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 Práticas de biologia molecular

Diagramação: Camila Alves de Cremo

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Indexação: Amanda Kelly da Costa Veiga
Revisão: Os autores
Organizadoras: Débora de Oliveira Lopes
Simone da Fonseca Pires

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

P912 Práticas de biologia molecular / Organizadoras Débora de

Oliveira Lopes, Simone da Fonseca Pires. – Ponta
Grossa - PR: Atena, 2022.

Formato: PDF
Requisitos de sistema: Adobe Acrobat Reader
Modo de acesso: World Wide Web
Inclui bibliografia
ISBN 978-65-258-0008-0
DOI: https://doi.org/10.22533/at.ed.080221703

1. Biologia molecular. I. Lopes, Débora de Oliveira

(Organizadora). II. Pires, Simone da Fonseca (Organizadora).
III. Título.
CDD 572.8
Elaborado por Bibliotecária Janaina Ramos – CRB-8/9166

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escopo da divulgação desta obra.
APOIO
 DEDICATÓRIA

A todos os pesquisadores, professores e estudantes que dedicam parte de suas

vidas ao ensino de ciências e à pesquisa nas universidades públicas federais.
 AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de prestar homenagem aos Professores, que proporcionam,

cada dia mais, um ensino de qualidade e excelência nas universidades federais brasileiras.
Nesse sentido, agradecemos à Universidade Federal de São João Del Rei por criar e
equipar o laboratório de Biologia Molecular com materiais e insumos de qualidade para o
desenvolvimento das aulas práticas. Em especial, agradecemos ao professor Dr. Eduardo
Sérgio da Silva, que durante sua gestão como diretor do Campus Centro-Oeste (UFSJ-
CCO) não poupou esforços para que os estudantes tivessem um ensino de qualidade.
Agradecemos também o apoio técnico prestado pelo servidor Dr. Flávio Martins de Oliveira,
que prepara e testa todas as aulas práticas com zelo e carinho, para que elas sejam
desenvolvidas com êxito pelos estudantes. Agradecemos ainda, o apoio do Programa de
Pós Graduação em Ciências da Saúde (UFSJ), da CAPES e do grupo PET Bioquímica
(MEC) por todo auxílio na construção, produção e divulgação deste livro.
 EPÍGRAFE

“Saber que ensinar não é transferir conhecimento, mas criar as possibilidades para
a sua própria produção ou a sua construção” (Paulo Freire).

“Não há docência sem discência, as duas se explicam e seus sujeitos, apesar das
diferenças que os conotam, não se reduzem à condição de objeto, um do outro. Quem
ensina aprende ao ensinar e quem aprende ensina ao aprender” (Paulo Freire).
 PREFÁCIO

Desde a descoberta da estrutura do DNA em meados do século XX, a Biologia

Molecular avançou de forma rápida e surpreendente, alcançando resultados até então
inimagináveis no mundo científico. O marco inicial da sua trajetória foi, sem dúvida, o
desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, que possibilitou desvendar o genoma
de diversos organismos, dentre eles o humano, cujo rascunho foi anunciado em 26 de
junho de 2000 por Francis Collins e J. Craig Venter. Desde então, o conhecimento gerado
na área da Biologia Molecular não parou de crescer, culminando em novas técnicas e
estratégias de estudo do DNA ou mesmo no aperfeiçoamento de técnicas já padronizadas.
Se no ano de 2000 existiam poucas unidades de genomas depositados, atualmente
existem mais de 60.000 genomas disponíveis no mais importante banco de dados de acesso
público de informações genômicas, o NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Apesar da notória evolução e alcances tecnológicos, conhecer os princípios básicos que
regem a Biologia Molecular (fluxo da informação genética) é de suma importância para se
entender técnicas mais refinadas, como a edição genética (CRISPR-CAS9). Diante desse
contexto, o objetivo deste livro é trazer de forma clara e objetiva, técnicas corriqueiras de
Biologia Molecular para serem realizadas em aulas práticas.
No primeiro capítulo do livro Práticas em Biologia Molecular é abordado a importância
da realização de aulas práticas no ensino e fixação do conhecimento. O segundo capítulo
aborda a importância do planejamento de experimentos, o conceito e princípios de boas
práticas laboratoriais e de biossegurança no laboratório. Uma vez estabelecidos esses
conceitos, os capítulos subsequentes tratam das aulas práticas a serem realizadas
no ambiente laboratorial. Ao todo são apresentadas 15 práticas em formato de roteiro,
contendo uma breve introdução, os objetivos da técnica, materiais e métodos, resultados
e discussão. Além disso, também é indicado um material de apoio que visa proporcionar
melhor compreensão acerca dos temas abordados. O livro é finalizado com um tópico
apresentando os avanços em Biologia Molecular nas últimas décadas.
Esperamos que esse livro possa ajudar e incentivar docentes e discentes do curso
de Bioquímica, Biomedicina, Ciências Biológicas, e outros cursos de graduação e pós-
graduação, na fascinante jornada da Biologia Molecular, servindo de apoio para o ensino e
inspiração para futuras pesquisas.
SUMÁRIO

O ENSINO DE BIOLOGIA MOLECULAR E A IMPORTÂNCIA DOS EXPERIMENTOS

PRÁTICOS..................................................................................................................... 1

BOAS PRÁTICAS LABORATORIAIS.......................................................................... 3

BIOSSEGURANÇA....................................................................................................... 5

BIOINFORMÁTICA NO ENSINO DE BIOLOGIA MOLECULAR................................ 9

PIPETAGEM................................................................................................................18

SÍNTESE DE INICIADORES (PRIMERS).................................................................. 22

EXTRAÇÃO DE DNA HUMANO................................................................................ 27

PRECIPITAÇÃO E DOSAGEM DE DNA.................................................................... 31

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)..................................................... 35

DIGESTÃO ENZIMÁTICA........................................................................................... 40

CLONAGEM EM PLASMÍDEO................................................................................... 44

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA NÃO DESNATURANTE E

COLORAÇÃO.............................................................................................................49

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE E COLORAÇÃO.................................. 56

PREPARO DE CÉLULAS ELETROCOMPETENTES............................................... 61

TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA (ELETROPORAÇÃO)..................................... 67

EXTRAÇÃO DNA PLASMIDIAL (MINIPREP)........................................................... 72

EXPRESSÃO HETERÓLOGA.................................................................................... 76

GEL DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE................................................................... 80

AVANÇOS EM BIOLOGIA MOLECULAR.................................................................. 87

CONSIDERAÇÕES FINAIS: A CIÊNCIA É CONSTRUÍDA COM A SOMA DE

VÁRIOS ESFORÇOS.................................................................................................. 91

SOBRE OS AUTORES............................................................................................... 92

https://doi.org/10.22533/at.ed.0802217031

SUMÁRIO
SOBRE AS ORGANIZADORAS................................................................................. 93

https://doi.org/10.22533/at.ed.080221703

SUMÁRIO
O ENSINO DE BIOLOGIA MOLECULAR E A IMPORTÂNCIA DOS
EXPERIMENTOS PRÁTICOS
Se por um lado ensinar o dogma central da Biologia Molecular pode ser complexo
e exigir profunda fundamentação teórica, a fixação do conhecimento através da realização
de práticas experimentais pode dar vida e sentido à molécula central da disciplina, o DNA.
Além de melhorar o entendimento, as aulas práticas também despertam o interesse dos
estudantes pela pesquisa científica, sendo um importante motivador e engajador de alunos
em projetos de iniciação científica nas universidades. A experimentação possibilita diminuir
a distância do aprendizado teórico e sua compreensão de maneira aprofundada, facilitada
e motivacional[1].
Não há dúvidas de que a realização das aulas práticas seja uma ferramenta
facilitadora do processo de ensino e aprendizado, entretanto, ela não se restringe à apenas
essa função. A experimentação prática pode desenvolver habilidades que vão além do
conteúdo a ser ministrado. Através do uso de metodologias alternativas de ensino pode-se
também desenvolver o raciocínio científico e senso crítico, promover a interação entre os
estudantes e com o professor, entre outros.
No modelo de ensino “aprendendo fazendo” cabe ao professor, enquanto
agente mediador do conhecimento, incentivar e estimular os estudantes, promovendo
oportunidades durante a aula para que eles se sintam parte do processo e possam discutir
ideias e aprimorar conceitos. Dessa forma, o processo de ensinar e aprender torna-se
muito mais dinâmico e prazeroso, principalmente, quando se trata de um tema complexo
como o dogma central da transmissão da informação genética[2].
As aulas práticas envolvem três etapas igualmente importantes: a preparação do
experimento, a sua condução e por último a interpretação dos resultados obtidos. Cada
uma destas etapas contém elementos importantes para a construção do aprendizado e
desenvolvimento de novas habilidades. A primeira etapa é geralmente realizada com a
ajuda de um técnico de laboratório, que verifica os reagentes e equipamentos a serem
usados. O suporte de um técnico qualificado e com experiência na preparação das aulas
é de extrema importância para o sucesso das práticas. A segunda etapa consiste em ler o
roteiro, entender a teoria e realizar o passo a passo da prática, sempre atento aos detalhes
contidos nas instruções. Nesse momento, o aluno é convidado a fazer parte do experimento
e atuará de forma autônoma. Após a finalização do experimento é realizada a última etapa
do processo, que consiste na análise e interpretação dos resultados. Quando conduzida
de forma conjunta e participativa, essa etapa torna-se extremamente rica, e um importante
espaço para o crescimento do grupo. É importante ressaltar que, mesmo padronizadas,
as aulas práticas podem não alcançar os resultados esperados e, nesse momento, é
fundamental que o professor intervenha e convide os alunos a participar de uma discussão
a respeito dos problemas enfrentados e as possíveis soluções para aquele experimento.

O ensino de Biologia Molecular e a importância dos experimentos práticos 1

 Nesse cenário, o livro “Práticas em Biologia Molecular” almeja promover e estimular
o ensino de Biologia Molecular e apresentar as principais técnicas de manipulação do DNA
e suas aplicações na ciência. Cada uma das práticas aqui apresentada foi cuidadosamente
planejada e faz parte da rotina de muitos laboratórios de Biologia Molecular. Os roteiros
destas aulas práticas foram criados, inicialmente, para a disciplina Práticas em Biologia
Molecular, do curso de Bioquímica da Universidade Federal de São João del Rei e podem
ser adaptados a várias outras disciplinas.

REFERÊNCIAS
[1] Souza, CM; Santos, CB. Aulas Práticas no ensino de Biologia: Desafios e Possibilidades. Id online:
Revista Multidisciplinar e de Psicologia, v. 13, n. 45(1), p.426-433, 2019.

[2] Silva, VG. A importância da experimentação no ensino de química e ciências. Dissertação

(Mestrado). Universidade Estadual Paulista – UNESP. Bauru/SP, 2016.

[3] Freire, P. Pedagogia da autonomia: saberes necessários à prática educativa. São Paulo, 25 ed:
p.52, 2004.

O ensino de Biologia Molecular e a importância dos experimentos práticos 2

Boas Práticas Laboratoriais
As Boas Práticas de Laboratório (BPL) são estabelecidas pela Organization for
Economic Co-operation and Development (OECD) para garantir qualidade, organização
e condições mais adequadas aos usuários no ambiente laboratorial. Com o propósito
de assegurar a aplicabilidade dos conceitos da BPL, é adotado nos laboratórios os
Procedimentos Operacionais Padrão (POP), que visam a padronização das atividades
realizadas neste ambiente, assegurando a qualidade e controle do experimento realizado e
minimizando os riscos e gastos inadequados[1]. É importante lembrar que embora algumas
regras sejam gerais, cada laboratório pode ter suas peculiaridades quanto ao funcionamento,
fluxo, paramentação, acesso, entre outros. Dessa forma, antes de ingressar em qualquer
laboratório é indispensável que os usuários recebam treinamento adequado, minimizando
os riscos individuais e coletivos naquele espaço.
Os usuários do laboratório devem sempre primar pela boa convivência neste
ambiente e respeitar todas as normas e regras vigentes. Além disso, é importante que os
usuários façam parte da rotina de trabalho, colaborando com a organização do espaço e
participando de todas as tarefas coletivas como: limpeza de equipamentos, preparação de
soluções, identificação de reagentes, entre outras.
O laboratório não é, e nunca será um lugar de lazer ou conversa, pois as distrações
podem trazer riscos à saúde e causar prejuízos aos experimentos realizados. Dessa forma,
é importante que todos os usuários mantenham o máximo de silêncio e concentração
durante a realização dos experimentos, próprios ou alheios.
Também faz parte das boas práticas laboratoriais atitudes simples como identificar o
material utilizado (nome, número, lote, data), estar sempre atento quanto à forma correta de
armazenamento das substâncias, verificar datas de validade dos reagentes, funcionamento
adequado dos equipamentos, entre outros. É extremamente importante que os usuários
do laboratório fiquem atentos ao ambiente onde estão trabalhando e caso seja detectado
qualquer problema, comunicar imediatamente ao coordenador ou responsável pelo
laboratório para que as providências sejam tomadas.
O primeiro passo de qualquer experimento é o seu planejamento. Essa simples
atitude pode evitar surpresas e imprevistos, reduzindo riscos e prejuízos. Um experimento
de sucesso, certamente passa por um rigoroso planejamento na leitura e entendimento
das etapas realizadas, na escolha dos reagentes, tempo de realização e verificação
dos equipamentos e sua disponibilidade. Planeje seu experimento com calma! Leia os
protocolos, faça anotações, converse com outros membros do laboratório e com seu
orientador, e sempre respeite as regras e ética no ambiente de trabalho/estudo[2].

Boas Práticas Laboratoriais 3

1 | USO DE EQUIPAMENTOS
Antes de utilizar qualquer equipamento no laboratório é importante fazer um
treinamento com o técnico responsável, para que todas as informações e regras de
utilização sejam esclarecidas. Além disso, é também aconselhável realizar o estudo prévio
do manual de funcionamento de cada equipamento e dos POPs do laboratório.
A maioria dos laboratórios tem tomadas com voltagem de 110v e 220v, antes de
usar o equipamento certifique-se que ele está ligado à tensão correta, evitando que ele seja
danificado. Quando estiver realizando experimentos longos, verifique constantemente se
está tudo certo e quando precisar se ausentar, deixe sempre alguém ciente do experimento
em andamento. E por último, sempre que verificar algo diferente como: cheiro de queimado
ou sons diferentes do usual, desligue o equipamento e verifique com o responsável do
laboratório o que deve ser feito[3].

REFERÊNCIAS
[1] Borba, CM; Costa, MAF; Pereira, MEC; et al. Biossegurança e Boas Práticas Laboratoriais.
In: Molinaro EM, Caputo LFG, Amendoeira MRR (org). Conceitos e Métodos para a Formação de
profissionais em laboratório de Saúde. Rio de Janeiro - RJ: EPSJV; IOC, 2009.

[2] Barker K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Updated Edition. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 2005.

[3] Almeida MFC. Boas Práticas de Laboratório. 2ª ed. São Caetano do Sul - SP: Difusão Editora, 2013.

Links:
Treinamento para o retorno aos Laboratórios de Pesquisa pós pandemia COVID-19. https://www.
youtube.com/watch?v=OeA-klgu7Ok&feature=emb_logo

Boas Práticas Laboratoriais - Parte 1. https://www.youtube.com/watch?v=Pvnq7_t_hxM

Boas Práticas Laboratoriais - Parte 2. https://www.youtube.com/watch?v=l7xD5TkEyOI

Boas Práticas Laboratoriais 4

Biossegurança
A Biossegurança é um conjunto de normas, técnicas e equipamentos que, em
conjunto, visam a prevenção, controle, redução ou eliminação de possíveis riscos para a
saúde humana, animal, vegetal e para o meio ambiente [1].
A responsabilidade legal pela segurança no ambiente de trabalho é atribuída
aos administradores da instituição, porém, os usuários do ambiente laboratorial têm
papel fundamental neste processo, visto que são eles que deverão seguir as normas de
Biossegurança adotadas. Além disso, as instituições de pesquisa também designam uma
comissão de Biossegurança que será responsável por implementar as normas de segurança
preconizadas pelos órgãos competentes, padronizar e normatizar procedimentos de
segurança, identificar e classificar áreas de risco, estabelecer programas de treinamento,
verificar o descarte de resíduos e investigar acidentes [2].
Os cuidados com a biossegurança se estendem além das boas práticas laboratoriais.
Além das normas de conduta, são necessários cuidados quanto à segurança individual e
coletiva de todos os usuários do ambiente. Conforme a peculiaridade de cada laboratório
será necessário adotar equipamentos específicos de proteção individual (EPIs) e/ou
coletiva (EPCs). Os EPIs são essenciais para garantir a proteção individual de modo a
evitar o contato do usuário com agentes infecciosos ou contaminados, evitar acidentes
químicos com agentes tóxicos ou corrosivos, entre outros. Já os EPCs são essenciais para
a proteção coletiva do laboratório, como, por exemplo: cabines de seguranças, capelas de
fluxo, chuveiros e lava olhos de emergência, extintores, etc.
O descarte de materiais, reagentes e amostras também é tratado pela comissão
de biossegurança e deve ser realizado de maneira apropriada, respeitando os protocolos
estabelecidos. Geralmente existe um local específico para o descarte ou acondicionamento
de cada material nos laboratórios e dentro da instituição, evitando contaminação humana,
animal e ambiental.
A comissão de Biossegurança e a instituição deve estabelecer um fluxograma de
atendimento a acidentes, com todos os passos a serem seguidos e realizar treinamentos
periódicos com todos os usuários. É importante lembrar que cada categoria de acidente
pode demandar um procedimento específico que mitigue não só a perda material, mas
zele, acima de tudo, pela vida dos usuários [3, 4]
.
No Brasil, o órgão responsável pelo controle das atividades realizadas com DNA
recombinante é a CTNBio, Comissão Técnica Nacional de Biossegurança, criada pela Lei
de Biossegurança (Lei nº 8.974 de 1995) no âmbito do Ministério da Ciência e Tecnologia [3].
A aplicação da biossegurança na biologia molecular ganhou mais força após o advento da
tecnologia do DNA recombinante, que permitiu a obtenção de organismos geneticamente
modificados com características artificiais. Neste caso, existe o risco de transferência do
material genético utilizado para a produção desses organismos geneticamente modificados

Biossegurança 5
(OGMs) ou mesmo contaminação com os organismos recombinantes [1]
. Dessa forma,
todos os laboratórios que trabalham com OGMs devem ser certificados pela CTNBio, para
poderem exercer suas pesquisas/atividades de forma correta.

1 | FLUXOGRAMA DE ATENDIMENTO A ACIDENTES

A utilização do laboratório de maneira segura e correta, seguindo os protocolos
de segurança e boas práticas, pode minimizar ou até mesmo extinguir alguns riscos,
entretanto, é importante a sensibilização dos usuários quanto ao risco inerente a esse
ambiente. Existem diferentes origens de riscos que podem ser de natureza química, física,
biológica e até mesmo ergonômica como levantamento de pesos, postura inadequada,
situação de estresse e jornadas prolongadas. Queimaduras, choques elétricos, contato
com agentes patogênicos, acidentes com perfurocortantes, incêndios, vazamentos de gás,
são exemplos, não raros, de acidentes que podem acometer os usuários do laboratório por
diversas razões, incluindo o descuido do usuário ou despreparo.
Os acidentes ou incidentes devem ser sempre notificados à comissão de
Biossegurança e investigados, para que as causas sejam averiguadas e ocorra uma
conscientização sobre os procedimentos corretos, evitando assim, novos acidentes. Vale
ressaltar que a primeira ação a ser tomada após um acidente é o atendimento à(s) vítima(s),
e para que esse atendimento seja eficaz é necessário a elaboração e implementação de
um Fluxograma de Atendimento a Acidentes, contendo as orientações que direcionam o
tratamento adequado da(s)vítima(s).
A primeira etapa da elaboração do Fluxograma de Atendimento a Acidentes
é a realização de um levantamento da estrutura da instituição (ou onde se encontra o
laboratório). É importante verificar se existe posto ou local com atendimento médico/
enfermaria próximo e se no laboratório existem usuários treinados para realizar o
atendimento de primeiros socorros às vítimas, ainda no local. É extremamente importante
que conste nesse fluxograma quais os serviços de emergência existem na cidade e a
indicação de qual suporte chamar, em cada situação.
Após estabelecido e aprovado o fluxograma de acidentes (Figura 1), é importante
que ele seja afixado em local visível no laboratório e que os usuários recebam treinamento
periodicamente.

Biossegurança 6
 Figura 1- Fluxo de atendimento a acidentes formulado pela CIBio-UFSJ-CCO.

REFERÊNCIAS
[1] Teixeira, P; Valle, S. Biossegurança: uma abordagem multidisciplinar [online]. 2nd ed. rev. and enl.
Rio de Janeiro: Fiocruz, p.442, 2010.

[2] Secretaria de Saúde da Bahia. Manual de Biossegurança. Universidade Federal da Bahia. Instituto
de Ciências da Saúde. Salvador, 2001.

[3] Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção
Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 1: Biossegurança e Manutenção de Equipamentos em
Laboratório de Microbiologia Clínica. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. – Brasília: Anvisa, 2013.

[4] Laboratório Central de Saúde Pública do Espírito Santo. Manual de Biossegurança. - Vitória, 2017.

