Boletim

Técnico
28
AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO
DE ESPECTROFOTÔMETRO
ULTRAVIOLETA E VISÍVEL

Josete Caetana Dani Sánchez

Juliana Braga Dallarosa
Agosto 2002
 GOVERNO DO ESTADO DO
RIO GRANDE DO SUL

Olívio Dutra
Governador

Secretaria da Ciência e Tecnologia

Renato de Oliveira
Secretário

Odilon Antônio Marcuzzo do Canto

Presidente

Luiz Antônio Antoniazzi

Diretor Executivo

André Antunes de Azambuja

Superintendente de Produção

Dilton Bolzoni Pereira da Luz

Superintendente de Administração
Boletim 28
Técnico Agosto 2002

AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO
DE ESPECTROFOTÔMETRO
ULTRAVIOLETA E VISÍVEL

Josete Caetana Dani Sánchez

Juliana Braga Dallarosa
Departamento de Química - DEQUIM
CIENTEC - PORTO ALEGRE, BRASIL

03
 Exemplares desta publicação podem ser
adquiridos na:
Fundação de Ciência e Tecnologia - CIENTEC
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

Nelia Elsa Pooch
CRB-10/486

Sánchez, Josete Caetana Dani

Avaliação do desempenho de espectrofotômetro
ultravioleta e visível / Josete Caetana Dani Sánchez e
Juliana Braga Dallarosa. -- Porto Alegre : CIENTEC,2002
26 p. - (Boletim Técnico ; 28)

1. Espectrofômetro - Avaliação de desempenho. I.

Dallarosa, Juliana Braga. II. Fundação de Ciência e
Tecnologia. III. Título. IV. Série.

CDU 503.422.3.07

04
 AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DE
ESPECTROFOTÔMETRO
ULTRAVIOLETA E VISÍVEL
JOSETE CAETANA DANI SÁNCHEZ
JULIANA BRAGA DALLAROSA

FUNDAÇÃO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA - CIENTEC

RESUMO
Na aplicação de métodos espectrofotométricos de análises, é de
responsabilidade do analista verificar e validar o funcionamento
apropriado desses instrumentos, visando a garantia de resultados
confiáveis. Sendo o espectrofotômetro UV e V utilizado desde os
laboratórios mais simples até os mais sofisticados, foi selecionada
uma série de procedimentos que poderão ser utilizados pelos
laboratoristas a fim de detectarem variações que possam
comprometer a exatidão e precisão dos resultados analíticos. O
presente trabalho abrange alguns parâmetros instrumentais
essenciais para a garantia da aceitabilidade dos dados analíticos e
que podem estimar a performance do equipamento.
Não pretende ser um estudo completo sobre o assunto, mas descreve
alguns métodos práticos para a avaliação da exatidão da escala de
absorbância em ampla faixa de comprimento de onda, abrangendo o
UV e V; apresenta método de controle da qualidade da faixa espectral
através dos pontos isosbésticos de soluções indicadoras; descreve
métodos para avaliar a presença de luz parasita ou dispersa através
da utilização de filtros e soluções salinas adequadas; sugere
metodologias que permitem avaliar a qualidade das cubetas utilizadas
nas medidas da absorbância e transmitância de uma solução; aborda
de maneira sucinta a linearidade fotométrica de um espectrofotômetro
UV e V e cita algumas técnicas para a avaliação dessa.
São métodos de fácil manuseio, baixo custo e cujos reagentes estão
disponíveis no mercado brasileiro.

05
 ABSTRACT

When analytical spectrophotometric methods are employed, the

operator expected to verify and validate the appropriate use of such
equipment. Since UV and V spectrophotometers are employed from
simple to sophisticated laboratories, a series of procedures are
necessary in order to help technicians detect variations which may
jeopardize accuracy and precision involved in such analytical results.
The present work covers some instrumental parameters essential to
guarantee the acceptability of analytical data and, as a consequence,
help predicting the equipment's performance. It is not intended to be
taken as a reference article, but sheds some light into practical method
description aimed, particularly, at the wide range wavelength
absorbance scale accuracy, covering both UV and V spectral regions.
It also presents a method for controlling the quality of the spectra range
through indicating solution isosbestic points; describes methods to
evaluate the presence of stray light by means of adequate filters and
saline solutions; suggests methods that allows the proper evaluation of
the quality of the cells employed for solution absorbance and
transmittancy measurements, and, covers, resumably, the
photometric linearity of an UV and V spectrophotometer as well as
describes techniques for such evaluation.
The methods described are of easy handling, low cost and which
reagents are available in the Brazilian market.

06
 INTRODUÇÃO
O espectrofotômetro UV e V é um dos equipamentos de bancada ou
de campo mais utilizado nos laboratórios de química ou análises
clínicas, por ser de baixo custo, de fácil manuseio, de manutenção
simples e por abranger uma vasta escala de determinações de cátions
e ânions a baixo custo. Estes laboratórios são responsáveis pelo
fornecimento de dados que influenciam as mais variadas decisões. A
fim de garantir resultados confiáveis, uma das principais providências
é monitorar o desempenho dos instrumentos, identificando sua
necessidade de calibração.
Dos laboratórios de análises é exigida a rastreabilidade analítica, ou
seja, após a emissão de resultados analíticos, que esses possam ser
verificados em todos os aspectos como: quem realizou a análise, se
houve manutenção do equipamento, a validação do método analítico,
o controle de armazenamento e manipulação de padrões e amostras,
a calibração do equipamento etc. (Leite, 1998).
Os testes de avaliação da performance têm, como objetivo principal,
verificar a operação do equipamento em suas principais variáveis, que
possam afetar o resultado analítico final. Os testes podem enfocar
uma determinada parte do equipamento ou do método, ou podem
analisar o comportamento geral da análise como um todo.
Segundo Ferreira (1998), "calibração é a comparação do valor
numérico de uma grandeza (mensurando) com um valor de uma
grandeza similar, de melhor qualidade (menor incerteza) tomada
como padrão". É desejável que a verificação da performance dos
equipamentos seja feita através do uso de materiais de referência
certificados, cujas propriedades têm sido medidas com precisão por
laboratórios de referência. Vários materiais de referência
internacionais são atualmente acessíveis, como os do National
Bureau of Standards - USA, U.S. Geological Survey - USA, Centre de
Recherches Pétrographiques et Géochimiques - França, Geological
Survey of Japan, National Research Council - Canada, British
Chemical Standard - Inglaterra, Community Bureau of Reference -
Bélgica etc.

