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AULA
Microscopia óptica

Ao fim desta aula, você deverá ser capaz de:

objetivos

• Traçar um breve histórico da microscopia.

• Definir o que é um microscópio.
• Conceituar limite de resolução.
• Descrever os princípios de funcionamento de um microscópio
simples.
• Listar os principais tipos de microscópios ópticos e suas aplicações.
• Enumerar as principais etapas do preparo de amostras para
microscopia óptica.
Biologia Celular I | Microscopia óptica

INTRODUÇÃO O primeiro problema a enfrentar no estudo das células é o seu tamanho:

as células são pequenas demais para serem observadas a olho nu. Por esse
motivo, as primeiras células foram observadas e descritas apenas no século
XVII, quando foi inventado o microscópio óptico.
Você tem idéia de qual é o tamanho de uma célula? As maiores células (algumas
amebas de vida livre, células de algas filamentosas) medem cerca de 0,2mm;
mas, em média, uma célula é 10 ou 20 vezes menor do que isso.
Você sabe qual o tamanho dos menores objetos que podemos distinguir a olho nu
(sem ajuda de instrumentos especiais)? A resposta você vai encontrar mais adiante.
Podemos distinguir uma formiga de uma pulga, mas somos capazes de ver os
olhos desses insetos?

a b

Figura 1.1: (a) Insetos como o mosquito Aedes são visíveis a olho nu, mas para vermos
detalhes como o olho composto (b), necessitamos utilizar equipamentos especiais
(Fotos: Márcia Attias).

HISTÓRICO

No século XVII, foram construídos os primeiros microscópios. Com

um deles, Robert Hooke (veja o boxe explicativo) observou lâminas de
cortiça, chamando células aos pequenos espaços regulares da sua estrutura
(Figura 1.2). Mais tarde, tanto Hooke quanto outros pesquisadores da
época observaram que as células vivas não eram ocas como a cortiça, mas
o nome original permanece até hoje. Não seria injusto ou incorreto dizer
que o estudo da Biologia Celular começou nessa época.

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 1 MÓDULO 1
AULA
Figura 1.2: (a) Microscópio seme-
lhante ao usado por Hooke.
As partes componentes são análo-
gas às dos microscópios usados
hoje em dia. (b) Reprodução de
um desenho feito por Hooke a
partir da observação de lâminas de
cortiça ao microscópio construído
por ele. Cada um dos espaços
foi por ele chamado de célula.
a b

Robert Hooke (1635-1703)

O inglês Robert Hooke foi, em pleno século XVII, o que hoje chamamos de “homem
dos sete instrumentos”, atuando com contribuições relevantes nos campos da
Física, Astronomia, Química, Biologia, Geologia, Arquitetura e Tecnologia Naval.
Foi colaborador de cientistas como Isaac Newton, seu grande rival da época, e
Robert Boyle, a quem auxiliou na determinação das leis dos gases. Correspondeu-
se com Antony van Leeuwenhoek confirmando suas observações ao microscópio.
Entre outras criações, inventou ou melhorou instrumentos como o barômetro
e o anemômetro e um mecanismo que tornou os relógios mais precisos.
A Lei de Hooke, equação que descreve a elasticidade, é empregada até hoje. Suas
contribuições nos campos da Biologia e Paleontologia não foram menos importantes.
A reputação de Hooke na história da Biologia se deve em grande parte a sua obra
Micrographia, publicada em 1665. Hooke desenvolveu o microscópio composto
e o sistema de iluminação mostrados na Figura 1.2.a, utilizando-o para descrever
detalhadamente uma grande variedade de organismos como insetos, esponjas, penas
e aquela que parece ser sua maior contribuição, finas lâminas de cortiça (Figura 1.2.b).
Em desenhos detalhados, Hooke descreveu a estrutura como pequenos poros, semelhantes a
favos de mel, dando-lhes o nome de células (= pequenas celas, alojamentos dos monges nos
conventos). Embora as estruturas observadas correspondessem apenas às paredes celulares
de células vegetais já mortas, o nome prevaleceu e dele derivaram os termos Citologia e,
mais modernamente, a Biologia Celular. Sua obra permanece até hoje, embora não exista
nenhum registro de sua própria aparência.