Links:
Biossegurança ações:
https://www.saude.mg.gov.br/ajuda/story/6613-bombeiros-ou-samu-saiba-quem-acionar-em-um-
momento-de-emergencias
http://www.sinaees-sp.org.br/arq/mtegat.pdf

Biossegurança 7
Biossegurança e Boas práticas:
https://www.youtube.com/watch?v=BGYsSqf1lNY
https://youtu.be/KWsd7Z_qtIg

Regras de Laboratório
https://youtu.be/BRDApYgvDqQ

Biossegurança 8
Bioinformática no Ensino de Biologia molecular
OBJETIVO
Conhecer ferramentas de Bioinformática que auxiliam no estudo de genes e
proteínas.

INTRODUÇÃO
A biologia molecular é uma área que está intimamente relacionada à bioquímica
e à genética, quando se trata do estudo do DNA (ácido desoxirribonucleico), RNA (ácido
ribonucleico), proteínas codificadas e dos processos envolvidos no fluxo da informação
genética[1]. Entretanto, com o passar do tempo, algumas “questões biológicas” ainda
permaneciam obscuras na ciência, impulsionando a associação da biologia molecular com
outras áreas, dentre elas a informática. Essa associação deu origem à bioinformática, uma
ciência que visa construir algoritmos computacionais para simular processos biológicos e
resolver “problemas” ou “demandas” provenientes da biologia[2,3].
Dentre as demandas mais importantes na ciência, podemos citar a participação ativa
da bioinformática no sequenciamento de genomas. Após o processo de sequenciamento
do DNA, os pesquisadores se depararam com um enorme arquivo contendo as bases A,
C, G e T, que, por si só, era vazio e não desvendava o código genético. Montar o “quebra-
cabeças” de sequências gerados pelo sequenciamento de DNA foi, sem dúvida, o papel
mais marcante da bioinformática na ciência[1].
A bioinformática vem evoluindo e se associando à diversas áreas (química, física,
estatística, medicina, matemática), com o intuito de responder questões multidisciplinares
e ajudando a predizer e direcionar os estudos in vitro e in vivo[1, 2]. Além de um sistema de
informação computacional e de métodos analíticos aplicados a problemas biológicos, a
bioinformática é também uma área na interseção da ciência experimental e teórica, e não
apenas sobre a modelagem de dados ou “mineração”, por compreender o mundo molecular
que sustenta a vida a partir de perspectivas evolutivas [2, 3]
.
A bioinformática no atual estado da arte abrange modelagem de fenômenos
biológicos, desenvolvimento de algoritmos e estatísticas, a análise da estrutura de
genes, promotores, proteínas, processamento alternativo dos genes (splicing), genômica,
metagenômica, genômica comparativa, transcriptômica, metatranscriptômica, interação
proteína-proteína, modelagem e docking de proteína, entre outros. “A Bioinformática é um
campo emergente da pesquisa, que utiliza ferramentas computacionais avançadas para o
armazenamento, análise e apresentação de dados biológicos e moleculares” [4].
O surgimento da Bioinformática trouxe para o mercado um novo profissional,
com conhecimentos sobre os problemas biológicos, capaz de analisá-los e, a partir dos
resultados encontrados, criar métodos para explicá-los: o bioinformata. Este, possui domínio

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 9

da ciência da computação, e familiaridade com os princípios e técnicas laboratoriais da
biologia molecular, sendo um profissional requisitado e raro em laboratórios desta área [5].

MATERIAIS
1 Computador pessoal Desktop, ou Notebook com acesso à internet.

MÉTODOS

Busca de sequência gênica (Genbank)

• Acessar o link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

• Inserir o nome ou termo do gene de interesse. Segue a busca pelo termo, ou

nome do gene dinB:

Figura 1: Busca pela sequência alvo no banco de dados.

• Escolher a espécie e clicar na opção desejada. Neste exemplo a Escherichia

coli str. K-12 substr. MG1655, no link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/944922:

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 10

 Figura 2: Escolha da espécie desejada no banco de dados.

• Clicar na opção fasta para a sequência de nucleotídeos.

Figura 3: Obtenção da sequência nucleotídica da sequência alvo.

• Selecionar a sequência fasta e colar no Word.

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 11

 Figura 4: Obtenção da sequência no formato FASTA.

Tradução da Sequência de DNA (Translate tool)

• Acessar o link https://web.expasy.org/translate/

• Inserir a sequência de nucleotídeos anteriormente selecionada do gene dinB e

clicar em Translate!

Figura 5: Tradução da sequência nucleotídica.

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 12

Alinhamento local (Basic Local Alignment Search Tool – BLAST)
• Acessar o link https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

• Clicar nas opções “Nucleotide BLAST” para alinhamento de nucleotídeos contra

banco de dados de nucleotídeos. “BLASTx” para alinhamento de nucleotídeos
contra banco de dados de proteínas. “tBLASTn” para alinhamento de proteínas
contra banco de dados de nucleotídeos. “BLASTp” para alinhamento de proteí-
nas contra banco de dados de proteínas.

Figura 6: Interface da página do alinhamento Local.

• Inferir homologia funcional através do programa “BLASTx”, inserindo a sequên-

cia fasta do gene dinB obtida anteriormente e clicar em “BLAST”:

Figura 7: Alinhamento Local usando o BLASTx.

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 13

 • Analisar e identificar os melhores os resultados através dos scores de percen-
tual de identidade, e-value, entre outros:

Figura 8: Resultado obtido no alinhamento Local usando o BLASTx.

Caracterização físico-química da proteína (ProtParam)

• Acessar o link https://web.expasy.org/protparam/

• Inserir a sequência de aminoácidos gerados “ExPASy - Translate tool” do gene

dinB e clicar em Compute Parameters:

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 14

 Figura 9: Caracterização físico química da proteína.

Modelagem da proteína (SWISS-MODEL)

• Acessar o link https://swissmodel.expasy.org/interactive

• Inserir a sequência de aminoácidos gerados “ExPASy - Translate tool” do gene

dinB e clicar em Build Model:

Figura 10: Modelagem Comparativa usando a ferramenta SWISS-MODEL.

• Analisar e identificar os melhores modelos gerados através dos scores de per-

centual de identidade, GMQE, QMEAN, entre outros:

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 15

 Figura 11: Escolha dos melhores modelos na ferramenta SWISS-MODEL.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
No Genbank, como saída do gene escolhido, é esperado que seja fornecida
uma sequência de nucleotídeos, cujo cabeçalho deve iniciar por “>” para identificação
nos diversos programas de bioinformática. No ExPASy Translate Tool espera-se como
resultado uma sequência de aminoácidos de tamanho equivalente a um terço da sequência
original. A ferramenta também permite o uso de algoritmos específicos para determinados
organismos. O programa BLAST realiza o alinhamento local de sequências de entrada com
o banco de dados, sendo que o pesquisador pode escolher o tipo de sequência de entrada
e saída e ainda o algoritmo e pontuação a serem usados. O ProtParam calcula vários
parâmetros físicos e químicos para uma determinada sequência de proteína, que incluem
o peso molecular, pI teórico (ponto isoelétrico), composição de aminoácidos, composição
atômica, coeficiente de extinção, meia-vida estimada, índice de instabilidade, índice alifático
e grande média de hidropaticidade (GRAVY). O SWISS-MODEL é um software on-line de
modelagem baseado em homologia de estruturas proteicas totalmente automatizado. Os
resultados são dispostos na ordem de GMQE, QMEAN, “Oligo-State” entre outros, sendo
necessário observar qual score é o mais adequado a sua análise.
Dessa forma, o uso de ferramentas de bioinformática proporcionará ao estudante
uma melhor compreensão da biologia molecular através da caracterização in sílico de um
gene/proteína conhecida ou hipotética de um organismo específico.

REFERÊNCIAS
[1] Pinho, MSL. Pesquisa em Biologia Molecular: Como fazer? Revista Brasileira Coloproct., v. 26, n. 3:
p.331-336, 2006.

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 16

[2] Thampi, S. M. Introduction to Bioinformatics.arXiv preprint arXiv. Computational Engineering,
Financeand Science, 2009.

[3] Griffiths, AJF; Wessler, SR; Lewontin, RC; Carroll, SB. Introdução a Genética. 9ed. Guanabara
Koogan, 2008.

[4] Ribeiro, DCD. Ferramentas de Bioinformática: Manipulação de sequências e recuperação de regiões

flanqueadoras de um alvo. IX Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e V Encontro Latino
Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba: p.182-185, 2005.

[5] Araújo, E. O biólogo das telas de computador. Boletim do Conselho de Informações Sobre
Biotecnologia. ano 2, n. 7, 2004.

Links:
Analisando resultados de sequências de genes alinhados com o software BLAST
https://www.youtube.com/watch?v=RzC-V67z5LA

Design de primer para PCR em tempo real usando NCBI Primer BLAST
https://www.youtube.com/watch?v=tGNPkiY0WJU

Ferramenta OligoAnalyzer para análise de dímeros de primers e cálculo de ™

https://www.youtube.com/watch?v=IcEbvNYzrSQ

Bioinformática no Ensino de Biologia molecular 17

Pipetagem
OBJETIVO
Manusear de forma correta pipetas automáticas e praticar a técnica de pipetagem
para promover a medição e transferência de volumes líquidos com precisão.

INTRODUÇÃO
Nos primórdios da ciência, a técnica de pipetagem para volumes pequenos exigia
que o líquido fosse sugado pela boca até a delimitação desejada na pipeta de vidro. O
uso dessa estratégia dificultava a obtenção de volumes exatos e dependia da prática do
usuário, que corria o risco de ingerir o material sugado[1].
As primeiras pipetas que surgiram eram de pistão de metal. Elas eram delicadas,
quebradiças e apresentavam alto risco de contaminação da amostra e do pipetador. O
marco do aperfeiçoamento da pipetagem em relação a micro volumes ocorreu no final da
década de 1950 pelo alemão Heinrich Schnitger, fundador da empresa Eppendorf, através
do desenvolvimento da micropipeta contendo a ponta de plástico movida a pistão. Essa
pipeta foi patenteada em 1957 e comercializada pela primeira vez em 1961[1].
As pipetas foram aperfeiçoadas ao longo dos anos e no atual cenário, as micropipetas
são indispensáveis ao desenvolvimento da pesquisa científica em diversos campos da
biotecnologia, biologia molecular, bioquímica, fisiologia e outras áreas afins[1]. Em biologia
molecular, é essencial que a pipeta seja utilizada de forma correta e habilidosa para obter
sucesso na condução dos experimentos, visto que, na maioria das vezes, os volumes
usados são demasiadamente pequenos, na ordem de microlitros. Dessa forma, antes de
realizar qualquer experimento, é importante que o usuário receba um treinamento acerca
do funcionamento deste equipamento e pratique exaustivamente até que seja conseguido
sucesso na técnica, para produzir resultados confiáveis[2].
As pipetas podem ser divididas em dois grupos: i) Mecânicas: são as pipetas
volumétricas graduadas e tipo Pasteur e ii) Eletrônicas: são os pipetadores automáticos,
as micropipetas digitais monocanal e multicanal, que têm de 8 a 12 canais simultâneos. No
laboratório de Biologia Molecular as micropipetas automáticas mono e multicanal são as
mais usadas, devido a sua capacidade de permitir a transferência de microlitros na faixa
0,1 µL a 10.000 µL. A nomenclatura das pipetas é dada conforme o volume suportado,
capacidade máxima e mínima de trabalho, por exemplo: a P1.000 permite aspirar/dispensar
volumes entre 200 a 1.000 µL, a P100 de 10 a 100 µL, a P10 de 1 a 10 µL e a P2 trabalha
com volumes de 0.1 a 2 µL.
As pipetas são compostas por 5 partes importantes: o embolo de ajuste do volume,
que também é usado para a sução e dispensa do líquido, a alça para segurar a pipeta, o
display de visualização do volume, a faixa de volume que a pipeta suporta e o botão de

Pipetagem 18
ejeção da ponteira (Figura 1). O primeiro passo da pipetagem é a escolha da pipeta, que
vai variar conforme o volume a ser usado. É necessário determinar o volume específico a
ser usado, o líquido a ser pipetado e também as ponteiras a serem usadas, dado que estas
são específicas para cada pipeta (10, 100, 1.000, 5.000 µL).

Figura 1: Partes da micropipeta automática monocanal.

MATERIAIS

Reagentes:
3 Caixas de ponteiras: P10, P100 e P1000

1 Filme plástico ou parafilme

1 Barca para a pipeta multicanal

1 Tubo de 10 mL contendo líquido azul a ser pipetado

1 Placa de 96 poços

1 Estante para armazenar os tubos

1 Balde ou lixeira para descarte

Equipamentos:
3 Pipetas monocanal - P10, P100, P1000

1 Pipeta multicanal P100

1 Pipeta repetidora monocanal

Pipetagem 19
MÉTODOS
• Escolher a pipeta desejada, conforme o volume a ser pipetado, e adequar o
micrômetro/display de visualização usando o embolo da pipeta.

• Adicionar a ponteira na ponta da pipeta e se for necessário ajustá-la.

• Pressionar lentamente o botão do êmbolo até o primeiro estágio, sem entrar em

contato com a solução.

• Para aspirar, inserir a ponteira da pipeta na solução e liberar gradualmente o

botão do êmbolo até que o mesmo retorne a sua posição inicial, aspirando o
líquido. O retorno lento e gradual do êmbolo evita a entrada de ar na pipeta.

• Para dispensar, pressionar o botão do êmbolo passando pelo primeiro estágio e

segurar até atingir o segundo estágio (ponto máximo permitido), dispensar todo
o volume do líquido no local desejado (parafilme, tubo ou placa).

• Apertar o botão ejetor para expulsar a ponteira no descarte apropriado.

• Usando o material pipetado, repetir a técnica descrita acima para verificar se

o conteúdo pipetado apresenta a precisão descrita pela pipeta. Caso contrário,
realizar a prática novamente quantas vezes for necessário até obter o resultado
almejado.

• Realizar a pipetagem de 1, 5, 20, 100 500 e 1000 µL em um parafilme.

Obs:
• A amostra pode ou não ser homogeneizada, dependendo do protocolo seguido.

• Caso fique líquido na ponteira, a pipetagem não teve sucesso. Verificar se a

ponteira está adequadamente encaixada e tentar novamente.

• No caso da pipeta multicanal, o procedimento é exatamente o mesmo, mas

deverá ser usado uma barca ou suporte para retirar o líquido de todos os canais
simultaneamente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O sucesso de qualquer experimento em biologia molecular está intimamente
relacionado ao processo de pipetagem, que deve apresentar precisão na transferência
do reagente. Caso o usuário verifique o mau funcionamento de uma pipeta, ele deve
comunicar ao técnico responsável para ser feita uma limpeza/descontaminação e calibração
do equipamento, evitando assim, que outros usuários comprometam seus experimentos.
Durante a pipetagem os olhos devem estar posicionados na altura do mesmo,
garantindo o acerto e conferencia do menisco. Após aspirar o líquido, é importante
movimentar a pipeta sempre na posição vertical, evitando que o líquido entre em sua parte
mecânica e cause a contaminação e corrosão do seu pistão (parte mecânica interna). Caso

Pipetagem 20
o líquido seja acidentalmente aspirado para dentro da pipeta, ela deve ser desmontada e o
pistão deve ser imediatamente limpo com álcool isopropílico a 70%.
Para evitar contaminação é indispensável trocar a ponteira após cada manipulação e
se possível, usar ponteiras com filtro ou ponteiras de deslocamento positivo para evitar que
o aerossol da amostra passe para o corpo da micropipeta e contamine a próxima amostra.
Se suspeitar de contaminação da micropipeta, ela deve ser limpa e/ou autoclavada,
conforme as instruções do fabricante. A frequência da verificação da calibração depende
do quanto a pipeta é utilizada e da qualidade e condição de uso. Para armazenar as pipetas
de forma correta, é necessário mantê-las na posição vertical em estantes apropriadas e
realizar a conferência de precisão e exatidão das mesmas com periodicidade.

REFERÊNCIAS
[1] Klingenberg, M. When a common problem meets an ingenious mind. EMBO Rep., 6(9): 797-800,
2005.

[2] Miller, JS; Sass, ME; Wong, SJ; Nienhuis, J. Micropipetting: An Important Laboratory Skill for
Molecular. The American Biology Teacher, 66(4): p.291-296, 2004.

Links:
Curiosidades sobre pipetagem
https://www.youtube.com/watch?v=gaNwXV4enWA

Como usar as micropipetas

https://www.youtube.com/watch?v=WrKFFw0LzL8&ab_channel=UniversidadedoDNA
https://www.youtube.com/watch?v=uEy_NGDfo_8

Pipetagem 21
Síntese de iniciadores (primers)
OBJETIVOS
Desenhar iniciadores específicos de DNA (primers) para um gene.

INTRODUÇÃO
A técnica de PCR, também conhecida como Polymerase Chain Reaction (reação
em cadeia da DNA polimerase), é a técnica que realiza a amplificação de uma sequência
específica de DNA a partir de um DNA molde (DNA genômico). O desenvolvimento da PCR
revolucionou a ciência e trouxe inúmeros avanços no campo da biologia molecular. A teoria
desta técnica foi proposta por Keppe e colaboradores em 1971, no entanto, somente 14
anos depois o procedimento completo da PCR foi descrito e experimentalmente testado por
Kary Mullis (1985), ganhador do prêmio Nobel de Química do ano de 1993[1].
A PCR é uma das técnicas mais utilizadas na ciência em todo o mundo e apresenta
diversos propósitos e finalidades, sendo eles: sequenciamento de DNA, aplicações no
diagnóstico clínico, identificação de subtipos de vírus, diagnóstico de doenças hereditárias,
identificação de “impressão digital” genética (usado em testes de paternidade e na medicina
forense), detecção de doenças infecciosas, criação de organismos transgênico, entre
outros[1] [2].
Projetar iniciadores específicos é essencial para que a PCR seja bem sucedida. As
primeiras reações de PCR utilizavam primers projetados manualmente, ou seja, baseados
apenas na sua complementaridade com a sequência alvo. Os pesquisadores utilizavam um
algoritmo simples para o cálculo da temperatura de anelamento dos primers (Tm) usando
a fórmula Tm = 2.(A+T)+ [4. (C+G)], onde A, T, G e C são as quantidades de cada base
componente do primer[3].
Atualmente existem diversos softwares disponíveis online e de uso gratuito que
facilitam o desenho de primers, poupando tempo e dinheiro, gastos na padronização de
reações em busca de uma amplificação específica. Esses programas possuem algoritmos
que calculam parâmetros importantes como: a temperatura de anelamento, tamanho,
composição, similaridade com outros genes, conteúdo GC, sentido dos iniciadores,
formação de grampos, homodímeros e heterodímeros, de modo a obter iniciadores capazes
de anelar especificamente na sequência alvo[1, 4].
Para se projetar um par de iniciadores para uma região específica do DNA, é
necessário o conhecimento prévio da sequência alvo, ou seja, o local onde os iniciadores
se anelarão. Ao desenvolver os iniciadores, um deles deve se anelar na fita positiva, que
por convenção é orientada na direção 5´ - 3´ (também conhecida como fita sense) e o outro
iniciador deve ser complementar a fita negativa, que é orientada na direção 3’ - 5 ́ (conhecida
como fita antisense), e os dois devem ter temperaturas de anelamentos próximas ou iguais,

Síntese de iniciadores (primers) 22

embora não necessitem apresentar o mesmo tamanho. De posse da sequência de primers
desenhada, as mesmas podem ser encaminhadas às empresas de biologia molecular para
serem sintetizadas.

MATERIAIS
1 Sequência nucleotídica no formato FASTA.

1 Computador pessoal Desktop ou Notebook com acesso à internet.

Programas de Bioinformática disponíveis online.

MÉTODOS

Obtenção da sequência alvo

• Primeiramente, deve-se obter a sequência gênica alvo (gene ou parte dele)
para o desenho dos iniciadores.

• Entrar no endereço eletrônico do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

• Selecionar a busca por “Gene”.

• Digitar: o nome de um gene ou de um organismo: Ex: Severe acute respiratory

syndrome coronavirus 2.

• Escolher o gene de interesse e clicar duas vezes para abrir a sequência. Obser-
vação: sugere-se que todos os alunos escolham o mesmo gene para desenho
dos iniciadores na aula.

• Ir até “mRNA and proteins” e clicar no código do RNA mensageiro.

• Após abrir a nova página, clicar em “FASTA” para selecionar a sequência gêni-
ca sem espaços entre os nucleotídeos.

• Copiar a sequência nucleotídica e salva-la em um documento “word”.

Obs: Caso a sequência escolhida seja um gene, verificar se a sequência é múltipla
de 3 e verificar se a sequência inicia com ATG e termina com códon de parada (stop códon).

Desenvolvimento manual do primer:

Para a construção manual do primer seguir as informações abaixo:

• Usando a sequência alvo, desenhar os iniciadores, que podem ter de 15 a 30

resíduos de nucleotídeos (bases). É importante lembrar que eles não precisam
ter o mesmo tamanho.

• Os primers deverão ser complementares a sequência alvo, sendo que cada um

deles será desenhado para uma das fitas de DNA (5’-3’)

Síntese de iniciadores (primers) 23

 • O conteúdo ideal de GC do primer pode variar entre 40-60%.

• Para calcular a temperatura de anelamento utilizar a fórmula; Tm = 2 x (A+T) +

[4 x (C+G)].

• A Tm para o par de iniciadores deve ser a mesma, e é importante que ela fique
na faixa de 50 a 60 °C (ideal), embora a faixa possa ser expandida para 45-65
°C, caso seja necessário.