07
São inúmeros os pesquisadores que se dedicaram ao estudo de
testes, de fácil utilização e acessíveis à maioria dos laboratórios de
análise quantitativa, preocupados com a avaliação do desempenho
dos espectrofotômetros UV e V (Rand, 1969; Dharan,1980; Pedrazzi
et al, 1980; Pedrazzi, 1995; Strufaldi, 1981; Linhares, 1995 e 1996;
Frings et al, 1976, Hoxter, 1979).
O presente trabalho não pretende ser um estudo completo sobre os
métodos disponíveis para o controle da qualidade em
espectrofotômetros UV e V, mas uma pequena revisão bibliográfica
sobre métodos rápidos e de fácil acesso. Pretende-se, numa
abordagem sucinta, transmitir algumas técnicas de baixo custo e que
poderão ser implantadas pelo laboratorista, a fim de verificar se o
instrumento está apto a fornecer um resultado confiável.

08
I - AVALIAÇÃO DA EXATIDÃO DA ESCALA DE
ABSORBÂNCIA

Algumas soluções, também chamadas de filtros líquidos ou padrões

líquidos de absorbância, são indicadas para a estimativa da exatidão
da escala de absorbância na região do ultravioleta e visível.
A ASTM E925-83 recomenda a utilização de soluções ácidas de
dicromato de potássio (NBS/SRM 935) para a avaliação da
performance da escala de absorbância na região do ultravioleta.
Preparo das soluções de dicromato de potássio (SRM 935).
Transferir 200,0 + 0,3mg; 250,0 + 0,3mg; 300,0 + 0,3mg e 350,0 +
0,3mg de dicromato de potássio p.a., K2Cr2O7 (seco a 110ºC por 1
noite) para balões volumétricos de 100 mL e diluir com água destilada.
Diluir estas soluções, pipetando 20,0 mL de cada solução para balões
volumétricos de 1L e adicionar 1 mL de ácido perclórico, HClO4 1M (8,6
mL de HClO4 70% diluídos a 100 mL com água destilada) e completar o
volume com água destilada. Estas soluções conterão 40, 50, 60 e
70mg de dicromato de potássio por litro de solução, respectivamente.
Preparar uma prova em branco, diluindo 1 mL de ácido perclórico 1M
em balão volumétrico de 1L com água destilada. Estas soluções,
adequadamente preparadas e estocadas, são estáveis pelo menos
por seis meses. Ler cada solução num espectrofotômetro, em cubeta
de 10 mm, nos comprimentos de onda indicados na Tabela I.
Determinar a absorbância de cada padrão líquido. Se os valores
estiverem fora do intervalo aceitável, conforme a tabela I, repetir a
leitura com uma baixa velocidade de varredura e uma largura da fenda
menor. Se a absorbância lida em todos os comprimentos de onda
estiverem fora da faixa de aceitabilidade, segundo a mesma tabela,
preparar novas soluções e repetir o procedimento acima descrito.
Persistindo os valores, um serviço qualificado de correção deve ser
solicitado.

09
 Tabela I
Calibração da absorbância na região do ultravioleta com utilização
do padrão NBS/SRM 935
Comprimento de Largura da Concentração da Faixa de
onda, nm banda espectral, solução utilizada, absorbância
nm mg/L aceitável
235 1,2 40 0,485 – 0,499
50 0,607 – 0,625
60 0,730 – 0,752
70 0,853 – 0,879
257 0,8 40 0,564 – 0,582
50 0,706 – 0,728
60 0,840 – 0,875
70 0,993 – 1,023
313 0,8 40 0,189 – 0,195
50 0,237 – 0,245
60 0,285 –0,293
70 0,332 – 0,342
345 0,8 20 0,207 – 0,216
40 0,419 – 0,431
50 0,523 – 0,539
60 0,627 – 0,647
70 0,733 – 0,765
350 0,8 20 0,210 – 0,217
40 0,431 – 0,434
50 0,528 – 0,543
60 0,633 – 0,653
70 0,740 – 0,768
Nota: Tabela extraída da ASTM E 925/83

Dharan (1980) citou diversas soluções que podem ser facilmente

obtidas nos laboratórios e que servem para avaliar o desempenho da
absorbância na faixa de 340nm a 700nm. Sugeriu a calibração da
escala de absorbância através do uso de uma solução contendo 50mg
de dicromato de potássio, K2Cr2O7 p.a. (sal seco a 110ºC, por uma
noite) em 1000 mL de ácido sulfúrico, H2SO4 0,01N. Esta solução lida
no comprimento de onda de 350nm, em cubeta de 10mm, deve
apresentar um valor de absorbância de 0,535 + 0,002, tendo como
referência um branco de ácido sulfúrico 0,01N.
Dharan (op. cit.), sugeriu, outrossim, a utilização de uma solução de
40mg de cromato de potássio, K2CrO4 p.a. em 1000mL de hidróxido de
potássio, KOH 0,05N, para a verificação da absorbância na região do
ultravioleta e visível (tabela II).
10
 Tabela II
Absorbância da solução de K2CrO4 (40mg/L) na região do
ultravioleta e visível.