Outro pioneiro da Microscopia e da

Biologia Celular foi Antony van Leewenhoek,
holandês que construía seus próprios
microscópios (Figura 1.3) com apenas uma Amostra
Parafuso de
lente, mas com resolução suficiente para focalização

observar até mesmo protozoários e bactérias.

Lente
Figura 1.3: Um dos microscópios
montados por Leeuwenhoek.

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Biologia Celular I | Microscopia óptica

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)

Embora tenha feito descobertas fundamentais em Biologia, como as bactérias e os protozoários
(parasitas e de vida livre), Antony van Leeuwenhoek não era um cientista convencional para seu
tempo. Ser filho de comerciantes, sem fortuna, sem educação universitária e sem dominar outros
idiomas senão o holandês já seria o bastante para excluí-lo do ambiente acadêmico da época.
Ainda assim, com habilidade extraordinária para polir lentes, uma curiosidade infinda e uma mente
aberta e livre dos dogmas científicos de sua época (o século XVII), Leeuwenhoek foi o primeiro a
descrever as hemácias, os espermatozóides e muito mais. Acredita-se que, inspirado pelo livro de
Hooke, Micrographia, Leeuwenhoek começou a polir lentes e a fabricar seus microscópios, tendo
montado mais de 500 deles.
Seus microscópios (Figura 1.3), embora dotados de uma única lente, eram capazes de aumentar
até em 200 vezes os objetos. Por outro lado, a iluminação era deficiente e sua manipulação
bastante desconfortável para o observador. Em 1673, Leeuwenhoek começou a enviar cartas com
suas observações à recém-criada Royal Society of London. Em 1680 foi eleito Membro Titular da
mesma, juntando-se a Robert Hooke, Isaac Newton, Henry Boyle e outros cientistas de renome
marcantes até nossos dias.

PRINCÍPIOS DO FUNCIONAMENTO DE UM MICROSCÓPIO

ÓPTICO

Os microscópios ópticos atuais (Figura 1.4) guardam grande

semelhança com os primeiros modelos usados por Hooke (Figura 1.2.a).

Lente ocular
Foco macrométrico

Foco micrométrico
Figura 1.4: Principais compo-
nentes de um microscópio Objetiva
óptico simples. Platina
Lente condensadora
Fonte de iluminação

Em todos os microscópios ópticos, atuais e antigos, teremos uma

fonte de luz que é concentrada por um sistema de lentes condensadoras
sobre uma amostra montada sobre uma lâmina. O feixe luminoso atravessa
a amostra e é captado por uma lente objetiva que produz uma primeira
imagem ampliada do objeto, que será em seguida captada pela lente ocular
que projetará a imagem final na retina do observador (Figura 1.5).

10 CEDERJ
 MÓDULO 1
1
AULA
Figura 1.5: Esquema da formação da imagem em um microscópio óptico simples.

QUANTO AUMENTA UM MICROSCÓPIO ÓPTICO?

O aumento final é o resultado da multiplicação do aumento dado

pela lente objetiva pelo aumento da lente ocular. Como existem várias
lentes objetivas num mesmo microscópio, uma grande variedade de
aumentos pode ser facilmente atingida, bastando girar o revólver. Assim,
se utilizamos uma objetiva de 20x e uma ocular de 10x, o aumento final
será de 200x (10x20=200). Hoje em dia não é mais necessário desenhar
as imagens observadas (como Hooke e seus contemporâneos faziam):
a imagem final pode ser capturada por uma câmara fotográfica, de vídeo
ou ainda por um sistema de computação. Uma ampliação suplementar
pode ser obtida ampliando uma fotografia da imagem observada.
Entretanto, de nada adiantaria ampliar a imagem além de determinado
ponto, pois nenhuma informação suplementar será obtida. Este é o
princípio do limite de resolução.

