Ciências Biológicas

Biologia Molecular

Vânia Marilande Ceccatto

Geografia

12

História

Educação
Física

Ciências Artes
Química Biológicas Plásticas Computação Física Matemática Pedagogia
 Ciências Biológicas

Biologia Molecular

Vânia Marilande Ceccatto

Geografia
2ª edição
Fortaleza - Ceará 9
12

História
2015

Educação
Física

Ciências Artes
Química Biológicas Plásticas Computação Física Matemática Pedagogia
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Bibliotecário

C387b Ceccato, Vânia Marilande

Biologia molecular / Vânia Marilande Ceccato. 2. ed.
Fortaleza : EdUECE, 2015.
139 p. : il . ; 20,0cm x 25,5cm . (Ciências Biológicas)
Inclui bibliografia.
ISBN: 978-85-7826-342-3
1. Biologia molecular. I. Ceccato, Vânia Marilande.
II. Título.
CDD 574.87

Editora da Universidade Estadual do Ceará – EdUECE

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 Sumário
Apresentação ......................................................................................... 5
Parte – Conhecendo o gene e o genoma ............................................ 7
Capítulo 1 – Considerações iniciais e histórico ................................. 9
1. Aspectos gerais .....................................................................................9
2. Breve histórico .................................................................................... 11
Capítulo 2 – Ácidos nucleicos............................................................ 14
1. Ácidos nucleicos .................................................................................14
Capítulo 3 – Núcleo eucariótico e cromossomos ............................ 18
1. Genes e genomas ...............................................................................21
Parte 2 – Mecanismos genéticos básicos ......................................... 33
Capítulo 4 – Considerações iniciais e histórico ............................... 35
1. Aspectos gerais ...................................................................................35
2. Breve histórico ....................................................................................36
Capítulo 5 – Mecanismos genéticos básicos ................................... 38
1. Replicação ..........................................................................................38
2. Transcrição .........................................................................................40
3. Tradução .............................................................................................46
Parte 3 – Polimorfismo gênico e evolução molecular ..................... 57
Capítulo 6 – Considerações iniciais e histórico ............................... 59
1. Aspectos gerais ...................................................................................59
2. Breve histórico ....................................................................................60
Capítulo 7 – Variação gênica .............................................................. 62
1. Bactérias, genes e plasmídeos ...........................................................62
2. Genomas extra nucleares: mitocôndrias e cloroplastos......................63
3. Polimorfismo e marcadores moleculares ............................................64
4. Alterações cromossômicas .................................................................66
5. O valor C em discussão ......................................................................67
6. Elementos de transposição .................................................................70
7. Mutações.............................................................................................72
8. Recombinação gênica ........................................................................76
Parte 4 – Expressão gênica ................................................................ 87
Capítulo 8 – Considerações iniciais e histórico ............................... 89
1. Aspectos gerais ...................................................................................89
2. Breve histórico ....................................................................................89
Capítulo 9 – Expressão gênica........................................................... 92
1. Expressão e regulação em procariotos ..............................................92
2. Cromatina celular e epigenética .........................................................95
3. Em eucariotos: regulação da transcrição ............................................97
4. Estabilidade do RNA como evento regulador .....................................99
5. O desenvolvimento e seu controle ....................................................100
Parte 5 – DNA recombinante ............................................................ 107
Capítulo 10 – Considerações iniciais e histórico ........................... 109
1. Aspectos gerais .................................................................................109
2. Breve histórico .................................................................................. 110
Capítulo 11 – Técnicas gerais .......................................................... 113
1. Técnicas associadas: eletroforese e enzimas de restrição ............... 113
Capítulo 12 – Plasmídios: vilões e heróis ....................................... 119
1. 1a Aplicação da técnica: bibliotecas genômicas e bibliotecas de cDNA.......122
2. 2a aplicação: transgenia ....................................................................123
Capítulo 13 – Reação em cadeia da polimerase:
a revolução dentro da revolução ..................................................... 126
1. Aplicação da técnica: fingerprint de DNA ..........................................129
Sobre a autora ................................................................................... 139
 Apresentação
Estamos envolvidos numa revolução científica iniciada no século XX. É cha-
mada de Revolução Biológic. Essa nova Biologia, segundo Waterman, T. H.
em “Revolution for biology”, 1962, sucedeu a era atômica, resultando numa
nova perspectiva humanística e ecológica. Essa revolução refere-se especial-
mente à integração das Ciências Biológicas com outras áreas e outros ramos
científicos, nunca antes ocorridos. Assim, surgiram os “novos biólogos”: bio-
químicos, biofísicos, bioestatísticos, biomatemáticos, bioinformatas, biólogos
moleculares, biósofos, bioéticistas.
Graças a técnicas espetaculares, alcançaram-se patamares nunca
sonhados nos estudos moleculares. Na área de saúde, temos vacinas, medi-
camentos, tratamentos, diagnósticos e, sobretudo, conhecimentos biológicos
básicos acumulados. As soluções práticas aplicadas envolvem um sem núme-
ro de técnicas: a transgenia, células tronco, clonagem, o DNA forense etc. Na
área gênica, em geral, nos regozijamos com avanços nas ômicas (incluindo a
genômica e outras). A genética molecular, de plantas, de animais, de micror-
ganismos, do ambiente e muitas outras áreas e subáreas tornam-se cada dia
mais fascinantes para os profissionais envolvidos e para o público em geral. Por
outro lado, ainda não faltam desafios. A vida humana (e, por conseguinte, toda
a vida) é frágil e problemática. Estamos num planeta em plena crise ambiental.
A cura para várias doenças como câncer (genericamente falando) e doenças
crônico-degenerativas, doenças genéticas e a própria terapia gênica, apesar
das perspectivas promissoras, ainda não avançou o esperado para este século.
Seria necessário esclarecer que a Biologia Molecular não se caracte-
riza como ciência em si própria, mas sim como ferramenta do profissional,
disponível para esclarecer, num determinado nível, suas perguntas. A Biologia
Molecular é sim, uma disciplina essencial, a qual se apropriou de várias outras
disciplinas e técnicas para formar seu corpo. Esse corpo de conhecimento é
praticamente ilimitado e, dessa forma, é difícil de ser definido. De uma forma
muito simplificada, chamaríamos a Bioquímica e a Genética para compor uma
base com n braços, da microbiologia, à imunologia, à citologia e muitas outras.
Buscamos uma abordagem mais atual possível para a disciplina. Assim, o
gene e o genoma estão sempre em evidência. As ações bioquímicas estão implí-
citas nos conceitos, portanto, a Bioquímica é visceral para o nosso entendimento.
Tenha sempre seu material de Bioquímica a mão para tirar dúvidas. Procure rever,
especialmente, macromoléculas em geral, especialmente a estrutura de proteí-
nas e mecanismo de ação das enzimas. Evidentemente não é possível a cober-
tura completa do conteúdo nem foi essa nossa pretensão, mas buscamos aqui
um guia que possa incrementar e direcionar seus estudos. Outra preocupação é
entender como os conhecimentos avançaram historicamente até o momento pre-
sente. Uma inspiradora frase de Carl Seagan diz que a Biologia está mais próxima
da História do que da Física. Dessa forma, só é possível compreender o avanço
da Biologia atual através do entendimento do passado.
Essa nova revolução também precisa de limites éticos, englobando pers-
pectivas filosóficas inéditas para o profissional de biologia. Com o genoma, inú-
meros questionamentos ainda não foram feitos, em termos de que chegará um
momento onde não sabemos como será resguardada a individualidade pessoal,
em razão das necessidades coletivas. No Brasil, a questão dos transgênicos é
de suma importância, sendo um dos países de maior produção de commodities
transgênicas do mundo. Células-tronco, DNA fingerprint, DNA ancient, questões
forenses, farmacogenômica, são assuntos de interesse da academia e também
do cidadão comum, mantendo um interesse contínuo pulsante na mídia.
O Brasil e o mundo precisam de biólogos e, mais que isso, de profissio-
nais esclarecidos, de excelência, compromissados e ruidosos. Bons estudos!

A autora
 Parte 1
Conhecendo o
gene e o genoma
 Capítulo 1
Considerações iniciais
e histórico

Objetivo
• Relacionar a estrutura dos ácidos nucléicos aos conceitos de gene e
genoma, além da integração destes à estrutura geral da célula.

1. Aspectos gerais
A sequência de DNA (Figura 1) é matéria prima para a evolução. Veja que
uma nova sequência inédita de DNA não aparece naturalmente sendo for-
mada na célula. Não surgem sequências randômicas novas, nenhum gene é
totalmente novo. O DNA só surge a partir de outro
molde (fita simples) de DNA predecessor. Então, sbarer
de onde vêm as inovações? Na manutenção e na (
cópia da informação genética, ocorrem acidentes T.G,G,A)
e erros aleatórios, alterando a sequência original
dos nucleotídeos, criando mutações. Na divisão
celular, essas mutações são passadas para a pró-
xima geração de células. Numa competição com
recursos limitados, é possível que estes mutantes
sejam eliminados. Em raras condições ambientais
especiais, esses mutantes podem permanecer,
mantendo estas mutações e mais raramente ain-
da, podem ter uma vantagem evolutiva. Essas ten-
tativas e erros aleatórios geram diversidade, que
possibilita a manutenção das espécies.

Figura 1 - Modelo simplificado da dupla fita de DNA. Os

bastões mostram os pares de bases e as fitas mostram
o esqueleto açúcar fosfato das duas fitas antiparalelas.
As medidas são mostradas em Angstrons (1Ǻ = 0,1 nm).
Fonte: Griffiths et al. (1999).
10 CECCATTO, V. M.

As células procarióticas (células que não apresentam um núcleo dis-

tinto) possuem, em geral, um cromossomo formando um círculo fechado. A
Evolução: fenômeno bactéria Escherichia coli é um organismo modelo para o estudo bioquímico e
biológico de diversificação considera-se também como modelo procarioto em geral. Como eubactéria,
genética, idealmente
em formato de bastão, vivendo no intestino humano e de outros vertebrados,
medida pela especiação.
Está intimamente ligado à pode crescer e reproduzir-se facilmente num meio simples com nutrientes,
frequência dos alelos nas em placa de cultura. E. coli luta em condições químicas variáveis. Sua única
populações. molécula circular de DNA (tirando os plasmídeos) possui cerca de 4.639.221
Mutações: alterações pares de bases (linhagem k12), codificando cerca de 4.300 tipos diferentes de
permanentes e
transmissíveis na
proteínas. Temos mais conhecimento sobre a E. coli do que sobre qualquer
sequência ou composição outro organismo vivo.
de DNA ou de um As complexas células eucarióticas possuem genomas maiores, for-
cromossomo.
mando organismos multicelulares, com células diferenciadas e altamente
Transcrição reversa:
produção de DNA a especializadas, as quais expressam diferentes conjuntos de RNA e de pro-
partir de fita simples teínas. Assim, o hepatócito é uma célula especializada com um conjunto
de RNA, feito pela único de genes expressos diferencialmente. Adipócitos, osteoblastos, eritró-
enzima transcriptase citos, células epidérmicas, a princípio, parecem muito diferentes morfologi-
reversa. A técnica de
laboratório que envolve camente. Entretanto seu genoma é igual ao das outras células do organis-
a transcrição reversa é a mo. A sua posição na estrutura multicelular é espantosamente bem regulada,
produção de cDNAs (DNA coordenada não somente com as células vizinhas, mas em harmonia com
complementar). sua idade, estado ambiental em que se encontra e funções a qual se desti-
No contexto usado no
na, desde seu desenvolvimento embrionário. A assustadora complexidade
texto, modelo biológico é eucariótica, tanto genética quanto fisiológica, exige o uso de modelo biológi-
um organismo estudado co, como a levedura Saccharomyces cerevisiae, serve como modelo euca-
extensivamente, gerando rótico mínimo. S. cerevisiae é um fungo unicelular e cresce quase como uma
dados que podem
bactéria, com toda complexidade de um eucarioto. Arabidopsis thaliana é
ser extrapolados pra
outros organismos, um pequeno arbusto escolhido pelos biólogos como planta-modelo. Para as
geralmente para o mesmo células animais, o verme nematódeo Caenorhabditis elegans, a mosca das
grupo caracterizado frutas, Drosophila melanogaster, o rato Mus musculus, o camundongo Rattus
taxonomicamente, ou norvegicus (Figura 2) são a escolha ideal para a pesquisa. Todos possuem
servindo para explicar
processos bioquímicos genoma conhecido.
universais. São
organismos que possuem
linhagens homogêneas,
geneticamente bem
conhecidas, de fácil
cruzamento, produtoras de
alta prole, de facilidade de Figura 2 - Rato (Rattus norvegicus var. albino) caminhando em
manuseio e manutenção sistema experimental de comportamento.
barata. Fonte: http://www.unicamp.br/unicamp/unicamp_hoje/ju/agosto2004/imagens/
260pag5e.jpg
 Biologia Molecular 11

O genoma eucariótico, por sua vez, contém DNA não codificante, que,
dependendo do organismo, pode ocorrer na ordem de milhares de vezes mais
abundante que o genoma procarioto. Cerca de 98% do genoma humano (11%
em E. coli) é não codificante. Possui cerca de 3,5 bilhões de pares de bases,
cerca de mil vezes mais nucleotídeos que o de E. coli. É possível, aliás, muito
provável, que muito desse DNA não codificante possua funções regulatórias,
além de outras, desconhecidas, a serem descobertas nos próximos anos.
O produto do gene é o RNA e de forma mais direta: a proteína. A síntese
proteica não é dirigida pelo genoma diretamente, mas utiliza o RNA como in-
termediário molecular durante o processo chamado de transcrição. Na trans-
crição, uma das fitas do DNA serve como molde para que a enzima polime-
rizadora (RNA polimerase) produza a fita simples de RNA. Os vários RNAs
serão, então, usados na tradução ou síntese proteica. Esse princípio funda-
mental foi chamado de “dogma central” da Genética ou da Biologia Molecular.
O conceito de “dogma” ainda pode ser usado com reservas, pois muitas des-
cobertas posteriores têm desafiado essa fundamentação, como a transcrição
reversa. Esses conceitos serão revistos na Unidade 2.

2. Breve histórico
Apesar da estrutura clássica Watson-Crick do DNA ser conhecida desde
1953, os primeiros passos para tornar possível esse conhecimento foram ge-
rados cerca de um século e meio antes, com os trabalhos de Mendel. Os
genes, em 1865, seriam chamados de “fatores particulados”. Esses “fatores”
passariam, sem serem modificados, do progenitor para a progênie. Em 1903,
os cromossomos são visíveis nos microscópios da época e são reconhecidos
como unidades hereditárias, vistas na divisão celular. Nos organismos diploi-
des, que possuem dois conjuntos de cromossomos, uma cópia é herdada de
cada progenitor. Dessa forma, os genes também seriam transmitidos para a
próxima geração. Na década seguinte observou-se que os genes estão nos
cromossomos e que o cromossomo contém arranjos lineares de genes.
De que forma isto aconteceu? Uma objeção séria ao trabalho de Mendel
era a ausência de fatos concretos sobre o comportamento dos cromossomos
nas fases mitótica e meiótica. Quando as Leis de Mendel foram redescobertas,
em 1900, esses fatos já haviam sido confirmados, sendo utilizados, em 1903,
por Walter S. Sutton, biólogo americano. Em seu trabalho, considerado clás-
sico: “The Chromosomes in Heredity” - Os Cromossomos na Hereditariedade
(publicado no periódico Biological Bulletin, n.4). Sutton destacou a informação
de que o conjunto cromossômico é diploide e que, durante a meiose, cada
gameta recebe apenas um cromossomo de cada par de homólogos. Dessa
forma, os dados de Mendel podiam ser explicados concretamente; o gene
12 CECCATTO, V. M.

fazia parte do cromossomo. O artigo de Sutton possibilitou a reunião de con-

ceitos que, na época, pareciam independentes, mas sabemos que hoje estão
intrinsecamente ligados.
Quase na mesma época, em 1915, Thomas Hunt Morgan e seus alu-
nos Alfred H. Sturtevant, Hermann J. Muller e Calvin B. Bridges, chamados
de o “Grupo da Columbia University”, publicaram o livro The Mechanism of
Mendelian Heredity - O Mecanismo da Herança Mendeliana, em que são re-
latadas, pela primeira vez, as bases cromossômicas da hereditariedade. Esse
grupo designou localizações para mais de 85 genes mutantes em Drosophila.
Os genes nos cromossomos foram localizados de forma estruturalmente line-
ar, nunca ramificada. As distâncias relativas foram calculadas com bases em
frequências obtidas em cruzamentos. As distâncias são medidas em unidades
de mapa ou centimorgans. Pela primeira vez, um mapa genético foi feito.
A definição do DNA ficou, durante um tempo, “oculta” num assim chama-
do “princípio ou agente transformante” caracterizado através de um experimento
aparentemente inexplicável, efetuado pelo microbiologista inglês Frederick Griffith,
em 1928, trabalhando com duas linhagens de Streptococcus pneumoniae, as bac-
térias causadoras da pneumonia. Uma dessas linhagens era virulenta e outra, não
virulenta. A linhagem não virulenta tornava-se virulenta (patogênica) quando era
misturada a um extrato de bactérias virulentas mortas pelo calor. A informação
genética da bactéria virulenta morta era lançada ao meio e atravessava a parede
celular, incorporando-se ao genoma da bactéria não virulenta, transformando-a.
Naquela época, os pesquisadores acreditavam que os genes (melhor dizendo, o
“princípio transformante”) eram proteínas.
Qual a surpresa quando os biólogos Owald Theodore Avery, Colin
Munro MacLeod e Maclyn McCarthy mostraram que, após purificarem o mes-
mo extrato de bactérias virulentas mortas pelo calor, esse princípio era des-
truído pela enzima desoxirribonuclease, que degrada as moléculas de DNA.
Uma das ideias mais sensatas postuladas para o conceito de gene foi
postulada por Archibald Edwardt Garrod em 1909, de que os genes afetavam
a síntese de enzimas. Na época, os geneticistas mendelianos trabalhavam
com organismos eucarióticos como milho, camundongo e Drosophila, inade-
quados para caracterizar a relação gene − proteína. Micro-organismos são
organismos mais adequados para esse trabalho. Pesquisas com Neurospora,
efetuadas por George W. Beadle e Edward Tatum, em 1940, geraram evidên-
cias fortes que sustentavam essa antiga hipótese: um gene – uma enzima.
Essa evidência levou à hipótese um gene – uma proteína (mais adequado:
um gene – um polipeptídio). A definição funcional que utilizamos no dia a dia,
considera o gene como sequência de DNA que é capaz de produzir uma (ou
mais de uma) cadeia polipeptídica, ou um RNA.
 Biologia Molecular 13

Texto complementar
A Lei Nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, chamada "Lei Arouca" regulamenta o uso de
animais em pesquisa no Brasil. De acordo com a lei:
“Art. 1° A criação e a utilização de animais em atividades de ensino e pesquisa científica,
em todo o território nacional, obedecem aos critérios estabelecidos nesta Lei.
§ 1° A utilização de animais em atividades educacionais fica restrita a:
I – estabelecimentos de ensino superior;
II – estabelecimentos de educação profissional técnica de nível médio da área biomédica.
§ 2° São consideradas como atividades de pesquisa científica todas aquelas relacionadas
com ciência básica, ciência aplicada, desenvolvimento tecnológico, produção e controle
da qualidade de drogas, medicamentos, alimentos, imunobiológicos, instrumentos, ou
quaisquer outros testados em animais, conforme definido em regulamento próprio.
§ 3° Não são consideradas como atividades de pesquisa as práticas zootécnicas relaciona-
das à agropecuária.
Art. 2° O disposto nesta Lei aplica-se aos animais das espécies classificadas como filo Chor-
data, subfilo Vertebrata, observada a legislação ambiental.”
A Lei também cria o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CON-
CEA, ao qual compete:
“I – formular e zelar pelo cumprimento das normas relativas à utilização humanitária de
animais com finalidade de ensino e pesquisa científica;
II – credenciar instituições para criação ou utilização de animais em ensino e pesquisa
científica;
III – monitorar e avaliar a introdução de técnicas alternativas que substituam a utilização
de animais em ensino e pesquisa;
IV – estabelecer e rever, periodicamente, as normas para uso e cuidados com animais
para ensino e pesquisa, em consonância com as convenções internacionais das quais o
Brasil seja signatário;
V – estabelecer e rever, periodicamente, normas técnicas para instalação e funcionamen-
to de centros de criação, de biotérios e de laboratórios de experimentação animal, bem
como sobre as condições de trabalho em tais instalações;
VI – estabelecer e rever, periodicamente, normas para credenciamento de instituições
que criem ou utilizem animais para ensino e pesquisa;
VII – manter cadastro atualizado dos procedimentos de ensino e pesquisa realizados ou
em andamento no País, assim como dos pesquisadores, a partir de informações remeti-
das pelas Comissões de Ética no Uso de Animais - CEUAs, de que trata o art. 8o desta Lei;
VIII – apreciar e decidir recursos interpostos contra decisões das CEUAs;
IX – elaborar e submeter ao Ministro de Estado da Ciência e Tecnologia, para aprovação,
o seu regimento interno;
X – assessorar o Poder Executivo a respeito das atividades de ensino e pesquisa tratadas
nesta Lei.”
Conheça a Comissão de Ética para o Uso de Animais - CEUA/UECE no site: http://www.
uece.br/ceua.
Fonte: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/l11794.htm
 Capítulo 2
Ácidos nucleicos
forfato
baze
nitrog

.
Auto complementação:

.
ligação entre pares de pentore
bases nitrogenadas
ederorinribore
complementares, sempre de 1. Ácidos nucleicos bribore
fita simples.
Esteroquímica: ramo da 1.1 O DNA é um polidesoxiribonucleotídeo
Química que estuda as
relações espaciais entre os
Ácidos nucleicos (DNA e RNA), as proteínas e os polissacarídeos são po-
átomos de uma molécula. límeros produzidos pela adição repetitiva de subunidades monoméricas
Tautômero: isômeros (monômeros) a uma das extremidades da cadeia em crescimento. A base
ocorrem quando duas molecular do DNA é o nucleotídeo, mais precisamente um desoxirribonu-
ou mais substâncias
apresentam fórmulas
cleotídeo. O nucleotídeo consiste em uma 2'-desoxirribose ladeada pelo
moleculares idênticas, lado direito (carbono 1') por uma base nitrogenada e do lado esquerdo (car-
mas que diferem em suas bono 5'), por um grupo fosfato. A primeira ligação é chamada N-glicosídica,
fórmulas estruturais. A e a segunda, 5'-fosfo-monoéster. A ligação fosfodiéster consiste no grupo
tautomeria é um caso
particular de isomeria
fosforil entre dois nucleotídeos adjacentes. O esqueleto de cada fita consiste
funcional, em que dois em resíduos alternados de açúcar e fosfato, projetando-se para fora como
isômeros ficam em equilíbrio o corrimão da dupla fita. Os degraus da escada são as bases nitrogenadas
químico dinâmico. ligadas por pontes de hidrogênio (Figura 3). A sequência de bases nitrogena-
Ribozima: são moléculas de
RNA, que funcionam através
das é irregular, caracterizando a informação genética, em evolução a alguns
de sua ligação à outra milhões de anos. O conjunto completo, haploide ou diploide, é chamado
molécula de RNA alvo e, via genoma. A revelação da estrutura da dupla hélice complementar de Watson
complementação, fazem e Crick mostrou que o DNA é uma estrutura simples em termos moleculares,
um corte específico na
ponte fosfodiéster. A reação
guardando, em duas fitas, a informação genética, de tal forma que qualquer
de auto-splicing ocorre por alteração pode ser corrigida a qualquer tempo.
uma transesterificação,
realizadas pelos introns do
tipo I. O conceito pode ser
aplicado aos tipos de RNA
que apresentam atividade na
tradução, como o RNAt.
 Biologia Molecular 15

Existem dois tipos de

bases no DNA: purinas e
pirimidinas (Figura 4). As
purinas são a adenina e a
guanina, e as pirimidinas
são citosina e timina. As ba-
ses púricas estão ligadas à
desoxirribose pela ligação
glicosídica no nitrogênio 1 e
as pirimídicas pelo N9. As
bases apresentam dois es-
tados tautoméricos alterna-
tivos, em equilíbrio entre si.
Essa capacidade de formar
tautômeros alternativos é
uma frequente origem de
erros durante a síntese do
DNA, conforme será visto
posteriormente no conceito Figura 3 – (a) Modelo bola e bastão da dupla fita do
“mutações” (veja item 7,7 - DNA e (b) modelo químico. O AZT (azido, 2', 3'-
mutações). Fonte: Griffiths et al. (1999). didesoxitimidina) é
um fármaco usado na
terapia contra o retrovírus
responsável pela
imunodeficiência humana.
Na célula infectada, o RNA
é copiado em DNA por
uma transcriptase reversa,
que é passível de erros
por não apresentar as
capacidades de revisão
da DNA polimerase III.
O AZT é azido-TTP, um
análogo ao trifosfato de
timidina, o dTTP (um dos
desoxirribonucleotídeos
incorporados ao DNA, além
do dATP, dCTP e dGTP).
A enzima transcriptase
reversa incorpora o azido-
TTP em lugar do dTTP,
bloqueando a transcrição
reversa porque o grupo
Figura 4 - Estrutura química dos quatro desoxiribonucleotídeos principais, blocos fun- 3'azido não pode formar uma
damentais do DNA. ligação fosfodiéster com
Fonte: Griffiths et al. (1999). os nuclesídeos trifosfatos
subsequentes.
16 CECCATTO, V. M.

A dupla hélice compõe-se de duas fitas ou cadeias polinucleotídicas

mantidas unidas pelas ligações não covalentes fracas entre os pares de
bases nitrogenadas. A adenina sempre se liga a uma timina e vice-versa,
e a guanina sempre com uma citosina e vice-versa. A polaridade estrutural
de uma fita é oposta à da outra fita, portanto, uma encontra-se na direção
3' → 5' e a outra, 5' → 3', de acordo com os carbonos da ribose. Assim, se
um lado apresenta 5' – AGCTCA – 3' a sua correspondente complementar e
oposta é 3' – TCGAGT – 5'. Formam-se três pontes de Hidrogênio entre CG
e duas entre AT. Os pares de bases formam pilhas entre os dois esqueletos
açúcar-fosfato. As interações de empilhamento e as pontes de hidrogênio
estabilizam estereoquimicamente a dupla fita.
O deslocamento de bases permite que uma base seja deslocada para
fora da fita dupla, sendo que as enzimas responsáveis pelo reparo do DNA, ou
metiladoras, atuam sobre uma base numa configuração extra helicoidal, per-
mitindo o encaixe dessa base na cavidade catalítica da enzima (veja figura7).
Algumas características da dupla fita incluem um empilhamento heli-
coidal de cerca de 10 pares de bases correspondentes a uma volta completa
ao redor da hélice. Como resultado, torna-se um longo polímero estendido,
formando duas cavidades ou sulcos laterais, uma maior e outra menor. Essa
propriedade tem um caráter fisiológico importantíssimo. As cavidades guar-
dam as extremidades de cada par de base, apresentando um padrão este-
reoquímico de doadores e receptores de pontes de hidrogênio, que é reflexo
da sequência de pares de bases interna. Esse mecanismo de decodificação
é reconhecido pelas cadeias laterais dos aminoácidos das enzimas metabo-
lizadoras do DNA, reconhecendo e ligando a sequências de DNA específica,
sem que seja necessário abrir a dupla fita.

1.2 O RNA é um oligoribonucleotídeo

O RNA, que possui fita simples, estruturalmente, é quimicamente muito pare-
cido com o DNA. Entretanto, possui características próprias distintas, graças à
sua capacidade de se dobrar e formar diferentes estruturas terciárias. Alguns
RNAs são enzimas, trabalhando ativamente na produção de proteínas.
O RNA é composto por nucleotídeos, porém com uma ribose contendo
uma hidroxila na posição 2'. A base nitrogenada timina é substituída por uraci-
la. Outro ponto essencial é que ele possui fita simples. O RNA é um interme-
diário entre a informação genética do DNA e a síntese protéica, como RNAm.
O RNA é estrutural quando na composição do ribossomo – RNAr e desem-
penha papel enzimático como RNA transportador – RNAt entre outros papéis
relevantes. Ainda, pode ser considerado molécula reguladora da expressão
gênica, chamado interferente ou silenciador da transcrição e da tradução.
 Biologia Molecular 17

Embora o RNA seja fita simples, ele exibe com frequência muitas re-
giões de dupla hélice, formando auto complementação em várias regiões,
formando grampos, laços ou estruturas as mais complexas, como se vê na
formação do ribossomo. Uma característica do RNA que o capacita a formar
duplas hélices é um pareamento de bases adicional que não é do tipo Watson-
Crick (tipo comum). É o par de bases G:U, com duas pontes de hidrogênio.
Lembre-se de que a dupla fita de RNA é bastante diferente da hélice dupla
regular e extensa do DNA. Dessa forma, o RNA pode formar grande variedade
de estruturas terciárias, com alta complexidade. Essas diferentes conforma-
ções ocorrem, especialmente, pela liberdade de rotação no esqueleto de suas
regiões não-pareadas. Proteínas auxiliam a formação de estruturas terciárias
compostas por grandes moléculas de RNA, como as encontradas nos ribos-
somos. Estas proteínas revestem as cargas negativas dos esqueletos de fos-
fato, cujas cargas repulsivas desestabilizam a estrutura.
Funcionando como enzima clássica, contendo sítio ativo, sítio de ligação
para o substrato e sítio ativo para ligação com co fator, o RNA enzimático é
conhecido como ribozima. Uma das mais conhecidas é a RNAse P, envolvida
nas modificações pós-transcricionais do RNAt, a partir de longos RNAt precur- exónlintrónterón
sores. Esta é composta por RNA e proteínas. Somente a parte composta por drølicing
RNA participa da catálise. A enzima cobre cargas negativas do RNA, possibili-
tando que ele possa se ligar ao seu substrato (RNAt) negativamente carregado.
nézonlezón
Outros RNAs podem remover introns, de precursores de alguns mRNAs, tRNAs
e RNAs ribossômicos, no processamento do RNA ou RNAo splicing.
O fato do RNA ser capaz de processos catalíticos inspirou a possibilida-
de de que, num mundo primitivo, o RNA poderia ter atuado tanto como mate-
rial genético e como maquinaria enzimática. Ele teria surgido antes que o DNA
e possivelmente ter dado origem a este. O DNA, dessa forma, teria se liberado
para o armazenamento da informação genética. A ribozima, como molécula
catalítica, poderia ser considerada uma relíquia evolutiva de um mundo prime-
vo, onde o RNA teria um papel preponderante. As proteínas, mais diversas,
teriam se especializado posteriormente na sua função catalítica.
Símbolos usados em
genética molecular e
citogenética humana:
Capítulo 3
Núcleo eucariótico e
Grupos cromossômicos:
A-G, segundo os seguintes
critérios citológicos: Grupo
A (cromossomos 1 a 3)
grandes cromossomos
aproximadamente
cromossomos
centroméricos, Grupo
B (cromossomos 4 e 5)
grandes cromossomos com
centrômeros submedianos Para compreender o conceito de gene, torna-se necessário inicialmente com-
(ou sub-metacêntricos), preender a estrutura física do cromossomo e, em consequência, do núcleo
Grupo C (cromossomos 6
eucariótico ou da célula procariótica onde se insere. Portanto, o DNA está
a 12 e o cromossomo X)
cromossomos de tamanho sempre organizado como cromossomo. Experimentos mostraram que algu-
médio com centrômeros mas estruturas do cromossomo, na verdade, são determinadas sequências
submedianos (ou sub- de DNA em pontos localizados, são essenciais para a manutenção deste. São
metacêntricos), Grupo D
elas: telômeros, centrômeros e origens de replicação.
(cromossomos 13 a 15)
cromossomos de tamanho As condições do DNA no núcleo eucariótico são muito importantes para
médio acrocêntricos. facilitar a expressão do gene. Imagine o DNA como a informação contida nos
Cromossomo 13 possui um
livros de sua biblioteca. Livros não usados, geralmente, ficam empacotados
proeminente satélite no seu
braço curto. Cromossomo e localizados em condições mais difíceis de acessibilidade, enquanto que os
14 possui um pequeno livros muito usados ficam pelas mesas, abertos e prontos para serem lidos. À
satélite no seu braço curto. medida que a informação é requerida e maior é a demanda, desespiralizam-
Grupo E (cromossomos
-se as várias fibras de cromatina, possibilitando a sua leitura.
16 a 18) cromossomos
curtos com centrômeros O termo cromatina foi cunhado como termo genérico, usado pelos pri-
medianos ou submedianos meiros microscopistas (cromo = cor; tina = substância) para definir o conte-
(ou metacêntricos ou
údo do núcleo eucariótico. Alguns textos científicos referem-se às fibras de
submetacêntricos). Grupo
F (cromossomos 19 e 20) cromatina para designar partes do cromossomo que estão condensadas, em
cromossomos curtos com diferentes graus de empacotamento. De certa forma, pode-se dizer que a cro-
centrômeros metacêntricos, matina é a substância amorfa que preenche o núcleo interfásico (que não está
Grupo G (cromossomos
em divisão). Nessa fase, a célula passa por intenso metabolismo de produção
21, 22 e o Y) cromossomos
muito curtos acrocêntricos de proteínas e prepara-se para a divisão celular, replicando o seu DNA.
números de cromossomos De que forma o DNA é empacotado nos núcleos eucarióticos? As histo-
autossomos 1 – 22,
nas são subunidades proteicas usadas para empacotar o DNA. São proteínas
cromossomos sexuais: X
e Y, braço mais curto do altamente conservadas evolutivamente e carregadas positivamente, ligando-
cromossomo p, braço mais -se ao DNA por interações iônicas.
longo do cromossomo q.
O DNA faz duas voltas em torno de um octâmero de histonas. Esse
octâmero é formado pelas histonas H2A, H2B, H3 e H4, duas cópias cada. A
histona H1 ancora o DNA em torno desse arranjo. Esse conjunto é conhecido
 Biologia Molecular 19

como nucleossomo (Figura 5). Cada nucleossomo é ligado a outro por uma
curta ligação de DNA nu, chamada de DNA ligador. Portanto, o conjunto de
nucleossomos aparece como contas em um colar (… – o – o – o – o – ...).
Essa configuração é identificada como cromômero. Dessa forma, o DNA eu-
cariótico encontra-se em um estado estável como polinucleotídeo complexa-
do com proteínas. O estado de contas no colar envolve então que o nucle-
ossomo é a unidade de compactação do DNA. A partir desse estado, então,
ocorre empacotamentos cada vez maiores.
Cromatina: complexo de
DNA e proteínas histonas.
Conteúdo genérico do
núcleo interfásico.
Nucleossomo: unidade
estrutural da compactação
da cromatina, consistindo
em duas voltas de fita de
DNA ao redor do octâmero
de histonas.
Regiões funcionais do
cromossomo: O centrômero
é uma região constrita do
cromossomo envolvida na
união das cromátides-irmãs.
Nele ocorre o cinetócoro,
uma reunião de proteínas
Figura 5 - Estrutura e arranjo dos nucleossomos com o DNA. específicas em que se ligam
Fonte: Griffiths et al. (1999). os microtúbulos do fuso
mitótico, na divisão celular.
Os telômeros correspondem
A cromatina, dessa forma, pode ser considerada um estado dinâmico às extremidades dos
do núcleo eucariótico. A heterocromatina é um estado de permanente con- cromossomos. A origem de
densação. Sabe-se que a heterocromatina é composta essencialmente de replicação é uma sequência
específica na qual se inicia
material não codificante, e sua inatividade transcricional é devida à sua alta
a replicação do DNA. Um
condensação. Da mesma forma, a eucromatina é a porção mais descon- característica importante
densada disponível para a leitura. Note que o conceito de cromatina e essas dessas sequências é
subdivisões são meio genéricas, facilmente aplicáveis, visíveis ao microscó- que são formadas por
sequências repetitivas em
pio eletrônico, ao núcleo interfásico. Entretanto, à medida que os cromosso-
tandem, não codificantes,
mos se dividem e se espiralizam em direção à divisão celular, as fibras de que, entretanto, são cruciais
cromatina se espiralizam formando estruturas cada vez mais condensadas e para o funcionamento do
indisponíveis, de forma geral, para a transcrição. O máximo de condensação cromossomo. Veja também:
em tandem.
dos cromossomos corresponde ao cromossomo metafásico.
Continua...
20 CECCATTO, V. M.

...Continuação
Interação DNA-histonas:
o nucleossomo forma
uma estrutura dinâmica,
permitindo um acesso
intermitente das proteínas
que se ligam ao DNA.
Portanto, o DNA envolvido
com o nucleossomo
não sofre qualquer
dificuldade em ser
replicado ou ser transcrito,
graças à remodelação
do nucleossomo.
Nucleossomos são formados
imediatamente à replicação,
deixando o DNA sempre
empacotado. Figura 6 - Cromatina interfásica em embrião de rato, mostrando, em A: as setas indi-
Sequências em tandem: cam os locais onde a cromatina está mais concentrada próximo ao envelope nuclear.
referem-se especialmente Em B: diferente tonalização. O círculo mais claro (parte superior) é o nucléolo.
a sequências repetitivas, Fonte: Ahmed et al. (2010).
as repetições ficam lado
a lado, como vagões num
trem, às vezes, com uma
pequena sequência variável
comunicante.