• Caso os dois primers desenhados não tenha a mesma temperatura de anela-

mento, continuar aumentando/diminuindo um dos primers para que os requisi-
tos acima sejam atendidos.
Obs: Repetições de duplas de nucleotídeos (por exemplo, ATATATAT OU
GCGCGCGC) ou de base única (por exemplo, GGGG OU CCCC) devem ser evitadas na
sequência dos iniciadores, pois podem formar grampos, homodímeros e heterodímeros.

ANÁLISE COMPUTACIONAL DOS INICIADORES

A) Verificar o anelamento inespecífico dos iniciadores no genoma

• Entrar no endereço eletrônico do programa Nucleotide BLAST https://blast.ncbi.
nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_
LOC=blasthome

• Colar a sequência de um dos primers e clicar em BLAST.

• Anotar os resultados (print da tela).

• Fazer o mesmo procedimento com o outro primer.

B) Verificar a possibilidade de formação de grampos, homodímeros e

heterodímeros
• Entrar no endereço eletrônico do programa Oligo Analyzer tool https://www.idt-
dna.com/pages/tools/oligoanalyzer e criar login e senha.

• Colar a sequência de um dos primers e clicar em “Hairpin”, anotar os resulta-

dos. Fazer o mesmo procedimento com o segundo primer.

• Colar a sequência de um dos primers e clicar em “Selfdimer”, anotar os resulta-

dos. Fazer o mesmo procedimento com o segundo primer.
Colar a sequência de um dos primers e clicar em “Heterodimer”, colar a sequência
do outro primer na segunda janela e calcular. Anotar os resultados.
Nota: Existem muitos softwares que auxiliam na projeção de iniciadores feitos de
forma automática. As ferramentas recomendadas para essa finalidade são:

• Design NCBI Primer: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

• Primer3: http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

Síntese de iniciadores (primers) 24

 • OligoPerfect Primer Designer: https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-s-
cience/ oligonucleotídeos-primers-probes-genes/custom-dna-oligos/oligo-de-
sign-tools.html.

Após o desenho dos primers, enviar a sequência para síntese

As sequências dos iniciadores devem ser enviadas para as empresas que irão
realizar a síntese, sempre no sentido 5’ → 3’.

• Iniciador direto 5’ → 3’ (Primer forward).

• Iniciador reverso 5’ → 3’ (Primer reverse).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
É esperado que a projeção dos iniciadores atinja todos os requisitos citados
anteriormente, evitando a construção de um primer com pouca ou nenhuma eficiência,
que muitas vezes só será percebido após várias tentativas de padronização da PCR,
desperdiçando tempo e recursos financeiros.
Algumas vezes a reação pode gerar produtos múltiplos e inesperados, como
fragmentos de tamanhos variados que aparecem como uma escada na eletroforese. Esse
resultado ocorre devido ao anelamento inespecífico dos iniciadores, ou seja, eles se ligam
em regiões fora da sequência alvo. Como resultado pode-se também ser observado a
ausência de qualquer produto de amplificação em decorrência do não anelamento dos
iniciadores ao DNA alvo[1].
O programa BLASTn é uma importante ferramenta na busca de primers específicos,
pois ele compara a sequência do primer com as sequências depositadas no banco de dados
e indica a possibilidade de anelamentos inespecíficos em outras sequências parecidas
(famílias gênicas).
Como a interação entre os primers é espontânea (delta G negativo) e vai depender
do conteúdo de cada um dos primers, é importante a utilização do programa Oligo analyzer
para prever as possíveis interações entre eles (homodímeros, heretodímeros, grampos),
evitando a diminuição do rendimento da PCR devido à baixa ligação à sequência alvo.
Os iniciadores obtidos manualmente podem produzir resultados satisfatórios, no
entanto, é recomendável projetá-los utilizando as ferramentas de bioinformática, para
garantir maior confiabilidade.

REFERÊNCIAS
[1] Lorenz, TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization
Strategies. J Vis Exp., (63): p.3998, 2012.

Síntese de iniciadores (primers) 25

[2] Ye J; Coulouris G; Zaretskaya I; Cutcutache I; Rozen S; Madden TL. Primer-BLAST: A tool to design
target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics, 13(134): p.1-11, 2012.

[3] Kubistaa M; Andrade JM; Bengtsson M; Forootan A; Jonáke J; Lind K; Sindelka R; Sjöback R;
Sjögreen B; Strömbom L; Ståhlbergag A; Zorica N. The real-time polymerase chain reaction. Molecular
Aspects of Medicine, 27(2–3): p.95-125, 2006.

[4] Chuang LY; Cheng YH; Yang CH. Specific primer design for the polymerase chain reaction.
Biotechnology Letters, 35: p.1541-1549, 2013.

Links:
Como desenhar primers do zero à PCR:
https://www.youtube.com/watch?v=M5YRPELAE8Y

Desenho de primers para PCR:

https://youtu.be/06hvNWg7yKE

Dicas para o desenho dos primers:

https://youtu.be/OcN6mML3DGI

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4846334/

Aplicação da PCR na área da saúde:

https://www.ted.com/talks/cella_wright_how_do_you_know_if_you_have_a_virus

Síntese de iniciadores (primers) 26

Extração de DNA Humano
OBJETIVO
Realizar a extração do DNA genômico humano a partir de células da mucosa bucal.

INTRODUÇÃO
Em 1869, o Bioquímico suíço Friedrich Miescher, isolou pela primeira vez o DNA
genômico de linfócitos, ao qual chamou nucleína, um material rico em oxigênio, nitrogênio
e fósforo, que foi posteriormente chamado ácido nucleico. Somente em 1929, o Bioquímico
inglês Phoebus Levene revelou que o DNA era composto por bases nitrogenadas (adenina,
guanina, citosina, timina), açúcar e fosfato[1].
A extração e a purificação de ácidos nucleicos a partir de diversas amostras
(bactérias, fungos, tecidos vegetais e tecidos animais) é uma etapa fundamental para o
desenvolvimento de estudos moleculares, incluindo a alta eficiência na amplificação de
segmentos genômicos através da reação em cadeia da polimerase (PCR)[1]. Para cada tipo
de amostra (sangue, tecido, sêmen, bactéria, planta, fungo) vários protocolos de extração
podem ser testados, adaptados e otimizados. Eles podem ser realizados usando kits
comerciais ou mesmo por protocolos caseiros, que podem ser rápidos, práticos, baratos,
livres de contaminação e de toxicidade e, eficazes no que tange à quantidade e qualidade,
dependendo do objetivo desejado[1, 2].
O Processo de extração de DNA inclui basicamente dois procedimentos principais:
a lise, que consiste na ruptura da membrana e liberação do conteúdo e a purificação, que
é a separação do DNA do debri celular ou pellet (mistura da parede/membrana celular e
demais macromoléculas: proteínas, lipídeos, carboidratos). Após a extração as amostras
de DNA podem também ser submetidas a processos de concentração e de purificação, com
a finalidade de se obter amostras mais puras e em maior quantidade[2].
A extração de DNA pode ser feita de várias formas, usando sais, fenol clorofórmio,
resinas, kits, entre outros. A extração de DNA usando a resina chelex 100, é rápida, simples
e de baixo custo. Trata-se de uma resina iônica constituída de polímeros de Estireno-
Divinilbenzeno pareados com íons iminodiacetato que agem como quelantes, por se
ligarem a íons metálicos polivalentes. A resina chelex, é fornecida em diferentes graus de
pureza, sendo que na biologia molecular é normalmente usado a mais pura, a chelex 100.
Uma importante propriedade desta resina é a atração por cátions divalentes como o Ca²⁺,
Mn²⁺ e Mg²⁺, sendo o último cofator da enzima DNAse, prevenindo a degradação do DNA[3].
A extração pode ocorrer em condições neutras ou alcalinas e nestas condições, a resina
apresenta afinidade aumentada por esses cátions. Além disso, as “beads” da resina são
polares e se ligam a componentes celulares polares depois que a célula é lisada, enquanto
o DNA e o RNA permanecem em solução[4, 5].

Extração de DNA Humano 27

MATERIAIS

Reagentes:
1 mL de água deionizada (autoclavada)

200 µL de resina chelex 100

1 Microtubo de 1,5 mL (estéril)

2 Caixas de ponteiras: P100 e P1000

Balde ou lixeira para descarte

Tipo de amostra biológica:

Células da mucosa bucal (swab bucal)

Equipamentos:
Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

Câmara de banho-maria

Centrífuga

Vortex

MÉTODOS

Método de extração pela resina chelex 100

• Transferir 1 mL de água deionizada (autoclavada) para o microtubo de 1,5 mL.

• Raspar com o cotonete (swab) a mucosa bucal, fazendo movimentos circulares

por aproximadamente 1 minuto.

• Colocar a ponta do cotonete dentro do microtubo contendo água deionizada e

rodar por alguns instantes, retirar o cotonete apertando-o contra o microtubo
para coletar o máximo de material possível.

• Agitar o tubo no vórtex rapidamente por 2 vezes.

• Centrifugar a amostra a 13.000 RPM por 5 minutos à temperatura ambiente.

• Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante com o uso da pipeta de 1 mL (P1000)

e descartar no local apropriado, deixando apenas o pellet no fundo do micro-
tubo.

• Aspirar 200 µl da resina chelex 100 e esperar a resina precipitar na extremidade

da ponteira. Em seguida, adicionar 3 a 4 gotas ao pellet da amostra.

• Agitar a amostra em vórtex até ressuspender o pellet.

Extração de DNA Humano 28

 • Incubar a amostra em banho-maria a 56 ºC por 1 hora.

• Agitar no vórtex e em seguida centrifugar a amostra a 15.000 RPM por 3 minu-

tos a temperatura ambiente.

• Realizar a leitura do DNA em espectrofotômetro para verificar a concentração e

pureza da amostra (230, 260, 280 nm).

• Conservar o DNA (amostra) entre 4ºC e - 20ºC.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A extração do DNA é o primeiro passo para a execução de outras técnicas moleculares
e o planejamento do método/protocolo usado, é essencial para garantir o sucesso nas
etapas seguintes [5]. Alguns métodos de extração se destacam pelo rendimento do DNA
extraído, outros pela pureza, outros pelo preço e outros pela praticidade, assim, o protocolo
pode ser escolhido baseado nas etapas subsequentes e também na disponibilidade de
recursos.
A extração pelo método chelex 100 apresentou ótimos resultados quanto a
sensibilidade em testes de PCR, quando comparado com outros métodos de extração,
entretanto, embora apresente alto rendimento é necessário um passo extra para realizar a
purificação da amostra e eliminar contaminantes: proteínas e resina[3, 5].
O DNA, em sua forma original de dupla fita, apresenta alta estabilidade e se mantém
preservado em várias condições: liofilizado, em solução, armazenado a -20 ºC ou no freezer
-80 ºC, podendo ser mantido em laboratório por muitos anos, sem o risco de degradação.

REFERÊNCIAS
[1] Chee Tan S; Yiap Beow Chin. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal
of Biomedicine and Biotechnology: p.1-10, 2009.

[2] Alves EA; Souza DS. Biologia molecular. In: Molinaro EM, Caputo LFG, Amendoeira MRR (org).
Conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratórios de saúde. v.3. Rio de Janeiro:
EPSJV: p.134-185, 2013.

[3] Scorsato AP; Telles JEQ. Fatores que interferem na qualidade do DNA extraído de amostras
biológicas armazenadas em blocos de parafina. J Bras Patol Med Lab., 47(5): p.541-548, 2011.

[4] Barea JÁ; Pardini MIMC; Gushiken T. Extração de DNA de materiais de arquivo e fontes escassas
para utilização em reação de polimerização em cadeia (PCR). Rev Bras Hematol Hemoter., 26(4):
p.274-281, 2004.

[5] Viana GMR; Barbosa DRL; Carmo EL; Peres JMV; Nascimento JMS; Póvoa MM. Comparação entre
dois métodos de obtenção de DNA a serem usados como protocolos alternativos para a detecção de
parasitas humanos causadores de malária por nested PCR. Rev Pan-Amaz Saude v.1 n.2, 2010.

Extração de DNA Humano 29

Links:
Extração de DNA - teoria
https://youtu.be/lYgVH6LmGd0

Protocolo de extração de DNA - parte 1

https://youtu.be/tcPgdR9_t64

Protocolo de extração de DNA - parte 2

https://youtu.be/1PisbDHKXTU

Extração de DNA Humano 30

Precipitação e dosagem de DNA
OBJETIVO
Realizar as técnicas de precipitação e dosagem de DNA, a fim de garantir a máxima
pureza e quantificação do material.

INTRODUÇÃO
O processo de extração do DNA pode ser realizado através de vários protocolos e
aplicado a diversos tipos de amostra, cada um com suas peculiaridades. Alguns tipos de
extração, embora simples e de alto rendimento, podem necessitar de um passo adicional,
de modo a conseguir uma amostra de DNA sem contaminantes[1].
O processo subsequente à extração, usado a fim de garantir a pureza da amostra
é denominado precipitação do DNA, processo que também pode ser realizado usando
diferentes protocolos e reagentes como: etanol, isopropanol, diferentes tipos de sal ou com
fenol[1, 2, 3]. O uso do etanol é o mais amplamente difundido sendo realizado pela primeira
vez visando concentrar ácido nucleico biologicamente ativo por J. Lionel Alloway e descrito
por seu colega Maclyn McCarty em 1985[2].
A precipitação realizada com álcool, na presença de cátions monovalentes,
promove uma transição estrutural na molécula de ácido nucléico, resultando em agregação
e precipitação do material genético [1, 2, 3]. A dosagem do produto obtido na extração do
DNA é essencial o rendimento do processo de precipitação e também para avaliar a
eficácia da precipitação, ou seja, a pureza da amostra. Para isso, é importante o auxílio
de um espectrofotômetro tipo nanodrop para ler de pequenas amostras de DNA (1 µL) nos
cumprimentos de onda: 230 (carboidrato, resina, fenol), 260 (DNA) e 280 (proteínas)[4, 5].
A seguir será descrito o passo-a-passo de como a precipitação do DNA é realizada
a partir de uma metodologia que utiliza o etanol como o agente principal.

MATERIAIS

Reagentes:
10 mL de etanol 100% gelado

5 mL de etanol 70% gelado

1 mL de água Milli-Q autoclavada

1 Microtubo contendo amostra de DNA a ser dosado

2 Microtubos de 1,5 mL

2 Caixas de ponteiras: P10 e P1000

Precipitação e dosagem de DNA 31

 1 Caixa de isopor com gelo

Papel toalha

Descarte

Equipamentos:
Espectrofotômetro

Centrífuga

Nanodrop

Estufa

Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

MÉTODOS

Precipitação do DNA
• Dosar o DNA em espectrofotômetro para quantificar o DNA a ser precipitado
(µg/µL) e verificar as relações 260/230 nm e 260/280 nm apresentadas pela
amostra. Anotar os resultados na Tabela 1.

• Adicionar 1/10 volume de NaAc 3M, pH 5,2 e 3 volumes de etanol absoluto

à amostra a ser precipitada. Misturar por inversão e incubar a -20º C por 20
minutos.

• Decorrido esse intervalo, centrifugar a amostra a 14.000 RPM a 4º C por 10

minutos e descartar o sobrenadante, cuidadosamente, por aspiração com a
pipeta p100.

• Lavar o precipitado com 5 volumes de etanol 75% gelado.

• Centrifugar a 14.000 RPM por 10 minutos a 4º C e descartar o sobrenadante,

como descrito anteriormente. Não deixar nenhuma gotícula, se for necessário
deixar o tubo aberto sobre a bancada para secagem total.

• Ressuspender o DNA em 50 mL H2O Milli-Q.

• Deixar no banho a 37º C por 5 minutos

• Homogeneizar e dosar o DNA em espectrofotômetro para quantificar o DNA

precipitado e verificar as relações: 260/230 nm e 260/280 nm, para confirmar
a pureza.

• Anotar os resultados na Tabela 1.

Dosagem de DNA no nanodrop

Ligar o aparelho nanodrop, abrir o programa (nanodrop 2000) e escolher a opção

Precipitação e dosagem de DNA 32

 ácido nucleico (DNA fita dupla).

Limpar o pedestal com lenço de papel e colocar 1 µL de água. Em seguida, zerar o

aparelho “blank”.

Limpar o pedestal com lenço de papel e colocar 1 µL da amostra homogeneizada

e medir a concentração da amostra “measure” e anotar na Tabela 1. Os valores
de relação 260/280 e 260/230 nm também são fornecidos na leitura e devem ser
anotados para fins de comparação.

Amostra Dosagem Razão Razão Dosagem Razão Razão

µg/µL 260/230 260/280 µg/µL 260/230 260/280
Antes Depois

Tabela 1: Quantificação de DNA por espectrofotometria: antes e após a precipitação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O DNA é comumente solúvel em álcool, porém, na presença de sal, como o NaAc,
o sódio se liga ao fosfato presente na estrutura do DNA, fazendo com que ele precipite.
O etanol absoluto adicionado também auxilia na precipitação do DNA. A adição do etanol
70%, é utilizado para lavagem do DNA, permitindo a solubilização e remoção dos sais
durante a lavagem[3].
Após a retirada do etanol 70% e secagem do tubo, o DNA pode ser ressuspendido
em água e em seguida dosado. É normal acontecer a perda de DNA durante o processo de
precipitação, então, é importante dosar o DNA para verificar a quantidade inicial e a final,
obtida após a precipitação. O processo de precipitação é aplicado com o intuído de obter
uma amostra pura de DNA, e essa pureza pode ser é verificada pela razão 260/280 nm,
260/230 nm, sendo que valores inferiores a 1,8 são referentes a resultados de amostras
contaminadas com proteínas, carboidratos, resina, etc[4, 5].

REFERÊNCIAS
[1] Oliveira, MCDS; Regitano, LCA; Roese, AD; Anthonisen, DG; Patrocínio, E, Parma; MM, Scagliusi;
SMM, Timóteo; WHB and Jardim, SN. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de
amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase. EMBRAPA. Disponível
em: <https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf>, 2007.

Precipitação e dosagem de DNA 33

[2] McCarty M. The transforming principle: Discovering that genes are made of DNA. Norton, 1985.

[3] Green MR; Sambrook J. Precipitation of DNA with Ethanol. Cold Spring Harb Protoc. 1; (12), 2016.

[4] Lucena-Aguilar G; Sánchez-López AM; Barberán-Aceituno C; Carrillo-Ávila JÁ; López-Guerrero

JÁ; Aguilar-Quesada R. DNA Source Selection for Downstream Applications Based on DNA Quality
Indicators Analysis. Biopreserv Biobank. 14(4): p.264–270, 2016.

[5] García-Alegría AM; Anduro-Corona I; Pérez-Martínez CJ; Corella-Madueño MAG; Rascón-

Durán ML; Astiazaran-Garci H. Quantification of DNA through the NanoDrop Spectrophotometer:
Methodological Validation Using Standard Reference Material and Sprague Dawley Rat and Human
DNA. Int J Anal Chem. 2020: 8896738, 2020.

Links:
Como precipitar o DNA
https://youtu.be/3T5DVW-lfT8

Medindo a concentração do DNA (NanoDrop):

https://youtu.be/y3ICiycWeCA

NanoDrop: microvolume na quantificação de ácido nucleico:

https://youtu.be/FiGZnNs2xXY

Precipitação e dosagem de DNA 34

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
OBJETIVO
Realizar a amplificação do DNA de interesse.

INTRODUÇÃO
Descrita pela primeira vez em 1985 por Mullis e colaboradores, a reação em cadeia
da DNA Polimerase, comumente conhecida por sua abreviação em inglês ‘PCR’, é uma
tecnologia simples usada para amplificar in vitro sequências de DNA, a partir de iniciadores
específicos para a sequência alvo[1]. Essa metodologia se baseia no princípio de replicação
enzimática dos ácidos nucleicos[2] e consiste no uso da enzima DNA polimerase derivada de
bactérias termostáveis (Thermus aquaticus). A termoestabilidade da Taq DNA polimerase é
indispensável para a sua atividade nos ciclos repetidos de desnaturação e renaturação em
altas temperaturas, os quais são submetidos aos reagentes da PCR[1].
A amplificação do DNA através da PCR usa como reagentes: i) os primers, que são
oligonucleotídeos que geram especificidade à reação e fornecem as extremidades 3´OH
livres para que a DNA polimerase possa fazer a extensão da cadeia, ii) os dNTPs, que
são os desoxinucleotídeos que irão compor os fragmentos a serem amplificados (A, C, G,
T), iii) o Mg2+, cátion divalente requerido para a atividade da enzima termoestável, iv) um
tampão para manter o pH da reação e v) um molde de DNA, contendo a sequência-alvo
da amplificação[3].
A reação de PCR ocorre em três fases, chamadas de: desnaturação, anelamento
e extensão, todas acontecem em um equipamento chamado termociclador. Na primeira
fase, a amostra é aquecida a 95 ̊C, quando a energia térmica é suficiente para superar a
ligação de hidrogênio entre os pares de base complementares nas duas fitas de DNA, o
que leva à separação e abertura da dupla fita. Na segunda etapa, chamada anelamento,
a amostra é resfriada entre 37 ̊C e 70 ̊C, temperaturas nas quais os primers se ligam
aos seus sítios complementares na fita simples da molécula de DNA. Em sequência, a
terceira fase é a extensão, a temperatura é elevada a 72 ̊C e a Taq polimerase começa a
sintetizar as novas sequências direcionadas da extremidade 5’ a 3’. No final de cada ciclo,
os fragmentos recém-sintetizados servem de modelo para a reação subsequente, o que
resulta na acumulação exponencial do DNA[1].

