Tipos diferentes de microscópios diferem em sua magnificação e resolução.

Microscópios de luz

A maioria dos microscópios de estudantes é classificada como microscópios de luz. Em um

microscópio desse tipo, a luz visível passa pelo espécime (a amostra biológica que está sendo

analisada) e é desviada pelo sistema de lentes, permitindo ao observador ver uma imagem ampliada.

Uma vantagem do microscópio de luz é que ele pode ser utilizado na visualização de células vivas,

assim é possível observar o comportamento normal das células (por ex., migração ou divisão).

Microscópio de luz, do tipo que é facilmente encontrado nos laboratórios de escolas e faculdades.

Os microscópios de laboratório de ensino geralmente são microscópios decampo claro, e significa

que a luz visível passa através da amostra e forma a imagem diretamente, sem qualquer modificação.

As formas de microscopia ótica um pouco mais sofisticadas usam truques óticos para realçar o

contraste, facilitando a visualização dos detalhes das células e tecidos.

Um outro tipo de microscopia ótica é a microscopia de fluorescência, que é usada para gerar

imagem de amostras que fluorescem (absorvem um comprimento de onda da luz e emitem outro). A

luz de um determinado comprimento de onda é usada para excitar as moléculas fluorescentes, e a

luz de um outro comprimento de onda diferente emitida por elas é coletada e usada para formar a

imagem. Na maioria dos casos, a parte da célula ou tecido que queremos examinar não é

naturalmente fluorescente, por isso precisa ser marcada com algum pigmento ou etiqueta

fluorescente antes de ir para o microscópio.

A imagem da folha no início do artigo foi obtida usando um tipo especializado de microscopia de

fluorescência chamado microscopia confocal. O microscópio confocal utiliza um laser para excitar

uma fina camada da amostra e coleta somente a luz emitida pela camada de interesse, produzindo

uma imagem nítida e sem interferência das moléculas fluorescentes das camadas adjacentes.

Microscópios eletrônicos

Alguns tipos de microscopia de luz mais avançados (além das técnicas que discutimos acima) podem

produzir imagens de resolução muito alta. No entanto, se você quer visualizar algo muito pequeno

em uma resolução muito alta, você pode querer usar uma técnica diferente, testada e aprovada: a

microscopia eletrônica.

Os microscópios eletrônicos diferem de microscópios de luz por produzirem uma imagem de uma

amostra usando um feixe de elétrons em vez de um feixe de luz. Os elétrons têm um comprimento

de onda muito menor que a luz visível, e isso permite que os microscópios eletrônicos produzam

imagens de alta resolução melhor que as de microscópios de luz padrão. Os microscópios de

eletrônicos podem ser usados para examinar não apenas a célula, mas também as estruturas

subcelulares (organelas) e seus compartimentos.

Uma limitação, no entanto, é que as amostras da microscopia eletrônica devem ser colocadas sob

vácuo (e normalmente são preparadas através de um processo extensivo de fixação). Isso significa

que células vivas não podem ser fotografadas na microscopia eletrônica.

Imagens da bactéria Salmonella produzidas por microscopia de luz e microscopia eletrônica de

varredura. Muitos outros detalhes podem ser vistos na eletromicrografia de varredura.

Na imagem acima, é possível comparar a aparência da bactéria Salmonellaem uma micrografia

(esquerda) com uma imagem produzida por uma microscópio eletrônico (direita). A bactéria aparece

como pequenos pontos roxos na imagem do microscópio de luz, enquanto na eletromicrografia, é

possível ver claramente sua forma e textura da superfície, bem como os detalhes das células

humanas que as elas estão tentando invadir.

Imagem de um microscópio eletrônico. Ele é muito grande, aproximadamente do tamanho de um

forno industrial.

Crédito da imagem: OpenStax Biology. Imagem modificada do original por Evan Bench.

Existem dois tipos principais de microscopia eletrônica. Na microscopia eletrônica de

varredura (MEV), um feixe de elétrons move-se para a frente e para trás através da superfície de

uma célula ou tecido, criando uma imagem detalhada da superfície 3D. Este tipo de microscopia foi

usado para realizar a imagem da bactéria Salmonella mostrada à direita, acima.

Na microscopia eletrônica de transmissão (MET), ao contrário, a amostra é cortada em fatias

extremamente finas. O MET é muitas vezes usado para obter imagens detalhadas das estruturas

internas das células.