O LIMITE DE RESOLUÇÃO

Se dependêssemos apenas de nossos olhos, não conseguiríamos

enxergar nada que medisse menos de 0,2mm. Este é o limite de resolução
de nossos olhos (se enxergarmos muito bem, diga-se de passagem). Graças
aos microscópios ópticos, pudemos distinguir objetos que medem até
1 milésimo desse valor, isto é, o limite de resolução dos microscópios
ópticos é de 0,2µm. Naturalmente, isso depende da qualidade das lentes,
mas, principalmente, do comprimento de onda da luz utilizada. Para
saber como esse valor foi calculado, consulte o boxe a seguir.

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Biologia Celular I | Microscopia óptica

O limite de resolução
O ponto-chave da Microscopia, seja ela óptica ou eletrônica, é o limite de resolução de
um microscópio. Este conceito é bastante simples: trata-se da menor distância entre dois
pontos em que eles podem ser vistos como objetos distintos.

Complicado? Nem tanto, observe a seguir:

A B

Os objetos A e B estão a uma distância que nos permite separá-los como distintos, mas se
eles estiverem muito próximos, não podem ser nitidamente separados, ou seja, o poder de
resolução dos nossos olhos não é suficiente para determinar os limites de cada objeto.

A B
Esse conceito é universalmente expresso na seguinte fórmula: d = 0,61λ
α
em que:
d= limite de resolução.
λ = comprimento de onda da radiação utilizada; no caso do feixe luminoso do microscópio
óptico, 550nm.
α= n.sen θ, onde n é o índice de refração do meio (ar/água) e q é metade do ângulo
formado pelo cone de luz que entra na objetiva (Figura 1.6).

Lente objetiva

Cone de luz

Lâmina contendo a amostra

Figura 1.6

Feitas as contas, d= 0,2µm no microscópio óptico e, como você deve saber, 1µm = 10-6m.

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 MÓDULO 1
Na próxima aula, você verá que esse limite foi novamente

1
As células e as

AULA
ultrapassado com a construção de microscópios eletrônicos, capazes estruturas que
as compõem são
de resolver (distinguir) objetos de até 0,2nm. Caso você não esteja muito pequenas
familiarizado com estas UNIDADES DE MEDIDA, consulte a Figura 1.7. para serem medidas
em centímetros ou
A Figura 1.7 é uma escala relativa das dimensões de células milímetros, como
os objetos do nosso
e estruturas subcelulares, assim como do alcance dos instrumentos cotidiano. Portanto,
(microscópios) utilizados na sua descrição e estudo. para elas usamos as
UNIDADES DE MEDIDA
dos micrômetros
(símbolo µm)
e nanômetros
(símbolo nm).
O micrômetro vale 1
milésimo do milímetro
e o nanômetro
vale 1 milésimo do
micrômetro.

1m= 103mm
ou 106mm
ou 109nm

Observação: 103 é a
maneira simplificada
com que os
Figura 1.7: Escala comparada do limite de resolução da microscopia óptica matemáticos escrevem
e da eletrônica e os objetos que cada uma pode discriminar. as potências de 10,
isto é, igual a 1.000;
da mesma forma 106 é
1.000.000, e assim
por diante.
Se você ainda não está convencido de que a resolução não depende
só das lentes, fique sabendo que Antony van Leeuwenhoek já observara
bactérias no século XVII, quando a tecnologia para construção de lentes
e microscópios era muito inferior à de nossos dias, mas as propriedades
físicas da propagação da luz eram as mesmas.
Caso você esteja considerando ampliar indefinidamente uma
imagem observada ao microscópio óptico até conseguir enxergar a
estrutura da membrana celular, por exemplo, podemos adiantar que
isso será tão eficaz quanto ampliar uma foto 3x4 para contar quantos
cílios há na pálpebra superior esquerda da pessoa.
Concluindo: aumento e resolução são coisas distintas, e o
aumento que não traz informações adicionais sobre a amostra
é chamado aumento vazio.
Por que será que isso acontece? Tudo é conseqüência da luz.