MATERIAIS

Reagentes:
1 Alíquota da enzima Taq DNA polimerase (0.5 μL/reação)

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 35

 2 Alíquotas dos primers específicos: foward e reverse (estoque 10 μM = 10 pmol/μL)

1 Alíquota do mix de dNTPs (estoque 1 mM)

1 Alíquota do tampão de reação 10X (100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 500 mM KCl)

1 Alíquota de MgCl2 (estoque 50 mM)

1 Alíquota de água Milli-Q (autoclavada)

1 Alíquota de DNA (100 ng/μL)

2 Caixas de ponteiras: P10 e P100

Microtubos de 200 μL

Balde de descarte

Equipamentos:
Conjunto de micropipetas de P10 e P100

1 Termociclador

Sequência dos Iniciadores usados:

F: 5’- GGATCCAGACCCCCACAGTTTACGAG – 3’ TM=59.06º C

R: 5’- CTCGAGGATGGTGGTATCCAGGTGAAC – 3’ TM= 59.1º

MÉTODOS

Preparo do pré-mix
É extremamente importante que exista no laboratório uma área específica para a
manipulação dos reagentes da PCR. Ela deve ser mantida limpa e livre de qualquer fonte
de contaminação e para isto, alguns cuidados especiais devem ser tomados:

1 - O operador deve usar sempre avental limpo e luvas novas e estéreis.

2- Todo material usado deve ser livre de DNases e RNases.

3 - Não manipular material amplificado nesse ambiente.

Antes de Iniciar a PCR

• Antes de dar início à prática, fazer os cálculos referentes aos volumes dos rea-
gentes a serem pipetados, usando as concentrações dos estoques descritas
em “Materiais”, e concentrações de uso, descritas abaixo. Usar a Tabela 1.
A reação deverá ter um volume final de 20 μL.

• Primers: na concentração final = 1 μM

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 36

 • dNTP: na concentração final = 0,2 mM

• Tampão: na concentração final 1X

• MgCl2: na concentração final= 2,5 mM

• Enzima Taq: 0,5 ui (0.5 μl)

• DNA: concentração final = 10 a 100 ng/μL

• Após os cálculos, colocar todos os tubos dos reagentes a serem usados no

gelo.

• Pipetar no fundo do tubo de 200 μL os reagentes na seguinte ordem: Primers,

dNTP, Tampão, MgCl2, DNA e enzima, totalizando um volume final de 20 μL.

• Colocar o tubo contendo a reação no gelo.

• Centrifugar por aproximadamente 10 segundos e coloca-los novamente no gelo.

• Programar o termociclador (ver abaixo) e colocar os tubos na máquina.

• Iniciar a corrida (run).

Concentração Concentração
Reagente Volume
Estoque Final
Primer 1 10 μM 1 μM

Primer 2 10 μM 1 μM

dNTP 1mM 0,2 mM

Tampão 10X 1X

MgCl2 50 mM 2,5 mM

Água - -

Taq DNA
0.5 µL 0.5 µL
Polimerase

DNA 100 ng/ µL 10- 100 ng

Volume final 20 μL

Tabela 1: Cálculo dos reagentes usados na PCR.

Termociclagem
• Programar o termociclador com as condições de PCR apropriadas para cada
par de primers:

1º Passo: Desnaturação inicial - 94 ºC por 10 minutos

2º Passo: Desnaturação - 94 ºC por 1 minuto

3º Passo: Anelamento- 59 ºC por 1 minuto

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 37

 4º Passo: Extensão- 72 ºC por 2 minutos

5º Passo: Voltar ao passo 2 x 30 vezes

6º Passo: Extensão final: 72 ºC por 10 minutos

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O resultado final de múltiplos ciclos é o acúmulo exponencial de um fragmento
específico. Visto que os primers são incorporados ao produto final da amplificação e que a
inserção de sequências específicas no início ou final do primer não alteram a amplificação,
novas informações, como sítios de enzimas de restrição, podem ser incorporadas ao produto
final. Através da PCR é possível detectar: polimorfismos genéticos, mutações pontuais,
deleções, inserções e até mesmo amplificar sequências de interesse para a clonagem em
vetores de expressão, para produzir proteínas heterólogas.
Alguns problemas podem ocorrer durante a PCR, como: erros de pipetagem,
contaminação, ou mesmo não amplificação. Assim, fazer os controles da reação de PCR
é extremamente importante para e entender os resultados obtidos na PCR. O controle
negativo informará a existência de contaminação e o positivo a eficiência da técnica[1, 2, 3].

REFERÊNCIAS
[1] Rameshi, R; Munshi, A; Panda, SK. Polymerase chain reaction. The National Medical Journal of
India, Vol.5, No.3, 1992.

[2] Staněk, L. Polymerázová řetězová reakce: princip metody a využití v molekulární patologii.
Polymerase chain reaction: basic principles and applications in molecular pathology. Cesk Patol., 49(3):
p.119-21, 2013.

[3] Green, MR; Sambrook, J. Polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Protoc. 1; (12), 2016.

Links:
PCR - Conceito e etapas:
https://youtu.be/tYY9B1_Crqs

PCR - Amplificação de fragmentos de DNA:

https://youtu.be/iARqzqU9rhw

PCR - Aplicação da técnica

hhttps://youtu.be/s7dZw_WOGAA

Animação 3D:
https://youtu.be/5YlfZwzRPa4

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 38

Rotina de uma reação de PCR:
https://youtu.be/rn40R5w5Fkw

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 39

Digestão enzimática
OBJETIVOS
Realizar uma reação de digestão enzimática dupla para retirar um inserto de um
plasmídeo circular.

INTRODUÇÃO
No início da década de 1950 alguns estudos foram publicados com intuito de relatar
a resistência de algumas cepas bacterianas contra infecções por bacteriófagos[1]. No ano
de 1971 os pesquisadores Kathleen Danna e Daniel Nathans mostraram pela primeira vez
que a enconuclease R (KpnI) isolada de Klebsiella pneumoniae possuía a capacidade de
cortar o DNA do vírus símio 40 (SV40), produzindo fragmentos específicos e de forma
reprodutível, ou seja, sempre com o mesmo padrão de fragmentos[5]. Esse mecanismo foi
mais tarde descrito como uma forma de defesa do hospedeiro contra material genético
exógeno, atuando de forma a fragmentar o material genético do invasor e restringindo sua
entrada, daí o termo enzimas de restrição[1].
As enzimas de restrição, também conhecidas como endonucleases de restrição,
são proteínas que reconhecem sequências de DNA curtas, específicas e frequentemente
palindrômicas. Essas sequências são compostas por 4 – 6 nucleotídeos, que são clivadas
dentro do sítio de restrição ou adjacentes às suas sequências de reconhecimento (pontas
cegas ou coesivas)[2]. Há quatro classes de enzimas de restrição, sendo que as pertencentes
à classe II são as mais utilizadas na área da biologia molecular, elas necessitam de Mg2+
para atuarem. As endonucleases do tipo I, III e IV são menos empregadas devido à baixa
especificidade de corte, realizado distante do sítio de restrição e, porque, geralmente, essa
reação é dependente de ATP[1].
As enzimas de restrição ficaram conhecidas como tesouras moleculares e sua
descoberta proporcionou um avanço significativo no desenvolvimento da tecnologia do DNA
recombinante. Essas tesouras moleculares permitiram a clonagem de fragmentos do DNA
de um organismo em plasmídeos, que foram inseridos em outros organismos (hospedeiro),
criando na biologia molecular uma gama de possibilidades. A descoberta de que o DNA
de diferentes espécies podiam ser clonados e propagados em outras espécies, marcou o
início da clonagem dos genes e expressão de proteínas recombinantes, tendo a insulina
humana, ganhado destaque naquela época[2, 3, 4]
Além da clonagem, as enzimas de restrição têm sido muito utilizadas em diversas
técnicas moleculares como: diagnóstico molecular, mapeamento, manipulação do DNA
recombinante, análise de polimorfismos, entre outros. Ao utilizar diferentes combinações
de enzimas de restrição, há muitas maneiras possíveis de caracterizar e manipular o DNA[1].

Digestão enzimática 40
MATERIAIS

Reagentes:
Aliquota das enzimas de restrição que serão utilizadas para a digestão dupla (ex:
BamHI e HindIII).

Alíquota de Plasmídeo (pUC18, pET21, pET28) 100 a 1000 µg/ µL

Tampão das enzimas (10X)

Aliquota de BSA

Água Milli-Q

2 Caixas ponteiras: P10 e P100

Gases de algodão

Microtubos 500 μL

Parafilme

Manual das enzimas de restrição

Equipamentos:
Espectrofotômetro Nanodrop

Conjunto de micropipetas de P10 e P100

Banho-maria

Rack estante termoestável para microtubos (ou um suporte com gelo para os
microtubos).

MÉTODOS

Digestão enzimática dupla (utilização de duas enzimas de restrição):

• Ao escolher as enzimas a serem usadas, verificar se não existe sítio de restri-
ção dentro do inserto.

• Após selecionadas as enzimas, verificar no manual do fabricante as condições

ideais de reação para cada enzima. Verificar o tampão indicado, a temperatura
da reação, o tempo de reação e concentrações indicadas.

• Escolher um tampão em que as duas enzimas funcionem com maior eficácia,

simultaneamente. Dê preferência para enzimas da mesma marca/fabricante
(tampões universais)

• Descongelar a amostra contendo o plasmídeo e colocá-la no gelo juntamente

com os demais reagentes.

Digestão enzimática 41
 • Dosar a amostra de DNA usando espectrofotômetro (260 nm)

• Ligar o banho-maria e programá-lo para a temperatura de 37 ºC.

• Fazer os cálculos da quantidade de cada reagente a ser usado, em volume final

de 20 μL de reação. Anotar na Tabela 1.

• Pipetar todos os reagentes da reação em um microtubo de 500 μL. Deixar sem-

pre a enzima por último.

• Fechar o microtubo e passar parafilme para evitar a evaporação da amostra.

• Incubar a reação por 3 horas à 37 ºC.

Reagentes Volumes

Água milli-Q estéril

Tampão 10X

Enzima 1

Enzima 2

DNA (μg/μL)

Volume Final 20 μL

Tabela 1: Reação de digestão enzimática.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A nomenclatura das enzimas de restrição deriva do nome científico da espécie onde
é extraída seguido da sua ordem de isolamento. Por exemplo, a enzima EcoRI, é a primeira
endonuclease a ser isolada da estirpe R da bactéria Escherichia coli[5].
As enzimas de restrição devem ser selecionadas considerando a sequência do
inserto a ser clonado, do plasmídeo que receberá o inserto (sítio múltiplo de clonagem) e o
propósito (subclonagem em outro vetor). Após o planejamento e execução da digestão dupla
é esperado que o inserto de interesse seja retirado do plasmídeo de origem. Entretanto,
em algumas condições, algumas enzimas podem cortar o DNA em locais inespecíficos,
ou seja, em sequências diferentes do seu sítio de restrição. O nome deste fenômeno é
“atividade estrela” (star activity) e acontece quando a reação de digestão do DNA não
segue as condições consideradas ótimas para o funcionamento da enzima, descritos pelo
fabricante.
A digestão do DNA será avaliada através de eletroforese em gel de acrilamida ou
agarose, sendo que a escolha do gel irá depender do tamanho dos fragmentos esperados
na reação. Para confirmar a digestão, é importante aplicar no gel a mesma amostra, não
digerida (controle negativo) e ao padrão de peso molecular.

Digestão enzimática 42
REFERÊNCIAS
[1] Felice FD; Micheli G; Camilloni G. Restriction enzymes and their use in molecular biology: An
overview. J Biosci, v. 44, n. 38: p.1-8, 2019.

[2] Bennett SP; Halford SE. Recognition of DNA by Type II Restriction Enzymes. Current Topics in
Cellular Regulation, v. 30, n. 1: p.57-104, 1989.

[3] Celie PHN; Parret AHA; Perrakis A. Recombinant cloning strategies for protein expression. Current
Opinion in Structural Biology, v. 38, n. 1: p.145-154, 2016.

[4] Vajo O; Fawcett J; Duckworth WC. Recombinant DNA Technology in the Treatment of Diabetes:
Insulin Analogs. Endocrine Reviews, v. 22, n. 5: p.706-717, 2001.

[5] Roberts, RJ; et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing
endonucleases and their genes. Nucleic Acids Research, v. 37, n. 7: p.1805-1812, 2005.

Links:
Enzimas de restrição do DNA
https://www.youtube.com/watch?v=jCThfx-7tnM

Enzimas de restrição - Análise da reação em eletroforese

https://www.youtube.com/watch?v=8yqEEyjgais

Utilização de enzimas de restrição para clonagem de DNA

https://www.youtube.com/watch?v=EDF_T0t7gN0&t=171s

Digestão enzimática 43
Clonagem em plasmídeo
OBJETIVO
Promover a ligação do inserto ao plasmídeo pET-21a (+).

INTRODUÇÃO
A clonagem molecular é uma técnica da engenharia genética também conhecida
como tecnologia do DNA recombinante, clonagem gênica ou manipulação gênica. Esta
tecnologia permite combinar partes ou sequências distintas de DNA, incluindo aquelas
provenientes de organismos distintos, sendo capaz de produzir várias cópias dessas
combinações genéticas. A tecnologia do DNA recombinante (rDNA) foi realizada pela
primeira vez por Paul Berg, professor da Stanford University (USA), em 1972. A descoberta
veio quando Berg utilizou enzimas de restrição e uma DNA ligase para criar a primeira
molécula de DNA recombinante, resultando em um Prêmio Nobel em Química no ano de
1980 [1, 2].
Para ter sucesso na clonagem gênica, é importante ter em mente a finalidade do
experimento, para que os materiais e estratégias sejam planejadas adequadamente.
Por exemplo, um vetor de expressão bacteriano pode ser utilizado para expressar uma
proteína humana em bactérias, entretanto, não terá sucesso se o hospedeiro for uma célula
eucariota.
Existem quatro tipos de vetores de clonagem: i) o plasmídeo, ii) os fagos, iii) os
cosmídeos e iv) os YAC’s e BAC’s (yeast/bacterial artificial chromossomes). Esses vetores
se diferem no tamanho do fragmento de DNA que conseguem incorporar, na capacidade
de expressar em determinados tipos celulares e no tempo de expressão. O mapa do vetor
contendo a localização do promotor, dos sítios de restrição/sítio múltiplo de clonagem,
do marcador de resistência à antibiótico ou gene repórter, devem ser cuidadosamente
analisados antes de iniciar o experimento (Figura 1)[ 3].
Um ponto que deve ser considerado, juntamente com a escolha do vetor, é a célula
escolhida para realizar a expressão gênica. O vetor e o hospedeiro estão intimamente
ligados, principalmente pelo promotor presente no vetor que só responde a determinados
tipos de células. Portanto, se o vetor não corresponder ao tipo celular escolhido, a expressão
gênica pode não ocorrer.
De posse do vetor e inserto, o próximo passo da clonagem gênica é a ligação,
reação executada pela enzima ligase. Essa enzima é extremamente importante para as
células, pois está envolvida na replicação celular (junção dos fragmentos de Okazaki) e
no sistema de Reparo (atua em quebras de fita simples/dupla unindo as cadeias). Essa
enzima forma duas ligações fosfodiéster covalentes entre a extremidade 3’ hidroxila de
um nucleotídeo (“recetor”) com a extremidade 5’ fosfato de outro nucleotídeo (“dador”),

Clonagem em plasmídeo 44
na presença de energia fornecida pelo ATP. Assim, as extremidades coesivas de dois
fragmentos de DNA, obtidos por ação de enzimas de restrição, tendem a emparelhar
devido à complementaridade das bases, e a ligação dos fragmentos é feita pela ação da
ligase do DNA[3, 4, 5].

Figura 1: Mapa do vetor de Expressão pET21a. Addgene: pET-21a(+)-IS200.

MATERIAIS
100 ng de vetor

50 ng de inserto

1 µL de tampão 10X (DNA ligase)

0,1 - 1 µL T4 DNA ligase

10 µL de água Milli-Q estéril

1 Microtubo de 0,2 mL

2 Caixas de ponteiras:P10 e P200

1 Descarte

Equipamentos:
Termociclador ou banho-maria

Centrífuga

Conjunto de micropipetas de P10 e P100

Clonagem em plasmídeo 45
METODOLOGIA
• - Dosar o veto e o plasmídeo a ser usado na prática (260 nm)

• - Fazer o cálculo da quantidade de reagentes a ser adicionar na reação. Usar

a fórmula abaixo.

Obs1: A quantidade sugerida é de 1:3 de vetor : inserto, essa quantidade varia

conforme o tamanho do vetor e do inserto. Alguns autores recomendam adicionar uma
quantidade de inserto maior que a do vetor, pois existe uma baixa probabilidade de ligação
do inserto ao vetor [3]
. A fórmula ilustra a conversão de razão molar em razões de massa,
para saber a quantidade de inserto a ser adicionado.
Obs2: Como modelo será usado um vetor de 3 Kb e um inserto de 0,5 Kb. Reações
de ligação usam de 100 a 200 ng de vetor, nesta prática será usado 100 ng de vetor[4].

• Adicionar os reagentes ao microtubo de 0,2 mL, seguindo as quantidades des-

critas na Tabela 1. O Volume final da ligação será de 10 µL.

Reagente Quantidade
Vetor de DNA 100 ng
Inserto 50 ng
Tampão Ligase (10X) 1 µL
T4 DNA Ligase 0,1- 1 µL
Água Milli-Q Completar para 10 µL
Tabela 1: Cálculo dos reagentes usados na ligação.

• Incubar a reação em um termociclador ou banho usando uma das seguintes

condições abaixo:

1- Por 3 horas à temperatura ambiente.

2- Por 16 a18 horas à temperatura de 4 °C.

3- Por 4 a 18 horas à temperatura de 15 °C.

• Decorrido o intervalo, proceder à eletroporação das células hospedeiras de in-

teresse com o produto de ligação.

Clonagem em plasmídeo 46
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O marco científico da clonagem e expressão heteróloga bem sucedida foi
representada pela produção da insulina recombinante no ano de 1977, que promoveu o
tratamento de pacientes diabéticos[3, 4, 5].
A prática da clonagem gênica usa como produtos provenientes de outras práticas:
1-síntese de primers, 2- extração do DNA genômico, 3-PCR, digestão enzimática do
inserto e do plasmídeo e por fim, 4- a ligação. Aqui, os produtos da digestão enzimática
dupla, tanto do plasmídeo quanto do produto de PCR (inserto), foram ligados de forma
unidirecional, na presença da enzima DNA ligase. Essa enzima permitiu o pareamento
dos fragmentos digeridos e a reconstrução das ligações fosfodiéster entre as duas fitas
de DNA utilizando a energia liberada pelo ATP. Essa união forma o que chamamos DNA
recombinante. Nos passos seguintes veremos como ocorre a inserção deste DNA dentro
de uma célula hospedeira, no processo de eletroporação [6, 7, 8]
.
O sucesso da reação de ligação depende da adição dos reagentes nas concentrações
e volumes corretos, visto que o funcionamento da DNA ligase depende diretamente da
sua concentração, da concentração de ATP, do tamanho e coesão dos fragmentos, da
temperatura, e por fim, do pH da reação, que deve estar entre 7,8 e 8,0. Outros fatores
responsáveis pelo insucesso da reação podem estar relacionados a complementariedade
das extremidades do vetor e a sucessivos descongelamentos do tampão de ligação que
contém ATP, devido às cargas negativas dos grupos fosfatos em pHs entre 5 e 8. Essas
cargas negativas geram repulsão dentro da própria molécula de ATP e com uma certa
sequência de descongelamentos pode resultar na sua degradação[9].
Vários vetores estão disponíveis no mercado para expressão de proteínas
recombinantes em diferentes hospedeiros. A Escherichia coli é um modelo padronizado
em muitos laboratórios devido à praticidade do crescimento dessa célula, entretanto, é
importante lembrar que essa célula não faz modificações pós traducionais. Os plasmídeos
mais comuns para expressão heteróloga nesse modelo são os da série pET (plasmid for
expression by T7 RNA polimerase) que também apresentam marcadores de resistência a
antibióticos, como a ampicilina.

REFERÊNCIAS
[1] Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante. KASVI, 2017. Disponível em: <https://
kasvi.com.br/clonagem-molecular-dna-recombinante/>. Acesso em: 08 de outubro de 2021.

[2] ARAGÃO F. A trajetória dos organismos transgênicos. EMBRAPA. Disponível em: <https://www.
embrapa.br/olhares-para-2030/artigo/-/asset_publisher/SNN1QE9zUPS2/content/francisco-jose-lima-
aragao?inheritRedirect=true>. Acesso em: 08 de outubro de 2021.

Clonagem em plasmídeo 47
[3] Vedoneli NCPS; CASTRO VP. Manual de Construção de Vetores de Expressão. Universidade De
São Paulo. Ribeirão preto, 2016.

[4] T4 DNA Ligase Protocol. Promega Corporation, 2018.

[5] Siqueira FF. Caracterização molecular, clonagem e expressão de isoformas da toxina alfa de
Clostridium perfringens e sua aplicação na imunização de animais. Tese (Doutorado em Genética) -
Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, p.42, 2013.

[6] Molinaro EM; Caputo LFG; Amendoeira MRR. (Org.). Conceitos e métodos para a formação de
profissionais em laboratórios de saúde. v. 3. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2013.

[7] College O. Biology. Houston: OpenStax, Cnx Biology, 2012.