Comprimento de onda, Absorbância

nm
340 0,316
375 0,991
400 0,396
450 0,033
Segundo o mesmo autor, uma solução de sulfato de cobre,
CuSO4.5H2O p.a., obtida pela dissolução de 20,00g do sal em 10mL de
H2SO4 concentrado e levados a 1000mL com água destilada, deve
apresentar as absorbâncias citadas na tabela III.

Tabela III
Absorbâncias da solução de CuSO4.5H2O (20,00g/L) em
comprimentos de onda ( l ) na faixa de 400 a 700nm.

Comprimento de onda, Absorbância

nm
400 0,002
600 0,068
650 0,224
700 0,527

Tanto Dharan (1980) quanto Rand (1969) recomendaram a utilização

de uma solução de sulfato de amônio e cobalto para a avaliação da
escala de absorbância ou para verificar a linearidade fotométrica. A
solução de sulfato de amônio e cobalto pode ser obtida a partir da
dissolução de 14,481g de sulfato de amônio e cobalto,
CoSO4.(NH4)2SO4.6H2O em 10mL de ácido sulfúrico concentrado e
diluídos a 1000mL com água destilada. Esta solução deve apresentar
as seguintes absorbâncias (Tabela IV):

11
 Tabela IV
Absorbâncias em vários comprimentos de onda ( l ), na região do
visível, da solução de sulfato de amônio e cobalto (0,0367M).

Comprimento de onda, Absorbância

nm
400 0,012
450 0,077
500 0,163
510 0,174
550 0,077
600 0,014
A escala de absorbância, na região do visível (400 a 650nm), pode,
também, ser testada pela utilização de três filtros do National Bureau
of Standards - Série SRM 930, que possuem os valores de
absorbância certificados para os comprimentos de onda de 440nm,
465nm, 590nm e 635nm (ASTM E925-83).
O procedimento para a avaliação da performance da escala de
absorbância baseia-se na medida da absorbância de cada filtro, nos
comprimentos de onda indicados, a fim de verificar a conformidade ou
não dos valores obtidos no espectrofotômetro com os valores
certificados.
Burke et al (1972) realizaram um estudo sobre os erros advindos das
medições da absorbância de filtros líquidos, ou seja, padrões líquidos
de absorbância. O estudo incluiu soluções obtidas a partir de
compostos com alta pureza, misturas compostas e soluções aquosas
de corantes orgânicos. Outrossim, descreveu a preparação e
certificação do material de referência NBR SRM 931. Com referência
a esse último, foram certificadas três faixas de absorbância (para um
conjunto de três filtros e um branco de ácido perclórico 0,1N), cujos
valores reproduzimos na Tabela V abaixo, com os respectivos
comprimentos de onda. Burke et al (op. cit.) apresentaram os
espectros de absorção dos referidos filtros líquidos e identificaram os
- +2
picos a 302 e 512nm como devidos à absorção pelo NO3 e Co(H2O)6 ,
respectivamente e os picos a 395nm e o "plateau" a 650 - 700nm
+2
devidos à absorção do Ni(H2O)6 .

12
 Tabela V
Valores certificados de absorbância para os
filtros líquidos NBS SRM 931.

Filtro Comprimento de onda, nm e largura da banda espectral, nm

302 (1,0) 395 (1,7) 512 (2,0) 678 (6,5)
“A” - branco 0,307  0,003 0,304  0,003 0,303  0,003 0,115  0,002
“B” – branco 0,608  0,005 0,605  0,005 0,606  0,005 0,229  0,003
“C” - branco 0,906  0,007 0,907  0,007 0,911  0,007 0,345  0,003
Nota: absorbância lida em cubeta de 10mm a 25ºC.

Garfield (1992) sugeriu, para a avaliação da precisão e

reprodutibilidade fotométrica, a utilização de uma solução de
dicromato de potássio, K2Cr2O7, 60 + 0,25 mg/L em ácido sulfúrico 0,01
N, correndo três espectros nos comprimentos de onda citados na
tabela VI abaixo. Citou um desvio máximo permitido de + 1,0%.

Tabela VI
Absorbância da solução de K2Cr2O7 (60 + 0,25 mg/L)
na região do UV.
Comprimento de onda, nm Absorbância
235 0,747
257 0,869
313 0,293
350 0,644

Outrossim, Garfield (op. cit.) citou o filtro de vidro SRM 930 do National
Institute of Standards and Technology para a avaliação do
desempenho fotométrico de um espectrofotômetro.