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 Biologia Celular I | Microscopia óptica

Observe a Figura 1.8: a luz se propaga na forma de

ondas. Estas ondas colidem com as partículas que formam a
amostra, sofrendo interferências. Assim se origina a sensação
de contraste (claro/escuro). A onda, por sua vez, representa
a luz visível: apenas objetos até um determinado tamanho
são grandes o bastante para causar interferência no trajeto
do raio luminoso. Objetos menores passam despercebidos,

a e não causam alteração na propagação da onda.

Figura 1.8: O comprimento de onda da luz sofre interferência de

objetos de determinado tamanho (a), enquanto objetos menores
não desviam o trajeto da luz (b). Os do primeiro tipo são visíveis,
e os do segundo, não.
b

!
Dê uma paradinha!
Imagine-se andando de bicicleta numa ciclovia. Você segue em linha reta à velocidade da
luz. Você é um raio de luz! Pedrinhas, formigas e outros pequenos objetos não impedem
que você continue deslizando suavemente, sem interferências.
Já uma chapinha de refrigerante ou um pedregulho podem fazer sua bicicleta se desviar
do trajeto e, no caso de obstáculos maiores, podem impedir sua passagem. Assim se
comporta a luz ao atravessar as amostras observadas ao microscópio óptico. Agora,
chega de passear: de volta ao estudo!

OS DIFERENTES MICROSCÓPIOS ÓPTICOS

Além de pequenas, as células possuem outras características que

tornam difícil sua observação:
1. em geral, são transparentes;
2. são muito hidratadas e frágeis;
3. quando em órgãos ou tecidos, precisam ser cortadas em lâminas
finas que permitam a passagem do feixe luminoso.

Por conta disso, foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos tanto
novas técnicas de preparo das amostras (vide boxe), que lhes conferissem
maior resistência e contraste, quanto novas tecnologias na construção de
microscópios que permitissem a observação de células vivas.

14 CEDERJ
 MÓDULO 1
1
O preparo de amostras para o microscópio óptico de campo claro

AULA
Para que possam ser guardadas por muito tempo, as amostras de células e tecidos precisam em
geral de um tratamento químico que garanta sua preservação. Esse tratamento inclui várias
etapas.

1. Fixação: é o tratamento da amostra com substâncias químicas, como o formol, que preservam
sua forma original.

2. Desidratação: é a substituição da água presente dentro e fora das células por um solvente
orgânico, como o etanol ou metanol. Esse solvente tanto pode ser removido deixando a lâmina
secar quanto pode ser substituído por parafina ou outra resina que torne o tecido rígido,
permitindo que seja fatiado.

3. Microtomia: tecidos como fígado ou músculo são muito espessos e precisam ser cortados em
fatias mais finas, que permitam a passagem parcial da luz. Uma vez embebidos em parafina,
deixa-se solidificar, e o tecido pode ser cortado (fatiado).

4. Coloração: como a maioria das células e seus componentes não são naturalmente coloridos, uma
série de corantes foi testada e, devido a sua afinidade química por determinados componentes
celulares, são empregados, ajudando na identificação dos diferentes compartimentos celulares.
O azul de metileno é um desses corantes.

Mais detalhes sobre as técnicas de preparo de amostras para microscopia óptica, você terá em
outra disciplina.

OS DIFERENTES MICROSCÓPIOS ÓPTICOS

O resultado disso é que existe hoje uma grande família de microscópios

ópticos, cada um com suas vantagens e limitações sobre os demais. Dentre
os de uso mais corriqueiro, é essencial que você conheça:
1. Microscópio de campo claro ou microscópio simples:
é o microscópio “padrão” representado na Figura 1.9.a. Em
geral, requer que a amostra seja fixada e corada antes da
observação (Figura 1.9.b). Entretanto, desde que a iluminação
seja ajustada fechando-se um pouco mais a passagem de luz
pela condensadora, é possível observar células a fresco, isto é, b

sem coloração prévia (Figura 1.9.c).