[8] Pascal J.M. DNA and RNA ligases: structural variations and shared mechanisms. Current Opinion in
Structural Biology. Epub, 18(1): p.96-105, Feb, 2008.

[9] Chauhan T. What is DNA Ligase? And How T4 DNA Ligase Works? Genetic Education, 2019.
Disponível em:<https://geneticeducation.co.in/what-is-dna-ligase-and-how-t4-dna-ligase-works/#The_
function_of_DNA_ligase_in_recombinant_DNA_technology>. Acesso em: 08 de janeiro de 2022.

Links:
Clonagem de DNA e DNA recombinante
https://youtu.be/EDF_T0t7gN0

Clonagem em plasmídeo 48
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA NÃO
DESNATURANTE E COLORAÇÃO

OBJETIVO
Desenvolver habilidades quanto ao preparo do gel de acrilamida, montagem da
cuba, realização da eletroforese e revelação do gel através da coloração por prata.

INTRODUÇÃO
A eletroforese em gel é uma técnica bioquímica para separação de moléculas com
base na sua carga elétrica e peso molecular. A separação de partículas utilizando a carga
elétrica foi proposta por Tiselius em 1937, mas só foi aplicada para separação de DNA em
meados dos anos 60 por Vin Thorne[1, 4].
Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) são exemplos de moléculas que possuem carga
elétrica (negativa), devido à presença do grupo fosfato na molécula. Essa característica é
usada para impulsionar a migração destas moléculas através de um gel utilizando corrente
elétrica e pode separá-las conforme o tamanho. Uma vez isolado o fragmento de DNA
de interesse, ele pode ser utilizado para diversos propósitos: PCR, clonagem, digestão
enzimática, sequenciamento, etc[1, 2].
O gel de eletroforese pode ser obtido usando diferentes reagentes que formam
malhas, dentre eles os mais usados são a acrilamida e a agarose. A acrilamida é um dos
principais e mais versáteis materiais para a produção do gel eletroforético. A reação de
ligação entre a molécula linear de acrilamida a uma molécula ramificada da bisacrilamida
é capaz de gerar uma malha fina o suficiente para apresentar resistência à passagem das
moléculas de DNA. A polimerização da mistura de acrilamida é conseguida pela adição de
persulfato de amônio, que vai ceder o átomo de enxofre que se posicionará na junção entre
as moléculas de acrilamida na formação do polímero. Essa reação é catalisada pela adição
do Temed (N,N,N′,N′-Tetrametiletilenodiamina), tudo sempre na presença do tampão TBE
(Tris borato EDTA)[2].
A concentração de acrilamida total para a produção do gel pode ser alterada de
acordo com a faixa de tamanho do DNA de interesse, de forma que a malha fique mais ou
menos fina (Tabela 1). A eletroforese também pode ser realizada no modo desnaturante,
com a adição de componentes como ureia e formamida, que vão manter o DNA em fita
simples durante a eletroforese[2].

Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e coloração 49

Concentração Bis Acrilamida Água TBE 5X Persulfato de
Temed
do Gel % 29:1 (mL) (mL) (mL) Amônia 10%
(μL)
(μL)
3,5 11,6 67,7 20 700 30,5
5 16,6 62,7 20 700 30,5
8 26,6 52,7 20 700 30,5
12 40 39,3 20 700 30,5
20 66,6 12,7 20 700 30,5
Tabela 1: Lista de soluções e proporção de mistura para o preparo do gel de acrilamida em
diferentes concentrações (para 100 mL).

O conhecimento prévio da amostra também vai auxiliar na escolha do padrão de

peso molecular, que é uma amostra contendo fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.
Eles são vendidos comercialmente e vem acompanhados de um mapa de migração dos
fragmentos presentes. Esse padrão deve ser aplicado no gel, ao lado das amostras de
estudo e, a distância de migração dos seus fragmentos são comparados aos da amostra
de interesse, permitindo estimar o tamanho aproximado das bandas da amostra. O seu uso
também permite, em alguns casos, fazer uma estimativa da concentração do DNA presente
na amostra de estudo, através da comparação da intensidade de brilho das bandas do
padrão e da amostra desconhecida (Figura 1).

Figura 1: Mapa do Padrão de Peso Molecular 1Kb DNA Ladder RTU da empresa Simply®.
Perfil eletroforético de um padrão de peso molecular mostrando o padrão migratório de
fragmentos de diferentes tamanhos pontuados à direita (base pair: pares de base), e bandas
de diferentes intensidades relacionadas com a concentração de cada fragmento pontuado à
esquerda (DNA mass: massa de DNA).

Visto que o gel está polimerizado entre placas de vidro com aparato (pente) para

Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e coloração 50

formação das canaletas, ele é mergulhado em uma cuba eletroforética, contendo tampão
de corrida TBE (Tris borato EDTA). Em seguida, prossegue a aplicação das amostras e,
para garantir que o DNA em solução aquosa alcance o fundo da canaleta preenchida pelo
tampão de corrida, a amostra deve ser misturada ao chamado tampão de carregamento.
Este contém glicerol, um reagente com alta densidade, o que permite com que o DNA seja
carregado para o fundo do poço. Além disso, esse tampão possui corantes específicos,
que vão auxiliar no acompanhamento da migração das amostras pelo gel. Os corantes
presentes no tampão de amostra também migram pelo gel no mesmo sentido do DNA,
porém podem ser observados a olho nu durante o experimento. Os corantes mais usados
são azul de bromofenol e xileno cianol (Tabela 2).

Tamanho dos
Concentração do Azul de Bromofenol Xileno Cianol
fragmentos separados
Gel (%) (pb) (pb)
(pb)
3,5 100 a 1000 100 460
5,0 100 a 500 65 260
8,0 60 a 400 45 160
12,0 50 a 200 20 70
15,0 30 a 150 15 60
20,0 5 a 100 12 45
Tabela 2: Migração dos corantes Azul de Bromofenol e Xileno Cianol em diferentes
concentrações de géis de poliacrilamida não desnaturante.

O experimento eletroforético é então realizado através da aplicação de uma voltagem
específica, que é diretamente responsável pela velocidade de migração. Voltagens em
média de 80 a 120 V são recomendadas na eletroforese em poliacrilamida.
Após a finalização da corrida, a posição do(s) fragmento(s) de DNA no gel precisa
ser revelada. Para isto é usada a coloração por prata, um reagente com alta sensibilidade,
que consegue marcar o DNA presente no gel, mesmo que este esteja em concentrações
muito baixas. A coloração por prata é um método de simples execução, em que são usadas
três soluções específicas para tratar o gel: 1) a solução fixadora, que é responsável por
estabilizar o DNA e evitar sua dispersão pelo gel; 2) a solução corante, que contém os
íons de prata, responsáveis por se ligar no DNA e por fim 3) a solução reveladora, que
possui formaldeído na sua composição e promove a oxidação dos íons de prata ligados
ao DNA. Nessa etapa ocorre a revelação do gel, com o aparecimento de regiões escuras
correspondentes às bandas/fragmentos de DNA[3].

Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e coloração 51

MATERIAIS

Reagentes:
3 mL de Bis acrilamida 29:1

10 mL de Água deionizada

70 µL de Persulfato de amônio

4 µL Temed

2 mL de TBE 5X (tampão de corrida)

1 L de TBE 1X

1 mL Tampão de carregamento (tampão de amostra)

1 rolo de Parafilme

1 Tubo tipo Falcon de 50 mL

10 µL de Padrão de DNA 100 pb ou 1 Kb

1 Lixeira para descarte

3 Caixas de ponteiras: P10, P100 e P1000

Equipamentos:
Cuba vertical com placas, pentes, espaçadores e fios

Fonte de eletroforese

Transiluminador

Computador para programa captura da imagem

Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

Agitador de placa

SOLUÇÕES

Acrilamida 29:1 (bis acrilamida)

145 g de Acrilamida

5 g de Bis-acrilamida

Água qsp 500 mL

TBE 5X
54 g de Tris base

Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e coloração 52

 27,5 g de Ácido bórico

3,72 g de EDTA

Água qsp 1000 mL

Ajustar pH para 8,3

Soluções coloração do gel

250 mL de solução fixadora (10% de etanol, 0,5% de ácido acético);

250 mL de solução com prata (0,5 g de nitrato de prata para 250 ml de solução
fixadora)

250 mL de solução de revelação (3% NaOH, 0,5% formaldeído)

MÉTODOS

Preparação do Gel e Corrida

• Preparar as placas e a cuba onde será realizada a corrida, verificar a espessura
dos pentes e espaçadores, eles devem ser compatíveis.

• Preparar 10 mL de solução para gel a 8% de bisacrilamida, seguindo as indi-

cações contidas na Tabela 3, adicionar os reagentes em um Falcon de 50 mL,
exceto o Temed, que deverá ser colocado por último.

10 mL de gel 8%
2,66 mL de bisacrilamida
5,27 mL de água
2 mL de TBE5X
70 μL de Persulfato de amônia
4,0 μL de Temed
Tabela 3: Protocolo para produção de 10 mL de gel de poliacrilamida 8%.

• Adicionar o Temed quando a cuba e os aparatos de gel estiverem prontos para

receber o gel.

• Colocar a solução na placa e em seguida colocar os pentes.

• Aguardar aproximadamente 15 a 30 minutos para a polimerização do gel.

• Colocar o gel na cuba, posicionando adequadamente para evitar vazamento e

para a passagem adequada da corrente elétrica.

• Adicionar TBE 1X, para preencher a cuba.

• Fazer o mapa da placa, com o posicionamento das amostras.

Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e coloração 53

 • Colocar padrão de peso molecular 100 pb ou 1 Kb em uma das canaletas (pri-
meira ou última).

• Misturar a amostra ao tampão de carregamento 6X e em seguida aplicar na

canaleta.

• Após a aplicação de todas as amostras, o sistema deve ser fechado e os fios

ligados aos polos corretos, na cuba e na fonte.

• Programar a corrida na fonte. Correr o gel a 80 volts por aproximadamente 1h

e 30 min.

• Decorrido o intervalo, retirar o gel da cuba e proceder à coloração pelo método

da prata.

Procedimento de coloração pela prata:

• Colocar o gel em solução fixadora por 15 minutos sob agitação.

• Retirar a solução fixadora.

• Adicionar solução de prata e deixar por 10 minutos sob agitação.

• Decorrido este intervalo, retirar a solução de prata. Cuidado ao manusear o gel,

pois ele pode manchar.

• Lavar 2 vezes com água destilada.

• Adicionar a solução de revelação e agitar por 10 minutos ou até aparecerem

as bandas.

• Retirar da solução reveladora e levar o gel ao aparelho transiluminador para

capturar a imagem.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A primeira observação que deve ser feita com a coloração em prata é a aparição
das bandas do padrão seguido pela aparição das bandas da amostra. A coloração de prata
marcou sua amostra com intensidade suficiente para análise? Deve-se analisar o padrão
de bandas da amostra com o conhecimento prévio da amostra. As bandas do padrão se
separaram o suficiente para permitir distinção entre elas com qualidade? Uma corrida mais
extensa pode ajudar na separação das bandas que vai facilitar a validação do resultado, por
outro lado, a aplicação de alta voltagem pode elevar muito a temperatura de todo sistema,
o que gera deformidades na migração do DNA pelo gel. Quantas bandas foram observadas
na amostra? A coloração de prata é capaz de marcar DNA em baixas concentrações,
revelando contaminantes na sua amostra. Essa banda é difusa ou bem definida? Alterações
no pH das soluções tamponantes podem levar a uma corrida difusa das amostras de DNA
no gel; tempo excessivo em soluções corantes têm o mesmo efeito. Qual o tamanho das

Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e coloração 54

bandas, em pares de base, quando usamos o padrão para comparação?

REFERÊNCIAS
[1] Cantor CR; Smith CL. Genomics: The Science and Technology Behind the Human Genome Project.
Copyright John Wiley & Sons, Inc: p.596, 1999.

[2] Slater GW; Guillouzic S; Gauthier MG; Mercier JF; Kenward M; McCormick LC; Tessier F. Theory of
DNA electrophoresis (~ 1999 –2002 ½). Electrophoresis, 23(22-23): p.3791-3816, 2002.

[3] Bassam BJ; Caetano-Anollés G; Gresshoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in
polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry, 196(1): p.80-83, 1991.

[4] Roberts GA; Dryden DTF. DNA Electrophoresis: Historical and Theoretical Perspectives. DNA
Electrophoresis: p.1-9, 2013.

Links:
Eletroforese - Técnica e equipamentos
https://youtu.be/Y-sl523tDEE

Animação da eletroforese
https://youtu.be/ZDZUAleWX78

Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e coloração 55

Eletroforese em gel de Agarose e coloração
OBJETIVO
Desenvolver habilidades na preparação de gel de agarose, praticar os passos
compreendidos desde a montagem da cuba até a realização da eletroforese e visualização
do gel corado pelo brometo de etídeo.

INTRODUÇÃO
A eletroforese em gel de agarose, assim como no caso de géis de poliacrilamida,
é uma metodologia desenvolvida nos anos 60. A agarose oferece algumas vantagens em
relação à acrilamida, como menor custo, rapidez e facilidade no preparo do gel. No entanto,
sua resolução é menor que a poliacrilamida, porém é o suficiente para separar ácidos
nucleicos através do tamanho utilizando suas cargas negativas para forçar a migração.
O preparo do gel de agarose é mais simples, a adição da agarose em pó em tampão
salino TAE ou TBE, seguida de aquecimento é suficiente para acelerar a dissolução da
agarose que ao se resfriar, solidifica em forma de gel. Esse gel é montado em fôrmas
horizontais com formação de canaletas para aplicação das amostras e mergulhado
também em tampão TAE ou TBE. Assim, como realizado na pratica do gel de acrilamida,
as amostras de DNA são preparadas em tampão de carregamento, composto por glicerol,
que é responsável por carrear a amostra para o fundo do poço e dos corantes: azul de
bromofenol e xileno cianol, que auxiliam no acompanhamento visual da corrida[1, 2].
A escolha da voltagem também é importante na eletroforese em gel de agarose.
Voltagens altas podem levar ao aquecimento do sistema e consequente derretimento da
agarose, o que compromete o experimento, 10 V/cm de distância entre os eletrodos da
cuba eletroforética é a voltagem aconselhada para o experimento, cerca de 80 V para
as cubas convencionais. O padrão de peso molecular com fragmentos conhecidos de
DNA, também é usado no gel de agarose para comparação com as bandas da amostra e
estimativa dos tamanhos da amostra. Ao fim da corrida, o gel é banhado em uma solução
contendo brometo de etídio, composto capaz de intercalar a molécula de DNA, revelado ao
ser exposto à radiação UV. Uma banda ou fragmento de DNA de interesse pode, inclusive,
ser retirada e purificada a partir do gel e, posteriormente, ser usada em futuros ensaios [1, 2].
Nota: O brometo é um potente agente mutagênico, a manipulação deve ser feita
com luvas e o material contaminado deve ser mantido separado dos demais.

QUANDO USAR TAMPÃO TAE OU TBE?

Ambos tampões, tanto TAE (1X) como TBE (1X ou 0,5X) podem ser usados
para moléculas de DNA menores que 12 a 15 Kpb. Para fragmentos de DNA maiores, é

Eletroforese em gel de Agarose e coloração 56

recomendável utilizar TAE associado a um baixo campo de força (1 a 2 V/cm). Durante
longas corridas eletroforéticas, a maior porosidade e menor campo de força diminui a
tendência à quebra do DNA. O TBE também é preferido para a separação de moléculas
pequenas de DNA (< 1kb), quando a recuperação do DNA não é necessária. A interação
do tampão TBE com a agarose resulta em poros menores. Esse gel mais compacto reduz
a expansão das bandas de DNA, causado pela dispersão e difusão.
A taxa de depleção de tampão depende do tampão usado e sua capacidade
tamponante. Um tampão TBE 0,5X possui uma capacidade tamponante maior do que TAE
1X, no pH utilizado, pois o pKa do Borato é mais próximo ao pH inicial do tampão do que o
pKa do acetato. Cubas de eletroforese de tamanho padrão (15 x 30 cm) com capacidade de
1,5 a 2 litros podem tolerar 40 a 50 Watt-horas antes da perda da capacidade tamponante.
A perda da capacidade tamponante em mini-cubas de eletroforese, não ocorre antes de
10 a 13 Watt-horas. As indicações de perda da capacidade tamponante advém da fusão
do gel, formação de rastro de DNA, e/ou sobre-aquecimento. Esses efeitos de perda de
capacidade tamponante e desenvolvimento de gradiente de pH podem ser reduzidos pela
recirculação do tampão. Isso é normalmente necessário apenas quando a eletroforese é
feita por longos períodos ou o tampão de eletroforese possui baixa capacidade tamponante.

MATERIAIS

Reagentes:
0,4 g de Agarose

1 Erlemeyer de 250 mL

1 µL de Brometo de etídeo

10 µL de Padrão de peso molecular

1 L de TAE 1X (tampão de corrida)

1 mL de Tampão de carregamento (tampão de amostra)

1 conjunto de cuba de eletroforese com pentes

1 Fonte de eletroforese

1 Espátula

1 rolo de papel filme

3 Caixas de ponteiras: P10, P200 e P1000

1 Lixeira para descarte

Eletroforese em gel de Agarose e coloração 57

Equipamentos:
Microondas

Transiluminador

Computador com programa captura de imagem

Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

SOLUÇÕES

Tampão TAE (50x)

242 g- TRIS base (2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol) (40 mM)

57,1 mL- Ácido acético glacial (40 mM)

100 mL- Solução de EDTA dissódico (Na2 EDTA) 0,5 M (pH 8,0)

Água destilada qsp 1 litro

Solução de EDTA dissódico 0,5 M (pH 8,0)

186.1 g de etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA)

800 mL de água destilada. Agitar vigorosamente. Ajustar o pH a 8,0 com hidróxido

de sódio, NaOH.

Acertar para 1L e esterilizar por autoclavagem.

MÉTODOS

Preparação do Gel:
• Pesar 0,4g de agarose em um erlenmeyer e adicionar 40 mL de TAE (1X), tam-
par com papel filme.

• Colocar o material 1 minuto no microondas, com as luvas térmicas retirar o

material.

• Homogeneizar e caso não tenha dissolvido colocar mais um minuto no microon-

das.

• Esperar o líquido esfriar, até que seja possível segurar o recipiente sem se
queimar (aproximadamente 5 minutos).

• Preparar as camas e pentes.

• Verter o líquido na cama e em seguida colocar os pentes, que irão formar as

canaletas (Evitar bolhas).

Eletroforese em gel de Agarose e coloração 58

Corrida
• Colocar o gel na cuba de eletroforese.

• Colocar o TAE 1X até cobrir todo o gel.

• Adicionar 5 μL do marcador de peso molecular na primeira ou última canaleta

do gel.

• Em um microtubo de 0,2 mL misturar 10 μL do produto de DNA com 2 μL da

solução carreadora 6X (tampão de amostra).

• Aplicar todo volume do tubo em um dos poços do gel (12 μL). Fazer esse pro-
cedimento com todas as amostras.

• Fechar o sistema e aplicar uma voltagem de 80 V na fonte, já conectada à

cuba.

• Verificar a formação de microbolhas no eletrodo quando a corrida iniciar, indi-

cando que a corrida está acontecendo.

• Aguardar em torno de 45 minutos.

Obs: Se, no próprio equipamento de aplicação de corrente, os valores de
miliamperagem estiverem zerados, significa ausência de passagem de corrente, checar se
os eletrodos estão definitivamente conectados. Lembre-se de orientar o DNA para correr
em direção ao polo positivo da cuba.

COLORAÇÃO
• Retirar o gel da cuba e colocar na solução de coloração de brometo de etídeo
por cerca de 30 minutos na câmara escura ou cobrindo o recipiente com papel
alumínio.

• Levar o gel ao transiluminador.

• Capturar as imagens.
Obs: o Transiluminador emite luz UV para excitar o Brometo de etídeo. Proteja o
rosto, mãos e principalmente os olhos utilizando face shield ou óculos de proteção.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O brometo de etídeo vai marcar o DNA em um sinal luminoso que pode ser
visualizado através do transiluminador e pode ainda ser registrado ou documentado a
partir de equipamento de imagem conectado. A qualidade das bandas reveladas deve ser
analisada em relação à definição e separação das bandas do padrão. Algumas questões
devem ser consideradas durante as análises, como: quantas bandas foram observadas

Eletroforese em gel de Agarose e coloração 59

na amostra? Essa banda é difusa ou bem definida? Qual seu tamanho em pares de base
quando usamos o padrão para comparação?
Alterações no pH das soluções tamponantes podem levar a uma corrida difusa das
amostras de DNA no gel; tempo excessivo em soluções corantes têm o mesmo efeito.

REFERÊNCIAS
[1] Charles R; Cantor CL. Smith Genomics: The Science and Technology Behind the Human Genome
Project. John Wiley & Sons, Inc. Copyright © 2004.

[2] Stellwagen NC. Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution.
Eletrophoresis, 30(S1): p.188-S195, 2009.

Links:
Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose:
https://www.youtube.com/watch?v=vL3EfRx78P0

Agarose Gel Electrophoresis of DNA fragments amplified using PCR

https://www.youtube.com/watch?v=kjJ56z1HeAc

Eletroforese em gel de Agarose e coloração 60

Preparo de células eletrocompetentes
OBJETIVOS
Produzir células eletrocompetentes com capacidade de hospedar e replicar um
DNA exógeno, treinar os procedimentos de manuseio, crescimento e cultivo de células
bacterianas.