13
II - AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO DO SELETOR
DA ÁREA ESPECTRAL
O seletor espectral deve ser capaz de isolar a porção desejada do
espectro. A qualidade deste depende não somente de seu modelo,
mas também de sua faixa de emissão, que pode ser definida como a
região espectral que é isolada eficientemente pelo seletor.
O seletor será mais eficiente quanto menor for sua faixa de emissão.
Além da linearidade, a faixa de emissão é responsável pela resolução
do aparelho, isto é, a capacidade de detectar variações na
absorbância ou transmitância na escala de transmissão espectral.
O controle de qualidade do seletor espectral pode ser realizado
através dos chamados "pontos isosbésticos", nome derivado da
palavra grega SBESSIS (iso= mesmo e béstis= absorção). Segundo a
American Society of Testing Materials, o termo isosbéstico indica o
comprimento de onda no qual são iguais as absorbâncias de uma
substância quando em diferentes valores de pH. Na literatura
referente a este assunto, usa-se indistintamente o termo isobéstico ou
isosbéstico.
A determinação do ponto isosbéstico permite verificar se há
concordância entre a emissão da energia radiante pelo seletor e o
valor do comprimento de onda indicado pelo dial do seletor da á
rea espectral. Este controle deve ser feito periodicamente pelo
analista.
A discordância permitida, para o uso rotineiro, será proporcional à
capacidade de seleção do comprimento de onda do equipamento. O
método segue um princípio básico e simples, no qual são usadas
substâncias facilmente disponíveis, sem requisitos especiais de
pureza, concentração, umidade ou controle da temperatura (Hoxter,
1979 ). A concentração absoluta da solução não influi no
deslocamento do comprimento de onda do ponto isosbéstico. Nestes
comprimentos de onda, as absorções independem do pH dentro de
certos limites. Se colocarmos uma solução indicadora não tamponada
em duas cubetas e acidificarmos uma e alcalinizarmos a outra, com
igual quantidade de ácido e base de mesma concentração, as leituras
das absorbâncias serão idênticas no ponto isosbéstico. Assim, lidas
as diferenças entre as absorbâncias (ou transmitâncias) destas
soluções a diferentes comprimentos de onda, somente será zero num
comprimento de onda, ou seja, no ponto isosbéstico.
Hoxter (1979), realizou o citado teste com uma solução indicadora de
azul de bromotimol (40 mmol/L), a diferentes pH, a 20ºC e encontrou
pontos isosbésticos a 260nm, 279nm, 325nm e 498nm.

14
Numa avaliação do desempenho de um seletor espectral, pode-se
selecionar, na Tabela VII, a solução indicadora que contemple a faixa
de comprimento de onda utilizada em análises de rotina e prepará-la
de acordo com a concentração citada (Hoxter, op. cit.). Utilizando
cubetas sem imperfeições, ou seja, cubetas já testadas, para uma
mesma solução, nos diferentes comprimentos de onda (Tabela VII), o
valor da absorbância não deverá sofrer alteração.
Tabela VII
Comprimentos de onda isosbésticos e concentrações de soluções
indicadoras (Hoxter, 1979).
Substância Comprimento de onda, nm Concentração,
201-270 271-290 291-325 326-400 401-550 mg/L
Riboflavina 266 275 296 369 462 9,5
Vermelho de fenol 238 273 322 365 514 7,0
Dicromato de potássio 245 - 297 339 445 29,5
Azul de bromotimol 260 279 325 - 498 25,0
Verde de bromocresol 265 277 - 329 508 35,0
Púrpura de bromocresol - - 322 - 490 27,0
Metilorange - - - 352 465 6,5
Vermelho do congo 269 - 295 - 541 14,0

Parthasarathy et al (1958) também utilizaram soluções indicadoras

ácidas e básicas para estimar a performance do comprimento de onda de
espectrofotômetros. Encontraram o valor de 469nm para o ponto
isosbéstico do metilorange e Hoxter (1979), segundo Tabela VII, 465nm.
O Laboratório de Águas da Fundação de Ciência e Tecnologia CIENTEC
confirmou o valor (469nm) encontrado por Parthasarathy et al. (gráfico I).

Gráfico I
Verificação do Ponto Isosbéstico da Solução de
Metilorange 6,5mg/L
0,7
0,6
Absorbância

pH =9,54
0,5
0,4
0,3
pH=3,53
0,2
0,1
0
450 455 460 465 470 475

Comprimento de onda, nm

15
Para a solução de dicromato de potássio (Tabela VII), Pedrazzi et al
(1980) encontraram um ponto isosbéstico a 442nm e Hoxter (op. cit.) a
445nm. O valor encontrado no presente estudo foi de 445nm (gráfico II).

Gráfico II

Verificação do Ponto Isosbéstico da Solução de

Dicromato de Potássio 29,5mg/L

0,12

0,1
pH= 10,95
Absorbância

0,08

0,06

0,04
pH= 2,94
0,02

0
420 430 440 450 460

Comprimento de onda, nm

Garfield (1992) recomendou a utilização de filtro de Holmium e

Didymium, na região do UV e V, para verificar a precisão e
reprodutibilidade do comprimento de onda, admitindo um desvio de +
1,0 nm e sugerindo que a avaliação seja realizada duas vezes ao mês.

III - AVALIAÇÃO DO DESVIO DA ENERGIA

RADIANTE OU LUZ PARASITA
Um grande problema relacionado com a fonte de energia é a chamada
luz parasita ou dispersa, que vem a ser qualquer tipo de energia
luminosa que incide na amostra com comprimento de onda diferente
do indicado na escala do monocromador. Segundo Dharan (1980), a
luz dispersa num determinado comprimento de onda analítico deverá
ser inferior a 0,1%. As principais causas da formação da luz parasita
são defeitos no sistema ótico, deposição de fumos químicos no vidro
da lâmpada e até nos orifícios do aparelho e reflexões sobre as
superfícies de diferentes partes do instrumento. Esta luz pode causar
erros analíticos, inclusive afetando a linearidade da curva de
calibração ou diminuindo a absorbância.

16
Para uma avaliação da luz dispersa (parasita) em 340nm, Dharan
(1980) sugeriu a utilização do filtro Corning nº 3060, cuja percentagem
de transmitância deve ser zero, pois este permite apenas a passagem
da luz visível, cortando todos os fótons abaixo de 340nm. A
percentagem de transmitância registrada será igual à quantidade de
luz dispersa. Para a luz dispersa a 400nm pode ser utilizado o filtro
Corning nº 3389 (Tabela VIII).
Rand (1969) citou o filtro Corning Vycor 7910 para a medida do desvio
da energia radiante, e Poulson (1964) listou uma série de materiais e
filtros que podem ser utilizados para a mesma finalidade (Tabela VIII).