Lente ocular

Foco macrométrico

Foco micrométrico

Objetiva c
Platina
Condensador
Fonte de iluminação Figura 1.9: Em (a), microscópio óptico de campo claro. Em (b),
hemócito (célula do sangue) de um molusco corado. Em (c), células
a que revestem a mucosa bucal observadas sem nenhum tipo de
corante. Que estruturas você reconhece? (Fotos b: Marco Antonio
V. Santos, c: Raul D. Machado).

CEDERJ 15
Biologia Celular I | Microscopia óptica

2. Microscópio de contraste de fase: dispensa o uso de corantes,

permitindo a observação de células vivas (Figura 1.10). Um sistema de filtros
(anéis de fase) interfere no trajeto da luz, criando um contorno claro/escuro
em torno das estruturas celulares. Esse contraste permite a observação de
células vivas, mas se elas estiverem muito aglomeradas, a imagem se torna
confusa, requerendo um sistema óptico mais elaborado.

a b

Figura 1.10: A luz, ao interagir com um sólido (= célula), tem sua trajetória atrasada, criando um contraste em
relação à luz que não encontrou nenhum obstáculo (a) (esquema à esquerda). Esse é o princípio do microscópio
de contraste de fase. À direita (b), você vê as mesmas células epiteliais (retiradas da mucosa bucal) já observadas
em campo claro tal como aparecem nesse microscópio. Há um halo em torno da célula e de algumas de suas
estruturas internas.

3. Microscópio de contraste interferencial: também utiliza filtros

para criar contraste a partir de diferenças no trajeto da luz. A imagem
final é mais agradável para o observador (Figura 1.11), mas o sistema é
menos comum, pois é mais caro que o contraste de fase. Também permite
observar células vivas. Quando essas células estão dispostas em camadas,
pode-se focalizar apenas um plano, obtendo-se assim cortes ópticos sem
que o tecido seja cortado.

Figura 1.11: As mesmas células epite-

liais, observadas na Figura anterior,
agora em contraste interferencial.
A imagem sombreada dá noção de
relevo das estruturas celulares (Foto:
Raul D. Machado).

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 MÓDULO 1
4. Microscópio de fluorescência: utiliza uma fonte de luz ultravioleta

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AULA
e requer o uso de corantes fluorescentes (você verá mais detalhes na Aula
6) que se ligam a componentes específicos das células. Esses corantes
são capazes de absorver luz de um determinado comprimento de onda
(ultravioleta, por exemplo) e emitir num outro, dentro do espectro visível
(Figura 1.12). Em algumas situações, as células podem ser observadas
vivas; em outras, não.
O mais comum é que um modelo possa ter seus jogos de lentes
e fontes de luz alternados (intercambiados) para que se possa observar
amostras pelos três métodos.
5. Microscópio confocal de varredura a laser: a conjugação da
ciência da computação aos microscópios de fluorescência trouxe uma
nova dimensão à microscopia óptica.
O microscópio confocal possui, além de uma fonte de luz visível,
uma fonte de luz ultravioleta e uma fonte de raio laser. O feixe de laser
incide sobre a amostra; um sistema de filtros e aberturas especiais captura
sucessivamente a fluorescência emitida de vários planos focais.
Este conjunto de imagens é capturado digitalmente, e imagens como
as da Figura 1.13.b em que você pode ver a distribuição de microtúbulos
em uma célula são geradas em programas específicos de computador.

a b

Figura 1.12: (a) Microscópio confocal de varredura a laser do Laboratório de Ultra-

estrutura Celular do Instituto de Biofísica da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ). (b) Distribuição de microtúbulos em uma célula de mamífero (Foto: Tecia
Ulisses de Carvalho).

CEDERJ 17
Biologia Celular I | Microscopia óptica

Alguns links interessantes – apesar de serem em inglês, vale a

pena visitar esses endereços na internet.

