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Diversidade
Microbiana da
Amazônia
Vol. 4
Editores:
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Copyright © 2024, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

PRESIDENTE DA REPÚBLICA
Luiz Inácio Lula da Silva

MINISTRA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E INOVAÇÃO

Luciana Barbosa de Oliveira Santos

DIRETOR DO INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

Henrique dos Santos Pereira

EDITORA INPA
Editor: Mario Cohn-Haft. Produção editorial: Rodrigo Verçosa, Shirley Ribeiro Cavalcante,
Tito Fernandes.

EDITORAÇÃO ELETRÔNICA
Tito Fernandes, Mellanie Valdivia

FOTOGRAFIAS DA CAPA
Denise Vilela de Rezende, Liane Cristine Rebouças Demosthenes, Luiz Antonio de Oliveira

FICHA CATALOGRÁFICA

D618 Diversidade microbiana da Amazônia. / Editores Luiz Antonio de Oliveira, Juliana

Gomes de Souza Oliveira, Luadir Gasparotto, Jania Lilia da Silva Bentes, Liliane Coelho
da Rocha, Maria Aparecida de Jesus, Suanni Lemos de Andrade, Kátia Santana Cruz,
Antônia Queiroz Lima de Souza.- Manaus : Editora do INPA, 2024.

xii, 844 p. : il. color.- (Volume 4)

ISBN: 978-65-5633-058-7
DOI: https://doi.org/10.61818/56330587

1. Microbiologia - Amazônia. I. Oliveira, Luiz Antonio de. II. Oliveira, Juliana Gomes
de Souza. III. Gasparotto, Luadir. IV. Bentes, Jania Lilia da Silva. V. Rocha, Liliane
Coelho da. VI. Jesus, Maria Aparecida de. VII. Andrade, Suanni Lemos de. VIII. Cruz,
Kátia Santana. IX. Souza, Antônia Queiroz Lima de.

CDD 579.698 11

Editora do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

Av. André Araújo, 2936 – Caixa Postal 2223
Cep : 69067-375 Manaus – AM, Brasil
Fax : 55 (92) 3642-3438 Tel: 55 (92) 3643-3223
www.inpa.gov.br e-mail: [email protected]
 iii

AGRADECIMENTOS

Pelo apoio financeiro para a realização do evento.

iv
Comitê Editorial do livro
Diversidade Microbiana da Amazônia Volume 4

Luiz Antonio de Oliveira

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]

Jania Lilia da Silva Bentes

Universidade Federal do Amazonas
[email protected]

Gilvan Ferreira Da Silva

[email protected]

Juliana Gomes de Souza Oliveira

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]

Luadir Gasparotto
Embrapa Amazônia Ocidental
[email protected]

Liliane Coelho da Rocha

Universidade do Estado do Amazonas
[email protected]

Maria Aparecida de Jesus

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]

Suanni Lemos de Andrade

Universidade do Estado do Amazonas
[email protected]

Kátia Santana Cruz

Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado
[email protected]

Antônia Queiroz Lima de Souza

Universidade Federal do Amazonas
[email protected]

Antônia Queiroz Lima de Souza

Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
 v

APRESENTAÇÃO

Temos a grata satisfação de apresentar o 4° volume do livro Diversidade Microbiana da Amazônia, contendo a maioria
dos trabalhos apresentados no 8° Congresso sobre Diversidade Microbiana da Amazônia (8° CDMicro), realizado em
Manaus no período de 24 a 27 de abril de 2023.
Este livro é uma coletânea abrangente, que explora a vasta diversidade de microrganismos presentes na Amazônia,
dividida em cinco áreas principais de estudo. Alimentos: Com cinco capítulos, esta seção aborda a importância dos
microrganismos na produção e preservação de alimentos, destacando seu papel na fermentação e na segurança alimentar.
Ambiental: A maior seção do livro, com 39 capítulos, foca na diversidade microbiana em diferentes ecossistemas
amazônicos. Discute a interação dos microrganismos com o meio ambiente, seu papel na decomposição de matéria
orgânica e na ciclagem de nutrientes. Básica: Com 19 capítulos, esta área cobre os fundamentos da microbiologia,
incluindo a identificação e caracterização de espécies microbianas, bem como estudos sobre a genética e fisiologia dos
microrganismos. Industrial: Esta seção, com 7 capítulos, explora as aplicações industriais dos microrganismos, como a
produção de biossurfactantes e outros bioprodutos de interesse econômico. Médica e Veterinária: Com 11 capítulos,
esta parte do livro investiga o papel dos microrganismos na saúde humana e outros animais, incluindo estudos sobre
patógenos, resistência antimicrobiana e o potencial terapêutico de microrganismos amazônicos.

A Comissão Organizadora
vi
SUMÁRIO

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 1

Análises micológicas do licor de taperebá (Spondias mombin L.) 1

Viana, Paula Manuele dos Santos; Ferreira, Darlison Conceição; Aguiar, Aline Lima; Ferreira,
Rayane Bonfim; Romano, Maria Lita Padinha Corrêa; Fonseca Júnior, Élcio Meira da; Otani,
Fabrizia Sayuri; Canto, Eveleise Samira Martins

Avaliação in vitro do extrato de casca da castanha-do-Brasil (Bertholletia 11

excelsa H.B.K) frente as bactérias patogênicas
Sousa, Maria Lucidalva Ribeiro de; Luciano, Jackeline da Silva; Albuquerque, Isabela Ribeiro
de; Sousa, Francy Mary Galucio; Lemos, Hanna Barbosa; Rocha, Waldireny Caldas; Freitas,
Adriana Dantas Gonzaga de; Kluczkovski, Ariane Mendonça

Contagem de Lactobacillus helveticus em queijos frescais condimentados com 18

pimenta murupi amarela (Capsicum chinense Jacq.)
Campos, Daniela Cavalcante dos Santos; Sousa, Layane Crystine Oliveira; Saldanha, Mário
Vinícius da Silva; Lima, Julia Ellen de Costa; Oliveira, Izabely Gomes; Silva, Anderson do
Nascimento; Costa, Nívea Acioly Azevedo; Duarte, Daniel de Sousa; Oliveira, Lailson de Sousa;
Lopes, Jalison

Produção de proteases fibrinolíticas por Pleurotus citrinopileatus (Fr.) Singer 27

(Basidiomycota, Pleurotaceae)
Farias, Viviane Gonçalves de; Santana, Romário da Silva; Gomes, Waldireny Rocha

Produção e análise de corantes vermelhos do fungo amazônico Chaetomium 35

sp., para uso na indústria alimentícia
Dirane, Icaro Rosas Dirane; Couceiro, Douglas de Moraes; Souza, Antonia Queiroz Lima;
Souza, Afonso Duarte Leão; Fernandes, Kamila Rangel Primo

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL E AGRÍCOLA 45

Acessando o potencial bioativo de Streptomyces sp. MAD39, isolada de 46

sedimentos do rio Madeira baseado em análises in silico do genoma
Pereira, Sílvia Vitória Cruz Gonçalves; Yamagishi, Michel Eduardo Beleza; Silva, Gilvan
Ferreira; Caniato, Fernanda Fatima

Análise do genoma completo de Labrys sp. CPAA013 revela o seu potencial 57

biotecnológico para a agricultura e biorremediação
Sousa,Thiago Fernandes Sousa; Queiroz, Claudia Afras de Queiroz; Silva, Gilvan Ferreira

Análise filogenômica e prospecção de moléculas de uma nova espécie de 72

Burkholderia isolada do Rio Juruá
Queiroz, Claudia Afras de; Sousa, Thiago Fernandes; Silva, Annie de Souza e; Silva, Gilvan
Ferreira da

Análise in silico do potencial de produção de metabólitos de Trichoderma 84

asperelloides
Fonseca, Jennifer Salgado; Gwinner, Raoni; Sousa, Thiago Fernandes; Koolen, Hector
Henrique; Silva, Gilvan Ferreira; Fernandes, Kamila Rangel Primo; Souza, Afonso Duarte Leão;
Souza, Antonia Queiroz Lima
 vii

Análise in vitro do potencial de bactéria do gênero Streptomyces no 93

biocontrole de fitopatógenos de interesse agrícola
Mendes, Valdir da Costa; Queiroz, Claudia Afras de Queiroz; Costa, Gerodes Vasconcelos;
Baia, Frankyrley Laison Jesus; Bandeira, Izabel Correa; Sousa, Thiago Fernandes; Silva, Gilvan
Ferreira

Análise metataxonômica de bactérias degradadoras de combustível diesel 99

obtidas do rio Juruá, AM
Santos, Samára Ferreira; Sousa, Thiago Fernandes; Queiroz, Claudia Afras de; Yamagishi,
Michel Eduardo Beleza; Silva, Gilvan Ferreira da

Antagonismo de isolados de Trichoderma spp. contra fungos fitopatogênicos 108

habitantes do solo
Willerding, André Luis; Coelho Netto, Rosalee Albuquerque; Assis, Luiz Alberto Guimarães;
Silva, Gilvan Ferreira; Sousa, Sandra Barbosa1; Freitas, Sara; Cristine, Nayara; Handa, Rogério
Eiji

Avaliação de métodos de inoculação de cepas de Bacillus e efeito na 119

produtividade de milho
Silva, Felipe Campos; Alves, Talles Henrique Pereira; Rodrigues, Victor Alef; Aragão, Ana Luisa;
Bini, Daniel; Santos, Flávia Cristina, Marriel, Ivanildo Evódio; Paiva, Christiane Abreu de
Oliveira

Bactérias nativas de Roraima com potencial para o controle da escaldadura 125

do arroz
Araújo, Ramila Santana de, Dutra, Lesliê de Cássia do Espírito Santo, Pereira, Gilmara Maria
Duarte, Schurt, Daniel Augusto

Caracterização da água do igarapé do Mindu e utilização de fungos 135

filamentosos no seu biotratamento
Silva, Isaque Ferreira; Campos, Maria Eduarda dos Santos; Matos, Rosangela Santana Martins;
Souza, Ivanete Ferreira; Silva, Ingrid Reis

Caracterização da população bacteriana presente em mucilagem produzida por 146

raízes aéreas de sorgo sacarino
Alves, Talles Henrique Pereira; Silva, Felipe Campos; Ribeiro, Tamara Palhares; Lana, Ubiraci
Gomes de Paula; Parrella, Rafael Algusto da Costa; Paiva, Christiane Abreu de Oliveira

Diversidade de fungos filamentosos no Campus da Universidade Federal do 154

Amazonas, (UFAM) Manaus, Brasil
Fernandes, Kamila Rangel Primo; Almeida, Maria de Fátima Oliveira; Alves, Thalita Caroline
Lima; Bieler, Phillipe Defáveri; Couceiro, Douglas de Moraes; Souza, Antonia Queiroz Lima
de; Souza, Afonso Duarte Leão de

Diversidade de macrofungos do gênero Fulvifomes Murrill 165

(Hymenochaetaceae, Basidiomycota) na região amazônica
Marques-Laborda, Juan Phillipe; Peres, Rafaela Saraiva; Jesus, Maria Aparecida

Diversidade de Xylaria hill ex Schrank (Xylariaceae) de áreas próximas a 177

cidade de Manaus-AM
Ferreira, Suzana Mineiro; Cruz, Kely da Silva; Jesus, Maria Aparecida de
viii

Diversidade do gênero Fuscoporia murrill (Hymenochaetaceae, 192

Basidiomycota) na Amazônia brasileira
Peres, Rafaela Saraiva; Marques-Laborda, Juan Phillipe; Jesus, Maria Aparecida

Efeito da adubação do solo e inoculação com bactérias solubilizadoras de 201

fosfato na colonização micorrízica da caroba (Jacaranda copaia (Aubl.)
D.Don)
Rodrigues, Elen Carla Pereira de Goes, Moreira, Francisco Wesen, Minelli-Oliveira, Cassiane,
Oliveira, Luiz Antonio

Efeito da adubação e inoculação com bactérias solubilizadoras de fosfato na 210

colonização micorrízica da castanheira de macaco (Cariniana micrantha)
Rodrigues, Elen Carla Pereira de Goes; Moreira, Francisco Wesen; Minelli-Oliveira, Cassiane;
Oliveira, Luiz Antonio de

Eficiência de bactérias endofíticas de milho, solubilizadoras de fosfato de ferro 218

III (FePO4) in vitro
Batista, Fernanda de Cássia; Rodrigues, Victor Alef; Souza, Fabiane Ferreira; Bini, Daniel;
Oliveira, Maycon Campos; Marriel, Ivanildo Evódio; Paiva, Christiane Abreu Oliveira

Eficiência de espécies de Bacillus, Paenibacillus e Pseudomonas na promoção 228

de crescimento do milho (Zea mays L.)
Diniz, Gisele de Fátima Dias; Alves, Talles Henrique Pereira; Rodrigues, Victor Alef; Silva,
Felipe Campos; Cota, Luciano Viana; dos Santos, Vera Lúcia; de Oliveira-Paiva, Christiane
Abreu

Genômica comparativa e Potencial biossintético de Streptomyces MAD1003, 240

isolada de sedimentos do Rio Madeira, para produção de metabólitos
secundários
Costa, Gerodes Vasconcelos; Queiroz, Claudia Afras de Queiroz; Mendes, Valdir da Costa;
Raposo, Débora de Sena; Sousa, Thiago Fernandes; Bandeira, Izabel Correa; Koolen, Hector
Henrique Ferreira; Silva, Gilvan Ferreira

Identificação e análise de gene efetores do gênero Neopestalotiopsis com base 252

no genoma completo
Baia, Frankyrley Laison; Sousa, Rodrigo da Silva; Caniato, Fernanda Fátima; Neto, Adhemar
Zerlotini; Mendes, Valdir da Costa; Silva, Gilvan Ferreira

Investigação de extratos brutos de fungos endofíticos no controle do Aedes 263

aegypti e Sclerotinia sclerotiorum
Ferreira, Maria Eduarda Gonçalves; Menezes Júnior, Orivaldo Teixeira de; Costa, Maria Beatriz
Silva; Demosthenes, Liane Cristine Rebouças; Espindola, Laila Salmen; Souza, Antônia Queiroz
Lima de; Oliveira Camila Martins de

Levantamento de fungos filamentosos em áreas de cultivo em municípios da 271

bacia do baixo e médio Amazonas
Vilamil, Edriely Souza; Macêdo, Rosinara da Silva; Neves, Suelem Cristina Albuquerque;
Moreira, Railson Nogueira; Demosthenes, Liane Cristine Rebouças

Mineração genômica de Bacillus velezensis MPUR 51.6 voltada a identificação 282

de genes relacionados ao biocontrole e promoção de crescimento vegetal
Amorim, Ana Beatriz Araújo; Sousa, Thiago Fernandes; Silva, Gilvan Ferreira
 ix

Mineração genômica de Penicillium labradorum INPA-AP10: prospecção de 292

Produtos Naturais em linhagem isolada de sedimentos do rio Amazonas
Silva, José Carlos Ipuchima; Neves, Kiandro de Oliveira Gomes; Queiroz, Claudia Afras de;
Yamagishi, Michel Eduardo Beleza; Koolen, Hector Henrique Ferreira; Silva, Gilvan Ferreira

Monilíase do cacaueiro e cupuaçuzeiro: impactos e desafios na Amazônia 316 305

Leite, Rodrigo Serpa Vieira; Gasparotto, Luadir

Monitoramento de comunidades fúngicas rizosféricas e endofíticas associadas 318

a estádios fenológicos da soja
Matsumura, Aida T. S; Matsumura, Akio S.; Martins Jr, Marcos Cardoso; Da Silva, Márcia
Eloísa; Grassotti, Tiela Trapp; Costa, Letícia Da Fontoura Xavier; Matsumura, Akira S

Obtenção de cultura micelial e atividade biológica de fungos Basidiomycota 327

da região de Santarém, Pará, Brasil
Silva, Ana Luiza Figueira; Vieira, Nayra Quetlen Avinte; Silva, Graciely Gonsalves; Aguiar,
Aline Lima; Ferreira, Rayane Bonfim; Santana, Marcos Diones Ferreira; Canto, Eveleise Samira
Martins

Occorrência de macrofungos lignocelulolíticos em pontes de madeira na 335

rodovia Álvaro Maia (Br-319), Amazonas, Brasil
Jesus, Maria Aparecida de; Costa, Jéssica; Paula, Estevão Vicente Cavalcanti Monteiro de ;
Silva, Ademir Castro

Paenibacillus polymyxa induz a síntese de glutationa redutase no milho e reduz 348

a podridão do colmo
Marins, Mikaely Sousa; Diniz, Gisele de Fátima Dias; Alves, Talles Henrique Pereira; Silva,
Dagma Dionísia; Paiva, Christiane Abreu de Oliveira; Pfenning, Ludwig Heinrich; Cota,
Luciano Viana

Potencial para promoção de crescimento de plantas em bactérias endofíticas 357

da rabo-de-guariba
Bandeira, Izabel Correa; Sousa,Thiago Fernandes; Lima, Ícaro Nascimento; Mendes, Valdir da
Costa; Costa, Gerodes Vasconcelos da; Silva, Gilvan Ferreira da

Predição in silico de efetores de Fusarium decemcellulare, agente causal do 367

superbrotamento do guaranazeiro
Chagas, Steffany Souza; Zerlotini Neto, Adhemar; Silva, Gilvan Ferreira; Caniato, Fernanda
Fatima

Predição in silico de efetores do patógeno foliar do guaranazeiro 380

Neopestalotiopsis formicidarum (Maharachch., K.D. Hyde & Crous, 2014)
Pereira, Virgínia Maria da Silva; Zerlotini Neto, Adhemar; Silva, Gilvan Ferreira; Caniato,
Fernanda Fatima

Produção de biossurfactantes por Trichoderma spp. obtidos de solos da 390

Amazônia
Menezes, Nadionara Costa; Rodrigues, Suziane Pinto; Oliveira, Luiz Antonio de

Produção de peptídeos da classe dos peptaibols por Trichoderma amazonicum 397

Castro, Gleucinei dos Santos; Silva, Gilvan Ferreira da; Koolen, Hector Henrique Ferreira
x

Prospecção de produtos naturais de interesse biotecnológico com base na 406

análise genômica de Streptomyces sp. MAD 27
Neves, Kiandro de Oliveira Gomes; Silva, José Carlos Ipuchima; Queiroz, Claudia Afras;
Yamagishi, Michel Eduardo Beleza; Koolen, Hector Henrique; Silva, Gilvan Ferreira

Prospecção genômica de quitinases de Bacillaceae isoladas de sedimentos de 417

rios amazônicos
Teixeira, Charles Araújo; Queiroz, Claudia Afras de; Sousa, Thiago Fernandes; Silva, Gilvan
Ferreira da

Prospecção genômica do isolado Bacillus sp. MAD202 como potencial na 423

indústria agrícola
Nascimento, Maria Giovana Cavalcante do; Sousa, Thiago Fernandes; Queiroz, Cláudia Afras
de; Silva, Gilvan Ferreira

Regulador transcricional LaeA em Trichoderma spp: identificação e 433

arquitetura genômica
Fernandes, Joelma dos Santos; Queiroz, Claudia Afras; Sousa, Thiago Fernandes; Hanada,
Rogério Eiji; Koolen, Hector Henrique Ferreira; Silva, Gilvan Ferreira

Seleção de isolados de Trichoderma spp. para controle biológico de Sclerotium 443

rolfsii em tomateiros
Willerding, André Luis; Coelho Netto, Rosalee Albuquerque; Assis, Luiz Alberto Guimarães;
Silva, Gilvan Ferreira; Sousa, Sandra Barbosa; Freitas, Sara; Blind, Ariel Dotto; Figueiredo, José
Nilton Rodrigues; Hanada, Rogério Eiji

Soybean productivity with Trichoderma asperellum seed treatment in different 452

regions of the Brazilian Cerrado
Chagas Junior, Aloisio Freitas, Chagas, Lillian França Borges

Transformação genética de Trichoderma sp. com GFP e análise de 467

micoparasitismo contra Fusarium decemcellulare
Fernandes, Joelma dos Santos; Silva, Ingride Jarline Santos; Queiroz, Claudia Afras; Sousa,
Thiago Fernandes; Hanada, Rogério Eiji; Silva, Gilvan Ferreira

MICROBIOLOGIA BÁSICA 478

Ação larvicida de leveduras do gênero Rhodotorula da Amazônia para o 479

controle de Aedes aegypti
Katak, Ricardo de Melo; Fonseca, Raissa Sayumy Kataki; Muniz, Veranilce Alves; Oliveira, Juan
Campos; Souza, João Vicente Braga; Souza, Érica Simplício; Roque, Rosemary Aparecida

A funga documentada: o Herbário HSTM e a descentralização do 489

conhecimento micológico no Estado do Pará, Brasil
Soares, Daniel Marinho; Santana, Marcos Dione Ferreira; Canto, Eveleise Samira Martins

Atividade antiparasitária de Streptomyces spp. contra o Trypanosoma cruzi 498

Gonçalves, Franque Ferreira; Jarline, Ingride Santos da Silva; Silva, Gilvan Ferreira da; Lima,
João Marcelo Silva; Procópio, Rudi Emerson de Lima
 xi

Autenticação e avaliação da síntese de enzimas de interesse industrial por 505

representantes do gênero Aspergillus
Barbosa, Elliza Emily Perrone; Pimenta, Laynah; Batista, Samara Cláudia Picanço; Brito, Ana
Kézia Pimentel de; Nobrega, Jordane Pimentel; Menezes, Adryene Mota de; Caetano, Thyago
Souza; Martim, Salomão Rocha; Teixeira, Maria Francisca Simas

Caracterização morfológica de Aspergillus spp. com divergência taxonômica da 516

Coleção de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural do INPA
Silva, Isabelly Guimarães Oliveira; Ferreira, Suzana Mineiro; Oliveira, Luiz Antonio; Jesus,
Maria Aparecida

Conhecendo o metaboloma de um fungo isolado de Annona jahnii saff. do 529

norte da Amazônia Brasileira
Xavier, Luciana Araújo; Porto, Carla; Flach, Adriana; Pilau, Eduardo Jorge; Costa, Luiz Antonio
Mendonça Alves da

Efeito dos meios de cultura na produção de amilases e proteases de 538

rizobactérias amazônicas
Medeiros, Rosângela Pereira; Moura, Luciana Aparecida Santos; Minelli-Oliveira, Cassiane;
Oliveira, Luiz Antonio de ; Oliveira Júnior, Paulo Rocha

Estudo taxonômico de macrofungos ressupinados, (Polyporales, 546

Basidiomycetes) da região Amazônica
Lima, Marly Castro; Jesus, Maria Aparecida; Abreu, Raimunda Liége Souza

Identificação de cluster gênicos biossintéticos nas linhagens de Streptomyces 556

MPUR-28.3 e MPUR-51.7
Souza, Rafael Pinto; Costa, Denise Xavier; Lopes, Eraldo Ferreira; Queiroz, Claudia Afras;
Yamagishi, Michel Eduardo Beleza; Silva, Gilvan Ferreira

Isolamento e patogenicidade de bactérias cultiváveis isoladas do ciclo 566

biológico de Aedes aegypti para o controle deste vetor
Oliveira, Juan Campos; Katak, Ricardo de Melo; Rocha, Elerson Matos; Muniz, Veranilce
Alves; Silva, William Ribeiro; Carmo, Edson Junior; Roque, Rosemary Aparecida; Astolfi-Filho,
Spartaco

Levantamento da coleção de macrofungos do Herbário INPA 576

Lima, Marly Castro; Cabral, Tiara Sousa; Gordiano, Ruby Vargas-Isla; Hopkins, Michael John
Gilbert; Ishikawa, Noemia Kazue; Oliveira, Jadson José Souza de

Linhagens de Paecilomyces spp. (Eurotiales, Ascomycetes) depositadas na 586

Coleção Microbiológica – INPA
Silva, Isabelly Guimarães; Nóbrega, Jordane Pimentel; Ferreira, Suzana Mineiro; Jesus, Maria
Aparecida

Manutenção de culturas de macrofungos (Basidiomycetes) da Coleção de 595

Microrganismo de Interesse Agrossilvicultural – INPA
Jesus, Maria Aparecida; Silva, Isabelly Guimarães; Ferreira, Suzana Mineiro; Nogueira, Renata
Geovana Costa; Oliveira, Luiz Antonio
xii

Obtenção de cultivo monospórico de fungos mitospóricos Aspergillus e 609

Paecilomyces depositados na Coleção Microbiológica do INPA
Ferreira, Suzana Mineiro; Silva, Isabelly Guimarães; Jesus, Maria Aparecida de

Ocorrência de macrofungos corticióides (Basidiomycetes, Corticiaceae) na 616

Região Amazônica
Pereira, William Wallace da Silva; Sousa, Sabrina Sinara Portela de; Costa, Flavio Fabian; Jesus,
Maria Aparecida de

Penicillium citrinum isolado da região amazônica: uma nova fonte de enzima 632
fibrinolítica
Souza, Thayana Cruz; Schwarz, Marcos Gustavo Araujo; Silva, Daniela Marinho; Maia,
Carolina Rabelo; Oliveira, Luiz Antonio; Degrave, Wim Maurits Sylvain; Mendonça-Lima,
Leila; Fernandes, Ormezinda Celeste Cristo

Prospecção de Bacillus spp. para produção de enzimas quitinases para o 643

controle de Aedes aegypti
Souza, Izane Maria Matos; Rocha, Elerson Matos; Oliveira, Juan Campos; Muniz, Veranilce
Alves; Souza, Douglas Vitor Barbosa; Roque, Rosemary Aparecida; Katak, Ricardo de Melo

Screening de Bacillus spp. da Amazônia para o controle de Aedes albopictus e 654

Anopheles spp
Katak, Ricardo de Melo; Muniz, Veranilce Alves; Oliveira, Juan Campos; Tavares, Claudia
Patrícia da Silva; Silva, William Ribeiro; Nascimento Neto, Joaquim Ferreira; Rocha, Elerson
Matos; Roque, Rosemary Aparecida

Viabilidade dos métodos de sílica-gel e óleo mineral na preservação de 664

Penicillium spp. depositados na Coleção Microbiológica-INPA
Sousa, Sabrina Sinara Portela de; Melo, Roger Fagner Ribeiro; Barbosa, Renan do Nascimento;
Jesus, Maria Aparecida de