Os microscópios eletrônicos, como o descrito acima, são significativamente mais volumosos e mais

caros do que os microscópios óticos convencionais.

MICROSCOPIA

O Objetivo da microscopia é a obtenção de imagens ampliadas de um objeto, que nos permitam

distinguir detalhes não revelados a olho nu. A forma mais comum é a lupa ou microscópio
estereoscópico, seguida do microscópio óptico, que ilumina o objeto com luz visível ou ainda luz
ultravioleta. O limite máximo de resolução dos microscópios ópticos é estabelecido pelos efeitos de
difração devido ao comprimento de onda da radiação incidente. Mas, em geral, os microscópios
ópticos convencionais ficam, então, limitados a um aumento máximo de 2000 vezes.
A imagem microscópica é caracterizada por três parâmetros: aumento, resolução e contraste.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
O MEV surgiu comercialmente em 1965 e desde então tornou-se indispensável em muitos tipos de
pesquisa. No MEV a imagem é formada através de um feixe de elétrons que é usado para varrer o
espécime (amostra), o qual emite os elétrons secundários (interação de um feixe primário com a
superfície de interesse). O feixe de elétrons é produzido em vácuo para evitar colisão com moléculas
do ar. Para espécimes bem preparados (bons condutores) é vantajoso trabalhar-se com feixe
primário de elétrons acelerados com 20 e 25 kV, pois ganha-se na resolução. Espécimes mais
sensíveis podem precisar de elétrons menos energéticos (abaixo de 20 kV).
Também é importante escolher adequadamente a distância de trabalho. Distâncias curtas favorecem
melhor resolução, com certo sacrifício da profundidade de foco. O inverso, maiores distâncias de
trabalho são necessárias para pequeno aumento, áreas e volumes grandes, garantindo boa
profundidade de foco.
A microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (usando canhão de emissão de campo)
fornece imagens de superfície e de estruturas abaixo da superfície.
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
É importante para determinar tamanho e forma de estruturas cristalinas e amorfas; inorgânicas e
biológicas. No caso de amostras cristalinas, também pode revelar a composição das partículas.
A formação de imagem no MET é uma projeção bidimensional da amostra, podendo haver
sobreposição das linhas e áreas de interesse. A imagem final pode ser de campo claro ou campo
escuro. Cada modo de imagem fornece informações complementares sobre a amostra.
No modo campo claro, uma abertura é acionada no plano focal inferior da lente objetiva que permite
a passagem apenas dos feixes diretos, não difratados. As regiões correspondentes a estes feixes
surgem escuras na imagem, enquanto que regiões com nenhuma amostra no caminho do feixe
aparecem mais claras na imagem.
Na imagem de campo escuro, o feixe direto é bloqueado pela abertura do plano focal inferior
enquanto que um ou mais feixes difratados passam pela lente objetiva e aparecem claros na
imagem. As regiões cujos feixes refratados não foram coletados vão aparecer escuras na imagem. Os
feixes difratados têm forte interação com a amostra, fornecendo importantes informações, como
defeitos na estrutura e tamanho de partículas.
A maioria dos MET utilizados no estudo de nanomateriais dispõe de tensão de aceleração de até 300
kV. Embora os MET utilizados em biologia, em geral, operam na faixa de 60 a 80 kV.
No Cetene, contamos com o Laboratório de Microscopia e Microanálise (LAMM) responsável pelo
gerenciamento da microscopia óptica e eletrônica, preparação de amostras e análise de materiais. O
LAMM possui à sua disposição as mais avançadas técnicas de caracterização microscópica, que vão
desde a microscopia eletrônica de varredura em modo ambiental até a microscopia eletrônica de
transmissão de alta resolução.
 Microscópio ótico: funciona com um conjunto de lentes (ocular e objetiva) que ampliam a
imagem transpassada por um feixe de luz que pode ser:
o Microscópio de campo claro
o Microscópio de campo escuro
o Microscópio de contraste de fase
o Microscópio de interferência.

 Microscópio eletrônico: amplia a imagem por meio de feixes de elétrons, estes dividem-se

em duas categorias: Microscópio de Varredura e de Transmissão.

A diferença básica entre o microscópio óptico e o eletrônico é que o eletrôniconão é utilizada a luz,

mas sim feixes de elétrons. No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas,
chamadas de lentes eletromagnéticas.

A diferença básica entre o microscópio óptico e o eletrônico é que o eletrônico não é utilizada a luz,
mas sim feixes de elétrons. No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas,
chamadas de lentes eletromagnéticas.