Tabela VIII
Materiais utilizados na avaliação da luz dispersa (parasita ).

, nm Material
205 Filtro Corning nº 7910(espessura 3,30,3mm)
200 Célula de 1cm – 12g/L de KCl em H2O
224 Célula de 1cm – 10g/L de NaBr em H2O
260 Célula de 1cm – 10g/L de NaI em H2O
340 Filtro Corning nº 3060
400 Filtro Corning nº 3389

A fração desviada da energia radiante também pode ser medida

através de soluções salinas citadas na ASTM E925-83 (Tabela IX).

Tabela IX
Soluções utilizadas na avaliação da fração da energia radiante
desviada (ASTM E925-83).
Solução , nm
KI, 1,0 g/L em H2O 220
K2Cr2O7, 0,25g/L em KOH 0,05N 370
Na utilização destas soluções (Tabela IX), usar lâmpadas com fonte
de luz visível em 370nm e com fonte de luz adequada a 220nm.
Determinar a transmitância ou absorbância de cada solução no
comprimento de onda citado, usando como referência (branco) o
solvente adequado. Nos comprimentos de onda indicados, as
soluções são opacas e as suas transmitâncias são proporcionais ou
equivalentes à fração desviada de energia radiante.
17
Outro procedimento que pode ser utilizado para a mesma finalidade é
o uso de solução de sulfato de níquel, NiSO4.7H2O, p.a., a 5%. Lê-se
as absorbâncias correspondentes aos comprimentos de onda de 400,
510 e 700nm utilizando-se uma prova em branco com água destilada.
As leituras em 400nm e 700nm correspondem aos pontos de maior
absorbância, e uma diminuição de 3% ou mais na absorbância medida
em relação à absorbância inicial (valor obtido por ocasião do início do
uso do equipamento) indica a presença de problemas. O menor valor
de absorbância corresponde a 510nm. Um aumento de 3% nesta, em
relação à leitura inicial, indica um aumento da faixa de emissão,
possivelmente devido à interferência junto à fonte de energia radiante,
como luz estranha ao sistema óptico.
Pedrazzi et al (1980) recomendaram a utilização de uma solução
ácida de sulfato de níquel, NiSO4.6H2O, 40%. Dissolver 40g do citado
sal em 75 mL de água destilada contendo 1mL de ácido clorídrico
concentrado e diluir a 100 mL com água destilada. Filtrar se
necessário e ler a absorbância desta solução a 400 e 700 nm, contra
uma prova em branco contendo ácido clorídrico 1% (v/v). A luz
parasita será constatada se variações de + 3% forem detectadas em
relação às absorbâncias inicialmente obtidas (quando do uso inicial do
espectrofotômetro).
Strufaldi (1981) recomendou a utilização desta solução como padrão
para determinar a presença de energia parasita, a qual é estável por
vários anos se armazenada em local fresco e ao abrigo da luz.
Recomendou filtrar as soluções-padrão e o branco em papel de
filtração lenta, desprezando os primeiros 5mL. Transferir para cubetas
testadas, tampar e parafinar a junção cubeta-tampa para selar
definitivamente o sistema. Recomendou ajustar o zero do
equipamento com a prova em branco, a 400nm e então ler a solução-
padrão nos comprimentos de onda: 460nm, 510nm, 550nm e 700nm.
Segundo Strufaldi (op. cit.), o espectrofotômetro que apresentar
variações nas absorbâncias de + 3% em relação às absorbâncias
iniciais deverá ser revisado por técnico especializado.
Os desvios de energia encontrados dependem das características
espectrais e são fixados limites nas especificações dos aparelhos.
Porém, se excessivo desvio for verificado, deve-se procurar auxílio
técnico.
Geralmente, problemas relacionados com o desvio da energia
radiante surgem devido às precárias condições ambientais, como
poeira, corrosão do colimador ou dispersor etc.