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL 671

Atividade enzimática de fungos filamentosos isolados de ambientes aquáticos 672

da região de Santarém, Pará, Brasil
Aguiar, Aline Lima; Ferreira, Rayane Bonfim; Silva, Ana Luiza Figueira; Santana, Marcos
Diones Ferreira; Canto, Eveleise Samira Martins

Atividades enzimáticas de fungos ascomicetos associados ao basidioma de 679

Hymenochaetaceae (Basidiomycota)
Couceiro, Douglas de Moraes; Almeida, Maria de Fátima Oliveira; Rodrigues, Rafael de Souza;
Souza, Afonso Duarte Leão; Astolfi Filho, Spartaco; Souza, Antonia Queiroz Lima

Avaliação de fungos endofíticos do gênero Aspergillus spp. isolados de Myrcia 687

guianensis como produtores de biossurfactantes
Soares, Angélica Ribeiro; Rodrigues, Juliana Gisele Corrêa; Albuquerque, Patrícia Melchionna

Efeito dos parâmetros nutricionais na produção de corante por Penicillium 692

gravinicasei P3SO332
Oliveira, Luciana Aires; Segundo, Walter Oliva Pinto Filho; Cortez, Ana Cláudia Alves; Souza,
Érica Simplício; Souza, João Vicente Braga
 xiii

Produção coagulante por uma espécie de Penicillium em resíduo da 698

fruticultura amazônica
Brito, Ana Kezia Pimentel; Pimenta, Laynah; Barbosa, Elliza Emily Perrone; Batista, Samara
Cláudia Picanço; Martim, Salomão Rocha; Teixeira, Maria Francisca Simas

Produção de proteases por Aspergillus oryzae var effusus para uso em processo 708
industrial
Pimenta, Laynah; Batista, Samara Claudia Picanço; Barbosa, Elliza Emily Perrone; Brito, Ana
Kezia Pimentel; Castro, Syandra Baiatones; Azevedo, Evila Silva Mortagua; Martim, Salomão
Rocha; Teixeira, Maria Francisca Simas

Tecnologia verde: recuperação da prata de filme de Raio-X processado com 715

proteases de fungo
Batista, Samara Claudia Picanço; Perrone, Elliza Emily; Brito, Ana Kézia Pimentel; Pimenta,
Laynah; Martim, Salomão Rocha; Nóbrega, Jordane Pimentel; Souza, Leidyane de Souza;
Teixeira, Maria Francisca Simas

MICROBIOLOGIA MÉDICA 724

Atividade larvicida de fungos Trichoderma isolados da região Amazônica 725

contra o vetor Aedes aegypti
Nonato, Mesaqueuri Mota; Araújo, Francys Sayara Andrade; Ríos-Velásquez, Cláudia María;
Moya, Kemily Nunes da Silva; Aquino, Priscila Ferreira

Avaliação do potencial antimicrobiano do extrato etanólico da Petunia 736

mexicana (Ruellia simplex C. Wright)
Albuquerque, Isabela Ribeiro; Freitas, Adriana Dantas Gonzaga; Nobre, Janaina da Costa
Nogueira; Souza, Maria Lucidalva Ribeiro; Luciano, Jackeline da Silva; Souza, Francy Mary
Galúcio; Farias, Mariana Nepomuceno

Bioprospecção de moléculas antibióticas em linhagem amazônica de 748

Streptomyces murinus MAD 24
Caldas, Luis Felype Garcia de Sousa; Queiroz, Claudia Afras de ; Silva, Gilvan Ferreira

Criptococose felina: primeiro relato de caso no município de Parintins 758

Amazonas, Brasil
Barroso, Layssa do Carmo; Segundo, Walter Oliva Pinto Filho; Oliveira, Luciana Aires de

Design in silico de epítopos da Mycobacterium tuberculosis com base na 766

proteína mpt64
Loureiro, Rebeca Trícia Oliveira; Procópio, Rudi Emerson de Lima

Distribuição espacial e frequência de casos de Sporothrix sp. em amostras 774

laboratoriais de Manaus
Nascimento, Pármenas Costa Macedo do; Plesu, Eldaiana Silva; Junior, Cláudio de Souza;
Guilherme Soares do Carmo; Danin, Amanda Paula Ferreira

Frequência de fungos identificados em laboratório de patologia clínica 784

veterinária em Manaus – AM
Nascimento, Pármenas Costa Macedo do; Plesu, Eldaiana Silva; Junior, Cláudio de Souza;
Guilherme Soares do Carmo; Danin, Amanda Paula Ferreira
xiv

Fungos endofíticos isolados da espécie Eleutherine plicata, Herb. (Iridaceae), 792

com atividade antibacteriana
Ferreira, Rayane Bonfim; Aguiar, Aline Lima; Silva, Ana Luiza Figueira; Sousa Junior, José
Jeosafá Vieira; Silva, Silvia Katrine Rabelo; Santos, Aysla Mclane Lobato; Canto, Eveleise
Samira Martins

Identificação de Candida spp. em cavidade oral de pacientes com carcinoma 802

de células escamosas
Silva, Denyson Reinaldo Xisto; Santos, Rosangela Brito; Feitosa, Felipe Aragão; Silva, Jacqueline
Botelho; Ono, Lia Mizobe; Andrade, Suanni Lemos

Perfil de sensibilidade a extratos vegetais por fungos filamentosos e 812

unicelulares
Baroni, Francisco de Assis; Silva, Vinicius Ribeiro da; Pereira, Juan Rojas; Alves da Silva, Vitória
Vieira; Oliveira, Aguida Aparecida; Campos, Sergio Gaspar; Bonci, Mário Mendes

Potencial antagônico de Bacillus spp. frente a fungos de importância médica, 819

agronômica e veterinária
Muniz, Veranilce Alves; Oliveira, Juan Campos; Matos, Izane Maria de Souza; Souza, Jakeline
Andrade; Souza, Douglas Vitor Barbosa; Brito, Ana Claúdia da Silva; Roque, Rosemary
Aparecida; Katak, Ricardo de Melo
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

1
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Análises micológicas do licor de taperebá (Spondias mombin L.)

Viana, Paula Manuele dos Santos1; Ferreira, Darlison Conceição1; Aguiar, Aline
Lima1; Ferreira, Rayane Bonfim1; Romano, Maria Lita Padinha Corrêa1; Fonseca
Júnior, Élcio Meira da1; Otani, Fabrizia Sayuri1; Canto, Eveleise Samira Martins1

1
Universidade Federal do Oeste do Pará.
Email: [email protected]

Resumo
O objetivo desta pesquisa foi avaliar a presença de fungos filamentosos e
leveduriformes em licor de taperebá armazenado durante um período de 30 dias,
e elaborado com dois diferentes tipos de destilados. As amostras do licor de
taperebá foram produzidas no Laboratório de Tecnologia de Produtos de Origem
Animal (LTPOA), e as análises micológicas foram feitas no Laboratório
Multidisciplinar de Biologia Aplicada (LABIO) e no Laboratório de Micologia e
Bioensaios (LAMIB), da Universidade Federal do Oeste do Pará - UFOPA. Foram
feitos dois tratamentos de licor de polpa de frutos de taperebá, sendo um com
teor alcoólico de 37,5% com a bebida destilada vodca (tratamento V) e outro com
40% de teor alcoólico com a bebida alcoólica cachaça (tratamento C). As
análises micológicas foram feitas em duplicata para cada tratamento, utilizando
1 ml de amostra de licor de taperebá inoculados em meio de cultura ágar batata
dextrose acrescido de cloranfenicol, em três períodos: no dia em que o licor foi
produzido (T0), aos sete dias de armazenamento (T1) e aos 30 dias (T2). O
material inoculado foi armazenado em incubadora com Demanda Bioquímica de
Oxigênio - BOD, a 30°C. Após cinco dias de incubação das amostras inoculadas
e posterior isolamento das colônias, foram feitas contagens de fungos
filamentosos e leveduriformes para identificação morfológica. Foram obtidos no
total dos dois tratamentos, 22 cultivos purificados, sendo 11 filamentosos, seis
leveduriformes e cinco dimórficos. No tempo T0 obteve-se 10 isolados, no T1,
seis isolados e no T2, seis isolados. Os gêneros descritos morfologicamente
foram Penicillium e Aspergillus, com uma predominância de fungos filamentos
em todos os tratamentos, sendo que no T0 obteve-se um maior número de
isolados, totalizando 10 colônias. Assim, houve fungos filamentosos e
leveduriformes no licor de taperebá armazenado durante um período de 30 dias,
onde sugere que Aspergillus sp. pode ter sido fruto de possível contaminação
durante o período de cultivo. Por tanto, são necessários estudos futuros para
maior conhecimento da micologia isolada de destilados artesanais feitos de
frutos da região Norte.

Palavras-chave: Destilados, Fermentação, Fungos, Frutos Amazônicos.

Introdução
As frutas tropicais da região Amazônica têm características funcionais e
nutricionais de interesse comercial, e que contribuem para a fruticultura no Brasil.

1
 Esses frutos in natura, possuem características sensoriais e intrínsecas
com potencial para desenvolver produtos de alto valor econômico no país,
principalmente nas regiões norte e nordeste (Tsukui et al. 2012). Dentre os frutos
que se destacam na região amazônica está o Spondias mombin L., conhecido
popularmente na região norte como taperebá e no Nordeste cajá, com elevada
qualidade nutricional e sendo utilizado para fabricação de polpa congelada,
sorvetes, picolés, geleia e bebidas como os licores (Sabino 2020).
Os licores são bebidas produzidas e apreciadas mundialmente, e as
características que os diferenciam de outros destilados são o modo de preparo,
a matéria-prima e a sua finalidade (Marques et al. 1994). Seu processo de
fabricação tem como princípio, a inserção de álcool etílico, obtido por destilação,
xarope de açúcar e o uso de essência de ervas ou frutas in naturas ou
congeladas, seguido por decantação e filtração (Almeida e Gherardi 2019). A
graduação de álcool do licor varia de 15 a 54 % em seu volume total, e o
percentual de açúcar é superior a 30g.L-1, sendo produzido a partir de álcool e
elementos de origem vegetal, podendo ser comercializados em temperatura
ambiente, podendo agregar valor aos frutos com fins de aumentar a renda de
pequenos produtores da região (Oliveira et al. 2015).
A fabricação do licor é um processo simples que não exige técnicas
complexas na fabricação, mas há variações no processo fermentativo por parte
de microrganismos produtores de enzimas que influenciam na qualidade do
produto, podendo aumentar o tempo de vida de prateleira ou não (Penha et al.
2003). O baixo pH e altos conteúdos de açúcares dos frutos, favorecem o
crescimento de bolores e leveduras que são produtores de amilases, invertases,
lipases e proteases usadas nos processos industriais para a melhoria do valor
nutricional dos alimentos (Afsharnezhad et al. 2019).
Considerando a valorização de frutos tropicais na região amazônica e
escassas informações sobre microrganismos que compõem o processo
fermentativo de destilados nesta região, o presente trabalho teve como objetivo
avaliar a presença de fungos no licor de taperebá (Spondias mombin L.),
produzido com dois diferentes substratos alcóolicos, e armazenado em um
período de 30 dias.
Considerando a valorização de frutos tropicais na região amazônica e
escassas informações sobre microrganismos que compõem o processo

2
fermentativo de destilados nesta região, o presente trabalho teve como objetivo
avaliar a presença de fungos no licor de taperebá (Spondias mombin L.),
produzido com dois diferentes substratos alcóolicos, e armazenado em um
período de 30 dias.

Material e Métodos
O presente trabalho foi desenvolvido na Universidade Federal do Oeste
do Pará, município de Santarém. O licor foi elaborado no Laboratório de
Tecnologia de Produtos de Origem Animal (LTPOA), e as análises micológicas
foram feitas no Laboratório de Micologia e Bioensaios (LAMIB) e no Laboratório
Multidisciplinar de Biologia Aplicada (LABIO).

Elaboração do Licor
Foram feitos dois tratamentos de licor de polpa de frutos de taperebá,
sendo um com teor alcoólico de 37,5% com a bebida destilada vodca (tratamento
V) e outro com 40% de teor alcoólico com a bebida alcoólica cachaça (tratamento
C). Em ambos os tratamentos, utilizou-se polpa congelada do fruto de taperebá,
açúcar e água nas proporções 1:1. A água e açúcar foram aquecidos a uma
temperatura de 100 ° C, até fervura e consistência de calda perolada. Após
retirada do fogo, a calda foi misturada nas infusões de 500ml de polpa do fruto
de taperebá e os dois diferentes tipos de destilados e misturados até
homogeneização. Cada mistura foi envazada em frascos de vidro de 1 litro
identificados para cada tratamento.

Análises Micológicas
As análises micológicas foram feitas em duplicata para cada tratamento,
utilizando 1 ml de amostra de licor de taperebá inoculados em meio de cultura
ágar batata dextrose acrescido de cloranfenicol, em três períodos: no dia em que
o licor foi produzido (T0), aos sete dias de armazenamento (T1) e aos 30 dias
(T2).
O material inoculado foi armazenado em incubadora com Demanda
Bioquímica de Oxigênio (BOD), a 30 °C. Após 5 dias de incubação das amostras
inoculadas e posterior isolamento das colônias, foram feitas contagens de fungos
filamentosos e leveduriformes para identificação morfológica. O isolamento foi

3
feito em cabine de fluxo laminar com alça de Drigalski previamente esterilizada
e na área branca da lamparina. Cada linhagem fúngica foi isolada em placas de
Petri nas dimensões 90x15 mm em duplicata. Após o isolamento e incubação,
foi feito o método de observação a fresco das estruturas vegetativas e
reprodutivas através de fita-cola nas colônias fúngicas, acrescidas de uma gota
do corante azul de algodão e fixadas em lâminas para posterior microscopia e
caracterização.
A caracterização microscópica foi realizada por meio da técnica de
microcultivo (Riddell 1950) que possibilitam a comparação entre as
características morfológicas com a literatura micológica disponível (Barnett e
Hunter 1972; Larone 1993) para a realização da identificação dos fungos ao
menor nível taxonômico possível. Foram calculados os valores em porcentagem
de fungos filamentosos e leveduriformes para cada intervalo de tempo e
descritos de acordo com sua morfologia.

Resultados e Discussão
Foram obtidos, no total dos tratamentos, 21 cultivos purificados, sendo 10
filamentosos, seis leveduriformes e cinco dimórficos. Foi possível isolar no
período T0, nove isolados fúngicos, e seis isolados fúngicos tanto no período T1
como no T2. O período de 30 dias do presente estudo, é o tempo médio de
fermentação do etanol, conhecido por processo de envelhecimento do licor.
O quadro 1 apresenta a identificação dos fungos filamentosos que foi
realizada por análises morfológicas das colônias feitas por microscopia de
acordo com características de textura, morfologia, margem, pigmentação,
topologia e elevação.

4
Quadro 1. Caracterização morfológica de fungos filamentosos (F seguido de numeral de
identificação por ordem de descrição: F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8), presentes em licor de
taperebá, Spondias mombin L, preparado com cachaça (C) ou vodca (V), em três diferentes
tempos de análise (T0: Tempo zero, T1: após sete dias, T2: após 30 dias).

Todos os fungos filamentosos encontrados neste trabalho foram

identificados a nível de gênero. Para os fungos dimórficos e leveduriformes, não
foi possível a identificação taxonômica. A morfologia macro e micromorfológica
de alguns fungos pode ser observada na Figura 1.

1 2 3

1 2 3

Figura1: Macro e micromorfologia de fungos filamentosos encontrados no licor de taperebá. (1A

e 1B) Aspergillus sp.; (2A e 2B) Penicillium sp 1.; (3A e 3B) Penicillium sp 2.

Foram quantificados fungos presentes no estudo e avaliada a frequência

de ocorrência dos espécimes. Os resultados apresentaram uma predominância

5
de fungos filamentosos em todos os tratamentos quando confrontados com as
leveduras, sendo que no T0 houve um maior do número isolados do gênero
Penicillium totalizando 60%. A tabela 1, apresenta a frequência de ocorrência do
número de fungos isolados nos três diferentes tratamentos.

Tabela 1. Quantidade e frequência (%) de fungos encontrados no licor de taperebá (Spondias

mombin L.) em um período de 30 dias. (T0 - Tempo zero, T1 – Após sete dias, T2 – Após 30
dias).
T0 T1 T2
Microrganismos
FR FR FR
Penicillium spp. (6) 60% (1) 16,66% (2) 33,33%

Fungos filamentosos ------ (1) 16,66% -------

não identificados
Aspergillus sp. ------ ------- (1) 16,66%

Dimórficos (1) 10% (3) 50% (1) 16,66%

Leveduras (3) 30% (1) 16,66% (2) 33,33%

A B
Figura 2 – Frequência de isolados fúngicos, cultivados em dois tipos de destilados alcoólicos. A-
Tratamento feito com destilado cachaça; B- Tratamento feito com destilado vodca.

As análises micológicas do licor de taperebá indicaram uma quantidade

significativa de leveduras e bolores, com maior frequência de ocorrência para
fungos do gênero Penicillium no T0 e T2 e Aspergillus sp., o qual foi cultivado
após 30 dias de armazenamento do licor (T2).
Os microbiomas presentes em bebidas são importantes nos processos de
sacarificação, fermentação alcoólica e geração de sabores. Esses processos
além de preservar os alimentos também são responsáveis pelas características

6
nutricionais e palatáveis dos mesmos, bem como se estão apropriadas para o
consumo humano, pois podem causar DTAs.
As enzimas microbianas, apenas de bactérias e leveduras, são agentes
responsáveis pela fermentação de açúcares em etanol. Os gêneros Aspergillus
e Penicillium isolados na presente pesquisa, têm sido indicados como bons
produtores de enzimas hidrolíticas como exemplo as xilanolíticas, da classe das
xilanases, que catalisam a despolimerização da xilana, principal componente da
hemicelulose que representa aproximadamente 15 a 30% do peso dos materiais
lignocelulósicos o que aumenta o teor de açúcares livres (Knob e Carmona
2010).
Um exemplo de aplicações práticas é o Penicillium roqueforti espécie que
possui características que favorecem a maturação, por apresentar bom
desenvolvimento em diferentes condições de pH e capacidade de usar uma
variedade de compostos químicos como substrato (Mioso et al. 2015).
A espécie Aspergillus sp. também encontrada na presente pesquisa no
tempo T2, é considerado um bom produtor de enzimas pectinolíticas, sendo uma
das espécies mais usadas para a produção na indústria por ser classificado
como GRAS (generally recognized as safe) (Denti et al. 2022). Entretanto, é um
dos maiores patógenos humanos, causando desde infecções a intoxicações. A
detecção de uma linhagem no T2 e ausência nos tempos T0 e T1 sugerem
contaminação durante a manipulação.
Outra enzima obtida através de fungos e leveduras que fazem parte do
processo de cultivo é a Beta-amilase, que tem como função catalisar a hidrólise
do amido em glicose, da maltose e da maltrotriose, onde é determinante a sua
função nas características da cerveja, no qual produzem açúcares
fermentescíveis, servindo de alimento para a levedura durante o processo de
fermentação (Denti et al. 2022).
Denti (2021) afirma que essas enzimas são muito usadas para a
conversão dos produtos tornando-se atrativo devido sua especificidade e
favorecendo sua atividade em condições moderadas de temperatura e pH.
Sendo alternativas eficientes para vários processos de produção de bebidas,
como vinhos, cervejas, açucares e laticínios.

7
 No T2 houve um decréscimo de isolados de fungos filamentosos e
aumento de leveduriformes quando comparado a T0. Além disso, fungos
dimórficos também foram predominantes no T1 totalizando 50% os isolados.
As leveduras são responsáveis pelos processos de fermentação alcoólica
os quais seus produtos são sintetizados principalmente pelo catabolismo de
aminoácidos, também conhecido como via de Ehrlich (Hazelwood et al. 2008).
Estudos mostram a participação da levedura de saquê do gênero
Saccharomyces, cepas com características favoráveis, como alta capacidade de
fermentação a qual têm sido usadas para fabricação de saquê desde 1895,
demonstrando o papel da levedura benéfica na fermentação e melhoria da
qualidade do saquê (Ohya e Kashima 2019).

Conclusão
As linhagens de Penicillium e Aspergillus, estiveram presentes ao longo
das análises, onde o tratamento feito com vodca demonstrou ter maior
diversidade fúngica, portanto menor eficiência. Estudos adicionais precisam ser
realizados para acompanhar o papel da micobiota presente em bebidas
alcoólicas, a fim de avaliar possível patogenicidade desses microrganismos no
processo de produção, assim como a interação com os fatores físico-químicos
visando alcançar a qualidade sensorial das bebidas elaboradas com frutos da
região amazônica.

Referências
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8
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9
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10
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Avaliação in vitro do extrato de casca da castanha-do-Brasil

(Bertholletia excelsa H.B.K) frente as bactérias patogênicas

Sousa, Maria Lucidalva Ribeiro de1; Luciano, Jackeline da Silva1; Albuquerque,

Isabela Ribeiro de1; Sousa, Francy Mary Galucio1; Lemos, Hanna Barbosa1;
Rocha, Waldireny Caldas1; Freitas, Adriana Dantas Gonzaga de1; Kluczkovski,
Ariane Mendonça1

1
Universidade Federal do Amazonas.
Email: [email protected]

Resumo
Os extratos vegetais representam uma fonte detentora de novos compostos com
atividade antimicrobiana, capaz de fornecer novos medicamentos no combate
de bactérias causadoras de doenças. O crescimento constante da resistência
bacteriana aos antibióticos convencionais é um problema de relevância global.
Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar a atividade antibacteriana
do extrato etanolico da casca de castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) contra
duas bactérias Gram negativas: Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. A
extração dos compostos orgânicos, foram feitos a partir do método estático e
soxhlet. Os extratos obtidos foram testados quanto ao seu efeito antibacteriano
pelo método de disco de difusão com quatro repetições por concentração, as
concentrações (mg/mL) utilizadas foram: C1 (0,010), C2 (0,015), C3 (0,020) e
C4 (0,050) para cada extrato. Os halos foram observados por 72h, e
mensurados. A média das medidas foi usada no teste estatístico de Turkey a 5%
de significância. A melhor atividade antibacteriana para o extrato com a casca
de castanha-do-Brasil, e com 15,32 mm na média, para as linhagens testadas
de E. coli, P. aeruginosa, foi pelo método estático diferindo assim dos extratos
com o método soxhlet. No presente estudo foram encontrados, atividade
antibacteriana nos extratos etanólicos com a casca da castanha para as
concentrações testadas, entretanto, variadas frações deste extrato devem ser
testadas, visando os compostos que apresentam os potenciais antibacterianos.

Palavras-chave: Atividade antibacteriana; Compostos bioativos; Extratos

etanolicos.

Introdução
Apesar dos avanços técnico-científicos, as doenças infecciosas
continuam sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em
todo o mundo. Isso se deve à habilidade dos microrganismos em desenvolver
resistência a uma ampla gama de antibióticos, reduzindo assim a eficácia dos
tratamentos.

11
 As infecções causadas por bactérias são uma das principais
preocupações na área da saúde, pois são responsáveis pela alta taxa de
mortalidade em pacientes com o sistema imunológico comprometido, além de
altas taxas de surtos dentro de UTI’S neonatais (Santos et al. 2019).
O uso extensivo de medicamentos pode não ser benéfico em alguns
casos leves ou graves, e o uso de altas doses é associado ao aumento da taxa
de mortalidade. Através dos seus efeitos adversos, causam um atraso na
eliminação dos microrganismos associado e também aumentam o risco de
coinfecções bacterianas, já que os mesmos diminuem a capacidade de defesa
do organismo, impedindo que seja gerada uma resposta eficaz contra esses
agentes agressores, deixando então o paciente suscetível a infecções
secundárias (Tang et al. 2020).
A resistência antimicrobiana tem aumentado de forma desproporcional em
todo o mundo, gerando dificuldades no controle de infecções e contribuindo para
o aumento dos custos do sistema de saúde e dos próprios hospitais (Thabit et
al. 2015). Nesse mesmo contexto, a importância das pesquisas que buscam
alternativas torna-se fundamentais para aumentar as possibilidades de controle
microbiano, visto que muitas plantas possuem metabolitos secundários
diferentes, com as mais diversas ações sobre microrganismos patogênicos
(Gaspar et al. 2017).
Várias espécies de plantas vêm sendo pesquisadas como bioindicadores,
sendo promissores com excelentes resultados contra diversos microrganismos
que culminam a saúde de homens e animais (De Freitas et al. 2019). Bertholletia
excelsa H.B.K (1804) conhecida como castanha-do-Brasil que é muito difundida
na região Amazônica, sua semente é consumida de forma in natura, e muito
apreciada por ter um valor nutricional. Por ter em sua composição a Vitamina E,
propriedades antioxidantes, aminoácidos essenciais e ácidos graxos mono
insaturados a castanha-do-Brasil é uma grande aliada para controlar diversos
microrganismos (Martins et al. 2012).
A quantidade de cascas ao retirar as amêndoas que são descartadas
constitui mais de 50% do fruto. Dessa forma, agregar valor a estes subprodutos
é de interesse econômico e ambiental, sendo necessárias investigações
cientificas e tecnológicas que possibilitem sua utilização. Desse modo, esta
pesquisa é justificada pela necessidade de realizar mais pesquisas com extratos

12
vegetais para o controle dos microrganismos patogênicos resistentes aos
antibióticos atuais.
O objetivo deste trabalho foi investigar in vitro o potencial de ação
antibacteriana do extrato etanólico da casca da castanha de Bertholletia excelsa,
utilizando o método estático e soxhlet em frente à inoculação das cepas
bacterianas de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.