Acetiltransferases
(Figura 7) são enzimas
que catalisam a adição de
grupos acetil a grupos lisina
das regiões N-terminais
(“caudas”) das histonas.
Desacetilases são enzimas
que removem estas adições.
A acetilação está ligada
à alta taxa de transcrição
dessas regiões do DNA
e, da mesma forma, as
histonas desacetiladas, com
áreas reprimidas do DNA. A
metilação (feita por enzimas
metiltransferases) deixa a
cauda das histonas ligada
mais fortemente ao DNA. As
modificações nas caudas
das histonas originam sítios
de ligação para enzimas
que fazem modificações na Figura 7 - Estrutura de uma DNA metilase ligada a um oligonucleotídeo mostrando a
cromatina. base a ser metilada.
Fonte: Berg et al. (1999).
 Biologia Molecular 21

1. Genes e genomas Splicing: processo de retirada

dos íntrons e união dos éxons,
1.1 Estrutura do gene efetuado por snRNPs (“small
nuclear ribonucleoproteins”)
Uma definição funcional para o gene poderia ser : região do DNA transcrita proteínas nucleares
como uma única unidade de transcrição, carregando informações sobre uma complexadas com RNA.
característica hereditária particular, correspondendo a uma única proteína (ou Colinearidade:
cadeias polipeptídicas relacionadas) ou a um único RNA (ou RNAs relaciona- correspondência linear entre
o gene e sua respectiva
dos). Essa definição é essencial para o entendimento prático do gene, mas proteína.
existem outras, mais recentes. Tm – Temperatura de
Os genes eucarióticos não têm a mesma estrutura dos genes procari- fusão (“m” de “melting”) é o
ponto médio do intervalo de
óticos. Veja na transcrição do gene que o RNAm precursor, ou transcrito pri- temperatura no qual o DNA é
mário, resultante da transcrição pela enzima RNA polimerase, possui a mes- desnaturado.
ma sequência do gene que o originou. Entretanto, isso não é verdade para Genes housekeeping:
os genes eucarióticos, os quais são genes interrompidos, ou seja, possuem são genes que codificam
proteínas de funções
sequências que interrompem a sequência pressuposta da proteína. Dessa metabólicas que ocorrem em
forma, os introns são essas sequências intervenientes, não codificantes, as todas as células.
quais são removidas no processamento ou splicing do RNA. Os exons cor-
As ômicas correspondem
respondem às sequências codificantes, que serão unidas no splicing, forman- a processos e técnicas
do um RNAm maduro (alguns chamam transcrito secundário) pronto para ser moleculares que envolvem
traduzido em proteína no citoplasma. Por definição, o gene começa e termina grande quantidade de
em exons, iniciando pela extremidade 5' e terminando na 3'. Após o splicing os informação como a
genômica. Surgiram
exons são sempre unidos na mesma ordem em que se encontra no DNA, de na sua continuidade,
forma que existe colinearidade entre o gene e a sua proteína. É importante a transcriptômica, a
lembrar que nem todos os genes eucarióticos são interrompidos e, por outro proteômica, a metabolômica
lado, nem todos os procariotos estão livres de introns. Nos eucariotos superio- e outras ômicas como a
peptidômica, a imunolômica.
res, a maioria dos genes são interrompidos, os introns são geralmente muito O sufixo "oma" - "conjunto
mais longos do que os exons. Portanto, a sequência do gene é muito maior de" - corresponderia
que a da proteína que codifica. ao conjunto de dados,
constituindo um banco de
A complementaridade entre fitas de DNA é determinada pelo pareamen- dados produzido (como
to Watson-Crick das bases AT e CG. Sequências distintas de DNA são ditas "genoma"), enquanto que
similares quando compartilham uma determinada proporção de pb (pares de "omica" seria a técnica em
bases) em comum. Caso a similaridade seja considerável, é possível que as si (como “genômica”). As
ômicas caracterizam-se por
sequências similares sejam homólogas, na qual se subentende que existe uma serem um corpo maciço
ancestralidade comum para as sequências estudadas. A separação das duas de informações obtidas
fitas complementares é chamada de desnaturação (de forma análoga ao visto através de técnicas rápidas
em proteínas). Essa desnaturação ocorre quando há quebra das pontes de hi- e automatizadas, de alto
rendimento. Acrescentam-se
drogênio entre as bases, através do aumento de temperatura. A temperatura de ferramentas computacionais
fusão (Tm) − lembre que fusão, neste caso, refere-se à separação de molécu- (bioinformática) que
las, como na água − é a temperatura média em que duas fitas de DNA se des- permitam integração,
naturam, a qual é dependente de sua composição GC. Uma temperatura típica comparação de dados e
anotação biológica.
de fusão é em torno dos 87oC em genomas de mamíferos. A renaturação é o
22 CECCATTO, V. M.

processo contrário à desnaturação. Quando estão envolvidos ácidos nucleicos

com origens diferentes, a renaturação é chamada de hibridização.
Sequências regulatórias aparecem no DNA, produzindo proteínas re-
gulatórias ou se ligando a elas. Possuem função de regular a expressão de
genes estruturais. O gene estrutural é aquele que tem um correspondente
no RNAm maduro (que já passou por splicing). O gene estrutural pode ser
definido como produtor de um RNAm intermediário de uma proteína. Genes
chamados de constitutivos têm uma expressão constante (também chama-
dos genes “housekeeping” – ou mantenedores da casa (veja Unidade 4).
As sequências de DNA podem ser encontradas em diversos tipos de
complexidade. O DNA não repetitivo inclui as sequências únicas do genoma,
codificantes. No DNA repetitivo, estão presentes em duas ou mais cópias, não
codificantes, compondo-se de várias frações: moderadamente e altamente re-
petitivo. Compõe-se de famílias de sequências relacionadas, não necessaria-
A anemia falciforme mente idênticas. O genoma de procariotos em geral, compõe-se apenas de
consiste numa patologia DNA não repetitivo. Nos eucariotos inferiores, temos que o DNA, em sua maior
que, em condições de parte, é não repetitivo. Em células animais e eucariotos, a porcentagem das
baixa tensão de oxigênio,
a cadeia β da hemoglobina
frações repetitivas varia, mas ocupa uma grande parte do genoma. Portanto,
A, a principal forma da genomas grandes apresentam altas quantidades de DNA repetitivo. O DNA mo-
hemoglobina no adulto, deradamente repetitivo está disperso por todo o genoma, geralmente na forma
produz uma proteína de sequências relativamente curtas. O DNA altamente repetitivo forma agrupa-
de estrutura alterada e,
consequentemente, altera
mentos. A repetição em tandem de uma sequência curta pode criar uma fração
significativamente sua do DNA com características específicas, geralmente com uma composição de
função. A alteração de bases única, características que são usadas para isolar essas frações. Esse
um único aminoácido faz DNA é chamado de DNA satélite, pelo fato de ficar separado do resto por ter
com que a proteína se
polimerize como um bastão,
densidade diferenciada. Um excelente exemplo de sequência repetitiva são as
resultando em deformação sequências Alu (veja Unidade 3). Essas sequências são exemplos de SINES
da hemácia. A mutação (Short Interspersed Elements), ou repetições curtas. Temos também as sequen-
que produz essa alteração cias LINES (Long Interspersed Elements) ou repetições longas.
é uma única alteração
em um nucleotídeo, As sequências repetitivas e o DNA satélite são encontrados na heterocro-
alterando o códon para matina. Em mamíferos, são comuns sequências que lembram satélites, forma-
glutamato → valina. Essa das por repetições em tandem de uma unidade curta, mas que tem um tamanho
mutação é chamada de
não conservativa, pois o
total mais curto, consistindo, por exemplo, de 5-50 pb, com extenso polimorfis-
novo aminoácido contém mo entre indivíduos. Essas sequências são chamadas de minisatélite ou regi-
características químicas ões VNTR (número variável de repetições em tandem) (veja a Unidade 5).
diferentes do anterior. Raras
mutações como essa são
Comparando os RNAs procarióticos e eucarióticos, os RNAs procarióti-
fenotipicamente importantes, cos são policistrônicos (produzem vários RNAs relacionados, cuja transcrição
pois interferem na é controlada por um único processo regulatório, chamado operon,). Os RNAs
sobrevivência do indivíduo. eucarióticos são monocistrônicos, produzindo um único RNAm e com diferen-
tes níveis de regulação (veja a Unidade 4).
 Biologia Molecular 23

1.2 Estrutura genômica e evolução

O genoma de um organismo é seu conjunto completo de cromossomos. O
mapa definitivo ou físico, do genoma consiste na sua sequência completa. A
partir da sequência, torna-se possível identificar genes e sua localização.
Como os genomas evoluem? Os organismos diferem muito quanto ao
tamanho do genoma, ao número de cromossomos, à abundância e ao tama-
nho dos introns e exons, à quantidade de DNA repetitivo e número de genes.
No caso do número de genes, este se correlaciona muito grosseiramente com
a complexidade dos organismos. Assim, o ser humano tem quase a mesma
quantidade de genes da planta do arroz (cerca de 25 mil genes estruturais).
Obviamente há uma correlação entre a complexidade de um organismo e o
tamanho de seu genoma. Bactérias contêm cerca de 500 genes, humanos,
cerca de 25 mil. Portanto, existe um complicado processo de evolução mole-
cular. Este nem sempre pode ser conferido nas características fenotípicas ou
morfo anatômicas. Para isso é preciso conferir os marcadores moleculares,
além de alinhar e comparar inúmeras sequências de DNA.
Um ponto importante é que os genes em si, são mais conservados que
a estrutura geral do genoma. Os genes diretamente ligados ao metabolismo
basal da célula são sempre sujeitos a pressões evolutivas que não permitem
alterações importantes. Mesmo assim, acumulam mutações sinônimas, ou
neutras, como veremos mais adiante. Sequências repetitivas e introns têm
maior liberdade para acumular mutações. As falhas nos mecanismos de re-
plicação, recombinação e reparação do DNA, pela enzima DNA polimerase
podem levar à simples falha de um nucleotídeo, como rearranjos genômicos
em larga escala, como deleções, duplicações, inversões e translocações cro-
mossômicas. Essas variações tomam forma nos polimorfismos de simples nu-
cleotídeo (SNPs – Single Nucleotide Polymorphism, veja a Unidade 3), como
pontos na sequência genômica onde os organismos podem variar, por ape-
nas um nucleotídeo naquela posição. Os SNPs e outros polimorfismos nem
sempre são visíveis no fenótipo, porém são herdáveis. Sítios polimórficos pos-
suem um papel relevante na prática dos estudos evolutivos, médicos e foren-
ses, pois podem caracterizar um táxon ou discriminar famílias ou indivíduos.
Um estudo promissor para compreender a evolução genômica são as du-
plicações gênicas, produzidas majoritariamente por crossing-over desigual. Ou
seja, um dos gametas recebe uma sequência a mais e, se isso não perturbar a
harmonia gênica, permanece no organismo a ser gerado, produzindo variação
genômica. Genes duplicados então divergem, a cópia pode ser funcional ou não,
por mutação de perda de função, gerando um pseudogene. Caso ambas as
cópias permaneçam funcionais, podem então divergir quanto ao padrão de ex-
pressão. Dessa forma, duplicação seguida de divergência pode gerar inúmeras
24 CECCATTO, V. M.

famílias de genes, (consequentemente, famílias proteicas) com funções corre-

lacionadas, aumentando a complexidade biológica. Um exemplo bem estudado
de família gênica advinda de duplicação é a família das globinas. Comparando as
diferentes proteínas globinas (como a hemoglobina), vemos homologias indiscutí-
veis nas suas sequências de aminoácidos e na sua estrutura, indicando que elas
todas devem ter se originado de um ancestral comum. Pseudogenes globínicos
também são encontrados. Portanto, é razoável dizer que sequências de aminoá-
cidos homólogas em proteínas denotam funções correlacionadas e antecessores
em comum. O fenômeno do parentesco gênico, que resulta em repetições de
genes e pseudogenes é chamado de redundância genética.
Marcadores moleculares:
Uma consequência disso é a existência de domínios proteicos, en-
sequência de DNA ou gene
transmissível, detectável contrados em diferentes famílias de proteínas. São caracterizados por uma
por técnica molecular, que repetição de uma estrutura proteica, em número variável, inseridos na estru-
tenha utilidade na análise tura tridimensional da proteína. Servem como elemento modular, produzindo
genética.
“colchas de retalhos” que produzem novas proteínas. Os domínios proteicos
Metabolismo basal:
metabolismo essencial das geralmente estão inseridos nos exons. Imagine que juntando vários exons di-
células que possibilita sua ferentes é possível formar novas proteínas, o que é chamado de embaralha-
sobrevivência. mento de exons (exon shuffling).
Pseudogene: sequências
de DNA derivadas de uma
cópia funcional de um
gene porém inativadas por
mutação posterior. Textos complementares
Famílias de genes:
conjunto de genes
relacionados, derivado de
Registro da proteína insulina humana no GenBank
duplicação gênica ou outro
LOCUS AAA59172 110 aa linear PRI 12-FEB-2001
processo multiplicador.
DEFINITION insulin [Homo sapiens].
Famílias de proteínas:
ACCESSION AAA59172
grupo de proteínas
VERSION AAA59172.1 GI:386828
estruturalmente e
DBSOURCE locus HUMINS01 accession J00265.1
funcionalmente similar,
KEYWORDS .
com identidade maior que
SOURCE Homo sapiens (human)
50% quando alinhada.
ORGANISM Homo sapiens
Exon shuffling:
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
embaralhamento de exons,
Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;
durante a transcrição. que
Catarrhini; Hominidae; Homo.
pode resultar em novas
REFERENCE 1 (residues 1 to 110)
proteínas. Veja também
AUTHORS Bell,G.I., Pictet,R. and Rutter,W.J.
splicing alternativo.
TITLE Analysis of the regions flanking the human insulin gene and
sequence of an Alu family member
JOURNAL Nucleic Acids Res. 8 (18), 4091-4109 (1980)
PUBMED 6253909
COMMENT On Aug 28, 1993 this sequence version replaced gi:186432.
Method: conceptual translation.
 Biologia Molecular 25

FEATURES Location/Qualifiers
source 1..110
/organism="Homo sapiens"
/db_xref="taxon:9606"
/map="11p15.5"
/tissue_type="liver"
/dev_stage="foetus"
Protein 1..110
/product="insulin"
sig_peptide 1..24
/gene="INS"
/note="G00-119-349"
mat_peptide 25..110
/gene="INS"
/product="c peptide; G00-119-349"
Region 26..110
/region_name="IlGF_insulin_like"
/note="IlGF_like family, insulin_like subgroup, specific
to vertebrates. Members include a number of peptides
including insulin and insulin-like growth factors I and
II, which play a variety of roles in controlling processes
such as metabolism, growth and...; cd04367"
/db_xref="CDD:58536"
Site order(32,35,37,108)
/site_type="other"
/note="putative receptor binding surface"
/db_xref="CDD:58536"
CDS 1..110
/gene="INS"
/coded_by="join(J00265.1:2424..2610,J00265.1:3397..3542)"
/note="precursor"
/db_xref="GDB:G00-119-349"
ORIGIN
1 malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy
tpktrreaed
61 lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAA59172.1

Projeto Genoma
Uma ideia considerada absurda no seu início foi a ideia de se conhecer, letra por letra,
a informação genética do ser humano, o chamado Projeto Genoma Humano (PGH). A
técnica de sequenciamento de DNA, surgida por volta de 1985, tornou possível pen-
sar estratégias que deveriam ser seguidas para um projeto desta magnitude. O maior
responsável pelo desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento por terminação
do dideóxi, nos anos 70, foi F. Sanger, britânico, ganhador do prêmio Nobel por duas
vezes. O objetivo primordial da iniciativa pública do governo americano para o PGH
era produzir a sequência completa do genoma humano com taxas mínimas de erro.
Formou-se assim o Consórcio Internacional de Sequenciamento do Genoma Humano
(HGSC). A previsão inicial foi que, em 2005, após 15 anos, este seria completado. Nos
26 CECCATTO, V. M.

anos 80 e 90 apareceram plataformas robotizadas para sequenciamento em larga es-

cala, acoplando o DNA a grupamentos químicos fluorescentes, detectáveis por laser.
Assim, em janeiro de 2000, cerca de 20 centros de sequenciamento já geravam cerca
de 1000 bases por segundo, 24 horas por dia, 7 dias por semana. Francis Collins assu-
Bioinformática: consiste
miu a coordenação após o próprio J. Watson ter sido coordenador.
numa nova disciplina
Em 1998, entretanto, surgiu um desafiante do PGH oficial: C. Venter, presidente da
que congrega a Biologia
empresa privada Celera Genomics, em parceria com a empresa Perkin-Elmer Applied
e Informática. Podemos
Biosystems, anunciou que iria sequenciar o genoma humano até 2001. Esta propos-
chamar de Bioinformática
ta alternativa concluiria o sequenciamento com 99,9% de cobertura com um erro
clássica, estudo ou
inferior a 1:10.000 a um custo total final de 200 a 250 milhões de dólares. Números
ferramenta que permite
à parte, a grande preocupação da iniciativa pública foi que a empresa patenteasse o
obter, estocar, manipular
genoma humano, posteriormente, vendendo o direito de acesso aos dados.
e avaliar sequências de
Em fevereiro de 2001, foi publicado o primeiro rascunho do genoma humano como
biomoléculas, especialmente
duas respectivas análises dos dois grupos nas famosas revistas científicas: Nature e
DNA, RNA ou proteínas.
Science. Esse rascunho possuía uma cobertura de 90% e 150.000 descontinuidades.
Em 14 de abril de 2003, o genoma foi considerado concluído. A versão final contém
99% do genoma, com 99,99% de precisão, as descontinuidades ficaram em apenas
algumas centenas. Uma série de conquistas adicionais incluem vários genomas euca-
rióticos como o do camundongo, do rato, de vários outros animais e vegetais-modelo
para a pesquisa. A Bioinformática possibilitou a análise das sequências obtidas, seu
registro autoral, anotação, acesso e aplicação de ferramentas, na comparação de se-
quências de nucleotídeos, aminoácidos, estrutura de proteínas, acesso e comparação
de genomas, entre muitas outras. Aliada à rede mundial de computadores, possibili-
tou acesso público e gratuito a este conhecimento.
O estudo molecular de sequências de genes e proteínas, incluindo aspectos evolu-
tivos que podem ajudar a classificar e caracterizar grupos taxonômicos de organismos
pode ser considerado uma dos maiores contribuições do PGH. O PGH possibilitou
excelente progresso nas heranças monogênicas ou com conjunto limitado de genes,
aplicável ao diagnóstico, tratamento e prognóstico. A identificação do gene e de suas
mutações têm revelado inúmeras estratégias. Entretanto, doenças multifatoriais ou
poligênicas, envolvendo inúmeras interações gene-gene e gene-ambiente, como por
exemplo, o câncer, doenças psiquiátricas, diabetes e doenças cardiovasculares são
um grande desafio para os pesquisadores, envolvendo estratégias ainda mais com-
plexas para seu estudo. Outra questão importante é que o PGH foi feito a partir de
um pequeno grupo de voluntários. Dessa forma, não inclui a herança genética que é
única (no sentido parental), inerente a todos os organismos, mas representa apenas
uma condição gênica universal. A análise genômica constatou a extraordinária sin-
tenia (conservação da ligação genética entre táxons diferentes) entre centenas de
grupos de organismos, o que vem ajudando sobremaneira os estudos evolutivos. Veja
na Figura 8 a homepage do Projeto Genoma.
 Biologia Molecular 27

A palavra sintenia,
empregada em genética
molecular, descreve uma
situação em que diferentes
genes ou diferentes loci
gênicos estão ligados no
mesmo cromossomo, em
indivíduos ou espécies.
Nos genes sintênicos,
esta localização torna-
se preservada, assim,
rearranjos no genoma
tais como translocações
cromossômicas podem
separar dois loci, resultando
na perda de sintenia entre
eles. De forma inversa,
as translocações também
podem reunir dois loci
gênicos anteriormente
separados, resultando
em ganho de sintenia. A
sintenia compartilhada pode
refletir relações funcionais
entre os genes sintênicos,
como combinações de
alelos que são vantajosos
quando herdados juntos ou
que estão compartilhando
Figura 8 - Página inicial da ferramenta Entrez – Genome Project – apresentando mecanismos de regulação.
centenas de links para genomas, finalizados e em andamento. Etimologicamente, a
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov palavra “sintenia” é um
neologismo usado para
descrever uma precisa
Após dez anos, mapa dos genes dá poucas pistas para tratamen- preservação da ordem dos
tos médicos loci gênicos a partir de um
ancestral comum. Os genes
Dez anos depois de o ex-presidente dos EUA Bill Clinton (1993-2001) ter anunciado que Hox nos animais são genes
o primeiro esboço do genoma humano estava concluído, a medicina ainda não viu gran- que são determinantes do
de parte dos benefícios prometidos. plano corporal, interagindo
Para os biólogos, o genoma produziu uma surpresa significativa após outra. Mas o de forma crítica entre
objetivo primário do genoma humano, de US$ 3 bilhões, era descobrir as raízes genéti- si, são essencialmente
cas de doenças comuns como câncer e Alzheimer, e criar tratamentos, no entanto, per- conservados
manece em grande parte uma ilusão. De fato, uma década após o esforço e os geneti- sintenicamente. A
cistas estão quase de volta ao início no conhecimento das origens das doenças comuns. chamada macrosintenia
Ao anunciar, em 26 de junho de 2000, que o primeiro esboço do genoma humano seria a preservação de
tinha sido alcançado, Clinton disse que ele "revolucionaria o diagnóstico, a prevenção e grandes porções de um
o tratamento da maioria ou de todas as doenças humanas". cromossomo, microsintenia,
Em entrevista coletiva, Francis Sellers Collins, então diretor da agência do genoma preservação da sintenia,
dos Institutos de Saúde dos EUA, disse que o diagnóstico genético de doenças seria preservação em poucos
alcançado em dez anos e que os tratamentos começariam a surgir talvez cinco anos genes por um tempo.
28 CECCATTO, V. M.

depois. "Em longo prazo, talvez em mais 15 ou 20 anos, vocês verão uma completa
transformação da medicina terapêutica", ele acrescentou.
A indústria farmacêutica gastou milhões de dólares para desvendar segredos genô-
micos e está começando a colocar no mercado várias drogas orientadas pela genética.
Enquanto os laboratórios continuam despejando muito dinheiro na pesquisa do geno-
ma, ficou claro que a genética da maior parte das doenças é mais complexa do que se
previa, e que são necessários muitos anos antes que novos tratamentos sejam capazes
de transformar a medicina.
A última década trouxe uma enxurrada de descobertas de mutações causadoras de
doenças no genoma humano. Mas na maioria dos casos, as descobertas só explicaram
uma pequena parte do risco de contrair a doença. E alguns cientistas começam a temer
que muitas variantes genéticas ligadas a doenças possam ser ilusões estatísticas.
O Projeto do Genoma Humano foi iniciado em 1989 com o objetivo de sequenciar,
ou identificar, as 3 bilhões de unidades químicas no conjunto de instruções genéticas
humano, encontrar as origens genéticas de doenças e, então, desenvolver tratamentos.
Com a sequência na mão, o passo seguinte foi identificar variantes genéticas que au-
mentam o risco de doenças comuns, como câncer e diabetes.
Em 2002, os Institutos de Saúde iniciaram um projeto de U$138 milhões chamado
HapMap, para catalogar as variantes comuns dos genomas europeu, asiático do leste
e africano.
Com o catálogo na mão, a segunda etapa seria ver se alguma das variantes era mais
comum nos pacientes com determinada doença do que em pessoas saudáveis. Esses
estudos exigiram grandes números de pacientes e custaram vários milhões de dólares
cada um. Quase 400 deles tinham sido concluídos em 2009. O resultado é que centenas
de variantes genéticas comuns hoje foram estatisticamente ligadas a diversas doenças.
Fonte: adaptado de Wade (2010).

Síntese da Parte
Os ácidos nucléicos consistem de polinucleotídeos. O núcleo eucariótico
contém DNA em várias condições de condensação, condição que afeta a
transcrição dos genes. A cromatina é o conteúdo eucariótico nuclear. Genes e
genomas são definidos de forma funcional, embora haja outras definições. Os
genes codificam RNA ou polipeptídeos e os genomas abrangem o conjunto
dos cromossomos. Discute-se o projeto genoma humano e dos experimentos
que levaram à descoberta da dupla fita do DNA.
 Biologia Molecular 29

Atividades de avaliação
1. Explique, em termos gerais, como funciona o fluxo da informação gené-
tica (replicação, transcrição e tradução). Inclua nesta questão: principais
elementos envolvidos (enzimas e outros elementos) etapas básicas de
cada processo, em sequência e o momento em que os processos ocor-
rem na célula.
2. Procure o conceito de transcrição reversa e quais organismos a produzem.
3. Desenhe um nucleotídeo com suas moléculas constituintes, indicando as
ligações entre elas. No esquema, apresentar a diferença entre desoxiri-
bonucleotídeo e ribonucleotídeo.
4. Procure e esquematize os diferentes tautômeros das bases nitrogenadas.
5. Procure as diferentes classes de íntrons e definição mais completa de
ribozima.
6. Desenhe e legende um núcleo eucariótico com todas suas estruturas bá-
sicas: membrana nuclear, nucléolo, poros nucleares, elementos cromáti-
cos. Analisar a função de cada um deles.
7. Recorde os ciclos celulares (mitose e meiose) e suas fases.
8. Procure nos livros e materiais didáticos: informações sobre cromossomos
politênicos.
9. Procure na rede mundial de computadores: técnica de cariotipagem.
10. Procure na rede mundial de computadores: técnicas de visualização do
núcleo e de seus componentes, como por exemplo, a imunofluorescência.
11. Revise a estrutura de proteínas: o que é estrutura primária, secundária, Síntese do Capítu
terciária e quaternária.
12. Desenvolva os conceitos relacionados: domínios estruturais proteicos e
motivos estruturais proteicos.
13. Faça uma busca bibliográfica no GenBank: Visite o site do NCBI (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov). Seguir o roteiro de busca abaixo para o PubMed;
a) No campo “Search” procure “PubMed” ou “PubMed Central” (nessa opção
somente são apresentados opções de literatura grátis para o download;
b) Digite a palavra-chave de seu interesse (veja sugestões a seguir);
30 CECCATTO, V. M.

c) Quantos resultados ("results") retornou a sua busca? Ou seja, quantas

referências foram obtidas? Quantas revisões ("reviews") e quantos textos
disponíveis grátis? ("Free Full Text")?
Por exemplo: “1 to 20 of 211181” significa “1 a 20 de 211.181 referências
no total.” Veja um resultado na página seguinte:

The antitumor activity of the fungicide ciclopirox. (Título)

Zhou H, Shen T, Luo Y, Liu L, Chen W, Xu B, Han X, Pang J, Rivera CA, Huang S. (Autores)
Int J Cancer. 2010 Mar 11. [Epub ahead of print] (Publicação)
PMID: 20225320 [PubMed - as supplied by publisher]
Related articles

Clicando no link do título (a sua escolha) obtém-se novas informações, es-

pecialmente o Resumo.
d) Procure os trabalhos da bibliografia deste texto ou relacionados.
Sugestões de palavras-chave: patologias como breast cancer - câncer
de mama (usado no exemplo), nome científico de organismos: “Canis
familiaris” ou “dog”, grupo geral: “bacteria”, moléculas: cytochrome, etc.
Observação: ao fazer esta busca nos computadores em rede da sua
Universidade, é possível obter mais material em “download”. A rede
CAPES está disponível somente nas redes de IES do país.
14. Leia os textos complementares e discuta as perspectivas do projeto ge-
noma para as próximas décadas.

Livros
• SCHWARTZMAN, S. Um espaço para a ciência: a formação da co-
munidade científica no Brasil. Brasília: MCT/CNPq/CEE, 2001. 307 p.
• WILMUT, I.; CAMPBELL, K.; TUDGE, C. Dolly: a segunda criação. Rio
de Janeiro: Objetiva, 2000. 394 p.
• BRODY, A. R.; BRODY, D. E. As sete maiores descobertas científicas
da historia. São Paulo: Companhia das Letras. 1999. 440 p.
 Biologia Molecular 31

Filmes
• Gattaca: a experiência genética (Dir. Andrew Niccol, 1997) - fabuloso
filme sobre questões do genoma e bioética.
• Uma verdade inconveniente (Dir. Davis Guggenhein, 2006) - aqueci-
mento global.
• Sonhos tropicais (Dir. André Sturm, 2002) – a “revolta da vacina” no
Rio de Janeiro.
• Avatar (Dir. James Cameron, 2009) - fabuloso filme que exibe clona-
gem e exobiologia.
• Viagem fantástica (Dir. Richard Fleischer, 1966, refilmagem de Pieter
Kuijpers, 2005 – Viagem fantástica II – rumo ao cérebro) – Fisiologia
humana e ciência.

Sites
(Livros grátis para download)
• http://bafanaciencia.blog.br/
• http://gigapedia.com/
• http://search.4shared.com/q/1/biologia
• http://bio-livros.blogspot.com

(Instituições e associações)
• http://www2.abed.org.br/ (Associação Brasileira de Educação a
Distância - ABED)
• http://www.abep.org.br/usuario/GerenciaNavegacao.php (Asso-
ciação Brasileira de Estudos Populacionais - ABEP)
• http://www.ancib.org.br/ (Associação Nacional de Pesquisa e PG
em Ciência da Informação - ANCIB)
• http://www.sbhc.org.br/ (Sociedade Brasileira de História da Ciên-
cia - SBHC)
• http://www.sbeb.org.br/ (Sociedade Brasileira de Engenharia Bio-
médica - SBEB)
32 CECCATTO, V. M.

Referências
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J.;BAZETT-JONES, D. P. Global chromatin architecture reflects pluripotency
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n. 5, p. 1-13, 2010.
ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER,
P. Molecular biology of the cell. 5. ed. New York: Garland Science, 2008.
1.261 p.
BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. Bioquímica. 6. ed. Rio de Ja-
neiro: Guanabara Koogan, 2008. 1.114 p.
ENGSTRÖM P. G; SUI, S. J. H.; DRIVENES, O; BECKER T. S; LENHARD,
B. Genomic regulatory blocks underlie extensive microsynteny conservation
in insects. Genome Research, New York, v. 17, n. 12, p. 1898–1908, 2007.
GRIFFITHS, A. J. F.; MILLER, J. H.; SUZUKI, D. T.; LEWONTIN, R. C.; GEL-
BART, W. M. An introduction to genetic analysis. New York: W. H. Freeman
and Company, 1996. 915 p.
JEFFREYS, A. J.; WILSON, V.; THEIN, S. L. Hypervariable “minisatellite” re-
gions in human DNA. Nature, New York, v. 314, p. 67-73, 1985.
VENTER, J. C.; ADAMS, M. D.; MYERS, E. W. et al. The sequence of the
human genome. Science, Washington, v. 291, p. 1304-1351, 2001.
WADE, N. Após dez anos, mapa dos genes dá poucas pistas para tratamen-
tos médicos. Folha de São Paulo, São Paulo, 21 jun. 2010. Caderno The
New York Times, p. 1-2.
WATERMAN, T. H. Revolution for biology. American Scientist, North Caroli-
na, v. 50, p. 458, 1962.
 Parte 2
Mecanismos genéticos básicos
 Capítulo 4
Considerações iniciais
e histórico
Objetivo
• Apresentar os mecanismos genéticos básicos da célula referentes ao
fluxo da informação genética e as suas implicações.

1. Aspectos gerais
A informação genética em todas as células segue, a princípio, uma via de
mão única: DNA especifica a síntese de RNA, e RNA especifica a síntese
de polipeptídeos, que, posteriormente, formam proteínas. Por causa de sua
universalidade, o fluxo de informação genética DNA → RNA → polipeptídeo
(proteína) é discutido como o dogma central da Biologia Molecular, conforme
foi visto no Capítulo 1. Neste capítulo iremos detalhar um pouco mais essas
importantes etapas. Atenção, pois esses processos são a base para nosso
futuro entendimento das técnicas de DNA recombinante.
A primeira etapa, a síntese de RNA usando uma DNA polimerase
dependente de RNA, é descrita como a transcrição e ocorre no núcleo
das células eucarióticas e, em certa medida, nas mitocôndrias e cloroplas-
tos, únicas organelas que apresentam uma capacidade genética, além
do núcleo eucariótico. Podemos chamar então o RNA (qualquer tipo) de
transcrito, pois ele é sempre produto de transcrição. A segunda etapa, a
síntese de polipeptídeos, é conhecida como tradução e ocorre pela ação
dos ribossomos, grandes complexos de proteínas e RNA os quais são
encontrados no citoplasma e também em mitocôndrias e cloroplastos. As
moléculas de RNA que contêm a informação específica para um polipeptí-
deo é o RNA mensageiro (RNAm).
A expressão da informação genética segue um princípio de colinearida-
de: a sequência linear de nucleotídeos no DNA é decodificada para dar uma
sequência linear de nucleotídeos de RNA, que pode ser decodificado, por sua
vez, em grupos de três nucleotídeos (códons) para dar uma sequência line-
ar de aminoácidos no produto polipeptídeo. A tradução envolve um conceito
36 CECCATTO, V. M.

importante, que é o código genético. Corresponde à chave que é usada para

transferir a informação de um alfabeto de 4 letras (AGCT) para um alfabeto de
20 letras (conjunto de aminoácidos envolvidos na síntese protéica). Apenas
uma pequena porcentagem de todo o DNA das células são sempre transcri-
tas. De acordo com as suas necessidades, células diferentes transcrevem
diferentes segmentos do DNA (unidades de transcrição), que são unidades
discretas, espaçados irregularmente ao longo da sequência do DNA. No en-
tanto, a grande maioria do DNA celular nunca é transcrita em qualquer célula.
No contraponto desse raciocínio, está o processo de replicação. Todo
o DNA é sempre replicado. A replicação é um ramo do dogma envolvido na
produção do DNA a partir do próprio DNA, portanto, DNA sempre é formado a
partir de outro DNA.
O que esses processos têm em comum?
São todos processos envolvidos na produção de novas macromoléculas,
todas envolvem polimerizações (formação de polímeros). DNA é um polímero
de desoxiribonucleotídeos; RNA é um oligômero de ribonucleotídeos; proteína,
polímero de aminoácidos. São processos do anabolismo celular. Outro ponto
em comum é que possuem três etapas básicas: (i) iniciação, quando um com-
plexo de iniciação é formado, contendo as enzimas e partículas iniciais, “mon-
tadas” no início do processo (geralmente no início do molde); (ii) alongamento:
etapa repetitiva onde ocorre rápido crescimento do polímero; por fim, ocorre a
(iii) finalização, a qual também apresenta um complexo de finalização, também
com enzimas e partículas de finalização (no final do molde).

2. Breve histórico
As décadas de 1940 e 1950 foram marcadas por estudos essenciais na
Biologia Molecular. George Beadle e Edward Tatum examinaram, em 1941,
as bases bioquímicas do metabolismo em Neurospora, a relacionando o ge-
nótipo ao fenótipo, ou genes a proteínas. O paciente método desenvolvido
por eles, por meio do qual mutantes deficientes nutricionalmente, chamados
auxotróficos, não crescem em meio mínimo, mas crescem em meio com o nu-
triente do qual o mesmo é negativo. Assim, se o fungo tinha uma mutação que
o tornava incapaz de produzir arginina, este só crescia em meio mínimo con-
tendo arginina. Classificando os mutantes em grupos, foi possível caracteri-
zar quais eram os requerimentos necessários para cada grupo, determinando
qual enzima seria necessária para cada etapa, até chegar ao produto final que
é a arginina. Esse método foi usado por Adrian Srb e Normam H. Horowitz, re-
velando o ciclo de produção da arginina. Esses experimentos foram a base da
teoria um gene, uma enzima. Quando se verificou a formação multimérica de
muitas proteínas, o modelo foi modificado para um gene, um polipeptídeo.
 Biologia Molecular 37

A partir da descoberta da dupla hélice (1953), sabia-se, então, que essa

molécula era a transmissora das informações genéticas. Entretanto, nada se
sabia sobre como as proteínas podiam ser formadas a partir dela. Somente
dez anos depois (em 1961), foi que ocorreu a descoberta de um código ge-
nético presente no DNA que organiza a montagem das proteínas, através dos
experimentos de Marshall Warren Niremberg e Johann Heinrich Matthaei,
usando RNAs sintéticos produzidos por uma enzima polinucleotídeo fosfori-
lase, a qual consegue produzir um RNA sem um molde para guiá-la. Dessa
forma, produziram homopolímeros, moléculas de RNA formadas por um único
nucleotídeo, por exemplo: 5'...UUUUUU...3' ou RNA poli(U). Este RNA poli(U)
foi então adicionado a 20 tubos cada um contendo um sistema de células de
síntese de proteínas e mais os 20 aminoácidos, cada um deles separadamen-
te em cada tubo. Obviamente somente o tubo contendo o aminoácido fenilala-
nina apresentou proteínas recém sintetizadas radioativas. Novos experimen-
tos, similares a esse puderam ser feitos, e o significado de todos os códons
foi concluído em 1965. Niremberg recebeu o Premio Nobel em Fisiologia ou
Medicina em 1968. Niremberg faleceu em 15 de janeiro de 2010.
 Capítulo 5
Mecanismos genéticos
básicos

1. Replicação
Unidades discretas:
unidades descontínuas, Durante o processo de síntese
pontuais e ordenadas, de DNA (replicação do DNA),
existentes em cada gene. as duas fitas de DNA de cada
dATP, dCTP, dGTP, dTTP:
cromossomo são desenroladas
desoxi adenosina trifosfato,
desoxi citosina trifosfato, por uma enzima helicase, e
desoxi guanosina trifosfato, cada fita de DNA dirige a sínte-
desoxi timidina trifosfato. se de uma fita de DNA comple-
De forma genérica, são
mentar para gerar dois duplex
chamados de dNTPs ou
desoxiríbonucleotídeos DNA, cada um dos quais é
trifosfato. São adicionados idêntico à molécula. A replica-
à fita de DNA nascente, ção é descrita como semicon-
perdendo dois fosfatos
servativa (Figura 1), pois cada
inorgânicos. dNMP:
desoxinucleotídeo nova fita duplex contém um fila-
monofosfato. mento da molécula-mãe e uma
Primer: Trecho curto fita de DNA recém sintetizada.
e temporário de RNA
A DNA polimerase (Figura 2) é
hibridizado a uma fita
simples de DNA molde. Sua a principal enzima, a qual cata-
função é fornecer um grupo lisa a síntese de DNA, usando
3' – OH para a ligação de as fitas parentais como molde
um novo nucleotídeo.
utilizando os quatro desoxirrí-
Fita atrasada ou
descontínua (filamento bonucleotídeos (dATP, dCTP,
Figura 1 - Modelo semiconservativo da replicação
lagging): filamento de dGTP, dTTP) como precurso- do DNA. As novas fitas são produzidas sempre na
DNA replicado de forma res de nucleotídeos. direção 5'→3', adicionando novas complexidades
descontínua, a qual é
sintetizada na direção
à um mecanismo cheio de detalhes. As pontes
contrária à da abertura da de H são abertas pelas enzimas helicases. Fonte:
forquilha de replicação. Griffiths et al. (1999).
 Biologia Molecular 39

Fita líder ou contínua

(filamento leading):
Filamento de DNA replicado
continuamente, com poucas
interrupções de primers,
sintetizado na direção da
Figura 2 - Esquema da replicação apresentando a forquilha de replicação, a direção abertura da forquilha de
da replicação e outros detalhes. Fonte: Griffiths et al. (1999). replicação.
Fragmentos de Okasaki:
Trechos curtos e temporários
As reações moleculares catalisadas pelas DNA polimerases ocorrem de DNA recém-sintetizado,
na extremidade 3´-OH exposta do DNA em crescimento adicionando a essa iniciados a partir dos primers
extremidade, um dNMP fornecido por um precursor dNTP, o dNMP é adicio- e finalizados pela enzima
DNA ligase. Note que são
nado e os dois resíduos de fosfato distal, ou seja, os resíduos β e γ são cli-
temporários, já que, no final
vados e resultam num grupo pirofosfato (PPi), o qual é descartado. Dessa da replicação, não se nota
forma, a energia necessária para o processo é fornecida inerentemente pelos qualquer diferença na fita de
próprios substratos. DNA.