Microscópio Óptico
Os raios luminosos provenientes de uma fonte qualquer, 
natural ou artificial, são projetados no objeto com ajuda de um espelho 
refletor móvel e de uma pequena lente, chamada condensador. Para ser 
ampliado, o objeto precisa ser posto a uma distância do instrumento 
pouco maior que a distância focal da objetiva. A ampliação obtida é 
função das distâncias focais dos dois sistemas de lentes e da distância 
que os separa.

Microscópio Eletrônico
Nesse aparelho, as amostras são 
iluminadas por um feixe de elétrons, focalizados por um campo 
eletrostático ou eletromagnético. Os microscópios eletrônicos produzem 
imagens detalhadas com uma ampliação superior a 250.000 vezes. Ao 
mostrar imagens de objetos infinitamente menores que os observados ao 
microscópio óptico, o microscópio eletrônico contribuiu para o progresso 
do conhecimento da estrutura da matéria e das células.

Conheça um pouco sobre os tipos de microscópios existentes.

Microscopia de luz
Também chamada de microscopia óptica, a microscopia de luz combina métodos tradicionais de
formação de imagem com princípios de aumento de resolução, permitindo a observação de detalhes
de até 200 nanômetros. Os microscópios ópticos são, geralmente, utilizados em laboratórios de
análises e se dividem em:
1. Microscópio ultravioleta
Neste tipo, utiliza-se a radiação ultravioleta, que tem um comprimento de onda para a luz visível,
melhorando o limite de resolução.

2. Microscópio de fluorescência
A observação dos espécimes é feita através da fixação de substâncias fluorescentes (fluoro e
cromos), que, ao receberem luz, podem ser observados através do brilho gerado.

3. Microscópio de contraste de fase

Transforma diferentes fases dos raios de luz em diferenças luminosas, permitindo a observação dos
espécimes através do contraste gerado.

4. Microscópio de polarização
Constituído por dois prismas – um polarizador e outro analisador – este tipo de microscópio é
utilizado na observação de materiais birrefringentes (estruturas anisotrópicas, com índices diferentes
de refração como os ossos, músculos, fibras, cabelos, etc.).

Microscopia eletrônica
Os microscópios eletrônicos utilizam, em vez da luz, um feixe de elétrons, para iluminar a amostra,
combinado a lentes eletrostáticas e eletromagnéticas. Sua capacidade de ampliação é superior a dos
microscópios de luz, atingindo um nível de resolução de 0,2 nanômetros. Os tipos principais são:

1. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

Capazes de produzir imagens em alta resolução, estes microscópios ampliam em até 100 mil vezes
objeto e permitem obter imagens tridimensionais, sendo bastante utilizados para a observação da
estrutura superficial da amostra.

2. Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)

Este tipo permite examinar detalhes ínfimos, ampliando o objeto em até um milhão de vezes. Seu
funcionamento consiste na emissão de um feixe de elétrons que interage com a amostra enquanto a
atravessa, formando uma imagem aumentada. Para a observação neste tipo de microscópio é
necessário que o material seja cortado em camadas bem finas.

Ao contrário da microscopia óptica, este tipo não utiliza lentes de vidro, mas sim ponteiras de vidro
com alta sensibilidade à superfície da amostra, permitindo a formação de uma imagem com
informações tridimensionais.  Além da grande resolução, os microscópios que utilizam essa
tecnologia podem medir características como dureza e elasticidade do material.

Microscopia de fundo escuro

Microscopia de fluorescência

Microscopia de fundo escuro

Existem três tipos de microscópio eletrônico básico:

 De varredura (ou M.E.V.) - os elétrons (que são os sinais formadores das imagens) são
coletados acima da amostra, o ângulo com que essas partículas são refletidas permite
determinar as características o relevo de sua superfície, possibilitando a análise de amostras
espessas.
 De transmissão - o feixe é coletado abaixo da amostra; assim, a fração do feixe que atravessa
a amostra ultrafina compõe o sinal formador da imagem. [3]
 De tunelamento (ou M.E.V.T.) - uma sonda aplica uma tensão elétrica sobre a amostra; um
sistema com alta precisão determina corrente oriunda da passagem de elétrons entre a ponta e
a superfície da amostra; se a ponta da sonda for movida, as alterações na altura da superfície e
na densidade dos estados causam alterações na corrente. Essas alterações são mapeadas em
imagens, cuja resolução permite a visualização de átomos.