Material e Métodos
Local de Pesquisa
O trabalho foi realizado no Laboratório de Pesquisas em Microbiologia, no
prédio 1 do Instituto de Ciências Biológicas (ICB), localizado na Universidade
Federaldo Amazonas.
Processamento e obtenção do material
As cascas de castanha-do-Brasil, foram doadas por uma microempresa
da região de Manaus após o processo de separação das amêndoas. As
amostras chegaram em embalagens metálicas bem fechada (proteção da luz) e
lacrada a vácuo, em seguida as cascas foram higienizadas manualmente em
água corrente, após esse processo, foram colocadas em estufa de circulação de
ar e mantida a temperatura de 55 °C, por 5 dias. Após o período de secagem, as
cascas foram trituradas com auxílio de um moinho de facas modelo Tecnal,
obtendo 100 g do material triturado.
Preparação dos Extratos
Para a obtenção dos extratos etanolicos foram utilizados dois métodos:
Soxhlet e Estático, para os dois métodos foram utilizadas a medida de 50 g das
cascas de castanha triturada e 500 ml de etanol P.A. O método Soxhlet foi
desenvolvido no Laboratório de biotecnologia na Universidade Estadual do
Amazonas (UEA) e o Estático no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia
(UFAM). Posteriormente os extratos foram rotaevaporados e encaminhados para
capela de exaustão para a total evaporação do solvente.
Microrganismos utilizados
As bactérias de padrões internacionais (ATCC- American Type Culture
Colletion) foram acessadas do Instituto Leônidas e Maria Deane-FIOCRUZ,
sendo elas: E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), para a
realização dos ensaios de atividade antibacteriana.

13
Preparo do inóculo microbiano
Para os testes de difusão em ágar, as bactérias foram inoculadas em
tubos deensaios contendo 5 mL de meio MH para cada uma das cepas, onde
cresceram em caldo por 24 h, em seguida, foram colocadas em meio de cultura
ágar Muller-Hinton (MH) e encubado por 24 h. Posteriormente, a suspenção
bacteriana por sua densidade celular padronizada pela turbidez ajustada
conforme a escala 0,5 de McFarland foi obtida de acordo com referência.

Avaliação da atividade antibacteriana

Para a avaliação da atividade antibacteriana, foram utilizadas cepas
bacterianas sendo elas: E. coli, P. aeruginosa, as bactérias foram reativadas em
caldo (MH) e em seguida espalhadas em placas Petri contendo mesmo meio de
cultura com Ágar, em três repetições, cada qual contendo 4 discos com
diferentes concentrações mg/mL: C1 (0,010), C2 (0,015), C3 (0,020) e C4 (0,050)
no papel filtro com 0,5 milímetros cada, todos foram embebidos com os extratos
etanolicos da casca de castanha-do-Brasil provenientes dos dois processos,
tendo ainda outros dois com Dimetilsulfóxido (DMSO) controle negativo e
antibiótico (tetraciclina) com C= (10 µL + 1 mL de DMSO) controle positivo. Os
discos foram posicionados equidistantes mantendo-se uma distância razoável
entre si para evitar interferências entre os possíveis halos de inibição. As placas
foram incubadas a 35°C em câmaras climatizadas B.O.D (Biological Oxygem
Demand) por 72h, durante os quais foram observados o desenvolvimento dos
microrganismos e o surgimento dos halos.

Avaliações das atividades antimicrobianas do extrato

Para avaliação do experimento foi utilizada um paquímetro para medição
dos halos de inibição, a leitura foi realizada durante três dias, ao final do terceiro
dia os valores obtidos e somados para retirar as médias precisamente.
Análise Estatística
Os experimentos foram feitos em três repetições por concentração, para
a comparação de crescimento dos valores a partir de cada concentração, e os
dados foram analisados através de Análise de Variância (ANOVA) e Teste de
Tukey a 5% de significância. Para análise dos dados foi utilizado o programa

14
com o software Sisvar, versão 5.6, segundo as recomendações de Ferreira
(2014). E feito a partir do Excel® as tabelas.

Resultados e Discussão
As médias dos halos (mm) frente as diferentes concentrações dos
extratos obtidos da casca de castanha-do-Brasil estão apresentadas na (Tabela
1). Observa se a inibição em todas as concentrações para o extrato com a casca
de castanha-do-Brasil. Houve uma diferença significativa na bactéria P.
aeruginosa com média nos halos de 15,32 mm, em relação a E.coli com 10,51
mm.
As cascas de castanha-do-Brasil por ser considerada resíduos, o lixo é o
seu destino final, sendo uma fonte rica de metabolitos secundários e de fácil
acesso para ser utilizado em largas escalas em estudo. Apesar do mercado
brasileiro ser considerado pouco representativo como relata Dewan (2017),
revela grande potencial, uma vez que, é um país agrícola, que gera grandes
volumes de resíduos agroindustriais. Logo, a redução nos custos de produção
de extratos, enzimas e outros através da utilização dos subprodutos agrícolas
gerado como matéria-prima é uma realidade pautável.

Tabela 1- Médias dos halos (mm) a partir das concentrações com as cascas de castanha-do-
Brasil, utilizando o método Estático.
concentração mg/mL
Cep C1 C2 0,015 C3 C4
a 0,010 0,020 0,050
P. aeruginosa 13,00 b 13,33 b 15,31 b 15,32 b
E. coli 8,00 c 8,22 c 8,33 c 10,51 c
Médias seguidas pela mesma letra para cada bactéria não diferem entre si pelo teste de Tukey
a 5%. C= concentração em mg/mL.

O extrato obtido pelo método soxhelt, não foi tão significativo para inibição
das bactérias P. aeruginosa e E. coli, as médias dos halos no Teste Tukey a 5%
foram menores em relação ao método estático, ou seja, o extrato da casca da
castanha pelo método soxhlet, não demostrou uma eficiência relevante perante
essas bactérias patogênicas. Sousa et al. (2021) em sua pesquisa usou o
método de soxhlet para o extrato da casca do tucumã, porém não obteve um
excelente resultado em relação as bactérias utilizadas como: Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae. No
entanto foi promissor pelo método de Ultrassom e Estático.

15
Tabela 2 - Avaliação antibacteriana através do extrato da casca de castanha-do-Brasil/soxhlet.
concentração mg/mL
Cep C1 C2 C3 C4
a 0,010 0,015 0,020 0,050
P. aeruginosa 4,50 c 5,04 b 5,31 d 5,32 a
E. coli 4,00 c 4,22 c 4,33 c 4,51 c
Médias seguidas pela mesma letra para cada bactéria não diferem entre si pelo teste de Tukey
a 5%. C= concentração em mg/mL

Conclusões
Os resultados obtidos por este trabalho permitem concluir que os extratos
etanólicos da casca de castanha-do-Brasil apresentam atividade antibacteriana.
O método soxhlet não foi tão eficaz em inibir as cepas trabalhadas, pois
demonstrou valores menos significativos que a extração com metanol formação
de halo de inibição maiores.

Agradecimentos
A Universidade Federal do Amazonas (UFAM), laboratório Núcleo de
estudos em composição e toxicologia de alimentos (NECTA) e o de Microbiologia
(ICB), por todo o apoio e pela ajuda, que muitos contribuíram para a realização
deste trabalho.

Referências
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17
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Contagem de Lactobacillus helveticus em queijos frescais

condimentados com pimenta murupi amarela (Capsicum
chinense Jacq.)

Campos, Daniela Cavalcante dos Santos1; Sousa, Layane Crystine Oliveira1;

Saldanha, Mário Vinícius da Silva1; Lima, Julia Ellen de Costa1; Oliveira, Izabely
Gomes1; Silva, Anderson do Nascimento2; Costa, Nívea Acioly Azevedo3; Duarte,
Daniel de Sousa3; Oliveira, Lailson de Sousa4; Lopes, Jalison3

1 2
Escola Agrotécnica da Universidade Federal de Roraima, Universidade Estadual de
3 4
Roraima, Universidade Federal de Roraima, Universidade Estadual de Campinas
E-mail: [email protected]

Resumo
Queijos frescais são alimentos mais favoráveis para a sobrevivência de
microrganismos probióticos, devido a alta umidade e baixa acidez. Além disso,
podem ser condimentados sendo opção na elaboração de novos produtos.
Nesse sentido a inclusão da pimenta murupi amarela (Capsicum chinense Jacq.)
potencializa este produto como fonte de capsaicinoides, β-caroteno e compostos
fenólicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade dos Lactobacillus
helveticus em queijos frescais condimentados com pimenta murupi amarela
durante o armazenamento refrigerado. As pimentas foram adquiridas de produtor
rural, selecionadas e levadas para o Laboratório de Tecnologia de Produtos
Agropecuários (LTPA) da Escola Agrotécnica da Universidade Federal de
Roraima (EAgro) onde foram processadas em pimenta em pó. Para obtenção
dos queijos, foi adicionado ao leite pasteurizado, 40 mL 100 L-1 de CaCl2 a 50%,
30 mL 100 L-1 de coagulante e Lactobacillus helveticus. Após a dessoragem foi
feita adição de sal e pimenta (0,5%, 1,0% e 1,5%) com posterior embalagem e
refrigeração a 4 ºC. As contagens de L. helveticus foram realizadas nos dias 1, 6,
12, 18 e 24 de armazenamento. As contagens de microrganismos probióticos
foram melhores nos queijos com 1,0% (8,36 UFC g-1) e 1,5% (8,47 UFC g-1)
mostrando efeito sinérgico da pimenta murupi amarela. Todos os tratamentos
mantiveram-se probióticos até o 18º dia de armazenamento, podendo-se concluir
excelente viabilidade dos L. helveticus em queijos frescais condimentados.

Palavras-Chave: Alimentos funcionais; Lactobacillus helveticus; Vida de

prateleira.

Introdução
A relação entre a saúde e a alimentação tem ocupado um lugar de
destaque nos hábitos alimentares da população mundial (Filbido et al. 2019), e
a partir da demanda por healthy foods, surgiram os alimentos funcionais unindo

18
tecnologia de desenvolvimento de novos produtos e benefícios a saúde (De
Barcellos et al. 2009).
Dentre os alimentos funcionais, os produtos lácteos têm sido
reconhecidos como uma importante fonte para nutrição humana, podendo
veicular compostos funcionais ou microrganismos probióticos (Pozzo 2012).
Os probióticos são microrganismos vivos, que quando administrados em
quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do hospedeiro (Hill et al.
2014; Govender et al. 2014). Estes microrganismos, predominantemente dos
gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, podem ser adicionados em alimentos
processados devendo ser capazes de resistir aos processos tecnológicos,
estocagem e ser seguro à saúde do consumidor (Favretto et al. 2013), garantindo
um número mínimo viável de cultura probiótica entre 108 e 109 UFC por porção
diária declarada no rótulo do produto (Brasil 2008).
A elaboração de queijos constitui-se em uma das mais importantes
atividades da indústria de laticínios, sobretudo no Brasil, destacando-se a
produção de queijo "minas frescal" que possui processamento simples e rápido
e bom rendimento (Queiroga et al. 2009). O queijo minas frescal apresenta alto
teor de umidade, consistência mole, sabor suave a levemente ácido e pequeno
tempo de vida útil, em torno de 20 dias (Ribeiro et al. 2009).
Considerando a suplementação de produtos lácteos com probióticos,
Buriti (2005) e Favretto et al. (2013) afirmam que em queijos frescos a
sobrevivência das bactérias probióticas é maior quando comparada aos queijos
maturados, devido ao menor tempo de armazenamento, baixo teor de sal e maior
atividade de água. Entretanto, não há dados relacionados ao crescimento destes
microrganismos em queijos condimentados.
A condimentação de queijos é uma opção na elaboração de produtos
diferenciados a partir da adição de especiarias como, alho, pimenta, orégano e
manjericão (Queiroga et al. 2009), prolongando a vida de prateleira do produto
devido sua atividade antibacteriana e antifúngica (Silva et al. 2012). Dente os
condimentos, pode-se citar as pimentas da espécie Capsicum chinense Jacq.,
conhecidas pela alta pungência e por serem fonte de capsaicina,
dihidrocapsaicina, além de carotenoides, vitaminas, flavonoides e compostos
fenólicos (Costa et al. 2009; Lima 2010).

19
 Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi elaborar queijos frescais
suplementados com Lactobacillus helveticus e condimentados com pimenta
murupi amarela e avaliar a viabilidade das bactérias probióticas durante o
armazenamento refrigerado.

Material e Métodos
Cerca de 500 ± 20 g de pimenta murupi amarela foram adquiridas de
produtor localizado no Projeto de Assentamento Nova Amazônia, polo 1 Vicinal
2A em Boa Vista, Roraima, no mês de março de 2022, período seco. As pimentas
foram selecionadas considerando o estágio de maturação completo
(completamente amarela), uniformidade de tamanho (5,8 ± 1,0 cm), isenção de
pragas e danos físicos aparentes, sendo em seguida levadas para o Laboratório
de Tecnologia de Produtos Agropecuários (LTPA) da Escola Agrotécnica da
Universidade Federal de Roraima (EAgro/UFRR), onde foram lavadas e
higienizadas com água clorada a 100 ppm por 10 minutos. Após a higienização,
as pimentas foram dispostas em bandejas tempo suficiente para evaporação da
água remanescente da lavagem e em seguida foram cortadas e desidratadas em
estufa de circulação de ar à temperatura de aproximadamente 45 ºC por 48 h
(Barduzzi 2011). As pimentas desidratadas foram trituradas em liquidificador e o
pó obtido embalado a vácuo.
O leite reconstituído foi submetido à pasteurização lenta a 65 ºC por 30 min.
Após o tratamento térmico, procedeu-se o resfriamento a 39 ºC, temperatura em
que foram adicionados 40 mL 100 L-1 da solução aquosa de cloreto de cálcio
(CaCl2) a 50%, 30 mL 100 L-1 de agente coagulante (coágulo líquido) da marca
HA-LA fabricado Chr. Hansen Industria e a cultura probiótica contendo 5U de L.
helveticus da marca Docina, que passou por processo de ativação em 500 mL
de leite a 42 ºC por 8 h em incubadora com demanda biológica de oxigênio
(B.O.D) até atingir pH 5,0. Após 40 a 60 min., foi feito o corte da massa em cubos
de 1,5 a 2 cm, intercalando a mexedura e o repouso para promover a
dessoragem da massa. Após essa etapa, foi feita a drenagem de cerca de 80%
do soro para então ser realizada a salga da massa (700 g 100 L-1 de sal branco
refinado e iodado), e a adição da pimenta em pó nas concentrações de 0,5%, 1%
e 1,5% (m/m). Os queijos, foram dispostos em dessoradores plásticos com
capacidade de 250 g, por 1 h com tempo de viragem de 30 min., para então,

20
serem embalados em potes plásticos de polietileno, conservados a 4 ºC em
B.O.D e armazenados durante o período de análise de estudo da viabilidade da
cultura probiótica.
Para contagem dos L. helveticus foram retirados 25 g do queijo, tanto da
superfície quanto da parte interna da massa. As amostras foram adicionadas de
225 mL de água peptonada estéril a 0,1%, homogeneizadas e diluídas
sequencialmente até 10-7. A proposta inicial era que as contagens em todas as
concentrações de pimenta fossem realizadas até 30 dias de armazenamento
refrigerado, porém as amostras apresentaram contaminação no dia 30 de
armazenamento, sendo, portanto, consideradas as contagens até o dia 24.
Foi utilizado como meio de cultura o ágar MRS (Man, and Sharpe)
(ACUMEDIA), sendo o plaqueamento realizado em profundidade (pour plate) e
a incubação em jarra de anaerobiose a 37 ºC por 72 h em B.O.D. Os resultados
foram expressos em log unidade formadora de colônia por grama (Log UFC g-1)
(Vinderola, Reinheimer, 1999). As contagens foram realizadas em duplicata nos
queijos frescais, nos dias 1, 6, 12, 18 e 24 de armazenamento refrigerado, para
verificar a viabilidade das culturas no produto ao longo do período de avaliação
e estocagem.
Para análise da contagem de L. helveticus nos queijos foi estabelecido
delineamento inteiramente casualizados (DIC) em fatorial duplo 4 x 5 (4
concentrações de pimenta x 5 períodos de avaliação). Os dados foram
submetidos à análise de variância e as médias avaliadas por regressão e teste
Tukey a 5%. Todos os dados foram avaliados utilizando o programa
computacional Sistema para Análise de Variância - SISVAR (Ferreira 2011).

Resultados e Discussão
De acordo com a análise de variância (Tabela 1) verificou-se que os
fatores isolados porcentagem de pimenta e dias de armazenamento refrigerado,
assim como a interação entre eles foram significativos a 5%.

21
Tabela 1. Resumo da análise de variância das contagens de Lactobacillus helveticus em queijos
condimentados com pimenta murupi Capsicum chinense.
Quadrados Médios
FV GL Log UFC
% de pimenta 3 7,3505*
Dias 4 16,3761*
Tratamento x Dias 12 5,4315*
Resíduo 20 0,1262
CV (%) - 4,42
*Interação significativa, com modelos de regressão quadráticos.

Considerando os percentuais de pimenta murupi amarela (Tabela 2)

adicionados aos queijos frescais verificou-se que o aumento no percentual de
pimenta adicionado não influenciou as contagens dos L. helveticus, entretanto
foram menores quando comparadas ao tratamento controle, concluindo efeito
antimicrobiano relacionado a pimenta murupi.

Tabela 2. Contagem de L. helveticus em função do fator isolado percentual de pimenta murupi

amarela
% de pimenta Log UFC g-1
0 8,68a
0,5 8,33b
1,0 8,36b
1,5 8,47b
Obs.:Médias com letras iguais na coluna não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%.

Sousa (2022), estudando queijos frescais com probióticos condimentados

com pimenta murupi vermelha, observou que a adição de pimenta aumentou as
contagens em relação ao tratamento controle, e as reduziu conforme os
percentuais de pimenta aumentaram (0% - Log 8,28 Log UFC g-1, 0,5% - Log 8,77
UFC g-1, 1,0% - Log 8,73 UFC g-1 e Log 8,70 UFC g-1), mesmo assim, todas os
tratamentos permaneceram com probióticos, concordando com os resultados
observados neste experimento.
Estudos como o de Carvalho et al. (2010) relacionados a atividade
antimicrobiana dos extratos das pimentas Capsicum demonstram resultados
positivos na inibição de microrganismos patogênicos como Staphylococcus
aureus, Enterococcus faecalis, Salmonella enteritidis, Candida albicans e
Escherichia coli. Dorantes et al. (2000) também verificaram efeito inibitório
utilizando extrato de C. annuum sobre Listeria monocytogenes, S. typhimurium,
Bacillus cereus e S. aureus.

22
 Avaliando o fator isolado - períodos de avaliação, verificou-se crescimento
exponencial dos L. helveticus até o dia 6 de armazenamento com posterior
redução nas contagens mostrando que o período de maior concentração dos
microrganismos está na primeira semana de observação. Como se trata de queijo
frescal, produto com vida de prateleira mais curta, aconselha-se o consumo nas
primeiras semanas de armazenamento, mantendo assim, os valores
recomendados pela legislação brasileira para probióticos.

Figura 1. Contagem de Lactobacillus helveticus em queijos frescais condimentados com pimenta

murupi (Capsicum chinense) em função do fator isolado períodos de avaliação.

Os estudos Cruz et al. (2022) com queijos frescais probióticos não

condimentados, também verificaram crescimento de L. helveticus nas primeiras
semanas de armazenamento, porém com fase exponencial até o 12º dia e
finalizando o tempo de prateleira de 18 dias com contagem probiótica de 8,85
UFC g-1. No presente trabalho, os queijos condimentados com pimenta murupi
amarela mantiveram contagens probióticas até o 24º dia (7,34 UFC g-1) de
armazenamento, demonstrando excelente adaptação e viabilidade do L.
helveticus frente ao potencial antimicorbiano associado a pimenta.
As diferenças mais significativas foram observadas para os tratamentos
de 1,0% e 1,5%, verificando-se aumento de um ciclo logarítmico entre os dias 1
e 6 de armazenamento, considerado como a fase exponencial do crescimento
microbiano neste trabalho. Este comportamento induz concluir que o aumento
nos teores de pimenta entre 1,0 e 1,5% nos tratamentos propostos melhoraram o

23
desempenho deste microrganismo na fase exponencial, provavelmente
relacionado aos conteúdos de substâncias antioxidantes como carotenoides,
flavonoides e compostos fenólicos. (Costa et al. 2010; Lima 2010).
A interação % de pimenta e períodos de avaliação está apresentada na
Tabela 3, já que as regressões, mesmo significativas, não se ajustaram aos
modelos quadráticos propostos. O tratamento controle e o de 0,5% mantiveram
suas contagens probióticas estáveis até o 18º de armazenamento, com posterior
redução para a faixa de potencialmente probiótico no dia 24 (Tabela 3).

Tabela 3. Contagem de Lactobacillus helveticus em função da interação % de pimenta e períodos

de avaliação.
Dias de Avaliação
% de pimenta
1 6 12 18 24
0 8,68Aa 9,61Aa 8,74Aa 9,03Aa 7,34Ba
0,5 8,41ABa 8,41ABb 8,35ABab 9,00Aa 7,49Ba
1,0 8,05BCa 9,4Aa 7,85Cab 8,95ABa 7,55Ca
1,5 8,00Ba 9,28Aab 7,69Cb 8,89ABa *
Obs.:Médias com letras minúsculas iguais na coluna não diferem significativamente pelo teste
Tukey a 5%. Médias com letras maiúsculas na mesma linha não diferem significativamente pelo
teste Tukey a 5%. * Amostra contaminada.

Campos et al. (2017) verificaram efeito positivo da polpa de açaí

adicionadas em percentuais crescentes em leites fermentados contendo L.
acidophilus e Bifidobacterium, concluindo o efeito sinérgico das antocianinas no
desenvolvimento dos microrganismos, reforçando que os componentes bioativos
na pimenta podem exercer efeitos positivos nos L. helveticus presentes no queijo
frescal.

Conclusões
Os L. helveticus mostraram-se viáveis em queijos frescais adicionados de
pimenta murupi amarela, sendo os melhores desempenhos observados nos
queijos com 1,0% e 1,5%.
Os queijos mantiveram-se probióticos até o 18º dia de armazenamento,
sendo considerados potencialmente probióticos até o 24º dia de prateleira.
Avaliando os resultados, o melhor período para o consumo dos queijos
propostos neste experimento compreende o dia 1 e 6 de armazenamento.

24
 A adição de condimentos ricos em compostos bioativos em queijos pode
garantir melhores desempenhos de crescimentos de microrganismos
probióticos, sendo uma excelente alternativa de enriquecimento nutricional de
produtos lácteos, entretanto é necessario saber que mudanças centessimais e
químicas as amostras sofrem ao logo do tempo em comparação com o controle.

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Produção de proteases fibrinolíticas por Pleurotus

citrinopileatus (Fr.) Singer (Basidiomycota, Pleurotaceae)

Farias, Viviane Gonçalves de1; Santana, Romário da Silva2; Gomes, Waldireny

Rocha2

1
Universidade do Estado do Amazonas, 2Universidade Federal do Amazonas.
Email: [email protected]

Resumo
As proteases correspondem a um grande e diversificado grupo de enzimas
hidrolíticas que podem ser encontradas em diversas fontes, dentre elas, em
cogumelos. Pleurotus citrinopileatus, também conhecido como "cogumelo-ostra
amarelo", apresenta diversas atividades biológicas comprovadas. Nesse
sentido, o objetivo desse trabalho consiste em verificar a atividade proteolítica e
fibrinolítica das enzimas obtidas dos extratos brutos de P. citrinopileatus. O fungo
foi cultivado em diferentes caldos (Caldo Malte + Extrato de Levedura (YMA),
Caldo Sabouraud Dextrose +Extrato de Levedura (SB+YE), Caldo Malte (M) e
Caldo Sacarose + Extrato de Levedura (YES)) para a produção de enzimas por
cultivo submerso. A dosagem proteica e as atividades proteolíticas e fibrinolíticas
dos extratos foram determinadas através de espectrofotômetro. Dos quatro
caldos testados, a maior quantidade de proteínas totais foi encontrada no caldo
YMA (0,0148 ± 0,0004 U/mg) e SB+YE (0,0134 ± 0,0001 U/mg). Os caldos com
maior atividade proteolítica geral foram os caldos SB+YE (19,47 ± 0,35 U/mg) e
YMA (18,69 ± 0,55 U/mg). Já a atividade proteolítica específica se destacou nos
caldos YES (1995,69 ± 57,3 U/mg) e SB+YE (1449,78 ± 41,0 U/mg). A atividade
fibrinolítica geral, os caldos SB+YE e YMA se sobressaíram (23,71 ± 0,24 U/mg
e 22,61 ± 0,42 U/mg, respectivamente) e os caldos SB+YE (1765,80 ± 38,4
U/mg) e YES (2724,52 ± 140,6 U/mg) apresentaram os melhores resultados na
atividade fibrinolítica específica. Esses dados indicam que P. citrinopileatus
produz protease fibrinolítica, principalmente, nos caldos SB+YE e YMA.

Palavras-chave: Cogumelos comestíveis, Meios sintéticos, Fibrina.

Introdução
As proteases, também conhecidas como enzimas proteolíticas,
correspondem a um amplo e diversificado grupo de hidrolases que transformam,
através da clivagem proteolítica, longas cadeias de proteínas em cadeias curtas
(Aruna et al. 2023).
Dentre essas proteases, há as enzimas fibrinolíticas que estão envolvidas
no processo de degradação da rede de fibrina, seja por fibrinólise direta ou
indireta, e conseguem manter o fluxo normal sanguíneo (Altaf et al. 2021).