Após a abertura das fitas, a enzima DNA primase (ou iniciase) adiciona
A transcrição reversa
primers de RNA a esses inícios de replicação para que possa formar a extre-
foi encontrada por meio
midade 3´- OH. Esses primers de RNA serão retirados após a polimerização, do estudo de tumores
pela própria DNA polimerase (uma outra isoforma). À medida que retira, adi- de galinhas, gatos e
ciona desoxiribonucleotídeos corretos, tapando esses pequenos buracos. A camundongos, onde vírus
com RNA foram implicados
enzima DNA ligase faz o fechamento final das pontes fosfodiéster, que não
na produção do tumor. Em
são fechadas pela DNA polimerase. 1970, David Baltimore,
A replicação do DNA é iniciada em pontos específicos, que são chama- Howard Temim e Satoshi
Mizutani descobriram uma
dos de “origens de replicação”. A partir dessa origem, o início ocorre em uma
DNA polimerase dependente
forquilha ou bolha de replicação, em que o DNA parental é aberto e bifurca-se. de RNA, chamada de
Como as duas cadeias do duplex DNA parental são antiparalelas, cada uma transcriptase reversa, a qual
funciona individualmente como modelo para a síntese de uma fita comple- permite a cópia do RNA em
DNA. A transcrição reversa
mentar antiparalela. As duas fitas correm e crescem em direções opostas,
é responsável pela inclusão,
cada uma em direção à abertura da forquilha de replicação. Entretanto, a di- nos genomas de muitos
reção do crescimento das duas novas cadeias, feita pela enzima DNA polime- tipos de sequências de DNA
rase ocorre sempre na direção 5'→ 3'. Uma das fitas demora mais para ser que foram retrotranscritas,
convertendo o RNA
feita, chamada de fita atrasada (ou descontínua), e é exatamente aquela que
unifilamentar em DNA
não está com a direção 5'→ 3' da sua fita parental em direção à abertura da bifilamentar.
forquilha de replicação. A fita oposta é chamada de líder (ou contínua).
40 CECCATTO, V. M.

Essa exigência introduz uma assimetria no processo de replicação do

DNA: só a fita líder terá o grupo 3'−OH livre no ponto de bifurcação e é sinteti-
zada continuamente. Nesse lado, ocorre a adição sequencial de nucleotídeos
e alongamento contínuo na mesma direção que o movimento de abertura da
forquilha de replicação. No entanto, a síntese da cadeia atrasada tem que ser
feita de forma fragmentada, pois a DNA polimerase tem que "esperar" que a
fita se abra. Esses fragmentos possuem de 100-1000 nucleotídeos de tama-
nho e são referidos como fragmentos de Okasaki. Esses fragmentos serão
A enzima telomerase faz a
posteriormente unidos pela enzima DNA ligase, de forma que nenhuma ponte
replicação dos telômeros.
Nos telômeros humanos, fosfodiéster deixará de ser formada. No final, toda a molécula é uniforme, sem
temos a sequencia TTAGGG sinal ou defeito aparente.
repetida em tandem. A
enzima estende a ponta 3'
do filamento molde. Sem
a telomerase, as pontas
dos cromossomos podem
ficar cada vez mais curtas
após cada replicação.
Essas perdas podem
caracterizar perda de genes,
o que pode ser letal. Uma
característica excepcional
é que ela contém um molde
de DNA incluso. Estudos
mostram uma correlação
entre tamanho do telômero
e envelhecimento humano,
em distúrbios chamados
progerias, doenças
genéticas caracterizadas
por envelhecimento tardio.
Os pacientes de progeria
têm telômeros curtos. Figura 3 - FISH em cromossomos humanos, evidenciando os telômeros, com anti-
Acredita-se que uma corpos fluorescentes. Cromossomos na fase metafásica. (Veja FISH na Unidade 5).
diminuição do telômero Fonte: Arnoult et al. (1991).
contribui normalmente,
para o processo de
envelhecimento. O Prêmio 2. Transcrição
Nobel de Fisiologia ou
Medicina do ano de 2009 As informações genéticas, tanto nos procariotos quanto nos organismos eu-
foi atribuído conjuntamente cariotos, passa pela molécula de RNAm para depois ser traduzido em um po-
a Liz Blackburn, Carol lipeptídeo funcional. Em procariotos, uma única RNA polimerase é a enzima
Greider e a Jack Szostak responsável pela produção de todos os tipos de RNAs: RNAt, RNAm e RNAr.
pela descoberta da
enzima telomerase e dos Nos eucariotos encontramos cerca de três RNAs polimerases: I, II e III. A RNA
telômeros como protetores polimerase I é responsável pela síntese de RNAs ribossômicos (menos do
das extremidades dos RNAr 5S), RNA polimerase II que é a principal responsável pela síntese dos
cromossomos (Figura 3). RNAs mensageiros e outros RNAs ligados à recomposição (ou splicing do
 Biologia Molecular 41

RNA), e a RNA polimerase III sintetiza RNAr 5S, tRNAs e outros RNAs de
baixo peso molecular.
A transcrição, portanto, é o processo de produção de qualquer RNA,
que também pode ser chamado de transcrito. Como, na replicação, uma das
fitas do DNA é usada como molde, porém, diferente da replicação, nem todo
o DNA é transcrito, mas somente genes (no sentido funcional, que já comen-
tamos) os quais codificam polipeptídeos ou RNA. Na replicação, todo o DNA
é replicado, em tese, sem faltar uma base. Na transcrição não há primers,
primase, helicase e ligase. A enzima RNA polimerase é responsável por todo o
trabalho, mas somente quando todas as subunidades da enzima se agrupam
sobre o DNA, numa condição chamada formação da enzima RNA polimera-
se holoenzima.
A enzima possui cinco subunidades polipeptídicas: 2α, ββ' e σ (duas al-
fas, beta e beta linha e sigma). A holoenzima forma-se sobre o DNA, mais pre-
cisamente sobre a sequência promotora, ou promotor. O promotor é a sequ-
ência onde se liga inicialmente a subunidade sigma. Quando isso acontece,
outras subunidades se juntam e formam então a holoenzima, num chamado, A replicação é sempre
semiconservativa, iniciando-
assim, complexo fechado. Assim que se inicia a transcrição, justamente a se nas origens de replicação,
partir do códon de iniciação, temos um complexo aberto. Abre-se, então, uma de onde saem forquilhas
bolha de transcrição de aproximadamente 19 nucleotídeos. A bolha abre-se de replicação para os dois
na frente e fecha-se atrás, sendo conduzida pela holoenzima em direção ao lados. Utiliza primers de
RNA. A fita é produzida
final do gene. sempre na direção 5' → 3'.
O RNA possui uma ponta 5' e uma ponta 3'. Os nucleotídeos também são Os nucleotídeos utilizados
adicionados nesta direção 5´→3' pela enzima RNA polimerase. Geralmente, a para a construção do
novo DNA são dNTPs,
ponta 5' é desenhada do lado esquerdo e a ponta 3´do lado direito, como quem produzindo dois fragmentos
lê. À medida que a molécula de RNA, progressivamente, vai sendo produzida, concomitantemente:
a ponta 5' é deslocada do molde e a bolha de transcrição fecha-se atrás da po- lagging e leading. Tipos
limerase. Várias polimerases movem-se ao longo do gene, produzindo várias diferentes de enzimas
participam da replicação,
moléculas de RNA ao mesmo tempo em diferentes estágios. em ordem e sequência bem
Uma questão importante é que a RNA polimerase copia uma das fitas, a estabelecidas, finalizando
fita molde. Portanto a fita do RNA recém sintetizado é igual à fita não molde, com a retirada dos primers,
reparação pela DNA
lembrando que o RNA possui uracilas em que de timinas. Sequências de ba- polimerase e DNA ligase.
ses, quando mostradas na literatura, como as que você vê nesta publicação Todo o DNA é replicado,
e em outras, são sempre iguais ao RNA ou ao filamento não-molde, também incluindo as sequências
chamado de codificante. teloméricas. A replicação
ocorre na fase S da
Como foi dito anteriormente, a transcrição possui três fases: iniciação, interfase. Após a replicação,
alongamento e término. Existem diferenças importantes nesses estágios, tan- histonas imediatamente já se
to em procariotos quanto em eucariotos. A iniciação tem um local iniciador ligam e formam a cromatina.
que é a sequência promotora ou promotor, situada um pouco antes do có-
don de iniciação do gene (Figura 4). Essa parte upstream ao gene também
42 CECCATTO, V. M.

A numeração que é contém sequências reguladoras (veja a Unidade 4), sendo que a região pro-
colocada no gene: ...-3-2- motora é uma das mais importantes e estudadas. Por convenção, o primeiro
1+1 +2 +3... diz respeito
somente à posição do
nucleotídeo do códon de iniciação (normalmente a sequência ATG) recebe a
nucleotídeo no gene. O numeração +1. Os próximos nucleotídeos à direita continuam a numeração:
códon de iniciação é a base +2, +3, +4, assim até o fim do gene. Upstream (anterior ao gene) os nucleo-
dessa numeração (ATG tídeos recebem numeração negativa (-1, -2, etc). Nas bactérias, como a E.
= +1+2+3). Os números
negativos à esquerda
coli, encontramos as caixas (ou boxes) que são sequências consenso (Veja a
referem-se às sequências Unidade 4). O fator ou subunidade sigma é importante na ligação com o pro-
upstream ao gene. Cuidado: motor. Nas bactérias também temos vários tipos de fatores sigma, como σ70,
essa numeração não tem (o expoente 70 foi atribuido porque ela possui 70 kDa). Os diferentes fatores
qualquer relação com
ionização ou propriedades
sigma reconhecem sequências promotoras diferentes e, assim, podem trans-
químicas do gene. crever diferentes conjuntos de genes. Nos eucariotos, a transcrição é regulada
bem no ponto de início pela presença dos fatores de transcrição. Os fatores
RNA polimerase
gerais de transcrição mais a enzima RNA polimerase II formam o complexo
holoenzima:
a reunião de todos os de pré-iniciação (veja também a Unidade 4).
polipeptídeos que compõem
a enzima RNA polimerase.
RNA de baixo
peso molecular:
pequenas moléculas de
RNA nuclear usadas na
recomposição (splicing) do
RNAm.
Fita molde (para a
transcrição): uma das fitas
que servem de molde
para a RNA polimerase.
Qualquer das fitas pode
ser considerada molde,
entretanto, nem todas são. Figura 4 - Sítios promotores da transcrição. (A) procarióticos e (B) eucarióticos. Fonte:
Nos procariotos, é comum Berg et al. (2008).
ver genes, de ambos os
lados da fita.
Fatores gerais de No alongamento, em bactérias como também em eucariotes, temos a
transcrição: pequenas bolha de transcrição (Figura 5), expondo o filamento molde. Nos eucariotos,
partículas protéicas que entretanto, os íntrons são retirados pelo processo de splicing, ou recomposi-
são usadas na transcrição
eucariótica. Sua função é
ção. A recomposição reúne os éxons formando um RNAm maduro ou trans-
aumentar a afinidade da crito secundário. Portanto, só as sequências codificantes são levadas para o
enzima RNA polimerase ao citoplasma para serem traduzidas.
promotor.
Fatores específicos são
identificados com um
determinado gene e ajudam
na sua regulação, induzindo
ou reprimindo um gene
específico.
 Biologia Molecular 43

Figura 5. Bolha de transcrição apresentando o alongamento da fita de RNA.

Fonte: Berg et al. (2008).

Nos procariotos encontra-se somente uma enzima transcrevendo todos os

genes. Nos eucariontes existem três RNA polimerases diferentes: (I, II e III), sendo
que somente a II transcreve RNAm, originando proteínas.

2.1 Recomposição e processamento

Conforme já comentamos, a remoção dos íntrons é chamada de recomposição
ou splicing (Figura 6). Pequenas partículas formadas por proteínas e RNA, cha-
madas snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins) ou mesmo chamadas snRNA
(alguns autores chamam de “snurps” devido à pronúncia em inglês) removem
os íntrons com precisão. As junções éxon-íntron possuem um papel importan-
te nessa questão. São formadas por sítios nos
quais ocorrem as reações de recomposição.
Nessas junções, sequências consenso são en-
contradas. Nas pontas 5' dos íntrons geralmen-
te possuem GU e AG nas pontas 3', chamadas
de regras GU – AG. Outro ponto comum, sem-
pre encontrado nos íntrons é uma A observada
na posição entre 15 e 45 nucleotídeos ante-
cedente ao sítio de corte 3'. Nucleotídeos que
flanqueiam aqueles altamente conservados
também mostram conservação, porém em me-
nor grau. Esses nucleotídeos conservados no
transcrito primário são reconhecidos por cinco
snRNPs (U1, U2, U3, U4 e U5). Essas proteí- Figura 6 - Transcrição e recom-
nas e mais outras fazem um complexo chama- posição do gene da B-globina.
do de spliceossomo (Figura 7). Fonte: Berg et al. (2008).
44 CECCATTO, V. M.

Figura 7 - Autoradiografia de loops cromossômicos do tritão Notophthalmus virides-

cens após hibridização com uma sonda antisenso para a snRNA U1, sonda tritiada
(marcada com o isótopo 3H). (A) snRNA U1 são vistas como glóbulos. (B) As setas
mostram spliceossomos. Fonte: Wu et al. (1991).

A notícia da ocorrência de auto splicing no gene de rRNA do protozoário

ciliado Tetrahymena, no ano de 1981, foi um choque para o estudo molecular.
Esse transcrito tinha capacidade de remover em si próprio um íntron de 413 nu-
cleotídeos, sem nenhuma outra proteína para ajudar. Posteriormente foram en-
contrados outros íntrons (íntrons tipo I e tipo II) com essa propriedade, porém
continuam sendo exceção à regra geral. Nos últimos estudos, percebe-se que
é o componente ribonucleico, e não a proteína, o responsável pela retirada do
íntron. Esses achados e o papel das ribozimas fornecem um novo paradigma
para o papel do RNA na célula, que muitos vêm chamando de Mundo do RNA.
Essa nova abordagem inclui a teoria de que o RNA teria sido predecessor do
DNA por sua versatilidade catalizadora e capacidade genética (Figura 8).

Figura 8. A transcrição e a tradução são acoplados nos procariotos (A) e espacialmen-

te e temporalmente separados nos eucariotos (B). Fonte: Berg et al. (2008).
 Biologia Molecular 45

O processamento das pontas 5' e 3' (Figura 9) ocorre quando o RNAm

emerge da transcrição. Consiste em revestimentos químicos protetores das pon-
tas 5' e 3'. A ponta cap é adicionada ao lado 5' por várias proteínas. O revestimento
consiste em uma 7-metilguanosina ligada ao transcrito por três grupos fosfato. A A transcrição possui
cauda poli A é adicionada ao lado 3´, depois que o RNAm é solto da enzima. propriedades importantes:
é seletiva, somente
algumas sequências do
DNA são transcritas em
um determinado momento.
Somente o molde é
transcrito. O transcrito é
complementar ao molde e
de polaridade inversa. Os
nucleotídeos (ATP, GTP,
CTP e UTP) contêm três
fosfatos, sendo que dois
deles são retirados, liberando
energia para a síntese.
A fita em crescimento
é produzida sempre na
direção 5' → 3' (portanto,
a leitura é feita na direção
3' → 5'). A transcrição não
precisa de primer. A RNA
polimerase é uma enzima
multimérica que necessita de
um fator sigma, específico,
que localiza o promotor. O
promotor contém sequências
Figura 9 – Processamento, recomposição (splicing) e produção do RNAm maduro consenso essenciais para
em eucariotos. Note a presença do promotor upstream ao gene, a presença de in- a ligação com a enzima.
A enzima possui atividade
trons e éxons. Fonte: Pierce (2004).
revisora. A transcrição
começa em alguns poucos
O processamento também tem como objetivo a sinalização para o ri- nucleotídeos antes do
bossomo. Essa sinalização é feita por sequências sinalizadoras como a se- códon de iniciação e termina
quência 5' não traduzida ou 5' UTR, que não codifica aminoácidos. Em bac- pouco depois da sequência
finalizadora.
térias essa região contém a sequência chamada Shine-Dalgarno, sítio de
ligação ao ribossomo.
A finalização da transcrição só ocorre muitos nucleotídeos após o fim
do gene, em sequências finalizadoras. Dois tipos de finalização são conhe-
cidos: a chamada dependente da proteína rô e a independente de rô (ou in-
trínseca). A sequência finalizadora, na verdade antecipa o ponto de término.
A transcrição não termina abruptamente no final do gene, como um carro no
final de uma estrada. O finalizador é como um quebra-molas, que diminui a
velocidade. Na finalização dependente de rô, a proteína auxilia, correndo ao
longo da fita de RNAm recém sintetizada e movendo-se em direção à ponta
46 CECCATTO, V. M.

Íntrons tipo I e II: íntrons 3', seguindo o movimento da RNA polimerase. Ao encontrar o grampo de RNA
autorremovíveis, ou seja, ela para e, com atividade de helicase, abre o híbrido de RNAm/DNA, liberando
independem de proteínas
para a sua recomposição
a nova fita de RNA.
(splicing). São encontrados No segundo caso, o término é direto, sem a ajuda de uma proteína.
em alguns genes de A sequência de término contém cerca de 40 nucleotídeos, terminando num
rRNA, em alguns genes
codificantes de proteínas
trecho rico em GC que é seguido por uma fileira de seis ou mais A. O RNAm
e em mitocôndrias e transcrito, portanto, é rico em GC. Essas bases formam complementação,
cloroplastos. produzindo um grampo no RNAm transcrito primário. O grampo faz com que
Sequências 5' e 3' a RNA polimerase pare a transcrição.
UTR: de “Untranslated
Region”, sequências não
codificantes, localizadas nas 3. Tradução
extremidades dos genes, as
quais são transcritas, mas A tradução é feita nos ribossomos. Estes são considerados verdadeiras má-
não traduzidas. quinas que coordenam todo o processo. Alguns fatos têm que ser apresenta-
Sequência de Shine- dos antes de compreendermos os passos essenciais da tradução. A tradução
Dalgarno: sequência
upstream ao gene, a
é um dos processos mais complexos da maquinaria celular eucariótica (e pro-
qual é encontrada no cariótica também). Os três passos essenciais já discutidos anteriormente: ini-
RNAm. Reconhecida cio, meio e fim, são acrescidos de mais dois: pré-início (ativação dos aminoá-
pelo ribossomo, faz cidos) e pós-final (modificações pós-traducionais, nas proteínas eucarióticas).
hibridização com o RNAr,
para que o primeiro
A ativação dos aminoácidos (Figura 10) consiste na ligação específica de um
códon seja colocado no aminoácido e de seu tRNA específico por uma enzima aminoacil tRNA sinte-
sítio P. Encontrada em tase. Existem 20 dessas enzimas, cada uma específica para cada “casamen-
bactérias, possui análogos to” aminoácido e RNAt. O RNAt é carregado com um aminoácido ligado à sua
em eucariotos como a
sequência Kozak.
ponta 3'. O reconhecimento dos tRNAs pela sintetase depende de sequências
Proteína rô: proteína que diferentes de nucleotídeos dos tRNAs. O aminoácido alanina (Ala) liga-se ao
auxilia na finalização da seu tRNA específico (tRNAAla), originando a seu aminoacil-tRNA (Ala-tRNAAla).
transcrição, liberando a RNA
polimerase de sua ligação
com o DNA, através de sua
atividade de helicase.

Figura 10 - Ativação dos aminoácidos: ligação do RNAt ao seu aminoácido específi-

co pela enzima aminoacil-t-RNA sintetase. Note, no final, a ligação códon/anticódon.
Fonte: Lodish et al. (1999).

As partículas envolvidas no processo são muitas e devem ser listadas

inicialmente: o ribossomo, contendo duas subunidades: 30S e 50S (em bacté-
rias): o complexo ribossômico de iniciação 70S ocorre quando os dois estão
 Biologia Molecular 47

juntos, o RNAm, conjunto de três proteínas, os fatores de iniciação (IF I, II e

III), o tRNA iniciador (fMet-tRNAfMet) e trifosfato de adenosina (ATP). As duas
subunidades ribossômicas ligam-se e separam-se em equilíbrio dinâmico. O
complexo ribossômico 70S ocorre quando os dois estão juntos. O ribosso-
mo completo contém três sítios ou cavidades internas: sítios A, P e E (A de
aminoacil, P de peptídeo e Exit de saída). No alongamento, temos o fator de
alongamento Tu (EF – Tu), fator de alongamento Ts (EF – Ts) e GTP. A enzima
peptidil transferase faz a ligação peptídica. Fatores de liberação são proteínas
que, em E. coli, são responsáveis pela finalização da tradução, liberando o po-
lipeptídio. Existem três fatores de liberação que ligam-se ao ribossomo: RF1, 2
e 3, de acordo com codons específicos de liberação.
Inicialmente, considerando os passos principais: iniciação, alongamen-
to e término, temos uma sequência típica de passos. O RNAm deve se ligar à
subunidade menor do ribossomo (30S). Nas bactérias, a subunidade menor
liga-se à sequência de Shine-Dalgarno no RNAm, posicionando o ribossomo
no códon inicial. Nos eucariotos, a ponta 5' é revestida pelo cap, com a ajuda
de fatores de iniciação. O cap é reconhecido pelo ribossomo e também pela
sequência Kozak. A iniciação eucariótica requer mais fatores de iniciação. IF3
liga-se à subunidade menor do ribossomo e impede a ligação da subunidade
maior durante a iniciação. A partir da junção de GTP, IF2 e IF1, a fMet-tRNAfMe
no códon de iniciação que já está posicionado no sítio P. A partir daí, o GTP é
hidrolisado em GDP e Pi, os fatores de iniciação IF1, IF2 e IF3 são liberados
para que a subunidade maior possa se firmar. Assim, temos o complexo de
iniciação 70S (Figura 11 A).
A partir desse momento, dá-se início ao alongamento, em que temos três
etapas. Na primeira, o tRNA carregado é levado para o sítio A, fazendo com-
panhia para o fMet-tRNAfMet. Junto com ele entra EF-Tu e EF-Ts e GTP para
ser hidrolisado. Nessa fase, o sítio P contém o fMet-tRNAfMet, e o sítio A contém
o próximo aminoacil – tRNA. Após o tRNA carregado ser colocado no sítio A,
o GTP é hidrolisado em GDP, liberando o complexo EF-Tu-GTP. O EF-Tu sai
do complexo, liberando GDP + Pi, sendo que EF-Ts regenera o complexo EF-
Tu-GTP, que está, então, pronto para se combinar com outro tRNA carregado.
Os dois aminoácidos iniciais estão próximos, e a enzima peptidil transferase
produz um dipeptídeo. Quando isso acontece, o primeiro aminoácido (fMet-
-tRNAfMet) fica liberado do seu transportador, que fica descarregado. Essa foi a
segunda etapa. A próxima e última etapa do alongamento é a translocação do
ribossomo todo ao longo do RNAm no sentido 5' → 3'. Essa etapa posiciona
o ribossomo no códon seguinte e requer o fator de alongamento G (EF – G)
e a hidrólise de GTP em GDP. Os tRNAs ainda estão ligados pelas pontes de
hidrogênio entre o códon/anticódon. O que ocorre é o deslocamento dentro
48 CECCATTO, V. M.

dos sítios E, A e P. O tRNAfMet cai dentro do sítio de saída (Exit), o segundo

tRNA – aminoácido vai para o sítio P, e o sítio A fica novamente liberado para o
próximo tRNA carregado. O ciclo se repete, adicionando aminoácidos um de
cada vez. O término ocorre quando se chega ao códon de finalização. O fator
1 reconhece os códons UAA e UAG, RF2 reconhece UGA e UAA. O fator 3
forma complexo com GTP e liga-se ao ribossomo. Estes fatores de liberação
então promovem o corte do tRNA no sítio da cadeia polipeptídica. O GTP
que forma o complexo com RF1 é hidrolisado em GDP e Pi. Outros fatores
adicionais podem ajudar a liberação de todos os componentes, RNAm, RNAt
e ribossomos, os quais estão livres para começar novamente (Figura 11B).
Veja, na Figura 12, a comparação entre a organização gênica, transcrição e
tradução entre procariotos e eucariotos.

Figura 11 – (A) Início da tradução com a formação do complexo de iniciação. (B)

Resumo das etapas da tradução.
Fonte: Pierce (2004).
 Biologia Molecular 49

Os eventos pós
traducionais ocorrem
juntamente com o
dobramento da proteína
em sua correta forma
tridimensional. Isso ocorre
com a ajuda de proteínas
chaperonas, uma classe
encontrada em quase
todos os organismos, as
quais formam complexos
com outras proteínas,
fazendo que elas dobrem
ou voltem a se dobrar
(como no caso de eventos
de desnaturação proteíca).
Figura 12 - Comparação entre a organização gênica, transcrição e tradução entre Outras modificações
procariotos e eucariotos. Em A: o óperon triptofano mostra-se como um segmento consistem em: modificação
das cadeias laterais como a
contínuo do cromossomo de E. coli, contendo cinco genes e que codificam as en-
fosforilação, adição de grupos
zimas necessárias, passo a passo para a síntese do triptofano. Esse tipo de RNAm
fosfato por enzimas cinases,
é chamado policistrônico em comparação com o RNAm eucariótico monocistrônico. aos grupos hidroxila dos
Em B verifica-se que os mesmos genes encontram-se distribuídos em cromossomos aminoácidos serina, treonina
diferentes, e cada um forma um RNAm isolado. Observe que cada gene eucariótico e tirosina, enquanto que as
possui um promotor específico. enzimas fosfatases retiram
Fonte: Lodish et al. (1999). esses grupos. A ubiquitinação
consiste na adição de várias
cadeias de uma proteína
3.1 Código genético ubiquitina, que marca a
proteína para degradação
Observando com atenção o Quadro 1, que apresenta a conversão dos co-
por uma protease chamada
dons de DNA em aminoácidos, nota-se que alguns aminoácidos correspon- proteossomo. Sequências
dem a mais de códon. Existem 6 trincas que codificam para arginina (CGT, sinais correspondem a um
CGC, CGA, CGG, AGA, e AGG), ou seja, se no ribossomo estiver presente pequeno polipeptídio, o
qual direciona a proteína
a trinca CGT ou a trinca AGG, ocorrerá a adição de uma arginina na cadeia
para uma organela como o
polipeptídica. Outros aminoácidos possuem um número menor de códons, retículo endoplasmático, por
por exemplo: a valina corresponde a quatro códons; a isoleucina é codifica- exemplo. Se a proteína for de
da por três códons, e a fenilalanina corresponde a duas trincas. A existência membrana, esta é direcionada
para a membrana, passando
de códons que são sinônimos (determinam a introdução do mesmo aminoá-
por poros do retículo
cido na cadeia polipeptídica) faz com que o código genético seja redundante endoplasmático. Em
(ou degenerado). O único aminoácido que possui apenas um códon é a me- sua maioria, as proteínas
tionina, e o códon desse aminoácido (ATG) é sinal para o início do processo eucarióticas são inativas,
necessitando de modificações
de tradução.
promovendo ativação ou
degradação.
50 CECCATTO, V. M.

Código genético padrão

TTT F Phe TCT S Ser TAT Y Tyr TGT C Cys
TTC F Phe TCC S Ser TAC Y Tyr TGC C Cys
TTA L Leu TCA S Ser TAA * Ter TGA * Ter
TTG L Leu TCG S Ser TAG * Ter TGG W Trp

CTT L Leu CCT P Pro CAT H His CGT R Arg

CTC L Leu CCC P Pro CAC H His CGC R Arg
CTA L Leu CCA P Pro CAA Q Gln CGA R Arg
CTG L Leu CCG P Pro CAG Q Gln CGG R Arg

ATT I Ile ACT T Thr AAT N Asn AGT S Ser

ATC I Ile ACC T Thr AAC N Asn AGC S Ser
ATA I Ile ACA T Thr AAA K Lys AGA R Arg
ATG M Met ACG T Thr AAG K Lys AGG R Arg

GTT V Val GCT A Ala GAT D Asp GGT G Gly

GTC V Val GCC A Ala GAC D Asp GGC G Gly
GTA V Val GCA A Ala GAA E Glu GGA G Gly
GTG V Val GCG A Ala GAG E Glu GGG G Gly

Código genético de mitocôndrias de vertebrados

TTT F Phe TCT S Ser TAT Y Tyr TGT C Cys
TTC F Phe TCC S Ser TAC Y Tyr TGC C Cys
TTA L Leu TCA S Ser TAA * Ter TGA W Trp
TTG L Leu TCG S Ser TAG * Ter TGG W Trp

CTT L Leu CCT P Pro CAT H His CGT R Arg

CTC L Leu CCC P Pro CAC H His CGC R Arg
CTA L Leu CCA P Pro CAA Q Gln CGA R Arg
CTG L Leu CCG P Pro CAG Q Gln CGG R Arg
ATT I Ile i ACT T Thr AAT N Asn AGT S Ser
ATC I Ile i ACC T Thr AAC N Asn AGC S Ser
ATA M Met i ACA T Thr AAA K Lys AGA * Ter
ATG M Met i ACG T Thr AAG K Lys AGG * Ter

GTT V Val GCT A Ala GAT D Asp GGT G Gly

GTC V Val GCC A Ala GAC D Asp GGC G Gly
GTA V Val GCA A Ala GAA E Glu GGA G Gly
GTG V Val i GCG A Ala GAG E Glu GGG G Gly
 Biologia Molecular 51

Diferenças para o código padrão:

AGA Ter * Arg R
AGG Ter * Arg R
AUA Met M Ile I
UGA Trp W Ter
Quadro 1 - Códigos genéticos: padrão e mitocôndria de vertebrados.
Legenda: i - iniciação; ter - terminação.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=tgencodes#SG1

No código genético três códons (ATT, TAG, TGA) não correspondem

a aminoácidos; essas trincas são sinais de final de tradução (códons de pa- Código genético não deve
rada). O estudo do processo de tradução em várias espécies de organismos ser usado para designar
revelou que o código usado para conversão de nucleotídeos em aminoácidos a informação genética.
Muitas vezes código
é o mesmo. São poucas as exceções (veja na parte final do quadro) e, por
genético aparece na mídia
isso, o código genético é chamado de universal. como sinônimo para DNA,
Outras propriedades do código genético: a redundância ou degeneração, genoma, sequência de
nucleotídeos, teste do DNA,
a qual é o fato de um aminoácido ser codificado por mais de um códon. Códons
projeto genoma humano etc.
sinônimos codificam para o mesmo aminoácido (veja mutações sinônimas na O código genético consiste
Unidade 3). A oscilação corresponde ao fato de que muitos códons sinônimos na chave de codificação
diferem na terceira posição. O anticódon é encontrado no RNAt, o qual tem do alfabeto de 4 letras do
DNA para as 20 letras das
que ser complementar ao códon. Em 1966, Francis Crick desenvolveu a hipó-
proteínas. Veja esta citação:
tese da oscilação, que propôs que pareamentos não padrões de bases podiam “Em jogo está a glória de ser
ocorrer na terceira base, ficando mal pareados ou oscilantes. Assim, de 30 a 50 o primeiro a decifrar o código
tRNAs são suficiente para a cobertura dos 61 códons do código genético. Os genético do homem, o
chamado genoma humano.”
tRNAs são chamados, assim, de isoaceptores, pois, apesar de ter diferenças na
revista Veja (20 de outubro
terceira base de seu anticódon, levam o mesmo aminoácido. de 1999 - p. 106 seção
A matriz de leitura corresponde aos conjuntos (de três nucleotídeos) Ciência). Comentário: O
código genético foi decifrado
possíveis, de códons para cada sequência. Qualquer sequência de nucleotí-
em 1965.
deos possui potencialmente três matrizes de leitura. Lembre-se de que quem
determina a matriz é o códon iniciador, o qual é o primeiro códon a especificar
um aminoácido. O primeiro códon geralmente é o AUG (metionina), assim,
todas as proteínas iniciam sua cadeia com uma metionina (apesar de ser re-
tirada posteriormente). Nas bactérias, temos um tipo modificado de metionina
que inicia as proteínas bacterianas, a N-fomilmetionina, sendo que esse grupo
formil pode também ser retirado posteriormente.
Finalmente, conforme já comentado, o código genético é, geralmente,
não-superposto. Alguns vírus mostram código superposto, assim, duas prote-
ínas podem ser codificadas na mesma sequência.
52 CECCATTO, V. M.

Texto complementar
Estará a sociedade preparada?
Nota: O texto abaixo foi publicado em 1967.
Novas informações estão sendo obtidas no campo da genética bioquímica numa taxa
extremamente rápida. Até agora, este conhecimento teve relativamente pouco efeito
sobre o homem. Mais informação deve ser obtida antes que aplicações práticas sejam
possíveis sendo que os problemas técnicos a serem resolvidos são formidáveis. Entre-
tanto, quando estes obstáculos forem removidos este conhecimento vai infuenciar de
forma marcante o futuro do homem. Tal poder pode ser usado sabiamente ou não,
para melhoramento ou detrimento da humanidade.
Salvador Luria disse "o progresso da ciência é tão rápido que cria um desequilíbrio
entre o poder nas mãos dos homens e as condições sociais nas quais este poder é
exercido”. Então, nem o aviso dos cientistas, a extensão da informação pública ou o
desejo dos cidadãos podem compensar pelas inadequações das instituições de lida-
rem com as novas situações.
O público entende em alguma extensão os recentes avanços na genética bioquí-
mica, mas tem somente uma vaga noção do que pode se esperar para o futuro, a
despeito dos esforços de muitos cientistas em informar o público sobre prováveis
derivações futuras.
Onde estamos hoje? A linguagem genética agora é conhecida e está claro que a
maioria, se não todas as formas de vida do planeta, usa esta mesma linguagem, com
menores variações. Mensagens genéticas simples agora podem ser quimicamente
sintetizadas. Cirurgia genética, aplicada à microorganismos é uma realidade. Genes
podem ser preparados de uma estirpe bacteriana e inseridos em outra, a qual pode
ser mudada geneticamente. Tais mudanças são herdáveis. Até agora isto não foi pos-
sível ser feito em células mamíferas.
O que podemos esperar para o futuro? Mensagens genéticas curtas mas significa-
tivas podem ser sintetizadas quimicamente. Desde que as instruções sejam escritas
na linguagem reconhecível pelas células, a mensagem poderá ser usada para o pro-
grama celular. As células poderão carregar estas instruções e o programa poderá ser
herdado. Eu não sei quanto tempo teremos antes que seja possível programar células
com mensagens quimicamente sintetizadas. Certamente, os obstáculos experimen-
tais são formidáveis. Entretanto, eu tenho poucas dúvidas que os mesmos eventual-
mente serão transpostos. A única questão é quando. Meu palpite é que as células se-
rão programáveis com mensagens sintéticas dentro de 25 anos. Se os esforços nestas
linhas forem intensificados, as bactérias poderão ser programáveis dentro de 5 anos.
O ponto que merece uma ênfase especial é que o homem pode ser capaz de pro-
gramar suas próprias células com informações sintéticas antes que seja capaz de avaliar
adequadamente as consequências de longa data destas alterações, antes de ser capaz
de formular objetivos e antes de resolver problemas éticos e morais que ainda serão
levantados. Quando o homem tornar-se capaz de instruir suas próprias células ele deve
refletir se ele tem desejo suficiente para usar este conhecimento para o benefício da
humanidade. Afirmo este problema na necessidade de resolvê-lo, porque decisões con-
cernentes a aplicação do conhecimento deve ser feita em última análise pela sociedade,
e somente uma sociedade informada pode tomar tais decisões sabiamente.
Fonte: Nirenberg (1967).
 Biologia Molecular 53

Síntese da Parte
Na replicação, a dupla hélice é desenrolada na forquilha de replicação, os
nucleotídeos são polimerisados pela DNA polimerase, juntamente com a ação
de várias outras enzimas. Na transcrição, temos a enzima RNA polimerase a
qual faz a cópia em RNA dos genes. Os principais componentes da maqui-
naria de tradução são os três tipos básicos de RNA: RNAt, RNAr e RNAm. A
precisão da tradução deriva da especificidade de códon com anticódon, da li-
gação do RNAt com seu aminoácido e do inicio da tradução, em que o primei-
ro códon deve ser reconhecido pelo ribossomo. Um complexo de iniciação, o
qual reúne todos os componentes, com exceção feita a alguns fatores, reúne
as duas subunidades do ribossomo aos RNAs citados. O alongamento é feito
com o avanço do ribossomo no RNAm até chegar a um códon de finalização.