1- Dados biográficos de Leeuwenhoek

http://www.ucmp.berkeley.edu/history/leeuwenhoek.html

2- Dados biográficos de Robert Hooke

http://www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke.html

3- Museu da Microscopia. Tutoriais sobre princípios de óptica. Galeria

de imagens, vídeos on line. Vale a visita
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/museum/index.html

4- Página da Sociedade Americana de Biologia Celular que disponibiliza

muitos links, imagens e vídeos interessantes.
http://www.ascb.org/

5- Atlas de imagens de Microscopia (óptica e eletrônica), organizado

pelo departamento de Histologia da UERJ.
http://www2.uerj.br/~micron/

6- Maravilhosas imagens de fluorescência obtidas em microscópio de

fluorescência confocal.
http://www.molbio.princeton.edu/confocal/510image2/
Zeisslist2.html

7- Imagens de protistas em Microscopia óptica de contraste interferencial

e de fase. Links para imagens desses mesmos organismos em microscopia
eletrônica, mostrando como vários métodos de observação devem ser
conjugados na análise de um organismo.
http://megasun.bch.umontreal.ca/protists/gallery.html -

8- Página da Nikkon, com tutoriais onde se pode manusear virtualmente

vários tipos de microscópio óptico.
http://www.microscopyu.com/tutorials/
Faça sua própria busca na internet a partir de palavras-chave como:
• Microscopia
• Microscope
• Fluorescência
• Fluorescence
• Células
Se quiser, faça outras buscas, com palavras que você escolher.

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 MÓDULO 1
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RESUMO

AULA
Os microscópios ópticos começaram a ser construídos no século XVII, e com
eles foram observadas e batizadas as primeiras células. O aperfeiçoamento na
construção de lentes, filtros e sistemas de iluminação deu origem a uma grande
variedade de microscópios ópticos. Além dos de campo claro, que requerem que
o material seja corado, existem microscópios de contraste de fase e de contraste
interferencial, onde as células podem ser observadas vivas e sem coloração
especial. Os microscópios de fluorescência permitem ver estruturas normalmente
muito finas para serem observadas com os comprimentos de onda da luz visível.
O microscópio confocal a laser inaugurou uma nova era na microscopia óptica,
mas a observação da maior parte das estruturas que compõem a célula só é
possível com um instrumento de maior poder de resolução: o microscópio
eletrônico, tema da próxima aula.

EXERCÍCIOS

1. Com base no que foi estudado, calcule o aumento final de um microscópio

óptico que utilize as seguintes combinações de lentes oculares e objetivas:

Ocular Objetiva Aumento final

5x 40x
10x 20x
20x 10x
10x 100x

2. Por que as células receberam esse nome?

3. Compare o microscópio de Hooke (Figura 1.2) com o modelo atual (Figura 1.4),
identificando as partes análogas.

4. Qual a importância de cada um dos componentes listados a seguir para

observação ao microscópio óptico?

• fonte de luz;
• lente condensadora;
• espessura da amostra;
• contraste da amostra.

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Biologia Celular I | Microscopia óptica

5. Em que tipo(s) de sistema óptico podemos observar células vivas e sem a adição
de corantes?

6. O que você entende por microscopia de fluorescência?

7. O que é limite de resolução? Qual o limite de resolução do microscópio óptico?

8. Uma hemácia mede 8mm(oito milímetros ). Quando observada sob um aumento

total de 1000 vezes, quanto medirá?

9. Por que, em geral, o núcleo é a única estrutura claramente visível dentro de

uma célula observada ao microscópio óptico?

10. Converta para as unidades correspondentes:

5µm =………...nm

0,5mm= …….. µm

100µm = ……..nm

1000µm= …….mm

60nm=……..….µm

11. Uma célula foi fotografada com 2000x de aumento no microscópio óptico. Uma
estrutura que tenha na realidade 2µm aparecerá com que comprimento na foto?

12. Procure determinar em que tipo de microscópio óptico foram obtidas as imagens
que estão na última página deste livro. Se conseguir identificar as amostras, melhor
ainda; caso contrário, consulte o gabarito desta aula no final do livro.

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