18
IV - CALIBRAÇÃO DE CUBETAS
As cubetas, recipientes de vidro ou quartzo que são utilizados como
suportes de soluções por serem a porção mais negligenciada do
aparelho, contribuem significantemente para aumentar o erro na
leitura de uma absorbância ou transmitância. Para realizar-se um
trabalho preciso é fundamental certificar-se de sua qualidade, tendo
em vista que serve de recipiente para a amostra, não devendo,
portanto, contribuir ou interferir nas medidas de absorbância ou
transmitância.
As cubetas, em função do uso contínuo, podem perder a
transparência, podem adquirir coloração e sofrerem danos por
abrasão, como ranhuras. Cubetas adquiridas em épocas diferentes
ou de diferentes fabricantes, podem apresentar alterações nas
leituras da transmitância ou absorbância de uma solução. Existem
cubetas de diversas formas geométricas, como redonda, quadrada,
retangular e de diferentes caminhos ópticos. As cubetas redondas não
são exatamente redondas e não são opticamente polidas,
apresentando irregularidades e efeitos ópticos. As cubetas quadradas
ou retangulares apresentam faces planas e paralelas, são
opticamente polidas, isentas de efeitos ópticos, sendo, portanto, mais
precisas e exatas.
O controle de qualidade das cubetas compreende testes de superfície
e determinação de erros na espessura, assim como testes para
verificar a limpeza da cubeta.
Para o controle das imperfeições na parede das cubetas, Pedrazzi et
al (1980) sugeriram um teste simples, realizado com água destilada.
Encher todas as cubetas com água destilada e escolher uma cubeta,
ao acaso, que será considerada como "referência". Ler no
espectrofotômetro (em feixe simples) o valor da absorbância e anotar.
Fazer leituras com as outras cubetas, nas mesmas condições, nos
seguintes comprimentos de onda: 420, 570, 580 e 650nm. Realizar as
medidas em triplicata, fazendo a média dos valores obtidos e
comparar os desvios em relação ao da absorbância encontrada para a
referência. Todas as cubetas deverão ser lidas nos mesmos
comprimentos de onda.
Testes para a determinação de imperfeições na espessura das
cubetas podem ser realizados utilizando o procedimento acima
referido para o teste da superfície da cubeta, substituindo a água
destilada por uma solução aquosa de sulfato de cobre 5% e
determinando sua absorbância a 610nm. Pedrazzi et al (1980)
recomendaram o mesmo teste com solução de sulfato de cobre a 9%.
19
Diante dos valores obtidos nos testes, as cubetas que apresentarem
variações de absorbância de + 0,002 em relação à cubeta
"referência",em espectrofotômetro, apresentam imperfeições, não
devendo ser utilizadas em trabalhos analíticos. Para fotômetros de
filtro, a variação máxima aceitável é de + 0,01.
A causa mais comum de erro deve-se a depósitos sobre as paredes da
cubeta, causada por sua ineficiente limpeza. A ASTM 275/93 cita um
método para testar a limpeza e diferenças na espessura ou
paralelismo das paredes da cubeta, determinando sua absorbância e
utilizando o ar como referência. Determinar a absorbância de uma
cubeta com água, usando ar como referência, a 240nm (com cubeta
de quartzo) ou a 650nm (com cubeta de vidro). Em equipamentos com
registrador, varrer a região espectral de interesse. A absorbância
obtida não deve ser maior do que 0,093 para células de 1cm de
quartzo e 0,035 para células de 1cm de vidro.
Para verificar se todas as paredes da cubeta são iguais, ler a
absorbância trocando a posição dessa. A diferença de absorbância
obtida não deve ser superior a 0,005.
A correção das cubetas também pode ser feita lendo a absorbância da
cubeta-amostra com solvente utilizado na metodologia analítica e
usando o mesmo solvente na cubeta-referência. A diferença não deve
ser maior do que 0,01. Para a correção da imperfeição, o valor obtido
para a absorbância da cubeta-amostra deverá ser subtraído de todas
as leituras de absorbância, para as amostras que utilizaram o mesmo
solvente do teste, se medidas nas mesmas cubetas em que o teste foi
realizado (ASTM 275/93).

20
V - LINEARIDADE FOTOMÉTRICA
A linearidade é a capacidade do instrumento de registrar um sinal
proporcional à intensidade da luz. A linearidade fotométrica é uma
maneira eficaz de caracterizar o desempenho espectrofotométrico de
um equipamento. Os dados fotométricos obtidos pelo analista serão
usados para determinar a concentração de íons em uma solução.
Necessário faz-se estabelecer a faixa de linearidade da relação
absorbância : concentração.
Rand (1969) apresentou diversos métodos para a avaliação da
linearidade, sensibilidade, calibração dos comprimentos de onda, luz
parasita e exatidão para espectrofotômetros e colorímetros, com a
utilização de padrões. Nenhum dado fotométrico deve ser
considerado correto se o equipamento não foi testado com padrões.
Rand realizou alguns testes provando que o grau de não-linearidade
de uma curva absorbância versus concentração é função do
equipamento, da largura da banda de absorção e da largura da banda
espectral. Com a largura da banda, a linearidade tende a diminuir.
Assim, se a declividade ótima de uma curva de calibração
absorbância versus concentração é igual a 1, em bandas com larguras
maiores a declividade será menor do que 1. A declividade de curva
varia de instrumento para instrumento e de composto para composto,
pelas mesmas razões que varia a linearidade fotométrica (Rand,
1969).
A resposta linear obtida em espectrofotômetro depende de um bom
relacionamento entre a energia luminosa, o receptor de fótons e a
escala de leitura. Com o passar do tempo, a célula fotoelétrica ou
fototubo pode perder sua capacidade original de transformação de
fótons em elétrons, resultando numa modificação da linearidade das
curvas de referência.
Para avaliar-se a linearidade fotométrica, deve-se determinar a faixa
sobre a qual a fotometria é linear para a análise de um dado parâmetro
e preparar uma curva de trabalho.
Para cada parâmetro a ser determinado por um método analítico,
preparar pelo menos três soluções contendo o componente em
concentrações que cubram a faixa para a qual o método é destinado.
Medir a absorbância de cada solução no comprimento de onda
analítico.
Plotar os dados de absorbância na ordenada e suas respectivas
concentrações na abscissa. Levantar uma reta, que representará a
linearidade da relação absorbância : concentração dos pontos
experimentais.

21
Strufaldi (1981) apresentou em detalhes como preparar uma curva de
calibração/ trabalho e possíveis causas de erro, ou seja, erros originados
pela amostra e erros laboratoriais, assim como sistemas de controle para
a avaliação da qualidade total de um laboratório.
Dharan (1980) citou um teste simples, ao alcance de muitos
laboratoristas, para verificar a linearidade de espectrofotômetros.
Usando os mesmos reagentes por ele citados para a avaliação da
absorbância (item.I), mas utilizando a metade, a mesma quantidade e o
dobro da substância empregada no teste da absorbância, observou que a
absorbância dessas três soluções devem obedecer à relação 1:2:4.
Rand (1969) sugeriu a utilização de vários compostos para testar a
linearidade fotométrica, entre eles, a utilização de soluções obtidas a
partir da dissolução de 2, 4, 6, 8 e 10g de sulfato de cobalto e amônio (alta
pureza) em 100mL de ácido sulfúrico 1%(v/v). Estas soluções fornecerão
valores de absorbância de aproximadamente 0,25; 0,50; 0,75; 1,0 e 1,23
em 512nm.
O controle da linearidade pode ser feito a partir de uma solução aquosa de
sulfato de níquel 5%. A partir desta, preparar diluições de 75%, 50% e
25%, que devem ser lidas nos comprimentos de onda de 400nm e 700nm.
Registrando os resultados em papel milimetrado, traçar a melhor reta
entre os pontos. Se houver pontos que se afastam da reta, determinando
uma curvatura ou a formação de "plateau", é sinal da perda da linearidade
e de que o espectrofotômetro necessita uma revisão realizada por técnico
especializado.
Abaixo apresentamos o gráfico III de linearidade obtido em dois
espectrofotômetros (Jasco e Shimadzu) no Laboratório de Águas da
CIENTEC.