27
 Podem ser encontradas em diversas fontes, como em bactérias, algas,
em minhocas, veneno de serpentes, fungos filamentosos e cogumelos (Lee et
al. 2004; Qinghua et al. 2006; Lu et al. 2010; Simkhada et al. 2010). Destacam-
se por atuar diretamente no coágulo de fibrina, seja por fibrinólise direta ou
indireta, e conseguem manter o fluxo sanguíneo normal (Cardoso et al. 2022a).
Dentre essas fontes de enzimas, os cogumelos (Basidiomycota) têm se
destacado devido à alta produção de substâncias de interesse econômico e
industrial, além de serem importantes produtores de proteases (Machado et al.
2017; Zhou et al. 2020). Alguns gêneros de cogumelos que produzem proteases
fibrinolíticas são Armillaria (Lee et al. 2005), Cordyceps (Cui et al. 2007),
Hericium (Choi et al. 2013), Pleurotus (Choi et al. 2017), Lentinus (Choi et al.
2018) e Agrocybe (Li et al. 2021).
O gênero Pleurotus, também chamado como "cogumelo-ostra", é
conhecido por seus basidiomas comestíveis e estão disponíveis
comercialmente. As espécies mais conhecidas são P. citrinopileatus, P. djamor,
P. eryngii, P. florida, P.ostreatus e P. pulmonarius (Krakowska et al. 2020). Várias
espécies deste gênero possuem inúmeras substâncias terapêuticas, e suas
potencialidades têm sido eficazes contra doenças virais, bacterianas,
cancerígenas e cardiovasculares (Golak-Siwulska et al. 2018).
Algumas espécies estudadas, como por exemplo, P. eryngii (Cha et al.
2010), P. ostreatus (Liu et al. 2014), P. ferulae (Choi et al. 2017) apresentaram
enzimas com atividade fibrinolíticas. No entanto, até o momento não há relato
sobre enzimas fibrinolíticas produzidas por P. citrinopileatus (cogumelo-ostra
dourado).
O objetivo deste trabalho foi verificar a atividade proteolítica e fibrinolítica
das enzimas obtidas dos extratos brutos de Pleurotus citrinopileatusem
diferentes meios de cultivo.

Material e Métodos
Obtenção do material biológico
A cepa de P. citrinopileatus (Basidiomycota, Agaricales) foi adquirida
comercialmente (CoguHouse, São Paulo, Brasil). A fim de obter culturas viáveis,
o micélio do fungo foi transferido para o meio de cultura BDA (Ágar Batata

28
Dextrose), com extrato de levedura à 5%, em placas de Petri (90mm x 15 mm),
e mantidos em estufa BOD durante 7 dias a 28 ºC.
A cultura pura foi depositada na Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), sob o
registro de depósito CMINPA 1959.

Preparação dos extratos por cultivo submerso

Os extratos foram preparados conforme proposto por Santa Anna (2001).
A partir de micélios crescidos em placas com meio BDA, foram adicionados 10
discos miceliais (Ø = 8 mm) em frascos contendo 600 ml de caldo, sendo
utilizado quatro caldos para o crescimento: Malte + Extrato de levedura (YMA);
Sabouraud Dextrose + Extrato de levedura (SB+YE); Malte (M); e, Sacarose +
Extrato de levedura (YES).
Todos foram preparados para 600 mL de água destilada. Para o Caldo
Malte + Extrato de levedura foi usado glicose (6 g), extrato de levedura (1,8 g),
peptona (3 g), extrato de malte (1,8 g). Para o Caldo SB+YE foi utilizado dextrose
(12 g), peptona (6 g) e extrato de levedura (1,8 g); para o Caldo Malte foi aplicado
somente o extrato de malte (18g); e, o Caldo YES continha extrato de levedura
(12g) e sacarose (90g). Após o preparo, os frascos foram esterilizados em
autoclave durante 15 minutos a 121 °C.
A produção do extrato se sucedeu com o auxílio de um agitador orbital
com incubadora IKA KS 4000I, durante 10 dias, sob temperatura 28°C. Após
este tempo de cultivo, o material foi filtrado com papel de filtro esterilizado em
funil de Buchner e bomba a vácuo. O conteúdo obtido foi centrifugado a 4000
rpm por 15 min e o sobrenadante foi filtrado em membrana 0,22 μm. Este
experimento foi realizado em triplicata.

Dosagem proteica
A concentração relativa de proteínas dos extratos fúngicos obtidos foi
estimada pelo método de Bradford (1976), onde BSA (albumina sérica bovina)
foi utilizada como padrão. Nesta metodologia, a mudança de cor é observada
durante o procedimento, no caso, o azul brilhante de Coomassie G-250 reage da
cor vermelha para o azul. Ao final, as leituras das absorbâncias foram obtidas
através de um espectrofotômetro UV a 595nm.

29
Determinação da atividade proteolítica por espectrofotômetro
A atividade proteolítica foi determinada através do método descrito por
Ginther (1979). Em um microtubo de 2 mL foi adicionado 200 μL da mistura de
reação (azocaseína 2% (p/v), preparado em tampão em Tris-HCl 0,1M, pH 7,2)
e em seguida, foram incubados em banho maria, de 1 a 2 minutos a 40 ºC para
atingir o equilíbrio térmico. Após este tempo, foi adicionado 150 μL da amostra
em temperatura ambiente e tanto as amostras e o branco foram incubados em
banho maria durante 15 minutos a 40 °C. Em seguida, a reação foi interrompida
pela adição de 800 μL de ácido tricloroacético (TCA) a 20% p/v, as amostras
foram centrifugadas a 12.000 rpm durante 15 minutos. O sobrenadante das
amostras e do branco foram retirados e a absorbância foi medida em 400 nm por
meio de um espectrofotômetro (Martim et al. 2017).

Determinação da atividade fibrinolítica por espectrofotômetria

A atividade fibrinolítica foi determinada através do método de Astrup e
Mullertz (1952), e foi quantificada através de espectrofotometria (Wang et al.
2014). Para a solução de fibrinogênio, foi usado 0,4 mL de TRIS-HCl-NaCl, 0,1
mL de fosfato e 2,88 g de fibrinogênio, para cada amostra. Colocou-se 500 μL
dessa solução em microtubos de 2 mL, tanto para as amostras quanto para o
branco. Em seguida, os microtubos foram colocados em banho maria a 37 °C
por 5 minutos. Após este tempo, 100 μL de trombina 20 U foi acrescentado ao
microtubos e novamente foram colocados em banho maria sob as mesmas
condições citadas anteriormente, desta vez somente por 10 minutos.
Em seguida, 100 μL do extrato da amostra líquida do fungo foi adicionado
nos microtubos, os quais foram levados ao banho maria durante 1 h a 37 ºC.
Após essa etapa, a reação foi interrompida pelo acréscimo de 700 μL de TCA a
0,2 molar e centrifugados a 12.000 rpm por 20 min. O sobrenadante foi retirado
e a absorbância foi medida a 275 nm (Cardoso et al. 2022b).
Neste ensaio, 1 unidade (unidade de degradação de fibrina, U) de
atividade enzimática foi definida como um aumento de 0,01 por minuto na
absorbância a 275 nm da reação (Wang et al. 2011).

Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata e as comparações
entre as amostras foram realizadas usando testes não paramétricos, além disso,

30
para a comparação das médias foi utilizado o software Minitab, versão 19.0
(Minitab 2019).

Resultados e Discussão

Dosagem proteica
Nota-se que dentre os meios de cultivos utilizados para obtenção de
extrato bruto de P. citrinopileatus, o maior teor de proteínas encontra-se no meio
YMA (Tabela 1).

Tabela 1. Teor de proteína total dos extratos de P. citrinopileatus sob os quatro meios de cultivo
por cultivo submerso.

Proteína total (mg)

YMA SB+YE YES MALTE
0,0148±0,0004a 0,0134±0,0001a 0,0071±0,0021b 0,0069±0,0004b

Médias seguidas por uma mesma letra em uma mesma coluna não diferem significativamente
pelo teste de Tukey (p≤0.05). Fonte: Dados do autor (2022).

Análise da Atividade proteolítica por espectrofotometria

Em relação a atividade proteolítica, do extrato bruto foram sintetizadas
mais proteases nos meios SB+YE e YMA, entretanto, a atividade específica foi
maior nos meios YES e SB+YE, respectivamente (Tabela 2).

Tabela 2. Atividade proteolítica geral e específica dos extratos brutos do cogumelo P.

citrinopileatus sob cultivo submerso.
Atividade proteolítica (U/mg)
Meios de cultura YMA SB+YE YES MALTE
Atividade Geral 18,69±0,55 a
19,47±0,35 a
11,91±0,16 b 4,16±0,16c
Atividade 1260,09±26,7 1449,78±41, 1995,69±57, 615,30±40,7
c d
Específica 0b 3a
Médias seguidas por uma mesma letra em uma mesma coluna não diferem significativamente
pelo teste de Tukey (p≤0.05). Fonte: Dados do autor (2022).

Atividade fibrinolítica por espectrofotômetro

Foi observado que P. citrinopileatus, cultivado no meio YES, apresentou
uma maior quantidade de enzimas fibrinolíticas correspondendo a um total de
2.724,52 U/mg do extrato bruto. Valor menor que o obtido por Choi et al. (2017),
cuja atividade fibrinolítica de P. ferulae foi de 4.202, 5 U (Tabela 3), entretanto,
o cogumelo ostra amarelo apresenta quantidade de enzimas fibrinolíticas maior

31
que P. ostreatus (8,10±1,56 U/mg) cultivado em meio a base de leite de soja (Liu
et al. 2014).

Tabela 3. A atividade fibrinolítica geral e específica dos extratos brutos do cogumelo P.

citrinopileatus sob cultivo submerso.
Atividade fibrinolítica (U/mg)
Meios de cultura YMA SB+YE YES MALTE
Atividade Geral 22,61±0,42b 23,71±0,24a 16,25±0,15c 6,19±0,07d
Atividade 1524,58±14,38 1765,80±38,4 2724,52±140, 917,09±44,1
Específica c b 6a d

Médias seguidas por uma mesma letra em uma mesma coluna não diferem significativamente
pelo teste de Tukey (p≤0.05). Fonte: Dados do autor (2022).

Conclusões
Dos quatro meios de cultura, meios líquidos (Meio Malte + Extrato de
Levedura (YMA), Meio Sabouraud Dextrose + Extrato de Levedura (SB+YE),
Meio Malte (M) e Meio Sacarose + Extrato de Levedura (YES) avaliados, as
proteases sintetizadas no meio YES apresentam maior atividade proteolítica e
fibrinolítica, seguido do meio SB+YE. De modo, pode-se concluir que P.
citrinopileatus é produtor de enzimas fibrinolíticas.

Referências
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32
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34
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Produção e análise de corantes vermelhos do fungo amazônico

Chaetomium sp., para uso na indústria alimentícia

Dirane, Icaro Rosas Dirane1; Couceiro, Douglas de Moraes1; Souza, Antonia

Queiroz Lima1; Souza, Afonso Duarte Leão1; Fernandes, Kamila Rangel Primo1

1Universidade Federal do Amazonas

Email: [email protected]

Resumo
Uma série de aplicações de biopigmentos em vários setores industriais estão
ganhando importância devido ao crescente interesse do consumidor em sua
origem natural e biodegradabilidade. Assim, este trabalho foi conduzido para
valorizar fungos da Amazonia Brasileira como uma plataforma eficiente de
produção de pigmentos naturais para os diferentes setores da sociedade,
especialmente o setor alimentício. Uma linhagem promissora isolada de
Fuscoporia gilva (Hymenochaetaceae, Basidiomycota) na Reserva Florestal do
Humaitá no Acre foi identificada como um ascomiceto elas características
morfológicas e produziu vários tipos de pigmentos de coloração vermelha. A
natureza dos pigmentos, presente em diferentes extratos fúngicos foi investigada
por análises de LC/ESI-MS/MS como primeiro passo para o desenvolvimento de
uma produção eficiente desde que possam ser aplicados para coloração de
alimentos como balas, embutidos cárneos, pães e outros alimentos. A
identificação foi investigada pelo sequenciamento de regiões do ITS 1 - 2 do
rDNA. Durante a produção do pigmento vermelho no meio de cultura líquido de
batata, dextrose e extrato de levedura (BDL) dois experimentos foram
conduzidos simultaneamente e um iniciou a produção do pigmento com 3 dias e
o outro com 16, foi verificado que a produção é dependente de oxigênio e não
sofre influência direta da dextrose. Os extratos de 2,5 L do cultivo foram obtidos
após 20 dias com 1 L de meio liquido que foram extraídos de 500 ml em cartucho
de SPE C8 com MeOH, MeOH + Acetato de Etila, Hexano/Metanol, resíduo
aquoso. O restante, 500 ml, foi liofilizado e foram feitos testes de solubilidade o
que indicou que as moléculas são polares, diluídas totalmente em água e
parcialmente em metanol. Adicionalmente, a análise de LC/ESI-MS/MS dos
extratos metanólicos e de acetato de amônia demostram o pico 524,2 como
majoritário. O mesmo pico estava presente no extrato liofilizado, entretanto este
apresentou um precipitado de exopolissacarídeos e não encontramos uma
molécula de m/z correspondente na literatura cientifica. Este é o primeiro relato,
até onde sabemos, sobre o isolamento de um ascomiceto, Chaetomium sp.
associado a basidioma de F. gilva com a produção bem-sucedida de pigmentos
naturais sob cultivo em meio líquido na Amazônia Brasileira.

Palavras-Chave: Amazônia; Biodiversidade; Enzimas

35
 Introdução
No planeta Terra diversos processos físicos, químicos, biológicos e
geológicos são estruturados por micro e macromoléculas visíveis e invisíveis
produzidas por procariotos e eucariotos. Entre estes, os pigmentos espectrais
visíveis (cor e luz, chamados de corantes) e os invisíveis atualmente têm
despertado interesse devido a inúmeras aplicações ecológicas, processos
evolucionários, biomimética e pelas perspectivas de aplicação industrial. Apesar
das inúmeras aplicações conhecidas dos corantes, as evidências mostram que
os biopigmentos (corantes naturais) podem influenciar diretamente o cérebro, a
psicologia, o gosto e o sabor dos humanos e ser menos prejudiciais a saúde
humana e do meio ambiente que os sintéticos. As fontes tradicionais, plantas e
animais, devido a sustentabilidade do planeta têm sido gradativamente
substituídas por novas fontes. Neste sentido numerosos estudos têm explorado
os pigmentos espectrais visíveis de microrganismos e organismos superiores
para diversas aplicações, entre estas na indústria alimentícia.
Os componentes alimentares de origem microbiana têm uma longa
história na ciência e na indústria alimentar e desde os tempos pré-históricos, os
fungos desempenham papéis críticos nas atividades diárias humanas, como
panificação, fabricação de bebibas alcoólicas (vinhos, cervejas e saquês) e
processamento de laticínios e embutidos. Entretanto com a descoberta
revolucionária da penicilina na década de 1930, os fungos tornaram-se uma fonte
muito importante de produtos farmacêuticos que deram origem a medicamentos
que salvam vidas, incluindo antibióticos, medicamentos anticancerígenos e
agentes redutores de colesterol (Wani et al. 2020).
Mas com o advento de novas tecnologias, principalmente da biotecnologia,
nos últimos 60 anos, o uso de fungos aumentou significativamente para a
produção de produtos comercialmente importantes, como cogumelos
comestíveis, bebidas, compostos de sabor, álcoois, ácidos orgânicos,
espessantes e agentes gelificantes, realçadores de sabor e cor, ácidos graxos
poliinsaturados, vitaminas, aminoácidos essenciais, acidulantes, enzimas e
corantes são alguns exemplos dessas aplicações industriais.
Atualmente quatro corantes vermelhos de origem fúngica diferentes
despertam o interesse da indústria de alimentos: (i) Carotenóide licopeno -
Produzido principalmente por leveduras; (ii) Monascus - Produção de corantes

36
vermelhos; (iii) Azafilonas - Nova classe de pigmentos produzida por fungos.
Estas são pigmentos fúngicos com estruturas de pirona-quinona e um núcleo
bicíclico altamente oxigenado tem um centro quaternário quiral com atividades
antimicrobiana, anticancerígena, antiviral, antioxidante, antifúngica e
antiinflamatória. (iv) Antraquinonas - Como uma possível alternativa ao corante
do inseto carmim.
A Floresta Amazônica é a maior floresta tropical do Planeta e também a
maior fonte de Biodiversidade terrestre. Em contraste com a exuberância da
cobiçada flora e fauna desta floresta estão os povos tradicionais que vivem em
condições subumanas, aguardando a modernidade e os benefícios da sociedade
atual chegarem até elas. Considerando que a biodiversidade microbiana pode
ser uma fonte para o desenvolvimentos de vários produtos e processos que
beneficiem a população local, nacional e mundial, que possa trazer recursos
financeiros para esta população iniciamos essa pesquisa dada a coincidência do
isolamento de linhagem de Fuscoporia gilva (madeira) (Hymenochaetaceae,
Basidiomycota) na Reserva Florestal do Humaitá no Acre que foram identificadas
como ascomicetos pelas características morfológicas e a produção de pigmentos
de coloração vermelha. (figura. 1C).
Pela intensidade da pigmentação vermelha, a linhagem DMC 638.2.2.2
(LaBMicrA 1345) foi selecionada para estudos químicos, a fim de elucidar as
moléculas responsáveis pela coloração. O objetivo desta pesquisa foi investigar
a produção de corantes vermelhos produzidos por fungos para uso na indústria
de alimentos.

Material e Métodos
Obtenção da Linhagem
Foi realizada a reativação da linhagem fúngica do Laboratório de
Bioensaios e Microrganismos da Amazônia da Universidade Federal do
Amazonas (LaBMicrA 1345), que anteriormente já tinha sido observada a
produção de pigmentos extra e intracelular. A linhagem DCM-638.2.2.2 (código
de isolamento) tinha sido isolada em 2022 na Reserva Florestal do Humaitá, no
Acre, associada ao basidioma de Fuscoporia gilva (Hymenochaetaceae,
Basidiomycota).

37
 A linhagem foi cultivada em três pontos equidistantes da placa de Petri
contendo BDA + ant (50 µg de Amplicilina e 50 µg de Tetraciclina / mL). As
culturas puras após 72 h foram repicadas para outras 10 placas de Petri com
BDA em ponto central, para servirem de inóculos.

Obtenção dos extratos orgânicos

Para obtenção dos extratos foram utilizados 28 frascos Erlenmeyrs de 250
mL com 100 mL de meio BDL (Souza et al. 2004), incubados em sheiker a 120
rpm, a 26 °C por 20 dias. Destes, 25 frascos continham o inoculo de cinco
fragmentos de ágar com hifas de 6 mm de diâmetro e outros três foram mantidos
sem inoculo como controle do cultivo. Simultaneamente, dois inóculos foram
incubados em dois Erlenmeyers de 125 mL com 20 mL de meio BDL por oito dias
nas mesmas condições citadas anteriormente para obtenção do micélio e
extração do DNA genômico.
Após a incubação o micélio e o meio de cultivo foram separados por
filtração á vácuo e foi observada uma coloração vermelha intensa para ambos os
extratos. Para o extrato do meio do cultivo (EC) foi realizada a abertura da
amostra em cartucho de extração em fase sólida C8 (SPE), com a obtenção de
4 frações de diferentes polaridades de solvente (MEOH, ETOH/HEX (1:1),
MEOH/H20 (1:1), MEOH 1% Acetato de amônio). O extrato do micélio foi feito
por maceração com Metanol (EM) três vezes. Todos os solventes orgânicos
utilizados nesta pesquisa eram grau HPLC.

Análises por Espectrometria de Massas e Cromatografia em Camada

Delgada
Após a obtenção de todas as frações foram preparadas alíquotas
contendo 20 µL da solução estoque adicionados a 980 µL de MeOH (solução de
análise) para inserção direta em MS (Thermo Scientific), analisador tipo íon trap,
operando em fonte de Ionização Química a Pressão Atmosférica (APCI-MS), full
scan na faixa de 100 a 1000 m/z nos modos positivos e negativos em
quadruplicata. Também foram realizadas placas de CCD para revelação da
classe química dos pigmentos.

38
Extração de DNA e Sequenciamento
O DNA genômico foi extraído usando o kit Zymo Research Quick-DNA™
Fungal/Bacterial Miniprep de acordo com seu próprio protocolo e algumas
adaptações. Após a extração, o DNA foi sequenciado usando um sequenciador
Genetic Analyzer modelo 3500 (Applied Biosystems, Foster city, CA, EUA). A
sequência de consenso foi confrontada com National Center for Biotechnology
Information (NCBI) (Silva-Filho et al. 2021).

Resultados e Discussão
A linhagem LaBMicrA 1345 tinha sido conservada em madeira e foi
reativada com sucesso. A análise do sequenciamento indicou proximidade de
73,4% com Chaetomium globosum o que é coerente com as análises macro e
micromorfológicas, entretanto não houve formação de corpo de frutificação
durante os 30 dias de análises. A comparação destes dados pode ser visualizada
na figura 1.

Os isolados do gênero Chaetomium tem sua importância na indústria

alimentícia e na agronômia devido a produção de pimento vermelho que na
indústria alimentícia pode ser usado na produção de balas, sorvetes, produtos
cárneos, kani e outros (Dufossé 2018; Chatragadda el al. 2021). Enquanto
os policetídeos, azafilonas, antraquinonas e outros pigmentos de origem fúngica
e bacteriana tem evidenciado fortes ações biológicas, entre elas o controle de
fitopatógenos (Eyal et al. 1994; Wani et al. 2021).

39
 A

Figura 1. Fotos de Chaetomium spp. Em A C. globosum e em B C. cupreum, ambas as imagens

retiradas da internet. Em C imagem dos dois isolados fúngicos produtores de pigmentos
vermelhos depositados no Laboratório de Bioensaios e Microrganismos da Amazonia da
Universidade Federal do Amazonas.

De 1 L obtido após o cultivo da linhagem LaBMicrA 1345 foram obtidos

quatro extratos: A - Água com metanol (1:1 - ECAM); B - Resíduo aquoso da
SPE (ECRA); C - Metanol e Acetato de amônia (ECMA); D - Hexano e Etanol (1:1
- ECHE), os quais foram analisados no modo APCI-MS positivo (Figura 2).

40
Figura 2. Espectrogramas APCI-MS positivo dos extratos da linhagem LaBMicrA 1345 em: A -
Água com metanol; B - Resíduo aquoso da SPE; C - Metanol e Acetato de amônia; D - Hexano
e Etanol.

Após as análises de APCI-MS, o extrato ECMA mostrou o pico majoritário

em 524,2. Devido a alta polaridade e complexidade do meio de cultivo se optou
por liofilizar o restante (500 mL) deste, que apresentou também o mesmo pico e
uma maior complexidade de moléculas, devido os resíduos de açúcar e
polissacarídeos da amostra, fato este observado também no EM onde houve a
decantação de um cristal branco, de natureza polissacarídea e pelo fato que o
os parâmetros finais de pH e glicose ainda eram iguais os do início do cultivo,
pH 6,5 e teor de glicose maior que 1000 mg/dL. É possível que valores de glicose
iniciais fossem maiores que o final, entretanto existia a necessidade de
acompanhamento com dosagem bioquímica. Silva-Filho et al. (2021) e Oliveira
et al. (2021) ao produzirem metabolitos secundários de Penicillium spp. e de uma
miscelânea de diferentes gêneros fúngicos respectivamente usaram o controle
do pH e o consumo da glicose, valor igual a zero, associados a visualização do
micélio e obtiveram com êxito seus objetivos, por esses motivos inferimos a
necessidade para estudos posteriores de uma curva de produção do pigmento
vermelho associado ao tamanho do inoculo, uma vez que o cultivo em menor

41
escala para a extração de DNA começou a produção em 6 dias enquanto o da
produção de extratos levou 16 dias.

Figura 3. Espectrogramas APCI-MS positivo e negativo respectivamente, do extrato liofilizado

(ECL) da linhagem LaBMicrA 1345.

Figura 4. Extratos da linhagem LaBMicrA 1345 1- Metanólico do micélio, 2- Metanólico com

Acetato de Amônia do cultivo, 3- Metanol e acetato de etila, 4- água e metanol, 5- Hexano e
etanol, 6 - Resíduo aquoso e 7- Extrato do meio de cultivo liofilizado.

A diluição dos extratos em água destilada (1 mg/ 2 mL) evidencia a

solubilidade em meio aquosos e a presença de diferentes corantes que
necessitam ser purificados para serem analisados em Ressonância Nuclear
Magnética (RMN).

42
Figura 5. Imagem das placas de CCD dos extratos do meio de cultivo da linhagem LaBMicrA
1345 visualizadas em luz UV: 1- Metanólico com Acetato de Amônia do cultivo, 2- Metanol e
acetato de etila, 3- água e metanol, 4- Hexano e etanol.

As análises de CCD, indicam metabolitos florescente e uma previa de

RMN mostrou que os extratos estão em mistura e precisam ser purificados.
Segundo Warley S. Borges (2011) isolaram seis novas Azafilonas de
Chaetomium globosum e Silva et al. (2011) isolaram 13 compostos, sendo dois
novos policetidios de Talaromyces spp. aqui da Amazônia Brasileira, ambos os
grupos de moléculas apresentaram diversas atividades biológicas. A faixa dos
metabolitos isolados e a solubilidade inferem a produção de ambos os grupos de
moléculas.

Conclusões
Este é o primeiro isolamento de um fungo produtor de pigmento vermelho
do Estado do Acre e abre perspectivas para a identificação de novas azafilonas
e Policetideos isolados da biodiversidade fúngica amazônica. Novos estudos
devem ser conduzidos para elucidação estrutural das moléculas majoritárias que
confirmem a possibilidade na indústria de alimentos, a avaliação das atividades
biológicas, entre elas a antioxidante e antimicrobiana e no controle de pragas

43
(fúngicas e inseticidas) na agronomia. Não menos importante é a conclusão dos
estudos taxonômicos desta linhagem.

Referências
Chatragadda, R.; Dufossé, L. 2021. Ecological and biotechnological aspects of
pigmented microbes: a way forward in development of food and pharmaceutical
grade pigments. Microorganisms 9(3): 637.

Eyal, J.; Mabud, M.A.; Fischbein, K.L.; Walter, J.F.; Osborne, L.S.; Landa, Z.
1994. Avaliação da linhagem Beauveria bassiana Nov. EO-1, que produz um
pigmento vermelho para controle microbiano. Applied Biochemistry
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Human Health. Journal of Fungi 6(4): 280.

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amazonian toxic plants: Palicourea longiflora (aubl.) rich and Strychnos cogens
bentham. Acta Amazonica 34(2): 185-195.

Silva-filho, F.; Souza, M.; Rezende, G.; Silva, F.; Cruz, J.; Silva, G.; et al. 2021.
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principal component analysis (PCA). Journal of the Brazilian Chemical Society
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evaluation of antibacterial activity of different extracts of soil-isolated fungus
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80.

Warley, S.; Borges, G.M.; Guimarães, D.O.; Duran-Patron, R.; Collado, I.G.;
Pupo, M.T. 2011. Azaphilones from the endophyte Chaetomium globosum.
Journal of Natural Products 74(5).