Atividades de avaliação
1. Procure em livros de Bioquímica os conceitos de anabolismo e cata-
bolismo. Dê exemplos.
2. Busque o papel das diferentes RNAs polimerases de eucariotos.
Faça um contraponto com os tipos e funções de DNAs polimerases
em procariotos.
3. Busque o passo a passo das ligações das snRNPs na formação do
spliceossomo.
4. Na leitura complementar apresentada “Estará a sociedade prepara-
da?” de 1967, o pesquisador Marshall W. Nirenberg diz “Meu palpite é
que as células serão programáveis com mensagens sintéticas dentro
de 25 anos.” Após a leitura da Unidade 5, comente sobre as previsões
de Nirenberg.
5. Ainda sobre esse texto, o que é possível dizer sobre a afirmação de
Niremberg: “está claro que a maioria, se não todas as formas de vida
do planeta, usa esta mesma linguagem, com menores variações”?
6. Observando o quadro que apresenta os códigos genéticos, que di-
ferenças encontramos entre os dois códigos apresentados? Por que
ainda consideramos o código genético universal? Verifique em outros
livros o código genético escrito com as letras do RNAm. Que diferen-
ças são verificadas?
54 CECCATTO, V. M.

Livros
• STRATHERN, P. Crick, Watson e o DNA em 90 minutos. Rio de Ja-
neiro: Jorge Zahar, 2007. 96 p.
• CHEDIAK, K. Filosofia da biologia. Rio de Janeiro: Jorge Zahar,
2008. 84 p.
• DAWKINS, R. A grande historia da evolução. São Paulo: Companhia
das Letras, 2009. 472 p.

Filmes
• Criação (Dir. Jon Amiel, 2009) - história da "Origem das espécies"
de Darwin.
• O vento será sua herança (Dir. Stanley Kramer, 1960 e também refil-
magem de Daniel Petrie de 1999) - famoso "julgamento do macaco"
que ocorreu no Tennesse – EUA, em 1925, sobre o ensino do darwi-
nismo nas escolas.
• O pesadelo de Darwin (Dir. Hubert Sauper, 2004) - Ecologia e am-
biente.

Sites
(Museus e exposições científicas):
• http://www.museunacional.ufrj.br/ (Museu Nacional)
• http://www.cienciaviva.org.br/ (Espaço Ciência Viva)
• http://www.eciencia.usp.br/ (Estação Ciência da USP)
• http://www.museufritzplaumann.ufsc.br/ (Museu Entomológico
Fritz Plaumann)
• http://www.mos.org/ (Boston Museum of Science - EUA)
• http://www.miamisci.org/ (Miami Science Museum - EUA)
• http://www.mnh.si.edu/ (Museu de História Natural do Smithsonian
Institute - EUA)
 Biologia Molecular 55

• http://www.ufrgs.br/ceclimar/ (Museu do Centro de Estudos Cos-

teiros, Limnológicos e Marinhos - CECLIMAR - UFRGS)
• http://www.fiocruz.br/museudavida/ (Museu da Vida - FIOCRUZ)
• http://www.museuhistoriconacional.com.br/ (Museu Histórico Na-
cional - MHN)
• http://www.museudomar.com.br/ (Museu do Mar – Santos/SP)

Referências
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BOUARICH-BOURIMI, R.; CAMPISI, J.; KIM, S.; BOUSSOUAR A.; OTTA-
VIANI, A.; MAGDINIER, F.; GILSON, E.; LONDONO-VALLEJO, A. Replication
timing of human telomeres is chromosome arm–specific, influenced by sub-
telomeric structures and connected to nuclear localization. PLoS Genetics,
Detroit, v. 6, n. 4, p. 1-15, 2010.
BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. Bioquímica. 6. ed. Rio de Ja-
neiro: Guanabara Koogan, 2008. 1.114 p.
LODISH, H.; BERK, A.; ZIPURSKY, S. L.; MATSUDAIRA, P.; BALTIMORE, D.;
DARNELL, J. E. Molecular Cell Biology. 4. ed. New York: W. H. Freeman and
Company, 1999. 1.084 p.
NIREMBERG, M. W. Will society is prepared? Science, New York, v. 157, n.
3789, 1967.
PIERCE, B. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Editora Guanabara Koo-
gan: Rio de Janeiro, 2004. 788 p.
WU, Z. A., MURPHY, C.; GALL, J. G. Small nuclear ribonucleoproteins and
heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in the amphibian germinal vesicle:
loops, spheres, and snurposomes. Journal of Cell Biology, New York, v. 113,
n. 3, p. 465-483, 1991.
 Parte 3
Polimorfismo gênico e
evolução molecular
 Capítulo 6
Considerações iniciais
e histórico

Objetivo
• Discutir variações genéticas e moleculares dentro do contexto evolutivo.

1. Aspectos gerais
Durante a maior parte do século vinte, o foco das pesquisas moleculares foi o re-
conhecimento dos fenótipos, identificando os produtos dos genes, as proteínas.
A partir do sequenciamento gênico vimos que, surpreendentemente, somente
uma parte do genoma eucariótico é destinada a essas proteínas. O genoma é
um sistema dinâmico, sempre em reparo e remodelamento. É mutável durante
o ciclo de vida do indivíduo e durante décadas e milênios, durante a evolução
de uma espécie, claro, dentro dos limites. As variações encontradas no geno-
ma variam de pessoa para pessoa, desde mudanças de uma base até rear-
ranjos cromossômicos em larga escala. Dessa forma, não existe um “genoma
humano”, genérico. Não existe o “normal” em qualquer sequência. O chamado
“tipo selvagem” ou wild type indica a versão mais comum ou mais frequente,
de uma característica genética na população, por exemplo, o olho vermelho
da Drosophila em relação ao olho branco, raro, o qual seria o “mutante”. O olho
é um fenótipo facilmente verificável, porém muitas variações não têm fenótipo
detectável, portanto, as variantes podem ser silenciosas, de tal forma que não
alteram visivelmente o fenótipo. A evolução molecular está em curso, porém
ainda não chegamos a compreender totalmente suas características.
Na agricultura e na pecuária, o conhecimento gênico é um grande aliado,
pois permite cruzamentos seletivos que podem aumentar ou diminuir a frequ-
ência gênica de determinadas características genéticas desejáveis de plantas
e animais. Essa seleção artificial proporcionou enormes vantagens de sobre-
vivência para o ser humano (embora estejamos pagando o altíssimo preço
ambiental desse estilo de vida). Essa seleção não é aplicável ao ser humano,
pois não é ético interferir nas liberdades individuais. O aconselhamento genéti-
60 CECCATTO, V. M.

Substâncias tóxicas: Uma

substância é considerada co, efetuado por especialistas médicos, é um serviço de grande alcance social,
tóxica quando causa dano ao
organismo. A injúria tóxica,
que busca evitar o sofrimento dos pacientes com anomalias. Existem defenso-
nesse sentido, refere-se a res da ideia de que os seres humanos deveriam evitar determinados casamen-
uma perigosa alteração, tos. Porém, existem extremistas que defendem, mesmo de forma velada, na
real ou potencial, da célula “melhoria” da espécie humana para características consideradas “desejáveis”
ou dos tecidos constituintes
e os processos, os quais
como inteligência, beleza, altura etc. Por outro lado, há correntes que defedem
podem ou não ser detectados que indivíduos suspeitamente propensos à violência, indivíduos de determina-
por sintomas clínicos bem dos grupos étnicos, homo ou bissexuais, pessoas com desvios sexuais tidos
claros. Uma substância como indesejáveis (como a pedofilia) etc, sejam impedidos de procriar e sejam
pode não ser, na realidade,
tóxica, mas as condições
até, castrados, ou mesmo mortos. A chamada eugenia buscaria aumentar a
são tais que ela pode frequência das “boas” características através de métodos absurdos, de castra-
apresentar risco à saúde. ção até genocídio em massa, como ocorreu durante o nazismo.
Nem todas as substâncis
tóxicas são sintéticas, muitas
Portanto, a humanidade não existe para ser “melhorada” e, como disse
são naturais, resultado dos Jacob Monod, não parece existir planos evolutivos que estejam dirigindo a evolu-
processos metabólicos ção (humana) para esta ou aquela direção. Mesmo que a pesquisa biológica fu-
dos organismos como tura indique, indubitavelmente, que certos comportamentos complexos (e mesmo
a solanina. A solanina é
uma toxina encontrada em
perigosos) sejam fortemente determinados no genoma, a ética deve sim, prepon-
batatas e solanáceas. É um derar em todos os sentidos em nossos estudos e atitudes. Muitas características
esteroide, glicoalcaloide. As são claramente deletérias; outras, nem tanto, e outras podem ser até vantajosas
batatas contêm de 2 a 15 em alguns casos. Quem deve ter a última palavra e determinar o que é adequado
mg/100 g de peso úmido de
batatas. Ela é um inibidor da
ou não adequado? O uso do determinismo genético, ou seja, a ideia de que somos
enzima acetilcolinesterase, o que nossos genes determinam, precisa e deve ser evitado a todo custo, especi-
do sistema nervoso. É almente à luz do conhecimento filosófico, da ética e da moderna Biologia.
necessária uma dose
muito alta para atingir
efeitos tóxicos, pois ela 2. Breve histórico
tem baixa absorção pelo
trato gastrointestinal. Há
O estudo das mutações está estreitamente ligado ao estudo químico, históri-
poucos estudos sobre sua co, de substâncias tóxicas. Especialmente de uso militar, essas substâncias
mutagenicidade. O que tóxicas podiam matar ou prejudicar o ser humano, além de animais e plantas.
define a toxicidade não é a Dessa forma, eram sistematicamente estudados nos laboratórios, para verificar
substância, mas a quantidade
ingerida. A ricina, extraída da
seu potencial mutagênico. As mutações podem surgir espontaneamente, mas
planta mamona, é uma das sempre se pergunta se alterações ambientais não teriam causado tal mutação.
três substâncias que acredi- Algumas substâncias químicas e radiação possuem ação mutagênica, embora
ta-se serem as mais tóxicas. seus efeitos variem consideravelmente em relação às doses aplicadas, à con-
Ela é o legendário veneno do
guarda-chuva, possivelmente
centração dos reagentes, intensidades utilizadas e outros fatores variáveis.
usado por espiões. Um mg de Em 1927, o pesquisador americano Joseph Hermann Muller demons-
ricina pode matar um homem trou que as mutações em moscas podiam ser induzidas por radiações, como
adulto. As outras duas
substâncias mais potentes
os raios X. Os raios X aumentavam muito o número de mutações nas gera-
são o antrax e a toxina ções posteriores, em todos os organismos estudados. Junto com Thomas
botulínica. Pesquise sobre Hunt Morgan, foi um dos redescobridores do mendelismo, publicando o livro
esse interessante assunto. The Mechanism of Mendelian Heredity conforme já contamos.
 Biologia Molecular 61

A geneticista Charlotte Auerbach, nascida em Berlim, em 1899, migrou

para a Inglaterra, onde conduziu pesquisas sobre mutações em Drosophila. Efeitos biológicos das
Na Inglaterra encontrou Muller, que mostrou que a radiação induz mutações. radiações: As células,
quando expostas à
Charlotte, então, começou a tentar induzir mutações em Drosophila, com radiação, sofrem ação
substâncias químicas, porém sem muito sucesso. Na época havia muitos de fenômenos físicos,
pesquisadores desenvolvendo o gás mostarda (utilizado na Primeira Guerra químicos e biológicos. A
Mundial). Colaborando com o farmacologista James Michael Robson. Eles radiação causa ionização
dos átomos, que afeta
mostraram que o gás mostarda era um potente mutagênico, reduzindo a via- moléculas, que poderão
bilidade dos gametas e aumentando o número de mutações nas gerações afetar células, que podem
de moscas. Ela experimentou outros agentes químicos sobre Drosophila, afetar tecidos, que poderão
Neurospora e leveduras. Suas experiências, comparando os raios X e as mu- afetar órgãos, que podem
afetar a todo o corpo. Os
tações induzidas quimicamente, mostraram que os raios X causaram muta- linfócitos (glóbulos brancos)
ções em todo o corpo, enquanto que os produtos químicos causaram muta- e das células que produzem
ções em apenas algumas partes do corpo. Outro resultado mostrava que os sangue estão em constante
raios X produziram mais alterações cromossômicas do que os mutagênicos reprodução e são as mais
sensíveis às radiações.
químicos. A explicação para isso, segundo Auerbach, foi que os raios X produ- As células reprodutivas e
ziam alterações genéticas quase que imediatamente. Os produtos químicos gastrointestinais não se
são mais atrasados, e apenas alguns genes foram afetados após várias divi- reproduzem tão rápido,
sões celulares. portanto, são menos
sensíveis. Células nervosas
Em agosto de 1945, ocorreu o lançamento da bomba atômica sobre a ci- e musculares são as mais
dades de Hiroshima e de Nagasaki, no Japão. Nesse momento, foram liberadas lentas e, portanto, as
imensas quantidades de radiação. O acidente no reator nuclear de Chernobyl, menos sensíveis. Os efeitos
somáticos classificam-se em
no nordeste da Ucrânia, ocorreu em 1986. Estima-se que ocorreu a liberação imediatos e retardados com
de cerca de 100 milhões de Curies, o equivalente radioativo a uma bomba atô- base num limite adotado por
mica, a qual seria pouco menor que as lançadas anteriormente. Evidentemente, convenção, de 60 dias. O
a ciência e a tecnologia dos anos 80 possibilitaram um melhor entendimento mais importante dos efeitos
imediatos das radiações
das patologias e das alterações em decorrência dessa tragédia. Considera-se após exposição do corpo
que a taxa de câncer de tireoide de crianças em toda a Ucrânia seja cerca de inteiro a doses relativamente
dez vezes maior que os níveis pré-explosão. Evidentemente, esses lamentáveis elevadas é a Síndrome
acontecimentos lançaram inúmeras questões sobre o papel das radiações nas Aguda de Radiação
(SAR). O efeito retardado
frequências populacionais relacionadas a diversas patologias, tanto congênitas de maior relevância é a
quanto não congênitas. As sequências de DNA dessas populações foram exa- formação de tumores,
minadas, evidenciando o potencial nocivo das radiações. os quais, geralmente, só
aparecem vários anos
Caso fosse possível concluir algo sobre esses terríveis acontecimentos, após a irradiação. A SAR
vemos que, apesar do avanço científico que essas técnicas propiciaram, do varia conforme a dose e a
outro lado da moeda temos sérios questionamentos éticos que o mau uso absorção diferencial dos
delas causou. Cientistas criaram a bomba atômica e sabe-se, que mesmo órgãos do corpo.
hoje em dia, suspeita-se do desenvolvimento de armas químicas e biológicas.
Considere a ideia de que o cientista é neutro, imparcial, incorruptível, um ser
quase divino, acima do bem e do mal como uma falácia, um mito.
 Capítulo 7
Variação gênica

1. Bactérias, genes e plasmídeos

As bactérias são organismos-chave para o entendimento da Biologia Molecular.
São nelas que os mais importantes princípios bioquímicos e moleculares fo-
ram descobertos. As bactérias, como E. coli, possuem um ou dois cromosso-
mo circulares. Os plasmídeos são elementos genéticos extracromossômicos,
pequenas moléculas de DNA circular. Os plasmídeos possuem tamanho vari-
ável, de poucos milhares a mais de cem mil pares de bases. Em comparação
Teoria endossimbiótica:
ao genoma bacteriano, como E. coli, a qual possui cerca de 4,6 milhões de pa-
considera que as
mitocôndrias e os res de bases, são relativamente pequenos. As bactérias possuem um ou mais
cloroplastos já foram plasmídeos. Em geral, não possuem genes essenciais para o funcionamento
bactérias de vida livre que se metabólico da célula bacteriana, porém são essenciais para a reprodução,
tornaram endossimbiontes
pois alguns promovem a reprodução da bactéria, outros contêm genes para
de células eucarióticas
primitivas. eliminar outras bactérias, portanto, possuem uma função na sobrevivência e
Heteroplasmia e muitos contêm genes de resistência a antibióticos. A chamada competência
homoplasmia: a presença bacteriana é uma característica de algumas espécies que são mais capazes
de mutações no DNA
de captar o DNA exógeno. Sob condições apropriadas, qualquer DNA pode
plastídico é comum.
Quando numa célula temos ser transferido para células competentes, mesmo sendo não bacteriano. As
mitocôndrias contendo DNA células que recebem o DNA são chamadas transformantes.
mutante e mitocôndrias
Como possui sua própria origem de replicação, o DNA se reproduz in-
contendo DNA não mutante,
chamamos esta condição dependentemente do cromossomo bacteriano. Epissomos são plasmídeos,
de “heteroplásmica”. capazes de se replicar independentemente ou de se integrar ao cromossomo
Quando todas são iguais bacteriano. As bactérias podem transferir e recombinar informações genéticas
(todas mutantes ou todas
através de três mecanismos diferentes: conjugação, transformação e trans-
não mutantes), chamamos
‘homoplasmia’. dução. A conjugação é a transferência direta de plasmídeos através de uma
conexão; na transformação, ocorre incorporação do DNA do meio, sendo este
introjetado dentro da bactéria e podendo sofrer troca de genes, ou recombi-
nação com o cromossomo bacteriano. Na transdução, os vírus bacterianos,
como os bacteriófagos, levam DNA de uma bactéria para outra. Desta forma
genomas bacterianos são remodelados e permite evolução em um organismo
que não possui atividade sexual.
 Biologia Molecular 63

Fosforilação oxidativa:
2. Genomas extra nucleares: mitocôndrias processo que gera ATP
e cloroplastos nas mitocôndrias. Ocorre
na membrana interna da
Sabemos que, além do genoma nuclear, existem outros genomas, nas mito- mitocôndria, requerendo
côndrias e nos cloroplastos. A teoria endossimbiótica diz que um precursor vários transportadores de
da célula eucariótica (proto eucarioto) endocitou uma possível proto bactéria elétrons diferentes, proteínas
ou célula procariótica. As mitocôndrias e os cloroplastos teriam sido formados codificadas pelo mtDNA e
genes nucleares.
pela evolução dessas estruturas (Figura 1). Acredita-se que este evento tenha Radicais livres: é um termo
ocorrido entre 1 e 1,5 bilhão de anos atrás. As bactérias fotossintéticas e as usado para designar átomo
células eucarióticas também levariam à evolução dos cloroplastos. ou molécula com existência
independente, contendo
um ou mais elétrons não
pareados, nos orbitais
externos. São altamente
reativos, capazes de reagir
com qualquer composto
situado próximo à sua órbita
externa, passando a ter
função oxidante ou redutora
de elétrons. Organelas que
metabolizam o oxigênio,
o nitrogênio e cloro, que
geram grande quantidade de
metabólitos. São as grandes
produtoras de radicais livres.

Figura 1 - Mapa esquemático do genoma do cloroplasto de Phaseolus vulgaris

(plastoma). Os genes que aparecem fora do mapa são transcritos na direção do
relógio e na parte interna contra. Íntrons são indicados por um asterisco.
Fonte: Guo et al. (2007).

O genoma mitocondrial das células atuais é muito pequeno. A maioria

das proteínas necessárias para o metabolismo da mitocôndria é obtida a par-
tir do genoma nuclear. Comparativamente às células bacterianas atuais, as
quais possuem poucos Megabase de DNA e algumas centenas ou milhares
64 CECCATTO, V. M.

Padrões isoenzimáticos:
enzimas que apresentam de genes, considera-se que esses genes teriam sido transferidos para o ge-
padrões de isoformas
enzimáticas e, portanto, na
noma da célula hospedeira. O genoma mitocondrial consiste em uma única
eletroforese de proteínas molécula de DNA circular, altamente helicoidizada. As plantas contêm mito-
formam muitas bandas, côndrias que comportam um conjunto complexo de múltiplas moléculas circu-
ou seja, são altamente lares de DNA. Como foi comentado anteriormente, os genomas mitocondriais
polimórficas e dessa forma,
permitem que se verifique a
são muito pequenos em relação ao núcleo celular. Não possui histonas, da
variabilidade genotípica. mesma forma que as bactérias. Outra particularidade é que possui conteúdo
GC diferente do genoma, nuclear de forma que o genoma mitocondrial pode
ser separado por uma centrifugação diferencial.
As mitocôndrias e os cloroplastos presentes no citoplasma são, em ge-
ral, herdados de um só genitor (herança uniparental). Nos animais, o mtDNA é
Insuficiência cardíaca herdado quase que exclusivamente da mãe, embora a literatura acuse exce-
e polimorfismo gênico: ções. As células podem conter dezenas a centenas de organelas, sendo que
apesar dos avanços
terapêuticos no último cada uma pode conter muitas cópias do genoma dessa organela. Uma célula
século, a insuficiência de fígado de rato, por exemplo, pode conter 5 a 10 moléculas de mtDNA em
cardíaca continua sendo cerca de 1000 mitocôndrias, e o mtDNA equivale a 1% do DNA celular. É pos-
uma das principais sível que haja populações de organelas com mutações diferentes, convivendo
causas de mortalidade,
de internação hospitalar e na mesma célula, uma condição chamada heteroplasmia. Quando essa cé-
de limitação funcional em lula se divide, sua prole pode apresentar fenótipos diferentes.
todo o mundo. Nas últimas O mtDNA humano é uma molécula circular com 16.569 pb que codifi-
décadas, a influência
dos fenótipos vem sendo
cam dois rRNAs, 22 tRNAs e 13 proteínas. Essas proteínas auxiliam na fos-
utilizada para a avaliação do forilação oxidativa, mas não suprem totalmente a demanda de proteínas para
prognóstico dos pacientes, essas reações, as quais são complementadas pelos genes nucleares. Essa
porém, em um grande relação é essencial para se compreender porque certas patologias e, até mes-
número de casos, pacientes
com fenótipos semelhantes
mo, o próprio envelhecimento do organismo, causam diminuição na quantida-
evoluem de formas de de ATP. Estudos mostram que o mtDNA, com a idade, acumula mutações,
distintas. Há, portanto, a especialmente pela proximidade da produção de radicais livres produzidos
necessidade de se pesquisar pelos processos citados. Os tecidos, como músculo e cérebro, necessitam de
os fatores genéticos que
possam influenciar em um
ATP em grande quantidade e com a idade, e certas patologias associadas po-
prognóstico individualizado. dem apresentar sintomas como deficiência no movimento, devido à demanda
Os principais polimorfismos de ATP pela musculatura esquelética, diminuição no raciocínio e na memória,
envolvidos são os genes do devido à demanda nervosa e cerebral, além dos rins, fígado e pâncreas.
receptor beta adrenérgico,
o da enzima conversora de
angiotensina, da aldosterona, 3. Polimorfismo e marcadores moleculares
da angiotensina, do fator de
necrose tumoral (TNF-α) e Observando o genoma, torna-se possível verificar vários tipos de polimorfis-
do óxido nítrico. mos: polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), tra-
tado na Unidade 5, consiste de um polimorfismo que depende do genoma ser
cortado com enzimas de restrição, portanto, baseia-se totalmente na técnica.
O polimorfismo de curtas repetições em tandem são repetições de dezenas
a centenas de bases, sendo que o número de polimorfismos é herdável. A
 Biologia Molecular 65

aplicação mais conhecida é o teste de paternidade. As repetições podem ser

detectadas por Southern Blot ou por PCR (veja também a Unidade 5). O poli-
morfismo de um único nucleotídeo (SNP) foi comentado na Unidade 1.
Um problema importante em biologia é a discriminação de genótipos.
Uma área que chama a atenção dos biólogos, porém relativamente confusa
em termos de definição, os marcadores moleculares é uma expressão cole-
tiva para um grupo de recursos destinado a várias funções em Bioquímica,
Biologia Molecular e Genética. Assim, em razão do seu nível de polimorfismo,
podemos ter sequências (proteínas e DNA) que podem discriminar grupos,
subgrupos ou mesmo indivíduos em particular. Os marcadores vieram em
função da necessidade de novos descritores, além dos utilizados tradicional-
mente pelos biólogos. Os descritores morfológicos são características morfo-
lógicas descritas pelos geneticistas, por exemplo, quando precisam descrever
ou cultivar uma nova variedade.
A década de 70 viu o surgimento de descritores baseados em enzimas e
proteínas. Várias enzimas contêm múltiplas isoformas (isoenzimas) que apa-
recem especificamente em determinados genótipos, influenciando na atividade
e caracterizando diferentes valores quantitativos e qualitativos. Dez anos após
os primeiros trabalhos com descritores de proteínas e enzimas, surgiram os de
DNA, com capacidade de detectar variação genética adicional. O avanço prin-
cipal que essas técnicas trazem é a possibilidade de acessar diretamente o ge-
nótipo de um indivíduo, evitando, assim, a expressão do fenótipo e a influência
do ambiente sobre ele. Também, enquanto os descritores de proteína amostram
apenas as regiões ativas na expressão gênica, os marcadores de DNA permi-
tem uma ampla amostragem do genoma de um indivíduo. Mutações que ocor-
rem em regiões não codificadoras de genes podem ser identificadas com aná-
lise de DNA, mas não com a análise morfológica ou de proteínas. Entretanto,
marcadores bioquímicos ainda são muito utilizados.
Em tese, qualquer sequência de DNA pode ser chamada de marcador
molecular (veja Fingerprint, na Unidade 5). Essas sequências são, geralmen-
te, muito polimórficas e sempre são herdáveis. Existe um número quase ilimi-
tado de descritores de DNA disponíveis, possibilitando o acesso da variabili-
dade genética utilizáveis para quaisquer tipos de organismo. O problema a ser
resolvido no laboratório é como visualizar e quantificar o polimorfismo, para
que seja possível fazer as devidas comparações entre os genótipos.
As técnicas incluem o uso de sondas, reação em cadeia da PCR, eletro-
forese, análise de fragmentos de restrição, comparações via sequenciamento do
DNA, enfim, praticamente quase todos os recursos disponíveis (veja Unidade 5).
66 CECCATTO, V. M.

O homem domesticou, na 3.1 Aplicação: melhoramento genético

sua existência, somente
cerca de cem a duzentas, O melhoramento genético envolve uma série de técnicas genéticas clássicas,
de milhares de espécies como o cruzamento e a seleção das progênies. Para fazer isso, é necessário
vegetais. Destas, menos
de 15 atualmente suprem
que o pesquisador tenha à sua disposição um banco de germoplasma. Uma
a maior parte da dieta coleção, contendo a maioria ou, pelo menos, o máximo número das raças, das
humana. Essas 15 espécies variedades, dos tipos e dos subtipos de plantas e animais de interesse eco-
podem ser agrupadas nas nômico, na necessidade de fazer cruzamentos direcionados. Universidades,
seguintes classes: cereais
(arroz, trigo, milho, sorgo
institutos e empresas particulares sempre buscam agregar novos acessos ao
e cevada); raízes e caules seu plantel. É assim com o café, o trigo, os caprinos, o arroz, as frutas tropicais
(beterraba, cana-de-açúcar, e muitos outros, até mesmo flores e plantas ornamentais.
batata, mandioca e inhame);
legumes (feijão, soja e
Na França, desde 1990, os dados de padrões isoenzimáticos são re-
amendoim) e queridos para a identificação e o registro de novas linhagens de milho, ha-
frutas (citros, banana, vendo planos de solicitar os padrões de marcadores de DNA. Mesmo assim,
manga etc). Quando o o uso de marcadores moleculares para registro de novas variedades ainda
melhoramento de plantas
teve seu início? O milho e
é limitado, mesmo em países onde a proteção de cultivares já há praticada
outras as culturas mostram a bastante tempo. No entanto, com a recente disponibilidade de tecnologias
detalhes que atestam que de DNA que revelam alto nível de polimorfismo e consistência nos resultados,
ele começou na mais remota é provável que os marcadores moleculares passem a ser incluídos no regis-
antiguidade e não era um
trabalho cientificamente
tro de novos genótipos. No Brasil, com a Lei de Proteção dos Cultivares, os
dirigido. O melhoramento marcadores tornaram-se essenciais na identificação e no reconhecimento de
executado pelo homem germoplasma em plantas (veja o texto complementar).
primitivo resultava da simples
procura de tipos mais
adequados para satisfazer a 4. Alterações cromossômicas
suas necessidades. O milho
é originário do Novo Mundo,
A poliploidia ocorre em células e organismos quando possuem mais de dois
onde foi domesticado pelos pares de conjuntos homólogos de cromossomos. Mudanças no número de
índios. Há milhares de cromossomos podem ser de dois tipos: euploidia aberrante e aneuploidia. No
anos, espalhou-se pelas primeiro caso, temos mudanças em conjuntos completos de cromossomos
Américas, a partir do México
(provável centro de origem),
e, no segundo, somente em partes dos cromossomos (Veja o item 7.7 muta-
e, quando aqui aportaram, ções). A poliploidia é especialmente comum em plantas (Figura 2), também
os europeus encontraram ocorre em animais como Carassius auratus auratus (peixe dourado), no sal-
centenas e centenas de mão e nas salamandras. A poliploidia, entretanto, raramente ocorre em hu-
variedades conservadas
pelas várias tribos indígenas.
manos, restringindo-se a alguns tecidos, como o fígado e o tecido muscular.
Principalmente a partir do Algumas condições patológicas provocam trissomias, tetrassomias e outras
século XIX, os melhoristas condições de variação do número de cromossomos, mas que não se com-
eram apenas pessoas param ao verificado em termos de ploidia em outros organismos. Organismos
práticas que tinham
habilidade de selecionar,
com múltiplos de conjuntos cromossômicos básicos (genoma) são chamados
dentre muitas outras, as de euploides.
plantas que apresentavam
diferenças e que podiam ser
de interesse econômico.
 Biologia Molecular 67

Organismos
geneticamente
modificados contêm uma
sequência nova de DNA ou
contêm DNA recombinante.
Todo transgênico é um
OGM. Existem diferenças
sutis entre os dois
conceitos. Nem todo OGM
é um transgênico, ou seja,
Figura 2 - Melancia sem sementes, rosa gigante e forrageira mais produtiva. A me- um OGM pode ter um
lancia sem semente é uma variedade triploide japonesa, resultado do cruzamento de gene overexpresso, ou
plantas diploides (2n) com tetraploides (4n), produzindo sementes triploides (3n) inviá- subexpresso, pode não
veis. Tem mais sabor e polpa, porém necessita de maior quantidade de mão-de-obra ter sido introduzido um
para fazer os cruzamentos entre as plantas 2n e 4n. Rosas e gramíneas tetraplóides. gene, mas feitas alterações
que podem aumentar a
Fonte: http://www.google.com.br/search?hl=pt-BR&q=Melancia+sem+semente&btnG=Pesquisar&meta=&
aq=f&aqi=&aql=&oq=&gs_rfai= expressão de um gene.
Portanto, o conceito de OGM
engloba o de transgênico.
Nos organismos poliploides, é possível distinguir os autopoliploides, que
têm conjuntos cromossômicos múltiplos com origem dentro de uma espécie,
e alopoliploides, que têm conjuntos de duas ou mais espécies diferentes. Os
alopoliploides formam-se apenas entre espécies proximamente relacionadas.
No caso de conjuntos cromossômicos diferentes, são chamados homeólogos
(parcialmente homólogos).
Mudanças na estrutura dos cromossomos devidos às quebras no DNA
também são conhecidas como rearranjos. Por exemplo, um segmento cro-
mossômico pode ser perdido, constituindo uma deleção, ou duplicado (não
confundir com duplicação gênica) ou invertido. A translocação move um seg-
mento para outro cromossomo. As causas e como ocorrem esses rearranjos
não serão discutidos aqui, mas são facilmente revisáveis nos bons livros de
estudos genéticos ou na rede mundial de computadores.

5. O valor C em discussão
Em 1948, Roger e Colette Vendrely apresentaram um trabalho que mostrava
que o conteúdo do DNA nuclear das células em todos os indivíduos é cons-
tante, dentro de uma dada espécie animal. Essa afirmativa demonstrava que
o DNA, não a proteína, era a substância na qual os genes são compostos. A
quantidade de DNA dentro de uma espécie e dentro de um mesmo indivíduo
(ressalvadas condições especiais da presença, em um mesmo organismo, de
células com diferentes níveis de ploidia) é aceita como Constante. O valor C
define a quantidade de DNA do genoma haploide, não replicado, de um indiví-
duo (Figura 3). Esse termo foi sugerido pelo biólogo canadense T. R. Gregory
em 2000. Assim, a quantidade de DNA é expressa em picogramas (pg), 10-12g
68 CECCATTO, V. M.

ou em mega pares de bases de nucleotídeos (Mb = 106 pares de bases), sendo

que 1pg corresponde a 965Mb. O valor C pode ser muito importante no estudo
comparativo de grupos de organismos em várias áreas do conhecimento bioló-
gico, como a fitogeografia e a sistemática.

Figura 3 - Número de genes em vários organismos.

Fonte: http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/hisbiotech/hisbiotech.htm

Alguns autores têm desafiado a premissa do valor constante, citando

casos isolados que apresentam alterações na quantidade de DNA que pode-
ria ser influenciada por fatores ambientais, mas salientam a necessidade de
repetições e amplas discussões sobre o assunto, o que poderia atualizar o
conceito da constância do valor C.
Ao se examinar as grandes linhas evolutivas, é possível perceber uma
relação geral entre aumento da quantidade de DNA e complexidade evolutiva.
Leveduras possuem 14 Mb; Caenorabiditis elegans possui 100 Mb; humanos,
3500 Mb. Profundamente chocante, porém, foi a descoberta que, ao exami-
narmos os eucariotos, vemos que essa quantidade pode variar em até 80.000
vezes, que essa variação não se condiz com a complexidade dos organis-
mos nem com o número de genes. Veja a Figura 4, apresentanto caso do
genoma mitocondrial. O caso dos anfíbios é o mais destacado, pois possuem
muito mais DNA nuclear do que os mamíferos. Salamandras possuem 40 ve-
zes mais DNA que os humanos. Samambaias, consideradas plantas primiti-
vas, apresentam valores altos em relação às angiospermas. Esse chamado
paradoxo do valor C aparentemente não tem ainda explicação adequada:
Presença de íntrons, transposons, DNA carregado passivamente pelos cro-
mossomos, DNA com funções não gênicas, entre outras.
 Biologia Molecular 69

Figura 4 - Mais de 200 genomas mitocondriais já foram determinados. Os tamanhos

de alguns desses mtDNA são mostrados em escala. Círculos representam genomas
circulares e linhas, lineares. O círculo maior mostra o genoma de Rickettsia pro-
wazekii, uma pequena bactéria patogênica cujo genoma é o que mais lembra uma
mitocôndria. O número de proteínas codificadas não corresponde ao tamanho dos
genomas, enquanto o mtDNA humano codifica 13 proteínas; o DNA de Arabidopsis
codifica somente 32 proteínas (apenas 2,5 vezes mais), sendo 22 vezes maior. O
mtDNA do protozoário Reclimonas americana tem 97 genes, mais que qualquer mi-
tocôndria de qualquer organismo analisado.
Fonte: Alberts et al. (2008).

Para obtenção dos valores C, os pesquisadores vêm usando técnicas

como microdensitometria por Feulgen, a qual se baseia na ligação específica
do DNA ao corante Feulgen (ou reagente de Schiff). Outra técnica que vem
sendo utilizada é a citometria de fluxo, a qual foi inicialmente desenvolvida
para contagem e análises rápidas de células sanguíneas. A partir da década
de 80, começou a ser adaptada para células vegetais. Essa técnica envolve a
análise das propriedades óticas de partículas em fluxo, movendo-se em rela-
ção ao ponto de medida. As partículas estão hidrodinamicamente contidas no
centro de um fluxo estreito de líquido e passam por um foco de luz intensa, o
que permite a excitação dos fluorocromos presentes nas partículas. Os pulsos
de luz e de fluorescência são colhidos por um sistema de detecção ótica, se-
parados por filtro e convertidos em pulsos elétricos por sensores óticos.
Um excelente local da rede mundial de computadores para dados sobre
o tamanho de genomas (animais) é o site Animal Genome Size Database:
http://www.genomesize.com.
70 CECCATTO, V. M.

6. Elementos de transposição
Barbara McClintock nasceu em 1902 e estudou botânica na Cornell University
– EUA. Tentou entrar para a pós-graduação em Genética, mas não foi aceita,
por ser mulher. Conseguiu entrar na pós-graduação em Botânica e estudou os
cromossomos de milho. McClintock permaneceu na Universidade, estudando
ligação entre genes, crossing over, mapeamento gênico com rearranjos cro-
mossômicos etc. Um problema da época era a presença de grãos chamados
de variegados ou multicoloridos. Os grãos eram incolores ou pigmentados, mas
nesse caso, tinham faixas de cor. Rollins Adams Emerson, contemporâneo de
McClintock, sugeriu que essas faixas coloridas eram resultado de uma mutação
instável, porém não havia maiores explicações. McClintock sugeriu, em 1948,
que essa mutação era resultado de um gene que se movia, apresentando a
hipótese de que havia inclusive genes controladores, mas que também se mo-
viam juntos. Alfred Sturtevan, destacado geneticista da época, comentou: “eu
não compreendi uma palavra do que ela disse, mas se ela diz que é assim, deve
O transposon Mutator (Mu)
ser mesmo”. Seu trabalho somente foi reconhecido e devidamente interpretado
foi originalmente identificado
em milho e depois utilizado quando se verificou a presença de transposons nos anos 70 e 80 em prati-
para a identificação de camente todos os organismos estudados. Ela ganhou o prêmio Nobel em 1984.
genes. Possui dois genes
Estamos acostumados a sequências de DNA que ocupam seus loci gênicos
que são transcritos em
sentido inverso, a partir fielmente nos seus respectivos cromossomos nucleares e nos genomas das mito-
de promotores que estão côndrias e dos cloroplastos. Entretanto, existem sequências que, por incrível que
contidos nas repetições possa parecer, levam vidas particulares, independentes da replicação do cromosso-
terminais invertidas
mo, ou seja, não estão ligadas restritamente ao ciclo celular para se reproduzir. Nas
chamadas de mudrA
e mudrB. A proteína bactérias e em alguns eucariotos, encontramos pequenas moléculas circulares que
codificada de mudrA: MURA se replicam independentemente, nossos conhecidos plasmídeos. Como vimos, os
tem homologia com as epissomos se comportam como plasmídeos, porém se integram ao DNA hospedei-
transposases bacterianas,
ro, como um vírus, incluindo os próprios fagos que infectam as bactérias. Da mesma
sendo encontrada em
diversas espécies vegetais, forma, ocorre a dinâmica dos elementos transponíveis ou transposons (já chamados
enquanto que o outro gene de “genes saltadores”). Geralmente inserem cópias de si mesmos em outras se-
mudrB codifica para a quências ou, mesmo, ele próprio é capaz de sair de um lugar no genoma e inserir-se
proteína MURB, cuja função
em outro. Os processos de transposição ainda não são bem esclarecidos, porém o
ainda não está esclarecida.
O sistema Mutator pouco que sabemos é um pouco estarrecedor, a princípio, porém, a estranheza cos-
compreende também tuma desvanecer-se à medida que conhecemos os processos de remodelamento
sequências denominadas do genoma. Assim, veremos que a transposição tem suas semelhanças com a re-
MuLES (Mutator-like
combinação por crossing over, por exemplo.
elements), encontrados
também em arroz, algodão, Alguns elementos transponíveis carregam genes com efeitos fenotípi-
soja e Arabidopsis. cos adaptativos, como exemplo clássico, genes para resistência a antibióti-
cos. Entretanto, tem sido visto também que muitos elementos móveis podem
transportar somente genes essenciais para sua transposição, especialmente
transposases, as quais são enzimas para a transposição. Quase 50% do ge-
 Biologia Molecular 71

noma humano é derivado de sequências produzidas por transposição, (veja

a Figura 5). Note que os estudos mostram que a maioria dessas sequências
estão inativas, incapazes de mais transposição, possivelmente há cerca de 50
milhões de anos. Os estudos sobre algumas patologias têm mostrado ativida-
de dessas sequências. Veja a presença da sequência Alu na figura 6.

