme zone de séchage (Kouakou et al., 2013). L'avantage du séchage à l'air est qu'il
ne nécessite pas d'énergie et facilite l'évaporation de l'acide acétique produit lors de la
fermentation (Barel, 1998). Les réactions biochimiques devraient durer les premiers jours de la
chirurgie. Les inconvénients du séchage au soleil sont la grande surface nécessaire pour étaler
les fèves et la nécessité de mélanger régulièrement la masse. De plus, il est fortement influencé
par le changement climatique de temps à autre. L'humidité reviendra et les fèves moisiront si
des précautions ne sont pas prises.

2-4-2- Séchage artificiel

Le séchage artificiel est effectué dans une étuve ventilée (Hii et al., 2009). N'affecte que
10 % du cacao produit (Barel, 2013). Utilisé dans des conditions climatiques défavorables
(zones humides ou ombragées) ou dans de gros volumes de fèves. Cette méthode est
principalement utilisée dans les coopératives. Les principaux inconvénients sont la rétention
d'acides volatils et une forte consommation d'énergie. En raison de la différence de pression de
vapeur et de diffusion de l'eau et de l'acide acétique observée aux températures de séchage au
four (supérieures à 45 ° C), l'eau s'évapore d'abord des grains et les solutés s'accumulent autour
d'eux, formant une barrière qui empêche l'acide acétique de s'échapper (Jaquet et al., 1980). Ce
type de séchage est la principale cause de la forte acidité volatile du cacao. Gardez à l'esprit que
les séchoirs artificiels sont souvent maltraités. En fait, il est important de laisser le temps aux
grains de sécher. Un séchage trop rapide extraira l'eau trop rapidement pour éliminer
suffisamment d'acide acétique. Plusieurs études comparant le séchage naturel et artificiel ont
conclu que le séchage naturel au soleil donne les meilleurs résultats (Bonaparte et al., 1998 ;
Zahouli et al., 2010).

21
 GÉNÉRALITÉS

2-5- Stockage
Le stockage des fèves sur le site de production est une tâche très délicate parce que la
moindre contamination par des moisissures affecte la qualité finale du produit. Les fèves doivent
être stockées dans de bonnes conditions, à l'abri de la chaleur et de l'humidité de l'air, qui
favorisent la croissance des moisissures et des insectes (Barel, 2013). Certains producteurs
stockent généralement les fèves de cacao sèches dans des sacs de jute de 60 à 65 kg. Celles-ci
sont fermes mais peuvent réabsorber l'humidité. Ils peuvent être empilés les uns sur les autres
et sont également biodégradables. Lorsqu'elles sont stockées correctement, la teneur en
humidité des grains ne doit pas dépasser 6 ou 7 %, et au-dessus de 8 %, il existe un risque de
développement de moisissures. En dessous de 5%, les fèves deviennent très cassantes. La
période de stockage est illimitée et varie selon le fabricant. Les sacs sont expédiés dans des cales
bien ventilées pour éliminer l'air humide (Cook, 1982 ; Beckett, 2009).

3- Microorganismes impliqués dans la fermentation du cacao

Diverses études décrivent la transition des groupes microbiens au cours des différentes
étapes de la fermentation des fèves de cacao (Ardhana & Fleet, 2003 ; Koffi et al., 2013). Cette
étude scientifique a montré que la levure était le premier type de microorganisme (J1 à J2) à se
développer, suivie des bactéries lactiques (LAB), puis des bactéries acétiques (AAB), et des
bactéries aérobies sporulées en fin de fermentation. Les modifications microbiennes au cours
de la fermentation reflètent l'évolution des propriétés du milieu de fermentation et de la
composition chimique du cacao (pulpe et fèves). En effet, le relais précité du microbiote ne se
produit qu'avec une aération adéquate, entraînant des profils de température et de pH (4,5)
propices au développement de différentes familles microbiennes (Biehl et al., 1989).

3-1- Levures
La fermentation alcoolique a lieu durant les deux premiers jours de fermentation. La
levure est le microorganisme dominant. Elles libèrent du dioxyde de carbone pour convertir les
sucres (saccharose, glucose et/ou fructose) en alcool éthylique. La réaction a lieu dans des
conditions anaérobies (en raison de la densité de la pulpe qui empêche l'air de pénétrer entre les
fèves) et en conditions acides (en raison de la présence d'acide citrique dans la pulpe, pH = 3,5).
Certaines levures ont une bonne activité pectinolytique qui hydrolyse le mucilage de la fève,
provoquant la liquéfaction de la pulpe (Schwan et al., 1997 ; Crafack et al., 2013). A ce stade,
la quantité maximale de levure est de 6 à 8 log UFC/g de cacao (Nielsen et al., 2007 ; Lagunes-
Gálvez et al., 2007). Cette fermentation alcoolique est modérément exothermique (93,3 kJ, la

22
 GÉNÉRALITÉS

température monte à 35-40 °C après 48 heures) et le pH légèrement élevé, probablement en

raison de la consommation d'acide citrique par la levure. Des études menées sur des fèves
fermentées ont montré que les levures Hanseniaspora sont le plus souvent isolées au cours des
premières étapes de la fermentation (Ardhana & Fleet, 2003 ; Nielsen et al., 2005 ; Lagunes-
Gálvez et al., 2007 ; Nielsen et al., 2007, 2008 ; de Melo Pereira et al., 2013). Dans ce genre,
Hanseniaspora guilliermondii est l'espèce la plus communément isolée du cacao fermenté au
Ghana (Nielsen et al., 2005, 2007 et 2008). Hanseniaspora opuntiae a également été isolée
(Papalexandratou et al., 2013). Saccharomyces cerivisiae est également impliqué dans la
fermentation du cacao de diverses régions : Indonésie (Ardhana & Fleet, 2003), Brésil (de Melo
Pereira et al., 2013), République dominicaine (Lagunes-Gálvez et al., 2007). De plus, il a été
rapporté que des espèces telles que Kloeckera apis, Candida tropicalis, Candida krusei,
Candida zemplinina, Candida diversa, Issatchenkia orientalis et Pichia membranifaciens
jouent un rôle dans la fermentation alcoolique (Ardhana & Fleet, 2003 ; Nielsen et al., 2005 ;
Lagunes-Gálvez et al., 2007 ; Nielsen et al., 2007, 2008 ; de Melo Pereira et al., 2013). Aussi,
Koffi et al. (2013) ont noté que la croissance des levures dans les fermentations de cacao en
Côte d'Ivoire effectuées sur des feuilles de bananier était 17 fois plus élevée que dans les
fermentations en bâche et en boîte.

3- 2- Bactéries lactiques
Les conditions micro-aérobies, le milieu acide (pH = 4) et la disponibilité du substrat
favorisent le développement de lactobacilles principalement, atteignant une croissance de 7 à
7,8 log UFC/g de fèves de cacao (Nielsen et al., 2007 ; Lagunes Galvez et al., 2007). Des études
ont montré que les bactéries lactiques les plus courantes trouvées dans le matériel végétal sont
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum et Leuconostoc pseudomesenteroides
(Camu et al., 2007 ; Lefeber et al., 2011 ; Papalexandratou et al., 2011a, 2011b et 2013).
D'autres espèces de bactéries lactiques des genres Fructobacillus, Enterococcus et Weissella
ont également été détectées dans le cacao fermenté (Camu et al., 2007 ; Lefeber et al., 2011 ;
Papalexandratou et al., 2011b).
Les bactéries lactiques convertissent l'acide citrique et les sucres de la pulpe en acide lactique
et, dans certains cas, en acide acétique et en éthanol par fermentation hétérolactique. Du fait de
sa très faible volatilité, l'acide lactique synthétisé pénètre à l'intérieur de la fève et y reste en
permanence. Par conséquent, l'acidité des cotylédons est augmentée, produisant des saveurs
désagréables et des fèves finales de mauvaise qualité (Passos et al., 1984). Ce type de
fermentation est donc indésirable. Dans le cacao de Côte d'Ivoire, la croissance des lactobacilles

23
 GÉNÉRALITÉS

pendant la fermentation de la bâche (8,9.109 UFC/g) était significativement plus élevée que
pendant la fermentation en boîte (1,8.108 UFC/g) et la fermentation des feuilles de bananier
(1,5.107 UFC/g ) (Kofi et al., 2013).

3-3- Bactéries acétiques

Les bactéries acétiques transforment l'éthanol en acide acétique par oxydation. Cette
réaction très exothermique (496 kJ par molécule d'éthanol convertie) s'accompagne d'une
montée rapide en température (jusqu'à 50 °C). La charge microbienne maximale d'Acetobacter
des fèves de cacao varie entre 7,8 et 8 log UFC/g (Lagunes-Gálvez et al., 2007 ; Nielsen et al.,
2007). L'acide acétique produit dans ces conditions aérobies est un métabolite important dans
le processus de fermentation des fèves de cacao. Cet acide pénètre dans les fèves et provoque
la mort de l'embryon et la destruction des cellules internes en raison des températures élevées
générées par l'oxydation de l'alcool. Cela marque la fin de la fermentation et initie des
changements biochimiques dans la fève qui conduisent à la formation de molécules précurseurs
de la saveur caractéristique du cacao (Nielsen et al., 2005 ; Camu et al., 2007). Ces propriétés
se développent lors du séchage et de la torréfaction. La fève entière doit être mélangée
régulièrement pour favoriser l'aération et obtenir une fermentation homogène. Le rythme le plus
couramment employé est de brasser après 24 heures de fermentation et ensuite toutes les 48
heures.

Les bactéries d'acide acétique les plus courantes trouvées dans les fèves fermentées
appartiennent au genre Acetobacter, avec une prédominance pour A. pasteurianus. D’autres
espèces de Acetobacter (A. syzygii, A. ghanensis, A. senegalensis A. tropicalis) constituent une
communauté d'acétobactéries couramment identifiées sur le cacaoyer (Camu et al., 2007 ;
Papalexandratou et al., 2011a, 2011b, 2013). Papalexandratou et al. (2011b) ont souligné la
présence de A. senegalensis au début de la fermentation, tandis que Lefeber et al. (2011) ont
montré que les bactéries acétiques n'étaient présentes qu'en fin de fermentation. Selon Nielsen
et al. (2007), A. syzygii, A. pasteurianus et A. tropicalis prédominent tout au long de la
fermentation. En Côte d'Ivoire, la fermentation en caisse et bâche a permis une meilleure
croissance de Acetobacter, avec des valeurs maximales de 8.106 et 44.104 UFC/g de fèves (Koffi
et al., 2013).

3-4- Moisissures et bactéries du genre Bacillus

Au fur et à mesure que la fermentation se prolonge, les conditions du milieu de
fermentation évoluent vers l'épuisement du substrat microbien et l'aération reste importante. De

24
 GÉNÉRALITÉS

nouvelles populations de bactéries apparaissent alors, notamment des bactéries sporulées, qui
produisent un certain nombre de molécules qui affectent l'arôme final. Ces bactéries
thermophiles ont peu de chances de se développer au début de la fermentation. En revanche,
après les dernières étapes de la fermentation (augmentation du pH et de la température,
modifications de la teneur en sucre et de la disponibilité en oxygène), ils peuvent devenir
dominants dans la flore des fèves.
Les espèces observées dans le cacao fermenté comprennent Bacillus cereus, Bacillus
megaterium et Bacillus coagulans. Cependant, leur rôle dans les processus de fermentation est
inconnu (Ardhana & Fleet, 2003). Bacillus licheniformis se trouve dans les dernières étapes de
la fermentation du cacao au Ghana (Nielsen et al., 2007). Des bactéries non sporulées sont
également présentes dans la fermentation du cacao, comme les entérobactéries : Tatumella,
Erwinia et Pantoea sp (Papalexandratou et al., 2011a ; Lefeber et al., 2011).

4- Jus de mucilage de cacao

4-1- Transformation de la pulpe en jus

Les cabosses mûres de cacao contiennent normalement de 20 à 40 graines (fèves)
enveloppées dans une pulpe mucilagineuse. Après la récolte, ces cabosses sont ouvertes, les
fèves et la pulpe adhérente récupérées dans des sacs. Le jus brut de pulpe peut être ensuite
obtenu par pressage ou par torsion de ces sacs ou par entassement des fèves (Figure 15). A partir
de 10 kg de fèves fraîches, on peut obtenir approximativement jusqu`à 1,1 l/kg de jus selon ces
procédés. Le jus s'écoulant doit être recueilli dans un récipient propre. En raison de sa teneur en
acide, il ne doit pas rentrer en contact avec des objets métalliques. Pour la conservation, il faut
au mieux utiliser les récipients en plastique (Baensch, 2000).

(B) Dispositif vue de l’intérieur (A) Dispositif vue de l’extérieur

Figure 18 : Dispositif de collecte de jus de cacao par entassement des fèves (Baensch, 2000)

25
 GÉNÉRALITÉS

D'un point de vue biologique, le jus de cacao est extrait de la pulpe mucilagineuse riche
en pectine qui enrobe les fèves de cacao fraîches par l'action des enzymes pectinolytiques de la
levure (Figure 16) (Barel, 2013). Ce jus blanchâtre contient des sucres tels que le glucose, le
fructose et le saccharose (Made & Graham, 2003 ; Sandra et al., 2007). En raison de sa forte
teneur en sucres, notamment en glucose (56,6 mg/g) et en fructose (88,8 mg/g), et de sa richesse
en micronutriments (Sandra et al., 2007), le jus de cacao est favorable à la croissance de
plusieurs microorganismes. Des études scientifiques menées à cet effet ont prouvé que la pulpe
de cacao contient des microorganismes d'origines diverses. Certains microorganismes peuvent
être présents sur les fèves à l’instar de levures trouvées dans le raisin. La charge varie autour de
4,4.106 UFC/ml (Elena et al., 2007). Il s’agit de Saccharomyces cerevisiae (Rosslyn et al., 2003
; Elena et al., 2007) et d’autres bactéries tels que Lactobacillus fermentum (Nielsen et al., 2007
; Camu et al., 2007) et des moisissures.

Figure 19 : Production du jus de mucilage de cacao par activité pectinolytique des levures
(Barel, 2013)

4-2- Réactions biochimiques subies par le jus de mucilage de cacao

Une fois produit, le jus de mucilage est sujet à plusieurs réactions biochimiques à savoir
la fermentation alcoolique réalisée principalement par les levures avec pour métabolite principal
l’éthanol. L’éthanol produit est ensuite transformé en acide acétique par l’action des bactéries
acétiques en conditions aérobies (Figures 17) (Barel, 2013). Par ailleurs, le taux relativement
élevé d’éthanol dans le jus de mucilage pourrait supposer la présence de souches de levures
résistant à l’éthanol (Cocolin et al., 2016). En effet, ces auteurs ont rapporté que 38 % et 54 %
du total des isolats issus de la fermentation des fèves de fermentation étaient capables de croître
à 8, 10 et 12 % (v/v) d'éthanol, respectivement, S. cerevisiae affichait la plus forte croissance à
12 % d'éthanol.

26
 GÉNÉRALITÉS

Figure 20 : Fermentation acétique se produisant dans le jus de mucilage (Barel, 2013)

4-3- Composition biochimique du jus de mucilage de cacao

Le jus de mucilage avec un pH compris entre 3,5 et 4 est composé principalement d’eau
et de sucres (glucose et fructose). Il renferme également de l’acide citrique et de la pectine
(Tableau I) (Pontillon, 1998 ; Baensch, 2000).

Tableau I: Composition biochimique du jus de mucilage de cacao

Composant Concentration (%)

Eau 80
Sucres (Glucose/Fructose) 12-15
Acide citrique 5-7
Pectine 5-7

Source : Baensch, (2000)

4-4- Valeur nutritionnelle du jus de mucilage de cacao

Les principaux constituants du jus de mucilage sont l’eau, les glucides, protides, lipides,
minéraux et vitamines (Tableau II).
Le jus de mucilage de cacao doit son importance nutritionnelle à sa teneur en vitamines
et minéraux. Le taux élevé de sucres dans le jus, composants majoritaires et sources d’énergie
rapide, lui confère une assez bonne valeur énergétique (Anvoh, 2013).

27
 GÉNÉRALITÉS

Tableau II: Valeur nutritionnelle du jus de mucilage de cacao

Composant Concentration
Saccharose 214 g/L
Glucose 3,2 g/L
Protéines 7,2 g/L
Lipides 5,5 g/L
Sodium 30,5 mg/L
Magnésium 82 mg/L
Acide citrique 9,1 mg/L
Acide acétique 2.3 mg/L
Acide malique 1,2 mg/L
Vitamine C 18 mg/L

Source : (Anvoh, 2013)

4-5- Composés phénoliques de jus de mucilage de cacao

A ce jour, il n’existe pratiquement pas aucune donnée sur les composés phénoliques du
jus de mucilage de cacao. Toutefois, les composés phénoliques présents dans le jus de mucilage
proviendraient probablement des fèves.
Selon Niemenak et al. (2004), les fèves de cacao sont riches en polyphénols en particulier les
flavonoïdes où ils représentent 12 à 18 % du poids sec d’une fève en bonne santé. Ils ont révélé
également que toutes les fèves de cacao, quelles que soient leur origine génétique et le
processus de fermentation utilisé, contiennent qualitativement les mêmes composés
phénoliques dont les principaux sont l’épicatéchine qui est présent avec 2 à 4 % du poids sec,
la catéchine, la quercétine. L’épicatéchine (flavonoïdes) a un effet bénéfique pour la santé en
(Figure 18). Ce composé joue un rôle d’anti-oxydant dans la lutte contre les radicaux libres de
l’oxygène. Il fait diminuer le taux sanguin de LDL-Cholestérol (Mathur et al., 2002 ; Carl et
al., 2005) tout en empêchant son oxydation (Kondo et al.,1996 ; Osokabe et al., 2002).
L’épicatéchine inhibe les agrégations plaquettaires qui conduisent à la formation de thrombus
au niveau des artères coronariennes (Rein, 2000 ; Murphy et al.,2003). Le cacao est plus riche
en polyphénols que le café et le thé (Lee et al., 2003).
Les flavonoïdes sont également impliqués dans la défense immunitaire. En effet,
plusieurs auteurs notamment Sanbongi et al. (1997) ont montré que le cacao a un effet
bénéfique sur le système immunitaire. Thomas et al. (2007) ont étudié in vitro l’effet des
flavonoïdes et les procyanidines sur les monocytes, les lymphocytes T CD4 et les lymphocytes
T CD8 contenus dans la poudre de cacao. Ces auteurs ont conclu que les polymères ont un
pouvoir de stimulation à la fois sur le système immunitaire inné et sur les réactions primitives
de l’immunité adaptative. Wan et al. (2001) et Holt (2002) ont aussi montré une augmentation

28
 GÉNÉRALITÉS

des procyanidines dans le plasma humain après consommation de flavonoïdes du cacao. Selon
Mao et al. (2003), ces molécules ont un effet favorable sur la synthèse et la sécrétion
d’interleukines 1β dans les cellules mononucléaires périphériques du sang, lesquels ont une
activité antivirale et anti proliférative.
Selon les travaux de recherches scientifiques de Levy et al. (1999) et de Davey et al. (2000),
l’addition de l’interleukine-2 (IL-2) induisait une augmentation significative du nombre de
lymphocytes CD4 circulants. Aussi ces auteurs ont-ils montré que des patients traités par IL-2
pendant au moins 3 ans ont une réponse immunologique soutenue.

De ce qui précède, les produits à bases de cacao pourraient être recommandés dans la prise en
charge nutritionnelle des personnes vivant avec le VIH sous thérapie avec un taux de
lymphocytes CD4 inférieur à 350 copies/mm3(Hulgan et al., 2005).
Par ailleurs, d’un point de vue quantitatif, les concentrations en polyphénols sont fonction de
la variété. En effet, Niemenak et al. (2004) ont obtenues des valeurs allant de 67 à 149,2 mg
de polyphénols par gramme de fèves fraîches. Ces dernières ont subi le même processus de
fermentation pourtant toutes ne présentent pas les mêmes variations : pour certaines variétés,
la quantité de polyphénols augmentait de 25%, pour d’autres cette valeur diminuait de l’ordre
de 14 à 25 %, enfin pour les certains, les quantités restaient constantes. Ces différences
pourraient être attribuées aux différentes conditions de culture, le climat (l’intensité de la
lumière ou l’humidité), la position de la cabosse sur l’arbre, la zone géographique ou l’origine
du cacao. Des grands pays producteurs de cacao, la Côte d’Ivoire occupe la 3 ième place en
termes de richesse de ses fèves en polyphénols derrière l’Equateur et le Brésil (Figure 19).

Figure 21 : Structure de l’épicatéchine

29
 GÉNÉRALITÉS

Polyphénols

Figure 22 : Polyphénols en fonction de l’origine du cacao (Bloch, 2014)

5- Valorisation des sous-produits du cacao

Le processus de fermentation des fèves de cacao comporte plusieurs étapes, générant
des sous-produits souvent abandonnés en tant que déchets à savoir les coques et le jus de
mucilage.

5-1- Coques

La coque de cacao représente 52 à 56 % du poids d’une cabosse mûre. Plusieurs travaux

menés sur la composition chimique des coques de cabosse ont montré que la coque est riche
en énergie brute (4150 kcal/kg), en cellulose (18,6 %) et en potassium (2,5 %). La coque de
cacao connaît des utilisations diverses qui vont de l’abandon pur et simple à la fabrication de
savon grâce à sa teneur en potassium en passant par l’alimentation animale et la production
d’engrais (Pitcholo, 1990). En effet, la grande partie de la coque est abandonnée dans les
champs après les opérations d’écabossage. Les coques pourrissent et fournissent ainsi des
engrais potassiques aux cacaoyers. Mais selon les agriculteurs, les engrais à base de coque
favorisent l’installation de la pourriture brune des cabosses, maladie très répandue en cacao-
culture. De plus en plus, les coques de cabosses sont ramassées et servent de matériaux de
chauffage après séchage. La cendre est ensuite recueillie pour la fabrication de potasse, puis de
savon après saponification (Pitcholo, 1990). En alimentation animale, les coques de cabosses
sont utilisées comme complément dans l’alimentation des porcins au brésil, du bétail au
Nigéria, des volailles au Sénégal où elles ont contribué aux performances de croissance (Opeke,
1982 ; Pitcholo, 1990). En effet, les coques évidées subissent un séchage solaire, puis sont
moulues à l’aide d’un moulin ou d’un mortier. La poudre obtenue est ensuite additionnée

30
 GÉNÉRALITÉS

à une céréale (maïs) avec un ratio de 1:3 de poudre de coque et 2:3 de poudre de maïs (Figure
20) (Adabe & Ngo-Samnick, 2000).

Figure 23 : Production d’aliment pour bétail à partir de coques de cacao (Adabe & Ngo-
Samnick, 2000)

5-2- Jus de mucilage de cacao

Le jus de cacao est extrait de la pulpe mucilagineuse qui enrobe les fèves fraîches de
cacao. Jusqu’à ce jour malheureusement, très peu de travaux ont été consacrés au jus de cacao.
En Côte d’Ivoire, seul Anvoh (2013) a entrepris des travaux scientifiques de valorisation du
jus de mucilage de cacao à travers la transformation du jus de mucilage de cacao en pâte à
tartiner, en marmelade et en vinaigre. Par ailleurs, le jus de mucilage, utilisé comme
complément alimentaire dans l'élevage de lapins au Nigéria (Ayindé et al., 2010) et dans la
production de pectine en Amérique latine (Bazarte et al., 2008). Aujourd’hui aucune étude n’a
été encore consacrée à la valorisation biotechnologique, nutritionnelle et fonctionnelle du jus
de mucilage de cacao.

6- Bioéthanol

6-1- Définition et propriétés

L’éthanol est aussi connu sous le nom d’alcool éthylique. Sa formule chimique est
CH3CH2OH. Le bioéthanol, ou éthanol biosourcé, est de l’éthanol produit à partir de biomasse
fermentée. C’est le même éthanol qui est retrouvé dans les boissons alcoolisées. De nos jours,
le bioéthanol est le biocarburant liquide le plus utilisé au monde (Cruz et al., 2014). Il est
principalement produit par fermentation microbienne de sucre ou d’amidon à partir de diverses
matières premières, y compris la canne à sucre, la betterave à sucre, le maïs, les céréales, les
déchets agricoles, les déchets forestiers, les déchets municipaux, les fumiers de bétail, etc.
Lorsque les sucres sont présents sous forme de polysaccharides, un processus d’hydrolyse
(acide ou enzymatique) est généralement utilisé pour la délignification et la formation de sucres

31
 GÉNÉRALITÉS

fermentescibles avant la fermentation. À l’aide de microorganismes (par exemple, la levure),

les sucres hydrolysés (par exemple, le glucose) sont convertis en éthanol (bioéthanol) pendant
le processus de fermentation. La distillation et la déshydratation sont ensuite utilisées pour
produire un alcool sans indice d’octane élevé, également appelé éthanol déshydraté ou éthanol
anhydre (Champagne, 2008 ; Escobar et al., 2009). Le bioéthanol produit peut-être directement
utiliser comme substitut de l’essence dans les moteurs. Le tableau III illustre les propriétés
physico-chimiques de l’essence et de l’éthanol (bioéthanol). Il a été observé que l’éthanol a un
pouvoir calorifique inférieur (21,1 MJ/L) à celui de l’essence (30 – 33 MJ/L), donc plus
d’éthanol est nécessaire pour obtenir le même rendement. Cependant, l’indice d’octane plus
élevé de l’éthanol permet d’utiliser un taux de compression du moteur plus élevé, ce qui conduit
à une efficacité thermique améliorée et à une puissance accrue, réduisant ainsi quelque peu la
différence de consommation de carburant (Cruz et al., 2014). Il a également été observé qu’il
existe des différences importantes entre les autres propriétés des deux carburants, par exemple,
viscosité, gravité spécifique, point de congélation, point d’ébullition, point d’éclair, pression
de vapeur, limite d’inflammabilité, température d’auto-inflammation, richesse nécessaire du
mélange air-carburant, etc.

32
 GÉNÉRALITÉS

Tableau III: Propriétés physico-chimiques de l’essence et de l’éthanol

Propriétés Essence Éthanol

Formule C4 à C12 C2H5OH
Poids moléculaire 100-105 46,07
Densité à 15 °C (kg/L) 0,69-0,79 0,79
Densité (densité relative) à 15 °C 91 106-110
Point de congélation (°C) - 40 - 114
Point d’ébullition (°C) 27-225 78
Pression de vapeur à 38 °C (kPa) 48-103 15,9
Chaleur spécifique (kJ/kg/K) 2,0 2,4
Viscosité à 20 ◦C (mPa.s) 0,37- 0,44 1,19
Pouvoir calorifique inférieur (kJ/L) 30-33 21,1
Point d’éclair (°C) - 43 13
Température d’auto-inflammation (°C) 257 423
Limite inférieure d’inflammabilité (%vol) 1,4 4,3
Limite supérieure d’inflammabilité (%vol) 7,6 19,0
Rapport stœchiométrique air-carburant 14,7 9,0
Indice d’octane de recherche 88-100 108,6
Indice d’octane moteur 80-90 89,7
Source : Ruan et al. (2019)

6-2- Production mondiale de bioéthanol

L’Amérique du Nord était le premier producteur mondial d’éthanol en 2019 et

représentait près de la moitié de la production mondiale, suivie de l’Amérique latine (Figure
21). Le continent américain concentrait à lui seul 79 % de la production mondiale de ce type
de biocarburants grâce aux États-Unis et au Brésil. Le reste du monde dont l’Afrique fait partie
ne produit que seulement 1 % ; ce qui reste très faible témoignant ainsi la dépendance des pays
Africains aux énergies fossiles ("Perspectives Agricoles de l’OCDE et de la FAO 2020-2029",
données extraites le 14 mars 2021)
.

33
 GÉNÉRALITÉS

Figure 24 : Production mondiale d’éthanol par zone géographique en 2019

(Source : "Perspectives Agricoles de l’OCDE et de la FAO 2020-2029", données extraites le
14 mars 2021)

6-3 Matières premières utilisées pour la production du bioéthanol pour les biocarburants
Les biocarburants restaient encore largement produits à partir de matières agricoles de
première génération en 2020. Le maïs a servi à fabriquer les deux tiers de la production
mondiale d’éthanol, devant la canne à sucre (26 %) (Figure 22). Les huiles végétales
représentaient près des trois quarts de la production de biodiesels et des huiles végétales
hydrotraitées (HVH), avec une part importante d’huile de colza. D’après le dernier rapport de
l’OCDE et la FAO, « les biocarburants avancés issus de produits cellulosiques (tels résidus de
récolte, cultures dédiées à la production énergétique ou bois) occupent une place marginale
dans la production totale de biocarburants ». Les autres céréales sont représentées par manioc,
betteraves sucrières, sorgho etc.

Figure 25 : Matières premières utilisées pour la production d’éthanol pour les biocarburants
(Source : Perspectives Agricoles de l’OCDE et de la FAO 2020-2029)

34
 GÉNÉRALITÉS

6-4- Modes de consommation du bioéthanol

En général, le bioéthanol est utilisé dans 3 secteurs d’activités à savoir : les carburants,
les boissons et en industries.

6-4-1- Applications industrielles

Le bioéthanol occupe une place de choix dans les industries chimiques et para
chimiques au même titre que l’éthanol produit par voie chimique. Il est utilisé principalement
dans les produits pharmaceutiques, cosmétiques et articles de toilette, détergents et produits de
nettoyage, les encres d’imprimerie, les peintures et revêtements, le lavage d’écran et dégivreurs
pour l’industrie automobile, les biocides et autres utilisations médicales et dans la production
d’importants intermédiaires chimiques, comme pour les polymères et les plastiques (Alio,
2021).

6-4-2- Consommation pour le déplacement

L’usage du bioéthanol pour la mobilité s’est généralisé pour les moteurs essence en
France et dans beaucoup de pays, et ce parce que le bioéthanol est un biocarburant que l’on
incorpore à l’essence. Ainsi, l’éthanol biosourcé est majoritairement destiné à être utilisé
comme carburant, soit environ 66 % de la consommation de l’éthanol en France selon le
Syndicat National des Producteurs d’Alcool Agricole (Alio, 2021). Cet éthanol doit être
anhydre (moins de 1 % d’eau) et il est dénaturé (rendu impropre à la consommation humaine)
pour une utilisation pour le transport, en ajoutant 2 à 5 % en volume de dérivés pétroliers,
généralement des pentanes. Cet éthanol dénaturé est principalement utilisé en mélange à faible
concentration avec de l’essence moteur pour son apport en oxygène ou comme activateur
(booster) d’octane. À des concentrations élevées, il est utilisé pour alimenter des véhicules à
carburant alternatif spécialement conçus pour son utilisation. Ainsi, différentes flottes de
véhicules à éthanol s’inscrivant dans une conception évolutive de la mobilité (moins carbonée
et plus diversifiée), sont déployées depuis quelques années. Toujours selon le Syndicat
National des Producteurs d’Alcool Agricole en France l’utilisation de bioéthanol comme
carburant permet de réduire de près de 50 % les émissions de gaz à effet de serre par rapport
aux carburants conventionnels fossiles, ce qui représente un atout non négligeable en termes
environnementaux. Sur le plan économique, le bioéthanol présente un autre avantage majeur :
il est bien moins cher à la pompe que l’essence, même s’il faut bien avouer que cela provient
de subventions à la production ou de taxes réduites à la vente. Dans un contexte de hausse à
long terme du prix des produits pétroliers liés à l’épuisement des ressources, le bioéthanol offre
une des meilleures solutions de repli puisque son prix est jusqu’à 75 % plus bas que celui des

35
 GÉNÉRALITÉS

autres carburants. Cependant, un désavantage réside dans une légère surconsommation du

véhicule par rapport à l’essence sans plomb (Alio, 2021).

7- Pectinases

Issu de la dégradation des matériaux pectiques enrobant les fèves par action de levures
pectinolytiques, le jus de mucilage de cacao pourraient contenir ces levures productrices de
pectinases.

7-1-Différents groupes de pectinases

L’hydrolyse des pectines est catalysée par un groupe d’enzymes appelées pectinases.
Les enzymes pectinolytiques utilisées se divisent en deux groupes : les enzymes déestérifiantes
(Pectines méthylestérases : EC 3.1.1.11), les enzymes dépolymérisantes (polygalacturonases :
EC 3.2.1.15 et les pectines lyases : EC 4.2.2.10). Cette classification est fonction du pH
optimum d’hydrolyse, de l’activité catalytique, de la spécificité du substrat, des besoins en
métaux et du mécanisme réactionnel (Favela-Torres et al., 2006). La différence la plus évidente
entre ces enzymes est la présence ou l’absence de groupements méthyles (Mehri-Kamoun,
2001). Les pectinases catalysent l'hydrolyse de liaisons glycosidiques à l'intérieur des polymères
de pectine. Différentes pectinases ont différentes préférences pour les formes méthylées et non-
méthylées de la pectine (Gagnon, 2009). Les pectinases constituent l’unique groupe des
enzymes qui catalysent la dégradation des polymères pectiques présents dans la paroi cellulaire
des plantes (Forgarty & Kelly, 1983).

7-1-1- Pectines méthylestérases

Les pectines méthylestérases (EC 3.1.1.11) sont des enzymes pectinolytiques qui
catalysent l’hydrolyse des liaisons esters méthyliques de pectines hautement méthyles (PHM)
entraînant la libération de méthanol et la formation d’acide polygalacturonique (Figure 23)
(Jayani et al., 2005). Elles hydrolysent principalement les groupes esters adjacents à un groupe
carboxyle libre et enlèvent ainsi les groupes méthyles de la chaîne les uns après les autres dans
une direction donnée (Sakai et al., 1993). Elles agissent par récurrence le long de la chaîne
pectique selon un mécanisme mono chaîne multiple attaque (Jeantet et al., 2007).

36
 GÉNÉRALITÉS

Figure 26 : Déméthylestérification des pectines par les PME (Micheli et al., 2001 ; Ridley et
al., 2001)

7-1-2- Polygalacturonases
Les polygalacturonases (PG) sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse des liaisons
glycosidiques α-(1-4) des acides polygalacturoniques (pectines acides). Les endo-
polygalacturonases (EC 3.2.1.15) libèrent des mono, di, triacides galacturoniques par un
mécanisme d’attaque « multi-chaîne », dans lequel les mono-, di-, et trimères s’accumulent
seulement après hydrolyse des produits initiaux de dépolymérisation. Pour les pectines
hautement méthylées (HM), l’hydrolyse n’a lieu qu’au niveau des résidus d’acides
galacturoniques non méthylés. Pendant l'hydrolyse, la configuration anomérique change de α à
β : ce qui fait que cette enzyme fonctionne par inversion (Biely et al., 1996). Cependant, lorsque
le degré de méthylation augmente, la vitesse d’hydrolyse de l’enzyme diminue (Sakai et al.,
1993). Les endo-polygalacturonases hydrolysent le substrat de façon aléatoire à l'intérieur du
polymère, tandis que les exo polygalacturonases font l'hydrolyse à partir de l’extrémité non-
réductrice du polymère libérant des acides galacturoniques (EC 3.2.1.67) ou des acides
digalacturoniques (EC 3.2.1.82) (Gainvors et al., 2000). La présence de groupements méthyles
et de rhamnose bloque leur action (Brudieux, 2007). La figure 24 montre l'hydrolyse de l'acide
polygalacturonique par une endo-polygalacturonase (endo-PG), et pour chacune des hydrolyses,
la longueur du polymère diminue et il y a formation d'un groupe réducteur à une des extrémités.

37
 GÉNÉRALITÉS

Figure 27 : Action des polygalacturonases sur l’acide polygalacturonique (Kester et al., 1996)

7-1-3-Pectines lyases
Les pectines lyases (PL) agissent sur les pectines, les oligomères et les polymères
d’acide galacturonique en catalysant la rupture entre deux motifs d’acide galacturonique par un
mécanisme de β-élimination (Jeantet et al., 2007 ; Combo et al., 2011). Les PL (EC 4.2.2.10)
hydrolysent les liaisons entre residus d’acides galacturoniques méthoxylés (Figure 25). Leur
action dépolymérisante entraîne la libération d’uronides insaturés et d’oligomères de petites
tailles. Au cours de la formation du pectate, il y a une diminution du pH entraînant la libération
des ions hydroniums (H3O+). L’hydrolyse d’une micromole de groupe ester nécessite la
libération d’une micromole de H3O+ (Gonzalez & Rosso, 2011). Les lyases sont les seules
dépolymérases capables de dégrader les pectines hautement méthylées (HM) sans action
préalable d’autres enzymes (Jayani et al., 2005, Dixit et al., 2013). Les pectines lyases ont pour
substrat préférentiel la pectine et agissent selon deux modes : les endopectines-lyases (endo PL,
E.C. 4.2.2.10) agissent par β-élimination et ont une préférence pour les pectines HM. Leur
affinité pour les pectines diminue avec le degré de méthylation (DM) du substrat et sont
inactives sur l’acide polygalacturonique (APG). Elles coupent la liaison soit entre deux acides
galacturoniques (AG) méthoxylés, ou entre un résidu AG libre et un résidu AG méthoxylé
(Lemberg et al., 2000). Quant aux exopectines-lyases, elles agissent sur les pectines fortement
estérifiées, elles ont été isolées d’Aspergillus niger (Sutherland, 1995).

38
 GÉNÉRALITÉS

PL

Figure 28 : Réaction catalysée par les pectines lyases (PL) (Jeantet et al., 2007)

7-2- Pectinases d’origine microbienne

Les pectines méthylestérases, les polygalacturonases et les pectines lyases sont produites
et sécrétées par divers microorganismes tels que certaines bactéries, levures et champignons.
Les champignons comme Aspergillus japonicus, Penicillium paxilli, Pichia pinus,Aspergillus
flavus, Stereum purpureum et Botrytis cinerea produisent et sécrètent diverses pectine
méthylestérase et polygalacturonase (Kars et al., 2005 ; Gonzalez et al., 2011 ; Combo et al.,
2012). La plupart des pectines lyases ont été produites par des microorganismes, tels que
Aspergillus, Penicillium, Fusarium… (Albersheim, 1966 ; Yandav & Shastri, 2005 ; Pedrolli &
Carmona, 2014). Quelques levures produisent aussi des polygalacturonases comme certaines
souches de Saccharomyces cerevisiae (Gainvors et al., 2000 ; Blanco et al., 2002 ; Sieiro et al.,
2003 ; Radoi et al., 2005) et d'autres levures comme Kluyveromyces marxianus (Siekstele et al.,
1999 ; Jia & Wheals 2000) et Kluyveromyces fragilis (Sakai et al., 1984). La plupart des
préparations commerciales de pectinases sont d’origine fongique. Aspergillus niger est la source
fongique la plus communément utilisée pour la production industrielle d’enzymes
pectinolytiques (Jayani et al., 2005).

39
 DEUXIÈME PARTIE
MATÉRIEL & MÉTHODES
 MATERIEL ET METHODES

1- Matériel

1-1-Matériel végétal
Le matériel biologique de cette étude est composé de jus de mucilage de cacao
(Theobroma cacao) provenant de cabosses de cacaco (Figures 26 et 27). Les jus de mucilage de
cacao ont été prélevés dans les champs de cacao de zones rurales chez cinq (05) producteurs de
cacao dans différents sites . Ils ont été obtenus de diverses variétés de cacao (tout venant). Des
échantillons de cinq litres (5 L) de jus de mucilage, de la grande traite (allant d’Octobre à
Novembre 2020) ont été recueillis de façon stérile dans un bidon et mis dans une glacière
contenant de la carboglace et acheminés au laboratoire de biotechnologie et microbiologie des
aliments de l’Université Nangui Abrogoua.

8,63 cm

6,64 cm

Figure 29 : Cabosse de cacao Figure 30 : Jus de mucilage de cacao

1-2- Matériel technique

Le matériel technique était constitué plusieurs appareils de laboratoire à savoir un
spectrophotomère pour la lecture des densités optiques, un pH-mètre qui a permis la mésure du
pH, d’un refractomètre à main pour la détermination de l’extrait sec refractométrique, un

41
 MATERIEL ET METHODES

thermocyleur utilisé pour l’amplification de la région de l’ADN d’intérêt, d’une chaîne de

chromatographie liquide à haute performance pour doser les acides organiques, vitamines.

2- Méthodes

2-1- Méthodes d’enquêtes

2-1-1- Généralités sur les sites d’enquêtes et d’échantillonage

Cinq (05) sites de la boucle du cacao ont été choisis pour réaliser des enquêtes sur la
consommation du jus de mucilage. Il s’est agi de Akoupé (6.3879° N, 3.8808° W) et Yakassé-
Attobrou (6. 1853° N, 3.6446° W) au Sud-Est ; Tiassalé (5.9043° N, 4.8261° W) au Sud, Taabo
(6.2338° N, 5.1394° W) au Centre et Buyo (6.4556° N, 6.9961° W) à l'Ouest (Figure 28).

Villes de Côte d’Ivoire d’enquêtes et d’échantillonnages

Figure 31 : Site d’échantillonnage et enquête

42
 MATERIEL ET METHODES

2-1-2- Procédure d’enquête

Une fiche d’enquête a été élaborée (voir annexe I). Elle a permis de déterminer le niveau
de connaissance (consommation, temps de conservation, éventuel effet bénéfique…) du jus
mucilage de cacao, de dresser le profil socio-économique et socio démographique des
répondants. L’enquête s’est déroulée de novembre 2019 à Juin 2020. Une première phase
constituant une pré-enquête a permis de collecter quelques données de la littérature, d’observer
les personnes intérrogées, d’établir des relations avec eux et de concevoir un questionnaire
portant sur la connaissance (consommation, temps de conservation, éventuel effet bénéfique…)
du jus de mucilage de cacao.

2-1-3- Population d’étude et collecte des données

Pour cette étude, 500 personnes ont été interrogées à raison de 100 par localité. La taille
de la population a été déterminée en utilisant la formule d'Israël, (1992) pour un échantillon
indépendant non exhaustif.
[𝑝(1 − 𝑝)]
N = t² (𝟏)
𝑒²
Avec "N" : taille de l'échantillon
"e" : marge d'erreur,
"t" : le coefficient de marge
"p" : la population de la zone d'étude. L'échantillon pour chaque zone a été obtenu par la
méthode probabiliste proportionnelle à la taille de la population dans chaque localité à partir
des données du recensement général de la population de la Côte d'Ivoire.
La collecte des données a été réalisée par le biais d’un questionnaire soumis aux personnes
interrogées de l’ensemble des sites. Afin de permettre une meilleure compréhension du
questionnaire aux personnes interrogées et de faciliter leurs réponses, une personne de la localité
ayant un niveau d’étude primaire ou secondaire ou supérieure et parlant la même ethnie que les
ces personnes a été sollicitée pour servir de point focal et d’interprète. Les questions étaient des
questions à choix multiple avec possibilité de 2 à 6 réponses proposées ou des questions avec
des réponses oui ou non et vrai ou faux.