44
MICROBIOLOGIA AMBIENTAL E AGRÍCOLA

45
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Acessando o potencial bioativo de Streptomyces sp. MAD39,

isolada de sedimentos do rio Madeira baseado em análises in
silico do genoma

Pereira, Sílvia Vitória Cruz Gonçalves1; Yamagishi, Michel Eduardo Beleza2;

Silva, Gilvan Ferreira3; Caniato, Fernanda Fatima4

1 2
Universidade Federal do Amazonas, Embrapa Informática
3 4
Agropecuária, Embrapa Amazônia Ocidental, Universidade Federal do
Amazonas.
Email: [email protected]

Resumo
A microbiota amazônica tem sido foco de pesquisas usando diferentes
abordagens, e os resultados preliminares têm revelado grande diversidade e
possibilitado a identificação de inúmeras novas espécies. A diversa microbiota
amazônica tem sido também investigada quanto ao seu potencial bioativo seja
para a produção de enzimas de interesse biotecnológico quanto para à atividade
antimicrobiana contra patógenos que comprometem a produção de culturas de
importância para o estado do Amazonas como o guaraná e açaí. Neste estudo,
conduzimos o sequenciamento do genoma do Streptomyces sp. MAD39 isolado
de sedimentos do Rio Madeira, visando identificar fatores associados com
potencial bioativo em seu genoma, com ênfase em CAZymes. O tamanho do
genoma Streptomyces sp. MAD39 foi de 15,44 Mb e conteúdo de G+C de
72,11%. Foram preditas 455 Cazymes: 44,01% glicosil hidrolases (GH = 224),
10,02% carboidratos esterases (CE = 51), 15,72% módulo de ligação a
carboidratos (CBM = 80), 6,29% enzimas com atividades auxiliares (AA = 32),
2,16% polissacarídeos liases (PL = 11) e 21,81% glicosil transferase (GT = 111).
Streptomyces sp. MAD39 parece capaz de degradar vários substratos, entre eles
celulose, hemicelulose, quitinas, quitosanas, amido, etc. Streptomyces sp.
MAD39 apresentou um número notável de 37 cópias de enzimas relacionadas a
hidrólise de amido das famílias GH13 e GH15, enzimas estas com aplicação
conhecida na indústria de alimentos. Os resultados obtidos precisam ainda ser
relacionados com dados funcionais conduzidos em diferentes substratos.

Palavras-Chave: Microbiota amazônica; Cazymes; Recursos naturais

Introdução
O interesse humano na exploração sustentável dos recursos naturais
disponíveis visando atender às necessidades da agricultura, meio ambiente e
indústrias de fármacos/cosméticos tem crescido nos últimos anos (Gupta et al.
2019; Ma 2019; Pham et al. 2019; Avila et al. 2021). Neste contexto, o potencial

46
de uso de microrganismos para suprir essas demandas tem sido intensamente
investigado e seus empregos já são realidades nestes setores. A agricultura já
conta com produtos comerciais que promovem a fixação biológica de nitrogênio
como os Rizoliq LLI e Rizoliq TOP HC (https://rizobacter.com.br) à base de
Bradyrhizobium japonicum e Masterfix (https://www.stoller.com.br) à base de
Azospirillum brasilense. Outro exemplo bem sucedido da utilização de
microrganismos no manejo agrícola tem sido o emprego de Trichoderma spp.
como agente de biocontrole contra vários patógenos, como Rhizoctonia solani,
Fusarium moniliforme, Alternaria triticina, Ustilago segetum, Fusarium udum,
entre outros (Puyam 2016).
Em consonância com a tendência de exploração sustentável dos
recursos naturais, esforços têm sido direcionados para a identificação e
caracterização de centenas de microrganismos isolados da microbiota
amazônica, incluindo microrganismos de sedimentos coletados em 7000 km de
diferentes rios amazônicos. A coleção de microrganismos resultante dos
esforços de isolamento, identificação e caracterização encontra-se hospedada
na Embrapa Amazônia Ocidental, Manaus, Amazonas, e conta com
representantes entre outros do versátil gênero Streptomyces.
Streptomyces são bactérias gram-positivas, filamentosas e produtoras de
esporos, reconhecidas pelas inúmeras habilidades as quais destacam a
produção de antibióticos, promoção de crescimento de plantas e biocontrole
de patógenos de interesse agrícola (Sousa e Olivares 2016). Pontuando alguns
exemplos, temos o Streptomyces roseocinereus MS1B15 que possui inúmeras
habilidades, as quais destacam a de solubilizar fósforo, produzir sideróforos,
sintetizar ácido indol acético, atividade antimicrobiana contra patógenos
Fusarium, Botrytis e Phytophthora (Chouyia et al. 2020). Streptomyces sp. CB-
75 isolado de solo de rizosfera de bananeira exibiu atividade antifúngica contra
11 diferentes patógenos e promoveu o crescimento de plantas de banana (Chen
et al. 2018). Em sua revisão, Quinn et al. (2020) apresentam uma lista de
moléculas importantes do ponto de vista clínico e econômico produzida por
membros do gênero Streptomyces, com atividades anticâncer, antibiótica,
antifúngica, herbicida, etc. Streptomyces sp. MAD39 isolado de sedimentos do
Rio Madeira, integrante da coleção de isolados da Embrapa Amazônia Ocidental,
tem chamado atenção diante dos resultados preliminares que indicam

47
potencial atividade antimicrobiana, com inibição in vitro acima de 73% contra
os patógenos Colletotrichum siamense, Fusarium decemcellulare e
Moniliophthora perniciosa bem como a identificação de 124 clusters
biossintéticos no seu genoma. Diante do potencial bioativo do Streptomyces sp.
MAD39 conduzimos a anotação do seu genoma para enzimas ativas de
carboidratos (CAZymes) visando identificação de fatores com potencial bioativo
entre os membros deste grupo de enzimas.
O objetivo desse trabalho foi realizar análises in silico no genoma do
isolado de Streptomyces sp. MAD 39 visando a identificação de fatores
associados com potencial bioativo em seu genoma, com ênfase em CAZymes.

Material e Métodos
O Streptomyces sp. MAD39, isolado de sedimentos do Rio Madeira
(SISGEN Nº AB6B14F), teve o seu genoma sequenciado por shotgun Illumina
com reads paired- end de 150 bp e cobertura de 100X. As inúmeras reads
obtidas do sequenciamento foram pré-processadas para remoção de
adaptadores utilizando o software Ktrim (Sun 2020). As paired-reads foram
unidas usando o FLASH (Magoc e Salzberg 2011) e então montadas em 4740
contigs usando o software SPAdes (Prjibelski et al. 2020). Foi feito o upload do
arquivo de montagem na workspace da KBase (US Department of Energy
Knowledge Database (Arkin et al. 2018) para a anotação do genoma do
Streptomyces sp. MAD39, que foi conduzida em duas diferentes plataformas:
Prokka v1.14.5 (Seemann 2014) e RASTtk v1.073 (Brettin et al. 2015).
As CDSs, "CoDing Sequence genoma" do isolado de Streptomyces sp.
MAD39 foram submetidas ao servidor da web dbCAN2
(http://bcb.unl.edu/dbCAN2/) utilizando a ferramenta HMMER (e-value < 1e-15,
coverage > 0,35) para a anotação de enzimas relacionadas ao metabolismo de
carbono de acordo com a classificação da CAZy database (http://www. cazy.org):
glicosil transferase (GT), glicosídeo hidrolases (GH), polissacarídeos liases (PL),
carboidratos esterases (CE), enzimas com atividades auxiliares (AA) e módulo
de ligação a carboidratos (CBM). A apresentação gráfica dos dados obtidos foi
feita usando o pacote do R "ggplot2" v.3.4.0 (https://cran.r-
project.org/web/packages/ggplot2/index.html).

48
 Resultados e Discussão
A anotação automática do genoma do Streptomyces sp. MAD39 pelo
Prokka e RASTtk foram similares: tamanho do genoma de 15,44 Mb, conteúdo
de G+C de 72,11%. O genoma do Streptomyces sp. MAD39 consistiu de 14371
e 17359 CDSs anotadas respectivamente pelo Prokka e RASTtk. Notavelmente,
Streptomyces sp. MAD39 apresentou tamanho de genoma superior ao dos
demais genomas de Streptomyces depositado no NCBI, sendo o maior deles do
Streptomyces rapamycinicus NRRL 5491 com 12,70 Mb (Baranasic et al. 2013).
Um total de 455 CDSs codificando CAZymes foram identificadas no genoma do
Streptomyces sp. MAD39, assim distribuídas: 44,01% glicosil hidrolases (GH =
224), 10,02% carboidratos esterases (CE = 51), 15,72% módulo de ligação a
carboidratos (CBM = 80), 6,29% enzimas com atividades auxiliares (AA = 32),
2,16% polissacarídeos liases (PL = 11), e 21,81% glicosil transferase (GT = 111)
(Figura 1). A predição de CAZymes no genoma de duas linhagens de
Streptomyces sp. denominadas F1 e F7, previamente selecionadas quanto ao
potencial celulolítico e hemicelulolítico, resultou na predição de 175 e 193
CAZymes, respectivamente (Melo et al. 2018). Em termos absolutos, o número
de CAZymes detectadas no genoma do MAD39 foi bastante superior aos do F1
e F7 (MAD39 = 455 vs. F1 = 175 e F7 = 193). Relativo ao número de genes
codificantes, embora a diferença tenha sido nivelada, MAD39 ainda apresentou
maior porcentagem de Cazymes que F1 e F7 (MAD39 = 3,17% vs. F1 = 2,36%
e F7 = 2,92%).

Figura 1. Distribuição das classes de CAZymes no genoma do Streptomyces sp. MAD39.

Abreviações: GH, glicosil hidrolases. CE, carboidratos esterases; CBM, módulo de ligação a
carboidratos; AA, enzimas com atividades auxiliares; PL, polissacarídeos liases e GT, glicosil
transferase.

49
 A classe das GHs é amplamente conhecida por conter atividades
catalíticas envolvidas na degradação da celulose, hemicelulose, lignina, etc. No
genoma do Streptomyces sp. MAD39 a classe das GHs constituiu a maior fração
das CAZymes anotadas. As 224 GHs identificadas foram distribuídas em 52
famílias. Encontramos 80 CBMs distribuídas em 15 famílias, 111 GTs
distribuídas em 14 famílias, 51 CEs distribuídas em 9 famílias, 32 AAs e 11 PLs
cada uma distribuídas em 7 famílias (Figura 2).

Figura 2. Famílias de CAZymes no genoma do Streptomyces sp. MAD39: A) GT, glicosil

transferase; B) GH, glicosil hidrolases; C) CE, carboidratos esterases; D) CBM, módulo de
ligação a carboidratos; E) AA, enzimas com atividades auxiliares e F) PL, polissacarídeos liases.

Streptomyces sp. MAD39 parece capaz de degradar vários substratos

(Figura 3A-L). Entre as CDS do genoma de Streptomyces sp. MAD39, nenhuma
foi categorizada como celulossoma por não apresentarem hits com domínios
coesinas, doquerinas e SLH (surface layer homology). Entretanto, encontramos
cópias de GHs que compõem o complexo multi-enzimático de celulases formado
pelas celobiohidrolases (CBH, EC 3.2.1.91), endoglucanase (EGL, EC 3.2.1.4) e
β- glucosidase (BGL, EC 3.2.1.21) (Figura 3A). Onze das 27 enzimas com

50
envolvimento putativo na degradação de celulose estavam associadas com
CBMs (CBM2: 5, CBM3: 4, CBM4: 1 e CBM11: 1). Em Streptomyces
consideradas celulolíticas foram encontrados os módulos CBM2, CBM3, CBM4,
e CBM46 associados com domínio catalítico GH, sendo CBM2 o mais comum
(Sidar et al. 2020).
Encontramos no genoma do Streptomyces sp. MAD39 hemicelulases
putativa (Figura 3B, 3C e 3E). Considerando a hidrólise enzimática de xilanas
encontramos sete cópias de GH43 (Figura 3B), para xiloglucano encontramos
seis cópias da GH1, duas cópias de cada umas das GH31, GH35 e GH74 (Figura
3C) e para manana quatro cópias das GH92 e três cópias de cada GH5 e GH38
(Figura 3E).

Figura 3 (parte 1). Famílias de CAZymes no genoma do Streptomyces sp. MAD39 de acordo
com substratos: A) Celulose, B) Xilana, C) Xiloglucano, D) Pectina, E) Manana e F) Trehalose.
Abreviações: BGL, β-glucosidase; EGL, endo-β-1,4-glucanase; ABF, α-arabinofuranosidase;
XG, xyloglucanase; BGAL, β-arabinofuranosidase; AXL, α-xylosidase; PL, pectate lyase;
AMA, α-mannosidase; EMA, endo- 1,4-β-mannanase; TrePP, trehalose-6-phosphate
phosphorylase; Trehalase, α,α-trehalase.

51
 A hidrólise enzimática de quitina pode ser mediada pela ação das mono-
oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs), quitinases e β-N-
acetylhexosaminidase resultando em quito-oligossacarídeos. No genoma do
Streptomyces sp. MAD39, encontramos sete LPMO da família AA10, quatro
delas apresentando domínio único e outras três associadas com CBM2 ou
CBM5. As quitinases do Streptomyces sp. MAD39 pertencem à família GH18 e
GH19. Das dez GH18 encontradas, seis delas estavam associadas com CBM2
ou CBM16. A única quitinase GH19 do Streptomyces sp. MAD39 apresentou um
único domínio. As β-N- acetylhexosaminidase do Streptomyces sp. MAD39 são
da família GH3 e foram encontradas contendo um único domínio (Figura 3G). A
hidrólise enzimática da quitosana é medida pelas quitosanases, quatro
quitosanases foram encontradas no genoma do Streptomyces sp. MAD39, duas
cópias de cada uma das famílias GH46 e GH75 (Figura 3H). Entre as potenciais
aplicações de quitinases e quitosanases destaca-se o tratamento de águas
residuais (Nechita 2017).
Foi notável o número de enzimas relacionadas à hidrólise de amido no
genoma Streptomyces sp. MAD39, principalmente representadas pelas
Cazymes das famílias GH13 (n=32) e GH15 (n=5), com atividades preditas de
isoamilase (EC: 3.2.1.68), α- glucosidase (3.2.1.20), glucoamilase (EC: 3.2.1.3)
e outras (Figura 3K). As isoamilases do MAD39 foram das famílias GH13_11 e
GH13_13 presentes com um único domínio ou associadas com CBM41 ou
CBM48. As isoamilases têm aplicação no processamento industrial de amido
para a produção de glicose ou maltose (Harada 1984). Outra enzima relacionada
à hidrólise de amido encontrada no genoma do MAD39 foi a α-glucosidase, todas
da família da GH13_30 apresentando um único domínio. A α-glucosidase de
Geobacillus stearothermophilus U2 apresentou potencial na biotransformação de
amido em isomalto oligossacarídeos (IMO), com conteúdo resultante dos
oligossacarídeos de 41,74% e de glicose foi de 9,81% (Chen et al. 2018). As
glucoamilases encontradas no genoma do MAD39 foram todas da família GH15.
Esta enzima tem sido utilizada na produção de dextrose pela indústria de
panificação, na fabricação de cerveja de baixa caloria e hidrólise de grãos
integrais pela indústria do álcool (James e Lee 1997). Encontramos também
enzimas de ramificação da família da GH13_9 que possuem envolvimento na

52
síntese de glicogênio, sendo capazes de usar seus próprios produtos alongados
como substratos (Gaenssle et al. 2021).

Figura 3 (parte 2). Famílias de CAZymes no genoma do Streptomyces sp. MAD39 de acordo
com substratos: G) Quitina, H) Quitosana, I) Oligossacarídeos, J) Polissacarídeos, K) Amido e L)
Lignina. Abreviações: LPMO10, Lytic chitin monooxygenase; BGAL, β-galactosidase;
Hexosaminidase, β- hexosaminidase; AGLU, α-glucosidase; GOOX, glucooligosaccharide
oxidase; GMC oxidoreductases, glucose methanol choline oxidoreductases.

Conclusões
A predição de CAZymes no genoma Streptomyces sp. MAD39 resultou em
455 enzimas, sendo as GHs a classe dominante com 224 representantes.
Streptomyces sp. MAD39 parece capaz de degradar vários substratos,
entre eles a celulose, devido à presença de cópias de membros do complexo
multi-enzimático de celulases: celobiohidrolases, endoglucanase e β-
glucosidase. Foram também encontradas cópias de enzimas relacionadas à
hidrólise de quitinas e quitosanas, entre outras.
Streptomyces sp. MAD39 apresentou um número notável de 37 cópias de
enzimas relacionadas à hidrólise de amido das famílias GH13 e GH15.

53
 Os resultados obtidos precisam ainda ser relacionados com dados
funcionais conduzidos em diferentes substratos.

Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e à Universidade
Federal do Amazonas pela concessão de bolsa de iniciação científica para a
primeira autora.

Referências
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Análise do genoma completo de Labrys sp. CPAA013 revela o

seu potencial biotecnológico para a agricultura e
biorremediação

Sousa,Thiago Fernandes Sousa1; Queiroz, Claudia Afras de Queiroz2; Silva,

Gilvan Ferreira3

1Universidade Federal do Amazonas, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,

3Embrapa Amazônia Ocidental.
E mail: [email protected]

Resumo
O gênero Labrys não é um gênero convencional pois segrega poucas espécies
de bactérias. Essas bactérias estão associadas a ambientes aquáticos, rizosfera
e tecidos vegetais e possuem um repertório enzimático relacionado a
degradação de muitos xenobióticos. Neste estudo, foi realizada a análise
genômica de uma bactéria (CPAA013) isolada da lâmina d'água do Rio Purus
(Pauíni-AM). Análise filogenética usando a região do rRNA 16S identificou o
isolado como sendo pertencente ao gênero Labrys e proximamente relacionada
a L. neptuniae e L. portucalensis. A partir da obtenção do genoma completo
desta bactéria, foi possível identificar o seu potencial biotecnológico através da
anotação do genoma, da genômica comparativa e da análise de clusters gênicos
biossintéticos. Foram identificados genes para detoxificação de metais pesados
como mercúrio, cádmio e arsênio, bem como BGCs para a produção dos
sideróforos ocrobactina, agrobactina e para o co-fator pirroloquinolina quinona.
Em adição, foram identificadas 74 proteínas exclusivas de CPAA013 que estão
relacionadas a adaptações ambientais. Esses resultados apontam o potencial do
isolado CPAA013 para aplicação em agricultura e biorremediação.

Palavras-Chave: Ambientes aquáticos; Genômica; Mineração de genomas

Introdução
O gênero Labrys (Xanthobacteraceae) é composto por α-proteobacterias
e contém apenas nove espécies descritas até o momento. Estas bactérias têm
sido encontradas em vários ambientes, incluindo lagos contaminados com
metais pesados, rizosfera, sedimentos e formando nódulos radiculares em
plantas aquáticas (Miller et al. 2005; Chou et al. 2007; Islam et al. 2007; Carvalho
et al. 2008; Feldner et al. 2010; Nguyen et al. 2015).
Até o momento, cinco genomas completos de espécies do gênero Labrys

57
foram disponibilizados em bancos de dados públicos, mas apenas dois são
referentes a espécies tipo (L. wisconsinensis e L. monachus)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/). A falta de genomas completos para todas as
espécies do gênero Labrys faz com que a taxonomia dessas bactérias ainda seja
baseada em análises de sequências de rRNA 16S, em vez de utilizar o padrão-
ouro de identificação taxonômica de procariotos (dDDH - Hibridização digital
DNA-DNA) (Meier-Kolthoff et al. 2019).
Em relação às aplicações biotecnológicas, para o gênero são descritas
atividades de biodegradação de antibióticos de interesse veterinário,
detoxificação de metais pesados e produção de fitohormônios (Liang et al. 2009;
Amorin et al. 2014; Rangel et al. 2017; Mulla et al. 2018). Apesar do potencial
descrito, até o momento não foram realizados estudos em campo para avaliar o
uso dessas bactérias no crescimento de plantas ou no controle de fitopatógenos,
bem como estudos acerca da sua químiotaxonomia ou genômica comparativa.
O mercúrio é um metal altamente tóxico que se acumula nos níveis
tróficos e tem sido usado ao longo dos anos na mineração extrativista (Guzzi et
al. 2021). Na Amazônia, estima-se que só no Rio Madeira foram liberadas 87
toneladas de mercúrio só entre 1970 e 1990 e a detecção de mercúrio é
relatadavista até os dias atuais em estudos com a biota aquática desse rio
(Bastos et al. 2015). O garimpo ilegal também se revela como outro fator para a
disseminação do mercúrio (Pestana et al. 2022). A identificação de
microrganismos que contenham genes de biorremediação para mercúrio pode
ajudar a mitigar os impactos causados nos ecossistemas e consequentemente
na saúde humana.
O presente trabalho teve como objetivo analisar o potencial
biotecnológico de uma linhagem de Labrys (CPAA013) isolado da lâmina d'água
do rio Purús pela anotação de genoma, da genômica comparativa e da análise
de clusters gênicos biossintéticos.

Material e métodos
Identificação do isolado CPAA013
A sequência correspondente a região 16S foi capturada do genoma
completo do isolado CPAA013 por meio de BLAST usando o WebServer 2.0. A
construção do dataset foi realizada com base nas sequências do rRNA 16S de

58
6 gêneros e 36 espécies da família Xanthobacteraceae (Azorhizobium= 3;
Xanthobacter= 9; Labrys= 9; Pseudolabrys= 1; Starkeya= 2; Ancylobacter= 12).
Rhizobium leguminosarum LMG 14904 foi usado como grupo externo. As
sequências foram alinhadas usando a plataforma online MAFFT (mafft.cbrc.jp).
O alinhamento foi plotado na plataforma IQTREE (Minh et al. 2020) e a análise
filogenética foi realizada pelo método de Maximum Likelihood com 1000
replicatas. O filograma foi gerado usando a ferramenta iTOL (Letunic et al. 2019)
e editado manualmente no software CoreDraw versão 2020.

Anotação do genoma
A anotação de genomas foi realizada por meio da plataforma RAST
(Rapid Annotation using Subsystem Technology) (https://rast.nmpdr.org/) e a
visualização gráfica dos subsistemas foi realizada pelo SEEDviewer (Overbeek
et al. 2014). Para a análise comparativa de proteínas ortólogas o genoma do
isolado CPAA013 bem como os genomas das espécies L. methylaminiphilus, L.
monachus, L. okinawensis, L. wisconsinensis disponíveis nos bancos de dados
JGI (genome.jgi.doe.gov) e Genbank foram submetidos a predição de proteína
usando o pipeline GLIMMER (Delcher et al. 2007). As proteínas preditas foram
plotadas na plataforma Orthovenn2 (Xu et al. 2019) para gerar o diagrama de
venn. As proteínas não compartilhadas do isolado CPAA013 foram submetidas
ao BLASTp para anotação manual.

Análise de clusters gênicos biossintéticos e sintenia

Os mesmos genomas usados para análise de proteínas ortólogas foram
usados para predição de clusters gênicos biossintéticos (BGCs) usando a
plataforma AntiSMASH (Blin et al. 2019). Os BGCs que apresentaram
similaridade com BGCs já caracterizados e disponíveis no banco MIBiG
(Minimum Information About a Biosynthetic Gene cluster) (Terlouw et al. 2022)
foram comparados por sintenia usando o pipeline clinker & clustermap.js
(Gilchrist et al. 2021).

59
 Resultados e Discussão
Identificação filogenética do isolado CPAA013
O alinhamento resultou em 1478 caracteres com 364 padrões distintos,
217 sites informativos, 86 sites únicos e 1175 sites constantes. O melhor modelo
estatístico selecionado para análise de Maximum Likelihood foi GTR+F+I+G4.
Na análise filogenética o isolado CPAA013 foi agrupado com Labrys neptuniae
e Labrys portucalensis, com alta taxa de bootstrap de suporte. No entanto, as
sequências de rRNA 16S não permitiram resolver a posição taxonômica exata
dessas espécies, mas confirmam o isolado CPAA013 como pertencente ao
gênero Labrys.
Ambas as espécies próximas de Labrys sp. CPAA013 foram isoladas de
ambientes aquáticos (Chou et al. 2007; Carvalho et al. 2008). Vários estudos têm
mostrado que Labrys portucalensis possui a capacidade de biodegradar
antibióticos e pesticidas tais como ofloxacina, norfloxacina, ciprofloxacina,
diclofenaco, Carbamazepina, fluoroanilinas, difluorobenzenos,
pentacloronitrobenzeno, Neonicotinoide (Amorin et al. 2013; Amorin et al. 2014;
Moreira et al. 2018; Bessa et al. 2019). Baseado nessas informações, estudos
podem ser conduzidos com Labrys sp. CPAA013 para verificar se essas
características são compartilhadas entre o clado. A degradação de antibióticos
pode ajudar na descontaminação de solos e mitigar a seleção de bactérias
resistentes (Jechalke et al. 2014).

60
Figura 1 - Filograma obtido pela análise de Maximum likelihood usando sequências do rRNA
16S da família Xantobacteraceae. O isolado Labrys sp. CPAA013 está destacado em vermelho.
Rhizobium leguminosarum LMG 14904 foi usado como grupo externo. Os números indicam o
suporte do ramo em bootstrap.

Anotação de genoma de genoma e análise de proteínas ortólogas

Das 6135 proteínas preditas no genoma de Labrys sp. CPAA013 apenas
23% (1630) puderam ser classificadas em subsistemas, nos quais os genes
relacionados ao metabolismo aminoácidos e derivados, metabolismo de
carboidratos e metabolismo de proteínas representaram a maior parte (Figura
2A). Por meio das proteínas anotadas foi possível a identificação de genes de
resistência e operons para detoxificação de metais pesados. O operon para
detoxificação de arsênio localizado no scaffold 30 possui cinco genes que estão
relacionados a regulação do operon (ArsR), transporte de meta-íons (ArsH),
formação do ácido dimetilarsínico (ArsN2) e redução de ácido dimetilarsínico
para sua forma menos tóxica As (III) (ArsC e Acr3) (Figura 2B) (Singh et al. 2016;
Chang et al. 2018; Chen et al. 2020). Já para a detoxificação de cádmio, dois
genes foram identificados sendo ambos responsáveis pela resistência a este
metal pesado por meio de transporte de membrana (CzcA e FieF) (Figura 2B)
(Khan et al. 2022).