Figura 5 - Transposição simples. A transposição simples não envolve replicação do

transposon. A enzima transposase cliva em ambos os lados do transposon e introduz
o elemento através do corte em extremidades coesivas. Os gaps são consertados
pela reparação do DNA feita pela DNA polimerase.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).
72 CECCATTO, V. M.

GGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGG
GCGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACC
CCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGGCGTGGTGGCGCGCGCCTGTA
ATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGG
AGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCG
AGACTCCGTCTC

Sequência Alu
Figura 6 - Exemplo de elemento de transposição – Sequência Alu - encontrada em
mais de um milhão de cópias no genoma humano, constituindo cerca de 11% do
nosso DNA. Na figura, vemos um cariótipo humano feminino, mostrando em tons
mais claros, os locais de concentração. A seguir, temos a sequência. Note que, dentro
destes 11%, encontramos muitas alterações devido a mutações. Portanto, elas não
são sempre iguais. A sequência Alu é um exemplo de SINE (veja Unidade 1). Várias
desordens herdáveis têm sido atribuídas à recombinação mediada por sequências
Alu, incluindo a diabetes tipo II insulinorresistente, sídrome de Lesch-Nyhan, doença
de Tay-Sachs, deficiência de componente C3, hipercolesterolemia e α-talassemia,
incluindo o Sarcoma de Ewing, o câncer de mama e a leucemia mielócita aguda.
Fonte: Batzer e Deininger (2002).

7. Mutações
O DNA é a fonte de informação genética, e a célula investe muito na manu-
tenção dessa informação. Existem vários mecanismos altamente eficientes
que proporcionam reparação ao DNA modificado ou danificado. Para que as
células e os organismos possam ter chances de sobrevivência, as sequências
de DNA devem ser passadas exatas e inalteradas para as próximas gerações.
Altas taxas de mutações significam alterações metabólicas que podem acar-
retar distúrbios agudos ou crônicos e morte. Taxas menores podem perturbar
o metabolismo de forma a ainda manter certo grau de sobrevivência do in-
divíduo, porém com possíveis repercussões na reprodução da célula ou do
indivíduo. Com a morte da estrutura ou do indivíduo antes de sua reprodução,
as mutações não são incorporadas na população, desaparecendo antes de
deixar descendentes mutantes que a perpetuem.
 Biologia Molecular 73

Erros na replicação e lesões químicas espontâneas do DNA podem alterar

bases e lesões causadas por mutagênicos e até romper as pontes fosfodiéster.
Essas alterações podem ser transmitidas ou, em determinados casos, inviabilizar
a célula ou o próprio organismo a ser derivado por essa célula. As mutações po-
dem ocorrer em qualquer gene e em qualquer local do gene, no entanto, são mais
frequentes nos seguintes casos: a) em regiões com sequências de DNA repetitivas
ou simétricas, os chamados pontos quentes (hotspots), nos quais aumenta o risco
de uma cadeia de DNA emparelhar consigo própria durante a replicação; b) em
genes de maior tamanho, que, assim, têm uma maior probabilidade de sofrer alte-
rações na sua sequência de bases; c) em genes do genoma mitocondrial que não
têm mecanismos de reparação do DNA.
Percebe-se, então, um paradoxo relativo ao metabolismo do DNA e dos
ácidos nucleicos e a sua fiel perpetuação. Se o DNA fosse mantido com fide-
lidade perfeita, como seria possível a evolução? Como seria possível ocorrer
variabilidade genética sem que ocorressem alterações gênicas que se man-
tivessem e pudessem ser submetidas à pressão de seleção? Portanto, o de-
safio biológico é produzir e manter variabilidade, entretanto, compatível com a
vida de forma geral e com a sobrevivência individual.
As mutações podem ser
a) gênicas – alteram a sequência de nucleotídeos do DNA, por substituição,
adição ou remoção de bases. Podem conduzir à modificação da molécula de
RNAm, que é transcrita a partir do DNA e, consequentemente, à alteração da
proteína produzida, o que tem, geralmente, efeitos no fenótipo.
b) cromossômicas – traduzem-se numa alteração da estrutura (mutação cro-
mossômica estrutural) ou do número (mutação cromossômica numérica) de
cromossomos. Podem afetar uma determinada região de um cromossomo, um
cromossomo inteiro ou todo o complemento cromossômico de um indivíduo.
Também podem ser somáticas ou germinativas, dependendo do tipo de
tecido que afetam. Ocorre durante a replicação do DNA que precede uma divisão
mitótica. No primeiro caso, todas as células descendentes são afetadas, mas po-
dem localizar-se apenas numa pequena parte do corpo. As mutações somáticas
estão na origem de alguns tipos de câncer. Não são transmitidas à descendência.
As mutações nas células germinativas – ocorre durante a replicação do DNA que
precede a meiose. A mutação afeta os gametas e todas as células que deles des-
cendem após a fecundação – é transmitida à descendência.
Vemos a seguir os tipos mais comuns de mutações moleculares:
Mutação silenciosa: substituição de uma base do DNA por outra (no 3º nu-
cleotídeo de cada códon), porém não ocorre alteração de aminoácido, devido
à redundância do código genético. São muito comuns e responsáveis pela
diversidade genética, que não é expressa fenotipicamente.
74 CECCATTO, V. M.

Mutação com perda de sentido: substituição de uma base do DNA por ou-
tra; como consequência ocorre a substituição de um aminoácido por outro
na proteína codificada. A conformação da proteína pode ser alterada (ex:
anemia falciforme).
Mutação sem sentido (nonsense): substituição de uma base do DNA de tal
modo que, no RNAm, um códon que especifica um aminoácido é alterado
para um códon de parada ou o contrário. Origina uma proteína inativa mais
curta ou mais longa do que a proteína normal.
Deleção: nesse caso podem ser removidas uma única base do DNA ou mi-
lhares delas. A remoção de um número de bases que não seja múltiplo de três
altera completamente a mensagem do gene.
Inserção: o número de bases adicionadas ao DNA pode variar. A adição de um
número que não seja múltiplo de três altera completamente a mensagem do
gene. Quando é inserida uma sequência igual a outra, ocorre uma duplicação.
As mutações podem ser espontâneas ou induzidas. Mutações espontâ-
neas podem ocorrer porque as quatro bases nucleotídicas podem existir sob
duas formas diferentes, uma comum e outra muito rara (chamada tautoméri-
ca). As principais são a desaminação e a depurinação (Figura 7) e a formação
de dímeros de pirimidina (Figura 8). Quando uma base adquire, temporária ou
permanentemente, a sua forma rara, pode emparelhar-se com uma base dife-
rente. Outra causa de mutações espontâneas são erros na replicação do DNA
motivados pela DNA polimerase. Quase sempre esses erros são reparados
durante o processo de replicação
do DNA. Contudo, alguns persis-
tem. Finalmente, há erros na
meiose ou mitose (não disjunção
de homólogos ou cromatídes,
tendo como consequência a for-
mação de células com excesso
ou falta de cromossomos).
Figura 7 - As duas formas predomi-
nantes de danos espontâneos ao
DNA: (A) desaminação da adenina,
citosina e guanina, (B) depurina-
ção (perda da base purina) resul-
tante da clivagem da ponte entre a
base purina e a ribose, produzindo
um sítio apurínico (AP) dGMP =
deoxiguanosina monofosfato.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).
 Biologia Molecular 75

Figura 8 - (A) A luz UV induz a formação de dímeros de pirimidina, nos quais duas
pirimidinas adjacentes (como exemplo, duas timinas) são unidas numa estrutura de
anel em ciclobutano. (B) A alquilação é a adição de grupos metil ou etil para várias
posições nas bases do DNA. Nesse exemplo, a alquilação da posição O6 da guanina
resulta na formação de uma O6 - metilguanina. (C) muitos carcinogênicos (como o
benzo-(a)pireno reagem com as bases de DNA, resultando na adição de grupos quí-
micos à molécula de DNA.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).

As mutações induzidas, por sua vez, são causadas por agentes mutagêni-
cos e radiações. Conforme vimos, muitas descobertas foram feitas como conse-
quência de testes militares, como o gás mostarda e a as armas atômicas. Como
resultado das pesquisas físicas e químicas, as quais tiveram grande avanço nas
últimas décadas, apareceram uma infinidade de produtos capazes de interagir
com o DNA. Por exemplo, os análogos de bases, como o 5-bromouracil, análogo
à timina, e também a 2-aminopurina, análogo à adenina. Os chamados agentes
alquilantes adicionam grupos metil e etil às bases nitrogenadas. O gás mostarda
também é um agente alquilante. Reações oxidativas são causadas pelas for-
mas reativas do oxigênio, como os radicais (livres) superóxido, peróxido de hidro-
gênio e radicais hidroxilas. Esses danificam o DNA e induzem mutações. Temos
76 CECCATTO, V. M.

também os agentes intercalantes, como acridina, brometo de etídio e dioxina.

Estes se intercalam entre as bases do DNA, causando inserções e deleções.

7.1 Mecanismos de reparação

Existem vários mecanismos de reparo para o DNA. Conforme já vimos, a DNA
polimerase exerce esse papel durante a sua polimerização, mantendo fiel a
informação genética durante a replicação do DNA. Após a replicação, novos
grupos enzimáticos entram em ação e procuram erros, diminuindo ainda sen-
sivelmente a taxa de erros que “escapam” após a divisão celular. A maioria
dos mecanismos de reparo envolve a remoção de nucleotídeos, numa via
comum com quatro etapas básicas: a) detecção do erro, reconhecendo o DNA
danificado, b) excisão, em que as endonucleases de reparo do DNA cortam
o arcabouço de fosfodiéster em um ou ambos os lados do dano ao DNA, c)
nova polimerização, em que a DNA polimerase adiciona nucleotídeos, substi-
tuindo os danificados e d) a DNA ligase fecha os cortes da ligação fosfodiéster.
No sistema de reparo de malpareamento, ocorre um mecanismo adicio-
nal da célula de reparar erros que escaparam da revisão da DNA polimerase
III. Esses malpareamentos são temporários, pois são eliminados no próximo
ciclo de replicação, quando aparecem, resultam nas mutações. Esse nucleo-
tídeo adicionado de forma errônea deve ser retirado do lado recém-sintetiza-
do, e não o seu molde do lado parental. Esse reparo tem que ocorrer de forma
rápida, antes que a mutação fique incorporada em uma das fitas.

8. Recombinação gênica
Se a mutação é a fonte primária de variabilidade, a recombinação gênica é
que efetivamente realiza a "mistura" entre os diferentes genes dos seres vivos.
A evolução seria extremamente lenta se não houvesse um modo de reunir ca-
racterísticas de diferentes indivíduos formando um recombinante. A mutação
em si é um fenômeno bem raro e, se a evolução dependesse apenas da mu-
tação, certamente não teríamos hoje em dia organismos tão bem adaptados
ao seu ambiente. A mutação e a recombinação agem em conjunto: a mutação
modifica o DNA, e a recombinação realiza uma mistura entre as partes modi-
ficadas de dois organismos.
A recombinação gênica acontece durante a meiose. A partir do momento que
os gametas se unem durante a fertilização, cada um deve conter apenas metade
do número de cromossomos que outras células do corpo possuem. Caso contrá-
rio, a célula fertilizada teria cromossomos a mais. Dentro das células germinativas
os cromossomos homólogos ficam pareados. Enquanto eles são comprimidos, os
cromossomos podem quebrar, e cada um pode trocar uma porção do seu material
genético pela porção correspondente de seu par. Essa forma de recombinação é o
 Biologia Molecular 77

nosso conhecido crossing-over (Figura 9). Quando os cromossomos se “grudam”

de volta e se separam, cada um obtendo um novo material genético do outro. As
versões de genes que o cromossomo apresenta agora são diferentes da original.
Como esse processo só ocorre com uma das duas cópias do cromossomo, o con-
junto das informações iniciais não é totalmente perdido. O resultado é o aumento da
variabilidade. Uma das proteínas envolvidas é a proteína RecA (Figura 10).

Figura 9 - Modelos de recombinação - Uma molécula de fita simples, parenta, liga-

-se à outra, por replicação ou simples troca, através de um quiasma (ou junção de
Holliday), resultando em recombinação. Cometário: o DNA recombinante, neste caso
refere-se ao produto do crossing over. Não confundir com o DNA recombinante
obtido por Engenharia genética.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).

Figura 10 - Função da proteína RecA: a proteína RecA inicialmente liga-se à fita simples
de DNA, para formar um filamento de proteína - DNA. A proteína RecA, então, liga-se
à segunda para formar o complexo, formando uma região heteroduplex.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).
78 CECCATTO, V. M.

Texto complementar
Para remover a palavra raça dos prontuários médicos no Brasil
Os avanços da genética molecular e o sequenciamento do genoma humano permiti-
ram um exame detalhado da correlação entre a variação genômica humana, a ances-
tralidade biogeográfica e a aparência física das pessoas e mostraram que os rótulos
previamente usados para distinguir raças não têm significado biológico. Pode parecer
fácil distinguir fenotipicamente um europeu de um africano ou de um asiático, mas tal
facilidade desaparece completamente quando procuramos evidências destas diferen-
ças raciais no genoma das pessoas. Uma pletora de linhas independentes de pesquisa
molecular fornece evidências científicas incontrovertíveis de que raças humanas não
existem do ponto de vista genético ou biológico. Apesar disto, o conceito de raças
persiste como construção social e cultural em nossa sociedade.
RAÇAS HUMANAS NA MEDICINA BRASILEIRA - o problema na medicina é que as
raças continuam a ser vistas como verdades biológicas e não como meras construções
sociais! Como exemplo, basta ler a bula no medicamento Cozaar, um bloqueador do
receptor da angiotensina, vendido no Brasil pela Merck Sharp & Dohme, que contém
o seguinte alerta: "Com base no estudo LIFE (Losartan Intervention For Endpoint Re-
duction in Hypertension — Intervenção com losartan para redução de desfechos na
hipertensão), os benefícios de COZAAR® (Losartan potássico, MSD) na morbidade e
mortalidade cardiovascular comparados aos do atenolol não se aplicam a pacientes
negros com hipertensão e hipertrofia ventricular esquerda". Este não é um exemplo
isolado, pois sabemos que Estados Unidos, bulas de 8% (15 entre 185) dos novos
medicamentos introduzidos de 1995 a 1998 continham advertências sobre diferenças
"raciais" em sua eficácia ou efeitos colaterais. Em 2005 a Food and Drug Administra-
tion (FDA) aprovou o medicamento BiDil® para tratamento da insuficiência cardíaca
congestiva, mas somente para negros.
Com base nos critérios de autoclassificação do censo do IBGE, em 2000 a popula-
ção brasileira era composta por 53,4% de brancos, 6,1% de pretos e 38,9% de pardos.
O que representam esses números em termos de ancestralidade genética? Essa é a
pergunta que tentamos responder usando as ferramentas da genética molecular. Os
nossos estudos demonstraram que no povo brasileiro existe um alto índice de mistu-
ra genética que torna as características de aparência física, como cor da pele, olhos,
cabelos, formatos dos lábios e do nariz, em indicadores muito pobres da origem geo-
gráfica dos ancestrais de um determinado indivíduo.
A fauna e flora dependem muito da geografia. Assim, diferentes origens geográ-
ficas significam exposições diferentes a elementos tóxicos do meio ambiente e a di-
ferentes dietas. Como consequência, emergiram polimorfismos genéticos nos genes
dos sistemas enzimáticos de detoxificação, representando adaptações seletivas ao
padrão geográfico de elementos tóxicos da flora e dieta locais. Essas variações estão
hoje em dia sendo detectadas pelos seus efeitos farmacogenéticos, já que o nosso
corpo usa os mesmos sistemas enzimáticos para metabolizar medicamentos. Pode-
mos usar em medicina clínica a aparência física, e mais particularmente a cor da pele,
como um substituto dos testes genômicos específicos? A resposta é não, especial-
mente no Brasil, onde nossos dados mostram que a correlação entre cor e ancestra-
lidade é muito imperfeita. Espera-se que possamos em breve ter à disposição testes
genômicos que nos permitam traçar o perfil farmacogenético do paciente e usar este
 Biologia Molecular 79

perfil na decisão clínica. Até lá, devemos nos refrear de usar raça como substituta dos
testes farmacogenéticos.
No consultório médico, o que está sendo examinado é um paciente individual e
não um grupo populacional. A autoclassificação ou a avaliação médica do grupo racial
de um paciente não tem nenhum valor em decisões sobre o diagnóstico, o tratamento
farmacológico ou outras terapias. Isto não quer dizer que a pigmentação da pele do (a)
paciente e outras características físicas não devem ser observadas e devidamente ano-
tadas. Elas são partes integrais do exame físico e podem ter implicações clínicas. O que
queremos defender é a retirada da expressão raça dos prontuários médicos no Brasil.
Alguns autores têm argumentado que as raças podem constituir-se em sub-roga-
das de variáveis não-genéticas sociais e culturais, e que abrir mão dessa classificação
significaria perda de correlações ambientais e prejuízo para a medicina e a população.
Mas essa utilidade hipotética da classificação racial deve ser considerada no contexto
dos seus possíveis riscos, sob uma ótica de relação risco-benefício, como tudo em
medicina. Temos de tomar cuidado de não dar legitimidade a falsos indicadores e
fazer todo o esforço para abandonar essas tênues correlações, atacando com firmeza
as verdadeiras variáveis genéticas e ambientais que afetam saúde e doença.
PELO BANIMENTO DO CONCEITO - assim, o conceito de raça lembra uma casca
de banana: vazio e perigoso. Vazio, porque sabemos que raças humanas não exis-
tem como entidades biológicas. Perigoso, porque no passado, a crença de que raças
humanas possuíam diferenças biológicas substanciais e bem demarcadas contribuiu
para justificar discriminação, exploração e atrocidades, mesmo no contexto médico.
Existe consenso entre geneticistas e antropólogos que a única divisão biologica-
mente coerente da espécie humana é em bilhões de indivíduos e não em um pu-
nhado de raças. Esse fato deve ser absorvido pela sociedade e incorporado às suas
convicções e atitudes morais. Vimos acima que independente da cor, a vasta maioria
dos brasileiros tem simultaneamente um grau significativo de ancestralidade africa-
na, européia e ameríndia. O genoma de cada brasileiro é um mosaico altamente va-
riável e individual formado por contribuições das três raízes ancestrais. Assim, não
faz sentido falar em afrodescendentes ou eurodescendentes porque a maior parte
dos brasileiros tem uma proporção significativa de ascendência africana, européia e
ameríndia. Além disso, por causa da pobre correlação entre cor e ancestralidade, não
faz sentido falar sobre "populações" de brasileiros brancos ou de brasileiros negros.
Assim, a única maneira de lidar eticamente com a variabilidade genética dos brasilei-
ros é individualmente, como seres humanos únicos e singulares nos seus genomas
mosaicos e nas suas histórias de vida. Do ponto de vista médico, esta conscientização
nos leva a propor que o conceito de raça deveria ser banido da medicina brasileira e
que a palavra raça deve ser eliminada dos nossos prontuários clínicos.
Fonte: Pena (2007).

Saiba mais
A Lei de Proteção de Cultivares, Lei n° 9456, foi sancionada em 25/04/1997, a qual
consiste na proteção intelectual dos direitos de criação do pesquisador desenvolve-
dor de pesquisa genética. A Lei proíbe o uso, pelo produtor de sementes, de uma
cultivar protegida, somente poderá ser feito mediante prévia autorização do criador
da cultivar, que poderá ou não exigir o pagamento de “royalties” pela sua exploração
80 CECCATTO, V. M.

comercial. De acordo com o Art. 3° considera-se, para os efeitos desta Lei:

“I – melhorista: a pessoa física que obtiver cultivar e estabelecer descritores que a
diferenciem das demais;
II – descritor: a característica morfológica, fisiológica, bioquímica ou molecular que
seja herdada geneticamente, utilizada na identificação de cultivar;
III – margem mínima: o conjunto mínimo de descritores, a critério do órgão compe-
tente, suficiente para diferenciar uma nova cultivar ou uma cultivar essencialmente
derivada das demais cultivares conhecidas;
IV – cultivar: a variedade de qualquer gênero ou espécie vegetal superior que seja
claramente distinguível de outras cultivares conhecidas por margem mínima de des-
critores, por sua denominação própria, que seja homogênea e estável quanto aos
descritores através de gerações sucessivas e seja de espécie passível de uso pelo
complexo agroflorestal, descrita em publicação especializada disponível e acessível
ao público, bem como a linhagem componente de híbridos;
V – nova cultivar: a cultivar que não tenha sido oferecida à venda no Brasil há mais
de doze meses em relação à data do pedido de proteção e que, observado o prazo de
comercialização no Brasil, não tenha sido oferecida à venda em outros países, com o
consentimento do obtentor, há mais de seis anos para espécies de árvores e videiras
e há mais de quatro anos para as demais espécies;
VI – cultivar distinta: a cultivar que se distingue claramente de qualquer outra cuja
existência na data do pedido de proteção seja reconhecida;
VII – cultivar homogênea: a cultivar que, utilizada em plantio, em escala comercial,
apresente variabilidade mínima quanto aos descritores que a identifiquem, segundo
critérios estabelecidos pelo órgão competente;
VIII – cultivar estável: a cultivar que, reproduzida em escala comercial, mantenha a
sua homogeneidade através de gerações sucessivas;
IX – cultivar essencialmente derivada: a essencialmente derivada de outra cultivar se,
cumulativamente, for:
a) predominantemente derivada da cultivar inicial ou de outra cultivar essencialmen-
te derivada, sem perder a expressão das características essenciais que resultem do
genótipo ou da combinação de genótipos da cultivar da qual derivou, exceto no que
diz respeito às diferenças resultantes da derivação;
b) claramente distinta da cultivar da qual derivou, por margem mínima de descritores,
de acordo com critérios estabelecidos pelo órgão competente;
c) não tenha sido oferecida à venda no Brasil há mais de doze meses em relação à
data do pedido de proteção e que, observado o prazo de comercialização no Brasil,
não tenha sido oferecida à venda em outros países, com o consentimento do obten-
tor, há mais de seis anos para espécies de árvores e videiras e há mais de quatro anos
para as demais espécies;
X – linhagens: os materiais genéticos homogêneos, obtidos por algum processo auto-
gâmico continuado;
XI – híbrido: o produto imediato do cruzamento entre linhagens geneticamente diferentes;
XII – teste de distinguibilidade, homogeneidade e estabilidade (DHE): o procedimento
técnico de comprovação de que a nova cultivar ou a cultivar essencialmente derivada
são distinguíveis de outra cujos descritores sejam conhecidos, homogêneas quanto
às suas características em cada ciclo reprodutivo e estáveis quanto à repetição das
mesmas características ao longo de gerações sucessivas;
XIII – amostra viva: a fornecida pelo requerente do direito de proteção que, se utiliza-
da na propagação da cultivar, confirme os descritores apresentados;
XIV – semente: toda e qualquer estrutura vegetal utilizada na propagação de uma
cultivar;
 Biologia Molecular 81

XV – propagação: a reprodução e a multiplicação de uma cultivar, ou a concomitância

dessas ações;
XVI – material propagativo: toda e qualquer parte da planta ou estrutura vegetal uti-
lizada na sua reprodução e multiplicação;
XVII – planta inteira: a planta com todas as suas partes passíveis de serem utilizadas
na propagação de uma cultivar;
XVIII – complexo agroflorestal: o conjunto de atividades relativas ao cultivo de gê-
neros e espécies vegetais visando, entre outras, à alimentação humana ou animal,
à produção de combustíveis, óleos, corantes, fibras e demais insumos para fins in-
dustrial, medicinal, florestal e ornamental.” Fonte: http://www.planalto.gov.br/ccivil/
leis/L9456.htm

Síntese da Parte
Nesta unidade verifica-se que existem várias formas de alterar o genoma,
desde os variados tipos de mutações, recombinação, transposons e ploidias.
Muitas dessas alterações são mais conhecidas e verifica-se que possuem
funções bem definidas, como na recombinação, em que existe aumento na
variabilidade. Porém muitas, aparentemente, não trazem sentido ao genoma,
como os transposons e possivelmente podem ser deletérias, em alguns ca-
sos patológicos. Os genomas das bactérias, mitocôndrias e cloroplastos, mais
simples, são mais fáceis de serem estudados e compreendidos e fornecem
algumas pistas para compreender a evolução molecular.

Atividades de avaliação
1. Leia atentamente o resumo de congresso que segue e responda as per-
guntas:
Título: Detecção de cinco novas mutações em pacientes brasileiros com
gangliosidose GM1
URI: http://hdl.handle.net/10183/6718
Autor: Vieira, Matheus Barbosa
Orientador: Coelho, Janice Carneiro
Co-orientador: Matte, Ursula da Silveira
Data: 2006
Nível: Mestrado
82 CECCATTO, V. M.

Instituição: Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de

Ciências Básicas da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas: Bioquímica.
Palavra-chave: Erros inatos do metabolismo, Gangliosidose gm1,
Mutações
Resumo: A Gangliosidose GM1 é um Erro Inato do Metabolismo (EIM)
causado pela deficiência da enzima B-galactosidase ácida. Essa do-
ença é caracterizada pelo acúmulo de metabólitos não degradados,
principalmente gangliosídeo GM1, nos lisossomos de vários tipos celu-
lares. Baseado na idade de início e na atividade residual da enzima, a
Gangliosidose GM1 é classificada em três diferentes tipos: infantil, juvenil
e adulto. O gene da B-galactosidase ácida (GLB1, GeneBank M27507)
está situado no cromossomo 3 e possui mais de 60 kb, contendo 16 exons.
Cerca de 50 mutações associadas à doença estão descritas na literatu-
ra. No sul do Brasil, há uma alta freqüência dessa doença (1:17.000 nas-
cidos vivos). Neste trabalho, vinte pacientes diagnosticados no Hospital
de Clínicas de Porto Alegre (Brasil) tiveram o gene GLB1 investigado por
SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) usando DNA extra-
ído de sangue periférico. Através desta triagem foram encontradas 52
alterações de mobilidade do DNA, indicando a presença de mutações.
As amostras relativas aos exons 2 e 15 foram submetidas a sequencia-
mento direto com seqüenciador ABI31O(Applied Biosystens) utilizado kit
BigDye 3.1. Cinco novas mutações no gene GLB1 (F63Y, R38G, Y36S,
Y64F e R59C) e duas mutações já descritas (R59H e 1622-1627insG)
foram encontradas. Este trabalho possibilitou a genotipagem completa
de 6 pacientes e parcial de 5, e direcionou a investigação de mutações,
contribuindo diretamente no diagnóstico da enfermidade e permitindo a
realização de estudos de correlação genótipo/fenótipo destes pacientes.
Fonte: http://www.lume.ufrgs.br/handle/10183/6718
a) o que são erros inatos do metabolismo?
b) procure informações nos livros e na rede mundial de computadores sobre
as gangliosidoses.
c) o que é frequência gênica?
d) procure as enzimas e as funções dos lisossomos.
e) o resumo relata que os pesquisadores encontraram mutações nos pa-
cientes. A seguir, temos a sequência traduzida em proteína, do gene da
enzima beta-D-galactosidase (EC 3.2.1.23) humana citada. Localize as
posições em que se verificaram alterações, veja o exemplo:
 Biologia Molecular 83

Mutação F63Y: conte até a posição 63 e encontrará o aminoácido

F (Fenilalanina) – nos pacientes estudados, este foi alterado para Y
(Tirosina).

MPGFLVRILL LLLVLLLLGP TRGLRNATQR MFEIDYSRDS FLKDGQPFRY

ISGSIHYSRV PRFYWKDRLL KMKMAGLNAI QTYVPWNFHEP WPGQYQFSED
HDVEYFLRLA HELGLLVILR PGPYICAEWE MGGLPAWLLE KESILLRSSD
PDYLAAVDKW LGVLLPKMKP LLYQNGGPVI TVQVENEYGS YFACDFDYLR
FLQKRFRHHL GDDVVLFTTD GAHKTFLKCG ALQGLYTTVD FGTGSNITDA
FLSQRKCEPK GPLINSEFYT GWLDHWGQPH STIKTEAVAS SLYDILARGA
SVNLYMFIGG TNFAYWNGAN SPYAAQPTSY DYDAPLSEAG DLTEKYFALR
NIIQKFEKVP EGPIPPSTPK FAYGKVTLEK LKTVGAALDI LCPSGPIKSL
YPLTFIQVKQ HYGFVLYRTT LPQDCSNPAP LSSPLNGVHD RAYVAVDGIP
QGVLERNNVI TLNITGKAGA TLDLLVENMG RVNYGAYIND FKGLVSNLTL
SSNILTDWTI FPLDTEDAVR SHLGGWGHRD SGHHDEAWAH NSSNYTLPAF
YMGNFSIPSG IPDLPQDTFI QFPGWTKGQV WINGFNLGRY WPARGPQLTL
FVPQHILMTS APNTITVLEL EWAPCSSDDP ELCAVTFVDR PVIGSSVTYD
HPSKPVEKRL MPPPPQKNKD SWLDHV

No caso da alteração 1622-1627insG:

1561 atatcctcac ggactggacg atctttccac tggacactga ggatgcagtg
cgcagccacc
1621 tggggggctg gggacaccgt gacagtggcc accatgatga agcctgggcc
cacaactcat
1681 ccaactacac gctcccggcc
aparece uma inserção de guaninas no gene na posição de 1622 a 1627.

para ver o gene completo e esta tradução:

site: ncbi.nlm.nih.gov, digite o no do registro: M27507 (veja no resumo)
na opcão “SEARCH”: Nucleotide e tecle Enter. (ou pelo link direto: http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/179400)
f) Compare as técnicas para verificação de mutações na Figura 11.
84 CECCATTO, V. M.

Figura 11 - Esquemas de três diferentes técnicas eletroforéticas para verificação de

mutações. Estas técnicas permitem a visualização de alterações mínimas em duas
fitas de DNA, a selvagem W (ou wild type) e a mutante M. (a) Ensaio de corrida
de fita dupla ou HTA (Heteroduplex Tracking Assay): as duas fitas são desnatura-
das/renaturadas e posteriormente misturadas. Note que as hélices homoduplex W
e M separam-se muito pouco. Através da formação de heteroduplex, as diferenças
ficam mais conspícuas, através do aumento da diferença de migração entre elas;
(b) Polimorfismo de diferentes estruturas de fita simples ou SSCP (Single Stranded
Conformation Polymorphism): as mutações criam pequenas alterações tridimen-
sionais na fita simples, causando diferença na migração e (c) eletroforese de gel
em gradiente desnaturante ou DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis),
W: wild type e M: mutante. Gel desnaturante: o gel de agarose contém um gradiente
de concentração de um desnaturante químico. Durante a migração, a molécula en-
contra concentrações cada vez mais altas, alterando dramaticamente o tempo de
migração, aumentando o polimorfismo entre as diferentes fitas.

Leituras
• PENA, S. D. J. Humanidade sem raças? 1. ed. São Paulo: Publifo-
lha, 2008. 72 p.
• BARBUJANI, G. A invenção das raças: existem mesmo raças huma-
nas? diversidade e preconceito racial. São Paulo: Contexto, 2007. 176 p.
 Biologia Molecular 85

Filmes
• Homo sapiens 1900 (Dir. Peter Cohen, Suécia, 1998) - documentário
sobre racismo e eugenia.
• O ponto de mutação (Dir. Bernt Capra, 1990) - existencialismo e ci-
ência, baseado na obra de Fritjof Capra.

Sites
(Sociedades científicas brasileiras – filie-se!)
• http://www.abc.org.br (Academia Brasileira de Ciências - ABC)
• http://www.abcmc.org.br (Associação Brasileira de Centros e Museus
de Ciência - ABCMC)
• http://www.aoceano.org.br (Associação Brasileira de Oceanografia -
AOCEANO)
• http://www.fesbe.org.br (Federação de Sociedades de Biologia Experimental)
• http://www.sbac.org.br (Sociedade Brasileira de Análises Clínicas - SBAC)
• http://www.sbbq.org.br (Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia
Molecular - SBBq)
• http://www.sbfic.org.br (Sociedade Brasileira de Ficologia)
• http://www.sbfis.org.br (Sociedade Brasileira de Fisiologia – SBFIS)
• http://www.sbg.org.br (Sociedade Brasileira de Genética - SBG)
• http://www.sbi.org.br (Sociedade Brasileira de Imunologia - SBI)
• http://www.sblimno.org.br (Sociedade Brasileira de Limnologia - SBL)
• http://www.sbma.com.br (Sociedade Brasileira de Malacologia - SBMa)
• http://www.sbmicrobiologia.org.br (Sociedade Brasileira de Microbio-
logia - SBM)
• http://www.sbpcnet.org.br (Sociedade Brasileira para o Progresso da
Ciência - SBPC)
• http://www.sbpflap.cjb.net (Sociedade Brasileira de Parasitologia - SBP)
• http://www.sbv.org.br (Sociedade Brasileira de Zoologia - SBZ)
• http://acd.ufrj.br/geologia/sbp/sbp.htm (Sociedade Brasileira de Pale-
ontologia - SBP)
86 CECCATTO, V. M.

• http://sbfte.org.br (Sociedade Brasileira de Farmacologia e Terapêutica

Experimental -SBFTE)
• http://www.sbmm.org.br/ (Sociedade Brasileira de Microscopia e Micro-
análise - SBMM)

Referências
ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER,
P. Molecular biology of the cell. 5. ed. New York: Garland Science, 2008.
1.261 p.
BATZER, M. A.; DEININGER, P. L. Alu repeats and human genomic diversity.
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BENNET, M. D.; LEITCH, I. J. Nuclear DNA amounts in angiosperms and their
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COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. The cell: a molecular approach. 5. ed.
Sunderland: Sinauer Associates, 2009. 771 p.
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nome sequence of a tree fern Alsophila spinulosa: insights into evolutionary
changes in fern chloroplast genomes. BMC Evolutionary Biology, Kansas
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GREGORY, T. R. Coincidence, coevolution, or causation? DNA content, cell
size, and the C-value enigma. Biological Reviews, Cambridge, v. 76, n. 1, p.
65–101, 2001.
GUO, X.; CASTILLO-RAMÍREZ, S.; GONZÁLEZ, V.; BUSTOS, P.; FERNÁN-
DEZ-VÁZQUEZ, J. L.; SANTAMARÍA, R. I.; ARELLANO, J.; CEVALLOS,
M. A.; DÁVILA, G. Rapid evolutionary change of common bean (Phaseolus
vulgaris L) plastome, and the genomic diversification of legume chloroplasts.
BMC Genomics, London, v. 8, p. 228, 2007.
PENA, S. D. J. Para remover a palavra raça dos prontuários médicos no Bra-
sil. Ciência e Cultura, São Paulo, v. 59, n. 1, p. 4-5, 2007.
 Parte 4
Expressão gênica
 Capítulo 8
Considerações iniciais
e histórico

Objetivo
• Apresentar aspectos da expressão gênica em procariotos e eucariotos.

1. Aspectos gerais
Como as células expressam seus genes? Toda sequência de DNA pode ser
considerado um gene? Procariotos e eucariotos expressam seus genes da
mesma forma? Vimos que nem toda molécula de DNA pode ser considerada
um gene, pois a definição funcional diz que o gene deve ser codificador de
algum RNA ou polipeptídeo. Pelo menos na maioria dos eucariotos, temos
muito mais DNA não codificante do que codificante. Obviamente, existem
muitas diferenças entre a expressão eucariótica e a procariótica. Procariotos
são unicelulares, apresentam uma expressão mais econômica e menos com- Nos grandes genomas
eucarióticos, somente
plexa, por isso, podem ser considerados modelos biológicos para estudo da
uma pequena porção de
expressão. Os eucariotos são pluricelulares, possuem células diferenciadas DNA codifica proteínas. Na
e especializadas. Os seres eucariotos partem de uma única célula que de- levedura, temos 70% de
termina (num momento exato do desenvolvimento) o início de diferenciação expressão de genes pelo
genoma, havendo um gene
em folhetos germinativos que irão se transformar em pele, ossos, cabelos,
a cada 2 Kb de sequência.
bastonetes e hepatócitos. O uso das células-tronco embrionárias é um exem- Saccharomyces cerevisiae
plo prático de que as células eucarióticas são induzíveis à diferenciação nos foi o primeiro organismo
seus primórdios. O estudo da diferenciação celular eucariótica ainda está nos eucariótico a ter o seu
genoma sequenciado. A
seus primórdios, sendo considerado um dos maiores desafios da era pós-
levedura possui 5.885 genes
-genômica. Há mais a ser descoberto ainda do que informação acumulada codificantes de proteínas.
sobre o assunto da expressão gênica. Em humanos, menos de 5%
(alguns autores colocam 1%
do genoma) é codificante.
Nos humanos ocorre um
gene para cada 130 Kb de
sequência.
90 CECCATTO, V. M.