43
 MATERIEL ET METHODES

2-2- Echantillonnage
Au niveau de chaque site 3 passages ont été effectués à raison d’un échantillon par
passage ce qui donne un total de 15 échantillons. Un premier lot d’échantillons a été conservé
à la température ambiante (28±2 °C) pendant 72 h. Un second lot de jus de mucilage de cacao
a été laissé en fermentation spontanée pendant 120 h à la température ambiante (28±2 °C) et
toutes les 24 h des échantillons ont été prélevés pour les différentes analyses.

2-3- Analyses biochimiques du jus de mucilage au cours de la conservation

2-3-1-Détermination de la teneur en eau et matière sèche

La détermination de la teneur en eau a été réalisée selon la méthode AOAC (1990). Une
masse de cinq grammes (5 g) de chaque échantillon de jus de mucilage de cacao (Me) a été
pesée dans une capsule en verre de masse connue (M0). La capsule contenant l’échantillon
(masse totale M1) a été placée à l’étuve (Memmert) réglée à 105 ± 2°C pendant une durée de 24
h. Au bout de 24 h la capsule a été retirée et placée au dessiccateur pour être refroidie.
L’ensemble (échantillon séché plus capsule) a été pesé (M2) après le refroidissement au
dessiccateur. L’expérience est répétée trois (3) fois et la teneur en eau (TE) exprimée en
pourcentage est déterminée par la relation mathématique suivante :
(𝑀1 − 𝑀2)
𝑇𝐸 (%) = ∗ 100 (𝟐)
𝑀𝑒

La teneur en matière sèche (TMS) est déduite de la relation mathématique suivante :

𝑇𝑀𝑆 (%) = 100 − 𝑇𝐸(%) (𝟑)

Avec :
Me : masse (g) de l’échantillon (5g)
M1 : masse (g) de l’ensemble (capsule + échantillon) avant étuvage
M2 : masse (g) de l’ensemble (capsule + échantillon) après étuvage
TE : teneur en eau (%)

2-3-2-Détermination de la teneur en cendres

La détermination de la teneur en cendres a été faite selon la méthode AOAC (1990).
Dans une capsule d’incinération (porcelaine) de masse connue (M0), cinq grammes (5 g) de
chaque échantillon de jus de mucilage (Me) a été prélevé. La capsule contenant l’échantillon

44
 MATERIEL ET METHODES

(masse totale M1) a été placée dans un four à moufle (Nobertherm) à 550 °C pendant une durée
de 24 h. Après les 24 h, la capsule contenant l’échantillon a été retirée du four et placée au
dessiccateur pour être refroidie. L’ensemble (capsule + échantillon incinéré) a été pesé (M 2).
L’expérience est répétée trois (3) fois et la teneur en cendre exprimée en pourcentage est obtenue
par la formule mathématique suivante :

(𝑀1 − 𝑀0)
𝐶𝑒𝑛𝑑𝑟𝑒𝑠 (%) = ∗ 100 (𝟒)
𝑀𝑒
Avec
M0 : masse (g) du creuset vide
Me : masse (g) de l’échantillon (Me)
M1 : masse (g) de l’ensemble (creuset + cendres) après incinération

2-3-3-Détermination de la teneur en lipides totaux

Les lipides totaux ont été extraits selon la méthode d'extraction liquide-liquide. Trois
extractions consécutives ont été réalisées. Pour la première extraction, à vingt (20 mL) de jus
mucilage ont été ajoutés 20 mL d'hexane, le mélange a ensuite été vigoureusement agité et laissé
à décanter. Un volume de 10 mL d'hexane a été ajouté à 20 mL du décantat de la première
extraction, pour la deuxième extraction. Cette même opération a été répétée pour la troisième
extraction. L'hexane a été évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif après l'extraction des lipides.
Le ballon d'extraction, préalablement taré, a été séché dans une étuve à 105 °C pendant 20 min.
A l'issue de cette opération, l'ensemble (flacon lipidique) a été pesé à la fin de cette opération.
L’expérience est répétée trois (3) fois et la détermination de la teneur en lipides totaux du jus
de mucilage de cacao est obtenue selon la relation mathématique suivante :

(𝑀1 − 𝑀0)
𝐿𝑖𝑝𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑢𝑥 (%) = ∗ 100 (𝟓)
𝑀𝑒

Avec :
M0 : masse (g) du ballon vide
Me : masse (g) de l’échantillon
M1 : masse (g) de l’ensemble (ballon + lipides) après évaporation

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 MATERIEL ET METHODES

2-3-4-Détermination de la teneur en protéines totales

La détermination des protéines totales a été réalisée selon la méthode AOAC (1990)
utilisant le Kjeldahl. Dans un matras de Kjeldahl, un gramme (1 g) de chaque échantillon de jus
de mucilage de cacao (Me) a été ajoutée à (20 mL) d’acide sulfurique concentré (96 %) en
présence d’une pincée de catalyseur de minéralisation (sélénite). La minéralisation a été faite
pendant 2 h dans un matras de Kjeldahl à 400 °C. Le minéralisât obtenu a été transvasé dans
une fiole de 100 mL puis complété avec de l’eau distillée. Un volume de 10 mL du mélange a
été prélevé auquel a été ajouté un volume de 50 mL de NaOH (40 %). Ensuite, une distillation
du mélange a été effectuée pendant 10 min, en prenant soin de piéger le distillat dans un ballon
contenant 20 mL d’acide borique additionné à indicateur mixte (rouge de méthyle + vert de
bromocresol). Le distillat obtenu a été titré par une solution d’acide sulfurique 0,01 N jusqu'à
ce que la solution vire du vert au rose (V1). Il a été réalisé un essai à blanc (V0). L’expérience
est répétée trois (3) fois et la teneur en protéines totales a été déterminé selon la relation
mathématique suivante :

(𝑉1 − 𝑉0) ∗ 14 ∗ 6,25 ∗ 𝑁

𝑃𝑟𝑜𝑡é𝑖𝑛𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 (%) = ∗ 100 (𝟔)
𝑀𝑒

Avec :
V0 : volume (mL) de solution d’acide sulfurique versé pour l’essai à blanc
V1 : volume (mL) de solution d’acide sulfurique versé pour l’essai (échantillon)
N : normalité de la solution d’acide sulfurique : 0,01
Me : masse (g) de l’échantillon
14 : masse atomique de l’azote
6,25 : coefficient correspondant au taux de conversion de l’azote en protéine

2-3-5- Détermination de la teneur en fibres brutes

La méthode de Weende décrite par Wolf (1968) a été utilisée pour la détermination des
fibres brutes. Un volume de 50 mL d’acide sulfurique 0,25 N a été ajouté à une masse de 2 g de
chaque échantillon de jus de mucilage de cacao (Me) et homogénéisé. Le tout a été porté à
ébullition pendant 30 min sous réfrigérant à reflux. Un volume de 50 mL de soude 0,31 N a été
ajouté au mélange et porté à ébullition pendant 30 min sous réfrigérant à reflux. L’extrait obtenu
a été filtré sur papier filtre (Whatman N° 42) puis le résidu a été lavé plusieurs fois à l’eau
chaude jusqu’à l’élimination complète des alcalis. Le résidu contenu dans le papier filtre a été

46
 MATERIEL ET METHODES

séché à l’étuve à 105 °C pendant 8 h, et refroidi au dessiccateur puis pesé (M1). Après la pesée,
le résidu a été incinéré au four à moufle à 550 °C pendant 3 h puis refroidi au dessiccateur et
pesé à nouveau (M2). L’expérience est répétée trois (3) fois et la teneur en fibres brutes est
déterminéé par la relation mathématique suivante :
(𝑀1 − 𝑀2)
𝐹𝑖𝑏𝑟𝑒𝑠 𝑏𝑟𝑢𝑡𝑒𝑠 (%) = ∗ 100 (𝟕)
𝑀𝑒

Avec :
M1 : masse (g) du résidu séché
M2 : masse (g) des cendres obtenues
Me : masse (g) de l’échantillon

2-3-6-Détermination de la teneur glucides totaux et valeur énergétique des jus de mucilage

Les glucides totaux (GT) et la valeur énergétique (VE) ont été déterminés par différence
suivant la méthode de calcul préconisée par la FAO (2002). Cette méthode prend en compte
d’une part les teneurs en humidité, en matière grasse, en protéines, en cendre, et d’autre part les
coefficients énergétiques relatifs aux condiments fermentés.

𝐺𝑇 (%𝑀𝑆) = 100 − [𝑃𝑇(%𝑀𝑆) + 𝐿𝑇(%𝑀𝑆) + 𝐶(%𝑀𝑆) + 𝐻(%)] (𝟖)

𝑉𝐸 (𝑘𝑐𝑎𝑙/100𝑔𝑀𝑆) = 22,4 ∗ 𝑃𝑇(%𝑀𝑆) + 8,37 ∗ 𝐿𝑇(%𝑀𝑆) + 3,57 ∗ 𝐺𝑇(%𝑀𝑆) (𝟗)

Avec :
PT : Pourcentage en protéines totales
LT : Pourcentage en lipides totaux
C : Pourcentage en cendres
GT : Pourcentage en glucides totaux
H : Humidité
VE : Valeur énergétique en kcal/ 100 g de matière sèche

2-3-7-Dosage des acides organiques et des vitamines

2-3-7-1-Dosage des acides organiques

Le dosage des acides organiques a été réalisé selon les instructions du fabricant de
l’appareil. Les échantillons ont été d’abord centrifugés (3000 rpm pendant 10 min) et les

47
 MATERIEL ET METHODES

surnageants filtrés sur filtre millipore 0,45 µm (Sartorius AG, Goëttingen, Allemagne). Les
acides organiques (acide lactique, acide tartrique, acide citrique, acide fumarique, acide
tannique acide acétique) ont été séparés par chromatographie en phase liquide à haute
performance (CLHP) (Shimadzu Corporation, Japon). Il est équipé d’une pompe (Shimadzu
LC-6A Liquid Chromatograph), d’un détecteur UV (Shimadzu SPD6A UV Spectrophotometric
detector) et d’un intégrateur (Shimadzu C-R 6A Chromatopac). La séparation
chromatographique a été réalisée avec une colonne d’exclusion ionique ORH-801 (300 mm x
6.5 mm, Interchrom, France) maintenue à 35°C à l’aide d’un four MetaTherm TM (Interchrom,
France). L’éluant est de l’acide sulfurique 0,004 N à une vitesse d’élution de 0,8 mL.min-1 et le
détecteur a été fixé à la longueur d’onde de 210 nm. Un volume de 20 µL de chaque échantillon
centrifugé et filtré a été injecté pour l’analyse HPLC. Les analyses ont été effectuées en double.
Les étalons d’acides organiques ont été préparés dans de l’eau distillée à des concentrations de
0,005 à 0,4 g/L. Les standards ont été filtrés et injectés séparément. Les différents composés ont
été identifiés et quantifiés en comparant les temps de rétention et les aires des pics des étalons
à ceux obtenus dans les échantillons.

2-3-7-2-Dosage des vitamines

Les échantillons ont été d’abord centrifugés (3000 rpm pendant 10 min) et les
surnageants ont été ensuite filtrés sur filtre millipore 0,45 µm (Sartorius AG, Goëttingen,
Allemagne). Les vitamines (acide ascorbique : vitamine C, acide folique : B9, cyanocabalamine
: B12) ont été séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)
(Shimadzu Corporation, Japon). Le chromatographe en phase liquide à haute performance est
équipé d’une pompe (Shimadzu LC-6A Liquid Chromatograph), d’un détecteur UV (Shimadzu
SPD6A UV Spectrophotometric detector) et d’un intégrateur (Shimadzu C-R 6A Chromatopac).
La séparation chromatographique a été réalisée à l'aide une colonne Nucleodur HTEC C18 de 5
µm (250/4,6 mm ID) (Macherey-Nagel, Allemagne).
La phase mobile est un mélange de deux phases A et B utilisées en mode gradient.
-La phase A était composée d'un mélange d'eau acidifiée avec 0,2 % d'acide métaphosphorique
(m/v) et d'acetonitrile (98/2 v/v), ajusté à pH = 3,5 avec une solution de NaOH 10 N.
- La phase B était constituée de 100 % d'acetonitrile.
Les solutions ont été filtrées et dégazées sous vide dans un bain à ultrasons avant d'être utilisées.
Les vitamines ont été analysées par une méthode d'élution à gradient à un débit de 0.75 mL/min
comme suit : 0-7 min : 100 % A ; 7-20 min : 100 % A à 87 % ; 20-23 min : 87 % A à 100 % ;
23 min à 100 %. A à 100 % ; 23 min jusqu'à la fin du cycle : 100 % A.

48
 MATERIEL ET METHODES

Le volume d'injection était de 20 µL. Chaque vitamine a été quantifiée à une longueur d'onde
spécifique : 245 nm (C), 280 nm (B9) et 360 nm (B12). Les étalons (0,5, 2,5, 15 et 30 mg/L)
ont été préparés par dilution de chaque solution mère dans de l'eau désionisée. Les standards
ont été filtrés et injectés séparément. Les différents composés ont été identifiés et quantifiés en
comparant les temps de rétention et les aires des pics des étalons à ceux obtenus dans les
échantillons.

2-3-8-Dosage des polyphénols totaux

Le contenu phénolique total des jus de mucilage de cacao a été estimé par une méthode
spectrophotométrique avec le réactif de « Folin-Ciocalteu ». Le dosage des polyphénols totaux
par ce réactif a été décrit par Singleton et al. (1999).
Cinquante (50 µL) d’échantillon de jus de mucilage a été mélangé avec 250 µL de réactif
de Folin- Ciocalteu non dilué. Après 5 min d’incubation à la température ambiante, 750 µL de
carbonate de sodium (Na2CO3) (20% (P/V)) est ajouté au mélange réactionnel. Après 2 heures
d’incubation, l’absorbance est mesurée à 760 nm avec un spectrophotomètre UV. Visible type
Analytics. Les mesures ont été réalisées en triple. La concentration des polyphénols totaux a été
calculée à partir de la courbe d’étalonnage établie avec l’acide gallique (0-250 μg/mL). Elle est
exprimée en microgramme (µg) d’équivalent d’acide gallique par millilitre d’échantillon de jus
de mucilage.

2-3-9- Dosage des flavonoïdes totaux

La teneur en flavonoïdes totaux des jus de mucilage de cacao a été déterminée selon la
méthode colorimétrique décrite par Meda et al, (2005) en utilisant le trichlorure d’aluminium
(AlCl3). Un volume de 0,5 mL d'aliquote a été mélangé avec les mêmes volumes d'eau distillée,
de trichlorure d'aluminium (AlCl3) 10% (p/v) (Labosi, Paris, France), d'acétate de sodium (1 M)
et 2 mL d'eau distillée. Après 30 min d'incubation à température ambiante, l'absorbance à 415
nm a été évaluée (spectrophotomètre UV Analytic ; USA). La teneur en flavonoïdes totaux a été
estimée à partir de la courbe d'étalonnage de la quercétine de 0-300 µg/mL (Sigma- Aldrich
Chemie, Steinheim, Allemagne). Elle a été ensuite exprimée en µg d'équivalents quercétine
(QE)/mL.

2-3-10- Tanins totaux

La détermination de la teneur en tanins facilement extractibles a été effectuée à l'aide de
la réaction de Bate-Smith, dans laquelle les proanthocyanidines incolores sont transformées en

49
 MATERIEL ET METHODES

anthocyanes colorés par chauffage à 100 °C en milieu acide et leur teneur est mesurée en
fonction de leur absorbance à 550 nm (Ribereau-Gayon & Stonestreet, 1966).
Dans deux tubes à essai, il a été ajouté consécutivement 2 mL d'échantillon de jus de mucilage
de cacao, 1 mL d'eau distillée et 3 mL d'acide chlorhydrique 12 N. Un premier tube à essai
contenant le précédent mélange a été laissé à la température ambiante tandis que l'autre a été
hermétiquement fermé et placé dans un bain-marie à 100 °C pendant 30 min, puis refroidis
pendant 10 min dans de la glace. Un volume de 0,5 mL d’éthanol a été ajouté à chacun des tubes
à essai et leurs densités optiques ont été mesurées. La teneur en tanins proportionnelle à la teneur
en anthocyanes, a été calculée en g/L selon la relation mathématique suivante :
𝑇𝑎𝑛𝑖𝑛𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑢𝑥 (𝑔/𝐿) = 19,33 ∗ 𝛥𝐷𝑂 (𝟏𝟎)

2-3-4-Dosage des activités antioxydantes

2-3-4-1- Activité antiradicalaire : DPPH (2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl)

La méthode de DPPH° a d’abord été décrite par Blois en 1958, et a ensuite été largement
modifiée par de nombreux chercheurs (Pereira Nunes et al., 2012). Le DPPH° (1,1-diphényl -
2- picrylhydrazyle) (C18H12N5O6 ; M= 394,33g/mole) est un radical libre stable, de couleur
violette (Figure 5) qui réagit avec des composés qui peuvent donner un atome d’hydrogène.
Cette activité a été testée selon la méthode décrite par Brand et al. (1995). Le mélange de 2 mL
d’une solution méthanolique de DDPH à 0,14 mg/mL avec 2 mL de chaque échantillon de jus
de mucilage de cacao est réalisé. Le mélange est ensuite agité vigoureusement pendant quelques
secondes et laissé à l’obscurité pendant 30 min. L’absorbance était mesurée à 517 nm contre le
blanc correspondant.

𝐴𝐴(%) = (𝐴𝑏𝑠 𝐷𝑃𝑃𝐻 – 𝐴𝑏𝑠 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒) / 𝐴𝑏𝑠 𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑥 100 (𝟏𝟏)

Avec :
Abs DPPH : Absorbance de départ de la solution 0,14 mg/mL du DPPH.
Abs finale : La valeur stable de l’absorbance après l’ajout de l’échantillon

2-3-4-2-Pouvoir réducteur-antioxydant du fer : FRAP (ferricyanure de potassium-

chlorure ferrique)
La capacité de réduction de l'ion ferrique (Fe3+) des échantillons de jus de mucilage de
cacao a été étudiée en utilisant la méthode du ferricyanure de potassium-chlorure ferrique (Liuk
et al., 2009). Un volume de 0,5 mL de chaque échantillon, 0,5 mL de tampon phosphate (0,2

50
 MATERIEL ET METHODES

M, pH 6,6) et 0,5 ml de ferricyanure de potassium K3Fe (CN)6 (1 %) ont été mélangés et incubés
à 50 °C pendant 20 min. La réaction a été arrêtée en ajoutant 0,5 mL d'acide trichloracétique
(10 % (p/v)). Un volume de 0,5 mL du mélange réactionnel précédent a été mélangé avec 0,8
mL d'eau distillée et 0,1 mL de FeCl3 (0,1 %) et l'absorbance a été mesurée à 700 nm. Le pouvoir
réducteur de chaque échantillon a été exprimé en μg d'équivalents d'acide ascorbique (AAE)
par mL.

2-4- Analyses physico-chimiques et microbiologiques du jus de mucilage au cours de la

fermentation

2-4-1-Mesure du pH
Le pH a été mesuré directement à l’aide d’un pH-mètre (PHS 550. pH/mV meter) dans
10 mL d’échantillon selon la méthode AOAC, (1990). La mesure est répétée trois fois.

2-4-2- Détermination de l’acidité titrable

L’acidité titrable a été obtenue par dosage de 5 mL de l’échantillon avec une solution de
NaOH 0,1 N après ajout au préalable de 2 à 3 gouttes de phénolphtaléine à 1 % (AOAC, 1990).
La fin du dosage est marquée par une coloration rose pâle persistante. Les résultats obtenus
constituent la moyenne de trois essais. Le taux d’acidité titrable exprimé en pourcentage (%)
d’acide lactique est calculé à l’aide de la formule suivante :

𝑉𝑜𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗ 𝑁𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗ 0,09 ∗ 100

% 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑖𝑡é 𝑡𝑖𝑡𝑟𝑎𝑏𝑙𝑒 = (𝟏𝟐)
𝑃𝐸
Avec :

Vol NAOH = volume de la solution d’hydroxyde de sodium

NNaOH = Normalité de la solution d’hydroxyde de sodium

PE = Prise d’essai

0,09 = milliéquivalent gramme d’acide lactique

2-4-3- Mesure de l’extrait sec réfractométrique

L’extrait sec réfractométrique (ESR) ou l'indice réfractométrique est déterminé selon la
méthode décrite par Audigié et al., (1980) à l'aide d'un réfractomètre à main (ATAGO, N-20E,
Japon). Il représente la matière sèche soluble présente dans le jus de mucilage et est corrélé à la
teneur en sucres. Les concentrations sont exprimées en °Brix. Le réfractomètre est constitué

51
 MATERIEL ET METHODES

d’un prisme mobile, d’un prisme fixe et d’un oculaire. Pour l’analyse, quelques gouttes de
l’échantillon sont placées sur le prisme fixe après ouverture de l’appareil. Le prisme mobile
(volet) est rabattu. L’oculaire est porté à l’œil et dirigé vers une source de lumière. Une échelle
graduée et une surface divisée en deux champs, l’un clair et l’autre sombre sont observées dans
la lunette. L’oculaire est tourné pour le régler à la vue de l’opérateur de façon que l’échelle soit
parfaitement nette. A ce moment, la ligne de séparation des deux champs est également nette.
La teneur en matière sèche soluble de l’échantillon est lue au point où la ligne de séparation des
deux champs divise l’échelle. Le chiffre lu correspond à l’extrait sec réfractométrique de
l’échantillon examiné.

2-4-4-Dosage de l’éthanol
Les échantillons ont été d’abord centrifugés (13000 rpm pendant 3 min) et les
surnageants filtrés sur filtre millipore 0,45 µm (Sartorius AG, Goëttingen, Allemagne).
L’éthanol a été dosé par chromatographie liquide haute performance (CLHP) (Agilent
Technologies, 1200 series, UK). L’appareil est équipé d’un détecteur UV barrette de diodes
(Agilent Technologies, 1200 series) et d’une colonne Aminex HPX 87H (300 mm x 7,8 mm,
Biorad, France) couplée à un réfractomètre (Agilent Technologies, 1200 series). La température
du four a été fixée à 50 °C. L’éluant a été de l’acide sulfurique 5 mM à une vitesse d’élution de
0,5 mL/ min et le détecteur UV a été fixé à la longueur d’onde de 210 nm. Un volume de 20 µL
des échantillons a été injecté et l’analyse a duré 35 min. Les solutions étalons ont été préparées
à des concentrations allant de 1 à 10 % (v/v) respectivement et injectées séparément. La
détermination quantitative de l’éthanol a été effectuée par la méthode de standard externe tandis
que la détermination qualitative a été basée sur le temps de rétention.

2-4-5- Détermination de la charge levurienne au cours de la fermentation

Le milieu de culture est le milieu YPDA (10 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de bactopeptone,
10 g/L de D-glucose, 10 g/L d’agar) préalablement préparée et coulée dans des boîtes de Pétri.
Les échantillons ont subi des dilutions décimales de façon aseptique jusqu’à la dilution 10-14
dans de l’eau peptonée tamponnée stérilisée. Les échantillons dilués ont été alors ensemencés
en double par étalement de 0,1 mL de l’inoculum sur la gélose sur les milieux YPDA (10 g/L
d’extrait de levure, 10 g/L de bactopeptone, 10 g/L de D-glucose, 10 g/L d’agar) coulée dans des
boîtes de Pétri. Les boîtes sont incubées à l’étuve à 30°C. Après 72 h d’incubation, les colonies
de levures sont dénombrées en prenant en compte seulement les boîtes où le nombre de colonies
est compris entre 30 et 300 (Norme NF ISO 6611, 1996). Les colonies ont un diamètre de 0,5 à
2 mm, des bords réguliers. Elles sont bombées, lisses, laiteuses

52
 MATERIEL ET METHODES

avec une odeur de pain. Le nombre de levures dans 1 mL de la culture mère est déterminé par
la formule mathématique suivante :

Ʃ𝐶
𝑁= (𝟏𝟑)
𝑑 ∗ (𝑛1 + 0,1𝑛2) ∗ 𝑉

N: Nombre de levures dans l’échantillon (UFC/mL)

ƩC: Somme de colonies des boîtes de Pétri retenues
n1: Nombre de boîte de Pétri à la première dilution considérée
n2: Nombre de boîte Pétri à la deuxième dilution considérée
V : Volume de la dilution prélevée pour l’étalement (mL)
d : Facteur de dilution correspondant

2-5-Isolement des levures

Toutes les 24 h et ce pour chaque jus de mucilage de cacao, 20 colonies issues du

dénombrement ont été isolées pour le screening des isolats de levures productrices de pectinase
sur la gélose YPDA soit un total de 100 colonies. Parallèlement, l’isolement des levures des jus
de mucilage de cacao dont les concentrations en éthanol en fin de fermentation ont été comprises
entre 7 et 10% (v/v) a également été réalisé sur la gélose YPDA comme résistant à l’éthanol.
Ce sont 08 colonies qui ont été sélectionnées pour chaque jus de mucilage de cacao dont les
concentrations étaient comprises entre 7 et 10 % (v/v) d’éthanol. Ces isolats ont été choisies sur
la base de leurs caractéristiques macroscopiques (taille, forme, couleur).

2-5-1-Screening des isolats de levures producteurs de pectinase

La sélection des isolats de levures productrices de pectinases a été réalisée selon la méthode
de Jaafar et al. (2006). Les souches de levures préalablement isolées sur le milieu YPDA ont
été repiquées sur le milieu pectine. La gélose pectine contenant l’acide polygalacturonique
comme seule source de carbone a permis la mise en évidence de l’activité pectinolytique des
isolats de levures. Les isolats ont été inoculés par touche centrale. Après 24 h d’incubation à 30
°C, la boîte a été inondée par une solution aqueuse d’acétate de cuivre (CuSO4.5H2O) à 7,5%
pendant 15 à 30 min et la présence d’un halo blanc indique la présence d’une activité
pectinolytique. Les isolats ayant les diamètres d’halo les plus élevés (≥ 10 mm) ont été retenus
et codifiés pour la suite de l’étude.

53
 MATERIEL ET METHODES

2-5-2-Optimisation de la production d'enzyme pectinase à partir d'isolats sélectionnés

Les isolats sélectionnés ont été soumis à différentes conditions (temps d’incubation, pH
et température) de culture afin de déterminer les conditions optimales de production de
pectinase.

2-5-2-1-Effet du temps d’incubation

Les isolats sélectionnés ont été utilisés pour produire l'enzyme pectinase. Les extraits
bruts enzymatiques ont été préparés selon la méthode décrite par Kumar & Sharma (2012) dans
le bouillon pectine. Le bouillon pectine était composé (g/L) de 3 g (NH4)2SO4, 4,5 g KH2PO4,
1 g d'extrait de levure, 0,25 g de MgSO4-7H2O, 0,25 g de CaCl2-2H2O, et 10 g d’acide
polygalacturonique. Tous ces ingrédients ont été dissous dans de l'eau distillée et le pH du milieu
ajusté à 5. Les milieux ont été stérilisés en autoclave à 121 °C sous une pression de 1 atmosphère
pendant 17 min. Des ballons de capacité de 250 mL renfermant 100 mL de milieu liquide chacun
sont inoculés séparément à une densité optique de 0,3 par chaque isolat sélectionné
préalablement cultivé dans le bouillon pectine. Les cultures ont été incubées à 30
°C sous agitation rotative (105 tours.min-1 ; 1 tour = 2л rad) durant 24 heures. Des prélèvements
ont effectué toutes les 4 heures pendant 24 h et centrifugés à 4 °C pendant 10 mn à vitesse de
9000 rpm et les surnageant ont constitué les extraits bruts enzymatiques pour la détermination
de l’activité pectinolytique.

2-5-2-2- Effet du pH

L’influence du pH du milieu de culture sur la production de pectinase a été réalisée en

faisant varier le pH des milieux de culture de 5 à 8. Pour cela, les valeurs de pH des milieux ont
été ajustées à 5 ; 5,5 ; 6 ; 7 et 8 et inoculés séparément par chaque isolat à 0,3 DO. Ils ont été
Ensuite incubés dans un incubateur agitateur (Shaking incubator, Biobase) à 30 °C pendant 24
heures. A la fin du temps d’incubation les milieux ont été centrifugés à 9000 rpm à 4 °C pendant
10 minutes à l’aide d’une centrifugeuse (TGL 16 M). Les surnageants obtenus ont constitué les
extraits bruts enzymatiques pour la détermination de l’activité pectinolytique.

2-5-2-3-Effet de la température d’incubation

L’effet de la température d’incubation a été mis en évidence en incubant les milieux

inoculés séparément par chaque isolat à 0,3 DO pendant 24 heures dans un incubateur agitateur
(Shaking incubateur, Biobase) à 30 °C (Behera et al., 2017). Les milieux ont été ensuite
centrifugés à 9000 rpm à 4 °C pendant 10 minutes à l’aide d’une centrifugeuse (TGL 16 M).

54
 MATERIEL ET METHODES

Les surnageants obtenus ont constitué les extraits bruts enzymatiques pour la détermination de
l’activité pectinolytique.

2-5-3-Dosage de l’activité pectinolytique

Le dosage de l’activité pectinolytique a été réalisé selon la méthode de Miller (1959).

Un volume de 100 μL de l'extrait enzymatique partiellement purifié a été ajouté à 100 μL de
substrat (tampon acétate de sodium 0,05M ; pH 5). Le mélange a été incubé au bain marie à 40
°C pendant 30 min. Au terme du temps d’incubation 400 μL de DNS sont ajoutés au mélange.
L’ensemble est ainsi incubé à nouveau à 100°C pendant 15 min, puis 4,4 mL d’eau distillée sont
ajoutés. L’activité enzymatique est la quantité d’enzyme dans 1 mL qui libèrerait des sucres
réducteurs, équivalent à 1 mg d’acide galacturonique. La teneur en acide galacturonique est
déterminée en se référant à une courbe d’étalonnage. L’absorbance est mesurée à 540 nm à
l’aide d’un spectrophotomètre.

2-6-Identification moléculaire des isolats de levures producteurs de pectinase et

résistants à l’éthanol

2-6-1- Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de la région ITS-5.8S rDNA

La PCR a été réalisée selon la méthode décrite par Jeyaram et al. (2008) sur colonies
avec quelques modifications. Des colonies fraîches de levure (moins de 5 jours d’âge) cultivée
sur la gélose YDPA sont diluées dans 100 mL d’eau pour biologie moléculaire en respectant les
conditions de stérilité.
Le mélange réactionnel pour l’amplification de la région 5.8S ADNr-ITS est présenté dans le
tableau IV. Les amorces ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) et ITS4 (5’-
TCCTCCGCTTATTGATA-3’) utilisées dans cette étude ont été décrites par White et al.
(1990).
Les réactions d’amplification de la région 5.8S rDNA-ITS ont été réalisées à l’aide d’un
thermocycleur (Techne Prime, UK) selon le programme décrit par van Aa Kühle et al. (2001)
avec quelques de modifications : la première étape est une dénaturation initiale à 95 °C pendant
10 min suivie d’une deuxième étape correspondant à 30 cycles (dénaturation à 94 °C pendant 2
min ; hybridation à 55,8 °C pendant 1 min ; élongation à 72 °C pendant 2 min) et d’une troisième
et dernière étape qui est une élongation finale à 72 °C pendant 7 min. Cette dernière étape
marque la fin de la réaction d’amplification. La taille des amplicons est analysée sur un gel
d’agarose 1,5 % contenant du bromure d’éthidium (BET). Les amplicons sont conservés à –
20°C pour d’autres utilisations.

55
 MATERIEL ET METHODES

Tableau IV : Composition du mélange réactionnel (volume final : 50 µL)

Composant Volume (µL) Concentration

Tampon Taq (5X Green Go Taq Flexi Buffer) 10 5X
(Promega Madison, WI, USA)

MgCl2 (Promega Madison, WI, USA) 8 [1-4] mM

dNTP mix (Promega Madison, WI, USA) 1 0,2 mM chaque dNTP
ITS 1 (Integrated DNA Technologies) 0,25 [0,1-1] µM
ITS 4 (Integrated DNA Technologies) 0,25 [0,1-1] µM
DNA polymerase (Promega Madison, WI, USA) 0,25 5u/µL
Colonie levurienne 5
Eau pour biologie moléculaire 30,25
(Ambion the RNA company)

2-6-2-Electrophorèse sur gel d’agarose

L’électrophorèse sur gel d’agarose permet la séparation et la détermination de la taille des
fragments d’ADN amplifiés par PCR.
Le gel a été préparé à 1,5 % dans du tampon TBE 0,5X [45 mM Tris-Base (Sigma), 45 mM
acide borique (Sigma), 1 mM EDTA (Sigma)]. La suspension est chauffée jusqu’à ébullition et
à l’obtention d’une solution limpide. Le gel liquide est refroidi et deux gouttes de bromure
d’éthidium (BET) y sont ajoutées avant d’être coulé dans un support de gel.
Une fois solidifié, le gel a été immergé dans une cuve à électrophorèse contenant du TBE 0,5X.
Des aliquotes de 10 µL des fragments amplifiés sont additionnés de 2 µL de tampon de charge
(50 % TE pH 8, 50% glycérol, bleu de bromophénol) avant d’être déposés dans les puits du gel.
Le gel a été visualisé (Clearver Scientific Ltd, - Clear view UV Transilluminator USA) sous
illumination UV après une migration à 80 V pendant 45 min pour l’ADN amplifié. La taille des
fragments d’ADN est déterminée directement à partir du logiciel Vision Pact en utilisant le
marqueur de taille moléculaire 200 pb DNA Ladder (Promega) comme référence.

2-6-3-Séquençage des fragments amplifiés

Sur la base des résultats de l’identification des levures par la PCR-RFLP, 30 souches de
levures ont été sélectionnées pour l’analyse du domaine D1/D2 de l’extrémité 5’ de l’ADN
codant la sous unité ribosomique 26S dont 24 souches résistantes à l’éthanol et 6 souches
productrices de pectinase. La méthode utilisée repose sur l’amplification par PCR de la région

56
 MATERIEL ET METHODES

suscitée telle que décrite par Kurtzman et Robnett (1998). La réaction d’amplification est
réalisée sur des colonies fraîches (moins de 5 jours d’âge) à l’aide des amorces NL-1
(5’GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) et NL-4 (5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG-
3’). Les conditions de la PCR sont les suivantes : dénaturation initiale à 94°C pendant 3 min ;
36 cycles comprenant chacun une étape de dénaturation à 94°C pendant 1 min, d’hybridation à
52°C pendant 2 min et d’élongation à 72°C pendant 2 min ; une extension finale à 72°C pendant
7 min. Les amplifiât obtenus sont envoyés à la société Génome Express (France) pour le
séquençage. Les amorces NL-1 et NL-4 ont servi pour le séquençage. Les séquences sont
ensuite assemblées grâce aux logiciels consed et phredPhrap. Les séquences obtenues sont alors
comparées aux séquences disponibles dans la base de données GenBank du NCBI (National
Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

3- Purification partielle de l’enzyme

La purification partielle de la pectinase a été conduite à travers une chromatographie
Echangeuse d’ions sur gel DEAE-sepharose 6 fast flow.

3-1-Chromatographie d’échange d’anions sur le gel DEAE-sepharose Fast Flow

Le gel diéthylaminoéthyl (DEAE) Sepharose CL-6B (PHARMACIA Biotech.) est coulé
dans une colonne (2,6 x 6,0 cm) et équilibré avec du tampon phosphate de potassium 100 mM
(pH 7,0) pour la recherche de l’α-glucosidase (Dejob, 2013). Le débit est fixé à 1 mL/min et
des fractions de 3 mL sont recueillies à l’aide d’un collecteur (GILSON TDC 80) relié à une
pompe péristaltique (GILSON) qui est connectée à la colonne. Quinze (15) mL d’extrait brut
sont déposés sur le gel DEAE-Sepharose CL-6B qui a été équilibré avec le tampon phosphate
de potassium 100 mM (pH 7,0). Le gel est ensuite lavé avec 60 mL du même tampon pour éluer
les protéines non fixées. Les protéines retenues par le gel sont éluées par une augmentation
progressive de la force ionique à pH constant, par l’application d’un gradient en escalier
croissant de 0 ; 0,3 ; 0,5, 0,7 ; 1 et 2 M de chlorure de sodium dans 60 mL de tampon acétate de
sodium 20 mM (pH 5,0). Les fractions d’intérêt c’est-à-dire celles contenant l’activité
pectinolytique ont été collectées.

3-2-Détermination des paramètres cinétiques

L'oxydation des substrats par l’enzyme purifiée a été déterminée par spectrophotométrie à
la longueur d'onde (540 nm) spécifique du substrat. Le test a été réalisé en mesurant
l'augmentation à l'absorbance (A540 nm) pour l’acide polygalacturonique dans un tampon
acétate de sodium 50 mM (pH 5).

57
 MATERIEL ET METHODES

La vitesse de réaction a été déterminée sur le substrat (acide polygalacturonique) dans un

intervalle de concentrations compris entre 2 et 10 mg/mL. Les constantes cinétiques, Km et Vm,
de l'enzyme ont été déterminées à l'aide de la représentation graphique de Lineweaver & Burk
(1934).

4- Applications biotechnologiques des espèces identifiées productrices de pectinase et

résistantes à l’éthanol

4-1-Essais de clarification enzymatique du jus d’orange (Citrus sinensis) et du jus

d’ananas (Ananas comosus) et d’extraction de composés phénoliques par l’extrait
enzymatique partiellement purifié des espèces de Yarrowia lipolytica
Les jus d’orange ont été pressés à l’aide d’un presseur mécanique en notre présence afin
de s’assurer qu’ils ne subissent aucun autre traitement ou ajout. Cinq cent millilitres (500 mL)
de jus, acheté dans la commune de Yopougon ont été placés dans une glacière contenant de la
glace et acheminés au laboratoire. Les jus de fruits (orange et ananas) ont été transvasés dans
des bouteilles et incubés au bain-marie à 85 °C pendant 15 mn. Après refroidissement, à 100
mL de chaque jus ont été additionnés à 200 µL d’extrait enzymatique partiellement purifié des
espèces Yarrowia lipolytica. L’ensemble a été incubé au bain-marie à 40 °C pendant 2 h. A la
fin du traitement, chaque milieu réactionnel est chauffé à 90 °C pendant 5 minutes pour inactiver
les pectinases.

4-1-1-Analyses physico-chimiques des jus clarifiés

Le dosage des paramètres physico-chimiques des jus d’orange clarifiés à savoir le pH,
l’acidité titrable et l’extrait sec refractométique a été effectué comme définit aux sections
2-4-1 ; 2-4-2 ; 2-4-3.

2-4-1-Mesure du pH
Le pH a été mesuré directement à l’aide d’un pH-mètre (PHS 550. pH/mV meter) dans
10 mL d’échantillon selon la méthode AOAC, (1990). La mesure est répétée trois fois.

2-4-2- Détermination de l’acidité titrable

L’acidité titrable a été obtenue par dosage de 5 mL de l’échantillon avec une solution de
NaOH 0,1 N après ajout au préalable de 2 à 3 gouttes de phénolphtaléine à 1 % (AOAC, 1990).
La fin du dosage est marquée par une coloration rose pâle persistante. Les résultats obtenus

58
 MATERIEL ET METHODES

constituent la moyenne de trois essais. Le taux d’acidité titrable exprimé en pourcentage (%)
d’acide lactique est calculé à l’aide de la formule suivante :

𝑉𝑜𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗ 𝑁𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗ 0,09 ∗ 100

% 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑖𝑡é 𝑡𝑖𝑡𝑟𝑎𝑏𝑙𝑒 = (𝟏𝟐)
𝑃𝐸
Avec :

Vol NAOH = volume de la solution d’hydroxyde de sodium

NNaOH = Normalité de la solution d’hydroxyde de sodium

PE = Prise d’essai

0,09 = milliéquivalent gramme d’acide lactique

2-4-3- Mesure de l’extrait sec réfractométrique

L’extrait sec réfractométrique (ESR) ou l'indice réfractométrique est déterminé selon la
méthode décrite par Audigié et al., (1980) à l'aide d'un réfractomètre à main (ATAGO, N-20E,
Japon). Il représente la matière sèche soluble présente dans le jus de mucilage et est corrélé à la
teneur en sucres. Les concentrations sont exprimées en °Brix. Le réfractomètre est constitué
d’un prisme mobile, d’un prisme fixe et d’un oculaire. Pour l’analyse, quelques gouttes de
l’échantillon sont placées sur le prisme fixe après ouverture de l’appareil. Le prisme mobile
(volet) est rabattu. L’oculaire est porté à l’œil et dirigé vers une source de lumière. Une échelle
graduée et une surface divisée en deux champs, l’un clair et l’autre sombre sont observées dans
la lunette. L’oculaire est tourné pour le régler à la vue de l’opérateur de façon que l’échelle soit
parfaitement nette. A ce moment, la ligne de séparation des deux champs est également nette.
La teneur en matière sèche soluble de l’échantillon est lue au point où la ligne de séparation des
deux champs divise l’échelle. Le chiffre lu correspond à l’extrait sec réfractométrique de
l’échantillon examiné.

4-1-2- Détermination de la clarté, la couleur et l’indice de brunissement

La clarté, la couleur et l’indice de brunissement ont été déterminés au spectrophotomètre
(Thermo Fischer Scientific) aux longueurs d’ondes respectives de 660 nm, 440 nm et de 420
nm, avec l’utilisation de l’eau distillée comme contrôle (Chan & Cavaletto, 1986 ; Rai et al.,
2006 ; Dedehou et al., 2015 ; Sharna et al., 2015 ; Meryandini et al., 2017). Trois mesures ont
été faites pour chaque échantillon de jus traité et le jus non traité.

59
 MATERIEL ET METHODES

4-1-3- Dosage des composés phénoliques

L’étude de l’extraction des composés phénoliques par l’extrait enzymatique
partiellement purifié de pectinase. Les composés phénoliques à savoir les polyphénols totaux et
les flavonoïdes totaux ont été dosés comme précédemment décrit aux sections 2-3-8 et 2-3-9.