61
 O arsênico é um elemento altamente tóxico que pode ser encontrado no
ambiente por processos geoquímicos ou por ações antropogênicas, como o uso
de herbicidas, pesticidas e fertilizantes de fosfato na agricultura e o descarte de
materiais usados na indústria no meio ambiente (Singh et al. 2015). A exposição
prolongada ao arsênico pode levar a problemas neurológicos, cardiovasculares
e diabetes (Rahaman et al. 2021). Bactérias que possuem os genes ars podem
ser uma alternativa ecológica para a biorremediação de ambientes
contaminados com arsênico e podem ser utilizadas na agricultura em solos
intensivamente tratados com defensivos químicos (Yan et al. 2019).
O gene merA, que codifica uma redutase de mercúrio capaz de converter
a forma tóxica de mercúrio (Hg2+) em uma forma menos tóxica (Hg0) (Mathema
et al. 2011), foi identificado no scaffold 13 do genoma de Labrys sp. CPAA013.
Curiosamente, este gene está localizado em um operon downstream de um gene
que codifica uma proteína de função desconhecida (DUF4146), sugerindo uma
possível expressão conjunta com merA e envolvimento no metabolismo de
mercúrio (Figura 2B). No entanto, são necessários estudos de expressão
heteróloga, gene knockout e ensaios bioquímicos para validar essa hipótese.
A análise de genômica comparativa de Labrys sp. CPAA013 com outras
três espécies do mesmo gênero revelou um maior número de proteínas
compartilhadas com L. methylaminiphylus e um total de 74 proteínas exclusivas
(Figura 3). Ao avaliarmos a função prevista dessas proteínas exclusivas,
identificamos genes para o mecanismo de toxina-antitoxina do tipo IV, que é
relacionado a infecções abortivas por bacteriófagos (Dy et al. 2014).

62
Figura 2 - A) Anotação e classificação em subsistemas de proteínas preditas em Labrys sp.
CPAA013. B) Genes e operons relacionados a resistência e detoxificação de metais pesados.

63
Figura. 3 - Diagrama de Venn de proteínas ortólogas de Labrys sp. CPAA013, Labrys
methylaminiphilus, Labrys monaschus e Labrys wiconsinensis Análise de clusters gênicos
biossintéticos (BGCs)

Foram identificados 11 BGCs para produção de metabólitos secundários

no genoma de Labrys sp. CPAA013. Esses BGCs estão distribuídos em 7
diferentes classes como terpenos (1), thioamidas (1), RiPPs (3), co-fator redox
(1), híbrido PKS NRPS-Homoserina lactona (1), NRPS (1) e sideróforos (2) (Fig.
4A). A comparação de genes por meio de sintenia revelou que BGCs para
sideróforos estão relacionados a produção de ocrobactina e agrobactina (Fig.
4BC), enquanto o cluster para co-fator redox foi relacionado a via já
caracterizada para produção de pirroloquinolina quinone (Fig. 4D).
Ocrobactina é um sideróforo anfifílico e tem sido isolado principalmente
de bactérias marinhas, incluindo ambientes contaminados com petróleo (Ahmed
et al. 2014). Alguns estudos têm sugerido a correlação entre a biodegradação de
petróleo e a produção de sideróforos anfifílicos (Kem et al. 2014). Agrobactina
tem sido relatada em bactérias isoladas de rizosfera e é capaz de aumentar a
disponibilidade de ferro em plantas (Becker et al. 1985).

64
 Pirroloquinolina quinona (PQQ) é um co-fator redox para muitas
desidrogenases e é produzido principalmente por espécies bacterianas que
habitam o solo (Misra et al. 2012). A produção de PQQ em solos e rizosfera pode
estar associada as plantas e acumulada nos frutos, sendo este o principal meio
pelo qual este metabólito entra na dieta humana (Kumazawa et al. 1995). Para
a PQQ é relatada para as atividades antienvelhecimento, antidiabetes, atuam
como neuroprotetor e aumentam a taxa de funcionamento da mitocôndria
(Akagawa et al. 2016). O co- PQQ vem sendo considerado uma promissora
vitamina de longevidade humana com base em ensaios quem usam roedores
como modelo (Ames, 2018).
Em adição, PQQ tem um importante papel na solubilização de fosfato pois
atua como co-fator da enzima responsável pela produção do ácido glucônico
(glucose desidrogenase) (Wagh et al. 2014; Stella et al. 2015). Por este motivo,
o gene core pqqC tem sido usado como marcador para identificação de isolados
bacterianos com habilidade de promover o crescimento de plantas (Meyer et al.
2014).

65
Figura. 4 - Análise de clusters gênicos biossintéticos (BGCs) no genoma de Labrys sp.
CPAA013. A) Distribuição dos BGCs identificados no genoma; B) Comparação entre o cluster
7.1 e o BGC responsável pela produção de Ochrobactin; C) Comparação entre o cluster 14.2 e
o BGC responsável pela produção de agrobactin; D) Comparação entre o cluster 7.2 e o BGC
responsável pela produção de pyrroloquinoline quinona.

Conclusões
O presente trabalho identificou que o isolado CPAA013 pertence ao
gênero Labrys e é proximamente relacionado às espécies L. neptuniae e L.
portucalensis. As análises usando o genoma completo do isolado revelaram
genes de resistência e operons para detoxificação de metais pesados como
arsênio e mercúrio. Em adição, Labrys sp. CPAA013 possui clusters gênicos
biossintéticos para produção dos sideróforos ocrobactina, agrobactina e para o
co-fator pirroloquinolina quinona. Os resultados deste trabalho indicam que o
isolado estudado pode ser usado no processo de descontaminação de solos, na
promoção de crescimento de plantas, bem como na melhoria da qualidade de
vida humana.

66
 Agradecimentos
Os autores agradecem às agências de fomento: FAPEAM (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas) CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Este trabalho contou com o
suporte financeiro da FAPEAM Editais: (PROSPAM 08/2021, CT&I ÁREAS
PRIORITÁRIAS 010/2021, PRODUTIVIDADE-CT&I-013/2022, Biodiversa Nº
007/2021), CAPES editais (Procad AmazonMicro, Amazônia Legal e pela
concessão de bolsa de estudo ao primeiro autor).

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Análise filogenômica e prospecção de moléculas de uma nova

espécie de Burkholderia isolada do Rio Juruá

Queiroz, Claudia Afras de1; Sousa, Thiago Fernandes2; Silva, Annie de Souza
e1; Silva, *Gilvan Ferreira da3

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – Pós-graduação em Agricultura
no Trópico Úmido; 2Universidade Federal do Amazonas; 3Embrapa Amazônia
Ocidental, Universidade Federal do Amazonas.
E-mail: [email protected]

Resumo
Com o aumento do uso indiscriminado de agrotóxicos e a crescente incidência
de doenças em plantas, a busca por novas moléculas com atividade antifúngica
e antibacteriana tem sido uma prioridade na pesquisa agrícola. Além das
aplicações agrícolas voltadas ao controle de doenças, os microrganismos
também podem ser aplicados na promoção do crescimento vegetal. Neste
trabalho, 2 isolados bacterianos (CPAA-010 e CPAA-011) foram identificados por
filogenômica e ANI como sendo pertencentes a uma nova espécie do gênero
Burkholderia. A análise de clusters gênicos biossintéticos (BGCs) revelou o
potencial para a produção dos sideróforos (pyochelin, ornibactin e cromobactin),
bem como para produção do antifúngico occidiofungin. A anotação de genes
dessas novas espécies mostrou genes relacionados à produção de fitormônio e
ao metabolismo do fósforo e a análise de proteínas ortólogas entre as espécies
mais relacionadas apresentou 25 proteínas únicas no isolado CPAA-010 e 19
proteínas únicas em CPAA-011 que podem estar relacionados a adaptações
ambientais. Esses resultados em conjunto indicam o potencial dessa nova
espécie para promoção de crescimento vegetal e biocontrole de fitopatógenos,
bem como a importância de prospectar novos recursos genéticos amazônicos.

Palavras-Chave: occidiofungina; ornibactin; pyochelin

Introdução
O gênero de bactérias Burkholderia é classificado como uma β-
proteobactéria e é amplamente distribuído em diversos ambientes terrestres,
aquáticos e simbióticos (Francis et al. 2013). Apesar de algumas linhagens de
Burkholderia serem conhecidas por causar doenças em seres humanos, plantas
e animais, avanços recentes em tecnologias de mineração genômica têm
revelado diversos metabólitos bioativos nesse grupo de bactérias que podem
auxiliar no combate a fitopatógenos (Liu et al. 2014).

72
 Espécies de Burkholderia também são excelentes promotoras de
crescimento vegetal sendo usada em tomate, cana-de-açúcar, trigo e outras
plantas de interesse econômico (Zhao et al. 2014; Paungfoo-Lonhienne et al
2016). Essa característica se deve a produção de sideróforos, solubilização de
fosfato, produção de ácido indolacético (IAA), ACC desaminase e produção de
enzimas extracelulares (Liu et al. 2014; Deng et al. 2017).
Embora o gênero Burkholderia tenha sido amplamente investigado,
muitos de seus clusters gênicos biossintéticos (BGCs) ainda permanecem pouco
conhecidos. Estudos recentes têm realizado esforços para conectar os
metabólitos secundários com suas respectivas vias de biossíntese, isso facilita
a busca por produtos naturais de interesse via sequenciamento de genomas
completos. Metabólitos como pyrrolnitrin, occidiofugin, cepacin e gladiolin são
antimicrobianos potentes no qual suas vias já foram identificadas.
Neste trabalho foi realizado o sequenciamento do genoma completo e
mineração genômica de dois isolados de Burkholderia isoladas da lâmina d'agua
do rio Juruá-Am para identificação filogenômica e prospecção de metabólitos
bioativos.
O objetivo deste trabalho foi realizar o sequenciamento do genoma
completo e mineração genômica de dois isolados de Burkholderia para
identificação filogenômica e prospecção de metabólitos bioativos.

Material e Métodos
Microrganismos
As linhagens Burkholderia sp. CPAA-010 e Burkholderia sp. CPAA-011
usadas neste estudo fazem parte da coleção de cultura do GENAGRO -
Laboratório de Genômica e Microbiologia Aplicada da Amazônia Legal da
Embrapa Amazônia Ocidental, localizada na rodovia AM 010, km 29, estrada
Manaus-Itacoatiara- Amazonas.

Análise filogenômica
A análise filogenética foi realizada por escala genômica, comparadas com
todos os genomas das espécies tipo disponíveis no banco de dados Type
(Strain) Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz.de), uma plataforma de alto
rendimento para taxonomia baseada em genoma por meio do algoritmo MASH,

73
todas as espécies tipos se baseia na Lista de nomes procarióticos com posição
na nomenclatura (LPSN) disponível em https://lpsn.dsmz.de (Meier-Kolthoff et al.
2022). A similaridade entre espécies foi determinada usando vários índices de
medidas, para a delimitação de similaridade com base na identidade média de
nucleotídeos (ANI) e identidade média de aminoácidos (AAI), onde os cálculos
dos valores médios de identidade nucleotídica (ANI) foram determinados através
software OrthoANI (Yoon et al. 2017). E valores de hibridização DNA-DNA digital
(dDDH), calculada com o Genome-to-Genome Distance Calculator (GGDC 2.1)
(Sandoval-Powers et al. 2021).

Anotação do genoma
A anotação de genomas foi realizada por meio da plataforma RAST
(Rapid Annotation using Subsystem Technology) (https://rast.nmpdr.org/). Para
a análise comparativa de proteínas ortólogas os genomas dos isolados
Burkholderia sp. CPAA- 010 e Burkholderia sp. CPAA-011 bem como os
genomas das espécies mais correlacionadas Burkholderia contaminans e
Burkholderia lata disponíveis banco de dados GenBank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome). As proteínas preditas foram plotadas na
plataforma Orthovenn2 (Xu et al. 2019).

Análise de clusters gênicos biossintéticos e sintenia

Os mesmos genomas usados para análise de proteínas ortólogas foram
usados para predição de clusters gênicos biossintéticos (BGCs) usando a
plataforma AntiSMASH (Blin et al. 2019). Os BGCs que apresentaram
similaridade com BGCs já caracterizados e disponíveis no banco MIBiG
(Minimum Information About a Biosynthetic Gene cluster) (Terlouw et al. 2022)
foram comparados por sintenia usando o pipeline clinker & clustermap.js
(Gilchrist et al. 2021).

Resultados e Discussão
Identificação dos isolados de Burkholderia sp. CPAA-010 e Burkholderia
sp. CPAA-011
Utilizando o genoma completo das linhagens Burkholderia sp. CPAA-010
e Burkholderia sp. CPAA-011, foi realizada a análise filogenética com suporte de

74
ramificação inferido a partir de 100 réplicas de pseudo-bootstrap (Lefort et al.
2015). Ambas as bactérias obtiveram valores de hibridização DNA-DNA (dDDH)
abaixo de 60%, o que indica fortemente que elas representam novas espécies
de Burkholderia (Meier-Kolthoff et al. 2013). Tanto a Burkholderia sp. CPAA-010
e Burkholderia sp. CPAA-011 foram mais correlacionadas com Burkholderia lata
e Burkholderia contaminans (Figura 1).
Os valores de ANI entre o isolado Burkholderia sp. CPAA-010 e as duas
espécies intimamente relacionadas B. lata e B. contaminans ficaram 94.04% e
94.72%, respectivamente e quando comparada com Burkholderia sp. CPAA-011
essa similaridade ficou em 98,65%, demonstrando que as duas linhagens de
Burkholderia sp. CPAA-010 e Burkholderia sp. CPAA-011 são pertencentes à
mesma nova espécie bacteriana, já que apresentaram valores maiores que 95%,
por outro lado valores abaixo de 95% são frequentemente indicativos de
espécies distintas (Figura 2). Segundo Lee et al. (2016), são esses os valores
recomendados como critério para a identidade nucleotídica média (ANI).

Figura 1 - Analise filogenética das linhagens Burkholderia sp. CPAA-010, Burkholderia sp.
CPAA-011.

75
Figura 2 - Heatmap da identidade média de nucleotídeos por ortologia (OrthoANI) entre os
Isolados Burkholderia sp. CPAA-010, Burkholderia sp. CPAA-011, e as linhagens das
espécies tipo relacionadas Burkholderia lata e Burkholderia contaminans.

Anotação do genoma
A partir da análise dos genomas completos das bactérias Burkholderia sp.
CPAA-010 e Burkholderia sp. CPAA-011, foi observado que apenas 23% e 24%,
respectivamente, das 8.271 e 8.272 proteínas preditas foram classificadas em
subsistemas. Dos grupos de proteínas classificadas, os dois maiores em ambas
as bactérias foram relacionados a aminoácidos e derivados, correspondendo a
660 proteínas para Burkholderia sp. CPAA-010 e 655 proteínas para
Burkholderia sp. CPAA-011, seguido de proteínas relacionadas à síntese de
carboidratos, com 454 e 444 proteínas, respectivamente (Figura 3 A, B).
As proteínas classificadas em subsistemas estão distribuídas em 25
grupos, incluindo o metabolismo de fósforo, enxofre e nitrogênio, além de
proteínas relacionadas à síntese do ácido indolacético (IAA) e metabolismo de
ferro. Dentre as 44 proteínas relacionadas ao metabolismo de fosfato, 21 estão
envolvidas no metabolismo de fosfonatos, que são amplamente utilizados na
agricultura.
Esses resultados evidenciam a diversidade metabólica de microrganismo
e sua capacidade de se adaptar a diferentes ambientes ecológicos. Além disso,
a presença de proteínas relacionadas ao metabolismo de fosfonatos sugere que
essas bactérias podem ter potencial na promoção do crescimento das plantas
em solos com baixa disponibilidade de fósforo (Pradhan et al. 2017). A
identificação dessas proteínas e suas funções é fundamental para o

76
desenvolvimento de novas estratégias agrícolas que possam aprimorar a
produtividade e sustentabilidade agrícola.
Já a análise de proteínas ortólogas das Burkholderia sp.CPAA-010 e
Burkholderia sp.CPAA-011 com outras duas espécies mais relacionadas revelou
um maior número de proteínas compartilhadas com Burkholderia lata e um total
de 25 proteínas exclusivas da Burkholderia sp.CPAA-010 e 19 em Burkholderia
sp.CPAA- 011 (Figura 4). Esses resultados indicam proteínas específicas que
podem estar relacionadas com a adaptação ambiental.

Figura 3 - Anotação e classificação em subsistemas de proteínas preditas nas linhagens de

Burkholderia sp. A- Burkholderia sp. CPAA-010, B- Burkholderia sp. CPAA-011

77
Figura. 4 - Diagrama de Venn de proteínas ortólogas das linhagens Burkholderia sp. CPAA-
010, Burkholderia sp. CPAA-011, B. contaminans e B. lata

Análise de clusters gênicos biossintéticos e sintenia

No genoma da Burkholderia sp. CPAA-010 foram identificados um total
de 17 BGCs para produção de metabolitos secundários, distribuídos em (5)
terpenos, (2) PKS tipo I, (1) hibrido PKS tipo I, NRP-like, NRPS, terpeno, (5)
NRPS, (1) phosphonate, (1) hserlactone, (1) RiPP-like e (1) arylpolyene. Já no
genoma da Burkholderia sp. CPAA-011 identificamos 18 cluster gênicos
biossintéticos (BGCs), sendo (3) PKS tipo l, (5) terpenos, (5) NRPS, (1) RiPP-
like, (1) hibrido PKS tipo I, NRP- like, NRPS, terpeno, (1) phosphonate, (1)
hserlactone, (1) arylpolyene (Figura 5).

78
Figura. 5 - Análise de clusters gênicos biossintéticos (BGCs) nos genomas de Burkholderia
sp. CPAA- 010 e Burkholderia sp. CPAA-011.

Foi observado que nas duas linhagens de Burkholderia sp. CPAA-010 e

Burkholderia sp. CPAA-011, há alguns BGCs em comum. Um desses BGCs é
responsável pela produção de occidiofungina, que é um peptídeo híbrido de
policetídeos e não ribossomicamente sintetizado (Figura 6A). A occidiofungina,
uma molécula composta por oito aminoácidos e possui uma importante ação
antifúngica (Emrick 2019; Jia et al. 2022).
Estudos recentes de Hansanant e colaboradores (2022) com a
occidiofungina produzida pela Burkholderia contaminans MS14, em testes in
vitro e in vivo mostraram o potencial antifúngico dessa molécula contra diversas
espécies de fungos. Além disso, eles descreveram um novo mecanismo de ação
da occidiofungina, demonstrando a capacidade dessa molécula de contornar os
atuais mecanismos de resistência a antifúngicos apresentados pelas espécies
de fungos.
Além do BGC responsável pela produção de occidiofungina, as duas
linhagens, Burkholderia sp. CPAA-010 e Burkholderia sp. CPAA-011,
apresentam outros clusters de genes (BGCs) em comum. Entre esses clusters
estão três relacionados à produção de sideróforos pyochelin, ornibactin e
cromobactin, que são compostos orgânicos de baixo peso molecular capazes de
sequestrar íons de ferro do meio ambiente e torná-los disponíveis para as
bactérias (Figura 6 B, C e D).

79
Figura. 6 - Comparação entre o cluster em comum Burkholderia sp. CPAA-010 e Burkholderia
sp. CPAA-011 ; A - Sintenia entre BGC responsável pela produção de occidiofungin, cluster
15.1 Burkholderia sp. CPAA-011, cluster 3.3 Burkholderia sp. CPAA-010 e o cluster 2.2 da
B.contaminans; B - Sintenia do BGC responsável pela produção de pyochelin, cluster 8.1
Burkholderia sp. CPAA-010, cluster 16.1 da Burkholderia sp. CPAA-011, cluster 3.1 B. lata e
o cluster 4.5 em B.contaminans ; C - Sintenia entre os BGC responsável pela produção de
ornibactin nas bactérias Burkholderia sp. CPAA- 010 cluster 4.1, Burkholderia sp. CPAA-011
cluster 12.1, B. lata cluster 1.2 e B.contaminans cluster 3.2. D - Sintenia entre os BGC
responsável pela produção de chromobactin, cluster 33.1 Burkholderia sp. CPAA-010 e 20.1
Burkholderia sp. CPAA-011.

O pyochelin é um dos sideróforos que tem a capacidade de se ligar a

outros metais além do ferro, como zinco, cobre, cobalto, molibdênio e níquel.
Dessa forma, além de sequestrar ferro, pyochelin desempenha um papel
importante na captação de outros íons metálicos biologicamente relevantes.
Apesar de sua seletividade pelo ferro ser mais fraca em comparação com outros
sideróforos, ele ainda é capaz de se ligar e transportar vários íons metálicos.
(Ronnebaum e Lamb 2018; Ghssein et al. 2022). A ornibactina é um sideróforo
produzido por diversas espécies de bactérias, possui propriedades
antimicrobianas (Lee et al. 2016). Estudos de Deng e colaboradores (2017)
sugerem uma função alternativa da ornibactina, demonstrando que além de sua
bem conhecida capacidade de sequestrar íons de ferro, a molécula também
exibe uma ação bactericida, desempenhando um papel importante na defesa
das bactérias produtoras contra outras bactérias no ambiente. Já o cromobactin,
é um sideróforo produzido por diversas espécies de bactérias do gênero
Chromobacterium, incluindo Chromobacterium violaceum (Batista et al. 2019).

80
 Esses resultados indicam o potencial dos isolados obtidos no presente
estudo para produção de metabólitos secundários que podem ser aplicados na
agricultura para promoção de crescimento e biocontrole.

Conclusões
As linhagens de Burkholderia sp. (CPAA-010 e CPAA-011) apresentam
diversos clusters de genes biossintéticos (BGCs) responsáveis pela produção de
compostos bioativos cujas as moléculas podem ser aplicadas em diferentes
áreas, como na medicina e na agricultura. Entre os BGCs identificados, destaca-
se o responsável pela produção de occidiofungina, que possui uma importante
ação antifúngica, além de BGCs para síntese de sideróforos, como pyochelin,
ornibactin e cromobactin, que podem ser utilizados como agentes
antimicrobianos e promotores de crescimento de plantas.

Agradecimentos
Os autores agradecem às agências de fomento: FAPEAM (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas) CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Este trabalho contou com o
suporte financeiro da FAPEAM Editais: (PROSPAM 08/2021, CT&I ÁREAS
PRIORITÁRIAS 010/2021, PRODUTIVIDADE-CT&I-013/2022, Biodiversa Nº
007/2021), CAPES editais (Procad AmazonMicro, Amazônia Legal e pela
concessão de bolsa de estudo ao primeiro autor).
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior CAPES pelo suporte financeiro e concessão de Bolsas
de estudo obtido via edital Amazônia Legal e edital Procad AmazonMicro, código
financeiro 001. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas
(Fapeam) pelo suporte financeiro obtido a partir do programa Biodiversa (Edital
Nº 007/2021). Os autores também agradece ao suporte financeiro do CNPq.

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83
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Análise in silico do potencial de produção de metabólitos de

Trichoderma asperelloides

Fonseca, Jennifer Salgado1,3; Gwinner, Raoni3; Sousa, Thiago Fernandes1,3;

Koolen, Hector Henrique2; Silva, Gilvan Ferreira3; Fernandes, Kamila Rangel
Primo1; Souza, Afonso Duarte Leão1; Souza, Antonia Queiroz Lima1

1Universidade Federal do Amazonas, 2Universidade do Estado do Amazonas, 3Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Email: [email protected]

Resumo
Trichoderma asperelloides foi descrito pela primeira vez por Samuels em 2010,
com base em uma revisão taxonômica, sendo segregado de Trichoderma
asperellum. Desde então, muitos estudos in vitro e em planta foram realizados e
demonstram o potencial da espécie para o biocontrole bem como para produção
de moléculas com diversas aplicações biotecnológicas. Embora bem explorado
do ponto de vista químico, poucos estudos têm utilizado a abordagem genômica
para caracterização de vias biossintéticas relacionadas ao metabolismo
secundário. Neste trabalho foi realizado o sequenciamento do genoma
completo de T. asperelloides (T.145) isolado de Victoria amazonica visando a
prospecção de clusters gênicos biossintéticos (BGCs). Foram identificados 36
clusters, nos quais 4 apresentaram 100% de similaridade com vias já
caracterizadas, indicando que a linhagem é capaz de produzir ácido clavárico,
eniatina, colina e peramina.

Palavras-Chave: BGC; Micotoxinas; NRPS

Introdução
A ubiquidade de Trichoderma em solos naturais e agrícolas é uma prova
de que é um bom competidor por espaço e pelos recursos nutricionais (Monte et
al. 2019). É encontrado em quase todos os solos e também em habitats naturais
que contém grandes quantidades de matéria orgânica, onde se comporta como
excelente decompositor de material vegetal e fúngico. Além disso, muitas
espécies de Trichoderma mostram uma grande versatilidade metabólica, além de
grande variação genética inter e intraespecífica, que lhes permite crescer
utilizando uma ampla gama de fontes de carbono e de nitrogênio (Shanmugam
et al. 2008; Silva 2020).
Dentre os metabólitos já descritos, pode-se citar ácido indolacético (AIA),

84
sideróforos, solubilizadores de fosfato, β-1,3-glucanase, quitinase, celulase,
lipase e protease, antraquinonas, peptaibols, peptídeos não-
ribossômicos, policetídios (trichoharzianol), terpenos (isoharziandione), pironas
(6-pentyl-a-pyrone) e outros compostos voláteis e não voláteis (Bara et al. 2003;
Liu et al. 2009; Jeerapong et al. 2015, França et al. 2017; Monte et al. 2019;
Nandini et al. 2021; Zhang et al. 2021).
Por ser uma espécie descoberta em 2010 por Samuel e colaboradores,
ainda se faz necessário muitos estudos metabolômicos e genômicos para
descrever o Trichoderma asperelloides. Desta forma, apenas em 2021 é relatado
o primeiro isolamento de metabólitos secundários (11R-methoxy-5,9,13-
proharzitrien-19-ol, 3S- hydroxy-9R, 10R-dihydroharzianone, 3S-
hydroxyTrichodermaerin, methyl-3S-hydroxy- 10, 11-seco-harzianate, harzianol
J, harziandione, harzianone, harzianol A, 9-harzien- 11-ol e Trichodermaerin) de
T. asperelloides e a elucidação das estruturas destes compostos (Zhou et al.
2021).
Ainda em 2021, também foram descritas peptaboils (asperelinas), com o
suporte de cromatografia líquida acoplada com espectrofotômetro de massa, de
uma linhagem de T. asperelloides isolado de Victoria amazonica, sendo uma com
estrutura inédita na literatura (Fernandes et al. 2021).
Na literatura, este fungo é descrito como um potencial inoculante e
biofertilizante, algo que é comum das demais espécies do mesmo gênero (Phoka
et al. 2020; Ramírez-Cariño et al. 2020; Ruangwong et al. 2021)
Para colaborar com os estudos químicos, é imprescindível realizar a
mineração genômica, uma vez que estes permitem avaliar e elucidar vias
biossintezadoras de metabólitos secundários de interesse biotecnológico e
estabelecer os alvos numa purificação e caracterização química dos extratos,
economizando recursos e otimizando os processos.
O objetivo desta pesquisa foi analisar os clusters gênicos de Trichoderma
asperelloides para a identificação de possíveis novas moléculas.