2. Breve histórico
O biologista francês Jacques Lucien Monod nasceu em 1910, estudou Medicina
em Paris até 1940. Com a guerra, fugiu para a Inglaterra. Ele lutou na África,
onde foi ferido. Seu desejo era ser médico cirurgião. Doutorou-se em 1947,
mas não podia exercer a profissão de cirurgião devido às extensas feridas de
guerra. Buscou por várias vezes, sem sucesso, emprego com André Lwoff,
com quem tinha lutado na Segunda Guerra, em seu laboratório, no Instituto
Pasteur e sempre foi recusado. Um dia Lowoff perguntou a ele se queria traba-
lhar com bacteriófagos. Apesar de não ter a menor idéia do que Lowoff sugeriu,
ele aceitou e, assim, dedicou-se à biologia dos fagos, no Instituto Pasteur. Em
1958, François Jacob, começou a trabalhar com Jacques Monod em pesqui-
A galactosemia é um sas sobre os mecanismos de transmissão da informação genética, como os
distúrbio metabólico conceitos de RNA mensageiro e genes reguladores da célula controlam a sín-
extraordinário no qual tese de proteínas. Posteriormente, aprofundou os problemas da genética bac-
lactentes são incapazes
de utilizar a galactose
teriana, em foco no estudo dos mecanismos de sua reprodução (Sexualidade
encontrada no leite. A e Genética de Bactérias, 1961). Jacob, Monod e André Lwoff receberam o
galactose é importante Prêmio Nobel de Medicina de 1965, por essa pesquisa. É importante lembrar
além de sua capacidade de que essas descobertas não tinham as facilidades que temos hoje em termos
fornecer glicose. Também
é importante componente
de tecnologia; elas foram deduzidos inteiramente com estudos genéticos feitos
dos cerebrosídeos, em bactérias, os quais posteriormente foram confirmados com isolamento de
gangliosídeos e genes e de proteínas utilizando equipamentos e técnicas modernas.
glicoproteínas. Estes são os
constituintes das membranas
Esse trabalho tinha como premissa o conhecimento de que as células
celulares. Os cerebrosídeos bacterianas e outras poderiam responder a condições externas, regulando
e gangliosídeos formam os níveis de produção de suas principais enzimas metabólicas e/ou a ativida-
uma porção significativa de dessas enzimas. Por exemplo, se uma bactéria encontra-se em um cal-
dos lipídeos cerebrais. Nos
pacientes portadores de
do contendo lactose, em vez da glicose, que é um açúcar mais simples, a
galactosemia, a galactose bactéria tem que adaptar-se à necessidade de: 1) transporte da lactose pela
não é transformada e membrana; 2) decomposição da lactose em seus componentes glicose e ga-
acumula-se em vários lactose e 3) conversão da galactose em glicose.
tecidos, ocasionando retardo
mental severo e catarata. O Conhecia-se a produção das enzimas responsáveis por essas etapas,
fígado mostra dilatação e, mas, quando havia glicose no meio, essas enzimas eram ausentes. Os estu-
frequentemente, a doença dos foram então evoluindo pela teoria da ação alostérica das enzimas, em que
causa a morte.
postula que pequenas moléculas podiam ligar e desligar o processo. Jacob e
Monod foram os descobridores teóricos e experimentais que demonstraram
como o sistema da lactose em E. coli funcionava, através de proteínas espe-
cíficas dedicadas a reprimir a transcrição do DNA em RNA, o repressor lac.
Esse repressor (o repressor lac) é produzido em todas as células, li-
ga-se diretamente ao DNA de genes que controla e fisicamente impede o
aparelho de transcrição de ter acesso ao DNA. Na presença de lactose, o
repressor liga lactose, tornando-se não poder ligar ao DNA, bem como, a re-
 Biologia Molecular 91

pressão da transcrição é levantado. Dessa forma, um ciclo de realimentação

é construído, permitindo que o conjunto de proteínas que metabolizam lactose
seja produzido quando necessário.
Jacob Monod publicou “La logique du vivant” - Histórias da Biologia,
em 1970, uma interessante análise histórica do conceito de herança. Outro
trabalho de Monod: O acaso e a necessidade publicado também em 1970, na
França, tornou-se um dos mais celebrados trabalhos da moderna Biologia.
Monod diz em seu livro: “A tese que apresentarei aqui é a de que a biosfera
não contém uma classe previsível de objetos ou de fenômenos, mas constitui
um acontecimento particular, de certo compatível com os primeiros princípios,
mas não dedutível desses princípios. Portanto, essencialmente imprevisível.”
Para Monod, a evolução não tem projeto ou seja, você pode, avaliando todo o
sistema biológico, estudar e ver de onde cada ser evoluiu. Porém, se estivesse
lá no começo de tudo, jamais poderia prever o aparecimento do ser humano.
 Capítulo 9
Ação alostérica: geralmente
um fator que se liga a uma
proteína, fazendo com que
Expressão gênica
ela mude de configuração
tridimensional, permitindo
que ocorra alguma ação.
Por exemplo, o aminoácido
triptofano liga-se ao
repressor, ativando-o 1. Expressão e regulação em procariotos
alostericamente. Dessa
As diferenças entre procariotos e eucariotos algumas vezes parecem super-
forma, ele se liga ao DNA.
Repressor do triptofano: ficiais e, em outras vezes, parecem marcantes. Vimos que, estruturalmente,
proteína regulatória os procariotos apresentam falta de vários componentes celulares, como de
produzida pelo gene citoesqueleto, da própria carioteca, falta de partículas, como as histonas,
regulador (trpR), a qual
de cap 5' e cauda poli A 3'; de sequências nucleotídicas, como os íntrons,
inativa o operador do
triptofano quando este está DNA repetitivo etc. Apesar de ser relativamente simples, as bactérias são
em alta concentração. seres de rápida resposta ao ambiente, pois disso depende sua sobrevivên-
Operador: parte de um cia. Lembre-se dos conceitos da metabolização de energia (glicogênese,
óperon que controla a
vias glicolíticas etc) vistos em Bioquímica. A dependência de energia (diga-
expressão de um ou mais
genes estruturais, servindo -se açúcar) da bactéria (E. coli) é o exemplo perfeito para o estudo de suas
como sítio de ligação para características de regulação gênica.
uma ou mais proteínas
As bactérias nadam em um mar de nutrientes. Esses nutrientes variam em
regulatórias.
AMP cíclico: adenosina qualidade e quantidade, aumentando e diminuindo, de acordo com as questões
3,5-monofosfato,o AMP ambientais envolvidas. As E. coli intestinais, após uma “bela refeição”, podem
cíclico é um nucleotideo estar presentes numa sopa de lactose, glicose, galactose ou xilose, dependendo
sintetizado a partir de ATP
do tipo de alimento ingerido. Lembre-se de que cada tipo diferente precisa de
por ação da adenilato
ciclase,enzima localizada uma proteína específica sinalizadora e de uma via metabólica. Qual das duas
na face interna da opções seguintes seria a mais interessante? 1) A célula bacteriana fica de pron-
membrana plasmática. O tidão, com todo o arsenal de enzimas e proteínas simultaneamente disponível
cAMP exerce seus efeitos
para degradar todo e qualquer tipo diferente de açúcar; ou 2) a célula bacteriana,
intracelulares ativando um
tipo particular de proteína inicialmente, identifica o açúcar preponderante e assim ativa as cascatas me-
quinase chamada “proteína tabólicas necessárias à sua degradação (e em consequência, desliga outros).
quinase dependente de
Imagine o quanto a bactéria iria gastar se fosse manter continuamen-
cAMP“. Ele liga-se às
subunidades reguladoras te, um arsenal disponível para produção contínua dessas proteínas, enzi-
provocando dissociação das mas e manutenção de vias metabólicas complexas. A opção correta é a 2.
subunidades catalíticas que, Metaforicamente, a célula atua com interruptores ou mecanismos que atuam
então, tornam-se ativas.
ligando e desligando genes necessários e desnecessários, para cada oca-
sião. A opção 1, entretanto, não é de todo errada, porque os mecanismos de
sinalização, os quais são necessários para saber (rapidamente) o que está
 Biologia Molecular 93

acontecendo no ambiente e fornecer um gatilho para cada situação são per-

manentemente disponibilizados, ou seja, são genes ligados, o tempo todo.
Óperon: um grupo de genes
Uma das proteínas regulatórias mais estudadas em E. coli é o repressor
que constitui uma unidade
do triptofano. Em bactérias, proteínas como a proteína repressora do triptofa- reguladora ou controladora.
no, desliga genes, reprimindo a transcrição. De que forma? Ligando-se a um Repressão catabólica:
local específico upstream ao gene chamado operador. Esse operador é uma redução mediada por glicose
nas taxas de transcrição de
pequena sequência de DNA com cerca de 15 nucleotídeos, fica localizado
óperons que especificam
dentro da região promotora do gene (onde se liga à enzima RNA polimerase). enzimas envolvidas nas vias
Essa ligação da proteína ao operador bloqueia a transcrição pelo simples fato metabólicas.
de impedir a RNA polimerase de se ligar ao promotor. Entretanto, esse repres- Região de controle
de locus: Região próxima
sor deve ser ativado pela presença de triptofano no meio. O meio, nesse caso,
aos genes que são
pode ser o intestino do mamífero, que acabou de se alimentar. O repressor é controladoras destas
uma proteina alostérica; a ligação do triptofano a ela produz uma ligeira mu- regiões.
dança conformacional que permite, então, a ligação ao DNA. Portanto, liga-se
ao DNA o complexo repressor-ativador (no caso, o triptofano).
O gene que é desligado, no entanto, é um conjunto de genes, todos pró-
ximos entre si, responsáveis pela produção de triptofano, chamado óperon do
triptofano. Obviamente, a célula bacteriana prefere adquiri-lo pronto do meio
ambiente. O sistema óperon é exclusivo de bactérias, os eucariotos regulam
individualmente cada gene (Figura 1).

Figura 1 - Óperon triptofano em procariotos. Note que os genes estruturais

(trpE, trpD, trpC, trpB, trpA estão próximos ao gene e ao promotor comum, forman-
do um RNAm comum.
Fonte: Pierce (2004).
94 CECCATTO, V. M.

Os erros inatos do Esse tipo de regulação coletiva de genes em bactérias só é possível pe-
metabolismo resultam los seguintes motivos: a) os genes de um determinado metabolismo bacteriano
da deficiência enzimática
com dano direto numa
estão arranjados próximos, de forma grupal, sob regulação de um único promo-
via metabólica específica, tor; b) uma vez ativado, produz um RNA coletivo chamado de policistrônico (veja
bastante raras como a transcrição na Unidade 2), que, depois de formado, vai dar origem às várias pro-
fenilcetonúria (deficiência teínas desse metabolismo e c) a proteína regulatória geralmente está acoplada
da enzima fenilalanina
hidroxilase), homocistinúria
à presença ou à ausência de outra substância que pode ser seu ativador.
e hiperomocistinúria O repressor (ou o ativador) pertence a uma classe de proteínas que
(deficiência da enzima pertence ao metabolismo basal da célula. A presença da proteína regulatória,
cistationina B-sintase), a
qual produz níveis elevados
nesse caso, é sempre constante. Por isso, a bactéria pode responder rapida-
de homocistina e metionina mente a um aumento ou uma diminuição do triptofano. Esse tipo de expres-
na urina. A maioria dos são é chamada de constitutiva. Inúmeros genes do metabolismo fazem parte
tratamentos para essas do conjunto constitutivo de genes de uma célula, pois estão sempre sendo
patologias envolve restrição
dietética do substrato
expressos, independentemente dos fatores ambientais. Outros genes são in-
(geralmente aminoácidos), duzíveis (ativados) ou reprimíveis (inativados), mas podem ter também uma
reposição do produto final, expressão mínima constante.
depleção da substância
de armazenamento,
Ativadores bacterianos, como a proteína ativadora do metabolismo
substituição da proteína (CAP), ligam-se ao AMP cíclico (cAMP), antes que ela possa se ligar ao ópe-
mutante (como no caso da ron. Os genes ativados por CAP são, então, dependentes da concentração
galactosidase), transplante de cAMP na célula. O aumento de glicose na célula torna os níveis de AMP
(rim, no caso de cistinose e
outras, como a doença de
cíclico baixos, e o cAMP tem menos probabilidade de se ligar a CAP. Portanto,
Crushing, fígado, no caso em E. coli, a concentração de cAMP é inversamente proporcional ao nível de
da tirosinemia) e remoção glicose. Quando a glicose está baixa na célula bacteriana, os níveis de cAMP
cirúrgica, como remoção são altos. O complexo CAP-cAMP liga-se ao DNA junto ao operador lac. A
da tireoide (síndrome do
carcinoma medular da
glicose é sempre preferida porque sofre glicólise e requer menos energia me-
tireóide), baço e cólon. tabólica que outros açúcares.
Na presença de glicose, todos os outros genes de metabolismo de açú-
cares são reprimidos, num processo chamado de repressão catabólica. Essa re-
pressão coletiva é resultado do controle positivo da célula em resposta à glicose.
Uma questão interessante na regulação eucariótica: se todo gene precisa
de reguladores específicos, a expressão dessas proteínas regulatórias também
necessitaria de outras proteínas regulatórias e assim por diante. Finalmente,
um número infinito de genes seria necessário para a expressão de poucos ge-
nes. Como isso é possível? A resposta é que, além da expressão constitutiva,
existe controle pelos sinais de dentro e fora da célula, que ajustam o programa
transcricional às necessidades fisiológicas da célula. Além disso, são usadas na
forma de combinações e afetando mutuamente a sua atividade. Uma grande
fração do genoma, cerca de 10%, codifica proteínas regulatórias.
 Biologia Molecular 95

2. Cromatina celular e epigenética A recomposição alternativa

ou splicing alternativo é uma
Ao analisarmos a estrutura da cromatina, imaginamos se os nucleossomos, junção diferencial de éxons
como estrutura, podem afetar a expressão do gene, a replicação, a repara- para formar mais de uma
variante do mesmo gene. O
ção etc. Estudos sugerem que o nucleossomo é modelado de forma que as
significado deste mecanismo
enzimas possam atravessá-lo, desde que ocorram alguns desencaixes en- é que ele aumenta a
tre os dímeros de histona. À medida que ocorre progressivo empacotamento diversidade dos produtos
da cromatina, na divisão celular, o gene torna-se cada vez mais inacessível. genéticos. Um exemplo
O empacotamento máximo dos cromossomos ocorre durante a metáfase, a proeminente no nível de
DNA é a troca da classe de
qual é uma fase transcricionalmente inativa. Para resumir, a ideia é a de que
imunoglobulina. No nível do
os nucleossomos não impediriam as enzimas metabolizadoras (RNA e DNA RNA, verifica-se o exemplo
polimerases), mas o empacotamento, esse sim, impede a transcrição. da distrofina, onde ocorre um
gene mutado nas distrofias
O exemplo clássico é a família da β-globina, expressa em células eri-
musculares de Duchenne
troides, estudada especialmente em humanos e em galinhas. Possui cerca de e Becker. Na distrofia
cinco genes expressos durante o desenvolvimento, os quais são ativados/de- ocorrem sete promotores
sativados por um mecanismo de alteração da estrutura da cromatina. Essas que são utilizados para gerar
mudanças surgem de uma região chamada de região de controle de locus expressões específicas em
diferentes tecidos.
(LCR). Pacientes com talassemia (um tipo de anemia) apresentam mutações
nessa região específica. As regiões de genes das globinas, nesses pacientes,
mostram-se resistentes ao tratamento com uma DNAse, mostrando que eles Evidências científicas sobre
se encontram inacessíveis e, portanto, inativados, pela cromatina. a epigenética mostram
A metilação é um recurso usado para regular os genes, geralmente de que alterações nos genes
não são suficientes para
forma inibitória ou inativadora, pois a adição de metilas (-CH3) aos nucleotí- responder determinadas
deos impede o perfeito ajuste do substrato DNA às enzimas que o metaboli- questões. Trata-se de um
zam. A metilação é efetuada por uma enzima metilase. Nos vertebrados, ela novo campo da biologia
ocorre restritamente aos nucleotídeos de citosina, na sequência CG. Esse pa- que desvenda os mistérios
de como o ambiente pode
drão de metilação é herdado pelas células-filhas, após a replicação do DNA.
influenciar o comportamento
A literatura sugere que a metilação do DNA é usada em vertebrados das células sem modificar o
para inativar o gene ou o segmento cromossômico e assegurar que ele per- código genético. O hábito de
maneça nesse estado. É comum perceber a presença de metilações em ge- fumar, o uso de esteróides
nes não expressos, de forma que a metilação CG foi adotada como modo de e certas drogas também
influenciam as funções
obstrução ao início de transcrição em segmentos inativos do genoma. Porém, genéticas por interagir
quando o gene retoma sua ativação (e caso isso ocorra), como, durante o química ou fisicamente
desenvolvimento do organismo, ele acaba perdendo suas metilações. O cro- com o DNA. Gêmeos
mossomo X inativo das fêmeas de vertebrados demonstra o papel da metila- idênticos (possuidores
do mesmo genoma)
ção no silenciamento gênico, pois, quando este é metilado, sua tendência é
apresentam diferenças
ficar permanentemente condensado. em seu comportamento e
Enquanto a metilação inibe, a acetilação de histonas (–CH3CO) relaxa fisiologia que poderiam ser
explicados dessa forma.
a estrutura dos nucleossomos, permitindo que os fatores de transcrição se li-
guem ao DNA, possivelmente pela neutralização das cargas positivas das his-
tonas. Desacetilases promovem a retirada desses grupos acetil das histonas e
96 CECCATTO, V. M.

restauram a repressão pela cromatina. Torna-se muito provável a associação

entre os dois processos: metilação e desacetilação. Da mesma forma, a des-
metilação do DNA permitiria a adição de grupos acetil pelas acetiltransferases,
alterando a estrutura do nucleossomo.
A epigenética é um campo recente da Genética Molecular que estuda
mudanças reversíveis e herdáveis no genoma funcional que não alteram a
sequência de nucleotídeos do DNA. Existem três mecanismos principais de
alterações epigenéticas: metilação do DNA, modificações de histonas e ação
de RNAs não codificadores. As modificações de histonas mais bem estuda-
das são as acetilações, fosforilações e ubiquitinações, formando o chamado
código de histonas, determinando a conformação da cromatina. Já a ação de
RNAs não codificadores (ver capítulo 5) está relacionada ao silenciamento
pós-transcricional de genes através do mecanismo de RNA de interferência
(RNAsi). Veja mais a diante onde ocorre o bloqueio da tradução ou degrada-
ção do RNAm alvo. Além da ação bloqueadora da transcrição, os RNAsi po-
dem ser associados à metilação de sequências de DNA. A pesquisa na área
da epigenética alcança implicações na Agricultura, na Biologia e doenças
humanas, incluindo o entendimento sobre células-tronco, câncer e envelheci-
mento. Inclui o estudo de como os padrões de expressão são passados para
os descendentes; como ocorre a mudança de expressão espaço-temporal de
genes durante a diferenciação de um tipo de célula e como fatores ambientais
podem mudar a maneira como os genes são expressos. Todos esses meca-
nismos parecem estar interligados para a organização estrutural da cromati-
na, tornando-a mais acessível ou não aos fatores de transcrição.
O ambiente influencia de forma importante as mudanças epigenéticas.
Qualquer alteração ambiental, como ataque de patógenos, xenobióticos, tipo
de alimentação, pode acarretar mudanças epigenéticas. O estresse ambien-
tal, incluindo a hibridação e a poliploidização, são determinantes na ocorrên-
cia de variações epigenéticas. Sendo assim, a epigenética está intimamente
relacionada com o aumento de variabilidade fenotípica dos indivíduos resul-
tando em relevante importância para a evolução.
Existem genes estruturais que codificam polipeptídios que participam
do metabolismo ou na biossíntese. Os genes ditos regulatórios produzem
RNA ou proteínas que interagem com outras sequências, induzindo ou repri-
mindo a expressão gênica. As proteínas regulatórias são proteínas com capa-
cidade de se ligar ao DNA (não confundir com as polimerases), reconhecendo
sequências específicas (ou sequências regulatórias), encaixando-se ge-
ralmente ao sulco maior do DNA, reconhecendo átomos expostos nesse local.
As proteínas de ligação ao DNA possuem domínios de ligação ao DNA.
Nesses domínios alguns aminoácidos fazem contato geralmente através de
pontes de H com bases nitrogenadas. Essas proteínas de ligação são agrupa-
 Biologia Molecular 97

Xenobióticos: (do grego,

xenos = estranho) são
das de acordo com esses motivos encontrados dentro dos seus domínios de
moléculas químicas
ligação. Os motivos de ligação ao DNA são bem conhecidos, são estruturas estranhas a um organismo
simples, como as alfas-hélices. Esses motivos se agrupam geralmente em ou sistema biológico.
dímeros que se dispõem face a face (Figura 2). Considera-se que não é
normalmente produzido.
Também se aplica a
substâncias presentes
em concentrações muito
mais elevadas que o nível
normal. Em específico,
medicamentos tais como
antibióticos são xenobióticos
em humanos porque o
corpo humano não os
produz nem as substâncias
fazem parte da dieta.
Poliploidização:
aumento do conjunto de
cromossomos (2n diplóide)
ou genomas – como
triplóide (3n), tetraplóide
(4n), pentaplóide (5n), etc.
Genes estruturais: genes
que especifica a síntese de
um polipeptídio.
Genes regulatórios: genes
que controlam a taxa de
expressão de outro gene.

Figura 2 - Estruturas em bola e em bastão para motivos proteicos de ligação ao DNA

(a) motivo em hélice – volta – hélice. (b) motivo zinc finger (ou dedos de zinco).
(c) motivo dedos de zinco fixando-se a dupla hélice de DNA formando um complexo
dedos de zinco-DNA. Note que os bastões são estruturas proteicas em alfa-hélice, as
linhas são estruturas protéicas ao acaso. Fitas são estruturas proteicas em folha-beta.
As esferas são íons.
Fonte: Griffiths et al. (1999).

3. Em eucariotos: regulação da transcrição

“O que é verdade para E. coli também é verdade para o elefante”, disse Monod,
porém existem alterações, no caso da expressão gênica. As bactérias mos-
tram economia na sua regulação. O mesmo não ocorre em eucariotos, nos
quais a regulação é complexa, e um gene pode responder de muitas formas a
vários sinais diferentes. Retornando ao tema da transcrição de genes, a trans-
crição eucariótica contém várias proteínas que se ligam à maquinaria de início
da transcrição e possibilitam que ela seja mais eficiente ou não. O início da
transcrição é caracterizado pela formação de um aparelho basal de transcrição.
98 CECCATTO, V. M.

Este consiste de RNA polimerase, uma série de fatores gerais de transcrição e

proteínas acessórias repressoras e ativadoras. Esse aparelho basal de transcri-
ção reúne-se sobre a sequência promotora (ou promotor) upstream ao gene a
Outras definições ser transcrito, e sua função é melhorar a afinidade da enzima RNA polimerase
de genes
ao promotor. Lembre-se de que o promotor não é uma proteína, mas uma sequ-
Gene repressor: gene
que codifica uma proteína ência de DNA upstream ao gene, ao qual se ligam todas estas partículas.
regulatória repressora. A RNA polimerase desempenha o papel principal. Em geral, temos três
Gene segmentar: gene
RNAs polimerases nos organismos eucarióticos: I, II e III. Para a produção
que controla a formação de
segmentos adjacentes no do pré-RNAm (ou transcrito primário: proteínas em geral), alguns snRNAs e
corpo de Drosophila, gene snoRNAs, a polimerase II é a responsável. Quando esta se fixa ao promotor,
homeiótico (veja o item os fatores de transcrição são liberados, e a enzima começa a fazer seu traba-
“O desenvolvimento e seu
lho de polimerização.
controle”).
Gene seletor: um gene que O passo a passo para a afinidade da RNA polimerase II pelo seu promo-
influencia o desenvolvimento tor é um processo que se inicia num local específico do promotor, chamado
de segmentos corpóreos
TATA box. Essa sequência é rica em nucleotídeos T e A, localizado a cerca de
específicos em Drosophila,
gene homeiótico. 25 nucleotídeos upstream ao início do gene. Os promotores merecem aten-
Gene supressor tumoral: ção especial pela sua importância na transcrição e na regulação do gene.
um gene cujo produto está Os promotores são encontrados em todos os organismos, porém são mais
envolvido na repressão da
conhecidos em bactérias. O exame dos promotores mostra que estes variam
divisão celular.
Genes homólogos: genes de sequência, trechos curtos, mas são comuns a muitos promotores. Esses
que evoluíram de um gene trechos curtos são comuns e, como todos os trechos conservados nos orga-
ancestral comum. nismos, são sequências consenso. Uma das sequências mais comuns está
Genes ortólogos: genes
na posição 10, chamada Pribnow box ou TATA box (5´ TATAAT 3´). Essa é
homólogos presentes em
espécies diferentes. uma sequência consenso; portanto, representa os nucleotídeos mais comu-
Genes parálogos: genes mente encontrados.
homólogos presentes dentro
Um fator de transcrição TFIID liga-se ao TATA box e promove uma tor-
da espécie.
ção no DNA que é essencial para o início do processo. Após o TFIID, liga-se
de forma adjacente o TFIIB, os próximos fatores também se ligam (TFIIE, TFIIF
e TFIIH). TFIIH utiliza ATP, fosforilando a enzima RNA polimerase II, mudando
sua estrutura conformacional de forma que ela se pode liberar desse complexo
de fatores e proteínas e possa caminhar em direção ao gene e transcrevê-lo.
O sítio de fosforilação é uma cauda peptídica da RNA polimerase, em que a
TFIIH contém uma enzima com atividade quinase em suas subunidades.
As proteínas ativadoras e co ativadoras (acentuadores ou enhancer)
do aparelho basal de transcrição (Figura 3) promovem a transcrição, facili-
tando a montagem sobre o promotor. Alguns deles acumulam a função de
acetiltransferase (adicionam acetilas) e facilitam mais ainda a transcrição pela
alteração da estrutura da cromatina. As proteínas repressoras, ao contrário,
inibem a transcrição, silenciando-a pela competição que fazem pelos sítios
de ligação dos acentuadores. Uma questão que chega a ser insólita é o fato
 Biologia Molecular 99

de os acentuadores serem capazes afetar a transcrição em promotores dis-

tantes. Sugere-se que o DNA se dobre de forma a posicionar o promotor e o
acentuador de forma próxima. Insuladores ou elementos limítrofes, como a
própria palavra diz, insulam ou isolam o efeito dos acentuadores, de forma que
eles não fiquem acentuando a transcrição de qualquer gene. Porém, ainda
pouco se conhece sobre essa ação, mas exemplos já são conhecidos.

Figura 3 - Fatores de transcrição ligam-se à acentuadores ou enhancers os quais são

capazes de interagir com fatores de transcrição gerais no promotor devido à formação
de loops no DNA.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).

4. Estabilidade do RNA como evento regulador

Uma abordagem diferente e relativamente recente que vêm chamando a
atenção, é o uso do RNA como regulador, devido ao fato que existem eventos
de regulação gênica dependentes do RNA. Imagine que a taxa de síntese e
degradação do RNAm regula a quantidade de RNAm disponível, que, por sua
vez, determina a quantidade de proteína a ser produzida. Destaca-se o silen-
ciamento do RNA (RNAsi – short interfering RNA, RNAi ou RNA de interferên-
cia). Essas pequenas moléculas de RNA são intermediárias de um processo
conhecido como RNA interference ou interferência mediada por RNA. Esse
fenômeno foi descrito pela primeira vez no nemátodo Caenorhabditis elegans,
em 1998, quando se observou que a presença de apenas algumas poucas
moléculas de RNA dupla-fita (RNAds) eram capazes de abolir a expressão de
um determinado gene com sequência similar àquele RNAds.
O silenciamento gênico corresponde a uma interação entre sequências
homólogas de DNA e RNA; portanto, é dependente de homologia entre essas
sequências. Podemos definir dois tipos. Primeiramente, silenciamento gênico
100 CECCATTO, V. M.

pós-transcricional, em que ocorre a degradação de RNAs mensageiros homó-

logos no citoplasma, levando à inibição da tradução. Outro seria o silenciamen-
to gênico transcricional relacionado com o bloqueio na transcrição, induzida
por um RNA antisenso derivado do próprio DNA, metilando a região promotora.
O RNAm possui meia vida curta, porém variável, de minutos a horas,
dias ou meses. Ele é degradado por vários tipos diferentes de ribonucleases.
O mRNAm bacteriano é o mais facilmente degradável, justamente por não
possuir elementos protetores como o cap 5´ e a cauda poli A 3', tipicamente
durando apenas alguns minutos. O silenciamento do RNA aparece em fun-
gos, plantas e animais, mas cogita-se muito mais que isso. O papel do silen-
ciamento gênico tem intrigado a ciência. Muitos postulam que seja defesa
contra ácidos nucléicos estranhos, proteção contra transposons eventuais,
em plantas, a expressão gênica de multigenes ou genes duplicados.

5. O desenvolvimento e seu controle

Morgan foi um dos primeiros descobridores das mutações em moscas. Ele e
seus alunos, como Calvin Bridges, nas décadas de 10 e 20, encontraram deze-
nas de mutantes em Drosophila. Essas alterações mostravam que o desenvol-
vimento embrionário deveria ser regulado por alguns genes então desconheci-
dos. Por exemplo, na mutação chamada antennapedia, pernas apareciam no
lugar de asas (gene homeótico). Uma abordagem para o estudo do desenvol-
vimento pode ser o isolamento e a caracterização de mutantes com o estudo
das proteínas responsáveis que são codificadas e que produzem tal defeito.
Uma das perguntas essenciais é: quais genes são responsáveis pelo
crescimento e pelo desenvolvimento? Já vimos que existem genes do tipo
housekeeping ou constitutivos, que mantém o estado basal de metabolismo
celular. Não são esses os conjuntos de genes que nos referimos, pois busca-
mos genes envolvidos com a formação de órgãos e tecidos, especificando ti-
pos celulares, plano corpóreo, número, identidade e outros padrões corporais.
As mutações mais interessantes do ponto de vista científico são as que
causam algum pequeno defeito facilmente perceptível na progênie, produzindo
segmentos diferentes, apêndices etc. Pesquisas mostraram em moscas existem
alguns genes, chamados complexo Hox, encontrados em oito diferentes loci gê-
nicos situados no terceiro cromossomo de Drosophila. A mutação antennapedia
é produzida por cinco genes Hox. No embrião em desenvolvimento, os genes
Hox (Figura 4) são expressos em locais específicos, formando padrões específi-
cos de desenvolvimento. Hoje sabemos da existência do homeoboxe, um curto
domínio proteico encontrado nessas proteínas Hox. O homeoboxe codifica um
homeodomínio de 60 aminoácidos. Essa sequência é muito comum nas pro-
 Biologia Molecular 101

teínas Hox. As similaridades desse homeodomínio com proteínas repressoras

(motivo hélice-giro-hélice) mostrou que as proteínas Hox ligam-se ao DNA, fun-
cionando nos mesmos princípios já vistos em relação à ativação e a desativação
de genes. Os genes Hox foram encontrados também em grande número de
animais, mostrando sua presença em ancestrais distantes e evidenciando que a
maioria de genes ligados ao desenvolvimento são comuns aos grupos animais.

O processo de splicing
alternativo modificou a
noção do gene e levou
ao entendimento de que
um gene poderia produzir
múltiplas proteínas
diferentes a partir da
uma mesma sequência.
Nesse novo contexto, a
definição ficou resumida na
expressão conhecida de
“um gene, várias proteínas”,
que representava a noção
Figura 4 – (A) Filogenia do grupo craniata mostrando localizações filogenéticas com
de uma sequência de DNA
duplicações gênicas para o gene Hox. (B) Representação esquemática da família
que possui éxons como
Hox em vertebrados. segmentos independentes
Fonte: Lynch e Wagner (2009). e que esses éxons,
dependendo do contexto
Em humanos, aproximadamente 3% de todas as gestações humanas celular poderiam fazer
terminam no nascimento de uma criança com um problema genético. A criança, proteínas diferentes.
Lembre-se do éxon shuffling
nesses casos, é perfeitamente sadia, apresentando defeitos isolados como a ou embaralhamento de
fenda labial, problemas cardíacos ou defeito do tubo neural, os quais, apesar de éxons eucariótico.
natureza multifatorial, em boa parte, são corrigidos com relativa facilidade com
102 CECCATTO, V. M.

cirurgia. Outras anomalias derivam de uma alteração cromossômica ou mesmo

de alterações em genes isolados, quando o indivíduo pode apresentar certa
gama de sintomas ou síndrome, com várias anomalias congênitas. O desen-
volvimento normal de um indivíduo envolve processos de replicação, migração
e diferenciação rigidamente controlados temporal e espacialmente, numa se-
quência pré-programada de ativação e desativação de genes.
A ciência da dismorfologia examina nos pacientes diferenças, tanto
aquelas facilmente visíveis quanto aquelas mais sutis, buscando estabelecer
padrões que podem ser reconhecidos durante o diagnóstico. Muitas anoma-
lias envolvem sistemas orgânicos, defeitos cardíacos congênitos, malforma-
ções intestinais etc., que precisam de avaliação genética precisa.

Texto complementar
Células tronco embrionárias
Linhagens de células tronco embrionárias (células ES - do inglês embryonic stem) são
células não diferenciadas, derivadas do botão embrionário de blastócistos, que têm
como característica principal pluripotência. Ou seja, quando reintroduzidas em um
blastocisto, as células ES possuem capacidade de retomar o desenvolvimento normal,
colonizando diferentes tecidos do embrião, incluída a linhagem germinativa. Somente
aquelas linhagens de células ES capazes de colonizar a linhagem germinativa de um
embrião são consideradas altamente pluripotentes.
Quando cultivadas em condições específicas, as células ES podem ser mantidas
em seu estado não diferenciado por múltiplas divisões celulares. Por outro lado, es-
sas células podem ser induzidas a iniciar um programa de diferenciação in vitro. Por
exemplo, quando cultivadas em suspensão, as células ES formam espontaneamente
agregados de células diferenciadas chamados “corpos embrióides” (Ebs “embryoid
bodies”), que simulam o desenvolvimento de um embrião pré-implantado. Através
de análises morfológicas, imuno-histoquímicas e moleculares, encontra-se uma gran-
de variedade de linhagens embrionárias dentro dos EBs – hematopoética, neuronal,
endotelial, cardíaca e muscular.
Essas propriedades das células ES levaram ao seu uso como modelo in vitro de de-
senvolvimento embrionário precoce. Nelas, podem ser estudados os mecanismos de di-
ferenciação celular, o processo de iniciação da inativação do cromossomo X, e os efeitos
de substâncias tóxicas e biologicamente ativas no desenvolvimento embrionário in vitro.
Modelos animais para doenças genéticas humanas: nos últimos anos, células ES
vêem sendo utilizadas para produzir camundongos transgênicos e modelos animais
de doenças genéticas humanas. Esses modelos animais são importantes ferramen-
tas para o estudo das patologias associadas com uma doença específica, além de
servirem como um sistema no qual podem ser testadas, novas terapias. O recente
desenvolvimento de técnicas de manipulação do genoma de camundongos faz do
camundongo transgênico o melhor sistema disponível para o estudo de doenças ge-
néticas humanas.
Fonte: adaptado de Kerkis et al. (2001).
 Biologia Molecular 103

Síntese da Parte
A regulação gênica consiste na expressão do gene mediada por diversos e
variados mecanismos em organismos procarióticos e eucarióticos. O conhe-
cimento da expressão gênica é um pouco limitado em eucariotos porque cada
gene possui uma regulação específica. Proteínas regulatórias são essenciais
nesse processo e possuem domínios de ligação ao DNA. Sua ação é mais
intensa na iniciação da transcrição, através de interação com a RNA polimera-
se. Outros mecanismos incluem a regulação por RNA, entre outros.

Atividades de avaliação
1. Procure, em livros de embriologia e desenvolvimento, como ocorre a di-
ferenciação dos tecidos multicelulares. Faça um resumo.
2. A clonagem de animais de companhia, como cães e gatos, vêm se tor-
nando um bom negócio nos EUA e na Europa. Entretanto, como a epi-
genética pode “atrapalhar” a clonagem? Dica: lembre que a epigenética
depende do ambiente gênico.
3. Pesquise doenças genéticas que ocorrem devido a alterações na ex-
pressão do gene, por exemplo, a talassemia.
4. Procure em livros os domínios e motivos de ligação ao DNA.
5. Procure resumir como o câncer é afetado pelas alterações na regulação
normal dos genes.
6. Procure o significado de “microarrays” ou “microarranjos” e como eles
podem ser usados para análise de expressão de genes.
104 CECCATTO, V. M.

Leituras
• DAWKINS, R. O gene egoísta. 1. ed. Belo Horizonte: Itatiaia, 2001.
230 p.
• SAGAN, C. Variedades da experiência científica. 1. ed. São Paulo:
Companhia das Letras, 2008. 304 p.

Filmes
• A guerra do fogo (Dir. Jean-Jacques Annaud, 1981) - evolução hu-
mana.
• O curandeiro da selva (Dir. John McTierman, EUA, 1992) - farmaco-
logia e meio ambiente.
• A ilha (Dir. Michael Bay, EUA, 2005) - clonagem humana.
• Quanto vale ou é por quilo? (Dir. Sérgio Bianchi, 2005) - sociologia e
miséria social.
• Escola da vida (Dir. William Dear, 2005) - educação e biologia.
• O tráfico humano (Dir. Christian Duguay, 2005) – sociologia e denúncia.