GRÁFICO III
Avaliação da Linearidade do Espectrofotômetro Jasco e
Shimadzu com Solução de Sulfato de Níquel 5% a 400 e 700nm.

0,8
0,7
0,6
Absorbância

0,5
400nm
0,4
0,3
0,2
0,1
700nm
0
0 25 50 75 100
Concentração, %

22
Para avaliar a faixa de linearidade de uma curva de trabalho, tem-se
que determinar a precisão dos dados fotométricos. A precisão
fotométrica é a capacidade do sistema fotométrico de reproduzir o
mesmo valor em sucessivas determinações (ASTM 275/93). Na
prática, a precisão é representada pelo desvio-padrão. Tanto a
precisão como a exatidão fotométrica podem ser determinadas com a
utilização de padrões de referência que possuem a transmitância ou
absorbância conhecidas.
Como curiosidade, apresentamos abaixo a Tabela X extraída da
ASTM 275/93, com a referência de telas metálicas (ou filtros de vidro)
que podem ser adaptados em espectrofotômetros (feixe simples), e
obtidas dez leituras sucessivas de absorbância ou transmitância
aparente, com as quais determina-se o desvio-padrão, avaliando-se a
precisão fotométrica.
Tabela X
Telas perfuradas utilizadas para as medidas da repetibilidade
fotométrica
Identificação, Nº Transmitância nominal Absorbância nominal
20W 0,01 2,0
30T 0,035 1,5
10S 0,07 1,2
12 1/2P 0,145 0,84
10N 0,205 0,70
15L 0,29 0,54
15H 0,41 0,39
20G 0,50 0,30
40Spec 0,60 0,21
Pedrazzi et al (1980) e Frings et al (1976) citaram um teste para o
controle da linearidade que utiliza o corante para alimentos "French's
green", que possui absorção máxima em três comprimentos de onda:
257nm, 410nm e 630nm e não depende da temperatura no intervalo
de 4° a 56°C. Outrossim, não foram detectadas variações da
absorbância no intervalo de pH de 2,5 a 10,0. A partir de uma solução-
estoque do corante (Frings et al, op. cit.), faz-se diluições a 100%,
50%, 25% e 12,5% com água destilada. Faz-se a leitura das
absorbâncias nos comprimentos de onda citados, com cubetas de
10mm e traça-se a curva de calibração em papel milimetrado.
O indicador (corante) "French's green" citado por Frings et al (op. cit.) é
constituído de uma mistura de 5 partes do FDC Yellow Nº
5 com 1 parte do FDC Blue Nº 1, 25g/L em água e propileno glicol.

23
A solução estoque (0,5mL/L) é obtida diluindo 0,10mL do indicador
French's green a 200mL com água destilada. Esta solução é estável
por 6 meses, se estocada em recipiente escuro, a temperatura
ambiente.
Rand (1969) citou uma solução de nitrato de potássio 1,170% como
solução-padrão para a avaliação da exatidão fotométrica na região do
ultravioleta, citando o valor da absortividade encontrado, em 302nm,
com cubetas de 10 mm, como 0,0705 - 0,0703. A absorbância de uma
solução depende da absortividade, do caminho óptico (largura da
cubeta) e da concentração da solução. A absorbância= a x c, onde a =
absortividade e c = concentração da solução. O valor da absorbância
encontrado por Rand (op. cit.) foi de 0,825.

VI - CONCLUSÃO
Não recomendamos uma metodologia em especial para a
avaliação da performance do equipamento, pois esta dependerá
da disponibilidade dos reagentes no laboratório, assim como da
faixa de comprimento de onda desejada. Dependendo da
bibliografia consultada, o erro máximo admissível na avaliação
da precisão e reprodutibilidade fotométrica varia de 1 a 3% da
absorbância obtida. Recomendamos, para as soluções em que
não é citado o desvio aceitável de absorbância, um desvio
máximo de + 1%, seguindo a sugestão de Garfield (1992).
Dependendo da freqüência de utilização do espectrofotômetro,
recomendamos uma verificação mensal. Se o equipamento
apresentar boa performance após alguns meses, o período de
verificação poderá ser estendido, a critério do usuário.
Outrossim, sugerimos uma verificação semestral para as
cubetas. Os testes descritos são, em sua maioria, de baixo
custo, rápidos, eficientes e cujos reagentes estão disponíveis no
mercado. São procedimentos que deverão integrar o sistema de
qualidade, fazendo parte da rotina de um laboratório analítico,
dando condições aos laboratoristas de identificarem a
necessidade de calibração dos espectrofotômetros, isto é, de
solicitarem um serviço especializado de manutenção.

24
VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ASTM. E275-93 : Standard practice for describing and measuring

performance of ultraviolet, visible, and near-infrared
spectrophotometers. In: __. 1998 annual book of ASTM
standards. West Conshohocken, PA, 1998. v.03.06, p.682-691.