2-3-8-Dosage des polyphénols totaux

Le contenu phénolique total des jus de mucilage de cacao a été estimé par une méthode
spectrophotométrique avec le réactif de « Folin-Ciocalteu ». Le dosage des polyphénols totaux
par ce réactif a été décrit par Singleton et al. (1999).
Cinquante (50 µL) d’échantillon de jus de mucilage a été mélangé avec 250 µL de réactif
de Folin- Ciocalteu non dilué. Après 5 min d’incubation à la température ambiante, 750 µL de
carbonate de sodium (Na2CO3) (20% (P/V)) est ajouté au mélange réactionnel. Après 2 heures
d’incubation, l’absorbance est mesurée à 760 nm avec un spectrophotomètre UV. Visible type
Analytics. Les mesures ont été réalisées en triple. La concentration des polyphénols totaux a été
calculée à partir de la courbe d’étalonnage établie avec l’acide gallique (0-250 μg/mL). Elle est
exprimée en microgramme (µg) d’équivalent d’acide gallique par millilitre d’échantillon de jus
de mucilage.

2-3-9- Dosage des flavonoïdes totaux

La teneur en flavonoïdes totaux des jus de mucilage de cacao a été déterminée selon la
méthode colorimétrique décrite par Meda et al, (2005) en utilisant le trichlorure d’aluminium
(AlCl3). Un volume de 0,5 mL d'aliquote a été mélangé avec les mêmes volumes d'eau distillée,
de trichlorure d'aluminium (AlCl3) 10% (p/v) (Labosi, Paris, France), d'acétate de sodium (1 M)
et 2 mL d'eau distillée. Après 30 min d'incubation à température ambiante, l'absorbance à 415
nm a été évaluée (spectrophotomètre UV Analytic ; USA). La teneur en flavonoïdes totaux a été
estimée à partir de la courbe d'étalonnage de la quercétine de 0-300 µg/mL (Sigma- Aldrich
Chemie, Steinheim, Allemagne). Elle a été ensuite exprimée en µg d'équivalents quercétine
(QE)/mL.

4-1-4-Détermination de la viscosité
La viscosité a été mesurée par un viscosimètre (Thermo Scientific) (Figure 29). Le temps
nécessaire pour traverser la section capillaire du viscosimètre a été noté à l'aide d'un
chronomètre pour la référence. Trois mesures ont été réalisées pour chaque échantillon.

60
 MATERIEL ET METHODES

Jus de fruit clarifié

Bille en verre en pleine chute
8,62 cm

7,7 cm

Figure 32 : Mesure de la viscosité

4-2-Production de bioéthanol par fermentation alcoolique du moût de sorgho (Sorghum

bicolor) par les espèces de levures Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula mucilaginosa,
Debaromyces hansenii, Pichia kudriavzevii résistantes à l’éthanol

4-2-1-Préparation du moût
Les moûts ont été stérilisés à 121 °C pendant 15 min et refroidi à température ambiante
en maintenant fermée hermétiquement les Erlenmeyers.

4-2-2-Conduite de la fermentation alcoolique

La conduite de la fermentation alcoolique a été réalisée selon la méthode décrite par
Coulibaly et al. (2017). Un volume de 500 mL de moût a été ensemencé à 0,5 DO en culture
mixte et en mono-culture pour chacune des espèces Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces
hansenii, Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae. La fermentation alcoolique s’est
déroulée à 25 °C pendant 120 h sous agitation constante de 120 rpm.

4-2-3-Analyses physico-chimiques du moût au cours de la fermentation alcoolique

4-2-3-1-Détermination du pH, l’acidité titrable et de l’extrait sec refractométrique

Ces paramètres ont été déterminés comme précédemment décrit aux sections 2-4-1 ; 2-4-2 et 2-
4-3.

61
 MATERIEL ET METHODES

2-4-1-Mesure du pH
Le pH a été mesuré directement à l’aide d’un pH-mètre (PHS 550. pH/mV meter) dans
10 mL d’échantillon selon la méthode AOAC, (1990). La mesure est répétée trois fois.

2-4-2- Détermination de l’acidité titrable

L’acidité titrable a été obtenue par dosage de 5 mL de l’échantillon avec une solution de
NaOH 0,1 N après ajout au préalable de 2 à 3 gouttes de phénolphtaléine à 1 % (AOAC, 1990).
La fin du dosage est marquée par une coloration rose pâle persistante. Les résultats obtenus
constituent la moyenne de trois essais. Le taux d’acidité titrable exprimé en pourcentage (%)
d’acide lactique est calculé à l’aide de la formule suivante :

𝑉𝑜𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗ 𝑁𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗ 0,09 ∗ 100

% 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑖𝑡é 𝑡𝑖𝑡𝑟𝑎𝑏𝑙𝑒 = (𝟏𝟐)
𝑃𝐸
Avec :

Vol NAOH = volume de la solution d’hydroxyde de sodium

NNaOH = Normalité de la solution d’hydroxyde de sodium

PE = Prise d’essai

0,09 = milliéquivalent gramme d’acide lactique

2-4-3- Mesure de l’extrait sec réfractométrique

L’extrait sec réfractométrique (ESR) ou l'indice réfractométrique est déterminé selon la
méthode décrite par Audigié et al., (1980) à l'aide d'un réfractomètre à main (ATAGO, N-20E,
Japon). Il représente la matière sèche soluble présente dans le jus de mucilage et est corrélé à la
teneur en sucres. Les concentrations sont exprimées en °Brix. Le réfractomètre est constitué
d’un prisme mobile, d’un prisme fixe et d’un oculaire. Pour l’analyse, quelques gouttes de
l’échantillon sont placées sur le prisme fixe après ouverture de l’appareil. Le prisme mobile
(volet) est rabattu. L’oculaire est porté à l’œil et dirigé vers une source de lumière. Une échelle
graduée et une surface divisée en deux champs, l’un clair et l’autre sombre sont observées dans
la lunette. L’oculaire est tourné pour le régler à la vue de l’opérateur de façon que l’échelle soit
parfaitement nette. A ce moment, la ligne de séparation des deux champs est également nette.
La teneur en matière sèche soluble de l’échantillon est lue au point où la ligne de séparation des
deux champs divise l’échelle. Le chiffre lu correspond à l’extrait sec réfractométrique de
l’échantillon examiné.

62
 MATERIEL ET METHODES

4-3-Production de CO2 durant la fermentation alcoolique par les espèces Rhodotorula

mucilaginosa, Debaromyces hansenii, Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae
Le volume de gaz produit pendant la fermentation a été mesuré à l'aide d'un dispositif
expérimental décrit par Lai (2010). Les fermentations ont été effectuées dans des Erlenmeyers
de 500 mL. Des échantillons sont prélevés régulièrement pendant la fermentation alcoolique.
Les Erlenmeyers sont pesés avant Poids (t-1) et après Poids (t) pour chaque échantillon afin de
déterminer la cinétique de production de CO2.

4-4-Distillation des moûts fermentés

L’extraction de l’éthanol a été effectuée par distillation des moûts à l’aide du distillateur
à colonne de vigreux QUICKFIT/FC3/13 de 85cm de longueur et 4,45cm de diamètre. La
température est maintenue à 79°C à la tête de colonne jusqu’à l’épuisement total de l’alcool des
moûts fermentés contenu dans le ballon de chauffage. Le taux d’éthanol a été dosé à l’aide d’un
pycnomètre.

5- Analyses statistiques

Les données de l’enquête ont été traitées avec le logiciel IBM SPSS (statistics 20).
L’analyse de variance à un facteur (ANOVA) et les tests de Tukey et de Levene (test-t) ont été
effectués avec le logiciel XLSTAT (Adinosoft Inc., version 2016) pour comparer les variables
analysées sur les jus de mucilages de cacao, les jus d’orange clarifiés et les moûts fermentés.
Les différences sont considérées comme significatives pour des valeurs de P < 0,05.
L’analyse en composantes principales (ACP) a servi à comparer les échantillons de jus de
mucilage à partir des variables mesurées. L’ACP permet de regrouper les variables mesurées en
de nouvelles variables appelées ‘’composantes’’ ou ‘’facteurs’’. Ce regroupement est basé sur
la corrélation des variables. Le logiciel XLSTAT (Adinosoft Inc.) a été utilisé pour faire
l’analyse en composantes principales. L’analyse de la corrélation de Pearson permettant de
révéler la nature de la corrélation entre les paramètres étudiés est réalisée avec le logiciel
XLSTAT (Adinosoft Inc.).
La classification hiérarchique ascendante (CHA) a été utilisée pour agglomérer les échantillons
de jus par similarité des paramètres analysés. CHA consiste à agréger les échantillons selon leur
ressemblance mesurée à l’aide d’un indice de similarité ou de dissimilitude. Elle produit une
suite de partitions emboitées de l’ensemble d’échantillons à classifier. L’algorithme commence
par rassembler les couples d’échantillons les plus ressemblants, puis à agréger progressivement

63
 MATERIEL ET METHODES

les autres échantillons en fonction de leur ressemblance, jusqu’à ce que la totalité des
échantillons ne forme plus qu’un seul groupe.
Les calculs et les figures ont été effectués à l’aide d’EXCEL 2010 (XP – Microsoft Corp.).

64
TROISIÈME PARTIE
RÉSULTATS & DISCUSSION
 RESULTATS ET DISCUSSION

CHAPITRE I : ÉVALUATION DES PARAMÈTRES BIOCHIMIQUES,

PHYTOCHIMIQUES, NUTRITIONNELLES ET FONCTIONNELLES DU
JUS DE MUCILAGE DE CACAO AU COURS DE LA CONSERVATION
À LA TEMPÉRATURE AMBIANTE (28±2 °C)

1- Résultats

Cette première partie des résultats nous a permis tout d’abord d’actualiser l’état actuel
des connaissances sur le jus de mucilage de cacao à travers une enquête de consommation du
jus de mucilage de cacao qui a été réalisée auprès des populations des zones échantillonnées.
Cette enquête avait pour but d’établir le profil socio-démographique des personnes interrogées
et de déterminer le niveau de connaissance du jus de mucilage, la consommation du jus de
mucilage et sa fréquence, la quantité consommée, sa durée maximale de conservation et ses
éventuels effets bénéfiques pour l’ensemble de tous les sites d’enquête. Ensuite, le jus de
mucilage de cacao a été prélevé pour la détermination de ses propriétés nutritives, biochimiques,
phytochimiques et fonctionnelles au cours de sa conservation à la température ambiante.

1-1-Profil socio-démographique des personnes interrogées

Pour l’ensemble des sites d’enquête, l’étude a permis de dresser le profil socio-
démographique des personnes interrogées soit 500 personnes au total. Il ressort de ces résultats
que 79 % des personnes enquêtées étaient de sexe masculin contre 31 % pour les femmes. Les
tranches d’âge majoritaires étaient de 25 à 50 ans (62,2 %) et de 15 à 25 ans (30,8 %). La plupart
des personnes interrogées n’avaient aucun niveau d’étude (54,4 %) dont la majorité exerçait
dans le secteur agricole (71 %) et les mariés (67,8 %) étaient les plus nombreux. Parmi les
personnes rencontrées les Ivoiriens (77,4 %) et le Burkinabé (19,8 %) étaient les plus dominants
(Tableau V).

66
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau V: Profil socio-démographique des personnes interrogées

Paramètres Effectifs Pourcentages

Sexe (n = 500)
Masculin 395 79
Féminin 105 21
Age (n = 500)
De 5 à 15 ans 20 4
De 15 à 25 ans 154 30,8
De 25 à 50 ans 313 62,6
Plus de 50 ans 13 2,6
Niveau d'étude (n = 500)
Aucun 272 54,4
Primaire 123 24,6
Secondaire 91 18,2
Supérieur 14 2,8
Profession (n = 500)
Elève 57 11,4
Etudiant 8 1,6
Artisan 8 1,6
Chômeur 3 0,6
Agriculteur 355 71
Autre 69 13,8
Situation matrimoniale (n = 500)
Marié 339 67,8
Célibataire 161 32,2
Nationalité (n = 500)
Ivoirienne 387 77,4
Ghanéenne 10 2
Burkinabé 99 19,8
Togolaise 4 0,8
n = nombre de personnes interrogées

67
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-2-Niveau de connaissance du jus de mucilage de cacao par ocalité

Le niveau de connaissance du jus de cacao ne diffère pas quelle que soit la localité. Il est
de 100% pour chaque localité (Figure 33). Par ailleurs, l’analyse statistique relatif au test de Khi-
deux (χ2) avec p>0,05 révélé qu’il n’y a pas de lien entre la variable localité et niveau de
connaissance du jus de mucilage de cacao.
120
100 100 100 100 100
100
Niveau de connaissance (%)

80

60

40

20

Localités

Figure 13 : Niveau de connaissance du jus de mucilage de cacao par localité

1-3- Moment de consommation du jus de mucilage de cacao selon les localités

Les résultats relatifs au moment de consommation du jus de mucilage de cacao montrent
que le jus de mucilage de cacao est plus consommé le soir dans la localité de Yakassé-Attobrou
avec un taux 41% suivi de la consommation durant les travaux champêtres avec 40% dans la
localité Taabo. Toutefois, l’analyse statistique a montré p> 0,05 (Tableau VI). Par conséquent,
il n’apparait pas de dépendance entre la localité et le moment de consommation.

68
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau VI: Moment de consommation du jus de mucilage de cacao par localités

Localités Moment de consommation (%) Paramètres de Khi-deux

(χ2)
Matin Travaux Soir Autres ddl (χ2obs) (χ2theo) P
champêtres
Akoupé 10 29 38 23
Tiassalé 12 31 36 21
Yakasse- 06 32 41 21 12 12,95 21,02 >0,05
Attobrou
Taabo 07 40 34 19
Buyo 15 24 33 28

1-4- Nature des effets bénéfiques du jus de mucilage de cacao

Les résultats de l’étude ont révélé divers effets bénéfiques à savoir laxatif, fortifiant,
antidiarrhéique, digeste et autres. Ces effets bénéfiques varient quelle que soit la localité. L’effet
le plus ressenti est laxatif. Les taux sont 42 %, 39 %, 41 %, 37 % et 34 % respectivement pour
les localités de Akoupé, Tiassalé, Yakassé-Attobrou, Taabo et Buyo. Toutefois, p>0,05
(Tableau VII). Ainsi aucun lien n’a été établi entre la nature de l’effet bénéfique ressenti et la
localité.

Tableau VII: Nature des effets bénéfiques du jus de mucilage de cacao par localité

Localités Nature des effets bénéfiques Paramètres de Khi-deux

(χ2)
Laxatif Fortifiant Anti Digeste Autre Aucun ddl (χ2obs) (χ2theo) P
Diarrhéique
Akoupé 42 26 14 14 03 1
Tiassalé 39 20 16 20 03 2
Yakasse- 41 35 12 11 0 1 20 22,72 31,41 >0,05
Attobrou
Taabo 37 26 17 18 0 2
Buyo 34 25 12 19 7 3

69
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-5- Quantités de jus de mucilage de cacao consommées

Les quantités de jus de mucilage de cacao diffèrent d’une localité à l’autre. La quantité
la plus consommée est de 1 Litre. Elles sont de 51%, 50%, 52%, 48% et 51% respectivement
pour les localités de Akoupé, Tiassalé, Yakassé-Attobrou, Taabo et Buyo. En effet p>0,05
(Tableau VIII). Ainsi, il n’y pas de lien entre la quantité consommée de jus de mucilage de
cacao et la localité.

Tableau VIII: Quantités de jus de mucilage de cacao consommées par localité

Localités Quantité consommée (%) Paramètres de Khi-deux

(χ2)
250 mL 500 mL 1L Plus de 1 L ddl (χ2obs) (χ2theo) P
Akoupé 09 21 51 19
Tiassalé 12 20 50 18
Yakasse- 10 21 52 17 12 2,46 21,02 >0,05
Attobrou
Taabo 13 23 48 16
Buyo 11 24 51 14

1-6-Temps de conservation du jus de mucilage de cacao

Les analyses ont montré que le temps de conservation du jus de mucilage varie en fonction de
la localité. Toutefois, le temps de maximale de conservation est de 3 jours. Les proportions du
temps de conservation de 3 jours étaient de 51%, 50%, 52%, 48% et 51% respectivement pour
les localités de Akoupé, Tiassalé, Yakassé-Attobrou, Taabo et Buyo. L’analyse statistique
relatif au test de Khi-deux (χ2) a montré que p>0,05 (Tableau IX). Par conséquent, il n’existe
pas de dépendance entre le temps de conservation du jus de mucilage de cacao et la localité.

70
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau IX: Temps de conservation du jus de mucilage de cacao dans les localités

Localités Temps de conservation (%) Paramètres de Khi-deux

(χ2)
1 Jour 2 Jours 3 Jours Autre ddl (χ2obs) (χ2theo) P
Akoupé 09 21 51 19
Tiassalé 12 20 50 18
Yakasse- 10 21 52 17 12 11,79 21,02 >0,05
Attobrou
Taabo 13 23 48 16
Buyo 11 24 51 14

1-5- Évolution des paramètres biochimiques des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation

I-5-1- Évolution des paramètres biochimiques des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation
Les paramètres biochimiques des jus de mucilage de cacao ont été évalués pour les
différents échantillons au même temps de conservation.
L’analyse des paramètres biochimiques a concerné l’extrait sec, l’humidité, les cendres, les
protéines, les lipides, les fibres et les glucides. Les valeurs de l’évolution de ces paramètres sont
consignées dans le tableau X. De façon générale, quel que soit le paramètre et les échantillons,
les valeurs évoluent de façon irrégulière au cours de la conservation. Ainsi, en début de
conservation (0 h), les valeurs de l’extrait sec, des teneurs en cendres et en glucides totaux les
plus élevées ont été observée l’échantillon de Taabo avec 12,29±0,06 % ; 0,63±0,05 % et
11,37±0,07 % respectivement. S’agissant de la teneur en proteins, le taux le plus élevé a été
enregistré au niveau de l’échantillon de Yakassé-Attobrou avec 0,40±0,01. Au bout de 24 h de
conservation, les valeurs les plus élevées de l’extrait sec, des teneurs en cendres et en glucides
totaux ont été observées avec l’échantillon de Taabo avec 12,31±0,08 % ; 0,59±0,06 % et
11,46±0,10 %. Le taux de protéines le plus élevé avec 0,66±0,02 % a été observé avec
l’échantillon de Tiassalé. Après de 48 h de conservation, les valeurs de l’extrait sec, des teneurs
en protéines et en glucides totaux les plus élevées ont été observée l’échantillon de Taabo avec
11,89±0,01 % ; 0,77±0,01 % et 10,64±0,04 % respectivement. La teneur la plus élevée en
cendres a été obtenue au niveau de l’échantillon de Tiassalé avec 0,62±0,03 %. En fin de
71
 RESULTATS ET DISCUSSION

conservation (72 h), les teneurs les plus importantes d’extrait sec et de glucides totaux avec
respectivement 10,04±0,01 % et 9,21±0,07 % ont été enregistrées avec l’échantillon de
Yakassé-Attobrou, alors que celle en cendres avec 0,63±0,07 % a été observée au niveau de
l’échantillon de Tiassalé. La teneur la plus importante en protéines a été obtenu au niveau de
l’échantillon de Buyo avec 0,46±0,01 %. De plus, les analyses statistiques ont montré une
différence significative (p < 0,05) entre les échantillons au cours de la conservation.
De manière générale, les lipides et les fibres brutes n’ont pas été détectés dans nos échantillons.

72
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau X: Teneur des paramètres biochimiques (%) des jus de cacao au cours de la conservation

Temps(h) Extrait sec(%) Humidité(%) Cendres(%) Protéines(%) Lipides(%) Fibres(%) Glucides(%)

T0 12,29±0,06a 87,70±0,06i 0,63±0,05a 0,30±0,01fghi 0 0 11,37±0,07a

T24 12,31±0,08a 87,64±0,01i 0,59±0,06abc 0,31±0,01fg 0 0 11,46±0,10abc

T48 11,89±0,01b 88,11±0,01hi 0,48±0,02abcd 0,77±0,01a 0 0 10,64±0,04a
Taabo
T72 5,29±0,14i 94,72±0,16bcd 0,38±0,04cdef 0,37±0,01de 0 0 4,53±0,07hi

T0 11,44±0,12c 88,56±0,12hi 0,44±0,01abcde 0,40±0,01cd 0 0 10,60±0,02ab

Yakassé T24 6,96±0,02g 93,03±0,02def 0,25±0,03efg 0,25±0,01hij 0 0 6,47±0,04fgh

T48 8,60±0,10f 91,39±0,10fg 0,28±0,01defg 0,33±0,01ef 0 0 8±0,13def
Attobrou
T72 10,04±0,01d 89,95±0,01gh 0,43±0,04abcde 0,41±0,02cd 0 0 9,21±0,07bcd

T0 5,46±0,11i 94,54±0,11cde 0,17±0,03fg 0,12±0,02l 0 0 5,17±0,06gh

T24 4,12±0,01j 97,37±2,12a 0,14±0,04g 0,12±0,01l 0 0 2,37±0,05j

T48 9,41±0,07e 90,58±0,07g 0,44±0abcde 0,30±0,01fghi 0 0 8,68±0,04cde
Akoupé
T72 8,70±0,16f 91,30±0,16fg 0,42±0,03abcde 0,40±0,01d 0 0 7,88±0,04def

T0 5,87±0,02h 94,12±0,02de 0,61±0,02ab 0,30±0,01fghi 0 0 4,97±0,05gh

Tiassalé T24 3,64±0,04k 96,36±0,04abc 0,42±0,05abcde 0,66±0,02b 0 0 2,56±0,05ij

T48 3,54±0,01k 96,45±0,01abc 0,62±0,03ab 0,14±0kl 0 0 2,79±0,02ij

T72 3,35±0,04kl 96,65±0,04ab 0,63±0,07a 0,2±0jk 0 0 2,52±0,06ij

T0 7,28±0,02g 92,72±0,02ef 0,38±0,07cdef 0,27±0ghi 0 0 6,63±0,40efg

Buyo T24 3,07±0,01l 96,92±0,01a 0,27±0defg 0,31±0fgh 0 0 2,5±0,02ij

T48 2,67±0,16m 97,325±0,16a 0,40±0,04bcde 0,25±0,01ij 0 0 2,03±0,03j

T72 2,44±0,03m 97,55±0,03a 0,35±0,02defg 0,46±0,01c 0 0 1,64±0,07j

Les valeurs exprimées sont les moyennes ± l’écart type de 3 mesures. Dans la même la colonne, les valeurs moyennes ne portant pas la même lettre sont 73
significativement différentes (p<0,05). T0 : 0h ; T24 : 24 heures ; T48 : 48 heures ; T72 : 72 heures
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-5-2- Évolution de la teneur en vitamines des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation
L’analyse de la teneur en vitamines par chromatographie en phase liquide à haute
performance a permis d’identifier et de quantifier 2 vitamines à savoir : l’acide ascorbique et la
cobalamine. Une irrégularité dans l’évolution des teneurs des vitamines (acide ascorbique et la
cobalamine) est observée pour tous les échantillons pour un même échantillon (localité) et au cours
de la conservation (Tableau XI). De manière générale, les teneurs en cobalamine sont plus
importantes que celles de l’acide ascorbique. Les teneurs les plus élevées en acide ascorbique et
en cobalamine sont enregistrées en début de conservation (0 h) dans l’échantillon de Tiassalé avec
respectivement 14,97± 0,45 et 34,51±0,69 g/L. A 24 h de conservation, les concentrations les plus
importantes d’acide ascorbique et cobalamine ont été observée dans l’échantillon de Taabo avec
9,6±0,63 g/L et 13,75±0,03 g/L respectivement.
Au de 48 h de conservation la concentration la plus élevée en acide ascorbique de 9,29±0,12 g/L
a été obtenu avec l’échantillon de Taabo alors que celle de la cobalamine de 20,61±0,25 g/L a été
observée avec l’échantillon de Akoupé. En fin de conservation (72 h) la concentration la plus
élevée en acide ascorbique de 9,20±2,89 g/L a été obtenu avec l’échantillon de Akoupé alors que
celle de la cobalamine de 14,87±0,70 g/L a été observée avec l’échantillon de Tiassalé. De plus
les analyses statistiques ont montré une différence significative (p < 0,05) entre les échantillons au
cours de la conservation.

74
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XI : Teneur en vitamines (g/L) des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation

Temps(h) Acide ascorbique Cobalamine

T0 7,43±0,43cdefg 13,86±0c
T24 9,60±0,63cd 13,75±0,03c
Taabo T48 9,29±0,12cd 12,98±0,28d
T72 4,73±0,38defg 12,94±0,11c
T0 4,62±0defg 14,66±0,38bc
T24 8,21±2,96cde 13,56±0,01
Yakassé- T48 7,74±1,65cde 12,87±1,06c
Attobrou T72 4,54±1,12defg 12,52±0,39c
T0 10,43±0,86bc 10,245±0,5cd
T24 7,50±0,70cdef 11,03±0,29c
Akoupé T48 5,27±0,29cdefg 20,61±0,25b
T72 9,20±2,89cd 12,15±0,19c
T0 14,97± 0,45ab 34,51±0,69a
T24 2,46±0,02fg 14,30± 0c
Tiassalé T48 3,59±0,57efg 13,52±0,67c
T72 5,93±0,44cdefg 14,87±0,70bc
T0 5,17±0,41defg 13,84±0,81c
T24 2,26±1,67g 13,39±0,69c
Buyo T48 2,25±1,41g 15,93±2,43d
T72 5,25±0,64cdefg 10,25±1,09cd

Les valeurs exprimées sont les moyennes ± l’écart type de 3 mesures. Dans la même la colonne, les
valeurs moyennes ne portant pas la même lettre sont significativement différentes (p<0,05).
T0 : 0h ; T24 : 24 heures ; T48 : 48 heures ; T72 : 72 heures

1-5-3- Évolution de la teneur en acides organiques des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation
L’analyse de la teneur en acides organiques par chromatographie en phase liquide à
haute performance a permis d’identifier et de quantifier 6 acides organiques à savoir : les acides
tannique, citrique, tartrique, fumarique, lactique et acétique (Tableau XII). A l’instar des autres
paramètres, l’évolution des teneurs en acides organiques au cours de la conservation est
irrégulière. La concentration la plus faible a été obtenue avec l’acide fumarique quel que soit
l’échantillon et ce, durant toute la durée de conservation. Aussi, pour les échantillons analysés
et durant toute la période de conservation les concentrations les plus importantes ont été
observées avec l’acide citrique et l’acide tartrique. Ainsi en début de conservation (0 h), les
concentrations les plus élevées étaient 23,52±1,38 g/L pour l’acide citrique et 25,13±1,37 g/L

75
 RESULTATS ET DISCUSSION

pour l’acide tartrique ont été obtenues dans l’échantillon Yakassé-Attobrou. Au bout 24h de
conservation les concentrations étaient de 75,66±1,32 g/L pour l’acide citrique et 77,77±1,31
g/L pour l’acide tartrique dans l’échantillon de Tiassalé. Après 48 h de conservation,
l’échantillon de Buyo a enregistré les concentrations les plus importantes d’acide citrique et
d’acide tartrique avec 36,38±0,51 g/L et 37,39±0,57 g/L respectivement. En fin de conservation
(72 h), les concentrations en acide citrique et en acide tartrique les concentrations les plus
élevées ont été obtenues dans l’échantillon de Buyo avec 28,25±1,59 g/L et 29,97±1,68 g/L
respectivement. Par ailleurs, les analyses statistiques ont montré une différence significative (p
< 0,05) entre les échantillons au cours de la conservation.

76
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XII: Teneur en acides organiques (g/L) des jus de mucilage de cacao au cours de la conservation
Temps(H) Acide Acide Acide citrique Acide Acide Acide
tannique Acétique lactique fumarique tartrique
T0 0,80±0,02cde 1,48±0,01efg 14,48±1,13ef 6,92±0,02fg 0,54±0ab 15,88±0,07f

T24 0,51±0,02de 0,86±0,04i 9,23±1,32g 4,32±0,20g 0,05±0,01b 8,97±1,31h

T48 0,56±0,02de 0,97±0,01ghi 10,37±0,10fg 4,49±0,30g 1,03±0,07a 9,92±0,07h
Taabo
T72 1,57±0,09bcde 3,44±0,07b 27,91±1,37c 13,34±0,09bcd 0,19±0,02b 16,27±0,04a
T0 1,40±0,02bcde 2,57±0,09c 23,52±1,38cd 10,55±1,34def 0,16±0b 25,13±1,37de

Yakassé T24 0,85±0,02bcde 1,66±0,29e 14,66±0,25ef 6,71±0,37fg 0,1±0b 15,7±0,14f

Attobrou T48 0,99±0bcde 1,80±0,07d 19,41±0,72de 7,89±1,28efg 0,13±0,02b 18,41±0,01f
T72 1,67±0,14bcd 2,55±0,11c 21,44±1,14d 10,88±0,20def 0,18±0b 24,31±1,4e
T0 1,30±0,02bcde 2,30±0,07cd 23,30±1,55cd 10,34±0,07def 0,15±0b 24,095±2,87e

Buyo T24 1,98±0,02bc 3,51±0,04b 35,75±0,14b 15,78±0,02bc 0,24±0,04b 36,43±0,57b

T48 1,90±0,01bc 3,63±0,04b 36,38±0,51b 16,24±0,01bc 0,21±0,04b 37,39±0,57b
T72 1,57±0,04bcde 2,82±0,05c 28,25±1,59c 12,49±1,28cde 0,19±0b 29,97±1,68c
T0 0,41±0,02e 0,74±0i 7,58±2,71g 3,33±1,37g 0,05±0b 7,77±1,31h

T24 0,43±0,04e 0,75±0i 7,60±0,42g 3,565±0,12g 0,054±0b 7,87±0,09h

T48 0,80±0,04cde 1,43±0,01efgh 14,48±0,11ef 6,39±0,12fg 0,097±0b 14,88±1,3fg
Akoupé
T72 0,58±0,01de 1,04±0,01fghi 10,47±2,72gh 4,61±0,15g 0,07±0,01b 10,76±1,32gh
T0 0,50±0,03de 0,89±0,11hi 9,20±0,11g 4,03±0,65g 0,062±0b 9,45±0,11h

Tiassalé T24 4,19±0,04a 7,42±0a 75,66±0,66a 33,33±0,73a 0,51±0,0ab 77,77±0,09a

T48 2,00±0,01b 3,71±0b 35,68±0,09b 17,53±0,01b 0,25±0b 36,80±0,02b
T72 0,87±0,09bcde 1,55±0,48ef 15,83±0,70e 6,97±0,21fg 0,1±0b 16,27±0,15f
Les valeurs exprimées sont les moyennes ± l’écart type de 3 mesures. Dans la même la colonne, les valeurs moyennes ne portant pas la même lettre sont significativement
différentes (p<0,05).
T0 : 0h ; T24 : 24 heures ; T48 : 48 heures ; T72 : 72 heures

77
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-5-4- Évolution de la valeur énergétique des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation
La valeur énergétique du jus de mucilage de cacao varie au cours de la conservation
quelle que soit la localité (figure 34). La valeur énergétique la plus élevée a été obtenue avec
l’échantillon de Taabo avec 40,59±0,8 kcal/100 mL en début de conservation (0 h) suivi de
celle l’échantillon de Yakassé-Attobrou avec 37,84±0,9 kcal/100 mL au bout de 24 h de
conservation. A 48 h de conservation, la valeur énergétique la plus importante est enregistrée
avec l’échantillon de Taabo avec 37,98±0,6 kcal/100 mL alors qu’en fin de conservation cette
valeur était plus importante avec l’échantillon d’Akoupe (37,09±0,8 kcal/100 mL). Par ailleurs,
l’analyse de variance a révélé une différence significative (p< 0,05) entre les échantillons au
cours de la conservation.

45 c c
b c d
40 c
b
Valeur énergétique (Kcal/100mL)

35 d
d b
30
a a
b
25 Tiassale
Yakasse-Attobrou
20
Taabo
15 a
a Akoupe
a a a
10 e e Buyo

0
0 24 48 72
Temps de conservation (heures)

Figure 34 : Valeur énergétique des jus de mucilage cacao au cours de la conservation

1-6- Évolution de la teneur en composés phénoliques des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation à la température ambiante
1-6-1- Évolution de la teneur en polyphénols totaux des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation à la température ambiante

78
 RESULTATS ET DISCUSSION

Les teneurs en polyphénols totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation sont présentés à la figure 35. Ces teneurs varient au cours de la conservation.
Cependant quelque soit l’échantillon, les teneurs les plus élevées en polyphénols totaux ont été
observées avec ceux de Tiassalé et ce tout au long de la conservation. Ces teneurs étaient de
1,17±0,7 en début de conservation à 1,32±0 g/L EAG en fin de conservation. Par ailleurs, les
analyses statistiques ont montré une différence significative entre les échantillons au cours de
la conservation.

1.6 a b c d e
a b c d e a b a b c
Teneur en polyhénols totaux (g/L EAG)

a b c d d
1.4

1.2

1
Akoupe
0.8 Yakassé

0.6 Taabo
Buyo
0.4
Tiassalé
0.2

0
0 24 48 72

Temps de conservation (Heures)

Figure 35 : Teneur en polyphénols totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation

1-6-2- Évolution de la teneur en flavonoïdes totaux des jus de mucilage de cacao au cours
de la conservation
La figure 36 présente l’évolution des teneurs en flavonoïdes totaux de nos échantillons
de jus de mucilage de cacao qui varie au cours de la conservation. Ainsi, en début de
conservation (0h), la teneur la plus importante est obtenue avec l’échantillon de Akoupé avec
0,08±0,01 g/L EQ suivi 24 h après de l’échantillon Buyo avec 0,14±0,01 g/L EQ puis de
l’échantillon de Yakassé-Attobrou avec 0,21±0,04 à 48 h et en fin de conservation (72h) avec
respectivement 0,21±0,01 et 0,16±0,01 g/L EQ. Par ailleurs, l’analyse de variance a révélé une
différence significative (p< 0,05) entre les échantillons au cours de la conservation.

79
 RESULTATS ET DISCUSSION

0.25
a b c c d
Teneur en flavonoïdes totaux (g/L EQ)

0.2
a a b c d
a b c d c

0.15 Akoupe
Yakassé
a b c d d
0.1 Taabo
Buyo
0.05 Tiassalé

0
0 24 48 72

Temps de conservation (Heures)

Figure 36 : Teneur en flavonoïdes totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation

1-6-3- Évolution de la teneur en tanins totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation
Les teneurs en tanins totaux varient au cours de la conservation (Figure 37). La
concentration la plus élevée en tanins totaux a été observée en début de conservation (0 h) au
niveau de l’échantillon de Tiassalé avec 60,40±0,68 g/L. Après 24 h de conservation, la
concentration la plus importante a été obtenue dans l’échantillon de Taabo avec 60,88±0,76
g/L. Les échantillons de Taabo et Tiassalé ont été enregistrées les concentrations les élevées
avec 35,27±2,56 g/L et 35,27±0,23 g/L respectivement. En fin de conservation (72 h) la
concentration la plus importante a été obtenue dans l’échantillon de Taabo avec 18,38±1,23
g/L. En outre, l’analyse de variance a révélé une différence significative (p< 0,05) entre les
échantillons au cours de la conservation.

80
 RESULTATS ET DISCUSSION

70
a b c a d
a b c d e
60
Teneur en tanins totaux (g/L)

50
a b c d c
40 Akoupe
Yakassé
30 Taabo
a b c a e
Buyo
20
Tiassalé
10

0
0 24 48 72

Temps de conservation (Heures)

Figure 37 : Teneur en tanins totaux des jus de mucilage de cacao au cours de la conservation

1-7- Évolution de l’activité antioxydante des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation
1-7-1- Évolution de l’activité antioxydante des jus de mucilage de cacao au cours de la
conservation par la méthode de DPPH (1,1-diphényl -2- picrylhydrazyle)
La figure 38 présente l’évolution de l’activité antioxydante des jus de mucilage
déterminée par la méthode de DPPH. Quel que soit l’échantillon, l’activité la plus importante a
été observée dans l’échantillon de Tiassalé et ce, durant toute la période de conservation. Les
valeurs étaient de 89,66±4,34 % ; 88,76±2,12 % ; 86,7±0,87 % et 87,78±1,56 % respectivement
à 0 h ; 24 h ; 48 h et 72 h. De plus, une différence significative (p<0,05) a été enregistrée entre
les échantillons au cours de la conservation.

81
 RESULTATS ET DISCUSSION

120
a b c d e
100 a b c d e
a b c d e a b c d e
Activité Antioxydante (%)

80
Akoupe
60 Yakassé
Taabo
40 Buyo
Tiassalé
20

0
0 24 48 72

Temps de conservation (Heures)

Figure 38 : Évolution de l’activité antioxydante (DPPH) des jus de mucilage de cacao au

cours de la conservation

1-7-2- Évolution de l’activité antioxydante des jus de mucilage de cacao au cours de la

conservation par la méthode FRAP (ferricyanure de potassium-chlorure ferrique)
L’évolution des valeurs de l’activité antioxydante déterminée par la méthode FRAP est
présentée à la figure 39. Pour l’ensemble des échantillons, l’activité antioxydante varie à
l’exception des échantillons de Taabo et Tiassalé. L’échantillon de Taabo est caractérisé par
une augmentation de l’activité antioxydante passant de 3,5±0,56 µg/mL de vit C en début de
conservation (0h) à 24,1±0,14 µg/mL de vit C en fin de conservation (72h). Par contre, au
niveau de l’échantillon de Tiassalé une baisse de l’activité antioxydante est observée tout au
long de la conservation avec des valeurs passant de 23,8±2,77 à 7,43±0,9 µg/mL de vit C. Par
ailleurs, quel que soit l’échantillon, l’activité antioxydante la plus importante a été obtenue avec
l’échantillon de Buyo au bout de 48 h de conservation avec 29,93±1,30 µg/mL de vit C tandis
que la plus faible activité a été enregistrée au niveau de l’échantillon de Taabo en début de
conservation (0h) avec 3,5±0,56 µg/mL de vit C. Aussi, une différence significative a (p<0,05)
été enregistrée entre les échantillons au cours de la conservation.

82
 RESULTATS ET DISCUSSION

35 a b c d a

30 a a b c d
a b c d e a b c d e
FRAP (µg/mL de Vit C)

25
Akoupe
20
Yakassé
15
Taabo
10 Buyo
Tiassalé
5

0
0 24 48 72

Temps de conservation (Heures)

Figure 39 : Évolution de l’activité antioxydante (FRAP) des jus de mucilage de cacao au

cours de la conservation
1-8- Analyse en composantes principales des caractéristiques phytochimiques et
antioxydantes
L’analyse en composantes principales effectuée à partir des paramètres phytochimiques
et antioxydants à 0 h de conservation est présenté à la figure 40A. Les deux axes Dim 1 et Dim
2 axes ont expliqué 80,20 % de la variabilité totale avec 47,86 % pour Dim 1 pour une valeur
propre de 2,393 et 32,33 % pour Dim 2 pour une valeur propre de 1,617 (Tableau XIII). Ainsi
en début de conservation (0h) l’activité antioxydante déterminée par la méthode FRAP est
fortement corrélée à la teneur en phénols totaux et tanins totaux avec respectivement pour
coefficient de corrélation r=0,698 et r=0,688. Cependant, une corrélation négative a été
observée entre la teneur en flavonoïdes totaux et l’activité antioxydante par DPPH (r=-0,807)
(Tableau XVI). Les polyphenols totaux, les tanins totaux et l’activité antioxydante (FRAP) ont
contribué fortement à la formation de l’axe Dim 1 tandis la formation de l’axe Dim 2 était due
aux flavonoids totaux (Figure 40B).

83
 RESULTATS ET DISCUSSION

Variables (axes F1 et F2 : 80,20 %) Biplot (axes F1 et F2 : 80,20 %)

1 Flavonoides
totaux 3

0.75 2.5
Flavonoides
2 totaux
Akoupe
0.5
1.5
Yakassé-
0.25 1
Attobrou

F2 (32,33 %)
F2 (32,33 %)

Tannins
totaux 0.5
0 Buyo
Polyphenols totaux
0

-0.25 -0.5
Taabo Tannins
FRAP -1
totaux
-0.5 Polyphenols totaux FRAP
-1.5

-0.75 -2
DPPH Tiassalé
DPPH
-2.5
-1 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
-1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1
F1 (47,86 %)
F1 (47,86 %)

(A) (B)
Figure 40 : Projection des variables initiales (paramètres phytochimiques) dans le plan formé
par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 0h de conservation

Tableau XIIIII : Valeurs propres et variances expliquées des axes principaux à 0h de

conservation

F1 F2
Valeur propre 3,447 1,355
Variabilité (%) 68,937 27,094
% cumulé 68,937 96,031

Tableau XIV: Corrélation entre les activités antioxydantes et les teneurs en composés
phénoliques en début de conservation (0h).

FRAP DPPH
Polyphénols totaux 0,698* -0,307

Flavonoïdes totaux 0,184 -0,807**

Tannins totaux 0,688* -0,124

*. La corrélation est significative au niveau 0.05 (unilatéral).
**. La corrélation est significative au niveau 0.01 (unilatéral).
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

84
 RESULTATS ET DISCUSSION

A 24 h de conservation, l’ACP présenté à la figure 41A a révélé que les deux axes Dim 1 et
Dim 2 axes ont expliqué 96,03 % de la variabilité totale avec 68,94 % pour Dim 1 pour une
valeur propre de 3,447 et 27,09 % pour Dim 2 pour une valeur propre de 1,355 (Tableau XV).
Les flavonoïdes totaux, les tanins totaux, les activités antioxydantes ont contribué
significativement à la formation de l'axe Dim 1 alors que seuls les polyphénols totaux ont
contribué significativement à l’axe Dim 2 (Figure 41B). Au bout de 24h de conservation, une
corrélation positive a été enregistrée entre l’activité antioxydante (FRAP) et les phénols totaux
et flavonoïdes totaux avec r = 0,761 et r = 0,610 respectivement en revanche l’activité
antioxydante (DPPH) a été positivement corrélée aux tanins totaux (r = 0,967) et négativement
corrélée aux flavonoïdes totaux avec pour coefficient de corrélation r = -0,936 (Tableau XVI).