Sites
Bases de dados públicas
• http://www.sciencenet.com.br
• http://www.isiknowledge.com
• http://www.scielo.br
• http://www.dominiopublico.gov.br
• http://www.prossiga.br/basesdedados

Revistas e sites de divulgação científica

• http://www.biotecnologia.com.br (Revista Biotecnologia)
• http://www.sciam.com.br/ (Scientific American - versão nacional)
• http://cienciahoje.uol.com.br/ (Ciência Hoje)
 Biologia Molecular 105

• http://www.uenf.br/index.html/jornalonline (Jornal UENF universi-

tário online)
• http://www.agencia.fapesp.br/ (Agência de Notícias da FAPESP -
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)
• http://www.abjc.org.br/ (Associação Brasileira de Jornalismo Cien-
tífico)
• http://www.usp.br/agen/ (Agência USP de notícias)
• http://www.comciencia.br/comciencia/ (Revista eletrônica de jor-
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Referências
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PIERCE, B. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Editora Guanabara Koo-
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 Parte 5
DNA recombinante
 Capítulo 10
Considerações iniciais e
histórico

Atualmente, podemos dizer

Objetivo que é quase impossível
• Compreender as técnicas básicas do DNA recombinante, habilitar a dis- separar a Biologia
Molecular do próprio estudo
cussão das bases teóricas dessas técnicas e suas conexões entre si e genético, devido à própria
com a atual perspectiva biotecnológica. natureza das moléculas da
hereditariedade. A Genética
Molecular é uma área de
1. Aspectos gerais interface geralmente mais
voltada para a área da
O homem sempre foi capaz de alterar a paisagem à sua maneira. A agricultura saúde, abrangendo o estudo
surgiu no sudoeste asiático por volta de 10.000 a.C. e do pastoreio, a domesti- de patologias genéticas.
A genética clássica
cação de carneiros, cabras e ovelhas acerca de 3.200 a.C. Com o advento do
envolve o conhecimento
sedentarismo humano, a moradia torna-se fixa em aldeias, próximas a rios e epistemológico acumulado
inicia-se a domesticação de animais, como o dromedário, boi, cão, cabra etc. durante anos de estudo
Utilizam também roupas de tecido, lã, linho e algodão. Em uma região do Oriente antes do advento da
estrutura do DNA e do início
próximo, chamada crescente fértil, ocorre a invenção da agricultura, com cere-
da Genética Molecular. Fruto
ais como o trigo e a cevada. Começa, então, a economia de produção, visando de grandes pensadores
o lucro. A economia humana forçou a escolha das melhores raças animais, a como Mendel, Darwin,
agricultura torna-se negócio. Nas prateleiras dos estabelecimentos comerciais, Sutton, Morgan, Fischer,
Haldane e Wright, esses
o homem esmera-se em apresentar os melhores e mais suculentos frutos de
pesquisadores e outros
seu trabalho. Portanto, não deveria haver surpresa quando se fala em engenha- fundaram a genética
ria genética. Nossos pais e nossos avós a faziam bem antes de nós, quando clássica. Esta envolve o
escolhiam as “melhores” sementes para plantar ou arranjavam “um bom repro- estudo de cruzamentos,
de frequências gênicas,
dutor” para sua fazenda. As plantas e os animais dos quais nos alimentamos ou
mapas de ligações, mapas
que usamos para produzir os bens de consumo são muito diferentes daquelas genéticos, entre outros.
que encontramos na natureza. Os cruzamentos são intencionais, como o que Aplicações mais evidentes:
fazemos com os cães, gerando uma variedade de cores, formas e caracterís- a genética de populações,
o melhoramento genético,
ticas desejáveis para os seres humanos. O cão doméstico é muito diferente do
usos em sistemática, em
seu ancestral: o lobo cinzento. Hoje temos tecnologia para acelerar algumas ecologia etc.
alterações no laboratório de Biologia ou Genética Molecular.
110 CECCATTO, V. M.

Mesmo dentro dessa perspectiva, há muita história para se contar. O

trabalho com o DNA in vitro sempre foi muito difícil e dependeu também do
avanço das técnicas bioquímicas, que, a partir dos anos 50, ganharam grande
avanço. Muitas descobertas, entretanto, tiveram que aguardar que a tecno-
logia pudesse resolver suas indagações. Os anos 70 foram palco de uma
FISH (Fluorescence In revolução dentro de uma revolução, que foi o advento da reação em cadeia
Situ Hybridization) é uma da polimerase, ou PCR. A partir desse momento, a biologia dos ácidos nuclei-
técnica citogenética cos escapou dos muros da academia e tomou de assalto a vida do cidadão
desenvolvida por Christoph
Lengauer usada para comum. A partir desse momento, foi impossível refrear as inúmeras aplica-
detectar e localizar a ções, desde resultados forenses até pesquisas ecológicas, paleontológicas
presença ou ausência de etc. Resultados de testes de DNA inundam a mídia hoje em dia. O cidadão
sequências de DNA em de nível médio talvez tenha problemas se for indagado sobre o que seja uma
cromossomos. FISH usa
sondas fluorescentes (ou proteína, porém certamente saberá o peso que um teste de DNA pode fazer
radioativas) que se ligam a sua vida e à sociedade. Com base nele, condenados à morte são libertos,
às partes do cromossomo seguros podem ser pagos, herdeiros são reconhecidos. Entretanto, o biólogo
em que as sondas se deve reconhecer na PCR e em outras técnicas as reais possibilidades como
hibridizam, em alto grau
de similaridade. Para a ferramentas de trabalho.
visualização, é necessário
o uso de microscopia
de fluorescência. Pode 2. Breve histórico
ser usado também para
Como fazer cortes na molécula de DNA? A resposta foi oferecida por Werner
localizar mRNAs específicos
dentro de amostras de Arber, que, em 1968, anunciou a endonuclease de restrição de E. coli. Na
tecidos, apresentando o época verificou-se em experimentos de transformação induzida, que bacté-
perfil específico espacial rias sempre degradavam o DNA de outras bactérias introduzidos experimen-
e temporal de expressão
talmente nelas. Hoje sabemos que distintas classes de bactérias contêm
de genes dentro de células
e dos tecidos. Algumas distintas classes de enzimas de restrição. Uma questão interessante é que
doenças importantes a bactéria protege o seu próprio DNA, através de metilações. Arber, então,
diagnosticadas com FISH encontrou uma nova classe de enzimas, as enzimas de restrição (do verbo
incluem a síndrome de
“restringir”) (Figura 1). Atualmente se conhecem várias classes de enzimas
Prader-Willi, Síndrome
de Angelman, leucemia de restrição, como as do tipo I e II. As do tipo II são utilizadas nos laborató-
mielógena crônica, leucemia rios para fazer cortes nas moléculas de DNA. Na época, Arber encontrou as
linfoblástica aguda, enzimas de restrição do tipo I, as quais cortam o DNA em locais distantes do
Cri-du-chat, síndrome
local desejado, portanto, inadequadas para o uso no laboratório. Foi ganhador
velocardiofacial e síndrome
de Down. Seu principal do prêmio Nobel em 1978. As enzimas de restrição do tipo II, essas sim, são
problema é o altíssimo custo endonucleases de restrição específicas, o que foi confirmado pelo geneticista
laboratorial e de mão-de- microbiano Hamilton Smith e seus colegas, Wilcox e Kelley, na Universidade
obra especializada. FISH
Johns Hopkins.
é uma das técnica mais
proeminente da citogenética
molecular, a combinação da
Biologia Molecular com a
Citogenética.
 Biologia Molecular 111

Figura 1 - O DNA recombinante é feito pela digestão de uma endonuclease de restrição,

que gera extremidades de fitas simples, as quais se tornam complementares.
A finalização é feita pela DNA ligase.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).

A reação da PCR foi desenvolvida por Kary Mullis, em 1983, nos Estados
Unidos. Alguns trabalhos pioneiros foram feitos em 1971, por Gobind Khorana,
que descreveu o princípio básico de replicar um DNA usando dois primers.
No processo original de Mullis, o DNA dupla fita foi separado em duas fitas
simples pelo aquecimento a 96°C. Nessa temperatura, no entanto, a DNA poli-
merase obtida de E. coli foi destruída, de forma que, a cada novo ciclo, o pes-
quisador deveria reabastecer a reação de enzima, tornando o processo muito
ineficiente. Esse problema só foi resolvido cerca de dez anos mais tarde, com
o uso da Taq DNA polimerase. O registro inicial dessa enzima, purificada da
bactéria Thermus aquaticus, obtida em fontes termais, foi publicada em 1976.
112 CECCATTO, V. M.

Hoje sua patente na utilização da PCR vale centenas de milhões de dólares.

Torna-se interessante como algumas descobertas um pouco obscuras, anos
mais tarde, tornam-se de importância prática imensa. Uma de suas desvanta-
gens é uma taxa relativamente alta de erro na polimerização. Outras enzimas
estão em utilização, como a Pfu polimerase, extraída de Pyrococcus furiosus,
Identificando genes com uma das menores taxas de erro de polimerização. A enzima Vent é extra-
causadores de patologias:
na comparação entre
ída de Thermococcus litoralis, também conhecida como Tli polimerase. Estas
genes de determinadas são usadas somente em alguns casos específicos.
patologias, obtidos de
pessoas com fenótipo normal
em relação com os obtidos
com pacientes, é possível
observar deleções, inserções
e outras mutações. Dessa
forma, é possível fornecer
pistas de qual (quais) gene(s)
são responsáveis. Para isso
são usados heredogramas
familiares para identificar
os possíveis doadores das
sequências. Utilizando essas
sequências, em pacientes e
familiares com fibrose cística
nos quais se constatou
que, as proteínas preditas
fornecidas por esse genes
são proteínas de transporte
de íons. Para confirmar,
essas sequências foram
usadas para transformar
linhagens celulares obtidas
de pacientes, cultivadas in
vitro, as quais tiveram seu
sistema normalizado.
 Capítulo 11
Técnicas gerais

Eletroforese é o movimento
1. Técnicas associadas: eletroforese e enzimas de restrição de moléculas carregadas
em um campo elétrico.
Imagine uma fita de DNA cortada em vários pedaços. Como seria possível É um método importante
visualizá-los? A eletroforese pode ser uma solução adequada, a princípio. para separação de
moléculas biológicas
Com ela, o DNA migra através de uma rede de polímeros de polissacarídeos, porque, normalmente, não
puxado por uma corrente elétrica, em direção ao polo positivo. Ao caminhar, afeta a estrutura nativa
as fitas menores vão mais rápidas; as maiores, mais lentas, se enredam e de biopolímeros e devido
param mais rapidamente; as intermediárias se separam e, com o tempo, não ser altamente sensível a
pequenas diferenças em
conseguem mais caminhar, formando bandas. Cada banda contém várias fi- ambas as cargas e massa.
tas de DNA do mesmo tamanho, mas não significa que sejam iguais, apenas O meio ideal de apoio para
têm o mesmo peso. Para proteínas, a eletroforese segue o mesmo protocolo eletroforese é quimicamente
analítico. Depois de separados, é possível isolar as bandas, cortando-as do inerte, de fácil manuseio e
tem porosidade controlável.
gel, retirando-se o gel com lavagens e centrifugação e usar a sequência. Embora o papel seja o
Para acompanhar a corrida eletroforética, sempre se utiliza um marca- suporte escolhido para
dor de peso molecular. No caso do DNA, utiliza-se uma coleção de pedaços algumas aplicações, como
aminoácidos e pequenos
de ácidos nucleicos com peso molecular conhecido. Eles se distribuem e per- peptídeos, há limitações
mitem visualizar, por comparação do perfil eletroforético da amostra, o seu porque a porosidade
peso molecular. Na verdade não se considera como “peso molecular”, mas não pode ser controlada.
sim massa molecular relativa. Outra vantagem é que o uso do marcador de Géis com porosidade
controlável ou variável são
peso permite verificar se a corrida foi adequada ou não. ideais para separação de
O DNA não é corável, ou marcado, com os mesmos corantes que se uti- componentes de alto peso
lizam para a proteína. As bandas no gel de agarose são invisíveis. Para vê-las é molecular (proteínas e ácidos
nucléicos), porque eles
possível usar vários tipos de marcação, como isótopos radioativos para marcar o permitem fácil movimentação
DNA, como o 32P (Figura 2). O fósforo incorpora-se ao DNA e emite uma partícula de macromoléculas enquanto
beta que é detectável, usando filmes fotográficos (autorradiografia). Entretanto, é previnem convecção e
mais simples usar agentes intercalantes, como o brometo de etídio. Essa substân- minimizam difusão.
cia é um fluoróforo que absorve a cerca de 300 nm e libera a energia a 590 nm, na
cor laranja ou amarela, tornando as bandas de DNA visíveis num transiluminador.
 114 CECCATTO, V. M.

O genoma bacteriano, como vimos anteriormente, foi um dos primeiros

Géis também adicionam a a ser sequenciado, o qual contem cerca de um milhão de correto. Os traba-
possibilidade de combinação
de separação eletroforética
lhos iniciais em Biologia Molecular do DNA eram feitos com Drosophila e ou-
com efeito de peneiramento tros genomas pequenos, utilizando métodos indiretos, como a construção de
molecular – permeação do mapas genéticos (feitos através de cruzamentos entre indivíduos e computan-
gel. Géis com efeitos peneira do as frequências) e citogenética (cariótipos feitos em lâminas histológicas).
podem ser preparados
com tamanhos de poros
Genomas grandes, como os eucarióticos, tornavam a pesquisa difícil para os
aproximadamente do mesmo pesquisadores. A tarefa de isolar uma única sequência era quase impossível.
tamanho de moléculas É possível usar nucleases e cortar o DNA, porém, elas cortam em locais ines-
a serem separadas pelo pecíficos (digerindo os nucleotídeos a partir das extremidades – exonucleases
controle da concentração do
gel. Três tipos de géis são
ou cortanto de forma inespecífica, pedaços de DNA – endonucleases). Pode-
comumente usados – amido, -se ainda usar clivagem mecânica como a própria agitação do tubo, sonicado-
poliacrilamida e agarose. res (ultra som) etc. Entretanto, esses métodos, com o tempo do experimento,
Para proteínas, são usados acabam por digerir totalmente o DNA e o cortam de forma aleatória, produzin-
mais comumente a acrilamida
e bisacrilamida. Estes
do pedaços de igual tamanho, portanto, pouco úteis para se isolar um gene
podem ser polimerizados ou, mesmo, qualquer sequência.
na presença de radicais Uma boa resposta para facilitar os trabalhos apareceu com a descober-
livres para gerarem géis
de variados, os tamanhos
ta das endonucleases de restrição ou simplesmente enzimas de restrição
de poros podem ser (Figura 2). Essas enzimas cortam o DNA em locais específicos, sempre os
controlados. Isso permite mesmos para cada enzima, chamados sítios de restrição (por ex. GAATTC
ao meio eletroforético é o sítio de restrição da enzima EcoRI). Portanto, uma fita de DNA digerida
ter um efeito direto na
separação eletroforética.
por endonucleases de restrição fica em pedaços, contendo, em cada uma de
Se o tamanho dos poros suas extremidades, uma parte do sítio de restrição. Esse sítio no DNA com-
for aproximadamente preende 4 a 8 nucleotídeos, distribuindo-se de forma aleatória no DNA.
igual aos das moléculas,
moléculas pequenas se
moverão livremente num
campo elétrico e moléculas
maiores serão restringidas na
migração delas.
 Biologia Molecular 115

As enzimas de restrição
são proteínas importantes
para o trabalho molecular,
especialmente aquelas
que formam pontas
adesivas (ou extremidades
coesivas). Os segmentos
onde elas cortam, ou
sítios de restrição, formam
geralmente um palíndromo
de DNA, como o reflexo num
espelho. Para a formação
do DNA recombinante,
ocorre, então, a hibridização
entre as fitas simples. Na
natureza, essas enzimas
são encontradas ocorrendo
naturalmente em diversos
procariotos. Como todas as
enzimas, existem em poucas
cópias, tornando difícil seu
isolamento no laboratório.
A maioria das enzimas são
produzidas em laboratórios
farmacêuticos que produzem
reagentes para pesquisa,
utilizando, por exemplo,
expressão da proteína de
interesse por sistemas
heterólogos. O site mais
bem estruturado, contendo
milhares de enzimas de
restrição é o REBASE
(Restriction Enzymes
Base), um repositório de
Figura 2 - Digestão de uma sequência de DNA com EcoRI e visualização da corrida dados exclusivo sobre
eletroforética. enzimas de restrição,
contendo ferramentas o
Fonte: Cooper e Hausman (2009).
reconhecimento de sítios
de restrição em sequências
1.1 Primeira aplicação da técnica: mapas de restrição ou RFLPs de nucleotídeos. Apresenta
também sua correspondente
Uma proposta muito utilizada que utiliza tanto a eletroforese quanto as enzi- enzima comercialmente
disponível (veja em http://
mas de restrição é a produção de mapas de restrição. Também conhecido
rebase.neb.com/rebase/
como RFLP ou Restriction Fragment Lenght Polymorphism ou polimorfismo rebase.html).ttv
de tamanho de fragmento de restrição. O princípio é relativamente simples.
Para entendê-lo, vamos imaginar uma atividade. Cinco ou seis alunos rece-
bem, cada um, uma fita de papel, todas quase do mesmo tamanho. Cada
um deles faz pedaços da tira, em quantidades e tamanhos que quiser. Para
116 CECCATTO, V. M.

analisar, cada aluno precisa fazer, numa superfície plana, como uma mesa,
a organização dos pedaços em ordem crescente de tamanho, de forma que
seja possível comparar todos os conjuntos ao mesmo tempo. Verifica-se de
forma um pouco grosseira, dois a dois, quais alunos formaram conjuntos mais
parecidos. Talvez seja até possível, numericamente, numa matriz, organizar
quais grupos são mais parecidos entre si e com outros grupos.
Da mesma forma, o DNA de várias espécies pode ser cortado por en-
zimas de restrição, formando um perfil eletroforético singular para aquela es-
pécie, este pode ser comparado com outros perfis e proporcionar uma com-
paração evolutiva, na qual os organismos podem ser analisados através do
polimorfismo dos fragmentos cortados por enzimas de restrição.
Esse tipo de trabalho é muito adequado para genomas pequenos ou
para produtos gerados por PCR (um único fragmento em muitas cópias).
Especialmente na microbiologia, variantes bacterianas são determinadas
por métodos fenotípicos. O polimorfismo apresentado por moléculas infor-
macionais, como proteínas e ácidos nucleicos, é utilizado como discrimina-
dor entre variantes biológicas. Nesses métodos, bactérias são submetidas
a testes morfológicos e bioquímicos, de sensibilidade a fagos e a bacterioci-
nas, perfis imunológicos (gerando sorotipos) e perfis de susceptibilidade a
agentes antimicrobianos. Esses testes são muito úteis até certo ponto, pois
conseguem determinar gênero e espécie. Entretanto, não são aplicáveis
para discriminar subespécie (estirpes e variantes). Como estão ligados ao
fenótipo, e não ao genótipo, os resultados obtidos por esses métodos depen-
dem fortemente das condições ambientais e são aplicáveis na tipagem de
apenas algumas espécies.
O genótipo não é alterado em função das alterações ambientais e fisio-
lógicas, por isso são muito usados no estudo da diversidade microbiológica,
produzindo genotipos para diferenciar de sorotipos diferentes. Organismos
geneticamente relacionados partilham características genéticas, bioquímicas
e, muitas vezes, fatores de virulência. Para a microbiologia clínica e na epide-
miologia, a genotipagem torna-se crítica, pois é possível rastrear a origem e a
disseminação de uma estirpe que se tornou causadora de um surto infeccioso
episódico, ou seja, é possível saber onde se iniciou uma contaminação.

1.2 Segunda aplicação da técnica: sondas moleculares

A fita simples de ácido nucleico é capaz de se ligar com alta seletividade com
uma segunda fita complementar. A desnaturação do DNA (separação das
duas fitas complementares) ocorre em altas temperaturas e volta a se renatu-
rar quando a temperatura cai. Esses fenômenos opostos, de desnaturação e
renaturação ocorrem pela propriedade de hibridização do DNA. Fitas duplas
 Biologia Molecular 117

Estringência: conjunto de
híbridas podem se formar com DNA-DNA, DNA-RNA (os primers adicionados condições que interfere
na associação das fitas
durante a replicação) e RNA-RNA. O processo de hibridização é a restaura- de ácidos nucléicos.
ção das pontes de hidrogênio entre os pares de base. A hibridização será mais Alguns fatores, como as
estável quanto maior for a complementaridade de bases entre as duas fitas. concentrações de sais e da
Uma fita simples de DNA de pouco mais de 17 a 20 nucleotídeos poderia ser sonda e a temperatura de
hibridização, influenciam
usada para localizar uma determinada sequência, por exemplo, num gel de significativamente nas
agarose, após a corrida. Evidentemente, ela necessita ser marcada com uma condições de estringência.
substância radioativa ou um fluoróforo para que seja possível sua localização. A alta estabilidade térmica
Essa pequena fita simples, marcada, é chamada de sonda molecular, ou pro- encontrada nos híbridos RNA-
RNA em relação aos híbridos
be (em inglês). DNA-RNA e DNA-DNA
Um pequeno problema ocorre nesse ponto: como pode a sonda de nu- favorece condições de alta
cleotídeos hibridizar, se os pedaços de DNA estão imersos e inacessíveis no estringência, e isso aumenta
a especificidade da reação,
polímero do gel de eletroforese? A resposta é a técnica é conhecida como ou seja, a probabilidade de a
Southern Blot. A palavra blot tem o significado de transferência, por isso, signi- sonda hibridizar apenas com o
fica transferência de Southern, conforme podemos ver no passo a passo abaixo: RNA-alvo.
1. Endonucleases de restrição são usadas para o corte de DNA de alto Epítopo: definido como
peso molecular em fragmentos menores. parte de uma molécula,
2. Os fragmentos passam por eletroforese em gel de agarose, onde são especialmente relevos de
superfície tridimensional, que
separados e formam bandas. é reconhecido, encaixando-se
3. Uma membrana de nitrocelulose é colocada sobre o gel ou abaixo, de- com precisão pelas células do
pendendo da direção da transferência. sistema imunológico, como
os anticorpos, as células B
4. Através de eletroporação (atração das moléculas de DNA por corrente ou as células T. Estes não
elétrica) ou por ação capilar (água ou solução alcalina), o DNA é transfe- precisam ser necessariamente
rido do gel para a membrana. Note que o padrão eletroforético de bandas exógenos, mas do próprio
corpo. A parte de um anticorpo
não é perdido no processo.
que reconhece o epítopo se
5. A membrana é seca em vácuo ou exposta à luz ultravioleta para fixar o chama paratopo.
DNA à membrana. Sorotipos: a definição
formal mostra que são
6. A membrana é exposta à sonda, que, então, se hibridiza ao DNA. Para microorganismos diferentes
evitar ligações não específicas, utilizam-se previamente reagentes blo- no tipo de antígenos de
queadores. superfície, ou o tipo de
microorganismo, determinado
7. Após a exposição, a membrana é lavada e procede-se à revelação, de- pela sua componente de
pendendo do tipo de marcação que a sonda carrega. Faz-se a autor- antígenos baseado em uma
radiografia (no caso de isótopos), revelação (fluoróforos ou substâncias de várias reações diferentes
antígeno-anticorpo, ou uma
cromogênicas).
subdivisão taxonômica. Por
8. O resultado é uma membrana contendo uma ou mais bandas marcadas, exemplo: existem quatro
as quais correspondem à sequência procurada. Pode-se voltar ao gel, sorotipos de vírus da dengue,
e cada um desses sorotipos é
recortar a banda correspondente e proceder a outras técnicas.
associado a uma variedade de
manifestações clínicas.
118 CECCATTO, V. M.

Variantes biológicas: 9. A temperatura de hibridização é muito importante, pois é muito fácil obter
são características mais
complexas ou mais simples,
falsos positivos. Aumentando a temperatura, ou a estringência, somente
que podem definir ou as hélices hibridizadas mais estáveis permanecerão.
compor a estrutura de um 10. Apesar de serem rotineiros em muitos laboratórios, os blots são geralmente
organismo, definindo-o
como uma nova variação
usados apenas para complementar ou confirmar resultados obtidos em ou-
em relação à outra. Portanto, tras técnicas. A ocorrência de falsos positivos, a difícil reprodutibilidade dos
os organismos mutantes perfis, os custos e as dificuldade no manuseio, o que demanda mão de obra
apresentam uma variação experiente, contribuem para isso. Apesar desses fatores, a hibridização com
(definida pelo observador)
em relação a um organismo
sondas, quando bem executada, é definitiva em diagnósticos de doenças
ancestral ou a seu tipo genéticas, devido à alta seletividade das sondas.
selvagem ou wild type. O método de Southern blot é referência ao pesquisador Edwin Southern,
As diferenças biológicas
biólogo britânico, que o desenvolveu em 1975. Como homenagem e brinca-
entre os seres humanos,
variações maiores ou deira com o biólogo, apareceram posteriormente protocolos derivativos dessa
menores entre genes, pode técnica, como o Western blot (usado para localizar proteínas específicas no gel
apresentar fenótipos que de eletroforese, com anticorpos), Northern blot (usado para RNA), Eastern blot
dão às pessoas as cores de
cabelo diferentes, tornam os
(para modificações pós-traducionais), Southwestern blot (para proteínas que se
indivíduos mais propensos a ligam ao DNA). Para o Eastern blot, múltiplas técnicas reivindicam esse nome.
certas doenças e determinar São usados para lipídeos, proteínas, glicoconjugados e epítopos de carboi-
como as pessoas reagem a dratos. Coletivamente, são modificações pós-traducionais. As proteínas trans-
medicamentos, na maioria
dos casos, como resultado
feridas são analisadas para as modificações pós-traducionais, pela detecção
de fatores hereditários e de lipídeos, carboidratos, fosforilação ou qualquer outra modificação proteica.
influência dos recursos Todos eles usam os mesmos princípios similares, utilizam uma membrana de
naturais e também dos nitrocelulose (nylon ou outro material) para receber a amostra vinda de uma
ambientes sociais. Há
grande diversidade
eletroforese, sem, contudo, perder o padrão eletroforético. O próximo passo é a
genética dentro de todas hibridização com uma sonda. Para proteínas, essa sonda é, na verdade, um an-
as populações humanas. ticorpo, produzido especificamente para localizar o antígeno. Em outros casos,
Infelizmente, muitas vezes pode ser utilizado um reagente, como cromogênios, fluoróforos, etc.
explicações biológicas
podem ser usadas para
sustentar relações racistas
entre "raça", a biologia e a
doença. Um outro exemplo
na área molecular: citocinas
(proteínas imunológicas
envolvidas em doenças
inflamatórias como a IL-6 e
TNF-alfa) aparecem com
grande variação, mesmo
em indivíduos saudáveis,
mas também são afetadas
por parâmetros como idade, Figura 3 - Técnica de transferência de Southern ou Southern blot. A mistura de
sexo, tabagismo etc. fragmentos de restrição é hibridizada (após a transferência do gel para membrana de hibri-
dização) com uma sonda específica e lida como positivo ou negativo para a hibridização.
Fonte: Lodish et al. (1999).t
 Capítulo 12 YAC, BAC e MAC - Yeast
artificial chromosome (YACs)
ou cromossomo artificial de
levedura. Cada YAC inclui os
três elementos essenciais de
Plasmídios: um cromossomo: telômeros,
centrômeros e origem de

vilões e heróis
replicação. Os YACs podem
ser transferidos para células
de camundongo. BACs e
MACs são os equivalentes
para cromossomos artificiais
de bactéria e de mamíferos,
Os plasmídeos bacterianos são elementos extracromossômicos bem conhe- respectivamente. Veja as
Figuras 4, 5 e 6.
cidos (ver Unidade 3). A conjugação bacteriana envolve a transferência de
Fago λ (lambda) –
plasmídeos entre duas bactérias. São moléculas muito pequenas de dupla fita bacteriófago lambda, o
de DNA, circulares, contendo poucos genes. Possuem origem de replicação qual infecta E. coli. No
e, com isso são replicados junto com a bactéria, porém, independentemente genoma do fago, genes não
essenciais são retirados.
do cromossomo bacteriano. Genes que são carregados por plasmídios geral-
Ao serem retirados, deixam
mente estão envolvidos com a resistência a antibióticos. Espalhando rapida- pontas curtas não coesivas
mente essa resistência, quando estão sob pressão seletiva para esse fator am- que servem para receber
biental, os plasmídeos são chamados de “vilões nosocomiais”. Obviamente, o novo inserto de DNA. O
cromossomo lambda possui
o ser humano é que é culpado da resistência bacteriana, especialmente pelo
pontas curtas unifilamentares
uso indiscriminado e incorreto dos antibióticos. chamadas sítios cos que
Graças a essas características, o plasmídeo foi eleito como ferramenta são necessárias para
biogenética pelos biólogos moleculares. Os plasmídeos, na Engenharia embalar o DNA completo
na cabeça do fago. Assim,
Genética, são chamados de vetores plasmidiais, e comumente são usados são empacotados em capas
para multiplicar ou expressar genes particulares. Para isso, estão disponíveis proteicas e adicionados à
comercialmente, específicos para esses usos. Os sítios de restrição são ca- E. coli. Os fagos injetam seu
racterísticas do vetor, disponibilizados nos plasmídeos pelos próprios fabrican- DNA na célula hospedeira
em que poderá ser replicado.
tes. Inicialmente o plasmídio é cortado com uma enzima de restrição (em um Interessante é que o DNA
sítio de restrição equivalente). O gene a ser inserido é também cortado com a não será empacotado em
mesma enzima de restrição, produzindo em ambos extremidades coesivas e uma capa de fago lambda a
complementares, que permitem que se unam e formem uma molécula só, menos que tenha o tamanho
adequado (40 a 50 Kb).
ainda circular. O gene a ser replicado pode ser qualquer sequência, de qual- Apenas os fragmentos de
quer ser vivo. O plasmídeo recombinante é, então, inserido e naturalmente tamanho certo contendo
absorvido pela bactéria, ocorrendo transformação bacteriana. O processo de os genes essenciais para
transformar bactérias através de um vetor é chamado clonagem molecular. o empacotamento serão
embalados nas capas dos
Cuidado, porque esse processo não tem nenhuma ligação com a clonagem fagos e, assim, compõem
gênica (como o caso da ovelha Dolly) e também não é relacionado ao proces- um sistema “natural” de
so natural de conjugação que ocorre em bactérias. Não existe interesse em seleção dos recombinantes.
transformar as bactérias em si, buscando, por exemplo, transformar bactérias
patogênicas em não patogênicas. Não pense que as bactérias e os plasmíde-
120 CECCATTO, V. M.

os são usados como reagentes biológicos com o objetivo de replicar (ou ex-
pressar) o gene de interesse, sendo possível mantê-lo indefinidamente, dispo-
nível para os trabalhos.
Figura 4 - Estrutura do cromosso-
mo artificial de bactérias – BAC –
apresentando os genes e os locais
de inserção do gene de interesse
(nos sítios de restrição). CMR -
gene marcador para a resistência
ao antibiótico cloranfenicol. orisS,
repE, parA e parB são genes F
para replicação e regulam o nú-
mero de cópias. cosN é o sítio cos
do fago lambda (veja o glossário).
HindIII e BamHI são sítios de res-
trição nos quais é possível inserir
o gene de interesse. Existem dois
promotores: T7 e Sp6. Dois sí-
tios NotI são usados para retirar
posteriormente os fragmentos.
Fonte: Griffiths et al. (1996).

Figura 5 – YAC: Yeast Artificial

Chromosome ou cromossomo artifi-
cial de levedura. O vetor contém uma
origem de replicação (ori) e um gene
que confere resistência à ampicilina
(Ampr), podendo ser propagado em
também em bactérias E. coli. Em adi-
ção, esse vetor contém uma origem
de replicação de levedura (ARS), um
centrômero (CEN), um gene marca-
dor que permite o crescimento em
ausência de uracila (URA3) e dois
telômeros (TEL). O vetor é digerido
com EcoRI e BamHI, produzindo
dois braços que terminam com telô-
meros e sítios EcoRI. Os fragmentos
maiores de DNA preparados com a
digestão com EcoRI são ligados aos
braços do vetor. As células de leve-
dura são, então, transformadas com
os vetores recombinantes, os quais
irão replicá-los da mesma forma que
os cromossomos lineares.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).
 Biologia Molecular 121

O gene lacZ, plasmidial,

é usado como um gene
marcador, ou repórter, em
combinação com o meio de
crescimento de bactérias
(usadas na clonagem
gênica) contendo o açúcar
X-gal, uma galactose. O
gene lacZ codifica para a
enzima β-galactosidase,
que quebra o açúcar X-gal,
produzindo um pigmento
azul. Assim, as bactérias,
com um gene lacZ íntegro,
produzem colônias azuis.
Figura 6 - Dois plasmídeos muito usados na clonagem molecular, apresentando a sua
A estratégia é que o gene
estrutura geral e a sítios de restrição (pBR322 e pUC19). O sucesso da inserção de genes
encontra-se no plasmídeo
em pBR322 é detectável pela inativação de um gene de resistência à tetraciclina (tetR). A usado para inserir o
inserção no plasmídeo pUC18 é detectado pela inativação da β-galactosidase indicado gene de interesse. Este
pela função do gene LacZ, a qual resulta na inabilidade de converter o substrato artificial gene deve ser clonado
X-Gal (veja o glossário) em um corante azul. dentro daquele gene,
Fonte: Griffiths et al. (1996). inativando-o. Assim, as
colônias recombinantes
são brancas, e não azuis,
Para produzir a clonagem molecular, apresentamos a seguir os passos
sendo assim, facilmente
básicos. reconhecidas e postas
1. Isolamento da sequência a ser inserida pelo corte com enzima de restrição. para repicagem. Estas
são os chamados “clones
2. Corte do plasmídeo com a mesma enzima de restrição. bacterianos”, contendo
3. Reação de ligação entre o plasmídeo e a sequência: produção de um os genes de interesse,
produzindo bibliotecas
plasmídio recombinante.
genômicas e outras
4. A DNA ligase é usada para fechar as ligações fosfodiéster. aplicações.
5. Transformação da bactéria com o plasmídeo recombinante.
122 CECCATTO, V. M.

6. Recuperação das bactérias recombinantes.

7. As colônias de bactérias recombinantes são, então, armazenadas e po-
dem ser cultivadas, a qualquer momento, em meio líquido, gerando mi-
lhões de cópias do gene inserido.
8. O plasmídeo recombinante pode então ser retirado por centrifugação do
meio onde cresceram as bactérias, gerando muitas cópias que podem
ser usadas em sequenciamento, produção de transgênicos, vacinas gê-
nicas, transfectados para células eucarióticas etc.
Os vetores de clonagem têm por objetivo a clonagem do gene, sendo,
então, possível armazenar o gene. Em geral, precisam de alguns requerimen-
tos essenciais para funcionar como tal: origem de replicação (para que pos-
sam ser replicados pela bactéria); sítios únicos de restrição (onde será corta-
do para a inserção do gene); genes de seleção (usualmente de resistência a
antibióticos, para proporcionar um meio de se recuperar os recombinantes).
Os vetores de expressão têm por objetivo que a sequência inserida
seja expressa em proteína. Para tanto, é necessário que além dos requeri-
mentos mencionados anteriormente, também estejam presentes sequências
regulatória e promotor, upstream ao gene.

1. Primeira aplicação da técnica: bibliotecas genômicas

e bibliotecas de cDNA
Bancos de sequências
expressas são conhecidos A clivagem de um genoma eucariótico inteiro, com uma enzima de restrição,
como ESTs ou Expressed pode gerar literalmente milhões de fragmentos. Cada fragmento é inserido em
Sequence Tags (ou
um plasmídeo e usado para transformar uma bactéria. As múltiplas colônias
rótulos de sequências
expressas). Consiste na armazenadas formam um conjunto global chamado de “biblioteca genômica”.
identificação (rótulo) de Cada colônia recombinante da biblioteca é chamada “clone”. Cada fragmen-
proteínas expressas em to é sequenciado, resultando no genoma completo do organismo, disponível
um tecido, por exemplo,
para análise. Existem inúmeras bibliotecas genômicas de centenas de orga-
no hepatócito. Esse tipo
de abordagem pode ser nismos, facilitando muito a vida dos pesquisadores, que têm disponível, na
muito útil, através de rede, em portais de dados, as sequências do genoma.
comparação de tecidos.
Pode-se produzir uma biblioteca a partir de outros tipos de fragmentos.
Comparando-se as
sequências expressas, Uma das melhores contribuições da era pós-genômica é buscar a expressão
por exemplo, de um tecido do gene de forma massiva, na forma de um transcriptoma (coleção de trans-
normal com tecido tumoral, critos de mRNAs) ou biblioteca de cDNA (DNA complementar).
é possível encontrar
genes que são expressos 9. Células de um tecido são usadas para a extração do mRNA. Para ga-
diferencialmente (tanto rantir que somente RNAs maduros sejam utilizados, lança-se mão de
quantitativa quanto colunas contendo caudas expostas de oligo-dTs. O RNAm maduro eu-
qualitativamente) e aí cariótico possui cauda 5'poli A, sendo então capturado pela coluna.
traçar estratégias para
uma terapêutica. 10. O RNAm é eluído da coluna, estando pronto para ser utilizado.
 Biologia Molecular 123

11. Inicialmente um primer de oligo dT liga-se à cauda poli A, possibilitando Eletroporação: a célula
que uma polimerase adicione nucleotídeos. No caso essa polimerase é passa por um pulso breve
de alta voltagem, o que a
a transcriptase reversa, capaz de usar um molde de RNAm para criar torna transitoriamente mais
uma fita híbrida RNAm/DNA. permeável à moléculas de
12. O RNAm é degradado com uma solução alcalina; deixa-se uma parte DNA no meio extracelular,
aumentando a frequência de
final que se autocomplementa, resultando num terminal em alça. células competentes.
13. A DNA polimerase finaliza produzindo uma fita nova DNA/DNA. Microinjeção de DNA:
uso de uma agulha muito
14. A alça é degradada com uma nuclease. fina, com a qual um hábil
15. O resultado é uma cópia de cDNA complementar ao mRNA inicial. manipulador injeta DNA
nas células uma a uma.
16. Quando todos os fragmentos estiverem complementados, entra em ação
O método é muito eficaz,
a clonagem, produzindo uma biblioteca com os fragmentos. porém trabalhoso e rende
17. A biblioteca pode ser sequenciada, apresentando uma coleção de se- poucas células competentes
por vez.
quências expressas do DNA naquele tecido.
Vetores virais: vírus
introduzem seu material
genético nas células.
2. Segunda aplicação: transgenia Um retrovírus introduz
A introdução de DNA exógeno via vetor de clonagem ou expressão, numa seu RNA nas células
hospedeiras, onde a sua
célula eucariótica animal ou vegetal é o primeiro passo para a produção de própria transcriptase reversa
animais e plantas transgênicos (Figura 7). O organismo transgênico é um or- converte seu RNA em DNA
ganismo permanentemente alterado geneticamente através de tecnologia do e então este é integrado
DNA recombinante. Entretanto, não é tão simples assim obter a inserção defi- aos cromossomos do
hospedeiro. Na técnica,
nitiva de um gene em um cromossomo da célula hospedeira. É desejável que genes virais são trocados por
esse gene esteja presente nas células filhas. Portanto, o início da produção DNA de interesse. O método
de um transgênico envolve a inserção do gene de interesse no vetor, poste- possui alta infetividade, e é
riormente, a transfecção do gene na célula, a seleção da célula recombinan- mais trabalhoso.
Terapia gênica: terapia pela
te através de genes de seleção ou genes marcadores ou repórter. O gene qual se busca a expressão
inserido deve, então, ser transcrito, traduzido pelos ribossomos e por outras de genes induzida em seres
partículas, produzindo uma proteína perfeita, no tecido certo e no tempo certo humanos ou em animais de
do desenvolvimento do organismo para que possa ser útil ao metabolismo. experimentação. Busca-se
a introdução eficiente de
A célula transfectada deve produzir um organismo completo, transgênico e, DNA num número suficiente
sabemos, quase sempre isso não é possível. de células somáticas (é
proibido o uso de células
germinativas), fazendo com
que estas expressem uma
proteína. Esta pode ser
uma proteína em déficit no
organismo ou que possa
atacar células cancerosas.
124 CECCATTO, V. M.