ASTM. E925-83 (Reapproved 1994) : Standard practice for the

periodic calibration of narrow band-pass spectrophotometers. In:
__. 1998 annual book of ASTM standards. West Conshohocken,
PA, 1998. v.03.06, p.763-768.

BURKE, R.W.; DEARDORFF, E.R.; MENIS, O. Liquid absorbance

standards. Journal of Research of the National Bureau of
Standards A. : Physics and Chemistry. v.76A, n.5, Sept.-Oct.1972,
p.469-482.

DHARAN, M. Control de calidad en los laboratorios clínicos.

Barcelona : Reverté, c1980.

FERREIRA, V.C.S. Avaliação da incerteza nas medições

segundo a ISO-GUM. Porto Alegre : Rede Metrológica RS, 1998.
57p.

FRINGS,C.S.; MUSCAT, V.I.; WALDROP, N.T. Convenient method

for checking detector response of spectrophotometers at three
wavelengths. Clinical Chemistry, v.22, n.1, p.101-102, 1976.

GARFIELD, Frederick M. Instrument Performance Checks. In: __.

Quality Assurance Principles for Analytical Laboratories.
Arlington, VA : AOAC International, 1992, c1991. Appendix C.
p.156

HOXTER, G. Suggested isosbestic wavelength calibration in clinical

analyses. Clinical Chemistry, v.25, n.1, p.143146, 1979.

LEITE, F. Validação em análise química. 3.ed. São Paulo :

Átomo, 1998. 224p.

25
LINHARES, P.S. Qualidade total no laboratório de análise/ensaio.
TECBAHIA, Camaçari, v.10, n.2, maio/ago., 1995.

LINHARES, P.S. Qualidade total no laboratório de análises

geoquímicas. Geochim. Brasil, v.10, n.2, p.257262, 1996.

PARTHASARATHY, N.V.; SANGHI, I. A simple technique for the

calibration of the wave-length scale of spectrophotometers. Nature,
v.182, n.1, p.44, 1958.

PEDRAZZI, A.H.P. Controle de qualidade de aparelhos

espectrofotométricos. NewsLab, v.2, n.8, p.40-47, 1995.

PEDRAZZI, A.H.P.; VILELA, S. Calibração e controle de qualidade

em fotômetros e espectrofotômetros de diferentes procedências.
Rev. Bras. Anál. Clín., v.12, n.1-4, p.21-27, jan./dez. 1980.

POULSON, R.E. Test methods in spectrophotometry : stray-light

determination. Appl. Opt., v.3, p.99, 1964.

RAND, R.N. Practical spectrophotometric standards. Clinical

Chemistry, v.15, n.9, p.839-863, 1969.

STRUFALDI, B. Obtenção de amostras; espectrofotometria;

controle de qualidade. Mcwill : São Paulo, 1981. P.50-133.

26
 Relação dos Boletins Técnicos já publicados

01 - Influência do comprimento da base de medida do extensômetro na

determinação do módulo de elasticidade de concreto. (Esgotado)
02 - Análise tensométrica, mecânica e química de esticadores e ganchos e
aço-carbono fundido, para tensores metálicos. (Esgotado).
03 - Considerações sobre inibição da pega de concreto em regiões em
contato com fôrmas de chapas de madeira compensada.
04 - Estudos de impacto ambiental.
05 - Arroz parboilizado: método para determinação de grãos não-
gelatinizados.
06 - Cromo em gelatina.
07 - Avaliação da emissão de fluoretos totais em plantas de fertilizantes.
08 - Determinação de quatzo em poeira respirável.
09 - Dias climáticos típicos para o projeto térmico de edificações em Porto
Alegre.
10 - Determinação de mercúrio em pescado por espectrofotometria de
absorção atômica - Técnica do vapor frio.
11 - Dosagem empírica de concreto.
12 - Determinação de resíduos de triadimenol por cromatografia gasosa.
13 - Método de seleção de áreas para aterros sanitários.
14 - Determinação de fluoreto em carvão com utilização de eletrodo íon-
seletivo.
15 - Grãos não-gelatinizados em arroz parboilizado, avaliação de métodos.
16 - Os institutos de pesquisa tecnológica estaduais na apropriação da
política nacional de C & T. O caso CIENTEC/RS. Uma síntese dos dados
e primeiras reflexões.
17 - Parboilização do arroz: parâmetro de encharcamento.
18 - O papel do estado no processo de desenvolvimento científico e
tecnológico.
19 - Cor na parboilização do arroz.
20 - Utilização do carvão e meio ambiente.
21 - Avaliação de metodologias para determinação de gorduras em produtos
formulados.
22 - Sistemas de monitoramento ambiental: conceitos básicos e proposta
para o geossistema.
23 - Metodologia para dimensionamento de pilares em minas de carvão do sul
do Brasil.
24 - Determinação de gorduras em rações: comparação de metodologias.
25 - Fissuras em Alvenarias: causas principais, medidas preventivas e técnica
de recuperação.
26 - Hidrodinâmica e transferência de massa em coluna de extração do tipo
Karr.
27 - Questão Ambiental e Incubação Tecnológica.
28 - Avaliação do Desempenho de Espectrofotômetro Ultravioleta e Visível.
 Tecnologia e inovação
na vanguarda do
desenvolvimento

Missão da CIENTEC
Promover o desenvolvimento da sociedade
através de ações em tecnologia industrial básica,
pesquisa e inovação tecnológicas.

Rua Washington Luiz, 675

CEP 90010-460 - Porto Alegre RS Brasil
tel (51) 3287.2000 fax (51) 3226-0207
e-mail [email protected]
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