Variables (axes Dim 1 et Dim 2 : 96,03 %) Biplot (axes Dim 1 et Dim 2 : 96,03 %)
1
4
Polyphenols totaux Polyphenols totaux
0.75
3

0.5FR AP FRAP Tiassalé

Tannins 2
Tannins
totaux
0.25 totaux
Dim 2 (27,09 %)

Dim 2 (27,09 %)

DPPH
1 DPPH
0
Buyo
0
-0.25 Ya kassé-
Flavonoides At tobrou Taabo
totaux -1
-0.5 Flavono ides
tota ux Akoup e
-2
-0.75

-3
-1 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
-1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1
Dim 1 (68,94 %)
Dim 1 (68,94 %)

(A) (B)
Figure 41 : Projection des variables initiales (paramètres phytochimiques) dans le plan formé
par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 24 h de conservation

Tableau XV : Valeurs propres et variances expliquées des axes principaux à 24 h de

conservation

F1 F2
Valeur propre 3,447 1,355
Variabilité (%) 68,937 27,094
% cumulé 68,937 96,031

85
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XVI: Corrélation entre les activités antioxydantes et les teneurs en composés
phénoliques à 24 h de conservation.

FRAP DPPH
Polyphénols totaux 0,761** -0,307

Flavonoïdes totaux 0,610* -0,936**

Tannins totaux -0,491 0,967**
*. La corrélation est significative au niveau 0.05 (unilatéral).
**. La corrélation est significative au niveau 0.01 (unilatéral).
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)
A 48 h de conservation, l’ACP a montré à la figure 42A que les deux axes Dim 1 et Dim
2 axes ont expliqué 88,34 % de la variabilité totale avec 63,84 % pour Dim 1 pour une valeur
propre de 3,192 et 24,50 % pour Dim 2 pour une valeur propre de 1,225 (Tableau XVII). Les
flavonoïdes totaux, les tanins totaux, les activités antioxydantes ont contribué significativement
à la formation de l'axe Dim 1 et la formation de l’axe Dim 2 était principalement due aux seuls
les polyphénols totaux (Figure 42B). Le tableau XVIII présente les coefficients corrélation entre
les teneurs en composés phénoliques et les activités antioxydantes à 48h de conservation. Il
ressort de ce tableau XVIII que de façon générale, l’activité antioxydante (FRAP) est
positivement corrélé aux flavonoïdes totaux (r=0,678) et négativement aux phénols totaux (r=-
0,867) tandis que l’activité antioxydante évaluée par la méthode DPPH le contraire était
observée. La corrélation entre l’activité antioxydante (DPPH) et les phénols totaux était positive
(r = 0,545) et négative avec les flavonoïdes totaux (r = -0,867).

86
 RESULTATS ET DISCUSSION

Variables (axes Dim 1 et Dim 2 : 88,34 %) Biplot (axes Dim 1 et Dim 2 : 88,34 %)
1
4 Polyphenols totaux
Polyphenols totaux
0.75
3

0.5 FRAP FRAP

2
Buyo
0.25
Dim 2 (24,50 %)

Dim 2 (24,50 %)
DPPH
1 DPPH
Tiassalé
0 Yakassé-
Flavonoides Attobrou
totaux 0
-0.25
Tan nins Flavonoides
tot aux totaux
-1
-0.5 Tannins Taabo
totaux Akoupe
-2
-0.75

-3
-1
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
-1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1
Dim 1 (63,84 %)
Dim 1 (63,84 %)

(A) (B)
Figure 42 : Projection des variables initiales (paramètres phytochimiques) dans le plan formé
par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 48 h de conservation
Tableau XVII : Valeurs propres et variances expliquées des axes principaux à 48 h de
conservation

F1 F2
Valeur propre 3,192 1,225
Variabilité (%) 63,838 24,503
% cumulé 63,838 88,342

Tableau XVIII : Corrélation entre les activités antioxydantes et les teneurs en composés
phénoliques à 48 h de conservation.

FRAP DPPH
Polyphénols totaux -0,847** 0,545*

Flavonoïdes totaux 0,678* -0,867**

Tannins totaux 0,370 -0,009

*. La corrélation est significative au niveau 0.05 (unilatéral).
**. La corrélation est significative au niveau 0.01 (unilatéral).
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

87
 RESULTATS ET DISCUSSION

En fin de conservation (72h), les deux axes Dim 1 et Dim 2 axes générés par l’ACP
(figure 43A) ont exprimé 81,74 % de la variabilité totale avec 61,79 % pour Dim 1 pour une
valeur propre de 3,089 et 19,95 % pour Dim 2 pour une valeur propre de 0,997 (Tableau XIX).
A l’instar des autres temps de conservation, les flavonoïdes totaux, les tanins totaux, les activités
antioxydantes ont contribué majoritairement à la formation de l'axe Dim 1 et la formation de
l’axe Dim 2 était le fait seul des polyphénols totaux (Figure 43B). En fin de conservation (72
h), le pouvoir réducteur du fer ferrique en fer ferreux (FRAP) était positivement corrélé aux
flavonoïdes totaux (r = 0,705) et aux tanins totaux (r = 0,759). En revanche, avec l’activité
antiradicalaire (DPPH), l’analyse a montré une corrélation positive avec les phénols totaux avec
r = 0,549 et une corrélation négative avec les flavonoïdes totaux où r = -0,732 (Tableau XX).

Variables (axes Dim 1 et Dim 2 : 81,74 %) Biplot (axesPolyhen

Dim 1olsettotaux
Dim 2 : 81,74 %)
1 Polyhenols to aux
4
t Flavonoi Flavonoides
0.75 totaux totaux
des 3
0.5
AkouYpaekassé-
2
FR Attobrou
0.25 Tiassalé
Dim 2 (19,95 %)

Dim 2 (19,95 %)

FRAP
Tannin DPPH
1
totaux AP
DPP0H
s Tannins
0 totaTuaxabo
-0.25
-1 Buyo
-0.5

-2
-0.75

-3
-1 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
-1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1
Dim 1 (61,79 %)
Dim 1 (61,79 %)
(A) (B)
Figure 43 : Projection des variables initiales (paramètres phytochimiques) dans le plan
formé par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 72 h de conservation

Tableau XIX : Valeurs propres et variances expliquées des axes principaux à 72 h de

conservation

F1 F2
Valeur propre 3,089 0,997
Variabilité (%) 61,788 19,947
% cumulé 61,788 81,735

88
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XX : Corrélation entre les activités antioxydantes et les teneurs en composés

phénoliques en fin de conservation (72h).

FRAP DPPH
Phénols totaux -0,366 0,549*

Flavonoïdes totaux 0,705* -0,753**

Tannins totaux 0,759** -0,420

*. La corrélation est significative au niveau 0.05 (unilatéral).
**. La corrélation est significative au niveau 0.01 (unilatéral).
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

1-9- Analyse en composantes principales et classification hiérarchique ascendante des jus

de mucilage de cacao au cours de la conservation
L’analyse en composantes principales et celle de la classification hiérarchique
ascendante des jus de mucilage de cacao au cours de la conservation spontanée ont permis de
réduire les vingt variables mesurées à quatre composantes principales virtuelles (Dim 1, Dim2,
Dim 3, Dim 4) dont Dim 1 et Dim 2 permet d’expliquer 79,17 ; 91,36 ; 83,53 et 80,71 % de la
variation totale respectivement à 0 h ; 24 h ; 48 h et 72 h de conservation. Pour la classification
hiérarchique ascendante l’intensité de la corrélation de la variable à l’axe est fonction de la
couleur. Ainsi, par exemple, plus la couleur bleue est foncée, plus le coefficient de corrélation
est élevé.

1-9-1-En début de conservation (0 h)

En début de conservation (0 h), ce sont les phénols totaux, tanins totaux, extrait sec,
humidité, valeur énergétique, acide ascorbique, acide tartrique, acide citrique, acide tannique,
acide acétique et l’acide lactique sont corrélés à l’axe Dim1 tandis que les flavonoïdes totaux,
DPPH, cendres, glucides totaux, cobalamine sont corrélés à l’axe Dim 2 (Figure 40) avec des
coefficients de corrélation compris entre 0,68 et 0,97. Ainsi, en début de conservation, les
échantillons ont été regroupés en 3 lots : les échantillons de Tiassalé et Akoupé sont similaires,
ceux Buyo et Yakassé-Attobrou sont aussi similaires et le dernier groupe est constitué de
l’échantillon de Taabo (Figure 45).

89
 RESULTATS ET DISCUSSION

Biplot (axes Dim 1 et Dim 2 : 80,71 %)

5

Glucides totaux
4 Flavonoides totaux
Extrait sec

FRAP
3
Akoupe Yakassé-Attobrou
Protéines
2 Valeur Energétique

Acide ascorbique Tannins totaux

1 Buyo
Dim 2 (31,03 %)

Fibres brutes Acide tannique

Lipides Acide fumarique
0
Acide acétique
Polyphenols totaux Acide lactique
Acide tartrique
-1 Acide citrique
Cobalamine

-2
Cendres Taabo

-3

DPPH
Tiassalé Humidité
-4

-5
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
Dim 1 (49,67 %)

Figure 44 : Projection des variables initiales (paramètres biochimiques et phytochimiques)

dans le plan formé par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 0h de conservation

90
 RESULTATS ET DISCUSSION

Cluster Dendrogram

7.5

5.0

Height
2.5

0.0
Taabo

Buyo

Akoupe

Tiassalé
Yakassé-Attobrou

(a) (b)
Figure 45 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et
dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) en début de conservation
Dim: axe
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

1-9-2-A 24 h de conservation
A 24 h de conservation, l’axe Dim 1 est fortement corrélé aux protéines, glucides totaux,
acide tartrique, acide citrique, acide fumarique, acide tannique, acide acétique, acide lactique et
moyennement corrélé aux phénols totaux, acide ascorbique. Par contre l’axe Dim 2 est
fortement corrélé au DPPH et moyennement aux tanins totaux, flavonoïdes totaux, cendres,
humidité (Figure 46). Les coefficients de corrélation sont compris entre 0,59 et 0,99. Ainsi, les
échantillons ont pu être classés en 4 groupes à savoir le groupe composé des échantillons de
Buyo et Yakassé-Attobrou, les 3 autres groupes comprenant respectivement les échantillons de
Akoupé, Taabo et Tiassalé (Figure 47).

91
 RESULTATS ET DISCUSSION

Biplot (axes Dim 1 et Dim 2 : 91,36 %)

8

Valeur Energétique
6 Acide acétique Glucides totaux
Cendres
Tannins totaux DPPH
Acide lactique
Cobalamine Taabo
4 Acide tannique Protéines

Tiassalé Extrait sec

2 Acide tartrique
Dim 2 (35,88 %)

Fibres brutes
Polyhenols totaux Lipides Acide ascorbique
0

Acide fumarique Yakassé-Attobrou

-2
FRAP
Acide citrique
Buyo
-4
Humidité

Akoupe Flavonoides totaux

-6

-8
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12
Dim 1 (55,48 %)

Figure 46 : Projection des variables initiales (paramètres biochimiques et phytochimiques)

dans le plan formé par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 24 h de conservation

92
 RESULTATS ET DISCUSSION

Cluster Dendrogram

7.5

5.0

Height
2.5

0.0

Taabo

Buyo
Akoupe
Tiassalé

Yakassé-Attobrou
(a) (b)
Figure 47 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et
dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) à 24 h de conservation
Dim: axe
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

1-9-3-A 48h de conservation

Au bout de 48 h de conservation, les variables contribuant fortement à l’axe Dim1
étaient l’extrait sec, l’humidité, protéines, valeur énergétique, acide ascorbique, acide tartrique,
acide citrique, acide tannique, acide acétique, acide lactique. Par ailleurs, les phénols totaux
sont moyennement corrélés à l’axe Dim 1. Les variables, tanins totaux et cendres sont fortement
corrélés à l’axe Dim 2 (Figure 48). Pour ces variables, les coefficients de corrélation étaient
entre 0,59 et 0,97. Par ailleurs, le dendogramme a montré que les échantillons de Akoupé et
Yakassé étaient similaires, mais différents des autres échantillons qui eux-mêmes étaient
différents les uns des autres (Figure 49).

93
 RESULTATS ET DISCUSSION

Biplot (axes Dim 1 et Dim 2 : 83,53 %)

8
Tannins totaux
Cendres
6

Valeur Energétique
DPPH
4 Acide fumarique

Taabo Tiassalé
2 Protéines
Polyphenols totaux
Dim 2 (19,54 %)

Extrait sec Fibres brutes

Lipides Acide lactique
0
Akoupe Cobalamine Acide tartrique
Acide ascorbique Humidité
-2
Buyo Acide tannique
Yakassé-Attobrou
Acide acétique
Glucides totaux
-4

Acide citrique
-6 Flavonoides totaux FRAP

-8
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12
Dim 1 (63,99 %)

Figure 48 : Projection des variables initiales (paramètres biochimiques et

phytochimiques) dans le plan formé par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 48 h de conservation

94
 RESULTATS ET DISCUSSION

Cluster Dendrogram

7.5

5.0

Height
2.5

0.0

Taabo
Buyo

Akoupe
Tiassalé

Yakassé-Attobrou
(a) (b)
Figure 49 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et
dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) au bout de 48 h de conservation
Dim: axe
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

1-9-4-En fin de conservation (72 h)

En fin de conservation (72 h), les variables contribuant fortement à l’axe Dim1 étaient
les phénols totaux, acide tartrique, acide citrique, acide fumarique, acide tannique, acide
acétique, acide lactique tandis que l’axe Dim 2 était fortement corrélé aux flavonoïdes totaux
(Figure 50). Les coefficients de corrélation variaient entre 0,55 et 091. La CHA a montré que
les échantillons de Taabo et Yakassé-Attobrou étaient identiques. Les échantillons de Buyo,
Tiassalé et Akoupé étaient différents les uns des autres (Figure 51).

95
 RESULTATS ET DISCUSSION

Biplot (axes Dim 1 et Dim 2 : 80,71 %)

5

Glucides totaux
4 Flavonoides totaux
Extrait sec

FRAP
3
Akoupe Yakassé-Attobrou
Protéines
2 Valeur Energétique Fibres brutes

Acide ascorbique Tannins totaux

1 Taabo
Dim 2 (31,03 %)

Acide tannique
Lipides Acide fumarique
0
Acide acétique
Polyphenols totaux Acide lactique
Acide tartrique
-1 Acide citrique
Cobalamine

-2
Cendres Buyo

-3
DPPH
Tiassalé Humidité
-4

-5
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
Dim 1 (49,67 %)

Figure 50 : Projection des variables initiales (paramètres biochimiques et

phytochimiques) dans le plan formé par les axes factoriels Dim1 et Dim2 à 72h de
conservation

96
 RESULTATS ET DISCUSSION

Cluster Dendrogram
9

Height

0
Taabo

Akoupe
Buyo

Tiassalé
Yakassé-Attobrou

(a) (b)
Figure 51 : Contribution des variables (a) dans la représentation des dimensions et
dendogramme des échantillons de jus de cacao (b) en fin de conservation (72 h)
Dim: axe
DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl
FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

97
 RESULTATS ET DISCUSSION

2- Discussion
Le jus de mucilage de cacao, sous-produit du cacao généré lors du processus du
traitement des fèves, est issu de la dégradation de la pulpe mucilagineuse enrobant les fèves par
l’action pectinolytique des levures présentes dans l’environnement (Barel, 2013). Ainsi,
souvent considéré comme un déchet, le jus de mucilage de cacao pourrait posséder des
propriétés nutritionnelles remarquables. Une enquête a été réalisée en vue de déterminer 1e
niveau de connaissance du jus de mucilage de cacao par les populations, sa durée maximale de
conservation et les bienfaits qui lui sont attribués. Il ressort de cette enquête que le jus de
mucilage de cacao est très bien connu des populations (100 %) surtout rurales avec un niveau
de consommation élevée (98,8 %). Ce niveau de consommation important pourrait-être liée aux
propriétés attribuées par les consommateurs (laxative, fortifiante, anti-diarrhéique). Dans leur
étude sur la consommation de la bière traditionnelle de sorgho produite en Côte d’Ivoire, Aka
et al. (2017) ont souligné que 53,4 % des personnes enquêtées ont affirmé l’avoir consommé
pour ses vertus thérapeutiques. Ainsi dans notre étude 39,70 % des personnes interviewées ont
attribué des propriétés laxatives au jus de mucilage de cacao et 20,44 % des propriétés
fortifiantes. En outre la majorité des consommateurs préfère consommer le jus de mucilage de
cacao le soir (37 %) à une fréquence de plus de 3 fois par jours (32,60 %) pour une quantité de
moyenne de 3 litres (52,80 %) par jour. La durée maximale de conservation à la température
ambiante du jus de mucilage de cacao était de 3 jours. En effet, les personnes interrogées
affirment que le jus n’est plus agréable à la consommation au-delà de 3 jours à cause de l’alcool
présent. Cette présence d’alcool associée à l’acidité du jus est due à une fermentation alcoolique
spontanée déclenchée par les levures présentes sur le matériel de traitement des fèves et dans
l’environnement (Koffi et al., 2013). Ainsi, l’analyse nutritionnelle et fonctionnelle du jus de
mucilage de cacao au cours de la conservation a été réalisée durant 3 jours.
L’évaluation des paramètres biochimiques et fonctionnels des jus de mucilage de cacao
a montré de façon générale une variation de ces paramètres. Les variations des teneurs en
cendres, en protéines, en glucides totaux pourraient être le fait de l’activité métabolique des
différents microorganismes présents naturellement dans le jus. En effet, selon Barel (2103), les
levures présentes dans le jus de mucilage métabolisent les sucres contenus dans le jus pour de
l’éthanol entraînant ainsi des variations de la concentration en sucres. Aussi, les variations des
teneurs en glucides totaux et protéines pourraient être liées aux activités des enzymes telles les
amylases ou glucosidases qui dégradent l’amidon contenu dans le jus ou des protéases qui elles
vont dégrader les protéines. Les valeurs des taux d’humidité de cette étude sont plus élevées

98
 RESULTATS ET DISCUSSION

que celles rapportés par Baensch et al. (2000) et Anvoh (2013). Par contre les teneurs en
protéines et en acide ascorbique sont plus importantes dans les échantillons de ces auteurs que
de celles de l’étude que nous avons effectué. Par ailleurs la présence de vitamines telles que
l’acide ascorbique et la cobalamine dans les jus de cette étude pourrait lui conférer la propriété
fortifiante que lui attribuent les consommateurs. Aussi, la teneur en cendres dans le jus de
mucilage de cacao pourrait suggérer la présence de minéraux ce qui fait de lui un aliment d’une
grande importance nutritionnelle. En effet, les minéraux font partir de la grande famille des
micronutriments. Certes, ils ne fournissent pas de calories, mais ils jouent un rôle important
dans les processus métaboliques du corps humain. La consommation accrue d’aliments qui en
contiennent peut améliorer la régulation minérale et réduire les risques de maladies
cardiovasculaires et certains risques de cancers (Ismail et al., 2011). Dans le monde il est estimé
à deux (2) milliards le nombre de personnes souffrant de malnutrition liée aux micronutriments
(Johns et al., 2006). Les femmes enceintes et celles qui allaitent, ainsi que les jeunes enfants
sont les premières victimes des carences, car leurs besoins en vitamines et en minéraux sont
plus importants. Ils souffrent donc davantage des conséquences préjudiciables de ces carences
(Black et al., 2003). Par ailleurs, les concentrations élevées en Acide citrique et Acide tartrique
déterminées dans nos jus de mucilage de cacao sont conformes à ceux trouvés par Schwan,
(1998) ; Ardhana & Fleet, (2003). En effet, ces auteurs ont indiqué que l’acide citrique se
trouvait à des teneurs élevées dans le jus de mucilage de cacao.
Aussi, les vertus thérapeutiques du jus de mucilage de cacao pourraient-elles être liées
à la présence de composés phénoliques au niveau des fèves et du mucilage. En effet, le cacao
est très riche en polyphénols (Lei et al., 2003). De plus, Bloch (2014) a souligné que le cacao
ivoirien était le 3è au rang des cacaos les plus riches en composés phénoliques. Par ailleurs,
Martin et Andrantsitohaina & Martin, (2002) et Hanhineva (2010) ont rapporté que les
polyphénols sont en effet, capables d’abaisser la pression artérielle chez le rat, d’empêcher
l’oxydation des LDL (lipoprotéines de faible densité), d’inhiber la prolifération des cellules
musculaires lisses vasculaires, d’empêcher l’agrégation plaquettaire et de stabiliser les cellules
immunitaires.
Ces composés ont été décrits comme étant des antioxydants, des anti-agrégants
plaquettaires, des anti-inflammatoires, des anti-allergènes, des anti-thrombotiques, des
antitumoraux neuroprotecteurs, antiviral, chimio-préventive et plus de preuves indiquent que
les polyphénols ont une influence sur le métabolisme lipidique et glucidique (Hanhineva, 2010).

99
 RESULTATS ET DISCUSSION

Par ailleurs, les fluctuations observées au niveau des teneurs en composés phénoliques et en
activités antioxydantes aussi bien évaluée par la méthode de DPPH que par la méthode de FRAP
pourraient être dues à la variété de cacao, aux techniques culturales, à l’espace et aux facteurs
environnementaux telle la pluviométrie, la température. En effet, Niemenak et al. (2004) ont
souligné que la teneur en polyphénols du cacao au cours de la fermentation pouvait augmenter
de 25 % pour certaines variétés ou diminuer de 11 à 25 % pour d’autres variétés. Aussi,
l’épicatéchine qui représente le flavonoïde plus important quantitativement est à l’origine de
nombreuses propriétés biologiques des aliments qui les contiennent. C’est un composé actif qui
a des propriétés anti-cancereuses. Des études ont démontré l'inhibition du développement et de
la progression du cancer de la prostate dans un modèle de souris transgénique, augmentant ainsi
leur survie L’épicatéchine améliore la relaxation des vaisseaux sanguins de manière comparable
à ce que fait un médicament comme l’aspirine. Sa consommation est potentiellement cardio-
protectrice (Mounjouenpou, 2008). Par ailleurs, les tanins contiennent 6 % de
polhydroxyphénol. C'est un composé organique qui inhibe le développement des bactéries
buccales (Mounjouenpou, 2008).
Dans cette étude, les jus de mucilage étaient issus de plusieurs variétés confondues d’où
l’expression “tout venant” dans le jargon de la cacao culture. En outre, l’analyse générale des
jus de mucilage de cacao des 5 zones échantillons au cours de la conservation a montré que les
jus pouvaient présenter à la fois des caractéristiques identiques et différentes au cours de la
conservation.
Le caractère laxatif du jus de mucilage de cacao attribué par les consommateurs pourrait
être du aux polyphénols. En effet, Les polyphénols ont été rapportés comme des composés
améliorant la digestion (Gary, 2013 ; Tarko et al., 2013). Dès lors la propriété laxative du jus
de mucilage de cacao serait plus du fait des composés phénoliques.
Aussi, les variations des teneurs des paramètres biochimiques, nutritionnels et
fonctionnels seraient largement liées à l’action des micro-organismes particulièrement
fermentaires naturellement présents dans le jus. En effet, Koffi et al. (2013) ont rapporté la
présence de levures et moisissures, de bactéries acétiques et lactiques, de Bacillus impliquées
dans le processus de fermentation des fèves de cacao en Côte d’Ivoire. Ainsi, les fluctuations
observées au niveau des acides organiques, des composés phénoliques pourraient être causées
par ces microorganismes. En effet, les levures produiraient de l’alcool par transformation des
sucres présents dans le jus, tout comme les bactéries acétiques et lactiques qui produiraient
principalement de l’acide acétique et l’acide lactique respectivement. Par ailleurs, Macheix et

100
 RESULTATS ET DISCUSSION

al. (2005) ont souligné que les levures étaient capables d’utiliser les composés pour leur
croissance.
Ainsi, ces levures vont concentrer l’essentiel de la suite de notre recherche qui
constituera la deuxième partie de notre étude. Cette partie sera consacrée aux propriétés
biotechnologiques des levures présentes dans le jus de mucilage de cacao.

Conclusion partielle
L’étude de l’état de connaissance sur le jus de mucilage de cacao a révélé que :
▪ Le jus de mucilage de cacao est bien connu des populations selon la totalité des
personnes interviewées (100%) pour l’ensemble des localités ;
▪ Le jus de mucilage de cacao peut se conserver sur une durée maximale de 3 jours
Les proportions du temps de conservation de 3 jours étaient de 51%, 50%, 52%, 48% et
51% respectivement pour les localités de Akoupé, Tiassalé, Yakassé-Attobrou, Taabo
et Buyo.
▪ Le jus de mucilage de cacao possède des vertus bienfaitrices particulièrement
laxative, fortifiante. L’effet le plus ressenti est laxatif. Les taux sont 42%, 39%, 41%,
37% et 34% respectivement pour les localités de Akoupé, Tiassalé, Yakassé-Attobrou,
Taabo et Buyo ;
▪ Une évolution irrégulière de tous les paramètres analysés est observée et ce quel
que soit le jus ;
▪ les jus de mucilage de cacao avaient des teneurs importantes en composés
phénoliques ainsi que des activités antioxydantes.

101
 RESULTATS ET DISCUSSION

CHAPITRE II : ÉTUDE DES PROPRIÉTÉS BIOTECHNOLOGIQUES

DES LEVURES DU JUS DE MUCILAGE DE CACAO EN
FERMENTATION

1- Résultats
A la suite de la précédente partie, les propriétés biotechnologiques des levures
résistantes à l’éthanol et/ou productrice de pectinase ont été isolées du jus de mucilage en
fermentation et identifiées.

1-1- Évolution des paramètres chimiques et microbiologiques (levures) du jus de mucilage

au cours de la fermentation spontanée du jus de mucilage de cacao

1-1-1-Évolution du pH et de l’acidité titrable (AT)

Les variations du pH et de l'acidité titrable au cours de la fermentation du jus de
mucilage de cacao sont indiquées dans la figure 48. Ces deux paramètres ont été liés. En effet,
l'augmentation des valeurs de pH était liée à la diminution de celles de l'acidité titrable et vice
versa. Les valeurs de pH et d'acidité titrable ont permis de classer les échantillons en 2 groupes
selon les phases observées au cours de la fermentation. Le premier groupe était composé des
échantillons Akoupé, Yakassé-Attobrou et Tiassalé. Ces échantillons ont été caractérisés par
une phase unique décroissante des valeurs de pH et une phase unique croissante des valeurs de
l’acidité titrable tout au long de la fermentation. Ces valeurs sont passées de 3,11±0,00 à
2,6±0,00 ; de 3,20±0,00 à 2,57±0,00 et de 3,01±0,00 à 2,21±0,00 respectivement pour les
échantillons Akoupé, Yakassé-Attobrou et Tiassalé. A l'opposé, les valeurs d'acidité titrable
ont augmenté au cours de la fermentation. Ces valeurs étaient comprises entre 1,21±0,01 et
2,11±0,01% ; 1,2±0,0 et 2,14±0,02% et 0,9±0,0 et 1,3±0,0% respectivement pour les
échantillons Akoupé, Yakassé-Attobrou et Tiassalé. Le deuxième groupe comprenait les
échantillons Tiassalé et Buyo. L’évolution des valeurs de pH et d’acidité titrable était marquée
par 2 phases. Une première phase caractérisée par une augmentation du pH et une baisse de
l’acidité titrable et une deuxième phase marquée par une diminution des valeurs de pH et une
augmentation de celles de l’acidité titrable. Les valeurs de pH ont augmenté de 3,93±0,0 à
3,99±0,0 et de 3,64±0,0 à 4,27±0,0 tandis que celles de l'acidité titrable ont diminué de
1,51±0,01 à 0,83±0,02% et de 1,39±0,24 à 1,03±0,06% respectivement pour les échantillons
Tiassalé et Buyo en fin de fermentation. Par ailleurs les écart-types n’apparaissent pas sur les
graphiques car leurs valeurs sont très faibles.

102
 RESULTATS ET DISCUSSION

Taabo
3.2 2.5 3.5 2.5
3.1 3
2 2

Acidité titrable (%)

Acidité titrable (%)

3
2.5
2.9
1.5 2 1.5
2.8

pH
pH

2.7 1.5 1
1
2.6
1
2.5 0.5 0.5
2.4 0.5
2.3 0 0 0
0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Durée de fermentation (heures) Durée de fermentation (heures)

Tiassalé Yakassé-Attobrou
4.5 1.8 3.5 1.6
1.6 1.4
3
Acidité titrable (%)

Acidité titrable (%)

1.4 1.2
2.5
4 1.2
1
1 2
pH
pH

0.8
0.8 1.5
0.6
3.5 0.6
1 0.4
0.4
0.5 0.2
0.2
3 0 0 0
0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120
Durée de fermentation (heures) Durée de fermentation (heures)

Buyo
4.4 1.8
1.6
Acidité titrable (%)

4.2
1.4
4 1.2
pH
pH

1
3.8 AT
0.8
3.6 0.6
0.4
3.4
0.2
3.2 0
0 24 48 72 96 120
Durée de fermentation (heures)

103
Figure 52 : Évolution du pH et de l’acidité titrable au cours de la fermentation des jus de
mucilage de cacao

RESULTATS ET DISCUSSION

104
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-1-2- Évolution de la charge levurienne, de l’ESR et du taux d’éthanol au cours de

fermentation spontanée du jus de mucilage de cacao
L’évolution des valeurs de la charge microbienne, de l’ESR et du taux l'éthanol observés
pendant la fermentation sont présentés dans la figure 49. Tous les échantillons ont présenté des
similitudes et des différences. Les similitudes dans l'évolution de ces paramètres ont été
observées au niveau des ESR et de l'éthanol et la différence a été enregistrée au niveau de la
charge microbienne. Pour tous les échantillons, les valeurs de l’ESR ont diminué alors que les
teneurs en éthanol ont augmenté. Ainsi, les valeurs de l’ESR ont diminué de 12,6±0,1 à 7,6±0
; de 12,6±0 à 7,8±0 ; de 12,4±0 à 7±0 ; de 13,2±0,14 à 1,6±0 et de 13,1±0,14 à 2±0
respectivement pour les échantillons Akoupé, Yakassé-Attobrou, Tiassalé, Taabo et Buyo. Les
teneurs en éthanol pendant la fermentation ont augmenté de 3,46 à 9,83 % dans les échantillons
Akoupe, de 1,67 % à 8,74 % dans les échantillons Yakasse-Attobrou, de 1,24% à 7,21% dans
les échantillons Tiassalé, de 1,6 % à 5,03 % dans les échantillons Taabo et de 0,84 % à 5,14 %
dans les échantillons Buyo.
En fin de fermentation, les teneurs en éthanol les plus élevées ont été enregistrées dans
les échantillons d'Akoupé, de Yakassé-Attobrou et de Tiassalé avec respectivement 9,83% ;
8,74 % et 7,21 %. La différence entre les échantillons a été observée au niveau de la charge
microbienne pendant la fermentation. Les échantillons Taabo et Buyo ont été caractérisés par
une croissance microbienne continue pendant la fermentation complète. La charge microbienne
était comprise entre 8,99±0,04 et 19,44±0,2 log (UFC/mL) dans les échantillons de Buyo et
entre 7,39±0,11 et 19,48±0,01 log (UFC/mL) dans les échantillons de Taabo. En revanche, dans
les échantillons d'Akoupé, de Yakassé-Attobrou et de Tiassalé, la croissance microbienne a
présenté trois phases. Premièrement, une phase exponentielle pendant les 48 heures de
fermentation où les charges microbiennes ont augmenté de 11,25±0,4 à 14,21±0,19 log
(UFC/mL) ; de 11,37±0,06 à 14,20±0,04 log (UFC/mL) et de 10,73±0,09 à 16,96±0,06 log
(UFC/mL) pour les échantillons d'Akoupé, de Yakassé-Attobrou et de Tiassalé respectivement.
La deuxième phase était une phase décroissante avec une diminution des charges microbiennes
entre 48 et 72 heures de fermentation.
Lors de cette phase, les charges microbiennes ont diminué de 14,21±0,19 à 10,38±0,04
log (UFC/mL) ; de 14,20±0,04 à 10,22±0,02 log (UFC/mL) et de 16,96±0,06 à 11,27±0,02 log
(UFC/mL) dans les échantillons d'Akoupé, de Yakassé-Attobrou et de Tiassalé. La dernière
phase, qui s'étend de 72 heures à la fin de la fermentation (120 heures), est une phase
stationnaire caractérisée par une très faible variation des valeurs des charges microbiennes.

105
 RESULTATS ET DISCUSSION

Ainsi, les charges microbiennes étaient de 10,38±0,04 et 10,15±0,05 log (UFC/mL) ;

10,22±0,02 et 9,55±0,1 log (UFC/mL) ; 11,27±0,02 et 11,19±0,1 log (UFC/mL) dans les
échantillons d'Akoupé, de Yakassé-Attobrou et de Tiassalé respectivement. Sur la base de la
teneur en éthanol, les échantillons ont pu être classés en deux groupes. Le premier groupe était
représenté par les échantillons de Taabo et Buyo avec des teneurs en éthanol en dessous de 7
%. Le second groupe était caractérisé par des teneurs en éthanol supérieures à 7 % et était
constitué des échantillons Akoupé, Yakassé-Attobrou et Tiassalé.

106
 RESULTATS ET DISCUSSION

Akoupé Yakassé-Attobrou
16 12 16 9

Charge levurienne (log UFC/mL)

Charge levurienne (log UFC/mL)

14 14 8
10
12 7

Taux éthanol (%)

12

Taux éthanol (%)

8 6

ESR (°Brix)
10 10
ESR (°Brix)

5
8 6 8
4
6 6
4 3
4 4 2
2
2 2 1
0 0 0 0
0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Durée de fermentation (heures) Durée de fermentation (heures)

Tiassalé Taabo
18 8
22 4
Charge levurienne (log UFC/mL)

16 7 20
Charge levurienne (log CFU/mL)

3.5
Taux éthanol (%)

14 6 18
3

Taux éthanol (%)

12 16
5 14 2.5
ESR (°Brix)

10
ESR (°Brix)

4 12
8 2
10
3 8 1.5
6
4 2 6 1
1 4
2 0.5
2
0 0 0 0
0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Durée de fermentation (heures) Durée de fermentation (heures)

Buyo
25 6
Charge levurienne

20 5
(log CFU/mL)

Taux éthanol (%)

ESR (°Brix)

Charge
4
15 levurienne
3 ESR
10

2
Ethanol
5 1
0 0
0 24 48 72 96 120
Durée de fermentation (Heures)

Figure 53 : Courbes de croissance (cercle), évolution de l'éthanol (carré) et de ESR (losange) au

cours de la fermentation du jus de mucilage de cacao des différentes localités
107
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-2- Identification moléculaire des isolats des levures résistants à l’éthanol

Les isolats de levures issus des échantillons de jus de mucilage de cacao en fin de
fermentation dont les taux en éthanol étaient égaux ou supérieurs à 7 % ont fait l’objet
d’identification moléculaire. Ainsi, donc ce sont les isolats émanant des échantillons de
Akoupé, Yakassé-Attobrou et Tiassalé qui ont fait l’objet d’identification moléculaire à raison
de 8 isolats en fin de fermentation par échantillon.

Les résultats de l’identification moléculaire des levures et les numéros d’accession (OP136085-
OP136108) des séquences nucléotidiques déposées dans la base de données de NCBI (National
Center of Biotechnology Information) sont indiqués dans le tableau XXI et les séquences
nucléotidiques sont présentées en annexe II. Le séquençage par la méthode moléculaire a permis
l’identification de 5 espèces pour l’ensemble des isolats identifiées. Ces espèces étaient
Rhodotorula mucilaginosa, Yarowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces
hansenii, Pichia kurdiavzevii. Les espèces Rhodotorula mucilaginosa, Yarowia lipolytica,
Saccharomyces cerevisiae ont été identifiées dans les échantillons de Yakassé-Attobrou avec
une proportion de 12,5 % pour Rhodotorula mucilaginosa, 12,5 % pour Saccharomyces
cerevisiaeet 75 % pour Yarowia lipolytica. Les isolats de Akoupé comprenaient 50 % de
Rhodotorula mucilaginosa et 50 % de Debaromyces hansenii. L’échantillon de Tiassalé
comprenait 50 % de Yarowia lipolytica, 12,5 % de Rhodotorula mucilaginosa et 37,5 % de
Pichia kurdiavzevii. A l’exception des isolats provenant de Akoupé, l’espèce Yarowia lipolytica
a été la plus détectée dans les échantillons de Yakassé-Attobrou et Tiassalé avec respectivement
75 et 50% (Tableau XXII).

108
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XXI : Identification des isolats de levures des jus de mucilage de cacao

Isolat Espèces Numéro d’accession

YA1 Rhodotorula mucilaginosa OP136085
YA2 Yarrowia lipolytica OP136086
YA3 Yarrowia lipolytica OP136087
YA4 Yarrowia lipolytica OP136088
YA5 Saccharomyces cerevisiae OP136089
YA6 Yarrowia lipolytica OP136090
YA7 Yarrowia lipolytica OP136091
YA8 Yarrowia lipolytica OP136092
AK1 Debaryomyces hansenii OP136093
AK2 Rhodotorula mucilaginosa OP136094
AK3 Debaryomyces hansenii OP136095
AK4 Debaryomyces hansenii OP136096
AK5 Rhodotorula mucilaginosa OP136097
AK6 Rhodotorula mucilaginosa OP136098
AK7 Debaryomyces hansenii OP136099
AK8 Rhodotorula mucilaginosa OP136100
TIAS1 Yarrowia lipolytica OP136101
TIAS2 Rhodotorula mucilaginosa OP136102
TIAS3 Pichia kudriavzevii OP136103
TIAS4 Pichia kudriavzevii OP136104
TIAS5 Yarrowia lipolytica OP136105
TIAS6 Pichia kudriavzevii OP136106
TIAS7 Yarrowia lipolytica OP136107
TIAS8 Yarrowia lipolytica OP136108
YA : Yakassé-Attobrou ; AK : Akoupé ; TIAS : Tiassalé

109
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XVIII : Distribution des espèces de levures identifiées

Echantillon Espèces Nombre d’isolats Taux (%)

Rhodotorula mucilaginosa 1 12,5
YA Saccharomyces cerevisiae 1 12,5
Yarowia lipolytica 6 75
Rhodotorula mucilaginosa 4 50
AK Debaromyces hansenii 4 50
Yarowia lipolytica 4 50
TIAS Rhodotorula mucilaginosa 1 12,5
Pichia kudriavzevii 3 37,5
YA : Yakassé-Attobrou ; AK : Akoupé ; TIAS : Tiassalé

110
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-3-Screening des isolats de levures producteurs de pectinases

La révélation sur gélose pectine des isolats de levures productrices de pectine a été
traduite par l’apparition d’un halo blanc autour du spot de la colonie (Figure 54). Ainsi, sur les
240 isolats de départ seulement six (06) isolats se sont révélés producteurs de pectinase avec
des diamètres du halo compris entre 10 et 20 mm (Figure 51). Le diamètre le plus élevé a été
obtenu avec l’isolat TIAS J0-6 et le plus petit avec l’isolat TIAS J4-8.

Spot de la colonie Résultat positif

Présence Halo
blanc

Absence d’halo
blanc Résultat négatif
Spot de la
colonie

Figure 54 : Révélation sur gélose pectine de production de pectinase par l’isolat TIAS J0-6

25
Diamètre de l'halo (mm)

20

15

10

0
Tias J0-6 Buy J2-1 YA J3-1 Buy J4-1 Tias J1-8 Tias J4-8

Isolats

Figure 55 : Diamètre des halos des isolats

110
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-4- Détermination des conditions optimales de production de la pectinase par 6 isolats

sélectionnés

1-4-1-Détermination du temps optimal de production de la pectinase

L’étude du temps d’incubation sur la production de pectinase par les six isolats
sélectionnés a révélé que l’activité pectinolytique augmentent avec le temps de d’incubation.
L’activité pectinolytique maximale a été enregistrée à 12 h d’incubation pour les tous isolats
sélectionnés, à l'exception de l'isolat Buy J4-1 qui a présenté une activité pectinase maximale à
16 h d'incubation (Figure 56). Les activités pectinases maximales à 12 h d'incubation étaient de
0,209±0,01 ; 0,237±0,002 ; 0,272±0,02 ; 0,327±0,02 ; 0,322±0,02 UI/mL respectivement pour
les isolats Tias J4-8 ; Tias J1-8 ; Tias J0-6 ; YA J3-1 ; Buy J2-1. En revanche, l'isolat Buy J4-
1, a présenté une activité pectinolytique maximale à 16 h d'incubation avec de 0,221±0,07
UI/mL. Sur la base du temps d'incubation, les isolats Tias J0-6, YA J3-1 et Buy J2-1 ont présenté
l'activité pectinase maximale par rapport aux autres isolats. De plus, l'analyse statistique a
montré une différence significative (p<0,05) entre ces isolats. L'activité pectinase maximale
dans cette étude a été observée à 12 h d'incubation.

0.4
Activité pectinolytique (UI/mL)

0.35

0.3

0.25 Tias J4-8

Tias J1-8
0.2
Tias J0-6
0.15 YA J3-1
Buy J2-1
0.1
Buy J4-1
0.05

0
0 4 8 12 16 20 24

Temps d'incubation (heures)

Figure 56 : Effet du temps d’incubation sur la production de pectinases par 6 isolats

sélectionnés

111
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-4-2-Effet du pH sur la production de la pectinase

A partir de l'extrait brut, la production de pectinase par les six isolats sélectionnés a été
testée en ajustant le pH du milieu liquide de pectine entre pH 5,0 et 8,0. La figure 57 illustre
l'effet du pH sur la production de pectinase. Les activités pectinolytiques les plus élevées
(0,074±0,005 et 0,06±0,00 U/mL) à pH 5,5 ont été observées avec les isolats Tias J0-6 et YA
J3-1. A pH 6 L'activité pectinase maximale (0,11±0,00 UI/mL) a été observée avec l'isolat Buy
J2-1. Au pH neutre (7), l'isolat Buy J2-1 a présenté l'activité pectinase la plus élevée (0,08±0,02
UI/mL). Les isolats Buy J1-4 et Tias J4-8 ont eu des activités pectinolytiques maximales
(0,054±0,01 et 0,076±0,001 UI/mL respectivement) à pH 8. L'isolat Tias J1-8 a eu une activité
pectinase optimale (0,045±0,01 UI/mL). En outre, l'analyse statistique a montré une différence
significative (p<0,05) entre les isolats pour un même pH.