Material e Métodos
A linhagem de T. asperelloides (T.145) foi isolada da planta aquática
amazônica Victoria amazonica (Poepp.) J.C. Sowerby, Nymphaeaceae, coletada
no município de Careiro, Estado do Amazonas, Brasil (registro SISGEN

85
brasileiro: A39C76B). A identificação da espécie foi realizada com base em
filogenia multilócus usando os barcodes ITS, tef e rpb2.
O genoma foi obtido por sequenciamento Illumina com comprimento de
read de: 2 x 150 pb (Paired End). O genoma montado obteve cobertura de 428X
e foi submetido a identificação de BGCs por meio da plataforma antiSMASH
fungal version 7.0 (02/01/2023). Os genes foram anotados por meio do plugin
AUGUSTUS do software Geneious usando Fusarium como referência e a
predição funcional dos genes foi realizada pelas plataformas PFAM e NCBI.

Resultados e Discussão
A mineração genômica da linhagem T.145 resultou em 36 clusters
biossintéticos distribuídos em diferentes classes: terpenos (8), NRPS (14), PKS
(10) e híbridos (3), sendo em sua maioria de função desconhecida (Tabela 1).
No cluster 5.2, ocorre a biossíntese de ácido clavárico (100% de
similaridade com o terpeno descrito em Hypholoma sublateritium), um
triterpenoide inibidor da proteína farnesyltransferase, atuando assim na redução
de tumores. Este composto é comumente encontrado em cogumelos
(Clavariadelphus truncatus, Hypholoma sublateritium), mas há estudos que
comprovam sua biossíntese em espécies de Trichoderma (Jayasuriya et al.
1998; Tamizi et al. 2022).
Dentre os clusters relacionados a PKS analisadas, somente a do cluster
2.1 (BGC 1) apresentou correspondência com alguma molécula já descrita, após
todas as análises in silico, e depositada nos bancos de dados, ácido carboxílico
atrocrisona (ACA), uma antraquinona empregada como laxativo e catártico. Essa
molécula é produzida por uma PKS I interativa previamente relatada em
Aspergillus terrreus e com expressão heteróloga em Aspergillus oryaze (Kan et
al. 2020).
Os clusters 6.1 (BGC 9) e 24.1 (BGC 24) possuem os genes para
sínterese de tricodieno sintase (TRI5), um sequiterpeno ciclase, que catalisa a
formação de tricodieno na biossíntese de antibióticos e micotoxinas. Além disso,
ambos os clusters possuem o gene de amino transferase, o que aumenta as
possibilidades de moléculas que podem ser sintetizadas, como tricodienos,
tricotecenos e tricoderminas (Proctor et al. 2018; Baruá et al. 2019).

86
Tabela 1. Clusters gênicos biossintéticos (BGC) de metabólitos previstos no genoma de
Trichoderma asperelloides usando FungiSmash 7.0.
BGC Tipo Tamanho (pb) Similaridade Metabólito MIBig ID
(%)
1 PKS I 42.642 19 Ácido abscísico BGC0001893
2 NRPS 45.733 - -
3 Terpeno 16.410 - -
4 Terpeno 22.110 40 Ácido BGC0001839
zaragozico
5 Terpeno 21.478 - -
6 PKS I 46.527 - -
7 Terpeno 22.373 100 Ácido clavarico BGC0001248
8 PKS I-NRPS-NRPS-like 76.264 15 Leucinatastina BGC0001989
9 Terpeno 20.980 - - -
10 PKS I 47.561 50 Tricóxido BGC0002233
11 PKS I 47.367 - - -
12 NRPS-like 42.888 - - -
13 Terpeno 13.582 - - -
14 NRPS 46.016 100 Eniatina BGC0000343
15 PKS I 46.215 - - -
16 NRPS 46.079 11 Ergotamina BGC0001249
17 NRPS 44.921 62 Ácido BGC0002710
dimerúmico
18 PKS I 47.840 - - -
19 NRPS 58.405 - - -
20 NRPS-like 46.203 - - -
21 NRPS-like 43.858 100 Colina BGC0002276
22 PKS I 47.444 35 Ácido fusárico BGC0002228
23 Terpeno 21.569 - - -
24 Terpeno 21.003 - - -
25 NRPS-like 30.914 - - -
26 NRPS-like 42.387 - - -
27 PKS I 47.355 9 Triptoquialanina BGC0002525
28 NRPS 36.019 - - -
29 NRPS-PKS I 66.629 - - -
30 NRPS-like 30.078 - - -
31 NRPS 46.263 - - -
32 PKS I 47.473 - - -
33 NRPS-PKS I 103.093 - - -
34 PKS I 45.242 - - -
35 NRPS-like 41.127 100 Peramina BGC0002295
36 Fungal-RiPP-like 60.312 - - -

Os genes encontrados no cluster 28.1 (BGC 28) para a formação do

tricoteceno T2, indicam que possivelmente o tricodieno sintetizado nos clusters 6.1
e 24.1 ser direcionado para a formação de inúmeros tricotecenos e a
tricodermina, sendo este último formado pela superexpressão de TRI5, o que é

87
uma hipótese válida uma vez que se observa que há dois clusters para a
biossíntese do mesmo composto (Gupta 2007; Baruá et al. 2019).
Dentre os BGC apontados na Tabela 1, 86% não apresentaram nenhuma
correspondência com clusters já caracterizados e depositados na base de dados
MIBiG, indicando que esses BGCs são novos e podem produzir novos
compostos.
Apesar do cluster 12.1 (BGC 19) não apresentar similaridade com clusters
já conhecidos (Figura 1), a análise filogenética da NRPS codificada pelo gene 33
revelou similaridades com a NRPS de Fusarium para a produção de fusaricidina.
Esses resultados podem indicar semelhanças estruturais do produto do BGC 19
com esse lipopeptídeo (Figura 2, 3).

Figura 1. Representação do cluster 12.1 de Trichoderma asperelloides com a organização dos

domínios dos genes 33 (NRPS), 38 e 39 (FAS).

Figura 2 - Organização dos domínios de NRPS responsáveis pela biossintese de lipopeptídeos

com similaridade com o sintetizado no cluster 12.1.

88
Figura 3. Filogenia da sequência de aminoácidos da NRPS do cluster 12.1.

Como comentado anteriormente, essa NRPS possui um trio de domínios

de condensação incomum. Com base na ordem de similaridade, foram
escolhidos três microrganismos (Figura 3) para estudar a organização da NRPS
(Figura 4). Trichoderma asperellum, Fusarium beomiforme e Fusarium fujikuroi
com 96.25%, 52.11% e 51.81%, respectivamente, de similaridade com a
sequência de aminoácidos da NRPS em questão.

Figura 4. Organização dos domínios de NRPS de maior a menor similaridade com a

T. asperelloides.

89
Figura 5. Organização e comparação dos clusters 12.1 (T. asperelloides) e 11.1 (T. asperellum).

A comparação do cluster 12.1 com T. asperellum revelou uma

metiltrasferase (gene 30) não compartilhada em T. asperelloides. Esses
resultados podem indicar uma decoração na molécula, o que implica que o
lipopeptídeo final formado terá diferenças químicas do formado pelo
T. asperellum.
A compreensão das vias produtoras de biomoléculas possibilita não
apenas a otimização da produção das mesmas, mas também a modificação do
produto final, levando a novas moléculas e aplicações. Ter um microorganismo
com o T. asperelloides, com alto potencial biotecnológico de aplicação, com
apenas 14% das moléculas já descritas na literatura a nível genômico demonstra
o quanto ainda são necessários estudos.

Conclusões
A avaliação preliminar dos clusters evidencia o potencial de produção de
antibióticos e micotoxinas, características interessantes ao se considerar o
desenvolvimento de um inoculante. Por haver estudos de isolamento de alguns
compostos produzidos por T. asperelloides, torna-se possível prever quais
clusters são responsáveis pela produção dos mesmos ao aprofundar as análises.

Agradecimentos
À FAPEAM, CNPq, CAPES e Embrapa pelo apoio à pesquisa.

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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Análise in vitro do potencial de bactéria do gênero

Streptomyces no biocontrole de fitopatógenos de interesse
agrícola

Mendes, Valdir da Costa1; Queiroz, Claudia Afras de Queiroz3; Costa, Gerodes

Vasconcelos1; Baia, Frankyrley Laison Jesus1; Bandeira, Izabel Correa2; Sousa,
Thiago Fernandes2; Silva, Gilvan Ferreira3

1InstitutoNacional de Pesquisas da Amazônia, 2Universidade Federal do Amazonas,

3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária.
Email: [email protected]

Resumo
O uso de produtos químicos nos campos agrícolas vem sendo utilizado há muito
tempo no intuito de controlar os prejuízos causados por pragas como, insetos e
microrganismos fitopatogênicos, porém, devido a efeitos nocivos à saúde
humana e ao meio ambiente, novas tecnologias vêm sendo criadas para
substituição desses químicos. O controle biológico torna-se uma opção para esta
mudança, pois também funciona como controlador, porém sem a utilização dos
compostos químicos. Podemos citar como os principais agentes de biocontrole
os microrganismos, mais especificamente, fungos e bactérias, dentre as mais
variadas espécies utilizadas, existe as bactérias do gênero Streptomyces, estas,
quando associados à planta hospedeira, podem produizir antibióticos,
sideróforos e enzimas com ação antimicrobiana. Com isto, o objetivo deste
trabalho foi testar in vitro o potencial de uma espécie do gênero Streptomyces
(MPUR 42.5) no controle de fitopatógenos de interesse agrícola. Utilizando como
método o antagonismo para a verificação de antibiose, os testes foram
realizados em triplicata utilizando 15 especies de fitopatógenos da coleção da
Embrapa Amazônia Ocidental/Laboratório de Genômica e Microbiologia
Aplicada da Amazônia. Como principais resultados, o isolado se mostrou
eficiente no controle de alguns patógenos, como contra o Colletotrichum
guaranicolla (INPA 2939) que agride as folhas do guaraná (89,1% de inibição).
Como resultados menos significativos, podemos citar o Fusarium sp. (Embrapa
MCT 10621), causador da murcha nos frutos do tomateiro com apenas 3,1% de
inibição. As porcentagens de inibição do crescimento dos fitopatógenos sob a
ação do isolado variou de 0 a 89,1%. Os resultados dos testes se mostraram
favoráveis para futuros ensaios in vivo, principalmente com os hospedeiros de
guaranazeiro.

Palavras-Chave: Antagonismo; Inibição; Antracnose

Introdução
Atualmente, o uso de compostos químicos de alto e médio risco, é a
alternativa mais utilizada pelo setor agrícola para diminuir a ocorrência de
patógenos de plantas.

93
 Contudo, o uso intensivo desses produtos vem causando problemas
ambientais e à saúde humana (Ferreira et al. 2020; Hess et al. 2021).
Estes defensivos representam um alto custo para o produtor, e estão
associados aos riscos de contaminação do meio ambiente, isto porque, resíduos
destes produtos podem se depositar sobre o solo, lençóis freáticos e cursos
d'água. Vale ressaltar ainda que a dosagem incorreta e uso contínuo favorece a
seleção de patógenos resistentes (Yadav et al. 2017; Botelho et al. 2020).
Como estratégia para reduzir os efeitos negativos do uso dos defensivos
químicos tem-se investido em produtos de origem biológica, sendo este, um
método de controle de pragas e doenças ambientalmente mais seguro e
sustentável (Carmona-Hernandez et al. 2019). Os principais agentes de controle
biológico são os microrganismos, mais especificamente, fungos e bactérias.
Dentro da grande diversidade destes microrganismos, o gênero
bacteriano Streptomyces vem sendo estudado para esta aplicação por possuir
potencial para produção de antibióticos e outros compostos terapeuticamente
úteis (Law et al. 2020). Chamados de "biofábricas de novas enzimas", os
compostos químicos sintetizados por este gênero, fazem com que a investigação
de novas moléculas promissoras seja ainda mais intensificada (Vaijayanthi et al.
2016).
Com isso, bactérias do gênero Streptomyces são alternativas favoráveis
para utilização de biocontrole em grandes e pequenas culturas agrícolas. O
presente estudo tem portanto, como objetivo, avaliar in vitro o potencial do
isolado Streptomyces MPUR 42.5 no controle de fungos fitopatógenicos de
interesse agrícola.

Material e Métodos

Foram utilizados nos testes de antagonismo o isolado de Streptomyces

MPUR 42.5, coletado em sedimentos da foz dos rios Purus. Este isolado faz
parte da coleção biológica do Laboratório de Genômica e Microbiologia
Aplicada da Amazônia Legal da Embrapa Amazônia Ocidental-CPAA, com
acesso ao patrimônio genético autorizado pelo SISGEN Nº AB6B14F.

Os testes de antagonismo do isolado foi realizado utilizando 15 fungos

fitopatogênicos (Tabela 1), seguindo os métodos descritos por Anith et al.

94
(2021). No centro de placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata
Dextrose Ágar) foram depositados um discos miceliais dos fitopatógenos de
5mm com 5 dias de idade. Após isso, o isolado foi inoculado paralelamente
entre si a uma distância de 3 cm do centro da placa (Figura 1), como controle,
foram utilizadas placas inoculadas apenas com o fitopatógeno. As placas
foram armazenadas em estufa incubadora BOD a 28 ºC por 15 dias, o ensaio
foi realizado em triplicata.
Os resultados foram avaliados em 5, 10 e 15 dias após o início do
experimento. A percentagem de inibição foi avaliada de acordo com a fórmula
abaixo:

Figura 1. Representação de ensaio de placa de cultura dupla para verificação de antagonismo

in vitro (Anith et al 2021).

95
 Resultados e Discussão
Os resultados dos testes de antagonismo da linhagem MPUR 42.5 contra
os 15 fitopatógenos variaram de 0% a 89,1% de inibição (Tabela 1). Tendo como
dados mais significativos, observa-se os resultados contra: Corynespora
cassiicola (50%); Colletrotrichum sp. (57,9%); Colletotrichum spaethianum
(58,75%); Colletotrichum scovillei (65,4%); Neopestalotiopsis formicidarium
(78.3%); e Colletotrichum guaranicola (89,1%).

Tabela 1. Resultados da percentagem de inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos.

Nº Código da Coleção Fitopatógeno Hospedeiro % inibição
1 Embrapa 609 Neopestalotiopsis Guaranazairo (folhas) 0
formicarum
2 INPA 2943 Rhizoctonia sp. Alfac 0
e
3 Embrapa MCT Fusarium sp. Tomate (fruto) 3,1
10621
4 INPA 2941 Sclerotium rolfsii Tomate (fruto) 6,2
5 INPA 1809 Colletotrichum theobromicola Cebolinha 23,3
6 Coll 2n Colletotrichum siamense Synedrella nodiflora 32
7 INPA 2942 Rhizoctonia sp. Feijão 35,4
8 Embrapa Fdc 307 Fusarium decemcellulare Guaranazeiro 36,25
9 Embrapa Mp01 Moniliophthora perniciosa Theobroma 44,7
grandiflorum
10 INPA 2671 Corynespora cassiicola Tomate (folha) 50
11 INPA 2973 Colletrotrichum sp. Mamão (fruto) 57,9
12 INPA 2908 Colletotrichum spaethianum Cebolinha 58,75
13 INPA 2910 Colletotrichum scovillei Pimenta do reino 65,4
(fruto)
14 Embrapa 2917 Neopestalotiopsis Guaranazeiro (folhas) 78,3
formicidarium
15 INPA 2939 Colletotrichum guaranicola Guaranazeiro (folhas) 89,1

O estudo realizado por Liotti et al. (2019) avaliou o potencial antagonista

da linhagem Streptomyces griseocarneus R132 frente a 11 fitopatogenos, onde
seu melhor resultado foi na inibição do crescimento micelial do fungo
Colletotrichum guaranicola (70,77% de inibição). No presente estudo, o valor de
inibição se mostrou mais eficiente contra o mesmo fitopatógeno (89,1% de
inibição), o que indica que o gênero Streptomyces, incluindo o isolado MPUR
42.5 possui efiencia no biocontrole in vitro do fitopatógeno do guaranazeiro.
Na Figura 2, é possível observar a diferença nas placas dos dois estudos
com o fitopatógeno. Vale ressaltar que embora os fungos pertençam a mesma
espécie, eles não são da mesma linhagem.

96
Figura 2. a) ensaio de placa de cultura dupla para verificação de antagonismo in vitro da
linhagem R132 de Liotti et al. (2019); b) ensaio de placa de cultura dupla para verificação de
antagonismo in vitro da linhagem MPUR 42.5.

Conclusões
Potencial do isolado MPUR 42.5 no controle biológico in vitro do fungo
causador da antracnose do guaranazeiro (Colletotrichum guaranicola), o que à
torna uma candidata para futuros ensaios in planta. Contudo, ressaltamos os rios
amazônicos quanto a investigação de novos microrganismos com potencial
biotecnológico.

Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas pelo suporte financeiro e concessão de Bolsas de estudo obtido a
partir do programa Biodiversa (Edital Nº 007/2021). Ao Conselho Nacional de

97
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e
CAPES-Amazônia Legal.
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98
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Análise metataxonômica de bactérias degradadoras de

combustível diesel obtidas do rio Juruá, AM.

Santos, Samára Ferreira1; Sousa, Thiago Fernandes2; Queiroz, Claudia Afras

de3; Yamagishi, Michel Eduardo Beleza4; Silva, Gilvan Ferreira da1

1Embrapa Amazônia Ocidental; 2Universidade Federal do Amazonas; 3Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia; 4Embrapa Agricultura Digital.
Emails: [email protected]; [email protected]

Resumo
A extensiva utilização de derivados de petróleo tem sido a principal causa de
poluição por hidrocarbonetos, pois são de difícil degradação no meio ambiente.
Derivados como o diesel, são tóxicos e letais para a maioria dos organismos
vivos e a contaminação do solo e água por este composto, tem consequências
danosas ao ambiente e a saúde humana. Muitos métodos físicos e químicos têm
sido desenvolvidos para remoção desses compostos, no entanto são muito
dispendiosos e ecologicamente não sustentáveis. Nesse sentido,
microrganismos surgem como uma alternativa para biorremediação pois são
capazes de utilizar esses hidrocarbonetos de cadeia longa como fonte de energia
ou produzir biossurfactantes que solubilizam esses componentes. Neste estudo,
foi usada a água do rio Juruá para uma seleção positiva de bactérias com
habilidade para degradação de diesel. O pool de bactérias capazes de utilizar
diesel como única fonte de carbono foi usado para obtenção do metagenoma
aqui avaliado quanto a composição de espécies. A análise metataxonômica
permitiu a identificação de fragmentos de DNA principalmente relacionados ao
gênero Burkholderia permitindo a identificação de quatro espécies (B. lata, B.
contaminans, B. cenocepacia e B. cepacia), também foram identificados
fragmentos de Dyella japonica, Dyella sp. e Cupriavidus sp. Os resultados
indicam o potencial dessas espécies na degradação do diesel. Ao nosso
conhecimento este é o primeiro relato de Dyella sp. para degradação de diesel
apesar do gênero já ser descrito como degradador de outros hidrocarbonetos
aromáticos. Espécies de Cupriavidus e Burkholderia são bem reconhecidos pela
degradação desses compostos e são uma alternativa ambientalmente
sustentável para a remediação de hidrocarbonetos.

Palavras-Chave: Biorremediação; BGCs; Taxônomia

Introdução
Os crescentes problemas de poluição do solo têm causado preocupações
em todo o mundo. Um grande número de contaminantes, como hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos (PAHs), petróleo e produtos relacionados, pesticidas,
clorofenóis e metais pesados entram no solo, representando uma enorme
ameaça à saúde humana e ao ecossistema natural (Chen et al. 2015).

99
 Os derivados de petróleo apresentam cadeias complexas e longas de
hidrocarbonetos que são usados como fonte de energia e estão associados a
diversas atividades humanas, gerando dependência do seu uso. A liberação
acidental de hidrocarbonetos em ambientes aquáticos e terrestres pela indústria
petroquímica, vazamentos de transportes fluviais é de grande preocupação por
causa da toxicidade e carcinogenicidade dos produtos petrolíferos, tendo grande
impacto nas mudanças de ecossistema (Loganathan et al. 2020). A remediação
de acidentes envolvendo derivados de petróleo é difícil, e os métodos físicos e
químicos disponíveis são de alto custo e não são ecologicamente sustentáveis
(Riser-Roberts 2020).
Sob condições favoráveis, foi relatado que micróbios usam pesticidas
como fonte de carbono, enxofre e doadores de elétrons. micróbios; bactérias,
actinomicetos e fungos ajudam a remover ou desintoxicar pesticidas clorados;
difenil policlorado, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, organofosforado. Na
literatura, os principais gêneros bacterianos relacionados a biodegradação de
compostos tóxicos são: Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium, Moraxalla,
Acinetobacter, Arthrobacter, Paracoccus, Aerobacter, Alcaligenes, Burkholderia
e Sphingomonas (Parte et al. 2017).
A biorremediação é uma abordagem alternativa para remover
hidrocarbonetos que são liberados no meio ambiente. Neste processo, bactérias
são usadas para degradar os componentes tóxicos como derivados de petróleo,
pesticidas entre outros (Moliterni et al. 2012; Malik et al. 2023). As bactérias são
selecionadas por sua capacidade de metabolizar compostos orgânicos e usar a
fonte de carbono para obtenção de energia e manutenção das suas atividades
essenciais (Patil et al. 2012). Bactérias também podem produzir metabólitos
secundários conhecidos como biossurfactantes nos quais solubilizam esses
hidrocarbonetos de cadeia longa (Ng et al. 2022). Enzimas como alcano
hidroxilases, monooxigenases e P450 oxigenases são descritas como atuantes
no processo de degradação, nos gêneros Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas
e Rhodococcus (Balseiro-Romero et al. 2017).
Nesse sentido, a descoberta de microrganismos que contenham enzimas
e vias metabólicas de interesse para biodegradação é de grande interesse
biotecnológico (Kachienga et al. 2018). O uso de metagenoma de ambientes
ricos em hidrocarbonetos tem sido uma abordagem usada para identificar genes,

100
enzimas e táxons envolvidos na degradação de derivados de petróleo (Sierra-
Garcia et al. 2014). Essa abordagem auxilia na engenharia genética e melhoria
de linhagens, na descoberta de novas vias e espécies que podem ser usadas no
processo de biorremediação para mitigar os impactos antrópicos (Liu et al. 2019).
O objetivo desta pesquisa foi estudar a biodiversidade microbiana
amazônica como fonte para prospecção de táxons com habilidade para
degradação de hidrocarbonetos usando uma abordagem metagenômica para
identificação taxonômica de microrganismos utilizando o diesel como única fonte
de carbono.

Material e Métodos
Obtenção de metagenomas de bactérias crescidas em meio seletivo para
degradação de hidrocarbonetos
A seleção foi realizada a partir de 1 mL de água coletada no rio Juruá,
adicionada em 299 mL de meio mínimo líquido BH (Bushnell Haas) contendo 1%
de diesel. A mistura foi colocada para crescer durante 3 dias a 28°C. Após esse
período o conteúdo foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante
contendo o meio de cultivo foi descartado e parte do pellet foi armazenado em -
80°C e a outra parte foi usada para extração de material genético. O DNA
metagenômico foi preparado com PureLink® Genomic DNA Mini Kit
(InvitrogenTM by Thermo) e quantificado em Fluorômetro Qubit TM 2.0 utilizando
o kit dsDNA BR Assay (InvitrogenTM by Thermo). O sequenciamento foi
realizado pela plataforma Illumina usando com read length: 2 x 150 (Paired End).
A montagem dos metagenomas foi realizada utilizando o SPAdes (Prjibelski et al.
2020).
O acesso ao patrimônio genético foi realizado de acordo com a solicitação
SISGEN cadastro de Acesso No AB6B14F.

Análise metataxonômica
O metagenoma sequenciado neste trabalho, foi submetido a análise
taxonômica com auxílio da plataforma Bacterial and Viral Bioinformatics
Resource Center (BV-BRC - https://www.bv-brc.org/) para identificação dos
táxons presentes no metagenoma.