Figura 7 - Modo de produção de plantas transgênicas. (a) um vetor intermediário é

usado para clonar o segmento de interesse. O vetor intermediário é recombinado com
um plasmídeo Ti desarmado, para gerar uma estrutura cointerada contendo o inserto
de interesse e um gene de seleção marcador de recombinantes que, nesse caso, é
um gene de resistência à kanamicina, entre as bordas do T-DNA. (b) protocolo de
geração da planta transgênica através da transformação com T-DNA.
Fonte: Griffiths et al. (1996).

Plantas são mais hábeis para transgenia, pois de qualquer célula ve-
getal, em tese, podemos produzir um organismo completo (chamada totipo-
tência vegetal). O mesmo benefício não se pode fazer o mesmo com célula
animal. As células animais são pluripotentes, de uma célula embrionária. Em
tese, seria possível derivar qualquer tecido (veja a polêmica do uso de células-
 Biologia Molecular 125

-tronco ou embrionárias). Para contornar esse “problema” várias técnicas são

usadas para produzir animais-modelo transgênicos, especialmente ratos e
camundongos com transgenia para várias doenças e que, assim, tornam-se
disponíveis para testes diagnóstico e novas terapias.
A utilização de células animais para a inserção de material genético
exógeno envolve centenas de técnicas e protocolos experimentais. Esses ex-
perimentos também permitem compreender como funciona o genoma animal
e gera também informações para a clonagem animal. Métodos mais usuais
para inserção de genes nos cromossomos animais envolvem, por exemplo, a
eletroporação, microinjeção de DNA, além de vetores virais. Esses veto-
res também vêm sendo estudados para uso em terapia gênica.
Os animais transgênicos são definidos de várias formas. Para a
Federação Européia das Associações de Ciência em Animais de Laboratório,
transgênico é "um animal que possui seu genoma modificado artificialmente
pelo homem, quer por meio da introdução, quer da alteração ou da inativação
de um gene - uma sequência definida de DNA. Esse processo deve culmi-
nar na alteração da informação genética contida em todas as células desse
animal, até mesmo nas células germinativas (óvulos e espermatozóides), fa-
zendo com que essa modificação seja transmitida aos descendentes". O uso
de ratos e camundongos transgênicos, modelos para várias patologias vêm
sendo muito expandido nos laboratórios experimentais. Um dos métodos mais
utilizados é a microinjeção de DNA no núcleo de ovos fertilizados, esperando-
-se que ocorra uma integração cromossômica adequada. Os ovos são, então,
introduzidos na fêmea onde se induz uma pré-gravidez, com uso de machos
estéreis. Faz-se, então, testes na progênie resultante para saber quais ani-
mais estão efetivamente expressando o gene. Os animais então são cruzados
entre si para obtenção de homozigose para o gene inserido, mantendo-se
então essa nova variedade transgênica pelo mesmo princípio do endocruza-
mento. Os genes inseridos podem ser induzidos por algum componente da
dieta, injeção de um fármaco ou xenobiótico.
Nas plantas, um aliado essencial tem se mostrado imprescindível na
transformação das células vegetais. Uma bactéria do solo, Agrobacterium tu-
mefaciens, invade células vegetais em locais feridos, produzindo um tumor,
conhecido popularmente como “galha”. O plasmídeo típico de A. tumefaciens
é um grande plasmídio chamado Ti. Quando a bactéria contacta uma parte
da célula vegetal, um segmento chamado DNA T é transferido do plasmídeo
Ti para o vegetal. O DNA T, então, fica incorporado ao cromossomo vegetal.
Esse é um raro exemplo de engenharia genética natural.
 Capítulo 13
Reação em cadeia da
polimerase: a revolução
dentro da revolução
Poucas vezes a tecnologia foi tão importante para o avanço da ciência como o que
Primers degenerados:
são misturas de primers
aconteceu em 1983, com o aparecimento da reação em cadeia da polimerase.
semelhantes, mas não Uma técnica única, de extrema sensibilidade, facilidade de manuseio, simplicida-
iguais. O desenho desses de, rapidez e custo relativamente baixo, com aplicações monumentais (Figura 8).
primers advém de uma
proteína conhecida, e não
de um gene conhecido.
Como vários códons podem
codificar um aminoácido,
muitas vezes é difícil deduzir
qual dos códons possíveis
é utilizado naquele gene em
particular. Um exemplo: se
o aminoácido é isoleucina,
podemos ter um 5'- ATH – 3',
onde A é adenina, T é timina
e H é adenina, timina ou
citosina. Veja Quadro 13.1.

Paleogenética: relação
entre paleontologia e
genética para estudo de
múmias, fósseis, roupas, Figura 8 - Amplificação por PCR - A região do DNA a ser amplificada é flanqueada por duas
materiais preservados
sequências usadas para o início da síntese. A dupla fita é separada nas duas fitas simples
antigos, ovos fossilizados,
pelo calor. Os primers se ligam (oligonucleotídeos de 15 a 20 bases) de cada lado da se-
coprólitos etc. Utiliza
sequências marcadoras quência alvo. A DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq polimerase) é usada para
nucleares e mitocondriais e sintetizar novo DNA a partir dos primers, formando duas novas moléculas. O processo pode
primers degenerados para ser repetido inúmeras vezes, resultando na replicação controlada da sequência alvo.
estudos genéticos. Fonte: Cooper e Hausman (2009).
 Biologia Molecular 127

Resumo do protocolo: DNA barcode: ou “código

de barras” - metáfora para
• Abertura da fita de DNA que servirá de molde por desnaturação térmica código identificador baseado
(etapa com duração entre 30s e 1min à temperatura de 92 - 96ºC); em DNA, como um rótulo
que seria dado a todos os
• Pareamento de oligonucleotídeos sintéticos, primers que funcionam como organismos baseado numa
os iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA sequência de cerca de 648
molde, à região complementar da fita que sofrerá a duplicação (duração nucleotídeos na maioria dos
de 30s a 1min à temperatura entre 58 e 65ºC); grupos. O DNA barcode seria
diferente entre indivíduos da
• Polimerização, através de uma enzima polimerase, das novas fitas de mesma espécie, porém num
DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando cada um dos quatro grau menor. O objetivo seria
o estudo e a preservação
dNTP como substrato da reação de polimerização (duração entre 45 se-
da biodiversidade, devido
gundos e 1 minuto, a 72ºC). Cada ciclo é repetido em torno de 60 vezes a vantagens como:
e promove a amplificação da região alvo determinada conforme afinidade facilidade na identificação
das sequências iniciadoras (primers). Assim, os primers reconhecem, por da vida, pois independe de
estágios vitais, distinção
complementaridade, o local de início do local a ser amplificado, efetua a
de espécies parecidas
ligação e sinaliza para a polimerase o início da sequência a ser replicada. ou quase indistinguíveis,
democratização do acesso,
O grande problema inicial foi a desnaturação seguida da enzima po-
entre outros. Veja o projeto
limerase, que, obtida de E. coli, não suportava a temperatura para abertura “Consortium for the barcode
das fitas de ácidos nucleicos. Assim, a cada ciclo, uma nova quantidade de of life (CBOL)” - http://www.
enzima deveria ser adicionada. barcoding.si.edu/
Shotgun: estratégia usada
Em 1988, contudo, Randall Saiki e colaboradores substituíram a poli- para cortar um genoma em
merase de E. coli pela já conhecida Taq polimerase, polimerase da bactéria milhares de pedaços usando
Thermus aquaticus, que vive em águas quentes de gêiseres e vulcões sub- uma, duas ou mais enzimas
de restrição, gerando
mersos e possui um ponto de crescimento ótimo entre 70 e 75ºC.
coleções de pedaços que
Então, qual o contexto de utilização da clonagem molecular e da PCR? se justapõem. Assim, após
Existe inicialmente um contexto histórico. O DNA recombinante, no sentido o sequenciamento, são
montadas em sequências
de criação de novas sequências de DNA, surgiu com a enzima de restrição.
consenso, cobrindo todo
Trata-se de obter a primeira resposta técnica, inserir o gene em vetores, fazer o genoma com pedaços
a alteração de um genoma bacteriano. A clonagem molecular permite manter justapostos. As sequências
sequências de DNA, de diferentes tamanhos, por tempo indeterminado, intac- de leitura superpostas são
chamadas de sequências
tas, podendo ser recuperadas e multiplicadas a qualquer momento, bastando
contigs (contíguas, ou que
fazer o repique dessas bactérias, ou leveduras, recombinantes, após anos ou se tocam). Espaços não
décadas, guardadas em freezer (Veja também a chamada estratégia shot- sequenciados de genoma,
gun de genoma) A clonagem molecular é adequada à produção de projeto que porventura ocorram após
a junção dos contigs (feito
genoma. A PCR, por sua vez, amplifica o gene apenas. O produto da PCR é
através de bioinformática)
a sequência amplificada, utilizável em dezenas de projetos, mas só pode ser são então completados
guardada por alguns dias, com perda de material. A fundamental vantagem posteriormente, usando
do PCR é que não necessita de tantos passos quanto a clonagem, o único primers específicos ou
mesmo outras abordagens.
segmento que será amplificado é aquele entre dois primers, o que acarreta
especificidade. Em tese, basta uma cópia do template (molde de DNA) para
128 CECCATTO, V. M.

que a amplificação ocorra, sendo portanto, é muito sensível. Especificidade,

PCR Hot Start: técnica de sensibilidade e rapidez no trabalho traduzem-se em praticidade na utilização di-
PCR utilizada para diminuir
a possibilidade de formar
ária e em aplicações variadas. Um crime pode ser investigado se houver uma
produtos inespecíficos, molécula de evidência, como poucas células foliculares de um único fio de cabelo
o que pode ocorrer do suspeito ou células sob as unhas da vítima. Um conceito relativamente difícil
em uma PCR comum. de compreender é que a PCR em si não apresenta a identificação do suspeito.
Certas combinações de
primers e DNA-molde.
Ninguém tem seu nome tatuado na molécula. É preciso um conhecimento a priori
Na reação tradicional para a produção e análise do PCR.
produtos inespecíficos No caso anterior, a eletroforese do fingerprint (impressão digital) de DNA
podem ocorrer devido ao
anelamento inespecífico
fornece algo como um código de barras (barcode). Esse código fornece um per-
dos primers (favorecido fil que necessita de base comparativa, como a pré-existência de um banco de
por baixa temperatura) em perfis de DNA de pessoas condenadas por crimes sexuais, por exemplo. Na falta
sequências de fita simples ou na deficiência do mesmo, suspeitos do crime (ou num outro caso, supostos
presentes na reação
como DNA parcialmente
parentes de uma vítima não identificada) devem contribuir com seu DNA para
degradado. Para evitar fornecer essa base de comparação. Por isso, o trabalho molecular nunca exclui
isso, a técnica busca evitar a investigação policial. Caso se queira produzir uma sequência específica, por
o contato da polimerase exemplo, o gene da insulina, torna-se essencial o conhecimento a priori do gene
na primeira etapa de
desnaturação
da insulina, facilmente obtível através dos bancos de dados disponíveis na rede
PCR Touch-down: nesta mundial de computadores ou mesmo na própria literatura. No PCR específico,
técnica, o termociclador é temos que saber que sequência específica queremos amplificar e desenhar os
programado para diminuir primers específicos para ela. No PCR inespecífico, primers ditos degenerados
de forma sequencial a
temperatura de anelamento
(Quadro 13.1) são usados para amplificar qualquer sequência.
Quadro 13.1
dos primers. Nos ciclos
iniciais da PCR (nos Código IUPAC para desenho de primers degenerados
primeiros dez ciclos) até Símbolo Descrição Bases representadas
determinada temperatura,
a qual é supostamente a A Adenina A
ideal, é mantida nos ciclos T Timina C
restantes. A temperatura C Citosina T
de anelamento mais alta G Guanina G
(maior estringência) evita
U Uracila U
a formação de produtos
inespecíficos, permitindo W Weak A T
que o produto esperado S Strong C T
seja o predominante. M Amino A
K Keto T G
R Purina A G
Y Pirimidina C T
B Menos A C T G
D Menos C A T G
H Menos G A C G
V Menos T A C T
N Qualquer nucleotídeo A C T G
 Biologia Molecular 129

1. Aplicação da técnica: fingerprint de DNA

Quem nunca ouviu falar no “teste do DNA”? Um recurso intensamente explorado
hoje em dia pela mídia, o teste do DNA na verdade é chamado tecnicamente de
fingerprint (impressão digital) e permite uma enorme gama de aplicações forenses
e criminais. Investigações civis também são beneficiadas, como a paternidade, o
reconhecimento de herdeiros, o reconhecimento de restos mortais, os estudos
de cadáveres mumificados (paleogenética), os estudos históricos e ecológicos.
A técnica do fingerprint é baseada em polimorfismo de marcadores mo-
leculares. O marcador molecular para a execução da técnica de fingerprint
são os VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats ou número variável de
repetições em tandem) (Figura 9). PCR multiplex: é uma
reação em que várias
regiões diferentes de
DNA são amplificadas ao
mesmo tempo e no mesmo
tubo devido à utilização
simultânea de vários pares
de primers específicos para
vários loci. Permite maior
rapidez na obtenção do
resultado, com economia de
reagentes.
Nested PCR:nesta técnica,
o template é produto de
amplificação anterior numa
segunda amplificação, com
primers que se anelam
internamente ao produto da
primeira amplificação.
RT-PCR: Reverse
Figura 9 - Utilizando o fingerprint de DNA como marcadores moleculares, em mapea- transcriptase – PCR. Numa
mento por eletroforese. Alelos de dominância podem ser localizados por análise de ligação. etapa anterior, o template de
Fonte: Griffiths et al. (1999). DNA é produzido por meio da
transcrição reversa aplicada
Estas VNTRs são sequências curtas, que, como qualquer sequência, a uma fita de RNAm obtida
de um tecido (veja o item
são herdáveis. Para identificar estes VNTRs, torna-se possível usar PCR e/ou Bibliotecas – Bibliotecas de
sondas específicas para estes. O passo a passo para a técnica do fingerprint cDNA). Esse trabalho pode
é visto a seguir: ser feito num termociclador
comum ou no real time,
1. O DNA é extraído do doador;
que é um termociclador
2. O DNA é cortado com uma ou mais enzimas de restrição; quantitativo, mais adequado
a esse tipo de trabalho, pois
3. Os fragmentos são separados por eletroforese;
o interesse é quantificar a
4. Faz-se a transferência de Southern; expressão de genes.
5. Utilizando várias sondas específicas de VNTRs, procede-se à incubação
com elas;
130 CECCATTO, V. M.

Extração do DNA 6. As sondas hibridizam-se com DNA da membrana;

O protocolo básico de extração
de DNA exige que inicialmente
7. Faz então a autoradiografia ou faz-se a revelação do reagente usado na
as células sejam rompidas para marcação da sonda;
que os constituintes celulares 8. Obtém-se então um padrão de bandas, comparável com outros padrões.
sejam liberados. Para tecidos
vegetais utilizam-se brotos ou Ou
folhas jovens e, para tecidos 9. O DNA é extraído do doador;
animais, sangue, fígado ou
tecidos macios. Pode-se 10. Uma alíquota é retirada a submetida a PCR com primers específicos
congelar o tecido previamente e para os VNTRs;
depois macerá-lo em almofariz e
11. O produto do PCR passa por eletroforese;
pilão. Em pequena escala, pode-
se usar um bastão de vidro e 12. Faz-se revelação comum com brometo de etídeo;
um tubo de microcentrifugação,
13. Obtém-se então um padrão de bandas, comparável com outros padrões;
sem o uso de nitrogênio
líquido. Utilizam-se detergentes 14. O DNA pode ser sequenciado (Figura 10).
como o SDS (dodecil sulfato
de sódio) ou CTAB (brometo
de cetiltrimetilamônio), para
rompimento das membranas.
O tampão de extração possui
pH ao redor de 8,0, já que
as DNAses (degradadoras
do DNA) possuem atividade
ótima ao redor de 7,0. O
uso de EDTA (ácido etileno
diamino tetracético) no
tampão de extração inibe a
ação de DNAses que têm
como cofatores metais, já
que o EDTA é um agente
quelante. A separação do
DNA das proteínas é um
passo importante, através de
várias extrações com fenol e/
ou clorofórmio, os quais são
desnaturantes de proteínas,
tornando-as solúveis em fase
aquosa. Os ácidos nucleicos se
encontram nessa fase, então
as proteínas ficam floculadas Figura 10 - Sequenciamento de DNA pelo método de Sanger. Dideoxinucleotídeos,
e formam uma fase separada os quais são desprovidos de grupos OH nos carbonos 3´e 2, são usados para ter-
na solução. Os polissacarídeos minar a síntese de DNA em bases específicas. Essas moléculas são incorporadas
também devem ser separados normalmente pelas fitas em crescimento. No momento que os dideoxinucleotídeos
dos ácidos nucléicos, pois são incorporados, encerra-se a reação de PCR. Quatro reações separadas são feitas,
tornam a solução viscosa, o que cada um contendo um dos dideoxinucleotídeos misturados com os desoxinucleotíde-
dificulta a migração dos ácidos os normais. Assim, cada reação produz somente fragmentos finalizados com o seu
nucleicos em gel de eletroforese.
didesoxi específico. Os produtos são separados por eletroforese, e a leitura, então,
O detergente também é usado
pode ser feita, de forma a produzir a sequência de DNA.
para essa função.
Fonte: Cooper e Hausman (2009).
 Biologia Molecular 131

CTNBio
Comissão Técnica
Nacional de Biossegurança
Textos complementares foi criada através da
lei nº 11.105, de 24 de
A Lei de Biosegurança - Lei nº 11.105, de 24 de março de 2005. março de 2005 e tem
a finalidade é prestar
“Art. 3o Para os efeitos desta Lei, considera-se: apoio técnico consultivo
I – organismo: toda entidade biológica capaz de reproduzir ou transferir material e assessoramento ao
genético, inclusive vírus e outras classes que venham a ser conhecidas; Governo Federal na
II – ácido desoxirribonucléico - ADN, ácido ribonucléico - ARN: material genético formulação, atualização e
que contém informações determinantes dos caracteres hereditários transmissíveis implementação da Política
à descendência; Nacional de Biossegurança
III – moléculas de ADN/ARN recombinante: as moléculas manipuladas fora das cé- relativa a OGM, bem
lulas vivas mediante a modificação de segmentos de ADN/ARN natural ou sintético como no estabelecimento
e que possam multiplicar-se em uma célula viva, ou ainda as moléculas de ADN/ de normas técnicas de
ARN resultantes dessa multiplicação; consideram-se também os segmentos de segurança e pareceres
ADN/ARN sintéticos equivalentes aos de ADN/ARN natural; técnicos referentes
IV – engenharia genética: atividade de produção e manipulação de moléculas de à proteção da saúde
ADN/ARN recombinante; humana, dos organismos
V – organismo geneticamente modificado - OGM: organismo cujo material genéti- vivos e do meio ambiente,
co – ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer técnica de engenharia genética; para atividades que
VI – derivado de OGM: produto obtido de OGM e que não possua capacidade au- envolvam a construção,
tônoma de replicação ou que não contenha forma viável de OGM; experimentação, cultivo,
VII – célula germinal humana: célula-mãe responsável pela formação de gametas manipulação, transporte,
presentes nas glândulas sexuais femininas e masculinas e suas descendentes dire- comercialização, consumo,
tas em qualquer grau de ploidia; armazenamento, liberação
VIII – clonagem: processo de reprodução assexuada, produzida artificialmente, ba- e descarte de OGM e
seada em um único patrimônio genético, com ou sem utilização de técnicas de derivados. Fonte: http://
engenharia genética; www.ctnbio.gov.br/
IX – clonagem para fins reprodutivos: clonagem com a finalidade de obtenção de
um indivíduo;
X – clonagem terapêutica: clonagem com a finalidade de produção de células-tron-
co embrionárias para utilização terapêutica;
XI – células-tronco embrionárias: células de embrião que apresentam a capacidade
de se transformar em células de qualquer tecido de um organismo.
§ 1o Não se inclui na categoria de OGM o resultante de técnicas que impliquem
a introdução direta, num organismo, de material hereditário, desde que não en-
volvam a utilização de moléculas de ADN/ARN recombinante ou OGM, inclusive
fecundação in vitro, conjugação, transdução, transformação, indução poliplóide e
qualquer outro processo natural.
§ 2o Não se inclui na categoria de derivado de OGM a substância pura, quimi-
camente definida, obtida por meio de processos biológicos e que não contenha
OGM, proteína heteróloga ou ADN recombinante.
Art. 4o Esta Lei não se aplica quando a modificação genética for obtida por meio
das seguintes técnicas, desde que não impliquem a utilização de OGM como re-
ceptor ou doador:
I – mutagênese;
II – formação e utilização de células somáticas de hibridoma animal;
III – fusão celular, inclusive a de protoplasma, de células vegetais, que possa ser
produzida mediante métodos tradicionais de cultivo;
132 CECCATTO, V. M.

IV – autoclonagem de organismos não-patogênicos que se processe de maneira

natural.
Art. 5o É permitida, para fins de pesquisa e terapia, a utilização de células-tronco
embrionárias obtidas de embriões humanos produzidos por fertilização in vitro e
não utilizados no respectivo procedimento, atendidas as seguintes condições:
I – sejam embriões inviáveis; ou
II – sejam embriões congelados há 3 (três) anos ou mais, na data da publicação
desta Lei, ou que, já congelados na data da publicação desta Lei, depois de com-
pletarem 3 (três) anos, contados a partir da data de congelamento.
§ 1o Em qualquer caso, é necessário o consentimento dos genitores.
§ 2o Instituições de pesquisa e serviços de saúde que realizem pesquisa ou tera-
pia com células-tronco embrionárias humanas deverão submeter seus projetos à
apreciação e aprovação dos respectivos comitês de ética em pesquisa.
§ 3o É vedada a comercialização do material biológico a que se refere este artigo e
sua prática implica o crime tipificado no art. 15 da Lei no 9.434, de 4 de fevereiro
de 1997.
Art. 6o Fica proibido:
I – implementação de projeto relativo a OGM sem a manutenção de registro de seu
acompanhamento individual;
II – engenharia genética em organismo vivo ou o manejo in vitro de ADN/ARN na-
tural ou recombinante, realizado em desacordo com as normas previstas nesta Lei;
III – engenharia genética em célula germinal humana, zigoto humano e embrião
humano;
IV – clonagem humana;
V – destruição ou descarte no meio ambiente de OGM e seus derivados em de-
sacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio, pelos órgãos e entidades de
registro e fiscalização, referidos no art. 16 desta Lei, e as constantes desta Lei e de
sua regulamentação;
VI – liberação no meio ambiente de OGM ou seus derivados, no âmbito de ati-
vidades de pesquisa, sem a decisão técnica favorável da CTNBio e, nos casos de
liberação comercial, sem o parecer técnico favorável da CTNBio, ou sem o licencia-
mento do órgão ou entidade ambiental responsável, quando a CTNBio considerar
a atividade como potencialmente causadora de degradação ambiental, ou sem a
aprovação do Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS, quando o processo
tenha sido por ele avocado, na forma desta Lei e de sua regulamentação;
VII – a utilização, a comercialização, o registro, o patenteamento e o licenciamento
de tecnologias genéticas de restrição do uso.
Parágrafo único. Para os efeitos desta Lei, entende-se por tecnologias genéti-
cas de restrição do uso qualquer processo de intervenção humana para geração
ou multiplicação de plantas geneticamente modificadas para produzir estruturas
reprodutivas estéreis, bem como qualquer forma de manipulação genética que
vise à ativação ou desativação de genes relacionados à fertilidade das plantas por
indutores químicos externos”.
Fonte: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-2006/2005/lei/L11105.htm

Knock-out, genética reversa e RNAi

A perda de função ou knock-out é um tipo de experimento utilizado dentre as estra-
tégias para se conhecer a função de um determinado gene. Busca-se impedir que o
gene produza a proteína de forma que se possa analisar as consequências ou o fenóti-
 Biologia Molecular 133

po decorrente desta inibição em um organismo, parte dele, ou em células cultivadas.

Deriva-se então, por via indireta, em quais vias o produto deste gene está envolvido,
vias de sinalizações, metabolismos, possíveis regulações, etc. Da mesma forma, este
tipo de abordagem, da proteína para o gene é chamada de “genética reversa”, dife-
rentemente da abordagem clássica (direta).
Uma das técnicas mais usadas para os estudos de genética reversa é a de knock out
de genes específicos. Com modificações apropriadas, o knock out pode ser utilizado
para identificar funções tecido-específicas de um determinado gene. Este método é
difícil, laborioso, especializado e custoso. Entretanto é possível fazer um semi knock
out de genes em experimentos de genética reversa, impedindo que ocorra a tradu-
ção do RNA mensageiro (mRNA). Os métodos de silenciamento gênico baseados em
mRNA poderão ser utilizados no tratamento de doenças causadas pela expressão
de genes deletérios. É possível utilizar agentes antisense. Esta estratégia consiste
em introduzir um oligonucleotídeo complementar ao mRNA-alvo dentro de uma
determinada célula, por exemplo. O híbrido DNA-RNA formado pode bloquear a li-
gação do mRNA ao ribossomo ou ativar a degradação do mRNA-alvo por uma RNase
H. Apesar da simplicidade conceitual, as tecnologias antisense são, de certa forma,
limitadas tanto pela ocorrência de inibição inespecífica de outros genes quanto pela
dificuldade em se introduzir o agente antisense produzido.
O objetivo de se usar RNAi é silenciar de forma específica um determinado gene.
Portanto, deve-se selecionar cuidadosamente uma região do mRNA alvo e evitar que
a região escolhida tenha similaridade com regiões pertencentes a outros RNAs não
relacionados. Aconselha-se fazer uma busca nos bancos de dados nos quais estão
depositadas as seqüências do genoma para verificar se a seqüência escolhida é espe-
cífica. Ao escolher um pequeno fragmento de RNA, recomenda-se evitar as primeiras
75 bases após o códon de início da transcrição, sequências com mais de 50% de G +
C, bem como, as regiões 5’ e 3’ não traduzidas, pois assume-se que proteínas regula-
tórias se liguem a essas regiões. Estudos recentes mostram que critérios bioquímicos,
termodinâmicos e estruturais devem ser considerados quando se “desenham” siR-
NAs. Sugere-se que a extremidade 5’ da fita antisense seja rica em AU, o que confere
uma baixa estabilidade a essa extremidade, aumentando a probabilidade de que essa
fita seja incorporada ao complexo RISC. Por outro lado, aconselha-se que a extremi-
dade 5’ da fita sense tenha um G ou C, de forma que apresente maior estabilidade in-
terna A utilização de diferentes dsRNA pequenos para um mesmo mRNA pode gerar
resultados mais ou menos eficazes, dependendo da estrutura secundária da molécula
alvo. Um siRNA é considerado eficiente quando provoca uma redução de pelo menos
90% no nível protéico.
Fonte: Barbosa e Lin (2004).

Síntese da Parte
O DNA recombinante é feito com o uso de enzimas de restrição. Essas en-
zimas cortam o DNA em locais específicos. A transformação de bactérias,
animais e plantas é possível com o uso das enzimas de restrição e de vetores
que fazem a ponte entre o inserto e o organismo a ser transformado ou trans-
134 CECCATTO, V. M.

fectado. A reação da PCR possibilitou a ampliação controlada de sequências,

permitindo novas aplicações, como a produção de bibliotecas, fingerprint etc.

Atividades de avaliação
1. Procure, leia e comente a lei de patentes e a Lei de Biosegurança. O que
elas determinam e o que têm em comum?
2. Por que os cruzamentos comuns efetuados com variedades de plantas
e animais não são considerados DNA recombinante? As raças animais
e as variedades comuns de plantas (especialmente de importância eco-
nômica, como milho, feijão, arroz) que são lançadas pelas empresas
agropecuárias ou institutos agrários têm que passar pelas avaliações do
CTNBio e pelas questões da Lei de Biosegurança? Avalie.

3. No fingerprint de DNA acima, 1, 2, 3 e 4 são filhos do casal. Entretanto,

um deles é filho (a) de um primeiro casamento (da mãe ou do pai) e um
dos filhos (as) é adotivo (a). Identifique os dois casos mencionados e o
Justifique essas afirmações.
4. O mapeamento de restrição de um trecho linear de DNA revela os se-
guintes sítios de restrição para a enzima EcoRI. Os fragmentos resul-
tantes são separados por eletroforese em gel, e o gel é corado. No espa-
ço para eletroforese abaixo, desenhe as bandas correspondentes: (Kb =
Kilobases) a cada poço.

a) Esse pedaço de DNA é digerido por EcoRI.

b) Se ocorrer uma mutação que altera o sítio 1 de corte da EcoRI.
 Biologia Molecular 135

c) Se ocorrer uma mutação que altera os sítios 1 e 2 de EcoRI.

d) Se ocorrer uma inserção de 1000 pb entre os dois sítios de restrição.
e) Se ocorrer uma deleção de 500 entre os dois sítios de restrição.

5. A partir da sequência polipeptídica a seguir, desenhe um primer de-

generado, usando o código genético e o Quadro 13.1, de acordo com
o exemplo:
Aminoá-
Asn Tir Tre Tri Lis Tre Val Ala Asn Trp Arg
cido
AAC UAC ACA
AAU UAU ACC
Código ACG
genético ACU

Primer AAS TAS ACN

Arg (Arginina); Asn (Asparagina); Trp (Triptofano); Tre (Treonina); Ala (Alanina); Gli
(Glicina); Met (Metionina); Val (Valina); Leu (Leucina); Tir (Tirosina).

6. Verificação de enzimas de restrição e como cortar uma sequência: http://

rebase.neb.com/rebase/rebase.html
Clique em “Rebase Tools”
Cique em "Theoretical digests with all REBASE prototypes..."
(Digestão teórica com todos os prototipos encontrados na Rebase)
Digite ou cole uma sequência de DNA ou de proteínas no campo
Clique em Submit (Submeter)
Verifique os resultados
136 CECCATTO, V. M.

Leitura
• ANDRADE, A.; PINTO, S. C.; OLIVEIRA, R. S. (Orgs.) Animais de
laboratório: criação e experimentação. 1. ed. Rio de Janeiro: FIO-
CRUZ, 2002. 388 p.
• CUMMINGS, K. Concepts of genetics. Prentice Hall: New Jersey,
1997. 703 p.
• DUPAS, G. Ética e poder na sociedade da informação. 2. ed. São
Paulo: Unesp, 2004. 135 p.
• GRIFFITHS, A. J.F.; MILLER, J. H.; SUZUKI, D. T.; LEWONTIN, R.
C.; GELBART, W. M. An introduction to genetic analysis. W.H.
New York: Freeman and Company, 1996. 915 p.
• ROTHWELL, N. V. Understanding genetics: a molecular approach.
New York: Wiley-Liss, 1993. 656 p.
Sites
• Livros disponíveis na web (on-line): Bookshelf no site Entrez PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/):
Introduction to genetic analysis. 7th ed. Griffiths, Anthony J.F.; Gel-
bart, William M.; Miller, Jeffrey H.; Lewontin, Richard C. New York: W
H Freeman & Co; c1999.
Modern genetic analysis. Griffiths, Anthony J.F.; Gelbart, William M.;
Miller, Jeffrey H.; Lewontin, Richard C. New York: W H Freeman &
Co; c1999.
Developmental biology. 6th ed. Gilbert, Scott F. Sunderland, Massa-
chusetts: Sinauer Associates, Inc.; c2000. ISBN 0 87893 243 7.
Cursos de Genética
• a) Primer on Molecular Genetics (http://www.ornl.gov/sci/techre-
sources/Human_Genome/publicat/primer/toc.html)
• b) Intermediate Genetics (http://www.ndsu.nodak.edu/instruct/
mcclean/plsc431/)
• c) Plant Molecular Genetics (http://www.ndsu.nodak.edu/instruct/
mcclean/plsc731/index.htm)
 Biologia Molecular 137

• d) Genetics, Emporia State University (http://www.emporia.edu/

biosci/genetics/genetics.htm)
Banco de dados (genomas, sequências de DNA, proteínas, artigos,
material didático, etc.), Periódicos On-Line, etc.
• Entrez PubMed: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/
• The WWW Virtual Library: http://vlib.org/Overview.html
• Links: O mundo da Genética: http://www.ornl.gov/TechResources/
Human_Genome/links.html
• Projeto Genoma Humano: http://www.ornl.gov/hgmis/
Gregor Mendel
• MendelWeb: http://www.mendelweb.org/
• Trabalhos de Mendel: http://www.esp.org/foundations/genetics/
classical/gm-65.pdf
Charles Darwin
• Trabalhos de CHarles Darwin: http://pages.britishlibrary.net/char-
les.darwin/
Filmes
• E a banda continua a tocar (Dir. Roger Spottiswoode, EUA, 1993) -
descoberta da Aids.
• Nas montanhas dos gorilas (Dir. Michael Apted, EUA, 1988) - antro-
pologia e meio ambiente.
• A ilha das flores (Dir. Jorge Furtado, Brasil, 1989) - crítica ao consu-
mismo.

Referências
BARBOSA, A. S.; LIN, C, J. Alternativamente ao knock-out de genes em ex-
perimentos de genética reversa, podem ser adotadas estratégias que impe-
çam a tradução do RNA mensageiro (mRNA). Arquivos Brasileiros de En-
docrinologia & Metabologia, São Paulo, v. 48, n. 5, 2004.
COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. The cell: a molecular approach. 5. ed.
Sunderland: Sinauer Associates, 2009. 771 p.
GRIFFITHS, A. J. F.; GELBART, W. M.; MILLER, J. H.; LEWONTIN, R. C. Mo-
dern genetic analysis. New York: W. H. Freeman and Company, 1999. 589 p.
138 CECCATTO, V. M.

GRIFFITHS, A. J. F.; MILLER, J. H.; SUZUKI, D. T.; LEWONTIN, R. C.; GEL-

BART, W. M. An introduction to genetic analysis. New York: W. H. Freeman
and Company, 1996. 915 p.
LODISH, H.; BERK, A.; ZIPURSKY, S. L.; MATSUDAIRA, P.; BALTIMORE, D.;
DARNELL, J. E. Molecular Cell Biology. 4. ed. New York: W. H. Freeman and
Company, 1999. 1.084 p.
SILVA-VALENZUELA, M. G.; ALMEIDA, F. C. S.; MATIZONKAS-ANTONIO, L.
F.; LIBÓRIO, T. N.; ACQUAFREDA, T.; CAZAL, C.; FERRAZ, A.; NUNES, F. D.
Hibridização in situ com sonda não-radioativa para mRNA: princípios e aplica-
ções em patologia. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial,
Rio de Janeiro, v. 42, n. 3, 2006.
 Biologia Molecular 139

Sobre a autora
Vânia Marilande Ceccatto: é bióloga, licenciada e bacharelada pela Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, a UNESP. Fez Mestrado em Ciências
pela Universidade de São Paulo – USP e Doutorado em Bioquímica pela
Universidade Federal do Ceará. É professora de Biologia Molecular desde 1998
na Universidade Estadual do Ceará. Está ligada ao Mestrado Acadêmico em
Ciências Fisiológicas, também da UECE.
A não ser que indicado ao contrário a obra Biologia Molecular, disponível em: http://educapes.capes.gov.br, está
licenciada com uma licença Creative Commons Atribuição-Compartilha Igual 4.0 Internacional (CC BY-SA
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distribuição gratuita. O conteúdo do livro publicado é de inteira responsabilidade de seus autores, não representan-
do a posição oficial da EdUECE.
Ciências Biológicas

F
iel a sua missão de interiorizar o ensino superior no estado Ceará, a UECE,
como uma instituição que participa do Sistema Universidade Aberta do
Brasil, vem ampliando a oferta de cursos de graduação e pós-graduação
na modalidade de educação a distância, e gerando experiências e possibili-
dades inovadoras com uso das novas plataformas tecnológicas decorren-
tes da popularização da internet, funcionamento do cinturão digital e
massificação dos computadores pessoais.
Comprometida com a formação de professores em todos os níveis e
a qualificação dos servidores públicos para bem servir ao Estado,
os cursos da UAB/UECE atendem aos padrões de qualidade
estabelecidos pelos normativos legais do Governo Fede-
ral e se articulam com as demandas de desenvolvi-
mento das regiões do Ceará.