0.14
Activité pectinolytique (UII/mL)

a b c dce
0.12
a b cdef
0.1 a b c def
a b c cde a b c cbd Tias J0-6
0.08
Buy J2-1
0.06 YA J3-1
Buy J1-4
0.04
Tias J1-8
0.02 Tias J4-8

0
5 5.5 6 7 8

pH

Figure 57 : Effet du pH du milieu sur la production de pectinase par 6 isolats sélectionnés

1-4-3-Effet de la température d’incubation sur la production de la pectinase

La température optimale de production de la pectinase de chaque isolat sélectionné a été
mesurée en déterminant son activité à différentes températures. De manière générale, l'effet de
la température d'incubation a également montré que la production de pectinase diminue avec
l'augmentation de la température d'incubation. Comme le montre la figure 58, sur les cinq
températures d'incubation testées (30, 40, 50, 60 et 70 °C), les activités maximales de pectinase

112
 RESULTATS ET DISCUSSION

ont été observées à 30 et 40 °C d'incubation. L'activité de l'enzyme a nettement diminué à des

températures supérieures à 40 °C. Parmi les six isolats sélectionnés, seul l'isolat Tias J0-6
présentait une activité pectinase maximale (0,151±0,003 UI/mL) à 40 °C. L'activité pectinase
maximale des autres isolats a été obtenue à 30 °C. À cette température (30 °C), les activités
enzymatiques étaient comprises entre 0,171± 0,001 et 0,124±0,002 UI/mL. Par ailleurs,
l’analyse de variance a révélé que la température d’incubation a un effet sur l’activité
pectinolytique des isolats sélectionnés. Par conséquent, il apparaît des différences significatives
au seuil de 5 %. Parmi les isolats sélectionnés, l'activité pectinase la plus élevée a été obtenue
avec l'isolat YA J3-1 (0,171± 0,001 UI/mL) suivi des isolats Buy J4-1 (0,143±0,001 UI/mL) et
Tias J4-8 (0,143±0,004 UI/mL). Ainsi, donc ces isolats de levures productrices de pectinase ont
l’objet d’identification moléculaire ce qui conduit au paragraphe suivant.

0.2
a bc dbd
0.18
0.16 a b cdce
Activité pectinolytique (UI/mL)

0.14
Tias J0-6
0.12
Buy J2-1
0.1
a b c cb e YA J3-1
0.08
Buy J4-1
0.06
Tias J1-8
0.04 a a b aca
a b c bde Tias J4-8
0.02
0
30 40 50 60 70

Temperature d'incubation (° C)

Figure 58 : Effet de la température d’incubation sur la production de pectinase par 6 isolats

sélectionnés

1-5- Identification moléculaire des isolats de levures producteurs de pectinase sélectionnés

1-5-1- Amplification de la région 5.8S rDNA-ITS

L’amplification de la région 5.8S-ITS de l’ADNr après révélation par électrophorèse
sur gel d’agarose a été positive pour les 6 isolats de levures productrices de pectinase
sélectionnés. Les amplicons générés par les 6 isolats ont tous la même taille autour de 380 pb
(Figure 59).

113
 RESULTATS ET DISCUSSION

M 1 2 3 4 5 6

400 pb
380 pb

M : marqueur (200 pb); 1-Tias J0-6; 2-Buy J2-1. 3-YA J3-1 ; 4-Buy J4-1 ; 5-Tias J1-8; 6-Tias J4-8

Figure 59 : Produits d’amplification par les amorces ITS 1 et ITS 4 de la région 5.8S-ITS de
l’ADNr des 6 isolats de levures productrices de pectinase sélectionnés

1-5-2- Caractérisation moléculaire des 6 isolats de levures productrices de pectinase

sélectionnés

Le séquençage des isolats de levures sélectionnés suivi du Blast a montré que tous les
isolats appartenaient à une seule et même espèce à savoir Yarrowia lipolytica quel que soit le
site d’échantillonnage. Les séquences partielles de l’ADN de toutes les 6 souches de ont été
déposées dans la base de données NCBI dont les numéros d'accession de ON202630-ON202635
sont indiqués dans le tableau XXIII. Seuls les échantillons émanant de Buyo, Tiassalé et
Yakassé-Attobrou contenaient des espèces les plus productrices de pectinase. Aussi ces espèces
ont été isolées durant les 4 premiers jours de la fermentation spontanée.

114
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XVIIII : Identification des 6 isolats de levure sélectionnées

Group Nucleotide sequence Specie Accession no

AGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAAGGCGCTCCCATTTGTAACCC
TCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCGGCAGTACACCGCCCACG
AGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCTCCACTCATTTCCTTCCCT
ATCAACAATTTCACATACTATTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTT
CACCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCACCAGTA Yarrowia lipolytica ON202630
BUY J2-1 TTTAGCTTTAGATGGAGTTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCA
AACAACTCGACTCTTTGATAAGGCAATACATGGAGAACGGTTAG
CCAGACGGGGTTGTCACCCTCTATGACGTACTATTCCAAGCAACT
TGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCTTCAAATTACAATCCCGA
GGGTTTCAAATTTGAGCTTTT

ACAATTTCACATACTATTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCACC
TTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCACCAGTATTTA
BUY J4-1 GCTTTAGATGGAGTTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCAAAC Yarrowia lipolytica ON202631
AACTCGACTCTTTGATAAGGCAATACATGGAGAACGGTTAGCCA
GACGGGGTTGTCACCCTCTATGACGTACTATTCCAAGCAACTTGG
GTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCTTCAAATTACAATCCCGAGGG
TTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACT

GGCAGTGTGGAGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAAGGCGCTCCCA
TTTGTAACCCTCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCGGCAGTAC
ACCGCCCACGAGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCTCCACTCAT
TIAS J0-6 TTCCTTCCCTATCAACAATTTCACATACTATTTCACTCTCTTTTCA Yarrowia lipolytica ON202632
AAGTTCTTTTCACCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCT
CTCACCAGTATTTAGCTTTAGATGGAGTTTACCACCCACTTTGAG
CTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTGATAAGGCAATACATGGA
GAACGGTTAGCCAGACGGGGTTGTCACCCTCTATGACGTACTATT
CCAAGCAACTTGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCTTCAAATT
ACAATCCCGAGGGTTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCG

GGCAGTGTGGAGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAAGGCGCTCCCA
TTTGTAACCCTCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCGGCAGTAC
ACCGCCCACGAGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCTCCACTCAT
TTCCTTCCCTATCAACAATTTCACATACTATTTCACTCTCTTTTCA Yarrowia lipolytica ON202633
TIAS J1-8 AAGTTCTTTTCACCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCT
CTCACCAGTATTTAGCTTTAGATGGAGTTTACCACCCACTTTGAG
CTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTGATAAGGCAATACATGGA
GAACGGTTAGCCAGACGGGGTTGTCACCCTCTATGACGTACTATT
CCAAGCAACTTGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCTTCAAATT
ACAATCCCGAGGGTTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGC
CCGTT

TCGTCGGTGGCAGTGTGGAGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAAGG
CGCTCCCATTTGTAACCCTCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCG
GCAGTACACCGCCCACGAGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCT
CCCACTCATTTCCTTCCCTATCAACAATTTCACATACTATTTCACT
TIAS J4-8 CTCTTTTCAAAGTTCTTTTCACCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCT Yarrowia lipolytica ON202634
ATCGGTCTCTCACCAGTATTTAGCTTTAGATGGAGTTTACCACCC
ACTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTGATAAGGCAA
TACATGGAGAACGGTTAGCCAGACGGGGTTGTCACCCTCTATGAC
GTACTATTCCAAGCAACTTGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATC
TTCAAATTACAATCCCGAGGGTTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTT
CACTCGCCGT

TCGTCGGTGGCAGTGTGGAGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAAGG
CGCTCCCATTTGTAACCCTCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCG
GCAGTACACCGCCCACGAGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCT
CCACTCATTTCCTTCCCTATCAACAATTTCACATACTATTTCACTC
TCTTTTCAAAGTTCTTTTCACCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTA Yarrowia lipolytica ON202635
TCGGTCTCTCACCAGTATTTAGCTTTAGATGGAGTTTACCACCCAC
YA J3-1 TTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTGATAAGGCAATA
CATGGAGAACGGTTAGCCAGACGGGGTTGTCACCCTCTATGACGT
ACTATTCCAAGCAACTTGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCTTC
AAATTACAATCCCGAGGGTTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCA

115
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-6- Purification et caractérisation partielles des pectinases des espèces Yarrowia lypolitica
Dans cette partie de l’étude, les souches de Yarrowia lipolytica (Tias J0-6 ; Buy J2-1 et
YA J3-1) ont été sélectionnées pour la purification et la caractérisation sur la base de leur
activité enzymatique maximale par aux paramètres physico-chimiques (pH, température, temps
d’incubation) émanant des extraits bruts respectifs.

1-6-1- Chromatographie par échange d’anions avec le gel DEAE Sepharose Fast Flow
Pour la purification partielle des extraits bruts pectinolytiques des souches de
Yarrowia lipolytica sélectionnées, seule la représentation graphique de la souche Yarrowia
lipolytica TIAS J0-6 a été illustrée à figure 60. Les protéines sont éluées dans les échantillons
compris entre les tubes 85 et 89. L’activité maximale du pic de la chromatographie a été
enregistrée dans le tube 87, ce qui correspond à une activité totale de 0,209 UI/mL.

0.6 0.25
Absorbance (A 540) et [NaCl (M)]

0.5

Acitvité Totale (UI/mL)

0.2

0.4
0.15
0.3
0.1
0.2

0.05
0.1

0 0
1
5
9
13
17
21
25
29
33
37
41
45
49
53
57
61
65
69
73
77
81
85
89
93
97
101
105
109

NaCl Absorbance Activité totale

Fractions

Figure 60 : Représentation graphique de la souche Yarrowia lipolytica TIAS J0-6

1-6-2- Paramètres de la purification partielle des pectinases

Les paramètres des purifications partielles des pectinases sur le gel DEAE-Sepharose
fast Flow sont présentés dans les tableaux XXIV, XXV, XXVI. La pectinase produite par la
souche de Yarrowia lipolytica Tias J0-6 a été purifiée 1,13 fois pour un rendement de 28,86%.
116
 RESULTATS ET DISCUSSION

Les pectinases produites par les souches de Yarrowia lipolytica Buy J2-1 et de YA J3-1 ont été
purifiées 1,04 et 1,02 avec des rendements respectifs de 35 et de 58,77%.

Tableau XXIV : Bilan partiel de la purification de l’enzyme produite par Yarrowia lipolytica
Tias J0-6

Purification Protéine Activité Activité Taux de Rendement

totale totale Specifique Purification (%)
(mg) (UI) (UI/mg)
Extrait brut 3,625 0,638 0,176 1 100

Chromatographie 0,915 0,183 0,2 1,13 28,68

échangeuse d’ion

Tableau XXV : Bilan partiel de la purification de l’enzyme produite par Yarrowia lipolytica
Buy J2-1

Purification Protéine Activité Activité Taux de Rendement

totale totale Specifique Purification (%)
(mg) (UI) (UI/mg)
Extrait brut 3,859 0,667 0,172 1 100
Chromatographie 2,226 0,392 0,176 1,02 58,77
échangeuse d’ion

Tableau XXVI : Bilan partiel de la purification de l’enzyme produite par Yarrowia lipolytica
YA J3-1

Purification Protéine Activité Ativité Taux de Rendement

totale totale Specifique Purification (%)
(mg) (UI) (UI/mg)
Extrait brut 6,82 0,6 0,087 1 100
Chromatographie 2,382 0,210 0,088 1,04 35
échangeuse d’ion

117
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-6-3- Caractéristiques physico-chimiques des pectinases partiellement purifiées

1-6-3-1-Effet du pH sur l’activité enzymatique

L’effet du pH sur l’activité enzymatique des extraits enzymatiques partiellement
purifiés est présenté à la figure 61. L’activité enzymatique maximale est atteinte à pH 7 quelle
que soit la souche de Yarrowia lipolytica,. L’activité enzymatique la plus importante a été
obtenue avec l’extrait de la souche de Yarrowia lipolytica Buy J2-1 avec 0.29±0.002 UI/mL
suivi de celle de la souche Yarrowia lipolytica YA J3-1 avec 0,200±0,006 UI/mL et enfin de
Yarrowia lipolytica Tias J0-6 avec 0.168±0.0016 UI/mL.

0.35

0.3
Activité pectinolytique (U/mL)

0.25

0.2
Tias J0-6
0.15
Buy J2-1
0.1 YA J3-1

0.05

0
5 5.5 6 7 8
pH

Figure 61 : Effet du pH sur l’activité enzymatique

1-6-3-2-Effet de la température sur l’activité enzymatique

La figure 58 montre l’évolution de l’activité enzymatique des extraits partiellement
purifiés en fonction de la température. Le test de l’effet de la température sur l’activité
enzymatique a permis de révéler que les enzymes produites par les souches de Yarrowia
lipolytica Buy J2-1 et Tias J0-6 sont thermorésistantes avec des activités maximales de
0,36±0,01 UI/mL et 0,122±0,008 UI/mL respectivement à 60 et 50 °C. La pectinase
partiellement purifée produite par la souche Yarrowia lipolytica YA J3-1 a présenté une activité
maximale de 0,177±0,005 UI/mL à 30 °C.

118
 RESULTATS ET DISCUSSION

0.4
Activité pectinolytique (UI/mL) 0.35

0.3

0.25

0.2 Tias J0-6

0.15 Buy J2-1
YA J3-1
0.1

0.05

0
30 40 50 60 70

Température (° C)

Figure 62 : Effet de la température sur l’activité enzymatique

1-6-4- Constantes cinétiques des pectinases partiellement purifiées

Les constantes cinétiques Km (constante de Michaelis) et Vmax (constante maximale)
déterminées par la méthode graphique en coordonnées inverses de Lineweaver et Burk (1934)
est présenté à la figure 59. Les valeurs de Km et Vm sont 5 mg/mL et 0,0316 mg/mL/min ; 2,74
mg/mL et 0,032 mg/mL/min ; 2,53 mg/mL et 0,053 mg/mL/min respectivement pour les
souches Yarrowia lipolytica Tias J0-6, YA J3-1 et Buy J2-1.

119
 RESULTATS ET DISCUSSION

BUY J2-1 YA J3-1

100 y = 117.29x + 31.12
60 y = 46.862x + 18.625 90 R² = 0.9744
R² = 0.992 80
50
70

1/V0
40 60
1/V0

50
30
40
- 1/ Km = - 0,395 20 - 1/Km = - 0,365 30
20 1/Vmax = 31,12
10 1/Vmax = 18,63
10
0 0

-0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/[S] 1/[S]

TIAS J0-6
120 y = 157.19x + 31.641
110 R² = 0.9907
100
90
80
1/V0

70
60
50
- 1/ Km = - 0,2 40
30
20 1/Vmax = 31,64
10
0

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/[S]

Figure 63 : Détermination graphique des constantes cinétiques Km et Vmax

120
 RESULTATS ET DISCUSSION

2- Discussion

Longtemps considéré comme un déchet, le jus de cacao pourrait avoir un intérêt

biotechnologique. En effet, lors du traitement post-récolte des fèves de cacao, le jus de cacao
est soumis à une fermentation spontanée au cours de laquelle des changements physico-
chimiques et microbiologiques ont été observés (Sandra et al., 2007 ; Elena et al., 2007 ; Camu
et al., 2007 ; Nielsen et al., 2007). Aussi, a-t-elle indiqué que le pH est corrélé négativement à
l’acidité titrable. Cela se traduit par le fait que la diminution des valeurs du pH est liée à
l’augmentation des valeurs de l’acidité et vice-versa. Cette observation serait due aux activités
métaboliques des microorganismes impliqués dans la fermentation. Pendant la fermentation,
les métabolites sous forme d'acides organiques sont produits et contribuent à l'acidification du
jus (Herrero et al., 1999 ; N’guessan et al., 2008). Ainsi, les acides organiques sont le support de
l'acidité. Cette acidité est la conséquence d'un pH faible et d'une acidité titrable élevée du jus.
L'évolution de la charge en levures, des ESR et du taux d'éthanol pendant la fermentation
spontanée du jus de cacao a montré que les échantillons d'Akoupé, de Yakassé-Attobrou et de
Tiassalé étaient caractérisés par une diminution de la charge en levures à partir de 48 h. Cette
diminution de la charge en levures serait causée par l'éthanol. En effet, la fermentation impose
une variété de stress à la cellule de levure parmi lesquelles la concentration en éthanol reste le
stress le plus important (Stanley et al., 2010). Dans cette étude, l'augmentation du taux d'éthanol
est corrélée à la diminution de la charge en levures. En effet, l'éthanol cible principalement les
membranes, augmentant leur fluidité et leur perméabilité, affectant ainsi le système de transport
de composés essentiels tels que les acides aminés et le glucose. Son accumulation compromet
un large éventail de fonctions cellulaires, entraînant une réduction du taux métabolique, de la
croissance et de la viabilité des cellules, et favorisant finalement une fermentation lente
(Alexandre et al., 2001 ; Gibson et al., 2007, N’guessan et al., 2016). Cependant, la présence
de levures à la fin de la fermentation spontanée pourrait signifier une tolérance ou une résistance
à l'éthanol. Le phénomène de la tolérance à l'éthanol est relativement difficile à étudier car il
n'existe pas de modèle universel pour le quantifier. Certains auteurs se basent sur des valeurs
de croissance cellulaire (Thomas & Rose, 1979 ; Beavan et al., 1982), de taux de production
spécifique d'éthanol (Thomas & Rose, 1979) ou de viabilité cellulaire (Dombek & Ingram, 1986
; Birch & Walker, 2000) pour comparer leurs résultats aux résultats de réfécence des auteurs
précédemment mentionnés. Il est également possible d'étudier le flux de protons à travers la
membrane plasmique (Jiménez & van Uden, 1985). En somme, l'étude de la tolérance à

121
 RESULTATS ET DISCUSSION

l'éthanol dépend du paramètre auquel on se réfère. Dans cette étude, la tolérance à l'éthanol a
été définie comme la capacité de la levure à maintenir sa viabilité à des concentrations d'éthanol
relativement élevées.
Ainsi, l'identification des isolats de levures provenant des échantillons d'Akoupé, de
Yakassé-Attobrou et de Tiassalé où les taux d'éthanol étaient compris entre 7,21 % et 9,83 % a
permis de révéler la présence de 5 espèces pour tous les isolats : Rhodotorula mucilaginosa,
Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces hansenii, Pichia kurdiavzevii.
Globalement, Yarrowia lipolytica était l'espèce majoritaire (41,16 %) suivie de l'espèce
Rhodotorula mucilaginosa (25 %), de l'espèce Debaromyces hansenii (16,66 %), de l'espèce
Pichia kurdiavzevii (12,5 %) et de l'espèce Saccharomyces cerevisiae (4,16 %). Contrairement
à plusieurs études qui ont montré la grande capacité de l'espèce Saccharomyces cerevisiae à
résister à l'éthanol, dans cette étude ce sont les espèces non-Saccharomyces qui sont majoritaires
dans les jus de cacao en fermentation spontanée dans tous les échantillons. Ceci démontre la
capacité des espèces non-Saccharomyces à tolérer l'éthanol. Ainsi, certains auteurs ont rapporté
la résistance à l'éthanol d'espèces non-Saccharomyces. Le fait que les non- Saccharomyces aient
présenté une plus grande tolérance à l'éthanol que certaines souches de S. cerevisiae n'est pas
surprenant, car de plus en plus d'études rapportent des isolats de vin d'espèces non-
Saccharomyces, qui présentent des tolérances à l'éthanol similaires à celles de S. cerevisiae (Pina
et al., 2004 ; Nisiotou et al., 2007). Selon Biryukova et al. (2009), Yarrowia lipolytica était
capable de résister à 15 % (v/v) d'éthanol après un pré-traitement des cellules à 1 % (v/v)
d'éthanol. Par ailleurs, Coulibaly et al. (2017) ont trouvé que l'espèce Candida tropicalis était
capable de maintenir un taux de survie de 80 % à 7,5 % d'éthanol. De même, Hanseniaspora
guilliermondii isolé du moût de raisin utilisé pour la production de vin de Porto dans la région
du Douro au Portugal, a montré une tolérance à l'éthanol très similaire à celle de Saccharomyces
cerevisiae à 25 % (v/v) d'éthanol (Pina et al., 2004). Selon Rosa et al. (2017), Candida
californica IT2-010, Hanseniaspora vineae IT2, Pichia cecembensis IT0-042 isolés du moût de
raisin Isabella ont montré la croissance à 7,5 % d'éthanol et Torulaspora delbrueckii IT1-039 a
montré une croissance importante à 10 % d'éthanol. Les souches RG1 de Issatchenkia orientalis
isolées de la bière traditionnelle rwandaise de sorgho ikigage ont montré une bonne tolérance à
10 % d'éthanol. De même, parmi plusieurs souches non-Saccharomyces, seule la souche RG1
de I. orientalis a été capable de survivre dans de l'éthanol à 15 % (Lyumugabe et al., 2010).
Selon Okuma et al. (1986) et Isono et al. (2012), Issatchenkia orientalis est très bien connue
comme première levure à haute tolérance à l'éthanol. En outre, Mendes-Ferreira et al.

122
 RESULTATS ET DISCUSSION

(2018) ont signalé que les souches de Metschnikowia pulcherrima de la région viticole du
Douro étaient capables de se développer en présence de la concentration maximale testée (12
% v/v d'éthanol). Ces auteurs ont affirmé que c'est la première fois que cette haute tolérance à
l'éthanol a été rapportée dans des souches de Metschnikowia pulcherrima. Le mécanisme qui a
permis aux souches non-Saccharomyces de résister à l'éthanol pourrait être un ajustement de la
composition des lipides membranaires, en particulier la synthèse d'acides gras non saturés, de
graisses neutres et de phospholipides (You et al., 2003 ; Shobayashi et al., 2005 ; Coulibaly et
al., 2018). Par ailleurs, La tolérance relativement élevée de l'alcool par les levures non-
Saccharomyces serait liée à la nature de la niche écologique d'où elles ont été isolées. En effet,
le jus de cacao contient des sucres et des nutriments favorables à la croissance des micro-
organismes et à la fermentation alcoolique. Les microorganismes présents dans un
environnement alcoolisé pourraient être susceptibles de développer une adaptation
physiologique. Nos résultats sont en accord avec ceux de Tra Bi (2017) qui a rapporté que la
résistance à l’éthanol des souches de Saccharomyces cerevisiae était influencée par la teneur en
éthanol des boissons traditionnelles d’où elles ont été isolées à savoir le vin de palmier à huile,
le vin de palmier raphia et la bière de sorgho.
Récemment reconnues pour leur influence significative sur les propriétés
organoleptiques et sensorielles du vin (Jolly et al., 2014 ; Padilla et al., 2016 ; Varela &
Borneman, 2017), de la bière traditionnelle de sorgho (Coulibaly et al., 2016), les souches non-
Saccharomyces de cette étude ont montré une bonne résistance à l'éthanol. D'autre part, la
répartition des espèces de levures résistantes à l’éthanol dépendait de la zone géographique. En
effet, les échantillons d'Akoupé et de Yakassé-Attobrou dans le Sud-Est étaient caractérisés par
la prédominance de Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica, Debaromyces hansenii
tandis que les échantillons de Tiassalé dans le Sud étaient caractérisés par celle de Yarrowia
lipolytica et Pichia kudriavzevii.
Une des propriétés biotechnologiques des souches de levures isolées des jus de
mucilage de cacao en fermentation spontanée évaluée était la production de pectinase. En effet,
cette enzyme a été étudiée car le jus de mucilage résulte de la dégradation pectinolytique de la
pulpe mucilagineuse qui enrobe les fèves par l’action de microorganismes. Ainsi, le screening
deux cent quarante (240) isolats, a permis la sélection de seulement six isolats sur la base de
leur capacité à hydrolyser la pectine avec un diamètre de zone claire supérieur ou égal à 10 mm.
Sur la base du criblage, les six isolats se sont avérés être productrices potentielles d'enzyme
pectinolytique. Ainsi, les pectinases de ces six isolats ont été caractérisées. Les diamètres de la

123
 RESULTATS ET DISCUSSION

zone claire dans notre étude étaient plus élevés que ceux trouvés par Banu et al. (2010) ;
Thangaratham & Manimegalai (2014) et Dange & Harke (2018) qui ont trouvé dans l’ensemble
3 à 4,3 mm de zone claire respectivement pour Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger,
Aspergillus flavus, Rhizopus oryzae et Aspergillus oryzae. D'autre part, Poondla et al. (2015)
ont signalé qu'une souche de Saccharomyces cerevisiae isolée et identifiée à partir de déchets
de fruits présentait une zone de clairance de 16 mm. Nos résultats sont conformes à ceux de
Banu et al. (2010) ; Thangaratham & Manimegalai (2014) ; Dange & Harke (2018) et Poondla
et al. (2015) Par ailleurs, l'identification moléculaire des isolats de levures productrices de
pectinase a révélé que toutes les souches appartenaient à l’espèce Yarrowia lipolytica.

La détermination des conditions optimales de production des pectinases a permis de

caractériser celles-ci. Sur la base du temps d'incubation, évalué uniquement sur les extraits bruts
des souches Yarrowia lipolytica Tias J0-6; YA J3-1; Buy J2-1 ont présenté l'activité
pectinolytique maximale par rapport aux autres souches. L'activité pectinolytique maximale
dans cette étude a été observée à 12 h d'incubation. Nos résultats sont en accord avec ceux de
Bouatenin et al., (2019). En effet, ces auteurs ont rapporté que les activités pectinolytiques
maximales de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilus, Rhizopus oryzae isolées et
identifiées à partir de ferments traditionnels de manioc utilisés pour la production d'attieke en
Côte d'Ivoire ont été observées entre 12 h. Toutefois notre résultat était inférieur à celui trouvé
par Kashyap et al. (2000) qui ont rapporté que l'activité pectinase maximale de Bacillus sp. DT7
a été observée après 24 h d'incubation. Okonji et al. (2019) ont montré que l'activité
pectinolytique maximale de Aspergillus fumigatus était atteinte après 144 h d'incubation.
De même, Saccharomyces cerevisiae (ATCC 52712) a présenté une activité pectinolytique
maximale à 6 jours de fermentation en utilisant un ratio de 80:20 % d'épis de maïs et de pelures
d'orange comme substrat (Dzogbefia et al., 2017). L'activité pectinolytique maximale de
Saccharomyces cerevisiae isolé et identifié à partir de déchets de fruits a été obtenue à 48 h
d'incubation (Poondla et al., 2015). Ainsi, la période d'incubation nécessaire pour obtenir les
activités pectinolytiques maximales semble dépendre des microorganismes. En plus, du temps
d’incubation, l'activité pectinolytique reste fortement influencer par le pH et la température du
milieu dans lequel l'enzyme travaille. Ainsi, l’effet du pH et de la température a été évalué aussi
bien à partir des extraits enzymatiques brutes qu’avec les extraits partiellement purifiés. Les
activités maximales ont été observées entre le pH 5,5 et 8, et les activités les plus importantes
ont été observées à pH 5,5 et 6 avec les extraits bruts et à pH 7 avec les extraits partiellement
purifiés. Nos résultats sont conformes à ceux de quelques auteurs. Le pH nécessaire à une
124
 RESULTATS ET DISCUSSION

activité pectinolytique maximale d’autres souches microbiennes était identique à celui de nos
souches de Yarrowia lipolytica. En effet, Piccoli-valle et al. (2001) ont rapporté que la pectine
lyase de Penicillium griseoroseum avait une activité maximale à un pH neutre (7). Kashyap et
al. (2000) ont montré que la production maximale de pectinase (15,72 UI/ml) de Bacillus sp.
DT7 a été observée autour du pH neutre (7,2). L'activité maximale de la pectine lyase de
Saccharomyces cerevisiae isolée et identifiée à partir de déchets de fruits a été atteinte à pH 6
(Poondla et al., 2015). Cependant, le pH optimal de l'activité pectinolytique dépendait des
microorganismes. En effet, il a été rapporté que les enzymes pectinolytiques de Saccharomyces
cerevisiae (ATTC 52712) et de Saccharomyces bayanus sont actives dans une large gamme de
pH allant de 3 à 5,5 (Ameko, 1998 ; Gognies et al., 1999). La pectinase de Aspergillus fumigatus
a un pH optimal à 5,0 (Okonji et al., 2019). Kashyap et al. (2000) et Manashi et al. (2014) ont
signalé que la pectinase produite par Bacillus subtilis présentait une activité optimale à pH 5,0.
Penicillium viridicatum a montré une production maximale de polygalacturonase et de pectine
lyase à un pH de 4,5 et 5 respectivement (Silva et al., 2002). Piccoli-valle et al. (2001) ont
observé que P. griseoroseum présentait une forte activité polygalacturonase et pectine estérase
à des pH acides de 4,5 et 5. Certains auteurs ont rapporté que Saccharomyces cerevisiae IM1-
8b et Kluyveromyces marxianus CECT1043 avaient une activité pectinase maximale à pH 4,5
(Birgisson et al., 2003 ; Eschstruth et al., 2011). Ghannam (2009) et Lamrini (2012) ont signalé
que les activités pectinases optimales ont été enregistrées à pH 10 pour la souche d'actinomycète
isolée du compost de poulet et les souches de Bacillus subtilis respectivement. Ainsi, la
production des pectinases serait optimale à pH 5,5 et 6 et l’activité des extraits purifiés serait
maximale à pH 7.
L'influence de la température sur l’activité pectinolytique de nos souches de Yarrowia
lipolytica a été évaluée à partir des extraits enzymatiques brutes et des extraits partiellement
purifiés. Les activités maximales ont été obtenues à une température modérée de 30 °C avec les
extraits enzymatiques bruts. Nos résultats sont conformes à ceux de Blanco et al. (1994), Moyo
et al. (2003) et Kumar et al. (2012). En effet, ces auteurs ont rapporté que les activités de la
polygalacturonase et de la pectine lyase de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
cerevisiae, Aspergillus foetidus et Kluyveromyces wickerhamii étaient maximales à 30 °C. Par
ailleurs, les activités maximales des extraits purifiés de notre étude ont été observées à 50 et 60
°C. Ce résultat est intéressant dans la mesure où les pectinases partiellement purifiés de cette
étude sont actives à des températures relativement élevées. Nos résultats sont en accord avec
ceux de Banu et al. (2010) et Okonji et al. (2019). En effet ces auteurs ont rapporté que

125
 RESULTATS ET DISCUSSION

les activités pectinolytiques maximales de Penicillium chrysogenum et Aspergillus fumigatus

ont été atteintes à 50 °C et 60 °C respectivement. La température optimale pour les activités
pectinases de ces espèces de levures : Candida norvengensis, Cryptococcus macerans-S3A,
Kluyveromyces wickerhamii IFO 1675 ont été observées à 50 °C (Yoshitake et al., 1994 ;
Birgisson et al., 2003). D'autre part, la température optimale pour l'activité pectinolytique de
Kluyveromyces fragilis CBS1555 a été enregistrée entre 50 et 60 °C (Sanchez et al., 1984).
Comme dans le cas du pH, la température optimale pourrait dépendre des micro-organismes.
Ainsi, cette différence observée entre les espèces de Yarrowia lipolytica de cette étude pourrait
être attribuée à des variations intraspécifiques entre ses espèces. Ainsi, la température optimale
de production des pectinases était de 30 °C et l’activité maximale des extraits partiellement
purifiés a été observée 50 et 60 °C.

Les caractéristiques des pectinases partiellement purifiés pourraient dépendre du

microorganisme et de la nature de la pectinase. Cette condition dépendant de la souche et de la
nature de la pectinase se confirme avec les résultats de Yadav et al. (2012). En effet, ces auteurs
ont rapporté une purification partielle de 1,9 fois avec un rendement de 16 % pour l'exo-
polygalacturonase de Rhizopus oryzae. La pectinase de Aspergillus fumigatus a été purifiée
avec un taux de purification de 1,74 fois et un rendement de 27,36 % (Okonji et al., 2019). Dans
nos résultats, toutes les espèces étudiées ont été identifiées en tant que Yarrowia lipolytica, avec
de taux de purification compris entre 1,02 et 1,13 et des rendements de 28,68 à 58,77 %.
Les valeurs de constantes de Michaelis des souches de Yarrowia lypolitica obtenue
étaient comprise entre 2,74 et 2,53 mg/mL puis entre 0,0316, 0.032 et 0,053 mg/mL/min
respectivement pour Km et Vm. De faibles valeurs de Km indiquent que l'enzyme n'a besoin que
d'une petite quantité de substrat pour être saturée ; par conséquent, la vitesse maximale Vm est
atteinte à une concentration de substrat relativement faible. Cependant, une valeur Km élevée
indique que l'enzyme a besoin de concentrations élevées de substrat pour atteindre la vitesse
maximale de réaction (Anosike, 2001). Ainsi, parmi ces trois souches de Yarrowia lypolitica,
la souche Buy J2-1 (Km = 2,53 mg/mL) avait une affinité plus élevée pour la pectine tandis que
celle Tias J0-6 avait une affinité plus faible pour le substrat. Cela voudrait dire que les
paramètres cinétiques des pectinases varient une fois de plus selon le microorganisme. Plusieurs
valeurs de Km dans la gamme de 1-9 mg/mL ont été rapportées pour les polygalacturonases
(Saad et al., 2007 ; Merin et al., 2015). Il a été démontré que l'exo-polygalacturonase de
Penicillium frequentans avait une valeur de Km de 1,6 mg/mL (Favey et al., 1992). La valeur
Km de 2,4 mg/ml a été rapportée pour une endo-polygalacturonase d'Aspergillus niger
126
 RESULTATS ET DISCUSSION

(Parenicova et al., 1998). Une exo-polygalacturonase de Aspergillus tubingensis avait une

valeur Km de 3,2 mg/mL (Kester et al., 1996). Les valeurs Km de la plupart des
polygalacturonases microbiennes sont comprises entre 0,1 et 5,0 (Polizeli et al., 1991 ; Zhang
et al., 1999 ; Niture et al., 2001 ; Singh & Rao, 2002 ; Thakur et al., 2010 ; Yadav et al., 2012
; Martins et al., 2013 ; Chen et al., 2014). Même si la spécificité de l’enzyme n’a pas été
déterminée, les valeurs de Km trouvées sont bien comprises entre 0,1 et 5,0. Une exo-
polygalacturonase du champignon Penicillium frequentans avait une valeur Km très faible de
0,059 (Barense et al., 2001) tandis que la polygalacturonase du champignon pathogène Ustilago
maydis a révélé une valeur Km comparativement très élevée de 57,84 (Castruita-Dominguez et
al., 2014).
Les enzymes identifiées sont des pectinases. Les conditions optimales de production des
pectinases étaient de obtenues aux valeurs de comprises entre pH 5,5-6, à la température de 30
°C pendant 12 h d’incubation. Les activités maximales des extraits enzymatiques partiellement
purifiés des 3 souches de Yarrowia lipolytica sélectionnées étaient observées à pH 7 et à la
température située entre 50 et 60 °C. Les valeurs de Km des pectinases purifiées étaient 5, 2,74
et 2,53 mg/mL respectivement pour les souches Tias J0-6; YA J3-1; Buy J2-1. Les valeurs de
Vmax des souches Tias J0-6; YA J3-1 et Buy J2-1 étaient de 0,0316; 0,032 et 0,053 mg/mL/min.

127
 RESULTATS ET DISCUSSION

Conclusion partielle
Ce travail rapporte une analyse détaillée sur l'identité de la communauté de levures
résistantes à l'éthanol présente à la fin de la fermentation spontanée du jus de cacao provenant
de 3 régions cacaoyères de Côte d'Ivoire. La collection de souches isolées dans ce travail
constitue une source potentielle de souches précieuses non-Saccharomyces et Saccharomyces
cerevisiae pour des applications biotechnologiques. Elle a montré que le jus de cacao pourrait
être un réservoir de micro-organismes. Cette étude représente la première caractérisation de
levures indigènes résistantes à l'éthanol à partir de jus de cacao fermenté. Les principaux
résultats se présentent comme suit :
▪ Les espèces de levures résistantes à l’éthanol identifiées dans cette étude étaient
Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae,
Debaromyces hansenii, Pichia kurdiavzevii;
▪ La distribution de ces espèces a été influencée par la zone géographique de l’étude ;
▪ L'étude des isolats producteurs de pectinases a révélé qu’ils appartenaient tous à
l’espèce Yarrowia lipolytica;
▪ Les conditions optimales de production des pectinases étaient obtenues à pH 5,5 -6, à la
température de 30 °C pendant 12 h incubation.
▪ Les activités maximales des extraits enzymatiques partiellement purifiés des 3 souches
de Yarrowia lipolytica sélectionnées étaient observées à pH 7 et à la température située
entre 50 et 60 °C. Les valeurs de Km des pectinases purifiées étaient 5, 2,74 et 2,53
mg/mL respectivement pour les souches Tias J0-6; YA J3-1; Buy J2-1. Les valeurs de
Vmax des souches Tias J0-6; YA J3-1 et Buy J2-1 étaient de 0,0316; 0,032 et 0,053
mg/mL/min.
Les souches de Yarrowia lipolytica résistantes à l’éthanol et/ou productrices de pectinase
pourraient être appropriées pour des applications biotechnologiques. Les souches productrices
de pectinase pourraient être utilisées pour la clarification des jus de fruits et celles résistantes à
l’éthanol, dans la production de bioéthanol. Ces applications biotechnologiques consistueront
la suite de l’étude.

128
 RESULTATS ET DISCUSSION

CHAPITRE III : APPLICATIONS BIOTECHNOLOGIQUES : ESSAI DE

PRODUCTION DE BIOÉTHANOL PAR LES SOUCHES DE LEVURES
RÉSISTANTES À L’ÉTHANOL, CLARIFICATION DE JUS D’ORANGE
(Citrus sinensis L.) ET D’ANANAS (Ananas comosus) PAR LES SOUCHES DE
LEVURES PRODUCTRICES DE PECTINASE

1- Production de bioéthanol par fermentation du moût sucré de sorgho par les souches de
levures résistantes à l’éthanol : Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces hansenii,
Saccharomyces cerevisiae, Pichia kurdiavzevii

1-1-Évolution des différents paramètres physico-chimiques au cours de la fermentation

alcoolique

1-1-1- Évolution du pH et de l’acidité titrable

Les valeurs de pH et de l’acidité titrable des moûts au cours de la fermentation évoluent
inversement (Figure 64). La courbe de l’évolution du pH présente une allure décroissante pour
toutes les souches testées aussi bien en monoculture qu’en culture mixte. Ainsi, la baisse la plus
importante des valeurs de pH a été observée avec la culture mixte avec des valeurs passant de
3,39±0,00 en début de fermentation (0 h) à 3,2±0,0 en fin de fermentation (120 h). Aussi,
inversement à l’allure de la courbe de l’évolution du pH, celle de l’évolution de l’acidité titrable
est caractérisée par une allure croissante pour l’ensemble des souches en monocultures et en
culture mixte. Ainsi, la culture mixte s’est avérée être celle qui acidifie plus le moût en
fermentation avec des valeurs d’acidité titrable passant de 0,41±0,01 % en début de
fermentation (0 h) à 0,59±0,01 % en fin de fermentation (120 h).

0.7
3.45
0.6
3.4
3.35 0.5
R.mucilaginosa
Acidité titrable (%)

3.3 0.4
pH

D. hansenii
3.25 0.3
S. cerevisiae
3.2 0.2 P. kudriavzevii
3.15 0.1 Mixte
3.1 0
0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120
Durée de fermentation (heures) Durée de fermenation (heures)

Figure 64 : Évolution du pH et de l’acidité titrable des moûts en fermentation avec les

différentes espèces de levures
129
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-1-2- Vitesse de consommation des sucres des espèces de levures au cours de la

fermentation
La vitesse de consommation des sucres au cours de la fermentation alcoolique par les
espèces de levures de cette étude est présentée à la figure 65. Elle augmente durant les 24
premières heures, quelle que soit la souche de levure. La vitesse de consommation la plus
importante pendant ces 24 h a été observée avec S. cerevisiae (0,104 %.h-1) alors que celles des
autres espèces sont presque identiques. À partir de 24 h, une baisse de la vitesse de
consommation des sucres est observée pour la culture mixte et les espèces S. cerevisiae et R.
mucilaginosa passant respectivement de 0,083 à 0,033 %.h-1 pour la culture mixte et l’espèce
R. mucilaginosa au bout de 96 h et de 0,104 à 0,033 %.h-1 pour l’espèce S. cerevisiae après 96
h de fermentation. À partir de 96 h jusqu’à la fin de la fermentation (120 h), la vitesse de
consommation est restée constante avec 0,033 %.h-1. Par ailleurs, l’espèce P. kurdiavzevii a
présenté une baisse de la vitesse de consommation de sucres de 24 h à 72 h passant de 0,081 à
0,034 %.h-1 avant connaître une légère augmentation de la vitesse de consommation au bout de
96 h pour atteindre la valeur de 0,036 %.h-1. Aussi, la vitesse de consommation des sucres de
l’espèce D. hansenii a diminué de 24 à 48 h avant d’augmenter légèrement de 48 à 96 h avec
une vitesse passant de 0,031 à 0,039 %.h-1. Toutefois en fin de fermentation (120 h), toutes les
espèces ont présenté la même vitesse de consommation des sucres qui est de 0,033 %.h-1.

0.12
Vitesse de consommation des sucres (%.h-1)

0.1

0.08
R.mucilaginosa
0.06 D. hansenii
S. cerevisiae
0.04 P. kudriavzevii

Mixte
0.02

0
0 24 48 72 96 120
Durée de fermentation (heures)

Figure 65: Vitesse de consommation des sucres au cours de la fermentation alcoolique avec
les différentes espèces de levures
130
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-2-Évolution la cinétique fermentaire des souches de levure au cours de la fermentation

alcoolique des moûts

I-2-1-Évolution du volume CO2 (g/L) dégagé au cours de la fermentation des moûts

Les performances de croissance des souches de levures ont été évaluées à travers le
dégagement de CO2 au cours de la fermentation (Figure 66). De façon générale, une
augmentation continue du volume de CO2 dégagé a été enregistrée pour toutes les espèces de
levures testées ainsi que la culture mixte. Durant les premières 72 h de fermentation, le plus
important volume de CO2 dégagé a été observée au niveau du moût fermenté par l’espèce P.
kurdiavzevii passant ainsi de 0 à 0,089 g/L. A partir de 72 h jusqu’à la fin de la fermentation,
une augmentation plus rapide du volume de CO2 dégagé a été obtenue dans les moûts
ensemencés avec l’espèce S. cerevisiae et la culture mixte. En fin de fermentation, les valeurs
de volumes de CO2 dégagé étaient de 0,156 g/L pour la culture mixte, 0,148 g/L pour l’espèce
S. cerevisiae et 0,143 /L pour l’espèce P. kurdiavzevii.