INTRODUÇÃO
Em 1928 Fred Griffith descreveu que o material biológico de uma cepa de
Streptococcus patogênico foi capaz de transformar em patogênica uma cepa de
Streptococcus não patogênica[1]. Posteriormente, foi descoberto que esse material
transformador é o DNA[2, 3, 4]. Além dessa captação natural do material genético do ambiente
descrita por Griffith, há outros dois processos naturais nos quais as bactérias podem obter
DNA exógeno: a conjugação e a transdução. A conjugação consiste na transferência de
DNA de uma célula para outra célula por contato direto e a transdução é transferência do
material genético através das infecções por bacteriófagos (vírus de bactérias)[5, 6, 7].
A partir dessas observações surgiu a necessidade de desenvolver sistemas de
transferência de genes mais eficientes, em que o DNA deve ser facilmente transferível
e mantido de forma estável em qualquer espécie bacteriana. A inserção de moléculas
exógenas em células vivas pode ser obtida, por vários métodos distintos, sendo os dois
principais o choque térmico e a eletroporação, onde as células são submetidas às mudanças
de temperatura e ao choque elétrico, respectivamente. Em ambos os métodos a função é
abrir momentaneamente a membrana celular e permitir assim, a entrada das moléculas de
interesse para o interior da célula.
A eletroporação é amplamente utilizada para inserção de genes e também de drogas
e em uma célula viva. Nessa técnica, as células são submetidas a um intenso e curto pulso
elétrico, o que provoca flutuações térmicas espontâneas dos lipídios de membrana. Como
consequência, ocorre a abertura de poros hidrofílicos e o aumento da permeabilidade da
bicamada lipídica[8].
Durante a eletroporação as células passam por uma sequência de fases: primeiro
ocorre a formação momentânea dos poros decorrente do curto e intenso pulso elétrico;
em seguida, ocorre uma expansão do tamanho dos poros que é dependente do tempo de
duração dos pulsos elétricos e geralmente, tem duração de micro a milissegundos; por fim,
após a aplicação do pulso elétrico, ocorre a recuperação da membrana que consiste no
fechamento dos poros com duração vários minutos[9].
A técnica de eletroporação foi, inicialmente, introduzida por Potter et al. em 1984[10]
com a transformação de células de mamíferos. Em seguida, a técnica foi aplicada em
protoplastos de plantas por Watts et al., 1987[11] e neste mesmo ano, Chassy et al., 1987

Preparo de células eletrocompetentes 61

produziram bactérias eletrocompetentes, Lactobacillus casei, um microrganismo gram-
positivo[12]. Desde então, novos protocolos, visando melhorar a eficiência de transformação
através da desestabilização da parede celular das células, foram desenvolvidos[13,14,15], o
que torna as células mais permeáveis às macromoléculas exógenas.
Os processos de replicação de genes e a obtenção de seus produtos exigem o
uso de células hospedeiras capazes de receberem os fragmentos de DNA exógenos e
de expressá-los em grande escala. Células hospedeiras capazes de receber o DNA
exógeno são ditas competentes e seu preparo é uma etapa central do processo e tem
grande impacto na eficiência da transformação, ou seja, na obtenção de células contendo
a molécula exógena.

MATERIAIS

Reagentes:
1L Meio LB (L-Broth) autoclavado

2 Erlenmeyers: 1 de 50 mL e 1 de 2000 mL- estéril

1 Proveta 100 mL- estéril

4 Pipetas sorológica (1 mL, 5 mL, 10 mL e 25 mL)- estéril

3 Caixas de ponteiras: P10, P100, P1000 estéril

1 Caixa de isopor média com Gelo

6 Tubos de centrífuga gelados- estéril

1 L de solução de glicerol 10% autoclavado e gelado- estéril

40 Microtubos de 0,1 mL gelados - estéril

Obs: por não ser usado antibiótico na preparação das células eletrocompetentes, é
essencial que todo material usado seja esterilizado.

Equipamentos:
Capela de fluxo laminar

Centrífuga refrigerada

Shaker a 37 ºC

Cubetas para espectrofotômetro

Espectrofotômetro

Autoclave

Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

Preparo de células eletrocompetentes 62

MEIO DE CULTURA

Meio LB (L-Broth):
10g de Bacto-triptona

5g de extrato de levedura

5g de NaCl

H2O qsp 1000 mL

Ajustar o pH para 7,2 e autoclavar a 121ºC por 20 minutos. Armazenar a temperatura

ambiente

MÉTODOS

Pré-inóculo bacteriano
• Irradiar a capela de fluxo laminar com luz UV (Ultravioleta) por 20 minutos.

• Em um erlenmeyer de 50 mL contendo 10 mL de meio LB, adicionar 10 μL do

estoque de bactérias (XL-Blue ou DH5α).

• Incubar sob agitação de 200 a 300 RPM por 16 horas a 37 ºC.

Inóculo bacteriano
• Irradiar a capela de fluxo laminar com luz UV (Ultravioleta) por 20 minutos.

• Em um erlenmeyer de 2000 mL contendo 500 mL LB, adicionar 5 mL da cultura

do pré-inóculo.

• Verificar a OD600 inicial, ela deve estar entre 0,08 – 0,1.

• - Incubar sob agitação (300 RPM) a 37 ºC, até que a cultura atinja a OD600 (den-
sidade óptica a 600 nm) de 0,4 – 0,6.

• Resfriar o erlenmeyer contendo a cultura em banho de gelo por 20 minutos.

• Em capela de fluxo laminar, transferir de forma equilibrada a cultura para fras-

cos de centrífuga, previamente gelados.

• Centrifugar os frascos em centrífuga refrigerada a 4 ºC por 15 minutos a 4000 g.

• Descartar todo o sobrenadante cuidadosamente.

• Ressuspender gentilmente as células bacterianas utilizando o mesmo volume

de solução de glicerol 10% gelada.

• Obs1: todos os procedimentos seguintes são realizados sob banho de gelo.

• Obs2: inicialmente, adicione pequeno volume para o deslocamento das cé-

lulas, em seguida complete o volume. Usar a proveta estéril para medir o

Preparo de células eletrocompetentes 63

 volume a ser adicionado.

• Centrifugar os frascos em centrífuga refrigerada a 4 ºC por 15 minutos a 4000 g.

• Descartar todo o sobrenadante cuidadosamente.

• Ressuspender gentilmente as células bacterianas utilizando metade do volume

de solução de glicerol 10% gelada.

• Centrifugar os frascos em centrífuga refrigerada a 4 ºC por 15 minutos a 4000 g.

• Descartar todo o sobrenadante cuidadosamente.

• Ressuspender gentilmente as células bacterianas utilizando 20 mL de solução

de glicerol 10% gelada.

• Obs3: nesta etapa, juntar as células bacterianas dos distintos frascos em

um único tubo de centrifugação.

• Centrifugar o frasco em centrífuga refrigerada a 4ºC por 15 minutos a 4000 g.

• Descartar todo o sobrenadante cuidadosamente.

• Ressuspender gentilmente as células bacterianas utilizando cerca de 1 a 2 mL

de solução de glicerol 10% gelada. A concentração de células de ser em torno
de 1-3 x 1010 células/mL.

• Distribuir alíquotas de 50 μL da cultura bacteriana eletrocompetente em tubos

de 100 μL estéreis, previamente gelados e manter em banho de gelo.

• Armazenar no freezer a -80 ºC por até 6 meses.

Leitura da OD600:
• Ajustar o espectrofotômetro para a leitura a 600 nm.

• Em uma cubeta limpa adicionar 1 mL do meio LB (branco).

• Em uma segunda cubeta limpa adicionar 1 mL da cultura em crescimento.

• Zerar o aparelho utilizando a cubeta contendo somente o meio LB.

• Realizar a leitura da cultura em crescimento e anotar a OD600.

• Caso não tenha atingido o valor desejado (0,4 - 0,6), incubar a cultura nova-
mente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
As etapas de preparo de células eletrocompetentes devem ser rigorosamente
seguidas para otimizar a obtenção de células com alta eficiência de transformação. Uma
dessas etapas, é o recolhimento das células de E. coli, que deve ser realizada na fase
exponencial tardia de crescimento, o que é conseguido através das leituras regulares da

Preparo de células eletrocompetentes 64

OD600[15]. É importante ter em mente que a cultura bacteriana usada (E.coli) o número de
células duplica a cada 20 ou 30 minutos.
Outra etapa também crucial é lavar as células para remover íons presentes no
meio de cultivo, dado que o processo de eletroporação na presença de alta força iônica
causa arqueamento elétrico, gerando fagulha, o que consequentemente, leva ao aumento
de temperatura, matando as células. A solução de glicerol 10% usada para as lavagens
das células e, também usada como meio para a eletroporação, aumenta a resistência
elétrica e, consequentemente, o tempo de duração do pulso elétrico, bem como limita o
extravasamento citoplasmático durante a formação dos poros transitórios na membrana e
parede celular[6].

REFERÊNCIAS
[1] Griffith F. The significance of pneumococcal types. J Hyg., 27(2): p.113-159, 1928.

[2] Avery OT; MacLeod CM; McCarthy RL. Studies on the chemical nature of the substance inducing
transformation of Pneumococcal types. J Exp Med., 79(2): p.137-158, 1944.

[3] McCarty M; Avery OT. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation
of Pneumococcal type 2. Effect of desoxyribonuclease on the biological activity of the transformation
substance. J Exp Med., 83(2): p.89-96, 1946.

[4] McCarty M; Avery OT. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation
of Pneumococcal type 3. An improved method for the isolation of the transforming substance and its
application to Pheumococcus type-II, type-III, and type VI. J Exp Med., 83(2): p.97-104, 1946.

[5] Johnsborg O; Eldholm V; Havarstein LS. Natural genetic transformation: prevalence, mechanisms
and function. ResMicrobiol., 158(10): p.767-778, 2007.

[6] Chen I; Christie PJ; Dubnau D. The ins and outs of DNA transfer in bacteria. Science, 310: p.1456-
1460, 2005.

[7] Lederberg J. Infectious history. Science, 288(5464): p.287-293, 2000.

[8] Neumann E; Toensing K; Kakorin S; Budde P; Frey J. Mechanism of electroporative dye uptake by
mouse B cells, Biophys. J., 74(1): p.98-108, 1998.

[9] Leontiadou H; Mark AE; Marrink SJ. Molecular dynamics simulation of hydrophilic pores in lipid
bilayers. Biophysical Journal, 86, p.2156-2164, 2004.

[10] Potter H; Weir L; Leder P. Enhancer-dependent expression of human k immunoglobulin genes

introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81: p.7161-
7165, 1984.

[11] Watts JW; King JM; Stacey NJ. Inoculation of protoplasts with viruses by electroporation. Virology,
157: p.40-46, 1987.

Preparo de células eletrocompetentes 65

[12] Chassy BM; Flickinger JL. Transformation of Lactobacillus casei by electroporation. FEMS Lett. 4:
p.173-177, 1987.

[13] Lelie D; Vosson J; Venema G. Effect of plasmid incompatibility on DNA transfer to Streptococcus
cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 54: p.865-871, 1988.

[14] Calvin NM, Hanawalt PC. High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation. J
Bacteriol., 170: p.2796-2801, 1988.

[15] Kim AY; Blaschek HP. Construction of an Escherichia coli–Clostridium perfringens shuttle vector
and plasmid transformation of Clostridium perfringens. Appl Environ Microbiol., 55: p.360-365, 1989.

Links:
Sistema de eletroporação
https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006217A.pdf

Preparo de células eletrocompetentes 66

Transformação bacteriana (Eletroporação)
OBJETIVO
Introduzir DNA plasmidial em bactérias competentes através da utilização de um
campo elétrico.

INTRODUÇÃO
Neumann e colaboradores, em 1982, publicaram o primeiro estudo sistemático feito
em relação a eletroporação através da transferência eficiente de DNA plasmidial às células
de camundongos. Durante a década de 1990, Tsong publicou um conjunto de artigos que
apresentou de forma clara o que é o processo de eletroporação e suas aplicações, a partir
da compreensão da biofísica. A eletroporação se tornou, no século XXI, umas das técnicas
de transfecção mais utilizadas devido a sua fácil execução e versatilidade, podendo,
inclusive ser aplicada a diversos tipos célulares[1].
A técnica de eletroporação ocorre quando um campo elétrico pulsado é aplicado
nas células em suspensão, promovendo a polarização da membrana e a formação
de nanoporos, e, aumentando assim, a permeabilidade celular. Durante esse período
pode ocorrer a entrada de diversos compostos para o interior da célula, como produtos
químicos, medicamentos, RNA, DNA ou peptídeos. Após a passagem do pulso, a célula irá
retornar ao seu estado inicial, recuperando sua integridade celular[2]. No campo da biologia
molecular, o processo de eletroporação é muito utilizado para transformar bactérias,
leveduras e protoplastos vegetais, que recebem um novo material genético e adquirem
novas características[3].

MATERIAIS
10 mL de meio de cultura LB sem antibiótico

6 placas de petri com meio LB contendo antibiótico

3 Caixas de ponteiras: P10, P100 e P1000

03 Cubetas

01 Recipiente com gelo

03 Microtubos de 1.5 ml

01 Estante para tubos

01 Tubo tipo Falcon 50 mL

01 Estante para tubo Falcon 50 mL

01 Alça para plaquear (estéril)

Transformação bacteriana (Eletroporação) 67

 01 Pisseta com álcool 70%

Alíquota de vetor fechado (1-10 ng)

Alíquota produto de ligação (1-10 ng)

Alíquota de célula eletrocompetente

01 Balde ou lixeira para descarte

Equipamentos:
Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

Eletroporador

Capela de fluxo laminar

Shaker 37º C

Autoclave

pHmetro

Banho-maria

Centrífuga

Freezer -80º C

Freezer -20 ºC

Geladeira

Estufa 37 ºC

MEIOS DE CULTURA

Meio LB
10 g NaCl

10 g Peptona

5 g Extrato de levedura

• Adicionar os componentes em um béquer contendo 800 ml de H20 e aguardar

até completar a dissolução.

• Colocar a solução já diluída em uma proveta e completar o volume obtido para

1 litro.

• Acertar o pH para 7,2.

• Misturar bem e autoclavar por 20 minutos.

• Retirar o Erlenmeyer da autoclave e colocar no banho a 56 ºC e aguardar a

Transformação bacteriana (Eletroporação) 68

 queda da temperatura para utilizá-lo.

Meio LB líquido ágar com antibiótico

• Fazer o mesmo procedimento acima e adicionar 15 g de ágar por litro de meio
LB.

• Autoclavar e em seguida deixar esfriar em banho-maria 56 ºC.

• Quando a temperatura do meio estiver suportável ao toque, adicionar a ampi-

cilina (100 mg/mL).

• Homogeneizar e despejar nas placas. Aguardar até que elas se solidifiquem.

Obs: O manuseio do meio autoclavado deve ser realizado em capela de fluxo
laminar.

MÉTODOS

Eletroporação
• Na capela de fluxo laminar, identificar as cubetas e coloca-las no gelo. Fazer o
mesmo procedimento com os tubos contendo as células competentes.

• Realizar 3 reações:

Reação 1: Adicionar 2 μL do produto de ligação (teste) ao tubo contendo

as células competentes. Em seguida, transferir todo o conteúdo do tubo na
cubeta e coloca-la no gelo.

Reação 2: Adicionar 2 μL do vetor fechado (controle positivo) ao tubo

contendo as células competentes. Em seguida, transferir todo o conteúdo
do tubo para a cubeta e coloca-la no gelo.

Reação 3: Adicionar apenas células competentes (controle negativo) na

cubeta e coloca-la no gelo.
Obs: Fazer todo o procedimento na capela e evitar deixar as cubetas muito tempo
fora do gelo.

• Submeter as células contidas nas cubetas ao choque elétrico em eletroporador

sob voltagem 2,5kV.

• Após o “choque ‘’, colocar 1 mL do meio LB na cubeta, homogeneizar e transfe-

rir todo conteúdo para tubo de 1.5 mL.

• Incubar os tubos em shaker sob agitação de 180 RPM por 45 a 60 minutos a

37 ºC.

Transformação bacteriana (Eletroporação) 69

Plaqueamento e seleção de clones
• -Abrir as placas na capela por 5 minutos.

• Colocar 100 μL da cultura sob a placa de petri com meio sólido e antibiótico.

• Espalhar o meio por toda a superfície com auxílio da alça estéril.

• Incubar as placas de petri em estufa a 37 ºC por 18 horas.

Obs: As tampas das placas devem estar voltadas para baixo e o lado do ágar
para cima. Isto evita que a água de condensação acumulada na tampa não caia sobre as
colônias, o que evita a contaminação dos clones.

• Analisar os resultados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Antes de realizar a eletroporação, as células precisam receber um tratamento
adequado para se tornarem “eletrocompetentes”, ou seja, serem capazes de receber
DNA exógeno. Esse tratamento permite também que as células sejam armazenadas por
longos períodos no freezer a -70°C. Após descongeladas, as células eletrocompetentes
são misturadas ao material genético, que após o pulso elétrico, pode ser transferido para
as células.
A inserção do novo material genético pelas células pode ter como finalidade, por
exemplo, a expressão de novas proteínas, processo conhecido como expressão heteróloga.
Após o pulso elétrico as células precisam se recuperar do estresse sofrido para poderem
aumentar a população e começar a produzir suas proteínas, inclusive aquelas inseridas
via plasmideo. Assim, imediatamente após a eletroporação o meio LB não deve conter
antibiótico, porque a resistência será conferida após a inserção do plasmídeo contendo o
gene de resistência ao antibiótico.
Alguns cuidados devem ser tomados durante o processo de eletroporação como,
ligar a luz ultravioleta da capela ou fluxo laminar antes de todos os procedimentos, para
evitar contaminação. Ao incubar as placas de petri elas devem permanecer com as tampas
voltadas para baixo e com lado do ágar para cima, para evitar a condensação da água e
possível contaminação.

REFERÊNCIAS
[1] Shi J, Ma Y, Zhu J, et al. A Review on Electroporation-Based Intracellular Delivery. Molecules, 23(11):
p.3044, 2018.

[2] Luft C, Ketteler R. Electroporation Knows No Boundaries: The Use of Electrostimulation for siRNA
Delivery in Cells and Tissues. J Biomol Screen., 20(8): p.932-942, 2015.

Transformação bacteriana (Eletroporação) 70

[3] Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Electroporation. Cold Spring Harb Protoc., 1(7), 2019.

Links:
Conceito de eletroporação
https://www.youtube.com/watch?v=InBnhL47IKo&feature=youtu.be

Como realizar a eletroporação

https://www.youtube.com/watch?v=0ob-cZkTNtA&feature=youtu.be

Curiosidade sobre eletroporação

https://www.youtube.com/watch?v=KjRd-c-LzMo&feature=youtu.be

Transformação bacteriana (Eletroporação) 71

Extração DNA Plasmidial (Miniprep)
OBJETIVOS
Obter e purificar DNA plasmidial recombinante e manipular cultura bacteriana.

INTRODUÇÃO
A extração e purificação de plasmídeos consiste em uma técnica fundamental
e necessária na biologia molecular, utilizada nas etapas de clonagem, expressão de
proteínas, sequenciamento, transformação de organismos, introdução de modificações em
sequências, mutagênese sítio-dirigida, ou mesmo para manter os plasmídeos em estoque.
O isolamento de DNA plasmidial tem sido usado por décadas[1–3] e continua sendo
um dos métodos mais utilizados nos laboratórios de biologia molecular. A purificação do
plasmídeo envolve duas etapas: lise bacteriana e isolamento do DNA.
Em 1969, Clewell e Helinski conseguiram isolar o DNA circular de E. coli utilizando
na lise celular a enzima lisozima e o detergente desoxicolato de sódio, seguido de
centrifugação[1]. Mais tarde, em 1978, Colman e colaboradores desenvolveram um novo
método, que envolveu a lise bacteriana na presença de lisozima e do detergente Triton
X-100, seguido da purificação em cromatografia de hidroxiapatita na presença de altas
concentrações de fosfato e ureia [2]. Logo em seguida, em 1979, Birnboim e Doly publicaram
um novo método, em que a lise foi realizada empregando NaOH e SDS, seguida da
precipitação do DNA plasmidial através da adição de acetato de sódio ao lisado[3].
A técnica descrita por Birnboim e Doly é empregada até os dias atuais e seu princípio
está na desnaturação alcalina (pH ~12) do DNA cromossômico de alto peso molecular,
enquanto o DNA circular covalentemente fechado permanece em fita dupla, visto que
suas fitas são topologicamente entrelaçadas. O controle adequado do pH é crucial, pois
após a neutralização, o DNA cromossômico renatura para formar um coágulo insolúvel,
juntamente com proteínas e restos celulares. Em contrapartida, o DNA plasmidial retorna
a forma nativa de forma mais rápida que o DNA genômico, e assim, o DNA do plasmídeo
fica solúvel no sobrenadante. Isto garante que DNAs de plasmídeos grandes e pequenos
possam ser extraídos por este método[3,4].

MATERIAIS
3 mL de cultura de bactéria E.coli contendo plasmídeo de interesse em meio LB

Microtubos de 2 mL

1 mL das Soluções I, II e III

1 mL de Etanol 75% gelado

Extração DNA Plasmidial (Miniprep) 72

 1 mL de Isopropanol

1 mL de Água deionizada autoclavada

Caixas de ponteiras: P10, P100 e P1000

1 Frasco para descarte contendo hipoclorito de sódio

Equipamentos:
Microcentrífuga

Autoclave

Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

SOLUÇÕES

Solução I: TE pH 8
25 mM Tris pH8

10 mM EDTA pH 8

Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos e armazenar a 4ºC

Solução II: SDS/NaOH

1% de SDS

0,2 M de NaOH

Esta solução deve ser fresca e mantida à temperatura ambiente.