0.18
0.16
Volume de CO2 dégagé (g/L)

0.14
0.12
R.mucilaginosa
0.1
D. hansenii
0.08
S. cerevisiae
0.06
P. kudriavzevii
0.04
Mixte
0.02
0
0 24 48 72 96 120
Durée de fermentation (heures)

Figure 66 : Dégagement de CO2 au cours de la fermentation des moûts avec les différentes

1-2-2-Évolution de la croissance levurienne au cours de la fermentation des moûts

La croissance levurienne a été déterminée par mesure de la densité optique (D.O) au cours
de la fermentation. Même si cette méthode n’est pas assez précise elle donne tout de même une
indication sur la croissance des espèces testées. Ainsi, quelle que soit l’espèce testée, une
augmentation continue des valeurs de D.O. a été enregistrée (Figure 67). Pour toutes les espèces
testées, deux phases de croissance ont été observées, ainsi une phase de croissance rapide
131
 RESULTATS ET DISCUSSION

pendant les premières 48 heures avec des valeurs de D.O. passant de 0,5 pour toutes les espèces
et la culture mixte en début de fermentation à 1,451; 1,487; 1,310; 1,470; 1,398 et 1,474
respectivement pour les espèces Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces hansenii,
Saccharomyces cerevisiae, Pichia kurdiavzevii et la culture mixte. La seconde phase de la
croissance levurienne qui s’étend de 48 h jusqu’en fin de fermentation était caractérisée par une
croissance moins rapide. Les valeurs de DO ont évolué de 1,451 à 1,578 pour l’espèce
Rhodotorula mucilaginosa ; de 1,487 à 1,626 pour l’espèce Debaromyces hansenii; de 1,310 à
1,634 pour l’espèce Saccharomyces cerevisiae; de 1,398 à 1,575 pour l’espèce Pichia
kurdiavzevii et de 1,474 à 1,644 pour la culture mixte. Ainsi, cette augmentation de DO est
corrélée à la baisse des valeurs d’atténuation et à l’augmentation de celles du volume de CO 2
dégagé.
1.8
1.6
1.4
DO (600nm)

1.2
R.mucilaginosa
1
D. hansenii
0.8
S. cerevisiae
0.6
P. kudriavzevii
0.4
Mixte
0.2
0
0 24 48 72 96 120
Durée de fermentation (heures)

Figure 67 : Évolution de la densité optique des moûts ensemencés par les souches de
levures au cours de la fermentation

1-3- Degré alcoolique des distillats provenant des différentes fermentations

La figure 68 nous présente les degrés alcooliques des distillats. Le degré alcoolique
des distillats était compris entre 7,01±0,007 et 7,38±0,063 % (v/v). Le degré alcoolique le plus
élevé a été obtenu dans le distillat provenant de l’espèce Rhodotorula mucilaginosa avec
7,38±0,063 % (v/v) tandis que le degré le plus faible a été observé au niveau du distillat émanant
de la culture mixte avec 7,01±0,007 % (v/v). L’analyse statistique a montré une différence
significative (⁕⁕P<0,05) entre le degré alcoolique du distillat produit par l’espèce Rhodotorula

132
 RESULTATS
mucilaginosa et le reste des échantillons. aucune différence significative (⁕P>0,05)
ET DISCUSSION
Toutefois

133
 RESULTATS ET DISCUSSION

n’a été observée entre les autres échantillons. Par ailleurs les flacons contentant le bioéthanol
produit sont présentés à la figure 68.

7.5 a

7.4
Degré alcoolique (% v/v)

7.3 b

7.2

7.1

6.9

6.8

6.7
R.mucilaginosa D. hansenii S. cerevisiae P. kudriavzevii Mixte

Espèces de levures et formulation

Figure 68 : Degré alcoolique des différents distillats

Figure 69 : Flacons de bioéthanol produit les différentes espèces de levures après distillation

134
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-4-Clarification des jus d’orange et d’ananas par les pectinases produites par les espèces
de Yarrowia lipolytica
Les extraits enzymatiques partiellement purifiés de pectinase produites par les
espèces de Yarrowia lipolytica Tias J0-6 ; YA J3-1 et Buy J2-1 ont été utilisées pour les tests
de clarification et extraction de composes phénoliques.Ces espèces ont été utilisées au regard
de leur activité pectinolytique importante.

1-4-1- Activités enzymatiques des extraits bruts et partiellement purifiés des espèces de
Yarrowia lipolytica Tias J0-6 ; YA J3-1 et Buy J2-1
Les activités enzymatiques des extraits bruts et partiellement purifiés des espèces de
Yarrowia lipolytica Tias J0-6 ; YA J3-1 et Buy J2-1 sont présentées à la figure 70 . De façon
générale, les activités des extraits enzymatiques partiellement purifiés sont plus importantes que
celles des extraits bruts. Elles sont de 0,183± 0,001 ; 0,209±0,003 et 0,392±0,005 UI/mL tandis
que celles des extraits bruts sont de 0,138±0,007 ; 0,177± 0,001 et 0,235±0,01 UI/mL
respectivement pour les espèces de Yarrowia lipolytica Tias J0-6 ; YA J3-1 et Buy J2-1. De
plus, les analyses statistiques ont montré une différence significative (p<0,05) entre les activités
aussi bien pour les extraits bruts que pour les extraits partiellement purifiés.

0.45 c
Activité enzymatique (UI/mL)

0.4
0.35
0.3
0.25 a
b Extrait brut enzymatique
0.2
0.15 Extrait enzymatique partiellement
purifié
0.1
0.05
0
Tias J0-6 YA J3-1 Buy J2-1
Espèces de Yarrowia lipolytica

Figure 70 : Activité totale des extraits brut et partiellement purifié

135
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-4-2- Paramètres physico-chimiques et phytochimiques des jus clarifiés

1-4-2-1- Paramètres physico-chimiques des jus d’orange et ananas clarifiés

Les paramètres physico-chimiques des jus d’orange et d’ananas clarifiés à partir des
extraits enzymatiques partiellement purifiés émanant des espèces de Yarrowia lipolytica ont été
consignés dans les tableaux XXVII et XXVIII. La clarification est caractérisée par la baisse des
valeurs des paramètres couleur, brunissement, pH, viscosité, densité et de l’augmentation de
celles de la clarté et de l’acidité par rapport au jus non traité (jus témoin). Ainsi, quel que soit
le jus de fruits (orange et ananas) traité et quel que soit l’extrait utilisé (Tias J0-6 ; YA J3-1 ;
Buy J2-1). Ainsi en ce qui concerne la couleur, les valeurs baissent de 11,90±0,00 % pour le
jus témoin d’orange (jus non traité) à 11,65±0,07 % ; 11,55±0,21 % et 11,25±0,35 % pour le
jus d’orange clarifié puis de 0,8±00 % pour le jus témoin d’ananas (jus non traité) à 0,6±00 %;
0,5±00 % et 0,5±00 % pour les jus d’ananas traité. Pour le paramètre brunissement, les valeurs
diminuent de 9,90±0,00 % pour le jus d’orange témoin à 3,25±0,07 % ; 8,95±0,07 % et 6,7±0,14
% pour les jus traités. Pour les jus d’ananas, ces valeurs baissent de 6±0 pour le jus d’ananas
témoin à 5±0 ; 4±0 et 4±0 pour les jus d’ananas traités. Pour le pH, les valeurs passent de
4,04±0,00 pour le jus témoin d’orange à 4,03±0,00 ; 4,02±0,00 et 3,96±0,00 pour les jus
d’orange traités. Pour le jus d’ananas, ces valeurs baissent de 5,01±0,00 pour le jus témoin à
4,59±0,00 ; 4,49±0,00 et 4,58±0,00 pour les jus d’ananas traités. S’agissant de la viscosité les
valeurs baissent de 0,17±0,00 mPa.s pour le jus témoin d’orange à 0,15±0,00 mPa.s; 0,15±0,00
mPa.s et 0,16±0,00 mPa.s pour les jus d’orange traités. Pour le jus d’ananas, la valeur de la
viscosité diminue de 0,31±0,00 mPa.s à 0,30±0,00 mPa.s, 0,30±0,00 et 0,29±0,01 mPa.s pour
les jus d’ananas traités.
Par ailleurs, les valeurs de la clarté ont augmenté passant de 27,50±0,00 % pour le jus témoin
d’orange à 29,20±0,00 % ; 28,40±0,00 % et 28,80±0,00 % pour les jus traités. Ces valeurs de
la viscosité ont aussi augmenté pour le jus d’ananas passant de 0,31±0,00 % pour le jus témoin
à 0,30±0,00 %, 0,30±0,00 % et 0,29±0,01 % pour les jus traités.
Aussi, aucun des extraits enzymatiques partiellement purifiés ne s’est distingué des autres. Par
ailleurs, les analyses statistiques ont montré à la fois des différences significatives (p<0,05) et
des différences non significatives (p>0,05) entre les jus traités et le jus non traité.
En ce qui concerne le jus d’orange, nous observons des différences non significatives (p>0,05)
entre les jus traités et le jus non traité pour les paramètres suivant : la couleur et la densité
Pour ce qui est du jus d’ananas, nous observons des différences non significatives (p>0,05)
entre les jus traités et le jus non traité au niveau de la viscosité et de la densité.
136
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XVIIIII : Paramètres physico-chimiques des jus d’orange clarifiés

Clarté (%) Couleur Brunissement pH Acidité Viscosité Densité ESR

(%) (%) (%) (mPa.s) (°Brix)
Jus non traité 27,50±0,00a 11,90±0,00a 9,90±0,00a 4,04±0,00a 1,030±0,014a 0,17±0,00a 1,008±0a 4,95±0,07a
Tias J0-6 29,20±0,00b 11,65±0,07a 3,25±0,07b 4,03±0,00a 1,076±0,019a 0,15±0,00b 1,006±0a 5,80±0,00b
YA J3-1 28,40±0,00b 11,55±0,21a 8,95±0,07c 4,02±0,00b 1,071±0,012a 0,15±0,00c 0,962±0a 5,50±0,14bc
Buy J2-1 28,80±0,00b 11,25±0,35a 6,7±0,14d 3,96±0,00c 1,080±00a 0,16±0,001a 0,997±0a 6,10±0,00b
Les valeurs exprimées sont les moyennes ± écart-types de trois mesures. Dans la même colonne, les valeurs moyennes portant au moins une lettre commune ne sont pas
significativement différentes (P>0,05).

Tableau XIXII : Paramètres physico-chimiques des jus d’ananas clarifiés

Clarté Couleur Brunissement pH Acidité Viscosité Densité ESR

(%) (%) (%) (%) (mPa.s) (°Brix)
Jus non traité 2,75±0,00a 0,80±0,00a 0,60±0,00a 5,01±0,00a 0,25±0,02b 0,31±0,00a 1,008±0a 10,75±0,07b
Tias J0-6 3,90±0,14b 0,60±0,00b 0,50±0,00b 4,59±0,00b 0,39±0,00a 0,30±0,00a 1,006±0a 10,95±0,07ab
YA J3-1 3,65±0,07b 0,50±0,00b 0,40±0,00b 4,49±0,00c 0,45±0,00a 0,30±00a 1,005±0a 10,90±0,00ab
Buy J2-1 3,55±0,07b 0,50±0,00b 0,40±0,00b 4,58±0,00b 0,35±0,04ab 0,29±0,01a 1,005±0a 11,00±0,00a
Les valeurs exprimées sont les moyennes ± écart-types de trois mesures. Dans la même colonne, les valeurs moyennes portant au moins une lettre commune ne sont pas
significativement différentes (P>0,05).

ESR : Extrait sec refractométrique

Tias J0-6
YA J3-1 souches de Yarrowia lipolytica
Buy J2-1

136
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-4-2-2-Teneurs en composés phénoliques et activité antioxydante des jus clarifiés

Le tableau XXIX présente les teneurs en composés phénoliques et activité
antioxydante des jus clarifiés aussi bien pour les jus d’orange que pour les jus d’ananas.
De façon générale, une augmentation des concentrations des composés phénoliques a été
observée au niveau des deux jus traités par rapport aux jus témoins. Ainsi pour le jus d’orange
les valeurs les plus importantes des composés phénoliques sont 172,71±1,49 µg/mL EAG,
316,23±55,47 µg/mL EQ et 66,49±0,33 g/L pour les polyphénols totaux, les flavonoïdes totaux
et les tanins totaux respectivement. Cependant, les valeurs les plus faibles étaient 283,92±17,40
µg/mL EAG, 59,23±0,53 µg/mL EQ et 170,19±0,13 g/L. Pour les jus d’ananas, seuls les tanins
totaux ont obtenu les concentrations les plus élevées dans les jus clarifiés par rapport aux jus
non clarifiés. La concentration la plus importante de 53,26±0,00 g/L a été obtenu avec le jus
clarifié par la pectinase émanant de la souche Buy J2-1 alors que la plus faible concentration de
31,93±0,05 g/L a été observée dans le jus clarifié par la pectinase de la souche Tias J0-6.
Ainsi, l’ANOVA a permis de révéler l’effet de la clarification enzymatique sur les teneurs en
composés phénolique. Par conséquent, il apparaît des différences significatives (p<0,05) entre
les jus traités et les jus témoins.
Les activités antioxydantes des jus de fruits clarifiés ont été évaluées à partir de deux
méthodes : DPPH et FRAP. La méthode DPPH a montré que les taux d'activité antiradicalaire
(DPPH) étaient les plus élevés dans le jus d'orange et le jus d'ananas clarifiés par la pectinase
de Tias (J0-6) 42,39 ±0,82% et la pectinase de Buy (J2-1) 60,43±0,54% que les contrôles
(35,31±0,24% et 60,43±0,54%) respectivement (Tableau XXIX). De plus, il y avait une
différence significative (P<0,05) entre les jus des échantillons et les contrôles. Pour la méthode
FRAP, l'activité antioxydante était la plus importante dans le jus d'orange clarifié par la
pectinase de YA J3-1 avec 211,16±7 µg/mL d'acide ascorbique tandis que dans le jus d'ananas
clarifié, la valeur la plus élevée (192,42±3,98 µg/mL d'acide ascorbique) a été obtenue dans le
jus clarifié par la pectinase de Tias (J0-6) bien que cette valeur soit inférieure à celle du contrôle
(224,02±11,74 µg/mL d'acide ascorbique). De plus, l'analyse statistique a montré qu’il existe
une différence significative (P<0,05) entre les échantillons et les contrôles (Jus non traités).

137
 RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau XX: Teneurs en composés phénoliques et activité antioxydante des jus clarifiés

Jus Jus
d’orange d’ananas
Polyphénols Flavonoïdes Tanins FRAP DPPH Polyphénols Flavonoïdes Tanins FRAP DPPH
totaux totaux totaux µg/mL de (%) totaux totaux totaux µg/mL de vit (%)
(µg/mL (µg/mL (g/L) vit C (µg/mL (µg/mL EQ) (g/L) C
EAG) EQ) EAG)
Jus 267,38±5,98a 58,36±0,41b 110,85±0,68a 186,45±2,4a 35,31±0,2b 407,67±7,61a 130,19±3,53a 23,46±0,02a 224,02±11,24a 50,96±0,5c
non
traité
Tias 297,96±8,42a 59,23±0,53b 172,71±1,49b 113,34±0,06b 42,39±0,82a 381,22±13,59a 124,90±5,3a 31,93±0,05b 192,42±3,98b 55,31±1,28b
J0-6
YA 316,23±55,47a 66,49±0,33a 171,45±0,27bc 211,16±7,00c 31,4±0,12c 398,84±4,78a 127,3±1,08a 34,39±0,04c 189,07±1,85b 51,77±0,35c
J3-1
Buy 283,92±17,40a 65,95±0,03a 170,19±0,13c 140,04±3,64d 32,82±1,01bc 391,61±34,81a 126,82±2,85a 53,26±0,00d 166,6±0,96c 60,43±0,54a
J2-1
Les valeurs exprimées sont les moyennes ± écart-types de trois mesures. Dans la même colonne, les valeurs moyennes portant au moins une lettre commune ne sont pas
significativement différentes (P>0,05).

Tias J0-6
YA J3-1 souches de Yarrowia lipolytica
Buy J

138
 RESULTATS ET DISCUSSION

1-5- Corrélation entre composés phénoliques et activité antioxydante des jus de fruits
clarifiés
Une matrice de corrélation dont les coefficients sont présentés dans le tableau XXX,
a été créée pour explorer les relations possibles entre les composés phénoliques et les activités
antioxydantes. Les coefficients de corrélation les plus élevés et positifs ont été trouvés entre les
tanins totaux et l'activité antiradicalaire (r = 0,717, P < 0,05) et entre les flavonoïdes totaux et
l'activité antioxydante évaluée par la méthode FRAP (r = 0,754, P < 0,05) concernant les jus
d'orange clarifiés. Cependant, un coefficient de corrélation négatif (r = -0,995, P < 0,05) a été
trouvé entre les flavonoïdes totaux et l'activité antiradicalaire. Dans les jus d'ananas clarifiés,
les activités antioxydantes (activité antiradicalaire et pouvoir réducteur ferrique) étaient
fortement corrélées uniquement aux tanins totaux. Un coefficient de corrélation positif a été
observé entre les tannins totaux et l'activité antiradicalaire (r = 0,855, P < 0,05) tandis qu'un
coefficient de corrélation négatif avait été obtenu entre les tannins totaux et le pouvoir réducteur
ferrique (r = -0,987, P < 0,05)

Tableau XXX : Matrice de corrélation de Pearson entre les composés phénoliques et les
activités antixoydantes

Phénols totaux Taninns totaux Flavonoïdes totaux

DPPH -0.071 0.717* -0.995*

Jus
d’orange FRAP 0.430 -0.216 0.754*

DPPH -0.131 0.855* -0.169

Jus
d’ananas
FRAP -0.118 -0.987* -0.282

* La corrélation est significative au seuil de 5% ;

DPPH :2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl ;

FRAP : Pouvoir réduction de l'ion ferrique (Fe3+) en ion ferreux (Fe2+)

139
 RESULTATS ET DISCUSSION

2- Discussion

La troisième et dernière partie de notre étude a été dédiée à l’application

biotechnologique des souches de levures résistantes à l’éthanol (Rhodotorula mucilaginosa,
Debaromyces hansenii, Saccharomyces cerevisiae, Pichia kurdiavzevii) et celles productrices
de pectinase (Yarrowia lipolytica). Dans la première section de cette discussion nous
aborderons la question de la production de bioethanol par les souches résistantes à l’éthanol
(Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces hansenii, Saccharomyces cerevisiae, Pichia
kurdiavzevii). Les désastres environnementaux (pollution environnementale, réchauffement
climatique…) provoqués par l’utilisation d’énergies fossiles a engendré l’avènement de
nouvelles sources plus respectueuses de l’environnement et moins énergivores (Hoekman, 2009
; Demirbas, 2010 ; Kiran et al., 2014). Ainsi, le biotéthanol reste l’une des plus anciennes
ressources à caractère écologique à être utilisée. Même si sa production et son utilisation sont
assez inexistantes en Afrique, ce n’est pas le cas dans les autres parties du globe. Déjà, les
premières utilisations du bioéthanol avaient été initiées au Brésil en 1925. Au début du XXè
siècle, le bioéthanol était largement utilisé dans les pays d’Europe et aux États-Unis. L’intérêt
croissant pour le bioéthanol et son adoption comme solution alternative par plusieurs pays a été
observée au début des années 80 (Azhar et al., 2017).
Longuement réputée pour ses performances fermentaires et grande résistance à
l’éthanol, l’espèce S. cerevisiae a été beaucoup utilisée pour la production le bioéthanol (Choi
et al., 2010 ; Zhao et al., 2010 ; Mussato et al., 2012 ; Scordia et al., 2012 ; Kumari et al., 2013 ;
Kim et al., 2014 ; Mossi et al., 2018). Cependant, d’autres auteurs ont rapporté l’utilisation
d’espèces de levures Non-Saccharomyces dans la production de bioéthanol telles que
Debaryomyces hansenii (Calahorra et al., 2009 ; Kurian et al., 2010) ; Rhodotorula
mucilaginosa (Bura et al., 2012) ; Pichia kudriavzevii (Ndubuisi et al., 2018 ; Akita et al., 2021
; Pongcharoen et al., 2022).
Même s’il n’existe pas de méthodes universelles pour déterminer la résistance des
micro-organismes à l’éthanol, des études se sont appuyées sur les valeurs relatives de la
croissance cellulaire, la vitesse spécifique de production de l'éthanol, la viabilité cellulaire et le
flux de protons à travers la membrane plasmique (Thomas & Rose, 1979 ; Beavan et al., 1982 ;
Dombek & Ingram, 1986 ; Birch & Walker, 2000 ; Jiménez & van Uden, 1985). Dans notre
étude, la capacité des souches de levures à la fois Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae)
et Non-Saccharomyces (Debaryomyces hansenii, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia
140
 RESULTATS ET DISCUSSION

kudriavzevii) à produire de l’éthanol a été considérée. De façon générale, toutes les souches ont
montré des performances fermentaires remarquables à travers une augmentation continue du
volume de CO2 ainsi celle des valeurs de densité optique et une cinétique de consommation des
sucres presque identique. Cette similarité observée au niveau des différentes souches se traduit
également à travers le taux d’alcool produit qui est compris entre 7,01±0,007 et 7,38±0,063 %
Par ailleurs, la résistance à l’éthanol a été évaluée à travers la capacité des espèces de levures à
produire de l’éthanol. Ainsi, le taux d’alcool de 7% v/v déterminé dans notre étude était
similaire à celui trouvé par Yan et al. (2015) qui était de 7,34 % (v/v) mais largement en-dessous
des valeurs trouvées par Singh et al. (2013) qui était de 15,3% (v/v), par Ishola et al. (2015)
37,1 % (v/v), par Moon et al. (2012) 86,1 % (v/v). Cette différence de taux d’alcool pourrait
dépendre de plusieurs facteurs à savoir la niche écologique d’où a été isolée la souche de levure,
la nature de la levure (Saccharomyces et Non-Saccharomyces), les conditions de fermentation
(Température, vitesse d’agitation, durée de fermentation, pH du milieu de fermentation),
matières premières (sorgho, maïs, blé, manioc…) (Azhar et al., 2017). En effet, les conditions
de fermentation étaient les suivantes : température de 25 °C, vitesse d’agitation de 120 rpm,
durée de 120h, et la matière première était le moût sucré de sorgho. Par ailleurs, les espèces de
levures Non-Saccharomyces ont montré une capacité à produire de l’éthanol au même titre que
les espèces Saccharomyces et même plus. En effet, le taux d’alcool le plus important a été
obtenu avec l’espèce Non-Saccharomyces, Rhodotorula mucilaginosa. Par exemple, selon
Mussato et al. (2012), les souches Pichia stipitis (NRRL-Y-7124), et Kluyveromyces fagilis
(Kf1) ont été signalées comme de bons producteurs d'éthanol à partir de différents types de
sucres au même titre que l’espèce Saccharomyces cerevisiae (RL-11).
La seconde session de notre discussion a été consacrée à des essais de clarification de
jus d’orange et d’ananas. Le jus de mucilage provenant de la décomposition des matériaux
pectiques recouvrant les fèves de cacao, est très apprécié des populations paysannes (Carr,
1982). Toutefois après quelques jours de fermentation, il devient difficilement consommable à
cause de sa teneur relativement élevée en éthanol et donc abandonné dans les champs sous
forme de déchet (Anvoh, 2013). Ainsi, le jus de mucilage contient une teneur importante en
pectine (Baensch, 2000 ; Barel, 2009 ; Anvoh, 2013). Les pectinases principalement utilisées
pour la clarification des jus en industrie agroalimentaire sont de sources microbiennes (Kashap
et al., 2001 ; Duvetter et al., 2005 ; Jayani et al., 2005). L’utilisation d’enzymes d’origine
microbienne présente plusieurs avantages à savoir un faible coût de production, la teneur en
enzymes est plus prévisible et contrôlable, la disponibilité des matières premières pour la

141
 RESULTATS ET DISCUSSION

production, et la production de masse sans autorisation éthique, réduction du taux de filtration,

fournir une grande gamme de produits aux consommateurs (Vaillant & Dornier, 2001). Ainsi,
Rai et al. (2006) ; Dedehou et al. (2015) ; Sharma et al. (2015) ; Utami et al. (2016) et
Meryandini et al. (2017) ont souligné que les indicateurs les plus pertinents des jus clarifiés
étaient la clarté, la couleur, le brunissement, le pH et la viscosité. Ainsi de façon générale, et
quel que soit le jus et l’extrait enzymatique, une baisse du pH est observée par rapport au jus
non clarifié (contrôle). Cette même observation a été faite par Adingra (2017) et Meryandini et
al. (2017) respectivement dans les jus de pomme de cajou et de pomme. En effet, la diminution
du pH est due à l'augmentation de la teneur en acide galacturonique dans le jus qui est le résultat
de l'hydrolyse de la pectine par la pectinase ce qui rend le jus plus acide (Acar et al., 1999). Cette
diminution du pH est corrélée par une augmentation de l’acidité. La clarté est le résultat de la
dépectinisation par addition de pectinases. La clarté de nos échantillons est supérieure à celles
des jus non clarifiés. Cette augmentation de la clarté est accompagnée par une baisse de la
couleur et celle du brunissement. La diminution d’intensité de couleur pourrait s’expliquer par
la destruction des caroténoïdes responsables de la couleur. Ce même constat a été fait par
Adingra (2017) et Meryandini et al., (2017). Toutefois, les taux de clarté de notre étude restent
inférieurs à ceux enregistrés par ces auteurs. La viscosité étant la résistance d’un fluide à
l’écoulement, un liquide plus clair est moins visqueux. Ainsi, les valeurs de la viscosité de nos
jus clarifiés sont inférieures à celles des jus non-clarifiées. Cette baisse de la viscosité est le
résultat de la depectinisation obtenu par l’action des pectinases. Nos résultats sont conformes à
ceux de Utami et al., (2016) ; Adingra (2017) ; Meryandini et al., (2017). En effet, ces auteurs
ont observé une baisse de la viscosité de leurs échantillons ayant subis une clarification
enzymatique par rapport au jus non clarifié. Ainsi, donc un jus clarifié est caractérisé par une
augmentation de la clarté et une baisse de la couleur, de brunissement et de la viscosité. Par
ailleurs, la variation des teneurs des composés phénoliques des jus d’orange et d’ananas serait
le fait du traitement enzymatique. La pectinase pourrait influencer la teneur en composés
phénoliques des jus de fruits clarifiés en particulier les tanins et donc leurs activités
antioxydantes. En effet, les activités pectinolytiques pourraient affaiblir les cellules de la pulpe,
libérant ainsi un jus inaccessible mais surtout des constituants liés aux parties solides, tels que
les tanins. Ceci pourrait confirmer la teneur élevée en tanins totaux trouvée dans nos
échantillons. Nos résultats sont en accord avec ceux de Wojdyło et al. (2011). En effet, pour
ces auteurs, la pectinase a amélioré l'extraction des polyphénols. Ils ont montré que la teneur en

142
 RESULTATS ET DISCUSSION

polyphénols des marcs traités avec la pectinase était plus élevée que le contrôle (marc non
traité).
Conclusion partielle

Les applications biotechnologiques des espèces de levures résistantes à l’éthanol

(Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces hansenii, Saccharomyces cerevisiae, Pichia
kurdiavzevii) et celles productrices de pectinase (Yarrowia lipolytica) réalisées à travers la
production de bioéthanol et la clarification des jus de fruits a permis de confirmer les propriétés
de ses souches.
Ainsi, pour la première application biotechnologique, les espèces de levures
résistantes à l’éthanol se sont montrées capables de produire du bioéthanol par fermentation
alcoolique du moût sucré de sorgho avec à taux compris entre 7,01 et 7,38 % (v/v). De toutes
les souches testées, l’espèce Non-Saccharomyces, Rhodotorula mucilaginosa a été la plus
performante avec une production de bioéthanol au taux de 7,38 % (v/v).
La seconde application biotechnologique a été dédiée à la clarification des jus de
fruits par les extraits de pectinase des souches de Yarrowia lipolytica. Ainsi, les pectinases
produites par les souches de Yarrowia lipolytica étaient capables de clarifier les jus d’orange et
d’ananas. Les jus clarifiés étaient caractérisés par une augmentation de la clarté et une baisse
de la couleur, du brunissement, de la viscosité et du pH. Par ailleurs les jus clarifiés étaient
également caractérisés par une augmentation de la teneur en composés phénoliques dont les
activités antioxydantes correspondantes étaient principalement dues aux tanins totaux et aux
flavonoïdes totaux.

143
 CONCLUSION
&
PERSPECTIVES
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Ce travail est une contribution à la valorisation du jus de mucilage de cacao. Considéré

comme un déchet, le jus de mucilage provenant de la décomposition des matériaux pectiques
recouvrant les fèves de cacao par les levures pourrait contenir des souches possédant des
propriétés biotechnologiques. Ce travail réalisé en 3 grandes étapes a permis dans une première
phase de faire le point sur l’état de connaissance du jus de mucilage de cacao et la caractérisation
de ses paramètres biochimiques. La seconde phase expérimentale a été consacrée à la sélection
et l’identification des souches de levures résistantes à l’éthanol et/ou productrices de pectinases
et à l’application biotechnologique de celles-ci.
Il ressort de l’étude de l’état de connaissance sur le jus de mucilage de cacao qu’il est très connu
des populations. De plus, ces dernières affirment que le jus a une durée maximale de
conservation de 3 jours et possède des vertus bienfaitrices à savoir laxative, fortifiante et anti-
diarrhéique. Par ailleurs, l’évolution des paramètres biochimiques, nutritionnelles, et
fonctionnelles des jus de mucilage de cacao au cours de la conservation à la température
ambiante était irrégulière pour tous les jus analysés.
Pour la sélection des isolats de levures résistants à l’éthanol, seuls les isolats issus des
jus dont le taux d’éthanol était compris entre 7 et 10 % (v/v) étaient sélectionnées. Ce sont donc
les isolats provenant des jus de Akoupé, Yakassé-Attobrou et Tiassalé avec des taux respectifs
d’éthanol de 9,83 % ; 8,74 % et de 7,21 %. L’identification moléculaire des isolats résistants à
l’éthanol a révélé la presence de 5 espèces : Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica,
Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces hansenii, Pichia kurdiavzevii. La distribution de ces
espèces était dépendante de la zone géographique.

Le screening et l’identification des isolats producteurs de pectinase ont révélé que

tous les isolats appartenaient à l’espèce Yarrowia lipolytica. Les conditions optimales de
production des pectinases étaient les suivantes : pH 5,5-6 ; temperature 30 °C ; durée 12 h
incubation. Les activités maximales des extraits enzymatiques partiellement purifiés des 3
souches Yarrowia lipolytica sélectionnées étaient observées à pH 7 et à la temperature de 50-
60 °C. Les valeurs de Km des pectinases purifiées étaient 5 ; 2,74 et 2,53 mg/mL respectivement
pour les souches Tias J0-6 ; YA J3-1 et Buy J2-1. Quant aux les valeurs Vmax des souches, Tias
J0-6 ; YA J3-1 et Buy J2-1, elles étaient de 0,0316 ; 0,032 et 0,053 mg/mL/min.

En ce qui concerne les applications biotechnologiques, les espèces de levures

résistantes à l’éthanol (Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces hansenii, Saccharomyces
cerevisiae, Pichia kurdiavzevii) et celles productrices de pectinase (Yarrowia lipolytica) ont été

145
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

testées. Ainsi, les espèces Rhodotorula mucilaginosa, Debaromyces hansenii, Saccharomyces

cerevisiae, Pichia kurdiavzevii ont montré une capacité à produire du bioéthanol dont le taux
est compris entre 7,01 et 7,38 % (v/v). L’espèce Rhodotorula mucilaginosa a produit le taux le
plus élevé d’alcool avec 7,38 % (v/v).

L’étude portant sur la clarification des jus de fruits par les extraits de pectinase des
souches de Yarrowia lipolytica, a permis de révéler que les pectinases produites par les souches
de Yarrowia lipolytica étaient capables de clarifier les jus d’orange et d’ananas. En effet, les jus
clarifiés présentaient une augmentation de la clarté et une baisse de la couleur, du brunissement,
de la viscosité et du pH. Aussi, les jus clarifiés étaient-ils également marqués par une
augmentation de la teneur en composés phénoliques et dont les tanins totaux et les flavonoïdes
totaux étaient les principaux composés responsables des activités antioxydantes.

Ces résultats permettent d’ouvrir de nombreuses perspectives de recherche. Ainsi,

d’autres matières premières et d’autres conditions de fermentations pourront être testées pour
la production de bioéthanol. Aussi, le bioéthanol produit pourra-t-il être utilisé pour des essais
de production de biocarburant. D’autre part, une combinaison d’extraits enzymatiques de nos
souches pourrait être utilisée afin d’optimiser la clarification. Des essais de clarification de jus
plus denses pourront également être testés.

Ainsi, les industries, les coopératives agricoles œuvrant dans le domaine des
biotechnologies sont invitées à se pencher sur le jus de mucilage de cacao qui regorge de
beaucoup de potentialités.

Comme recommandation, nous invitons les acteurs de la chaîne de valeur cacao à

s’investir dans les produits générés lors du processus de traitement des fèces de cacao
notamment le jus de mucilage de cacao. Le jus de mucilage au regard de ses importantes valeurs
nutritives, fonctionnelles et biotechnologiques pourrait être une source de revenu additionnelle
pour les ménages de producteurs.

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183
ANNEXES

182
 ANNEXES

Annexe I : Fiche d’enquête

Enquête consommation sur le jus de mucilage de cacao

1- Quartier ou Commune ou Village:

2- Sexe: 1- M 2- F

3- Quel âge avez-vous ? 1) 5-15 ans 2) 15-25 ans 3) 25-50 ans 4) 50 ans
et plus

4- Niveau d’étude : 1-Aucun 2-Primaire 3-Sécondaire 4-Supériéur

5- Profession : 1-Elèves 2-Etudiants 3-Fonctionnaires 4-Artisans

4- Chômeurs 5- Agriculteurs 6 - Autre (à préciser) .........................

6- Situation matrimoniale : 1-Marié 2-Célibataire

7- Nationalité : 1-Ivoirienne 2-Ghanéenne 3-Burkinabé 4-Togolaise

5- Béninoise 6- Autres (à préciser) .........................

8- Connaissez-vous le jus de mucilage de cacao? Oui Non

9- Consommez-vous le jus de mucilage de cacao? Oui Non

Si oui
10- A quel moment de la journée ?
1- Matin 2- Travaux champêtres 3- Soir 4- Autre (à
préciser)

11- Combien de fois consommez-vous le jus de mucilage de cacao par jour ?

1- 1 Fois 2- 2 Fois 3-3 Fois 4- Autre (à préciser)

12- Quelle quantité consommez-vous de jus de mucilage de cacao par jour?

1- 250mL 2- 500mL 3- 1 L 4- Autre (à préciser)

13- Combien de temps peut on conserver le jus de mucilage de cacao pour

consommation?
1- 1 Jour 2- 2 Jours 3-3 jours 4-autre (à préciser)

14- Avez-vous déjà ressenti un effet bénéfique après la consommation le jus de

mucilage de cacao?
 ANNEXES

1- Oui 2- Non
15- Si Oui, le ou lesquels ?
1- Laxatif 2-Fortifiant 3-Antidiarrhéique 4-Digeste
5 - Autres (à préciser) ........................
 ANNEXES

Annexe II : Séquences nucléotidiques

>YA1 Rhodotorula mucilaginosa

ACAAAGGATCCCTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATC
TGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGTTGGACCGC
ACACAAGTCTGTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCG
GACGCCCAGCGCTTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAG
CTCAAATTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAG
CGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAG
TACGTGAAATTGTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAAT
CGGTTTGCAGGCCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTA
GCAGTTTCGGCTGTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAA
CGCAGTGTGCCTTTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGA
ATGGCTTTAAACGACCCGTCTAAAACCCCGGGAAAAAAA
>YA2 Yarrowia lipolytica
ACAAAGGGATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAA
CCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCT
TGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGT
ATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAA
ACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGA
AGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTG
ATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGC
GGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAG
CGCCTTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCAC
CCATTTCACCCGTCTGAAAACCCGGGACAAAAAAA
>YA 3 Yarrowia lipolytica
CCAAGGGATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAAC
CCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTT
GGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTA
TTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAA
CTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAA
GGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGA
TAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCG
GTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGC
GCCTTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACC
CATTTCACCCGTCTACCACCCGGGAACCAAA

>YA 4 Yarrowia lipolytica

GCCTCAGTAACGGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAACCCTCGGGA
TTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGT
 ANNEXES

ACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTATTGCCTTAT
CAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTA
AAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGGTG
AAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGATAGGGAAGG
AAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCGGTGTACTGCC
GACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGCGCCTTTCGGG
CGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACCCATTTCACC
>YA 5 Saccharomyces cerevisiae
TTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGG
TGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCC
TTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTC
TTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGT
GGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTAC
AGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAAT
TGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTG
TGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATA
AATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGC
CAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATAT
GCCGCC
>YA 6 Yarrowia lipolytica
TGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAACCCTCGGGA
TTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGT
ACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTATTGCCTTAT
CAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTA
AAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGGTG
AAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGATAGGGAAGG
AAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCGGTGTACTGCC
GACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGCGCCTTTCGGG
CGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACCCATTTCACCC
G
>YA 7 Yarrowia lipolytica
AGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAACCCTCGGGATTGTAA
TTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGTACGTCA
TAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTATTGCCTTATCAAAG
AGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTAAAGCT
AAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGGTGAAAAG
AACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGATAGGGAAGGAAATG
GGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCGGTGTACTGCCGACGC
CGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGCGCCTTTCGGGCGTTCT
CCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACCCATTTCA
>YA 8 Yarrowia lipolytica
 ANNEXES

CAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAACCCTCGGGATTGTA
ATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGTACGTC
ATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTATTGCCTTATCAAA
GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTAAAGC
TAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGGTGAAAA
GAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGATAGGGAAGGAAAT
GGGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCGGTGTACTGCCGACG
CCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGCGCCTTTCGGGCGTTC
TCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACCCATTTCA
>AK 1 Debaryomyces hansenii
CCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTC
GGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTTGGCTCTTGTCTATGTT
CCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAAT
TCTATGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGG
GTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGT
ACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGA
AATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGCGATCCTTTCCTT
CTTGGTTGGGTTCCTCGCAGCTTACTGGGCCAGCATCGGTTTGGATGGTAGGATA
ATGACTAAGGAATGTGGCTCTACTTCGGTGGAGTGTTATAGCCTTGGTTGATACT
GCCTGTCTAGACCGAGGACTGCGTCTTTTGACTAGGATGTTGGCATAATGATCTT
AAGCCA
>AK 2 Rhodotorula mucilaginosa
CCTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATCTGGCACCTTCG
GTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGTTGGACCGCACACAAGTCT
GTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCGGACGCCCAG
CGCTTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAATTG
GGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAG
TACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAGTACGTGAA
ATTGTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAATCGGTTTGC
AGGCCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTAGCAGTTTC
GGCTGTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAACGCAGTGT
GCCTTTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGAATGGCTTTA
AACGA

>AK 3 Debaryomyces hansenii

TTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGG
TGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTTGGCTCTTGTCTATGTTCC
TTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTC
TATGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGT
GGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTAC
AGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAAT
TGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGCGATCCTTTCCTTCTT
GGTTGGGTTCCTCGCAGCTTACTGGGCCAGCATCGGTTTGGATGGTAGGATAATG
 ANNEXES

ACTAAGGAATGTGGCTCTACTTCGGTGGAGTGTTATAGCCTTGGTTGATACTGCCT
GTCTAGACCGAGGACTGCGTCTTTTGACTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGC
CA
>AK 4 Debaryomyces hansenii
TAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGT
GTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTTGGCTCTTGTCTATGTTCCT
TGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCT
ATGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG
GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACA
GTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATT
GTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGCGATCCTTTCCTTCTTG
GTTGGGTTCCTCGCAGCTTACTGGGCCAGCATCGGTTTGGATGGTAGGATAATGA
CTAAGGAATGTGGCTCTACTTCGGTGGAGTGTTATAGCCTTGGTTGATACTGCCTG
TCTAGACCGAGGACTGCGTCTTTTGACTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGCC
A
>AK 5 Rhodotorula mucilaginosa
CTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATCTGGCACCTTCG
GTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGTTGGACCGCACACAAGTCT
GTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCGGACGCCCAG
CGCTTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAATTG
GGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAG
TACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAGTACGTGAA
ATTGTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAATCGGTTTGC
AGGCCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTAGCAGTTTC
GGCTGTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAACGCAGTGT
GCCTTTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGAATGGCTTTA
AACGAC
>AK 6 Rhodotorula mucilaginosa
CCCTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATCTGGCACCTTC
GGTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGTTGGACCGCACACAAGTC
TGTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCGGACGCCCAG
CGCTTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAATTG
GGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAG
TACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAGTACGTGAA
ATTGTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAATCGGTTTGC
AGGCCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTAGCAGTTTC
GGCTGTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAACGCAGTGT
GCCTTTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGAATGGCTTTA
AACGACCC
 ANNEXES

>AK 7 Debaryomyces hansenii

TTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGG
TGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTTGGCTCTTGTCTATGTTCC
TTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTC
TATGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGT
GGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTAC
AGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAAT
TGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGCGATCCTTTCCTTCTT
GGTTGGGTTCCTCGCAGCTTACTGGGCCAGCATCGGTTTGGATGGTAGGATAATG
ACTAAGGAATGTGGCTCTACTTCGGTGGAGTGTTATAGCCTTGGTTGATACTGCCT
GTCTAGACCGAGGACTGCGTCTTTTGACTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGC
C
>AK 8 Rhodotorula mucilaginosa
TAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATCTGGCACCTTCGGT
GTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGTTGGACCGCACACAAGTCTGTT
GGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCGGACGCCCAGCGC
TTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAATTGGGT
GGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTAC
CGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAGTACGTGAAATT
GTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAATCGGTTTGCAGG
CCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTAGCAGTTTCGGCT
GTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAACGCAGTGTGCCT
TTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGAATGGCTTTAAAC
GA
>TIAS1 Yarrowia lipolytica
CCAAAGGGATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAA
CCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCT
TGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGT
ATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAA
ACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGA
AGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTG
ATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGC
GGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAG
CGCCTTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCAC
CCATTTCACCCGTCTTGACCCCCCGGGAACAA
>TIAS 2 Rhodotorula mucilaginosa
ACAAAGGATCCCTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATC
TGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGTTGGACCGC
ACACAAGTCTGTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCG
GACGCCCAGCGCTTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAG
CTCAAATTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAG
CGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAG
TACGTGAAATTGTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAAT
 ANNEXES

CGGTTTGCAGGCCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTA
GCAGTTTCGGCTGTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAA
CGCAGTGTGCCTTTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGA
ATGGCTTTAAACGACCCGTCTAACAACCCGGGGAAAAAAAA

>TIAS 3 Pichia kudriavzevii

CCAAAGGGATGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAA
TCGTGCTTTGCGGCACGAGTTGTAGATTGCAGGTTGGAGTCTGTGTGGAAGGCGG
TGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGCGCCCAGGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGATGC
CGGCGGAAGCAGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCC
AAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGA
ACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA
CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGCGCCCGACATGGGGATTGCGCACCG
CTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGCTTTCCCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTG
CAGGAGAAGGGGTTCTGGAACGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCAGGGCCAGA
TGCTGCGTGCGGGGACCGAGGACTGCGGCCGTGTAGGTCACGGATGCTGGCAGA
ACGGCGCAACACCGCCCGTCTGAAAACCGGGGACAAAAAAAA

>TIAS 4 Pichia kudriavzevii

ACAAAGGGATGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAA
TCGTGCTTTGCGGCACGAGTTGTAGATTGCAGGTTGGAGTCTGTGTGGAAGGCGG
TGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGCGCCCAGGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGATGC
CGGCGGAAGCAGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCC
AAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGA
ACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA
CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGCGCCCGACATGGGGATTGCGCACCG
CTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGCTTTCCCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTG
CAGGAGAAGGGGTTCTGGAACGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCAGGGCCAGA
TGCTGCGTGCGGGGACCGAGGACTGCGGCCGTGTAGGTCACGGATGCTGGCAGA
ACGGCGCAACACCGCCCGTCTAAAAACAGGGGAACAAAAAAA

>TIAS 5 Yarrowia lipolytica

ACAAAGGGATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAA
CCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCT
TGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGT
ATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAA
ACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGA
AGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTG
ATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGC
GGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAG
 ANNEXES

CGCCTTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCAC
CCATTTCACCCGTCTTGAACACCACGGGACCAA
>TIAS 6 Pichia kudriavzevii
ACAAAGGGATGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAA
TCGTGCTTTGCGGCACGAGTTGTAGATTGCAGGTTGGAGTCTGTGTGGAAGGCGG
TGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGCGCCCAGGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGATGC
CGGCGGAAGCAGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCC
AAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGA
ACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA
CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGCGCCCGACATGGGGATTGCGCACCG
CTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGCTTTCCCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTG
CAGGAGAAGGGGTTCTGGAACGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCAGGGCCAGA
TGCTGCGTGCGGGGACCGAGGACTGCGGCCGTGTAGGTCACGGATGCTGGCAGA
ACGGCGCAACACCGCCCGTCTAGAAAACCGGGGACAAAA

>TIAS 7 Yarrowia lipolytica

CCAAAGGGATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAA
CCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCT
TGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGT
ATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAA
ACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGA
AGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTG
ATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGC
GGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAG
CGCCTTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCAC
CCATTTCACCCGTCTTGAACACCCCGGGAACAAAGA

>TIAS 8 Yarrowia lipolytica

ACAAAGGGATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAA
CCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCT
TGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGT
ATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAA
ACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGA
AGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTG
ATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGC
GGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAG
CGCCTTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCAC
CCATTTCACCCGTCTAAAACCCAGGACCAAA
 ANNEXES

Annexe III : Matériel technique

Spectrophotomètre

Centrifugeuse réfrigérée
 ANNEXES

Incubateur-agitateur

Etuve
ANNEXES

Autoclave
PUBLICATIONS
 PUBLICATIONS

LISTE DES PUBLICATIONS

Publication 1: Identification of pectinase-producing yeast strains

isolated from fermented mucilage of cocoa juice. Current topics in
biotechnology, 2021, 12: 27-38. “Extrait de la these”.

Publication 2: Assessment of physicochemical, biochemical and

functional properties of mucilage cocoa juice during storage at room
temperature. Open Journal of Food and Nutrition, 2022, 1, 10-27.
“Extrait de la these”.

Publication 3: Clarification treatments of pineapple (Malus domestica)

and orange (Citrus sinensis) juices by pectinase from Yarrowia
lipolytica strains identified from cocoa juice in fermentation. Journal of
Biochemistry International, 2022, 9 (4): 82-93. “Extrait de la these”.
 PUBLICATIONS

Publication 1
Identification of pectinase-producing yeast strains isolated from
fermented mucilage of cocoa juice. Current topics in biotechnology,
2021, 12: 27-38. “Extrait de la these”.
 PUBLICATIONS

Publication 2
Assessment of physicochemical, biochemical and functional
properties of mucilage cocoa juice during storage at room
temperature. Open Journal of Food and Nutrition, 2022, 1, 10-27.
“Extrait de la these”.
 Open Journal of Food and Nutrition, 2022, 1, 10-27
www.scipublications.org/journal/index.php/ojfn
DOI: 10.31586/ojfn.2022.186

Article

Assessment of physicochemical, biochemical and functional

properties of mucilage cocoa juice during storage at room tem-
perature
Tano Marie-Ange Sakia Mian 1,2, Fatoumata Camara 2, Wahauwouele Hermann Coulibaly 3,* , Grah Avit
Maxwell Beugré 1

1 Laboratoire d’agro-valorisation; Unité de Formation et de Recherche d’Agroforesterie, Université Jean

Lorougnon Guédé, Daloa, Côte d’Ivoire
2 Laboratoire
de Nutrition et Sécurité Alimentaire, Unité de Formation et de Recherche en Sciences et
Technologie des Aliments (UFR-STA), Université Nangui Abrogoua, 02 BP 801 Abidjan 02, Côte
d’Ivoire
3 Laboratoirede Biotechnologie et Microbiologie des Aliments, Unité de Formation et de Recherche en
Sciences et Technologie des Aliments (UFR-STA), Université Nangui Abrogoua, 02 BP 801 Abidjan 02,
Côte d’Ivoire

*Correspondence: [email protected]; +2250707731604; Côte d’Ivoire

Abstract: Beans cocoa exploitation process generated by-products such as mucilage cocoa juice.
This juice called “cocoa water” was often considered as waste because her storage is delicate at
room temperature. The aim of this study was to assess self-life of mucilage cocoa juice during
storage at room temperature. Consumption survey revealed that mucilage cocoa juice was self-
How to cite this paper: Mian, T. M. life until 72 hours at room temperature and according to surveyed population, he possessed
A. S., Camara, F., Coulibaly, W. H., laxative, strengthening and anti-diarrheal properties. For all physicochemical, biochemical and
& Beugré, G. A. M. (2022). Assess- functional parameters assessed during storage at room temperature, variations were ir-
ment of physicochemical, biochemi- regulars. Also, mucilage cocoa juice samples have phenolic compounds contents and antioxi-
cal and functional properties of mu-
dant activities important and high energetic values.
cilage cocoa juice during storage at
room temperature. Open Journal of
Keywords: Mucilage cocoa juice, storage at room temperature, phenolic compounds, antioxi-
Food and Nutrition, 1(1), 10–26. Re-
dant activities
trieved from https://www.scipubli-

cations.com/journal/in-
dex.php/ojfn/article/view/186

1. Introduction
The cocoa tree (Theobroma cacao Linne) is widely farmed for its beans in tropical
Received: November 20, 2021 farms around the world [1]. Three nations (Côte d'Ivoire, Ghana, and Cameroun) are
Accepted: February 3, 2022 the largest producers, contributing for more than 70% of global production in 2018-
Published: February 4, 2022
2019. [2]. Only one country, Côte d'Ivoire, accounts for more than 35 percent of global
production [2]. Her entire output was meant for sale to industrialized countries (Eu-
rope and America), where the fermented cocoa beans were mostly used to make
Copyright:© 2022 by the authors.
chocolate. Cocoa "fermentation" is one of the phases in post-harvest processing that
Submitted for possible open access
determines the quality of the final product. The cocoa beans are embedded in a mass
publication under the terms and of mucilaginous pulp in the pods, and after both beans and pulp were removed from
conditions of the Creative Commons the pods, the mucilaginous pulp was destroyed by pectinolytic enzymes to produce a
Attribution (CC BY) license mucilage fluid known as "cocoa water" or “cocoa honey” [3-4]. Mucilage juice is
(http://creativecommons.org/licenses created when the mucilaginous pulp enclosing beans is broken down, resulting in
/by/4.0/). cotyledon death [5]. This beverage is popular among farm laborers and their children.
However, fermentation of cocoa beans involved multiple processes, resulting in by-

DOI:https://doi.org/10.31586/ojfn.2022.186 Open Journal of Food and Nutrition

Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 2 of 18

products that are frequently discarded as waste. Indeed, each year, more than 300
million liters of mucilage liquid are wasted during the shucking process [6].
Furthermore, the high level of alcohol obtained after a few days of storage at
room temperature in juice could indicate the presence of yeasts with a relatively high
resistance and tolerance to alcohol and metabolites produced, such as organic acids
(acetic acid, lactic acid, citric acid), and other products that influenced the taste [7].
Anvoh [6] found that under controlled fermentation to 28 °C and 35 °C, the alcohol
concentrations of mucilage juice were 7.8% and 8.4%, respectively, in her investiga-
tion.
According to Cocolin et al. [8], 38 % and 54 % of total isolates from cocoa bean
fermentation could grow at 8, 10 and 12% (v/v) of ethanol, respectively. S. cerevisiae
grew the fastest at 12 %ethanol. The majority of investigations on cocoa fermentation
were focused on beans at the time of handover. Some authors researched cocoa mu-
cilage juice to transform it into marmalade, vinegar, wine, and refreshing beverages
[4-6-7-9]. Therefore, objective of this study was to determine the maximum storage
and consumption time of mucilage cocoa juice through survey. The physicochemical,
biochemical and functional properties were investigated.

2. Materials and Methods

2.1 Survey form
A survey sheet has been prepared to determine the knowledge level of mucilage
juice of cocoa, maximal storage time, beneficial effects eventual. The next analyses
depended of survey results.
2.2. Material
The mucilage cocoa juices were collected from five (05) cocoa producers in dif-
ferent locations: Akoupé: (6.3879° N, 3.8808° W) and Yakasse-Attobrou: (6.1853° N,
3.6446° W) in the south-east; Tiassalé (5.9043° N, 4.8261° W) in the south; Taabo
(6.2338° N, 5.1394° W) in the center; and Buyo. Moreover, samples were taken from
production equipment’s, with five (05) liters being taken aseptically in sterile plastic
bottles, the samples being maintained in a box containing ice, and being routed to the
laboratory. The bottles were kept at room temperature in the laboratory. Each 24
hours, mucilage cocoa juices were sampled for different analyses.
2.3. Methods
2.3.1. Study sites and population
The surveys were conducted in the same localities where samplings have been
carried. For this study, 500 people were interviewed with 100 per locality.
2.3.2. Size of individuals to be investigated
The sample size for this investigation was determined using Israel's [10] formula
for a non-exhaustive independent sample.

n = t2 (p (1 − p) )/e2 (1)

With n denoting the sample size, e denoting the margin of error, t denoting the
margin coefficient calculated from the confidence rate, and p denoting the population
in the study area. Based on data from the general population census of Côte d'Ivoire,
the sample for each area was created using the probability approach proportional to
the size of households in each locale [11-12].
Consumers are given step-by-step instructions on how to complete the question-
naire on the websites. The questions were either multiple choice questions with two
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 3 of 18

or three possible responses or yes/no questions with true/false answers. The final sur-
vey was organized around three (3) primary points: knowledge and consumption of
cocoa mucilage juice, storage time of cocoa mucilage juice and eventual benefits ef-
fects of cocoa mucilage juice.
2.3.3. Physicochemical and biochemical analyses
The constant weight method was used to determine the ash content and mois-
ture level [13]. Fat content was estimated using a liquid-liquid extraction in according
with method AOAC [13]. Protein content was evaluated with Kjeldahl method [ 1 3 ]
. The amount of fibers in the sample was determined using Wolf's method [14]. The
glucid total contents and energetic values were determined by calcul from others
biochem- ical compounds contents.
The vitamins (ascorbic acid and cobalamin) organic acids (lactic, malic, oxalic,
propionic, tartaric, citric and acetic acids) were separated and quantified by Shi-
madzu LC-6A Liquid Chromatograph, equipped by a detector (Shimadzu SPD-6A
UV Spectrophotometric detector) a pump (Shimadzu LC-6A Liquid Chromatograph)
and an Integrator (Shimadzu C-R 6A Chromatopac). An ion-exclusion ORH-801 col-
umn was used for chromatographic separation (300 mm x 6.5 mm, Interchrom,
France). The eluant was 0.004 N H2SO4 at a flow rate of 0.8 ml/min, with a 210 nm
detector. For HPLC samples, a 20 µL injection volume was used. The analysis was
carried out twice and the mean values were used. The organic acids standards were
dissolved in distilled water at values between 0.05 and 0.4 g/L. The standards were
filtered and injected into the same containers as the samples. By comparing retention
periods and peak areas to those of a standard, components were found and quanti-
fied.
2.3.4. Phytochemical contents of mucilage cocoa juice during storage at room tem-
perature
2.3.4.1. Phenols total contents
The Folin-Ciocalteu colorimetric technique was used to determine total phenol
content [15]. After centrifugation, 250 µL of diluted Folin-Ciocalteu-reagent (10% v/v)
were added to a 50 µL aliquot of the final result. After 1 minute, 750 µL of aqueous
Na2CO3 (20% w/v) was added, and the volume was adjusted to 5.0 mL using H 2O.
Except for the sample, the controls contained all of the reaction reagents. The absorb-
ance was measured at 760 nm after 2 hours of incubation at 25 °C and compared to
both a gallic acid calibration curve and controls. Total phenols were measured in gal-
lic acid equivalents per mL (g GAE/mL), and the results were provided as the means
of three measurements.
2.3.4.2. Total flavonoid contents
The AlCl3 colorimetric technique was used to estimate total flavonoid content
[16]. A total of 0.5 mL of sample was mixed with the corresponding amounts of dis-
tilled water, aluminum trichloride (AlCl3) 10% (w/v) (Labosi, Paris, France), sodium
acetate (1 M), and 2 mL of water. On a Rayleigh spectrophotometer, absorbance at
415 nm was recorded after 30 minutes of incubation at room temperature (UV spec-
trophotometer; USA). Total flavonoid contents were determined using the means of
three replicates and compared to a 0–300 g/mL quercetin calibration curve (Sigma–
Aldrich Chemie, Steinheim, Germany).
2.3.4.3. Total tannins contents
The Bate-Smith reaction, in which colorless proanthocyanidins are converted
into colored anthocyanins by heating at 100 °C in an acidic solution and their amounts
assessed based on their absorbance at 550 nm, was used to determine easily
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 4 of 18

extractable tannins [17]. Two (2 mL) sample, 1 mL distilled water, and 3 mL 12N hy-
drochloric acid were added to two test tubes. One sample test tube was kept standing
while the other was hermetically sealed and immersed in a water bath at 100 °C for
30 minutes before cooling in ice for 10 minutes. Each test tube received 0.5 mL of
ethanol, and the optical densities were measured. The concentration of tannins in g/L
was determined by using the following equation, which is proportional to the con-
centration of anthocyanins.

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑡𝑎𝑛𝑛𝑖𝑛𝑠 = 19.33 ∗ 𝛥𝐷𝑂 (2)

The difference in optical density between the two tubes is denoted by ΔOD
2.4. Antioxidants activities
2.4.1. Antiradical activity: DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) assay
The DPPH assay method, which is one of the most widely used methods for
assessing the antioxidant capacity of natural products, was chosen because of its sim-
plicity and accuracy [18]. In the presence of an alcoholic solution of DPPH, yielding
the free radical form DPPH, the antioxidant activities of mucilage cocoa juice are as-
sessed by evaluating their respective free radical scavenging abilities [19]. In a meth-
anol solution, the samples were mixed with the stable DPPH radical. 2 mL sample, 2
mL DPPH radical solution 100 mM in methanol were added to the reaction mixture.
When DPPH combines with an antioxidant that can donate hydrogen, it undergoes a
transformation. From deep violet to bright yellow in color. Using a Rayleigh UV
spectrophotometer, the color changes after 30 minutes of reaction time were meas-
ured as Absorbance (Abs) at 517 nm (USA). Using equation (3), the rate of scavenging
activity (AA %) was estimated as follows:

𝑋−𝑌
𝐴𝐴 = [ ] ∗ 100 (3)
𝑋

Where X is the absorbance at 517 nm of oxidized DPPH in pure unreacted form

and Y is the absorbance of the sample after 30 min incubation with DPPH.
2.4.2. Ferric reducing-antioxidant power FRAP (potassium ferricyanide ferric
chloride) assay
Using the potassium ferricyanide-ferric chloride method, the ferric ion (Fe 3+)
reduction ability of mucilage cocoa juice samples was examined [20]. A 0.5 mL ali-
quot of each sample was mixed with 0.5 mL of phosphate buffer (0.2 M, pH 6.6) and
0.5 mL of potassium ferricyanide K3Fe(CN)6 (1 percent) and incubated at 50 C for 20
minutes. A volume of 0.5 mL trichloroacetic acid (10% (w/v)) was used to stop the
reaction. The absorbance of 0.5 mL of the reaction mixture was measured at 700 nm
after it was mixed with 0.8 mL of distilled water and 0.1 mL of FeCl 3 (0.1 %). Each
sample's reducing power was measured in µg of ascorbic acid equivalents (AAE) per
mL.
2.5. Statistical analysis
The R software was used to do an analysis of variance, and Tukey's test was used
to identify differences between mean values (P< 0.05). In order to regroup mu- cilage
cocoa juices during storage which have the same characteristics during storage,
dendrogram was done using R. Pearson correlation analysis was used to look into
any links between antioxidant activity and the presence of phenolic substances.
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 5 of 18

3. Results
3.1. Data survey
3.1.1. Profile of the surveyed population
The survey allowed to establish socio-demographic profile of the respondents.
The results showed that 79% of the respondents were male, compared with 31% who
were female. The main age groups were 25 to 50 years (62.2%) and 15 to 25 years
(30.8%). Most of the respondents had no education (54.4%), the majority of whom
worked in the agricultural sector (71%), and married people (67.8%) were the most
numerous. Among the people interviewed, Ivorians (77.4%) and Burkinabe (19.8%)
were the most dominant (Data not shown).
3.1.2. Knowledge, consumption and frequency of consumption by the population
interviewed
The survey revealed that all respondents (500 people: 100%) knew about muci-
lage cocoa juice and 98.8% of interviewed consumed it. Also, the respondents pre-
ferred to consume mucilage cocoa juice more during field work (37%) and in the
evening (33%) with a frequency of 3 times (31.80%) and more than 3 times (32.60%)
per day (Data not shown).
3.1.3. Amount consumed, storage time and beneficial effect of mucilage cocoa
juice
Most interviewed claimed, that they consumed more than 3 liters per day (52.8%)
and that the cocoa mucilage juice had a maximum self-life of 3 days (46.96%).
Number of respondents stated that they felt a beneficial effect (95.14%) following
the consumption of mucilage cocoa juice. Among these beneficial effects, the laxative
(39.70%) and strengthening (20.44%) characteristics were the ones most mentioned
by the interviewed (Table 1).
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 6 of 18

Table 1. Amount consumed, storage time and beneficial effect of mucilage cocoa juice

Parameters Number of re- Percentage

spondents
Amount of consumed juice (n = 494)
250 mL 46 9.31
500 mL 98 19.89
3L 261 52.80
Others 89 18
Storage time (n = 494)
24 hours 31 6.27
48 hours 145 29.37
72 hours 232 46.96
More than 3 times 86 17.4
Benefit effect (n=494)
Yes 470 95.14
No 24 4.86
Effect (n=494)
Laxative 196 39.70
Strengthening 101 20.44
Anti-diarrheal 80 16.19
Digest 52 10.52
Others 39 7.89
None 26 5.26
n= number of people surveyed

3.2. Physicochemical and biochemical characteristics of mucilage cocoa juice

during storage at room temperature
From the survey’s data, mucilage cocoa juice had a maximum self-life of 3 days.
Thus, sampling during mucilage cocoa storage have been done until 3 days. The re-
sults of physicochemical and biochemical characteristics of mucilage cocoa juice dur-
ing storage have been assessed each 24 hours during 72 hours (3 days).
3.2.1. Evolution of physicochemical parameters of mucilage cocoa juice during
storage at room temperature
The analysis of physicochemical parameters was focused on dry matter, mois-
ture, ash, protein, lipids, fibers and carbohydrate. The values of the evolution of these
parameters were consigned in the Table 2. Generally, and whatever the parameter,
the values of these parameters evolved in an irregular way during the conservation.
On the other hand, total lipids and total fibers were not detected in our samples. From
all the parameters studied, total carbohydrates have the highest content between
11.46 and 1.64%. Furthermore, statistical analyses showed a significant difference
between the samples during storage.
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 7 of 18

Table 2. physicochemical parameters of mucilage cocoa juice during storage at room temper-
ature

T0 T24 T48 T72

Dry matter 12.29±0.063 a 12.31±0.084 a 11.89±0.014 a 5.29±0.14 c
Moisture 87.70±0.063 e 87.64±0.014 c 88.11±0.014 e 94.725±0.16 c
Ash 0.63±0.05 a 0.59±0.06 a 0.48±0.02 ab 0.38±0.04 b
Protein 0.30±0 b 0.31±0.01 b 0.77±0.01 a 0.37±0.01 b
Lipid 0 0 0 0
Fiber 0 0 0 0
Taabo carbohydrate 11.37±0.07 bc 11.46±0.1 a 10.64±0.04 b 4.53±0.07 a
Dry matter 11.44±0.12 b 6.965±0.02 b 8.605±0.1 c 10.04±0.007 a
Moisture 88.56±0.12 d 93.035±0.02 b 91.395±0.10 c 89.95±0.007 e
Ash 0.44±0.007 b 0.25±0.03 c 0.285±0.012 c 0.43±0.04 b
Protein 0.40±0.009 a 0.25±0.009 c 0.33±0.01 b 0.41±0.02 b
Lipid 0 0 0 0
Yakassé Fiber 0 0 0 0
Attobrou carbohydrate 10.60±0.02 bc 6.47±0.04 a 8.37±0.13 a 9.21±0.07 a
Dry matter 5.46±0.11 e 4.125±0.007 c 9.415±0.07b 8.7±0.16 b
Moisture 94.54±0.11 a 97.375±2.12 a 90.58±0.077 d 91.3±0.16 d
Ash 0.17±0.03 c 0.14±0.04 c 0.44±0 bc 0.425±0.03 b
Protein 0.12±0.02 c 0.12±0.01 d 0.30±0.009 b 0.4±0.008 b
Lipid 0 0 0 0
Fiber 0 0 0 0
Akoupé carbohydrate 5.17±0.06 a 2.37±0.05 a 8.68±0.04 a 7.88±0.04 a
Dry matter 5.875±0.02 d 3.64±0.04 d 3.545±0.007 d 3.35±0.04 d
Moisture 94.125±0.02 b 96.36±0.04 a 96.45±0.007 b 96.65±0.04 b
Ash 0.615±0.02 a 0.42±0.05 b 0.62±0.03 a 0.63±0.07 a
Protein 0.3±0.008 b 0.66±0.02 a 0.14±0 d 0.2±0 c
Lipid 0 0 0 0
Fiber 0 0 0 0
Tiassalé carbohydrate 4.97±0.05 c 2,56±0.05 c 2,79±0.02a 2,52±0.06 d
Dry matter 7.28±0.02 c 3.075±0.007 e 2.675±0.16 e 2.445±0.03 e
Moisture 92.72±0.02 c 96.92±0.007 a 97.325±0.16 a 97.55±0.035 a
Ash 0.38±0.07 b 0.27±0 c 0.40±0.04 bc 0.35±0.02 b
Protein 0.27±0 b 0.31±0 b 0.25±0.01 c 0.46±0.01 a
Lipid 0 0 0 0
Fiber 0 0 0 0
Buyo carbohydrate 6.63±0.42 d 2.5±0.02 c 2.03±0.03 c 1.64±0.07 e
Values are means ±standard deviation, n=3. Means in the same column with different letters
are significantly different according to Tukey's test (p < 0.05).
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 8 of 18

3.3 Evolution of biochemical parameters of mucilage cocoa juice during storage

at room temperature
3.3.1 Changes in the vitamin
The analysis of vitamin content allowed identification and quantification of 2
vitamins: ascorbic acid and cobalamin. An irregularity in evolution of contents of
vitamins (ascorbic acid and cobalamin) was observed for all samples (Table 3).
Gobally, cobalamin contents were higher than ascorbic acid contents. The highest
ascorbic acid and cobalamin contents were recorded at the beginning of storage in
the Tiassalé sample with 14.97± 0.45 and 34.51±66.09 g/L respectively. The lowest
concentration of ascorbic acid was obtained with the Buyo sample after 48 h of
conservation, while the lowest concentration of cobalamin was observed with the
Akoupé sample at the beginning of conservation and the Buyo sample at the end
of conservation with 10.245±0.5 and 12.52±0.39 g/L respectively. Furthermore,
statistical analysis showed a significant difference between samples during storage.

Table 3. Vitamin contents (g/L) in mucilage cocoa juice during storage at room temperature

T0 T24 T48 T72

Ascorbic acid 14.970± 0.45b 2.465±0.02 e 3.59±0.57 fg 5.93±0.44 e
Tiassalé Cobalamin 34.51±66.09 a 14.30± 00a 13.52±0.67 bc 14.87±0.7 a
Yakassé Ascorbic acid 4.625±0 e 8.21±2.96 d 7.74±1.65 de 4.545±1.12 e
Attobrou Cobalamin 14.665±0.38 bc 13.56±0.01 ab 12.87±1.06 c 12.52±0.39 abc
Ascorbic acid 5.175±0.41 e 2.26±1.67 e 2.25±1.41 g 5.255±0.64 e
Buyo Cobalamin 13.84±0.81 bc 13.39±0.69 ab 15.935±2.43 b 10.25±1.09 cd
Ascorbic acid 10.435±0.86 cd 7.5±0.7 d 5.27±0.29 ef 9.205±2.89 d
Akoupé Cobalamin 10.245±0.5 cd 11.03±0.29 bc 20.61±0.25 a 12.15±0.19 bc
Ascorbic acid 7.43±0.43 de 9.6±0.63 cd 9.29±0.12 d 4.73±0.38 e
Taabo Cobalamin 13.86±0 bc 13.75±0.03 a 12.98±0.28 c 12.94±0.11 ab
Values are means ±standard deviation, n=3. Means in the same column with different letters
are significantly different according to Tukey's test (p < 0.05).

3.3.2 Changes of the organic acid content

The analysis of organic acid content by HPLC allowed identification and
quantification of 6 organic acids: tannic, citric, tartaric, fumaric, lactic and acetic
acids. As other parameters, evolution of organic acid contents during storage was
irregular. The lowest concentration was obtained with fumaric acid, whatever
sample, during the whole storage period, whereas highest concentrations were
observed with citric and tartaric acids after 24 hours of storage in the Tiassalé sample,
with 75.66±1.32 and 77.77±1.31 g/L respectively (Table 4). Furthermore, statistical
analyses showed a significant difference between the samples during storage.
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 9 of 18

Table 4. Organic acids content (g/L) of mucilage cocoa juice during storage at room tempera-
ture

T0 T24 T48 T72

Tannic acid 0.505±0.02 ij 4.19±1.28 h 2±0.02 l 0.87±0.09 mn
Acetic acid 0.89±0.01 hij 7.42±0.04 fg 3.71±0.01 k 1.55±0.07 lmn
Tiassalé 9.2±1.13 cd 75.66±1.32 b 35.68±0.1 c 15.83±1.37 e
Citric acid
Lactic acid 4.03±0.02 f 33.33±4.2 d 17.53±1.3 e 6.97±0.09 i
Fumaric acid 0.062±0.001 j 0.51±0.01 kl 0.25±0.07 o 0.1±0.02 n
Tartric acid 9.45±0.07 cd 77.77±1.31 a 36.8±0.07 ab 16.27±0.04 e
Tannic acid 1.405±0.02 ghij 0.855±0.02 kl 0.99±0.007 mno 1.675±0.14 klmn
Acetic acid 2.57±0.09 fgh 1.66±0.29 jkl 1.8±0.07 lm 2.55±0.11 klm
Yakassé Citric acid 23.52±1.38 a 14.66±0.25 e 19.41±0.72 d 21.44±1.14 d
Attobrou Lactic acid 10.55±1.34 c 6.71±0.37 g 7.89±1.28 i 10.88±0.20 gh
Fumaric acid 0.16±0.007 j 0.1±0.0007 l 0.13±0.02 o 0.18±0.004 n
Tartric acid 25.13±1.37 a 15.7±0.14 e 18.41±0.01 e 24.31±1.4 c
Tannic acid 1.3±0.02 hij 1.98±0.02 ijk 1.9±0.01 lm 1.57±0.04 lmn
Acetic acid 2.3±0.07 fghi 3.51±0.04 hij 3.63±0.04 k 2.82±0.05 kl
Buyo Citric acid 23.3±1.55 a 35.75±0.14 c 36.38±0.51 bc 28.25±1.59 ab
Lactic acid 10.34±0.07 c 15.78±0.02 e 16.24±0.01 f 12.49±1.28 fg
Fumaric acid 0.15±0.001 j 0.24±0.04 kl 0.21±0.04 o 0.19±0.003 n
Tartric acid 24.095±2.87 a 36.43±0.57 c 37.39±0.57 a 29.97±1.68 a
Tannic acid 0.41±0.02 ij 0.43±0.04 kl 0.8±0.04 no 0.58±0.01 n
Acetic acid 0.743±0.00 hij 0.752±0 kl 1.43±0.01 lmn 1.047±0.01 mn
Citric acid 7.58±2.71 de 7.6±0.42 fg 14.48±0.11 g 10.47±2.72 h
Akoupé Lactic acid 3.33±1.37 fg 3.56±0.12 hi 6.39±0.12 j 4.61±0.15 j
Fumaric acid 0.05±0.003 j 0.054±0.002 l 0.097±0.009 o 0.07±0.01 n
Tartric acid 7.77±1.31 de 7.87±0.09 fg 14.88±1.3 g 10.76±1.32 gh
Tannic acid 0.80±0.03 hij 0.51±0.04 kl 0.56±0.01 no 1.57±0.09 lmn
Acetic acid 1.48±0.11 ghij 0.86±0.008 kl 0.976±0.008 mno 3.44±0.48 jk
Taabo Citric acid 14.48±0.11 b 9.23±0.66 f 10.37±0.09 h 27.915±0.75 b
Lactic acid 6.92±0.65 e 4.32±0.73 h 4.49±0.01 k 13.34±0.21 f
Fumaric acid 0.549±0hij 0.058±0.002 l 1.03±0.01 mno 0.19±0.003 n
Tartric acid 15.88±0.11 b 8.97±0.09 f 9.92±0.02 h 29.11±0.15 ab
Values are means ±standard deviation, n=3. Means in the same column with different letters
are significantly different according to Tukey's test(p < 0.05).

3.3.3. Changes of the energetic value

The changes of the energy value of the cocoa juices during storage is presented
in Figure 1. It emerges from this analysis that these values evolve in an irregular
manner whatever the sample. At the beginning of storage, the highest energy value
was obtained with the Taabo sample with 40.59±0.8 Kcal/100 mL, followed by the
Yakasse-Attobrou sample with 37.84±0.9 Kcal/100 mL after 24 hours of storage. At 48
hours of conservation, the highest energy value was recorded with the Taabo sample
with 37.98±0.6 Kcal/100 mL, whereas at the end of conservation this value was higher
with the Akoupe sample (37.09±0.8 Kcal/100 mL).
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 10 of 18

Figure 1. Evolution of energetic values of juices during storage

3.4. Evolution of phytochemical compounds of mucilage cocoa juice during storage

at room temperature
3.4.1. Changes of phenols total content
Phenols total content of mucilage cocoa juice during storage was presented in
Figure 2. These contents evolve irregularly during storage. However, whatever sam-
ple, highest levels of phenols total were observed in Tiassalé juices throughout stor-
age period. These contents ranged from 1.17±0.7 at the beginning of storage to 1.32±0
g/L GAE at the end of storage. Statistical analyses showed a significant difference
between the samples during storage.

Figure 2. Phenols total contents variations of juices during storage

3.4.2. Changes of flavonoids total content

Figure 3 showed changes of total flavonoids contents of mucilage cocoa juice
samples during storage. Like total phenols, total flavonoids evolution was character-
ized by irregular variations. Highest concentrations differed from one sample to
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 11 of 18

another during storage. Thus, at the beginning of storage (0h), highest content was
obtained with Akoupé sample with 0.083±0.00084 g/L EQ, followed 24 hours later by
Buyo sample with 0.14±0.00021 g/L EQ, and then Yakasse-Attobrou sample at 48h
and at the end of storage (72h) with 0.21±0.00042 and 0.16±0.001 g/L EQ respectively.
Also, the statistical analyses showed a significant difference between samples during
storage.

Figure 3. Flavonoids total contents variations of juices during storage

3.4.3. Changes of tannins total content

On the basis of total tannins content variations, samples can be classified into
two groups. Thus, first group, was represented Akoupé and Tiassalé samples, which
characterized by a decreasing in total tannins content during storage. The values went
from 46.38±1.36 to 2.89±0 g/L and then from 60.40±0.68 to 5.31±0.68 g/L for Akoupé
and Tiassalé samples respectively. The second group was composed of sam- ples from
Taabo, Yakasse-Attobrou and Buyo where total tannins content in mucilage cocoa
juice during storage showed irregular fluctuations (Figure 4). Also, total tan- nins
remained most abundant group of phenolic compounds in the juice samples.
Furthermore, statistical analyses showed a significant difference between samples
during storage.

Figure 4. Tannins total contents variations of juices during storage

Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 12 of 18

3.5. Antioxidant activities of mucilage cocoa juice during storage at room

temperature
3.5.1. DPPH radical scavenging ability
DPPH radical scavenging ability rate allowed to characterize samples according
to their evolution. Thus, Akoupé and Taabo samples were by regular variations re-
flected by a decreasing in activity from 40.07±0.5 to 7.63±0.01% and from 89.66±7.6 to
2.35±0.01% respectively. The irregularities in evolution of antioxidant activity were
observed in samples from Tiassalé, Yakasse-Attobrou and Buyo (Figure 5). In addi-
tion, a significant difference was recorded between the samples during storage.

Figure 5. Scavenging rate of juices during storage

3.5.2. Ferric reducing-antioxidant power FRAP (potassium ferricyanide ferric

chloride)
Evolution of antioxidant activity values determined by FRAP method was
showed in Figure 6. For all samples, fluctuations were irregulars excepted for Taabo
and Tiassalé samples. Taabo sample was characterized by an increase in antioxidant
activity from 3.5±0.56 µg/mL of vitamin C at beginning of storage (0h) to 24.1±0.14
µg/mL of vitamin C at the end of storage (72h). On the other hand, in Tiassalé sample,
a decrease in antioxidant activity was observed throughout storage period, with val-
ues lowed from 23.8±2.77 to 7.43±0.9 µg/mL of vitamin C. Moreover, whatever sam-
ple, highest antioxidant activity was obtained with Buyo sample after 48 h of storage
with 29.93±1.30 µg/mL of vitamin C whereas lowest activity was recorded in Taabo
sample at beginning of storage (0) with 3.5±0.56 µg/mL of vitamin C. Also, a signifi-
cant difference was recorded between the samples during storage.
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 13 of 18

Figure 6. Antioxidant activity (FRAP) evolution of juices during storage

3.6. Correlation between phenolic compounds and antioxidant activities of

mucilage coco juice during storage at room temperature
A correlation matrix has been created to explore the possible relationships be-
tween phenolic compounds and antioxidant activities during mucilage cocoa juice
storage (tables not shown). At beginning storage (0h), antioxidant activity (FRAP)
was positively correlated to total phenols and total tannins (r=0.698 and r=0.688 re-
spectively). In contrast, a negative correlation has been observed between total flavo-
noids and antioxidant activity (DPPH) (r=-0.807). At 24 hours of storage, positive cor-
relation has been recorded between antioxidant activity (FRAP) and total phenols
and total flavonoids with r= 0.761 and r=0.610 respectively whereas antioxidant ac-
tivity (DPPH) and total tannins were positively correlated (r= 0.967). Antioxidant ac-
tivity (FRAP) was positively correlated with total flavonoids (r=0.678) and negatively
with total phenols (r=-0.867), whereas correlation between antioxidant activity
(DPPH) and total phenols was positive (r = 0.545) and negative with total flavonoids
(r = -0.867) at 48 hours of storage.
At the end of storage (72h), the reducing power of ferric iron to ferrous iron
(FRAP) was positively correlated with total flavonoids (r = 0.705) and total tannins (r
= 0.759). On the other hand, with free radical scavenging activity (DPPH), the analysis
showed a positive correlation with total phenols with r = 0.549 and a negative corre-
lation with total flavonoids where r = -0.732.
3.7. Cluster dendrogram of mucilage coco juices during storage at room temperature
Dendrogram presented in Figure 7 revealed that during storage, mucilage cocoa
juices sampled in 5 aeras where cocoa was cultivated, showed the similarities and
differences. This analysis has been carried out on basis physicochemical, biochemis-
try, phytochemical compounds and antioxidant activities parameters data. In this
paragraph correlation coefficients to axis not mentioned. Thus, at beginning of stor-
age (0h), mucilage cocoa juices have been regrouped in 3 class: Akoupé and Tiassalé
samples were similars; also, Yakasse-Attobrou and Buyo samples were similaries, but
Taabo sample was different from previous samples (Figure 7a). At 24 h of storage,
mucilage cocoa juice samples from Yakasse-Attobrou and Buyo were similars but
different from others samples, which represented each one a different group (Figure
7b). After 48 hours of storage, cluster dendrogram showed that Akoupé and Yakasse-
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 14 of 18

Attobrou samples consisted a same group which was different from others samples.
For others samples, each one was different from one another (Figure 7 c). At the end
of storage (72h), samples from Taabo and Yakassé-Attobrou were identical. The sam-
ples from Buyo, Tiassalé and Akoupé were different from each other (Figure 7d).

Cluster Dendrogram Cluster Dendrogram

7.5 7.5

5.0 5.0
Height

Height

2.5 2.5

0.0 0.0
Taabo

Akoupe
Buyo

Taabo

Akoupe

Buyo
Tiassalé

Tiassalé

Yakassé-Attobrou
Yakassé-Attobrou

(a) (b)

Cluster Dendrogram
Cluster Dendrogram
9

7.5

5.0
Height

Height

3
2.5

0.0 0
Taabo
Buyo

Akoupe

Taabo
Tiassalé

Buyo

Akoupe
Yakassé-Attobrou

Tiassalé
Yakassé-Attobrou

(c) (d)
Figure 7. Cluster dendrogram of mucilage coco juices during storage at room temperature.
(a) 0 h of storage; (b) 24 h of storage; (c) 48 h of storage; (d) 72 h of storage
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 15 of 18

4. Discussion
Mucilage cocoa juice, a cocoa by-product generated during the beans processing,
was derived from degradation of mucilaginous pulp coating beans by pectinolytic
action of yeasts present in environment [21]. Thus, often considered as a waste prod-
uct, mucilage cocoa juice could have interesting nutritional properties. A survey con-
ducted to determine level of knowledge of mucilage cocoa juice by population, its
maximum shelf-life and benefits attributed to it. The survey showed that mucilage
cocoa juice was very well-known by population, especially in rural areas, and was
consumed with great frequency. Also, its high frequency of consumption was linked
to properties attributed by consumers, in particular laxative, strengthening and anti-
diarrheal. The maximum shelf-life of mucilage cocoa juice at room temperature stor-
age was 3 days. In fact, people interviewed stated that juice was no longer pleasant
to drink after 3 days because of alcohol produced. This alcohol occurrence associated
with acidity of juice was due to spontaneous alcoholic fermentation triggered by
yeasts present on beans processing equipment and in environment [22]. Thus, nutri-
tional and functional analysis of mucilage cocoa juice during storage was carried out
during 3 days.
Assessment of physicochemical, biochemical and functional parameters of mu-
cilage cocoa juice showed in general an irregular evolution of these parameters. The
moisture content values in this study were higher than those reported by Anvoh [6]
and Werner et al. [7]. On the other hand, lipid, protein and ascorbic acid contents
were higher in the samples of these authors than in this study but organic acids con-
tents in this work were higher than values reported by Schwan; Ardhana and Fleet,
[23-24] which were for citric acid, 2.1–2.4% (w/w), lactic acid, 0.03% (w/w) and acetic
acid, 0.04% (w/w).
Moreover, vitamins such as ascorbic acid and cobalamin in juices of this study
could give it strengthening property that consumers attribute to it.
Also, virtues of mucilage cocoa juice could be related to presence of phenolic
compounds contents in the beans and the mucilage. Indeed, according to Lee et al
[25], cocoa was very rich in polyphenols. Moreover, Bloch [26] pointed out that Ivo-
rian cocoa was the third richest in phenolic compounds. Furthermore, Hanhineva,
[27] reported that polyphenols were responsible of several properties.
Able to lower blood pressure in rats, prevent LDL (low density lipoprotein) ox-
idation, inhibit vascular smooth muscle cell proliferation, prevent platelet aggrega-
tion and stabilize immune cells.
They have been described as antioxidants, anti-platelet aggregation, anti-inflam-
matory, anti-allergenic, anti-thrombotic, neuroprotective, anti-viral, chemo-preven-
tive and more evidence indicate that polyphenols influence lipid and carbohydrate
metabolism [27].
Furthermore, fluctuations observed in phenolic compounds content and antiox-
idant activity, both assessed by DPPH and FRAP methods, could be due to cocoa
variety, cultivation techniques or space. Niemenak et al. [28] claimed that polyphenol
contents of cocoa during fermentation could increase by 25% for some varieties or
decrease by 11-25% for other varieties. In this study, mucilage juices were obtained
from several different varieties, hence the term "all types" in cocoa culture jargon.
Also, these variations in phenolic compound levels and corresponding antioxidant
activities could also be due to the cultivation techniques used, which vary from one
region to another, and to environmental factors such as rainfall and temperature. In-
deed, juices of this investigation were sampled from a part of the area called “the
cocoa loop” which extends from the West to the East of Côte d'Ivoire through the
Central region. In addition, the general analysis of mucilage cocoa juices from 5
Tano Marie-Ange Sakia Mian et al. 16 of 18

sample areas during storage showed that juices could present both similar and dif-
ferent characteristics during storage.
Dietary fiber as a compound contributing to digestion and production of soft
stools would be responsible for the laxative character mentioned by consumers.
However, analyses revealed only trace amounts of fiber, so laxative properties could
be due to other compounds such as polyphenols. The latter have been reported as
digestion-enhancing compounds [29-30]. Therefore, laxative property of mucilage co-
coa juice would be more due to phenolic compounds than to dietary fiber. This same
observation has been done par Coulibaly et al. [31] where phenolic compounds con-
tents were most important in traditional sorghum beer than dietary fiber contents.
Also, irregular contents of physicochemical, nutritional and functional parame-
ters would be largely related to microorganisms’ activities, particularly fermentation,
naturally present in juice. Koffi et al. [22] reported involvement of yeasts and moulds,
acetic and lactic bacteria, Bacillus in the fermentation process of cocoa beans in Côte
d'Ivoire. Thus, fluctuations observed in organic acids and phenolic compounds could
be due to these microorganisms. Yeasts produce alcohol by transforming the sugars
present in juice, such as acetic bacteria and lactic bacteria, which mainly produce ace-
tic acid and lactic acid respectively. Furthermore, Macheix et al. [32] reported that
yeasts were able to use phenolic compounds for their growth.