Solução III: Acetato de sódio 3M pH 4,8

3 M de Acetato de sódio

Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos e armazenar a 4 ºC

MÉTODOS
• Crescer 3 mL de cultura em meio LB + ampicilina (100 µg/mL), durante 16 a18
horas.

• Centrifugar 1 mL da cultura por 10 min a temperatura ambiente, desprezar todo

o sobrenadante no frasco descarte contendo água sanitária.
Obs: Todas as centrifugações são realizadas a 13.000 RPM.

• Ressuspender bem o pellet com 200 µL da solução I (TE pH 8), homogeneizar

usando a pipeta.

Extração DNA Plasmidial (Miniprep) 73

 • Adicionar 200 µL de solução II (SDS/NaOH) e homogeneizar pipetando.

• Incubar a 56 ºC por 5 minutos. A suspensão ficará transparente e viscosa.

• Adicionar 150 µL de NaAc 3M, pH 4,8.

• Homogeneizar por inversão, várias vezes, até formar “grumos”.

• Centrifugar por 10 minutos a temperatura ambiente.

• Transferir, cuidadosamente, o sobrenadante para outro tubo e adicionar 1mL de

isopropanol. Homogeneizar por inversão.

• Incubar a 37º C por 5 minutos.

• Centrifugar por 10 minutos a 4º C. Descartar o sobrenadante e lavar o pellet

com 1mL de etanol 75% gelado.

• Centrifugar por 5 minutos a 4º C.

• Secar o pellet a temperatura ambiente e suspendê-lo em 50 µL de H2O deioni-

zada autoclavada.

• Dosar o DNA.
Obs: Para remover o RNA da preparação, acrescentar TE pH 8 contendo 20μg/mL
de Rnase, incubar a 37º C por 0,5-1 hora. Para reduzir a contaminação do DNA purificado
com proteínas, pode ser empregado a extração com mesmo volume de fenol: clorofórmio:
álcool isoamílico e/ou clorofórmio: álcool isoamílico. Misture por inversão várias vezes e
centrifugue na velocidade máxima por 2 minutos a 4 ºC. Transfira a fase superior para um
tubo novo e o DNA é então precipitado através da adição de álcool (0,6-0,8X volume de
isopropanol ou 2,5X volumes de etanol) na presença de sais. Após a lavagem com etanol
70% para remoção do excesso de sais, o DNA é solubilizado em TE.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para melhor rendimento do processo, garanta que o pellet de bactérias seja
completamente solubilizado na solução I, não deixar grumos de células, pois dificulta a
interação com a solução de lise.
O SDS, um detergente aniônico, possui a função de lisar as membranas da célula
e desnaturar as proteínas celulares, enquanto o NaOH eleva o pH do extrato para valores
muito alcalinos (pH 12 a 12,5). Nestas condições, ocorre a desnaturação diferencial do
DNA, o DNA cromossomal será desnaturado, enquanto o DNA plasmidial circular e menor
permanece inalterado. Ao incorporar o Acetato de Potássio (ou Acetato de Sódio) com pH
5,5, o extrato é neutralizado sob condições de alta concentração de sais, fazendo com que
o DNA cromossomal precipite, enquanto que o DNA plasmidial permaneça em solução. A
adição dessa solução também causa a precipitação de proteínas complexadas ao SDS,

Extração DNA Plasmidial (Miniprep) 74

incorporado pela adição da solução II. A centrifugação final produz um extrato claro com o
DNA plasmidial em solução.

REFERÊNCIAS
[1] Clewell DB; Helinski DR. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification
and induced conversion to an open circular DNA form. Proc Natl Acad Sci USA., 62(4): p.1159-1166,
1969.

[2] Colman A; Byers MJ; Primrose SB; Lyons A. Rapid purification of plasmid DNAs by hydroxyapatite
chromatography. Eur J Biochem., 91(1): p.303-310, 1978.

[3] Birnboim HC; Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.
Nucleic Acids Res., 7: p.1513-1523, 1979.

[4] Sambrook J; David WR. Molecular cloning: a laboratory manual Vol 1. Cold Spring Harbor
Laboratory Pr. 2001.

Links:
Extração de DNA plasmidial
https://www.youtube.com/watch?v=nsv8py5ujA0&ab_channel=Abnova

Extração DNA Plasmidial (Miniprep) 75

Expressão heteróloga
OBJETIVOS
Realizar produção da proteína recombinante em células E. coli.

INTRODUÇÃO
A tecnologia do DNA recombinante surgiu no início dos anos 1970 e possibilitou
a produção de proteínas heterólogas que apresentam grande interesse comercial e
tecnológico. Dentre essas proteínas, está a insulina, cuja expressão de forma recombinante
a partir de 1977 possibilitou o tratamento efetivo de pacientes diabéticos. Dentre os
organismos utilizados para a produção de proteínas heterólogas, estão as bactérias gram
negativas, como a Escherichia coli. Este é um dos hospedeiros mais utilizados para esse
propósito, por ser bem caracterizado geneticamente, ter à disposição inúmeros plasmídeos
de expressão, possuir elevada taxa de multiplicação, fácil cultivo, baixo custo e alto
potencial de produção[1, 2].
A utilização do sistema bacteriano para a expressão de proteínas heterólogas
possui duas principais desvantagens: i) o dobramento incorreto da cadeia proteica e
ii) a produção de proteínas insolúveis, ou seja, em corpúsculos de inclusão. Durante o
processo de expressão, é desejável que a proteína recombinante esteja na forma solúvel
e na conformação estrutural correta, ou seja, biologicamente ativa. No entanto, caso
ocorra o mau dobramento das proteínas produzidas, a molécula fica sujeita à degradação
proteolítica no citoplasma da bactéria. Isto porque essas proteínas em sua conformação
incorreta são rapidamente degradadas como forma de reciclagem de aminoácidos[3].
Outro problema que pode surgir é a formação de corpúsculos de inclusão, que são
agregados insolúveis formados pelo acúmulo da proteína expressa. A maioria das proteínas
heterólogas produzidas em E. coli podem estar na forma de corpúsculo de inclusão. Isto
porque essas células apresentam alto nível da expressão citoplasmática e uma pequena
quantidade de chaperonas no seu citoplasma, que são as proteínas que auxiliam no
dobramento correto das cadeias proteicas em crescimento. Por outro lado, a formação
de corpúsculos de inclusão fornece uma grande quantidade de proteínas, o que facilita a
produção e purificação em larga escala[2].
Para a produção de proteína heteróloga em sistema de expressão que utiliza o
modelo E. coli, é necessário a utilização de um plasmídeo de expressão bacteriano. O
plasmídeo deve possuir uma origem de replicação, possibilitando a duplicação do número
de cópias do gene de interesse e um promotor para transcrição e tradução do gene de
interesse. O promotor é uma das regiões mais importantes para a transcrição do gene, pois
controla a velocidade da transcrição do gene. Assim, um promotor forte aumenta a taxa de
produção de mRNA, e a produção da proteína de interesse. Os promotores bacterianos

Expressão heteróloga 76
mais utilizados nos plasmídeos de expressão são: lac, trp, T7[4].
Diversos plasmídeos bacterianos são utilizados para a expressão de proteínas
recombinantes, dentre eles temos os plasmídeos da família pET (plasmid for expression
by T7 RNA polimerase), muito utilizados para expressão em células E. coli. Os plasmídeos
dessa família possuem o promotor T7-Lac, que permite a expressão da proteína heteróloga
sob o controle do repressor lac, o que reduz assim, o backgroud de expressão da proteína
de interesse na ausência do agente indutor. A indução da transcrição é obtida através
da adição de um análogo de lactose sintético e não degradável (tiogalactopiranosídeo de
isopropila, IPTG), o qual se associa ao repressor, de modo a inibi-lo, deixando o promotor
livre para a interação com a RNA polimerase e consequente transcrição do gene de
interesse[4,5].
Ao utilizar os plasmídeos da família pET, as proteínas expressas por células de E.
coli podem ser purificadas por cromatografia de afinidade, pois o plasmídeo possui uma
sequência que codifica seis resíduos do aminoácido histidina em fusão na porção N-terminal
da proteína de interesse (His-Tag). A His-Tag possui grande afinidade por alguns íons
metálicos, como Ni2+, Cu2+ e Co2+, o que permite com que o produto em fusão seja separado
de outras proteínas existentes no meio, com pureza de até 95%[2,4].

MATERIAIS
Célula ou clone de E. coli transformada com o plasmídeo contendo gene de interesse
(ex: pET-21a + gene de interesse)

100 mL Meio de cultura (LB ou 2XYT)

Tampão de amostra DTT 2X

Alíquota de Ampicilina (100 mg/mL)

Alíquota de IPTG 1 M

Tubos para centrifugação com fundo cônico estéril de 50 mL

2 Microtubos de 2 mL

2 Cubetas de vidro ou plástico de 2 mL

1 Frasco/lixeira para servir como descarte de material contaminado

Equipamentos:
Nanodrop

pHmetro

Shaker (temperatura de crescimento ótimo para E. coli – 37° C e rotação 180 RPM).

Capela de fluxo laminar

Expressão heteróloga 77
 Autoclave

MÉTODOS
• O primeiro passo é realizar um pré-inóculo na capela de fluxo laminar. Adicionar
10 mL de meio de cultura ao tubo de fundo cônico estéril de 50 mL.

• Adicionar 10 µL de ampicilina a 100 mg/mL ao meio de cultura.

• Com o auxílio de uma ponteira, coletar células de uma colônia isolada da placa
que contenha as bactérias eletroporadas com o plasmídeo contendo o gene de
interesse.

• Inserir a ponteira no tubo contendo o meio.

• Incubar os tubos no shaker a 37 °C a 180 RPM por 18 h.

• O segundo passo é realizar o inóculo para expressão da proteína de interesse

em pequena escala. Em um tubo tipo Falcon de 50 mL adicionar 20 mL de meio
de cultura (LB ou 2XYT), 20 µL de ampicilina 100 mg/mL e 200 µL do pré-inó-
culo.

• Incubar o frasco no shaker a 37 °C a 180 RPM até atingir uma densidade optica
(DO) entre 0,6 e 0,8. O tempo para atingir esta DO varia conforme a linhagem
bacteriana utilizada, sendo, o tempo usual, entre 2,5 e 4 h.

• Medir a densidade optica (DO) do inóculo após 1,5 h de incubação. Caso o valor
esteja próximo do ideal (ex.: A>0,450), monitorar a DO a cada 20-30 minutos.

• Após atingir a DO desejada, transferir uma alíquota de 2 mL do inóculo para um

microtubo de 2 mL, que será a amostra de tempo zero (T0).

• Centrifugar e ressuspender o pellet no tampão de amostra (DTT).

• Adicionar o volume de IPTG (0.5 mM) desejado para a indução da expressão.

• Incubar o inóculo à 37 °C, 180 RPM por 4 horas.

• Retirar T0, T1, T2 e T4 horas de indução.

• Submeter o produto obtido a eletroforese em SDS-PAGE em condição desna-

turante.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir do pré-inóculo crescido, um inóculo de 1% será realizado e o crescimento
bacteriano acompanhado através da medição da DO. Após duas a três horas, é esperado
que a DO do inóculo atinja valores entre 0,6 e 0,8 e então, nesse ponto, o agente indutor
(IPTG) deve ser adicionado na concentração desejada. A cada duas horas uma alíquota
deve ser retirada até completar 4 horas de expressão proteica. Essas alíquotas devem ser

Expressão heteróloga 78
centrifugadas e o pellet ressuspendido em tampão de amostra (DTT), e utilizadas para
verificar a expressão através de uma eletroforese SDS-PAGE.
Espera-se que o indutor (IPTG) promova a expressão seletiva da proteína de fusão,
que terá um aumento gradual de expressão a cada hora. O T0, será usado como controle
negativo, ou seja, momento onde não se espera a produção da proteína de interesse,
seguido pelos demais tempos, onde se espera um aumento da quantidade da proteína
expressa. Para análise dos resultados é necessário o conhecimento prévio do tamanho da
proteína de fusão (proteína recombinante) e aplicação de um padrão de peso molecular.

REFERÊNCIAS
[1] Vajo O; Fawcett J; Duckworth WC. Recombinant DNA Technology in the Treatment of Diabetes:
Insulin Analogs. Endocrine Reviews, v. 22, n. 5: p.706-717, 2001.

[2] Idalia VMN; Bernado F. Escherichia coli as a Model Organism and Its Application in Biotechnology. -
Recent Advances on Physiology, Pathogenesis and Biotechnological Applications, cap. 13: p.253-274,
2016.

[3] Huo L; et al. Heterologous expression of bacterial natural product biosynthetic pathways. Natural
Product Reports, v. 36, n.10: p.1412-1436, 2019.

[4] Wingfield PT; Palmer I; Liang SM. Folding and Purification of Insoluble (Inclusion Body) Proteins from
Escherichia coli. Curr Protoc Protein Sci., v. 78:6: p.51-65, 2014.

[5] Davy AM; Kildegaard HF; Andersen MR. Cell Factory Engineering. Cell Systems, v. 4, n.3: p.262-
275, 2017.

Links:
Operon Lac.
https://www.youtube.com/watch?v=7_FrhNHBSW4

Família de plasmídeo pET utilizados para expressão heteróloga.

https://www.youtube.com/watch?v=_J9noI2UAN8

Expressão de proteínas heterólogas e purificação

https://www.youtube.com/watch?v=YJr_Xtji5NE&t=331s

Expressão heteróloga 79
Gel de poliacrilamida SDS-PAGE
OBJETIVO
Verificar a expressão, permitir o fracionamento e conferir a massa molecular do
conjunto de proteínas que compõem o extrato proteico estudado.

INTRODUÇÃO
Após a expressão da proteína alvo do estudo, é importante conferir a presença da
mesma e também verificar o tamanho relativo ou peso molecular da molécula. Somado a
isso, após as etapas de purificação e fracionamento por cromatografia, também é adequado
verificar a pureza da amostra, ou seja, quão bem uma determinada etapa de purificação
removeu as proteínas contaminantes. A técnica de Eletroforese em Gel de Dodecil Sulfato
de Sódio-Poliacrilamida (SDS-PAGE) é amplamente utilizada para monitorar cada uma
destas etapas, por se tratar de um método simples, rápido e relativamente barato[1].
A eletroforese envolve a migração de moléculas eletricamente carregadas em
soluções devido a um campo elétrico aplicado entre um ânodo e um cátodo. Trata-se
de uma técnica amplamente difundida e já em 1897, Kohlrauch descreveu a ordem da
migração eletroforética de íons, suas concentrações relativas e explicou o comportamento
de substâncias em movimento em um campo elétrico. Mais tarde, em 1930, Tiselius publicou
sobre a eletroforese de contorno móvel, que permitiu estudos das propriedades físico-
químicas de proteínas. Ele mostrou que bandas nítidas de moléculas ionizadas podiam ser
obtidas em tubos de vidro em forma de U e as bandas de proteínas podiam ser detectadas
por fotografia com luz ultravioleta[2].
A eletroforese em solução livre de Tiselius estava sujeita a uma baixa resolução
devido à mistura dos componentes, ocupava grande espaço físico e exigia vários miligramas
de proteína. Então, por volta de 1950, surge a eletroforese em papel, na qual o papel de
filtro serve como meio de suporte. O método foi um sucesso e permitiu a análises com
menores quantidades de amostra, de forma mais barata, maior resolução na separação e
visualizados através da coloração das proteínas[3].
A eletroforese em géis de poliacrilamida (PAG) foi descrita em 1959 por Raymond
e Weintraub[4]. Em 1967, foi relatada a relação proporcional entre a migração eletroforética
de proteínas em PAG e seu peso molecular na presença de SDS[5]. Posteriormente, foi
introduzido o gel de placa para facilitar a resolução simultânea de várias amostras[6,7] e
um sistema tampão modificado inicialmente introduzido para melhorar a solubilização e
resolução das proteínas[1].
O sistema descontínuo desenvolvido por Laemmli[1] tem sido usado e modificado
por vários laboratórios. A técnica de SDS-PAGE é útil para separar moléculas de acordo
com seu tamanho, na qual sua estrutura é composta por um gel de empilhamento na parte

Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 80

superior, seguido de um gel de resolução na região logo abaixo. O gel de empilhamento
possui uma porcentagem menor de poliacrilamida, o que permite com que as proteínas
penetrem e se movam rapidamente, de forma empilhada umas sobre as outras, dentro da
malha de poliacrilamida. Daí elas adentram o gel de resolução de maior porcentagem, o
que leva à separação das distintas frações proteicas. É possível otimizar as porcentagens
de poliacrilamida a fim de aumentar a resolução de separação, de acordo com a faixa de
tamanho das moléculas presentes na amostra. Proteínas pequenas irão se mover mais
rapidamente do que proteínas grandes através do gel de resolução. A visualização das
proteínas é possível após coloração adequada das moléculas com diferentes corantes
como coomassie ou prata, que revelam as bandas proteicas.

MATERIAL
2 Placas de vidro para eletroforese

2 Espaçadores de 1,5 mm de espessura

1 Pente para eletroforese de 1,5 mm de espessura

3 Caixas de ponteiras: P10, P100 e P1000

2 Pipetas de vidro: 10 mL

2 Tubos cônicos de polipropileno de 15 mL

9 μL de Temed – N,N,N´,N´- Tetrametilenediamina

5 mL de Tris-Cl 1,5 M, pH 8,8

5 mL Tris-Cl 0,5 M, pH 6,8

5 mL SDS 10%:

1 mL Persulfato de amônio (APS) 10%:

0,5 mL Tampão da amostra

1 L Tampão Tris-Glicina/Eletroforético

5 mL Solução de acrilamida / bis (29: 1)

100 mL Solução de coloração:

100 mL Solução descorante rápida

100 mL Solução descorante lenta

Equipamentos:
Fonte eletroforética

Conjunto de micropipetas de P10, P100, P1000

Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 81

SOLUÇÕES

Tris-Cl 1,5 M, pH 8,8:

Dissolver 90,7 g de Tris em aproximadamente 500 mL de água. Ajustar o pH para
8,8 adicionando HCl. Completar até o volume de 1 L com água e armazenar a 4 ° C

Tris-Cl 0,5 M, pH 6,8:

Dissolver 15 g de Tris em aproximadamente 200 mL de água. Ajustar o pH para 6,8
adicionando HCl. Completar o volume até 250 mL com água e armazenar a 4 ° C

Tampão da amostra:
2,5 mL de Tris-Cl 0,5 M, pH 6,8 (0,125 M)

4 mL de SDS a 10% (4%)

2 mL de glicerol (20%)

1 mL de β-mercaptoetanol (10%)

0,5 mL de azul de bromofenol a 1% (0,05%), armazenar a -20 ° C

Tampão Tris-Glicina/Eletroforético
3 g de Tris (0,025 M)

14,4 g de Glicina (0192 M)

10 mL de SDS a 10% (0,1%)

Completar até o volume de 1 L com água. Não há necessidade de se verificar o pH

desta solução.

Solução de acrilamida / bis (29: 1)

29 g de acrilamida

1 g de bisacrilamida

Adicionar o volume de 100 mL com água, homogeneizar e armazenar a 4 ° C em

uma garrafa coberta com papel alumínio.

Solução de coloração:
45 mL de metanol (45%)

10 mL de ácido acético (10%)

45 mL de água

0,25 g de Coomassie Blue R-250 (0,25%)

Dissolver completamente o Coomassie Blue R-250 no metanol por homogeneização.

Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 82

Solução descorante rápida:
45 mL de metanol (45%)

10 mL de ácido acético (10%)

45 mL de água

Solução descorante lenta:

10 mL de metanol (10 %)

5 mL de ácido acético (5%)

85 mL de água. Homogeneizar bem todos os reagentes

MÉTODOS
• Limpar as placas de vidro, espaçadores e pentes e montar o sanduíche: placa
maior, posicionar os espaçadores nas extremidades dessa placa, colocar a pla-
ca menor e por último fazer a vedação lateral e inferior do sistema.

• Preparar a solução do gel de resolução 12% nesta ordem:

3,3 mL de água

4 mL de acrilamida/bisacrilamida (29:1)

2,5 mL de Tris-HCl 1,5M pH 8,8

0,1 mL de SDS 10%

0,1 mL de APS 10%

0,004 mL de TEMED

• Distribuir a solução do gel de resolução 12% no sistema de placas, respeitando

o limite máximo determinado.

• Distribuir uma pequena quantidade de isopropanol ou água para remover bo-

lhas e alinhar a superfície do gel.

• Aguardar até a completa polimerização da solução do gel de resolução, por

aproximadamente 40 minutos.

• Remover o isopropanol/água enxaguando o gel de resolução com água e remo-

va o excesso de líquido com um papel de filtro.

• Preparar a solução do gel de empilhamento 5% nesta ordem:

2,85 mL de água

0,83 mL de acrilamida/bisacrilamida (29:1)

1,26 mL de Tris-HCl 0,5M pH 6,8

Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 83

 0,05 mL de SDS 10%

0,05 mL de APS 10%

0,005 mL de Temed

• Pipetar a solução de gel de empilhamento sobre o gel de resolução, enchendo

até a borda da placa anterior.