5. Conclusion
The survey on current state of knowledge of mucilage cocoa juice revealed that
this juice was largely known by people. For these latter, maximal time of storage at
room temperature was 72 hours and he possessed laxative, strengthening and anti-
diarrheal.
Physicochemical, biochemical and functional properties investigation of muci-
lage cocoa juice during storage at room temperature showed that irrespective of juice,
variation of all parameters were irregulars. During storage at room temperature,
juices exhibited differences and similarities. Also, juices have phenolic compounds
contents and antioxidant activities important. For further investigation, storage pa-
rameters will be study for allow her consumption during long time.

Author Contributions: his work was carried out in collaboration between all authors. Authors
FC and GAMB were responsible for study design and supervision of work. Authors WHC, and
TMASM were responsible for laboratory work, data analysis and manuscript preparation. All
authors read and approved the final manuscript
Funding: This research did not receive any specific grant from funding agencies in the public,
commercial, or not-for-profit sectors.
Data Availability Statement: Data is not publicly available, only available by requesting email
to corresponding author.
Acknowledgments: Participants of survey for their valuable time and support.
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.

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(Citrus sinensis) juices by pectinase from Yarrowia lipolytica strains
identified from cocoa juice in fermentation. Journal of Biochemistry
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Journal of Biochemistry International
9(4): 82-93, 2022
ISSN: 2454-4760

CLARIFICATION TREATMENTS OF PINEAPPLE

(Ananas comosus) AND ORANGE (Citrus sinensis) JUICES BY
PECTINASE FROM Yarrowia lipolytica STRAINS IDENTIFIED
FROM COCOA JUICE IN FERMENTATION

FATOUMATA CAMARA a*, TANO MARIE-ANGE SAKIA MIAN a,b*,

WAHAUWOUELE HERMANN COULIBALY c, ALANE ROMARIC N’GUESSAN c
AND GRAH AVIT MAXWELL BEUGRÉ b
a
Laboratoire de Nutrition et Sécurité Alimentaire, Unité de Formation et de Recherche en Sciences et
Technologie des Aliments (UFR-STA), Université Nangui Abrogoua, 02 BP 801 Abidjan 02, Côte d’Ivoire.
b
Laboratoire d’Agro-Valorisation, Unité de Formation et de Recherche d’Agroforesterie, l’Université Jean
Lorougnon Guédé, Daloa, BP-150, Côte d’Ivoire.
c
Laboratoire de Biotechnologie et Microbiologie des Aliments, Unité de Formation et de Recherche en Sciences
et Technologie des Aliments (UFR-STA), Université Nangui Abrogoua, 02 BP 801 Abidjan 02, Côte d’Ivoire.

AUTHORS’ CONTRIBUTIONS
This work was carried out in collaboration among all authors. All authors read and approved the final
manuscript.

Article Information

DOI: 10.56557/JOBI/2022/v9i47917

Received: 20 August 2022

Accepted: 28 October 2022
Published: 01 November 2022 Original Research Article

ABSTRACT

Background: Pectinases are a group of enzymes that break down pectin, a polysaccharide that is found in plant
cell walls. Today, the application of pectinolytic enzymes plays an important role in food technology for the
maceration of fruits and vegetables, including for the extraction and clarification of juice.
Aim of the Study: This study aimed to test the clarifying ability of pectinase of three Yarrowia lipolytica strains
(Tias J0-6; YA J3-1; Buy J2-1) identified for cocoa juice in fermentation.
Materials and Methods: The pectinase from Yarrowia lipolytica strains (Tias J0-6; YA J3-1; Buy J2-1) were
produced using a basic liquid medium and partially purified through ion exchange chromatography. The fruit
juices were clarified by enzymatic treatments against a control (free enzymatic treatment juice) and
physicochemical and phytochemical parameters and antioxidant activities of the clarified juices were determined.
Results: The results revealed that from three strains, Tias J0-6 strain produced pectinase which showed the best
clarification activity on pineapple and orange juices. The juices clarified exhibited an increasing of clarity values
and decreasing viscosity and pH values. Thus, pectinase of Tias J0-6 allowed increasing clarity to 41.81% and
7.27%, to decrease viscosity up to 14.03% and 6.55% respectively for pineapple juices and orange juices clarified.
The pH values decreased from 4.036±00 to 4.031±00 and from 5.010±00 to 4.592±00

*Corresponding author: Email: [email protected], [email protected];

 Camara et al.; JOBI, 9(4): 82-93, 2022

respectively for orange and pineapple juices. The antioxidant activities of juices clarified were strongly
correlated to total tannins and total flavonoids (r = 0.717, r = 0.754, r = 0.855).
Conclusion: Tias J0-6 strain seemed a suitable candidate to biotechnology applications such as fruit juices
clarification.

Keywords: Pectinase; Yarrowia lipolytica; pineapple juice; orange juice; clarification; functional food.

1. INTRODUCTION viscosity reduction and cluster formation, which

facilitates separation through centrifugation or
“Pectinases constitute a unique group of enzymes filtration. As a result, the juice presents higher clarity,
which catalyze the degradation of pectic polymers as well as more concentrated flavour, color, highed
present in the middle lamella and primary cell walls of yield and quality” [24-27].
plants” [1]. “As an important renewable resource,
pectin has great potential applications in the The current research aims to evaluate pectinase activity
biomedical, food, agricultural, textile industry, plant from Yarrowia lypolitica strains from fermented cocoa
tissue maceration, fruit juice clarification, waste water juice and to investigate its ability for pineapple and
treatments and other industries” [2]. “The degradation orange juice clarity as well as to determine phenolic
of pectin is mainly facilitated by pectinases group of compounds and antioxidant activities.
enzymes, including pectin methyl esterases (PME,
E.C.3.1.1.11), pectin lyases (PL, E.C. 4.2.2.10), 2. MATERIALS AND METHODS
exopolygalacturonase (exo-PG, E.C. 3.2.1.67), and
endopolygalacturonase (endo-PG, E.C. 3.2.2.15)” [3]. 2.1 Microorganisms for the Production of the
“Various microbes have been reported to produce Enzymatic Extracts
pectinase, such as filamentous fungi including
Aspergillus sp.” [4], Aspergillus niger MTCC 478 [5], “Three Yarrowia lipolytica strains (Tias J0-6; YA J3-
Aspergillus fumigatus [6], bacteria including Bacillus 1 and Buy J2-1) belonged to the culture collection of
sp. [7,8], Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilus the Food Technology Department (University Nangui
[9] and yeast including Saccharomyces cerevisiae and Abrogoua, Abidjan, Côte d’Ivoire). They were isolated
Candida tropicalis [10], Aureobasidium pullulans and identified from the cocoa juice in fermentation by
[11], Saccharomyces cerevisiae (ATCC 52712) [12], Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment
Saccharomyces cerevisiae [13]. “In general, both Length polymorphism (PCR- RFLP) of the Internal
submerged state fermentation (SmF) and solid-state Transcribed Spacer (ITS) region and sequencing of
fermentation (SSF) have been successfully used in D1/D2 domains of the 16S rRNA gene” [28]. Partial
pectinases production from different microbial strains” 16S rRNA sequences of the strains were deposited in
[14-17]. the NCBI database with accession numbers of
ON202632, ON202635, ON202630 for strains Tias J0-
“It is estimated that, nearly 20-40% of fruits produced 6; YA J3-1 and Buy J2- 1 respectively. They were used
in developing countries are lost due to spoilage, for the production of enzymatic extracts by using a
mishandling during transportation and inadequate cold basic liquid medium was used for the production of
storage facilities and processing techniques, hence the pectinase with composition (g/L) as follow; 3 g
need for conversion into juice concentrate” [18]. “Fruit (NH4)2SO4 (Scharlau, Spain), 4.5 g KH2PO4 (Scharlau,
juices are naturally cloudy, yet in different degrees, Spain), 1 g yeast extract (Laboratoire Humeau,
especially due to presence of polysaccharides (pectin, France), 0.25 g MgSO4•7H2O (Merck, Germany), 0.25
cellulose, hemicelluloses, lignin and starch), proteins, g CaCl2•2H2O (Merck, Germany), 10 g pectin citrus
tannins and metals” [19]. “As the juice clear (Sigma Aldrich, Germany) and 10 g agar (Oxford,
appearance is a determinant factor for consumers, the UK). All these ingredients were dissolved in sterile
fruit juice industry has been investing in methods that distilled water and adjusted to pH 5.5, and 6
optimize this feature” [20]. “The high concentration of respectively for YA J3- 1, Tias J0-6 and Buy J2-1 and
pectin leads to colloid formation, which constitutes one media were sterilized in autoclave at 121 °C under
of the main problems during the processing of clear pressure of 1 atmosphere for 17 min.
fruit juices. However, although the suspended pulp
particles can be removed through filtration, the 2.2 Experimental Conditions
presence of pectin may make this method difficult”
[21]. “The depectinisation of fruit juices through the “Erlenmeyer flasks (500 mL) with 100 mL of pectin
use of pectinases has been presented as an efficient liquid medium were used to obtain the enzymatic
alternative to reduce turbidity, in many studies” [8-19-
22,23]. “Pectinases degrade pectin hence resulting in

83
 Camara et al.; JOBI, 9(4): 82-93, 2022

extracts by culture process. Three flasks were cut in pieces. Sweet orange and pineapple juice were
inoculated with a suspension of YA J3-1, Tias J0-6 and extracted manually using a fruits squeezer. Pineapple
Buy J2-1 respectively. Each flask was inoculated with juice and orange juice were then filtered using a filter
each strain suspension diluted to reach an OD600 nm of cloth to separate the pulp. The pineapple juice and
0.3. The flasks were incubated at 40; 30 and 30 orange juice were then transferred into a bottle and
°C respectively for Tias J0-6, YA J3-1 and Buy J2-1 incubated in water bath at 85 °C for 5 min [30]. The
strains for 12 h. These conditions corresponding to pineapple (100 mL) and orange juice (100 mL) were
optimal production conditions of pectinase of these stored in the bottle and different enzymatic treatments
strains described” by Mian et al. (2021) [28]. The were given. Juice without treatment is kept as control.
biomass was separated by centrifugation at 8.000 rpm 100 mL of each juice were added with partially purified
for 10 min at 4 °C. The supernatant constitutes the pectinase of each strain (200 µL). Pectinase- treated
enzymatic extract crude. The crude extract enzyme pineapple and orange juices were then incubated in
preparation was used firstly to evaluate pectinase water bath at 40, 30 and 30 °C for 2 h respectively for
activity and then to perform the partial purification. Tias J0-6, YA J3-1 and Buy J2-1 strains. To inactivate
enzymatic reaction, the bottles were heated at 90 °C for
2.3 Partially Purified Pectinase Production 5 min.
Ion by Ion Exchange Chromatography
The pH measurements were performed using a pH-
Anion exchanger, DEAE-Sepharose, was packed into a meter (Hanna Instruments; HI 8010) after calibration
glass column (2.6 *6 cm). The column was equilibrated with KCl buffer. Titratable acidity was determined
with sodium acetate buffer (0.05M, pH 5.5) and a 3.0 through titration with 0.l N NaOH. The titratable
mL sample was loaded on to it. The column was acidity was expressed as % meq of lactic acid. Density
washed with sodium acetate buffer containing 400 mM of each juice was determined by using of densimeter
NaCl concentration. Fractions of 3 mL volume were (Mettler Toledo). The clarity, color and browning of
collected. The fractions showing pectinase activity the juices obtained were determined by measuring the
were pooled, concentrated and used to evaluate the absorbance at a wavelength of 660 nm,
pectinase enzyme activity. 440 nm and 420 nm using spectrophotometer
(Rayleigh; USA) and distilled water was used as the
2.4 Enzyme Assay reference. The viscosity was measured by a viscometer
(Techno Fischer) and distilled water was used a
The pectinase activity was measured according to reference. Time required to flow through the capillary
Miller [29]. The assay mixture contained 100 µL of section of the viscometer was noted using a stop watch
extract, 100 µL of 1% pectin prepared in sodium for the reference. All the experiments were carried out
acetate buffer (0.05 M; pH 5). After incubation at 40 in triplicate.
°C for 30 min, the reaction was stopped by addition of
400 µL of dinitrosalicylic acid (DNSA) (Sigma 2.6 Phytochemical Analysis of Fruits Juices
Aldrich, Steinheim, Germany). The mixture was kept
in boiling water bath for 10 minutes until the yellow 2.6.1 Total phenols
colour developed. Then the tubes were cooled and
4.4 mL of distilled water was added to the mixture. “Total phenols contents were estimated according to
Absorbance change (OD) was measured the Folin-Ciocalteu colorimetric method” [31]. To 50
spectrophotometrically at 540 nm. The amount of µL aliquote of juice after centrifugation were added
reducing sugar released was quantified using 250 µL of diluted Folin-Ciocalteu-reagent (10% v/v).
galacturonic acid as standard. The pectinase activity After 1 min, 750 µL of 20% (w/v) aqueous Na2CO3
was expressed as international Unit (U) per ml of were added, and the volume was adjusted to 5.0 mL
reaction medium. One unit of enzyme activity (μmol) with H2O. The controls contained all the reaction
was defined as the amount of enzyme required to reagents except the sample. After 2 h of incubation at
release 1 μmol of galacturonic acid under the assay 25 °C, the absorbance was measured at 760 nm and
conditions. The results were expressed as mean ± compared to both a gallic acid calibration curve and to
standard error of mean. controls. Total phenols were determined as gallic acid
equivalents per mL (µg GAE/mL), and the values are
2.5 Clarification of Pineapple and Orange presented as means of triplicate analyses.
Juices using Pectinase 2.6.2 Total tannins
Two kilograms of each fruit (pineapple and orange) “The quantitation of easily extractable tannins was
were washed thoroughly with running water, dried, carried out using the Bate-Smith reaction, during

84
 Camara et al.; JOBI, 9(4): 82-93, 2022

which uncolored proanthocyanidines are converted 2.7 Antioxidant Activities

into colored anthocyanins (quantitated based on their
absorbance at 550 nm) through heating at 100 °C in 2.7.1 Antiradical activity: DPPH (2,2-diphenyl-1-
acidic medium” [32]. In two test tubes, 2 mL of aliquot, picryl-hydrazyl) assay
1 mL of distilled water and 3 mL of 12 N hydrochloric
acid were added. One of the two tubes, hermetically “Among commonly used methods for the investigation
closed, was placed in water bath at 100 of the antioxidant capacity of natural products, the
°C for 30 minutes, and then was cooled for 10 min in DPPH assay was selected for its ease of use and
ice. Finally, 0.5 mL of ethanol was added to both tubes. accuracy” [35]. The antioxidant activity of juice
The concentration of tannins, which is proportional to samples was assessed Brand-Williams et al. [36], “by
the concentration of anthocyanins, was calculated in evaluating their respective free radicals scavenging
g/L using the following equation (1): abilities in the presence of an alcoholic solution of
DPPH, yielding the free radical form DPPH°. The
Tannins = 19.33xΔ OD (1) samples were reacted with the stable DPPH radical in
a methanol solution. The reaction mixture consisted of
Where ΔOD is the variation in optical density between adding 2 mL of sample, 2 mL of DPPH radical solution
the two tubes. 100 mM in methanol. When DPPH reacts with an
antioxidant compound, which can donate hydrogen, it
2.6.3 Total flavonoid contents is reduced. The changes in color (from deep violet
to light yellow) were read [Absorbance (Abs)] at 517
Total flavonoid contents were determined as reported nm after
by Meda et al. [33] using the AlCl3 colorimetric 30 min of reaction using a UV spectrophotometer
method. Briefly, 0.5 mL of aliquot was mixed with the (Rayleigh; USA). The rate of scavenging activity
same volumes of distilled water, aluminum trichloride (AA%) was calculated as follows using equation” (3):
(AlCl3) 10% (w/v) (Labosi, Paris, France), sodium
acetate (1M) and 2 mL of water. After 30 min of (%) AA= [(X - Y)/X] x 100. (3)
incubation at room temperature, absorbance at 415 nm
was assessed (UV spectrophotometer Rayleigh; USA). Where X is the absorbance at 517 nm of oxidized
Total flavonoid contents were estimated from means of DPPH in pure form and Y is the absorbance of the
three replicates against a 0–300 µg/mL quercetin sample after 30 min incubation with DPPH
calibration curve (Sigma–Aldrich Chemie, Steinheim,
Germany) and expressed as µg of quercetin 2.7.2 Ferric reducing-antioxidant power FRAP
equivalents (QE)/mL. (potassium ferricyanide-ferric chloride)
assay
2.6.4 Total anthocyanins
“The ferric ion (Fe3+) -reducing capacity of juice
Anthocyanins (At) are found in two forms: free samples was investigated by using the potassium
anthocyanins (Af), which are susceptible to ferricyanide-ferric chloride method” [37]. Briefly,
discoloration by SO2, and anthocyanins combined with 0.5 mL of each sample, 0.5 mL of phosphate buffer (0.2
tannins (Ac), which are not [34]. Initially, a solution M, pH 6.6), and 0.5 mL of potassium ferricyanide
was prepared by adding: 1 mL of aliquot, 1 mL of K3Fe(CN)6 (1%) were mixed and incubated at 50 °C
ethanol (95%) acidified with 0.1% hydrochloric acid for 20 min. The reaction was stopped by adding 0.5
(HCl) and 20 mL to 2% hydrochloric acid (35%). In a mL trichloroacetic acid (10% (w/v)). Finally, 0.5 mL
first test tube, 5 mL of the above solution was added to of previous mixture was mixed with 0.8 mL of distilled
2 mL of distilled water. In a second test tube, 5 mL of water and 0.1 mL of FeCl3 (0.1%) and absorbance
the above solution was added to 2 mL of sodium was measured at 700 nm. The reducing power of each
bisulfite (15%). After incubation for 20 min at room sample was expressed as μg of ascorbic acid
temperature, the absorbance at 520 nm was measured equivalents (AAE) per mL.
for an optical path of 10 mm. The concentration was
calculated in mg/L by the following relation equation 2.8 Statistical Analysis
(2):
The statistical tests were performed through variance
Anthocyanins = 875xΔOD (2) analysis (ANOVA) and Tukey’s test, with probability
level below 5% (P < 0.05) using software XLStat
Where ΔOD is the variation of optical density between version 2016.
the first tube and the second tube

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 Camara et al.; JOBI, 9(4): 82-93, 2022

3. RESULTS AND DISCUSSION strain. In addition, the significant difference was

observed between pectinase treatments (P<0.05).
3.1 Enzymatic Activity Assays of Extract
Crude and Extract Purified The same observation was obtained with pineapple
juice. The pH of pineapple juices treated decreased
The enzymatic activities from extracts crude and (4.584±00; 4.495±00; 4.592±00) than pineapple juice
extracts purified of strains were showed in Fig. 1. For un-treated (5.01±00). The lowest pH value of juices
all strains, enzyme activity after purification procedure treated was obtained with YA J3-1 strain. The analysis
showed the highest value. The pectinolytic activities pineapple juice with Tias J0-6; YA J3-1 and Buy J2-1
from extracts crude were 0.138±0.007; 0.177± 0.001 pectinase treatment have significantly different to the
and 0.235±0.01 U/mL while those from control (P<0.05). The addition of pectinase in
extracts partially purified were 0.183± 0.001; pineapple juice and orange juice decreased the pH
0.209±0.003 and 0.392±0.005 U/mL respectively for value. According to Acar et al. [30] treated “juices
YA J3-1, Tias J0-6 and BuyJ2-1 strains. This became more acidic, indicating that the enzyme able to
observation had been reported by Utami et al. [38] hydrolyze the pectin polymer in solution into its
where the amylase activity of yeast strain was highest monomer form named galacturonic acid. The pectinase
after ammonium sulfate precipitation and dialysis of Buy J2-1 and YA J3-1 strains resulted the lowest pH
steps. Whatether the strains and extracts, the highest values of 3.962±00 and 4.495±00 respectively in
pectinase activity was obtained with BuyJ2-1 strain and orange juice and pineapple juice”. According to Acar
the lowest activity with YA J3-1. More the statistical et al. [30], “the decrease in pH was due to the
analysis showed the significant difference between increasing amount of galacturonic acid content which
strains (P<0.05). was the result of pectin hydrolysis by pectinase which
was causing pineapple juice and orange juice more
3.2 Application of Purified Pectinase in Fruit acidic. In both cases, the pH decreasing was correlated
Juices Clarification with increasing acidity. Several pectinases in
particulary polygalacturonases from Aspergillus
“In general, microbial pectinases are important group carbonarius and Achaetomium sp. Xz8 have been
of enzymes with potential applications in various reported to have the capacities to improve the juice
industries like wine industry, paper industry, textile yield and clarity” [43] and reduce the viscosity of
industry and food industry” [39]. “Use microbial papaya juice [44]. “Polygalacturonase produced by A.
pectinases presented several advantages mainly low- niger using banana peel as a substrate has been used for
cost production, enzyme content is more predictable clarification of banana juice” [45]. “Use of
and controllable, availability of raw materials for polygalacturonases from Neosartorya fisheri in
production, and high production without ethical clarification of apple and strawberry juice have also
approval, rate filtration reduced, provide a wide range been reported” [46].
of products to consumers” [19].
The viscosity of pectinase-treated orange juice samples
Application of purified pectinase in clarification ranged from 0.147±0.001 to 0.169±0.001 cP
of fruit juices was studied on pineapple juice respectively for Tias J0-6, YA J3-1 and Buy J2-1
(pH 5.01±0.014) and orange juice (pH 4.036±0.001) strains which lower than control sample (0.171±0.002
produced at laboratory. Thus, the pineapple juice cP). The lowest viscosity was observed with Tias J0-6
and orange juice clarification trials from our (0.147±0.001 cP). There was a significant difference
enzymatic extracts partially purified allowed to between viscosity values from samples, then between
assess most relevant indicators of clarified juices samples and control. For pineapple juice, the viscosity
mainly clarity, viscosity and pH [8-38-40-42]. of juices treated decreased than control, pineapple juice
un-treated. The viscosity values of treated pineapple
As it can be seen in Tables 1 and 2, the difference result juices were 0.295±00, 0.297±00 and 0.285±0.01 cP
of pH, viscosity, and clarity between pineapple juice respectively for Tias J0-6, YA J3-1 and Buy J2-1
and orange juice without enzyme additions and strains against 0.305±0.007 cP for the control. There is
pineapple juice and orange juice with enzymes none significant difference between juice samples
treatment was observed. Whatether the juice and pectinase treatment and control although the samples
pectinase of strains, the values pH of clarified juices viscosity was lowest than control. Based on these
decreased than those of control. These values were results, among the Yarrowia lipolytica strains tested,
ranged between 3.962±00 and 4.031±00 for juices Tias J0-6 and YA J3-1 were able to decrease the
treated against 4.036±00 for orange juice control. The viscosity by 14.03% and 6.55% for orange juice and
pH decreased was most important with Buy J2-1 pineapple juice respectively. The pectinase efficacy
could depend of juice nature and

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microorganisms. Indeed, Meryandini et al. [8] reported respect to controls. Several studies reported
that “pectinase of Bacillus sp decrease the viscosity of involvement pectinase microbial in increasing of fruit
apple juice by 6.99% which is higher amounts of juices clarity. Pectinase of Bacillus sp can increase
enzyme may be effectively reduce the viscosity of the clarity of apple juice by 42.6% [8]. Also, Alvarez et al.
juice”. Dey et al. [47] reported that “the results of apple [49] reported that “during the incubation in apple juice
juice clarification using purification polygalacturonase treatment, the pectinase (In this experiment used
from Aspergillus awamori Nakazawa MTCC 6652 was Pectinex 3XL, activity 3000 FDU1/mL) break down the
able to decrease viscosity to 38%”. Arsad et al. [48] pectin polymer in solution which ultimately increased
reported that “the viscosity value of juice can decrease the formation of pectin and protein into clots, resulting
significantly by combining pectinase and other enzyme in a clearer fruit juice supernatant. The potential of
types, such as cellulose”. pectinase produced by bacterial was found in
clarifying the others juice fruit such as lemon” [50] and
The clarity values of pineapple juice and orange juice mango [51]. In addition, pectinase of Aspergillus niger
treated by pectinase enzyme from our isolates were MTCC 478 increased by 27% orange juice clarity with
given in Table 2. For all juices treated, the clarity was respect to control [5]. “Transmittance of the treated
characterized an increasing of clarity values than juice increased because of removal of colloidal and
control (juices untreated). The clarity values of orange suspended particles in the juice especially pectin.
juices treated were ranged between 28.4±00 and Colloid formation due to the presence of pectin is a
29.2±00% which lower than control (27.5%). The major challenge in fruit juice industry, which decreases
highest value was obtained with Tias J0-6 strain the commercial value of juices. Pectin present in fruit
(29.2±00%). In pineapple juices treated, the clarity juices is degraded by pectinases resulting in viscosity
values were comprised between 3.55±0.07 and reduction and cluster formation. As a result, the juice
3.90±0.14 %. These values were highest than control becomes clear and more concentrated in flavor and
(2.75±00%). Such as orange juice, the highest clarity color” [26-27]. “Clarification of fruit juice can be
value was observed with Tias J0-6 strain attributed to biochemical nature of the enzyme. The
(3.90±0.14%). For both juices, pectinase treatments application of pectinase in improving the quality of
have significantly different to the control although fruit juices is still relatively low compared to the
there was no significant change in others treatments. commercial enzyme Novozym 33095” [52] which can
The increasing of clarity values of juices treated increase clarity up to 80% and reduce viscosity up to
indicated pectinase of our isolates addition in orange 40%. On the hand other, the clarification of fruit juice
and pineapple juices showed clarification ability. Tias in this study was corroborated by decreasing of color,
J0-6 strain increased clarity of orange juice and browning and density of samples juices than controls
pineapple juice by 7.27 and 41.81% respectively with (Tables 1 and 2).

Fig. 1. Pectinase activities of strains

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Table 1. Physicochemical characteristics of orange juices clarified

Clarity (%) Color (%) Browning (%) pH Acidity (%) Viscosity (cP) Density
Control 27.5±00a 11.9±00a 9.9±00a 4.036±00a 1.030±0.014a 0.171±0.002a 1.008±0a
Pectinase (Tias J0-6) 29.2±00b 11.65±0.07a 3.25±0.07b 4.031±00a 1.076±0.019a 0.147±0.001b 1.006±0a
Pectinase (YA J3-1) 28.4±00b 11.55±0.21a 8.95±0.07c 4.018±00b 1.071±0.012a 0.155±0.002c 0.962±0a
Pectinase (Buy J2-1) 28.8±00b 11.25±0.35a 6.7±0.14d 3.962±00c 1.080±00a 0.169±0.001a 0.997±0a
Values are means ± standard deviation, n = 3. Means in the same column with different letters are significantly different according to Tukey’s test (P < 0.05)

Table 2. Physicochemical characteristics of pineapple juices clarified

Clarity (%) Color (%) Browning (%) pH Acidity (%) Viscosity (cP) Density
Control 2.75±00a 0.8±00a 0.6±00a 5.010±00a 0.250±0,02b 0.305±0.007a 1.008±00a
Pectinase (Tias J0-6) 3.90±0.14b 0.6±00b 0.5±00b 4.592±00b 0.390±00a 0.295±00a 1.006±00a
Pectinase (YA J3-1) 3.65±0.07b 0.5±00b 0.4±00b 4.495±00c 0.455±0.007a 0.297±00a 1.005±00a
Pectinase (Buy J2-1) 3.55±0.07b 0.5±00b 0.4±00b 4.584±00b 0.355±0.04ab 0.285±0.01a 1.005±00a
Values are means ± standard deviation, n = 3. Means in the same column with different letters are significantly different according to Tukey’s test (P < 0.05)

Table 3. Phytochemical composition of fruits juices clarified

Orange juices Pineapple juices

Total phenols Total flavonoids Total tannins Total phenols Total flavonoids Total tannins
(µg/mL EGA) (µg/mL EQ) (g/L) (µg/mL EGA) (µg/mL EQ) (g/L)
Control 267.38±5.98a 58.36±0.41b 110.85±0.68a 407.67±7.61a 130.19±3.53a 23.46±0.05a
Pectinase (Tias J0-6) 297.96±8.42a 59.23±0.53b 172.71±1.49b 381.22±13.59a 124.90±5.3a 31.93±0.04b
Pectinase (YA J3-1) 316.23±55.47a 66.49±0.33a 171.45±0.27b 398.84±4.78a 127.3±1.08a 34.39±0.007c
Pectinase (Buy J2-1) 283.92±17.4a 65.95±0.03a 170.19±0.13b 391.61±34.81a 126.82±2.85a 53.26±0.02d
Values are means ± standard deviation, n = 3. Means in the same column with different letters are significantly different according to Tukey’s test (P < 0.05)

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Table 4. Antioxidant activities of fruit juices clarified

DPPH (% Antiradical Activity) FRAP (µg/mL Ascorbic Acid)

Control 35.31±0.24a 186.45±2.4a
Pectinase (Tias J0-6) 42.39 ±0.82b 113.345±0.06b
Orange juices Pectinase (YA J3-1) 31.4±0.12c 211.16±7c
Pectinase (Buy J2-1) 32.82±1.01ac 140.04±3.64d
Control 50.96±0.5a 224.02±11.74a
Pectinase (Tias J0-6) 55.31±1.28b 192.42±3.98b
Pineapple juices Pectinase (YA J3-1) 51.77±0.35a 189.07 ±1.85b
Pectinase (Buy J2-1) 60.43±0.54d 166.6±0.96c
Values are means ± standard deviation, n = 3. Means in the same column with different letters are significantly different according to Tukey’s test (P < 0.05)

Table 5. Correlation between phytochemical composition of fruit juices clarified and antioxidant activities

Total Phenols Total Tannins Total Flavonoids

DPPH -0.071 0.717* -0.995*
Orange juices FRAP 0.430 -0.216 0.754*
Pineapple juices DPPH -0.131 0.855* -0.169
FRAP -0.118 -0.987* -0.282
* The correlation is significant at the 0.05 level

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 Camara et al.; JOBI, 9(4): 82-93, 2022

tannins. This could confirm the high content of total

3.3 Phenolic Compounds and Antioxidant
tannins found in our samples. Also, the pectinase
Activities of Fruit Juices Clarified improved to polyphenols extraction. Indeed Wojdyło et
al. [57] showed that polyphenols content from marc
Among the phenolic compounds assayed in fruit juices
treated with pectinase was higher than control (pomace
clarified in this study, the total tannins were found in
untreated).
highest amount than others. In orange juices, an
increasing of total tannins was observed compared to On the hand other, correlation matrix with coefficients
the control. The total phenols contents were ranged presented in Table 5, was created to explore the
between 170.19±0.13 and 172.71±1.49 g/L which possible relationships between phenolic compounds
highest than control 110.85±0.68 g/L. In addition, there and antioxidant activities. The higher and positives
had significantly difference between samples juices correlations coefficients were found between total
and control. Such as orange juices, the total tannins tannins and antiradical activity (r = 0.717, P < 0.05) and
were polyphenols which found in greatest content in between total flavonoids and antioxidant activity
pineapple juices clarified. Their amounts increased in assessed by FRAP method (r = 0.754, P < 0.05)
samples juices than control. The total tannin contents regarding orange juices clarified. However, negative
were comprised between 31.93±0.04 and 53.26±0.02 correlation coefficient (r = -0.995, P < 0.05) was found
g/L while control sample showed between total flavonoids and antiradical activity. In
23.46±0.05 g/L (Table 3). The most total tannins pineapple juices clarified, the antioxidant activities
concentration had been obtained in pineapple juice (antiradical activity and ferric reducing power) were
clarified by pectinase of Buy J2-1 strain. “More, strongly correlated only to total tannins. Positive
statistical analysis showed a significant difference correlation coefficient was observed between total
between pineapple juices treated and control. In Table tannins and antiradical activity (r = 0.855, P < 0.05)
3, it was informed that orange juices and pineapple while a negative correlation coefficient had been
juices had the highest level of polyphenols in general. obtained between total tannins and ferric reducing
Polyphenol content in fruit juices clarified is an power (r = -0.987, P < 0.05).
important variable to be controlled due to the anti-
oxidant activity of these substances” [53], “which are 4. CONCLUSION
associated to the prevention of certain pathologies as
coronarian diseases and cancer” [54]. “On the other The use of pectinase of three Yarrowia lipolytica
hand, polyphenols can form complexes with proteins strains Tias J0-6, YA J3-1 and Buy J2-1 from
that could result in the formation of haze [55] and fermented cocoa juice in fruit juices clarification
present limited possibility of separation by showed the ability of these isolates to clarify these
centrifugation” [56]. Antioxidant activities of fruit juices. Among the three strains, Tias J0-6 exhibited
juices clarified were assessed from two methods: most important ability in fruit juices clarification.
DPPH and FRAP. The method DPPH showed that Pectinase of Tias J0-6 allowed increasing clarity to
antiradical activity (DPPH) rates were highest in 7.27 and 41.81%, to decrease viscosity up to 14.03%
orange juice and pineapple juice clarified by pectinase and 6.55% respectively for pineapple juices and orange
of Tias (J0-6) 42.39 ±0.82% and pectinase of Buy (J2- juices clarified. Additionally, the juices clarified
1) 60.43±0.54% than controls (35.31±0.24% and showed antioxidant properties important mostly
60.43±0.54%) respectively (Table 4). More, there had because to total tannins and total flavonoids. All of
significantly difference between samples juices and these properties make the pectinase of Tias J0-6 strain
controls. For the FRAP method, the antioxidant activity a suitable candidate in application potential in the
was most important in orange juice clarified by beverage industry. Other investigations will can to be
pectinase of YA J3-1 with 211.16±7 µg/mL ascorbic performed on others fruit juices to tested the efficacy
acid while in pineapple juice clarified, the highest value of pectinase of Tias J0-6. Also, the nutritional value and
(192.42±3.98 µg/mL ascorbic acid) was obtained in shelf life of the purified of fruit juices will can be
juice clarified by pectinase of Tias (J0-6) although this determined.
value was less than control value (224.02±11.74 µg/mL
ascorbic acid) (Table 4). In addition, the statistical COMPETING INTERESTS
analysis showed a significantly difference between
samples and controls. Thus, the pectinase could be Authors have declared that no competing interests
influenced the phenolic compounds content of fruit exist.
juices clarified in particularly the tannins and therefore
their antioxidant activities. Indeed, pectinase activities
REFERENCES
could weaken the pulp cells, thus releasing an
1. Fogarty MV. and Kelly CT. In Microbial
inaccessible juice but mainly constituents related to the
Enzymes and Biotechnology. ed. Fogarty,
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 RESUME

Le processus de traitement des fèves de cacao génère plusieurs déchets tels que les cabosses et le jus de mucilage de cacao. Ce
jus provient de la dégradation de la pectine enrobant les fèves par les levures dotées d’activités pectinolytiques. Aussi, au bout
de quelques jours le jus de mucilage de cacao devient difficilement consommable quand bien même qu’il soit apprécié des
populations à cause de sa concentration relativement élevée en éthanol. Ces deux phénomènes pourraient suggérer la présence
de levures résistantes à l’éthanol et/ou productrices de pectinases. Malgré ces potentialités, le jus de mucilage de cacao est laissé
à l’abandon dans les champs sous forme de déchet. Ainsi, cette étude a été réalisée dans le but de valoriser le jus de mucilage de
cacao. Les approches méthodologiques adoptées ont porté sur 15 échantillons à raison de 3 échantillons par sites de prélèvement,
ont concerné la réalisation d’une enquête afin d’évaluer l’état actuel des connaissances du jus de mucilage. Puis des analyses
physico-chimiques, nutritionnelles et fonctionnelles des jus de mucilage de cacao au cours de la conservation à température
ambiante, suivi du screening des isolats des levures résistantes à l’éthanol et/ou productrices de pectinases et à leur
identification. Enfin des applications biotechnologiques à travers la production de bioéthanol par les espèces de levures
résistantes à l’éthanolet à la clarification des jus de fruits par celles productrices de pectinases ont été effectuées. Il ressort donc
de cette étude que le jus de mucilage peut être conservé durant 3 jours maximum selon les personnes interviewées. Aussi durant
la conservation à température ambiante, les paramètres physico-chimiques, phytochimiques, nutritionnels et fonctionnels
évoluaient de manière irrégulière. L’étude des propriétés biotechnologiques des souches de levures contenues dans le jus de
mucilage de cacao a permis tout d’abord d’isoler des souches de levures des échantillons Akoupé, Yakassé-Attobrou et Tiassalé
où la teneur en éthanol était respectivement de 9,83% ; 8,74% et 7,21% (v/v) puis celles productrices de pectinase à travers
l’apparition d’halo blanc autour de la colonie. L’identification moléculaire a montré que les isolats des levures résistantes à
l’éthanol appartenaient à 5 espèces : Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces
hansenii, Pichia kurdiavzevii alors que celles productrices de pectinases appartenaient toutes à l'espèce Yarrowia lipolytica. Les
applications biotechnologiques des souches de levures résistantes à l’éthanol ont montré que les espèces Rhodotorula
mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces hansenii, Pichia kurdiavzevii en monoculture et en culture mixte
étaient capables de produire du bioéthanol dont le taux variait entre 7,01 et 7,38% (v/v). Par ailleurs, les pectinases partiellement
purifiées produites par les souches Yarrowia lipolytica clarifiaient les jus d’orange et d’ananas qui étaient caractérisés par une
augmentation de la clarté et une baisse de la couleur, du brunissement, de la viscosité et du pH. Ces données démontrent que le
jus de mucilage de cacao possède d’importantes teneurs en composés phénoliques et en activités antioxydantes et pourrait
contenir des micro-organismes dotés de propriétés biotechnologiques.

Mots-clés : Jus de mucilage de cacao, pectinase, bioéthanol, clarification, levures

ABSTRACT
The cocoa bean processing generates several wastes such as pods and cocoa mucilage juice. This juice comes from the
degradation of the pectin coating the beans by yeasts with pectinolytic activities. Also, after a few days, cocoa mucilage juice
becomes difficult to consume, even though it is appreciated by the population because of its relatively high concentration of
ethanol. These two phenomena could suggest the presence of ethanol-resistant and/or pectinase-producing yeasts. Despite these
potentialities, cocoa mucilage juice is left abandoned in the fields as waste. Thus, this study was carried out with the aim of
valorizing the juice of mucilage of cocoa. The methodological approaches adopted concerned 15 samples at a rate of 3 samples
per site of sampling, concerned the realization of a survey to evaluate the current state of the knowledge of the juice of mucilage.
Then, physicochemical, nutritional, and functional analyses of cocoa mucilage juice during conservation at room temperature,
followed by the screening of isolates of ethanol-resistant and/or pectinase-producing yeasts and their identification. Finally,
biotechnological applications through the production of bioethanol by ethanol-resistant yeast species and the clarification of
fruit juices by pectinase-producing yeasts were carried out. It appears from this study that the mucilage juice can be preserved
for a maximum of 3 days according to the interviewees. Also, during the conservation at room temperature, the
physicochemical, phytochemical, nutritional and functional properties evolved irregularly. The study of the biotechnological
properties of the yeast strains contained in the cocoa mucilage juice allowed us to isolate yeast strains from the Akoupé,
Yakassé-Attobrou and Tiassalé samples, where theethanol content was 9.83%, 8.74% and 7.21% (v/v), respectively, and then
those that produce pectinase through the appearance of white halo around the colony. Molecular identification showed that the
ethanol-resistant yeast isolates belonged to five species: Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica, Saccharomyces
cerevisiae, Debaromyces hansenii and Pichia kurdiavzevii, whereas the pectinase- producing isolates all belonged to the
Yarrowia lipolytica species. Biotechnological applications of ethanol-resistant yeast strains showed that the species
Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, Debaromyces hansenii, Pichia kurdiavzevii in monoculture and in
mixed culture could produce bioethanol with a rate varying between 7.01 and 7.38% (v/v). In addition, partially purified
pectinases produced by Yarrowia lipolytica strains clarified orange and pineapple juices which were characterized by increased
clarity and decreased color, browning, viscosity, and pH. These results show that cocoa mucilage juice has high contents of
phenolic compounds and antioxidant activities and may contain micro-organisms with biotechnology properties.

Keywords: Cocoa mucilage juice, pectinase, bioethanol, clarification, yeast