• Inserir o pente entre as placas do sanduíche até que fique totalmente apoiado
sobre a placa menor anterior. Evitar a formação de bolhas entre os dentes do
pente e a solução do gel de empilhamento. Caso necessário, adicionar solução
de gel para preencher quaisquer áreas vazias.

• Aguardar até a completa polimerização da solução do gel de empilhamento, por

aproximadamente 40 minutos.

• Retirar o sanduíche de placas do sistema de vedação, remover o pente e lavar

as canaletas com um jato suave de água destilada.

• Inserir o sanduíche de placas e gel polimerizado na cuba eletroforética e preen-

chê-la com tampão de corrida Tris-glicina. Verificar o nível do tampão dentro na
cuba, ele deve cobrir toda a parte superior do gel.

• Misturar 5 μL (5–20 μg de proteína) de cada uma da(s) amostra(s) de proteína

em 5 μL do tampão de amostra e aquecer a 95 ºC por 5 minutos.

• Aplicar 5 μL do marcador de peso molecular na primeira canaleta do gel.

• Aplicar cada uma das amostras proteicas nas canaletas individuais seguintes.

• Fechar a cuba eletroforética e conectar os cabos elétricos à fonte de alimen-

tação. Ficar atento à combinação dos cabos vermelho e o preto da cuba aos
conectores de mesma cor da fonte de alimentação.

• Ligar a fonte de alimentação a uma constante de 50 V até que a amostra pene-

tre no gel e em seguida aumentar a voltagem para 100 – 120 V por 35 minutos
por 1 h ou até que o corante azul de bromofenol atinja a parte inferior do gel.

• Desligar a fonte de alimentação e desconectar os cabos.

• Separar as placas de vidro para acessar o gel, posicionar uma espátula entre as
placas na parte superior e inclinar cuidadosamente para liberar o gel.

• Transferir o gel para um recipiente contendo 100 mL da solução de coloração e

incubar por 30 a 40 minutos, sob agitação lenta.
Obs: o gel ficará totalmente coberto e impregnado pelo corante Coomassie Blue
R-250 e não será possível visualizar as bandas proteicas, o que só é possível após
descoloração da superfície do gel.

• Retirar a solução de coloração.

Obs: a solução de coloração pode ser reaproveitada algumas vezes, assim, retornar

Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 84

a solução para um frasco coberto com papel alumínio e armazenar a temperatura ambiente.

• Adicionar ao gel 100 mL da solução descorante rápida ou lenta e incubar sob

agitação lenta até que se possa visualizar as bandas proteicas.
Obs: o aquecimento da solução descorante no micro-ondas pode acelerar o
processo de descoloração do gel.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O SDS atua como um agente solubilizante, é um detergente que desnatura as
estruturas terciárias e secundárias, e também recobre as proteínas com cerca de uma
molécula de SDS para cada resíduo de aminoácido. Desta forma o SDS contribui com
uma grande carga final negativa, tornando a carga intrínseca da proteína insignificante[8].
Ainda contribui para a total abertura e linearização da estrutura proteica, a adição de
β-mercaptoetanol, composto responsável por reduzir as ligações dissulfeto. Assim, ao
serem submetidas a um campo elétrico, as proteínas completamente desnaturadas e
recobertas pelo SDS negativo, migram em direção ao eletrodo positivo sendo separadas
conforme as massas moleculares.
O APS e o Temed catalisam a polimerização da acrilamida. O APS forma radicais
livres de oxigênio em solução aquosa catalisados pelo Temed, uma amina terciária. Os
radicais livres atuam na polimerização de acrilamida e bis-acrilamida, formando a matriz
do gel [9].
Após a eletroforese, as proteínas são visualizadas pela adição de um corante, como
o Coomassie R-250 que dão cor às bandas de proteína de forma reversível. Isto porque
em um meio ligeiramente ácido, o ânion corante é atraído eletrostaticamente pelos grupos
NH3+ da proteína e formam um complexo firme, mas que pode ser removido totalmente
alterando o pH[10].
Obs: Acrilamida é um composto neurotóxico, cancerígeno e mutagênico. Por isso,
é necessário cuidado ao manusear essa substância, principalmente o pó. Evitar qualquer
contato com a pele e os olhos, para isto, faça o uso de máscara e luvas e certifique-se
de que a ventilação do ambiente é adequada. Pesar com cuidado, evitar a formação e
dispersão de poeira, não inalar o pó ou vapores de acrilamida.

REFERÊNCIAS
[1] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature, 227: p.680-685, 1970.

[2] Vesterberg O. A short history of electrophoretic methods. Electrophoresis, 14(12): p.1243-1249,

1993.

Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 85

[3] Wieland T; Fischer, E. Naturwissenschaften. 35: p.29-30, 1948.

[4] Raymond S; Weintraub L. Science, 130: p.711, 1959.

[5] Shapiro AL; Vinuela E; Maizel IV. Molecular weight estimation of polypeptide chains by
electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun., 28: p.815-820, 1967.

[6] Reid MS and Bieleski RL. A simple apparatus for vertical flat-sheet polyacrylamide gel
electrophoresis. Anal. Biochem., 22: p.374-381, 1968.

[7] Studier, FW. Bacteriophage T7. Science 176 (4033): p.367-376, 1972.

[8] Nelson DL; Cox MM. Princípios de bioquímica de Lehninger. 6 ed. Porto Alegre:Artmed, 2014.

[9] Maurer HR. Disc Electrophoresis and Related Techniques of Polyacrylamide Gel Electrophoresis De
Gruyter; 2nd REV. and Expand. 1971. Reprint ed. Edição, 1978.

[10] St Groth FS; Webster RG; Datyner A. Two new staining procedures for quantitative estimation of
proteins on electrophoretic strips. Biochim Biophys Acta., 71: p.377-391, 1963.

Links:
Animação da técnica de SDS-PAGE
https://www.youtube.com/watch?v=i_6y6Z5UvwE&ab_channel=BiologywithAnimations

Como fazer um SDS-PAGE

https://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4&ab_channel=labtricks

Gel de poliacrilamida SDS-PAGE 86

Avanços em Biologia Molecular
Os primeiros relatos do uso de conceitos relacionados ao DNA e hereditariedade foi
quando os seres humanos começaram a praticar a criação de forma seletiva, produzindo
colheitas e rebanhos mais robustos. Alguns filósofos gregos também exploraram a ideia da
herança humana e Aristóteles, inclusive, sugeriu que os traços adquiridos durante a vida de
um organismo poderiam ser transmitidos a sua prole[1]. Da observação à prática, iniciamos
os primeiros relatos científicos da genética em 1865, quando Gregor Mendel, conhecido
como pai da genética, propôs os fundamentos da hereditariedade. Em 1868 o médico suíço
Friedrich Miescher chamou o material genético de nucleinas e em seguida, por volta de
1902, Theodor Boveri e Walter Sutton postularam que os cromossomas eram os portadores
das unidades hereditárias. Desde então, muitos cientistas fizeram importantes descobertas
na área da genética e biologia molecular como: Frederick Griffith (1928), Phoebus Levene
(1929), Erwin Chargaff (1940), Rosalind Franklin (1952), Watson e Crick (1953)[1, 2].
Analisando o histórico da pesquisa do DNA e hereditariedade verificamos que cada
um desses pesquisadores atuou frente ao seu tempo, usando as tecnologias existentes
em sua época e produzindo informação científica de qualidade. Atualmente as informações
científicas são produzidas em grande escala pelos laboratórios de pesquisa, informatizados
e possuem equipamentos com tecnologias de ponta. Além disso, a internet se tornou uma
importante ferramenta científica para compartilhar os trabalhos e resultados obtidos, de
forma rápida e brilhante.
Contrapondo às tecnologias de ponta, Mendel em seu laboratório improvisado,
cultivando ervilhas ao fundo do prédio, atuou sem tecnologias avançadas, sem estudantes
de mestrado ou doutorado, sem suporte financeiro e nem por isso deixou de ter notável
papel na ciência: transformando o simples em um marco histórico. Infelizmente Mendel
faleceu em 1884 e a importância dos seus trabalhos só foi conhecida 16 anos após sua
morte [1-3].
Os avanços em Biologia Molecular são cada vez mais surpreendentes e a cada ano
surgem novas técnicas aplicadas ao estudo do DNA, como o sequenciamento, técnicas
para manipulação de genes, edição de genomas, entre outras. A ciência está em expansão,
sempre criando ou aprimorando técnicas de estudo para compreender a dinâmica da
informação genética e a sua relação com a vida[3-7].

SEQUENCIAMENTO DE DNA - PRIMEIRA GERAÇÃO

Após Watson e Crick desvendarem a estrutura tridimensional do DNA, surgiu a
necessidade de entender o que estava por trás desta molécula, o que era o real sentido
do código genético, e os mistérios que vinham por trás dele. Para alcançar tal objetivo,
foi realizado, na década de 70, o sequenciamento genômico, cujo objetivo era ler todas

Avanços em Biologia Molecular 87

as informações contidas no DNA da célula humana. Esse sequenciamento, conhecido
como primeira geração, usou a técnica de separação por comprimento de polinucleotídeos
através da eletroforese em gel, onde os fragmentos de DNA eram separados conforme o
comprimento das cadeias. [3].
Essa técnica foi utilizada em dois protocolos: o procedimento de Alan Couson
e Frederick Sanger, cujo princípio é baseado no uso da DNA polimerase e dos
didesoxinucleotídeos (ddNTPs) para determinar a sequência de nucleotídeos por meio de
uma fita simples de DNA; e o protocolo de Allan Maxam e Walter Gilbert, que utiliza a
clivagem química para identificar a sequência das bases, após marcar radioativamente a
terminação 5’ dos fragmentos de DNA[1].

SEQUENCIAMENTO DE DNA - SEGUNDA GERAÇÃO

No início do século XXI surgiu o método de pirosequenciamento (454 Roche), a
primeira plataforma de sequenciamento de nova geração, essa técnica não utiliza a
clonagem prévia de fragmentos e sequência milhares de DNA e amostras em paralelo. Nesse
método, quando um nucleotídeo é agrupado na molécula de DNA, um pirofosfato é liberado
na reação e sua luz é detectada[4]. A partir disso, surgiram os chamados Sequenciamento
de Nova Geração (NGS), com tecnologias que possibilitaram o sequenciamento de um
volume maior de DNA de maneira mais rápida e com o custo menor, quando comparado
com o sequenciamento de primeira geração. Outras metodologias foram criadas
como o sequenciamento por ligação (SOLiD), metodologia de semicondutores (Ion),
sequenciamento por síntese (Illumina) e o sequenciamento de moléculas únicas (Pacific
Biosciences e o Oxford Nanopore)[5].

SEQUENCIAMENTO DE DNA - TERCEIRA E QUARTA GERAÇÕES

Atualmente, com os avanços proporcionados pela ciência, novos métodos de
sequenciamento estão sendo desenvolvidos como a terceira geração de sequenciamento,
que utilizam do método shotgun, pois saltam a etapa da PCR, visto que esse processo
está incluso no sequenciamento automatizado. O fato de não ser necessário fragmentar e
amplificar o DNA permite um ganho na agilidade e precisão do sequenciamento.
A quarta geração do sequenciamento é ainda mais recente, essa geração iniciou
após o surgimento dos sequenciadores portáteis, lançado pela primeira vez com o MinION
da Oxford Nanopore. O método foi desenvolvido para uso em campo, com tecnologia
que permite o sequenciamento de trechos curtos e longos de fragmentos do DNA, essa
tecnologia utiliza de proteínas canais em um chip (flow cell), por onde os fragmentos de
DNA passam, ao longo do processo são liberadas variações na corrente elétrica da flow

Avanços em Biologia Molecular 88

cell, permitindo a leitura[6].
A capacidade de sequenciamento atual permite comparar grandes extensões de
DNA em vários indivíduos diferentes. As técnicas são aprimoradas constantemente e
os ganhos para a ciência são imensuráveis como, diagnósticos e terapias de doenças
genéticas, melhoramento genéticos de animais e plantas, sequenciamento de vírus e
bactérias, monitoramento ambiental, além de uma gama enorme de possibilidades a serem
descobertas.

RT-PCR
A Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) é uma evolução
da técnica de PCR, sendo capaz de quantificar um RNA específico utilizando a enzima
transcriptase reversa para gerar DNA complementar (cDNA) a partir de um molde de
RNA. Após esse procedimento, ocorre a reação em cadeia da polimerase com intuito de
amplificar o cDNA presente, caso ele seja o equivalente ao primer utilizado.
A RT-PCR pode ser utilizada na análise de expressão gênica, visto que é possível
analisar o RNA responsável pela síntese proteica. Além disso, essa técnica é amplamente
utilizada para diagnosticar infecções, uma vez que ocorre a amplificação e detecção do
cDNA quando um vírus está presente na amostra. Na pandemia do novo coronavírus
(Covid-19), essa técnica foi considerada padrão ouro no diagnóstico, uma vez que a técnica
permite identificar a presença do vírus em amostras com baixas quantidades de carga
viral[7].

CRISPR-CAS9
O Nobel de Química de 2020 foi concedido à duas pesquisadoras pela técnica de
CRISPR, inspirada pela forma como as bactérias utilizam seu sistema imune primitivo.
Basicamente, com essa técnica é possível modificar genomas com precisão e eficiência
nunca antes alcançada[8, 9, 10].
Nas bactérias, o locus CRISPR é uma região no seu material genético que é
“misturada” com trechos de DNA de vírus que as infectaram no passado. Quando uma
espécie de vírus, que já teve seu material genético incorporado ao DNA da bactéria, invade
esse microrganismo, ela gera um RNA a partir desse trecho específico que se associa à
enzima Cas-9 e cliva o DNA viral, inativando-o[9].
A partir disso, como a ciência aplicou esse sistema na biologia molecular e engenharia
genética? É simples, na célula existe um núcleo formado por cromossomos com longas
cadeias de DNA. Com o auxílio da CRISPR, um trecho do material genético alvo é “cortado”
e um RNA formulado com a sequência alvo de interesse serve como transportador que

Avanços em Biologia Molecular 89

auxilia a enzima Cas no corte preciso do DNA. Após esse processo, o DNA clivado pode
ser reparado por meio das junções diretas a partir das pontas causadas pelo corte, ou pode
ocorrer a inserção de um DNA “doador” que será inserido na região do corte. Sendo assim,
é possível corrigir alterações na sequência do DNA ou inserir mutações específicas[10].

REFERÊNCIAS
[1] Jean Gayon. From Mendel to epigenetics: History of genetics, C R Biol, 016;339(7-8): p.225-230,
2016.

[2] Dahm, R. Friedrich Miescher e a descoberta do DNA. Biologia desenvolvente. doi.org/10.1016/j.

ydbio.2004.11.028, 2005

[3] Sanger F; Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with
DNA polymerase. Journal of molecular biology, v. 94, n. 3: p.441-448, 1975.

[4] Heather JM; Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, v.
107, n. 1: p.1-8, 2016.

[5] Mardis ER. Next-Generation Sequencing Platforms. Annual review of analytical chemistry, v. 6:
p.287-303, 2013.

[6] Jain M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community.
Genome biology, v. 17, n. 1: p.1-11, 2016.

[7] Freeman WM; Walker SJ; Vrana KE. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques.
26(1): p.112-125, 1999.

[8] Zhang PH; Marraffini L; Barrangou R; Fauci A; Plummer F. Prêmio Nobel de Química 2020 a la
edición génica con tecnología CRISPR/Cas9. MEDICINA (Buenos Aires), v. 80, n. 6: p.738-740, 2020.

[9] Driehuis E; Clevers H. CRISPR/Cas 9 genome editing and its applications in organoids. American
Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, v. 312, n. 3: p.257-265, 2017.

[10] Arend M; Pereira J; Markoski M. O Sistema CRISPR/Cas9 e a possibilidade de edição genômica

para a cardiologia. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v. 108, n. 1: p.81-83, 2017.

Avanços em Biologia Molecular 90

CONSIDERAÇÕES FINAIS: A CIÊNCIA É CONSTRUÍDA COM A
SOMA DE VÁRIOS ESFORÇOS

Testar novas metodologias e estratégias que possam permitir ao estudante

uma experiência diferente daquela que ocorre nas aulas teóricas, além de melhorar
o entendimento acerca do conteúdo, contribui também por despertar o interesse pela
investigação científica. A vivência experimentada durante o desenvolvimento de práticas
científicas pode levar a muitas reflexões, que seriam raramente alcançadas durante a aula
teórica, simplesmente porque o indivíduo está fazendo parte do processo. As práticas
aplicadas durante a graduação contribuem para uma proposta educacional que aproxima o
discente do objeto de estudo e desperta, entre outras habilidades, o raciocínio científico [1, 2].
Na era da informação digital, das tecnologias avançadas e inúmeras descobertas
científicas, a sala de aula não é mais a protagonista do processo ensino x aprendizagem[3].
Fazer parte da descoberta científica é o que move os pesquisadores, e isso deve ser
sempre incentivado pelo professor durante as aulas, para que o discente, futuro cientista,
possa entender sua importância na solução de problemas que impactam a vida do homem.
Todos nós pesquisadores, quando graduandos, iniciamos a carreira científica
sonhando em realizar grandes descobertas, e acho isso maravilhoso. Entretanto, com o
passar do tempo, começamos a entender que “a cura do câncer”, por exemplo, só será
feita com a soma de vários esforços, de vários pesquisadores, de várias áreas, que, ao
contribuir com anos de trabalho, poderão fornecer informações importantes para outros
pesquisadores que ainda virão... e talvez estes façam a descoberta. E cada achado tem
a sua importância na história da ciência. Com o passar do tempo, terminamos o mestrado
ou doutorado, extremamente honrados por contribuir com a ciência, mesmo que não tenha
sido gerando um produto imediato.
Assim, termino dizendo que vivenciar a Ciência é um importante instrumento de
motivação, que impulsiona o graduando em formação e exercita suas capacidades criativas,
humanas e sociais, imprimindo em seu interior o desejo de transformar a sociedade [1, 2]
.
Débora de Oliveira Lopes

REFERÊNCIAS
[1] Paulo F. Pedagogia da autonomia: saberes necessários à prática educativa. São Paulo, 25 ed: p.52,
2004.

[2] National Research Council. How Students Learn: Science in the Classroom. Washington. p.264,
2005.

Considerações finais: A ciência é construída com a soma de vários esforços 91

Sobre os autores
BRUNO CARVALHO RESENDE - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/6755918379255189.
Pós doutor - Biologia Molecular ICB/UFMG.

CÁSSIO SIQUEIRA SOUZA CASSIANO - Link Lattes: http://lattes.cnpq.

br/0491292205069465. Aluno de doutorado - Ciências da Saúde - UFSJ.

DÉBORA DE OLIVEIRA LOPES - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/1497095411339190.

Professora Universidade Federal de São João del Rei.

DÉBORA PATRÍCIA MARTINS DE DEUS - Link Lattes: http://lattes.cnpq.

br/0982758135451642. Aluna de graduação - Bioquímica - UFSJ.

DIEGO LISBOA RIOS - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/0699520071972078. Pós

doutorando - Microbiologia ICB/UFMG.

JOSÉ ARIMATÉA DE ALELUIA JÚNIOR - Link Lattes: http://lattes.cnpq.

br/5489405361373363. Técnico em Segurança do Trabalho e Especialista em Sistemas
de Informação.

LETÍCIA DE AZEVEDO TEIXEIRA - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/7340540807301893.

Mestranda - Ciências da Saúde - UFSJ

PRISCILLA OLIVEIRA GIL - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/3873152521932762.

Mestranda - Bioquímica e Biologia Molecular - UFSJ.

SAMUEL GUIMARÃES COSTA PEREIRA - Link Lattes: http://lattes.cnpq.

br/3466710736942033. Aluno de graduação - Bioquímica - UFSJ.

SAULO NASCIMENTO DE MELO - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/2227481540925142.

Doutorando - Ciências da Saúde - UFSJ.

SIMONE DA FONSECA PIRES - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/6176557291233456.

Professora do Instituto Federal Sudeste MG.

THALIA QUEIROZ LADEIRA - Link Lattes: http://lattes.cnpq.br/1864284966848761. Aluna

de graduação - Bioquímica - UFSJ

Sobre os autores 92
Sobre as organizadoras
DÉBORA DE OLIVEIRA LOPES - Cursou Ciências Biológicas (licenciatura) pela Universidade
Federal de Minas Gerais (2001), onde também realizou Mestrado (2003), Doutorado (2007) e
Pós-doutorado (2008) na área de Bioquímica e Biologia molecular. Foi pesquisadora Sênior
da Capes (2018), onde realizou um projeto de pesquisa junto à Universidade de Surrey
(Inglaterra). Atualmente é professora Associada III da Universidade Federal de São João
del Rei (UFSJ), onde coordena o laboratório de pesquisa de Biologia Molecular CT-Infra II
(Finep) junto ao programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde (PPGCS-UFSJ). É vice
presidente da comissão interna de Biossegurança da UFSJ-CCO e tutora do grupo PET
Bioquímica (MEC). Atua nas áreas de biologia molecular, bioinformática e bioquímica.

SIMONE DA FONSECA PIRES – Cursou Ciências Biológicas (Bacharelado) pela Universidade

Federal de Minas Gerais (2002), com mestrado (2003), doutorado (2007) e pós doutorado
(2007-2012) em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais.
Atualmente é Professora do Instituto Federal Sudeste MG - Unidade Manhuaçu e atua nas
áreas de bioquímica, com ênfase em biologia celular e molecular, abordagem proteômica e
espectrometria de massas.

Sobre as organizadoras 93