101
 Resultados e Discussão
A análise do metagenoma permitiu a identificação de 7826 fragmentos de
DNA pertencentes a espécies de Burkholderia, dos quais 4125 puderam ser
relacionadas com B. cepacia, 764 com B. lata, 2807 com B. contaminans e 130
com B. cenocepacia. Os fragmentos de DNA pertencentes ao gênero
Burkholderia representaram 77% dos fragmentos totais da amostra (Figura 1 e
2). Também foram identificados 130 contigs relacionados ao gênero Cupriavidus
que correspondem a 1% da amostra total, 558 contigs (5%) relacionados a
espécie Dyella japonica e 517 contigs (5%) relacionados a Dyella sp. (Figura 1).
O gênero Burkholderia tem distribuição cosmopolita, ocupa diferentes
nichos como plantas, solos, animais e é reconhecido pela produção de enzimas
de importância industrial, metabólitos bioativos, bioremediação e aplicação na
agricultura (Vial et al. 2007; Back et al. 2022). Algumas espécies de Burkholderia
podem ser agentes causais de doenças em plantas, animais e humanos, por
esse motivo, a expressão heteróloga de genes com aplicação biotecnológica em
hospedeiros seguros vêm sendo uma alternativa para explorar o potencial do
gênero na produção de moléculas ou na melhoria de linhagens aplicadas à
promoção de crescimento e controle de fitopatógenos (Adaikpoh et al. 2022;
Petrova et al. 2022).
Bactérias pertencentes ao gênero Dyella têm sido estudadas como
bioremediadores devido ao seu potencial na degradação de bifenil no qual é
constituinte de muitos poluentes como petróleo, corantes e solventes (Li et al.
2009). Por outro lado, o gênero Cupriavidus auxilia na biorremediação de metais
pesados como o mercúrio (Rojas et al. 2011; Bravos et al. 2020).
A identificação de fragmentos de DNA de Burkholderia, Dyella e
Cupriavidus pode auxiliar na criação de produtos e processos voltados à
agricultura e bioeremediação de ambientes contaminados.

102
Figura 1. Linhagens bacterianas encontradas na mineração gênica.

Figura 2. Linhagens de Burkholderia sp. encontradas na mineração gênica.

103
 A identificação metagenômica de genes, agrupamentos gênicos como
operon para degradação de compostos tóxicos e cluster gênicos biossintéticos
relacionados ao metabolismo secundário de Burkholderia, Dyella e Cupriavidus
pode auxiliar na criação de novos produtos e processos voltados à
biorremediação de ambientes contaminados, bem como na prospecção de de
moléculas de interesse biotecnológico.
O gênero Burkholderia é reconhecido pela produção de enzimas de
importância industrial, metabólitos bioativos, biorremediação e aplicação na
agricultura. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro relato que o gênero Dyella
é estudado como biorremediadores devido ao seu potencial na degradação de
diesel, apesar do gênero já ser descrito como degradador de outros
hidrocarbonetos aromáticos. Por fim, o gênero Cupriavidus auxilia na
biorremediação de metais pesados como o mercúrio. Diante dessa realidade,
microrganismos surgem como uma alternativa para biorremediação pois são
capazes de utilizar esses hidrocarbonetos de cadeia longa como fonte de energia
ou produzir biossurfactantes que solubilizam esses componentes.

Conclusões
A abordagem metagenômica utilizada para sequenciamento de
microrganismos com habilidade de degradação de hidrocarbonetos
selecionados a partir da diversidade microbiana do bioma Amazônico permitiu a
seleção de consórcio contendo 77% das especies de Burkholderia cepacia, B.
lata, B. contaminans e B. cenocepacia. Também foram identificadas sequências
de DNA relacionados ao gênero Cupriavidus e Dyella.

Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas pelo suporte financeiro e concessão de Bolsas de estudo obtido a
partir do programa Biodiversa (Edital Nº 007/2021). Ao Conselho Nacional de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e
CAPES-Amazônia Legal.

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Antagonismo de isolados de Trichoderma spp. contra fungos

fitopatogênicos habitantes do solo

Willerding, André Luis1; Coelho Netto, Rosalee Albuquerque1 Assis, Luiz Alberto
Guimarães1; Silva, Gilvan Ferreira2; Sousa, Sandra Barbosa1; Freitas, Sara3;
Cristine, Nayara²; Handa, Rogério Eiji1

1InstitutoNacional de Pesquisas da Amazônia, 2Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária, 3Universidade Paulista.
Email: [email protected]

Resumo
Para reduzir os prejuízos na produção de hortaliças causados por patógenos
habitantes do solo, uma das alternativas é o controle biológico. Este trabalho
teve como objetivo avaliar o antagonismo in vitro de seis isolados amazônicos
de Trichoderma spp. provenientes da Coleção de Microorganismos de Interesse
Agrossilvilcultural - INPA que foram avaliados em experimentos anteriores como
controladores da queima-da-saia em alface (Rhizoctonia solani) e de podridão-
de-Sclerotium (Sclerotium rolfsii) em pimentão e tomate. A possibilidade de
utilização de isolados de Trichoderma spp. no controle de doenças nas plantas,
visando o aumento da renda com a produção orgânica. A partir desses
resultados, um desenvolvimento de um bioinsumo poderá ofertar condições
melhores de manejar das doenças no estado do Amazonas. Os isolados de
Trichoderma spp. apresentaram potencialidade de controlar o fitopatógeno e o
isolado do tratamento T-3 (T. rugulosum) obteve a melhor resposta nas
condições testadas, mostrando-se potencialmente promissor. Outros
experimentos de campo deverão validar esses resultados e possibilitar a
continuidade do experimento para se chegar em um nível de maturação
tecnológica TL-6 visando um produto biotecnológico comercial.

Palavras-Chave: Controle biológico; Rhizoctonia solani; Sclerotium rolfsii

Introdução
O controle biológico tem se mostrado como uma das melhores
alternativas para o controle de doenças de plantas. Fungos do gênero
Trichoderma são os principais biocontroladores. Comercialmente no Brasil, 34
produtos para controle biológico, à base de espécie de Trichoderma, estão
registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Agrofit
2021).

108
 Isolados de Trichoderma spp. competem com os patógenos por
nutrientes, espaço, produzem metabólitos que modificam as condições
ambientais, ativam mecanismos de defesa e promovem o crescimento das
plantas (Benítez et al. 2004). Estes mecanismos diretos ou indiretos podem agir
coordenadamente e sua importância no processo do controle biológico depende
do isolado de Trichoderma spp., do fungo antagonista, da cultura hospedeira e
das condições ambientais, incluindo a disponibilidade de nutrientes, pH,
temperatura e teores de ferro.
A ativação de cada mecanismo implica na produção de compostos e
metabólitos específicos, como fatores de crescimento das plantas, enzimas
hidrolíticas, sideróforos, antibióticos e permeases das membranas (Benítez et al.
2004). O efeito na regulação do crescimento das plantas é considerável e vários
exemplos indicam a influência positiva de Trichoderma spp., como em feijoeiros
jovens (Phaseolus vulgaris L.), a altura das plantas foi de 160% a 200% e no
aumento das massas fresca e seca, de 133% a 217% (Barakat et al. 2006).
Trichoderma sp. induziu alterações na anatomia de plantas de soja (Glycine max
L.). Oliveira et al. (2020) observaram o aumento do índice estomático na
superfície abaxial das folhas, da espessura do córtex da raiz, da epiderme
adaxial, do diâmetro médio do cilindro vascular e da espessura do mesófilo do
parênquima lacunoso e concluíram que estas alterações, podem estar
relacionadas ao processo de resistência das plantas aos patógenos e a um
melhor desempenho contra condições adversas.
Isolados de Trichoderma spp. apresentam grande variação genética inter
e intraespecífica com relação à produção de metabólitos e mecanismos
envolvidos na inibição de patógenos e no estímulo no crescimento das plantas
induzindo a produção de ácido indolacético (AIA), sideróforos, solubilizadores de
fosfato (França et al. 2017), β-1,3-glucanase (Bara et al. 2003), quitinase (El-
Katatny et al. 2000).
No estado do Amazonas, Rhizoctonia solani causa doença em vários
hospedeiros como alface (Lactuca sativa L.), couve (Brassica oleracea L. var.
acephala) e pepino (Cucumis sativus L.) e Sclerotium rolfsii ataca pimentão
(Capsicum annuum L.), tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) e cubiu
(Solanum sessiliflorum Dunal.). As perdas causadas pela podridão-de-
Sclerotium podem ser maiores que 50% (Fery e Dukes 2002).

109
 Na perspectiva de identificar potenciais inibidores desses patógenos, os
bioensaios em laboratório servem para triagem das dezenas ou mesmo
centenas de isolados fúngicos que estão depositados na coleção. Essas
seleções visam exemplares que podem ser aptos aos próximos passos de
avaliação, como experimentos em vaso em casa de vegetação e de campo com
plantio comericial para validar um insumo biológico competitivo técnico e
comercialmente.
A caracterização molecular e a análise filogenética são ferramentas que
permitem que isolados de Trichoderma spp., identificados pela análise
morfológica, sejam podem ser confirmados em grupos de espécies distintas
(Hermosa et al. 2000). A utilização de isolados de Trichoderma para o controle
de doenças em hortaliças pode ser uma alternativa viável e sustentável,
econômica, ambiental e de grande interesse, principalmente com a identificação
de isolados adapatados ao solo, o que favorece agricultores orgânicos nas
condições amazônicas.
O objetivo desta pesquisa foi analisar a capacidade de antagonismo in
vitro e de produção de metabólitos funcionais de isolados de Trichoderma spp.
selecionados como controladores biológicos de doenças causadas por
Rhizoctonia solani Kühn e Sclerotium rolfsii Sacc.

Material e Métodos
Os bioensaios in vitro foram realizados no Laboratório de Fitopatologia,
do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas,
Brasil e os ensaios bioquímicos na Embrapa - Amazônia Ocidental, Manaus. Os
isolados de Trichoderma spp. e S. rolfsii e R. solani testados nesta pesquisa
pertencem à Coleção de Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do Inpa e foram identificados seguindo protocolos específicos
(Bric et al. 1991; Carbone e Kohn 1999; Blin et al. 2021; Cai e Druzhinina 2021).

Avaliação do antagonismo in vitro de Trichoderma spp em cultura pareada.

Utilizou-se a metodologia descrita por Tamandegani et al. (2020). Dois
discos de colônias, cultivadas em meio BDA, por sete dias, foram inoculados em
placas de Petri (9 cm de diâmetro) contendo o mesmo meio de cultura. O disco
do fitopatógeno (R. solani ou S. rolfsii) com 0,5 cm de diâmetro, foi colocado a

110
1,5 cm do centro da placa e,apos 48 h, um disco do antagonista (Trichoderma
spp.), com as mesmas dimensões, foi inoculado a 3 cm de distância do primeiro
disco. Seis isolados de Trichoderma spp. foram avaliados em triplicata e após
incubação por sete dias a 25°C, foram avaliados na escala de Bell et al. (1982)
listados na Tabela 1. A descrição do material biológico utilizado está na Tabela
2.

Tabela 1: Escala ou nível ou tipo de antagonismo estabelecidos para a cultura pareada em

discos das cepas para o bioensaios.
Escala de Antagonismo Situação
1 Colonização completa da placa por S. rolfsii ou R. solani;
2 Colonização de 2/3 da placa por S. rolfsii ou R. solani;
3 Colonização de 50% da placa por cada fungo;
4 Colonização de 2/3 da placa por Trichoderma sp.;
5 Colonização completa da placa por Trichoderma sp.

Tabela 2: Isolados de Trichoderma avaliados em relação ao antagonismo aos fitopatógenos

Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.
Tratamento Isolado Espécie
T-1 CMIAINPA 2473 Trichoderma endophyticum
T-2 CMIAINPA 2951 T. asperelloides
T-3 CMIAINPA 2957 T rugulosum
T-4 CMIAINPA 2959 T. asperellum
T-5 CMIAINPA 2961 T. asperellum
T-6 CMIAINPA 2475 T.albovelutina

Durante sete dias, foi feita a medição do diâmetro das colônias de S. rolfsii
e R. solani com um paquímetro digital, em dois eixos ortogonais, sendo
posteriormente calculadas as medias. Esses dados foram utilizados no cálculo
da porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC), com uso da Equação
1 descrita em Bastos (1997).
Equação 1: PIC = (C-T / C) × 100, onde PIC = porcentagem de inibição
do crescimento; C = crescimento radial (mm) do patógeno controle; T =
crescimento radial (mm) do patógeno sobre a influência dos isolados de
Trichoderma spp.

Ensaios Bioquímicos para metabólitos funcionais promotores de

crescimento de plantas
Foi realizada uma análise qualitativa da atividade enzimática para a
produção de quitinase pelos isolados de Trichoderma. Também foi realizada
uma avaliação in vitro de traços promotores do crescimento de plantas, como

111
solubilização de fosfato, produção de sideróforos e produção de ácido indol
acético (AIA). Os meios de cultura usados para cada teste são apresentados na
Tabela 3,seguindo as metodologias descritas em (Schwyn e Neilands 1987;
Roberts e Selitrennikoff 1988; Shekhar 1999). Os bioensaios foram realizados
em triplicata e a incubação foi a 28°C por sete dias, e a presença de halos em
torno das colônias indica um resultado positivo para as enzimas avaliadas.

Tabela 3: Meios de cultura usados para os ensaios enzimáticos com os isolados.

Meio de cultura Composição Atividade enzimática Referência
Quitina coloidal 10 g; KCL 0,2 g; Presença de halo
Roberts e Selitrennikoff
Quitinase MgSO4 7H2O 0,2 g; NH4H2PO4 1 g; translúcido ao redor
ágar 15g; 1 L de água destilada. (1988)
da colônia.
60,5 mg de CAS dissolvidos em 50 ml
de água desionizada e misturados
com 10 ml de solução de ferro (III)
Presença de halo
(FeCl3.6H20 1 mM, HCl 10 mM) + Schwyn e Neilands
CAS ágar amarelo-alaranjado
72,9 mg de HDTMA dissolvidos em (1987)
ao redor da colônia
40 ml de água; 750 ml de água
destilada; 15 g de agar; pH ajustado
para 7.
Glicose 10 g; Ca3 (PO4)2 5 g;
MgCl2.6H2O 5 g; MgSO4 7H2O 0,25 Presença de halo C.Shekhar Nautiyal
PKV
g; KCl 0,2 g; (NH4)2 SO4 0,1 g; 1 L translúcido. (1999)
de água destilada.

Ensaio de atividade bioquímica

A produção e quantificação de AIA foi realizada usando um método
espectrofotométrico. O sobrenadante da cultura de caldo de 72 horas (200 g. L-1
Batata; 20 g. L-1 dextrose) suplementada com triptofano (100 µg. mL-1) foi
misturado em proporção 1:1 com o reagente de Salkowski (50 mL, 35% de ácido
perclórico, 1 mL de solução de FeCl3 0,5 M). O desenvolvimento de cor rosa
indica a produção de IAA descrito por Bric et al. (2013). A leitura da densidade
óptica foi realizada a 530 nm e a concentração de IAA foi estimada usando uma
curva padrão de IAA puro preparado na faixa de 100-1000 µg. mL-1.

Ensaio de antagonismo in vitro entre os isolados de Trichoderma x os de

S. rolfsii e R. solani
A inibição do crescimento micelial de colônia de S. rolfsii por isolados de
Trichoderma spp. foi avaliada por cultivo pareado, em meio de cultura BDA
(Mariano 1993). O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado,
com três repetições. Aos sete dias de incubação (a 25 ºC (± 2 ºC), com

112
fotoperíodo de 12 h por sete dias), o crescimento micelial foi avaliado utilizando
escala baseada em Bell et al. (1982).

Resultados e Discussão
Quatro isolados de Trichoderma foram positivos para a produção de ácido
indo acético sendo que o isolado de Trichoderma rugulosum (CMIAINPA 2957)

produziu a maior concentração (162,13 µg.mL-1), seguido pelo Trichoderma

asperelloides (CMIAINPA 2951) que apresentou produção de 73,33 µg.mL-1. Os

isolados de T. albovelutina (CMIAINPA 2475) e Trichoderma asperellum
(CMIAINPA 2959) apresentaram as menores concentrações de 10,66 e 18,4

µg.mL-1, respectivamente (Figura 1).

Figura 1: Produção de ácido indol acético (AIA) pelos isolados de Trichoderma

T-1 = CMIAINPA 2473 (Trichoderma endophyticum); T-2 = CMIAINPA 2951 (Trichoderma
asperelloides); T-3 = CMIAINPA 2957 (Trichoderma rugulosum); T-4 = CMIAINPA 2959
(Trichoderma asperellum); T-5 = CMIAINPA 2961 (Trichoderma asperellum); T-6 =
CMIAINPA 2475) (Trichoderma albovelutina).

113
 Para os ensaios enzimáticos, não foram observadas a presença de halo
em nenhum dos testes enzimáticos realizados, indicando novos ensaios
bioquimicos necessários para reafirmar esses resultados.
Na Figura 2 constam as notas do antagonismo com base em escala de
notas adaptada por Bell et al. (1982), onde maior a nota, maior é a inibição do
patógeno pelo Trichoderma. Dentro de cada experimento com patógenos
diferentes, os tratamentos não diferiram entre si. Porém, comparando os
resultados entre os patógenos, a eficiência sobre S. rolfsii foi significativa com
relação ao outro patógeno, indicando o possível controle do fitopatógeno por esse
grupo de isolados de Trichoderma.

Figura 2: Nível de antagonismos com base em escala de notas adaptada por Bell et al.
(1982). Onde: (T-1 = CMIAINPA 2473 (Trichoderma endophyticum); T-2 = CMIAINPA 2951
(Trichoderma asperelloides); T-3 = CMIAINPA 2957 (Trichoderma rugulosum); T-4 =
CMIAINPA 2959 (Trichoderma asperellum); T-5 = CMIAINPA 2961 (Trichoderma
asperellum); T-6 = CMIAINPA 2475) (Trichoderma albovelutina).

Ao se analisar a porcentagem de inibição de crescimento (PIC) dentro de

cada ensaio, não houve diferenças significativas quanto à eficiência na PIC entre
os isolados de Trichoderma. Todos os isolados de Trichoderma testados
apresentaram um mesmo padrão de antagonismo. No entanto, ao se comparar

114
o antagonismo promovido pelos Trichoderma spp. aos dois fungos patógenos,
percebe-se dois níveis diferentes de eficiência e que são distintos
estatisticamente entre si (Figura 3).

Figura 3: Porcentagem de inibição de crescimento (PIC) em cultura pareada de Trichoderma

spp. com isolados de Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani. Onde: (T-1 = CMIAINPA 2473
(Trichoderma endophyticum); T-2 = CMIAINPA 2951 (Trichoderma asperelloides); T-3 =
CMIAINPA 2957 (Trichoderma rugulosum); T-4 = CMIAINPA 2959 (Trichoderma asperellum);
T-5 = CMIAINPA 2961 (Trichoderma asperellum); T-6 = CMIAINPA 2475) (Trichoderma
albovelutina).

Para R. solani, na média, a PIC variou entre 18.89 a 49.71%,

caracterizando uma baixa eficiência dos isolados selecionados nos ensaios in
vitro. Com relação aos resultados do antagonismo, S. rolfsii foi superior e variou
entre 62.04 a 87.59%, portanto com variação menor que a apresentada com R.
solani. Além de maior eficiência no antagonismo, as respostas dispersaram
menos entre si. Esses dados indicam que há o potencial dos isolados testados
de Trichoderma, particularmente para o biocontrole de S. rolfsii em cultura
olerícolas, mas outros experimentos serão necessários. Na Figura 4 consta a
capacidade antagônica dos seis isolados de Trichoderma testados para os dois
fungos fitopatógenos.

115
Figura 4: Amplitude da Porcentagem de inibição de crescimento (PIC) como capacidade
antagônica de isolados de Trichoderma, in vitro coma colônias de Rhizoctonia solani e
Sclerotium rolfsii . Pic = Porcentagem de inibição de crescimento micelial. Onde: (T-1 =
CMIAINPA 2473 (Trichoderma endophyticum); T-2 = CMIAINPA 2951 (Trichoderma
asperelloides); T-3 = CMIAINPA 2957 (Trichoderma rugulosum); T-4 = CMIAINPA 2959
(Trichoderma asperellum); T-5 = CMIAINPA 2961 (Trichoderma asperellum); T-6 =
CMIAINPA 2475) (Trichoderma albovelutina).

Conclusões
Os isolados de Trichoderma apresentaram potencial para inibir os
patógenos em difererentes escalas para S. rolfsii e R. solani nos bioensaios in
vitro. Mais ensaios em campo devem corroborar com os resultados aqui
apresentados para a seleção dos isolados mais promissores.

Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)
pela assistência financeira via Edital: Edital N. 008/2021 - PROSPAM/FAPEAM.
Projeto: Isolados de Trichoderma spp. para o controle de doenças em cultivos
de interesse econômico no estado do Amazonas.

116
 Referências
Agrofit - Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários - Ministério de Agricultura e
Abastecimento. 2021.
(https://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons). Acessado
em 28 de julho de 2021.

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biocontrol isolates of Trichoderma spp. Applied Environmental Microbiology
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118
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Avaliação de métodos de inoculação de cepas de Bacillus e

efeito na produtividade de milho

Silva, Felipe Campos1; Alves, Talles Henrique Pereira1; Rodrigues, Victor Alef1;
Aragão, Ana Luisa2; Bini, Daniel3; Santos, Flávia Cristina3, Marriel, Ivanildo
Evódio3; Paiva, Christiane Abreu de Oliveira3

1Universidade Federal de São João del-Rey, 2Universidade Federal de Viçosa,

3Embrapa Milho e Sorgo

Email: [email protected]

Resumo
As pesquisas agrícolas buscam métodos que garantem boa produtividade,
usando áreas relativamente menores e potencialmente produtivas, por meio de
tecnologias sustentáveis. O objetivo desse trabalho foi avaliar o desempenho
produtivo de plantas de milho, inoculadas com três métodos de inoculação com
a mistura das cepas de Bacillus (B. megaterium CNPMS B119 e B. subtilis
CNPMS B2084) da Coleção de Microrganismos da Embrapa Milho e Sorgo. O
experimento foi conduzido no campo experimental da Embrapa Milho e Sorgo
em blocos casualizados, composto por quatro tratamentos e quatro repetições.
Os tratamentos foram: T1- sem aplicação de inoculantes, usando 100% da dose
indicada de P2O5; T2 - aplicação do inoculante na semente, usando 50% da dose
recomendada de P2O5; T3 - aplicação do inoculante no sulco do plantio, usando
50% da dose recomendada de P2O5; T4 - aplicação do inoculante após o plantio,
durante o estádio V3 da planta de milho, usando 50% da dose recomendada de
P2O5. Os resultados foram submetidos a análise de variância (ANOVA), cujas
médias dos tratamentos foram submetidas ao teste de médias Scott- Knott 5%,
utilizado o software estatístico R. A inoculação na semente, pulverização no
sulco e pulverização no estádio V3, combinados com 50% da dose de fósforo,
apresentaram produtividade de milho estatisticamente iguais e superiores a
testemunha (T1). Esses resultados indicam que os métodos de inoculação da
mistura das cepas de Bacillus B119 e B2084 asseguraram a manutenção e
aumento da produtividade e milho mesmo com metade da dose de P
recomendada, indicando a eficiência dessas cepas em promover o
desenvolvimento da planta e potencializar a adubação fosfatada.

Palavras-chave: Solubilizador de fosfato; Biodiversidade; Método de inoculação

Introdução
Estima-se que seja necessário aumentar cerca de 70% na produção de
alimentos até 2050, para suprir a demanda necessária para atender o
crescimento substancial da população (Ingran 2011; Vinchira-Villarraga 2019).

119
Neste caso, o constante progresso da agricultura se ampara na busca por
métodos que garantem boa produtividade, utilizando áreas relativamente
menores e soluções ecológicas que viabilizem a produção (Ratz et al. 2017).
O mercado atual dispõe de tecnologias e métodos que possibilitam
retorno atrativo, indo desde as técnicas de manejo a uso de insumos biológicos,
como os inoculantes, que vêm destacando sua relevância no mercado atual,
posto que a baixa fertilidade dos solos compõe algumas das diversas condições
ambientais que causam estresse na cultura do milho (Júnior et al. 2020).
Alguns insumos biológicos propiciam o uso de recursos não renováveis
que são limitantes na produção, de forma eficiente e com o menor impacto
ambiental. Entre os microrganismos promotores do crescimento de plantas,
destacam- se os do gênero Bacillus, sendo que algumas espécies apresentam
mecanismos eficientes para aumentar a eficiência do uso de fósforo no solo
(Oliveira et al. 2009; Oliveira-Paiva et al. 2020 a; Sousa et al. 2021). Para tanto,
a inoculação de microrganismos que potencializam a adubação fosfatada vem
se tornando cada vez mais recorrente no cultivo do milho. Em simbiose com a
rizosfera do milho, possuem alta capacidade de produzir enzimas e ácidos
orgânicos, que são substâncias que mineralizam e solubilizam o fósforo na
região da rizosfera, além de apresentarem outras características que promove o
crescimento radicular e, desta maneira, há maior absorção de nutrientes e água
(Aloo et al. 2019; Oliveira-Paiva et al. 2020).
Um dos casos mais recentes é o uso das cepas combinadas de Bacillus,
CNPMS B119 (B. megaterium), isolada da rizosfera do milho, e CNPMS B2084
(B. subtilis), na qual possui características endofíticas para a cultura do milho,
sendo estas a base do primeiro inoculante comercial brasileiro voltada para o
fósforo, o BiomaPhos®. Um dos fatores que permitiram o avanço sistêmico do
uso de inoculantes, além da legislação implementada em 1980, foi o
desenvolvimento de inoculantes na forma líquida, ocorrido na década de 1990
por empresas nacionais, permitindo maior praticidade de uso para fins agrícolas
(Castro e Araújo 2018).
No Brasil, predomina o uso de inoculantes via sementes, ocasionado
assim a preocupação quanto à compatibilidade com outros tratamentos, como
químicos ou até mesmo biológicos usados nas sementes (Hungria et al. 2015). A
partir disso, métodos de aplicação vêm sendo aprimorados desde então,

120
como aplicação no tratamento da semente, pulverizados no sulco de plantio e
até mesmo no desenvolvimento inicial da plântula.
O objetivo desse trabalho foi avaliar o desempenho produtivo de plantas
de milho, inoculadas com a mistura de duas cepas de Bacillus (B. megaterium
CNPMS B119 e B. subtilis CNPMS B2084), por três diferentes métodos de
inoculação, via tratamento de semente, pulverizado em sulco de plantio e
pulverizado em estádio V3 da planta do milho.

Material e Métodos
O experimento foi conduzido durante a safra de milho 2021/22 no campo
experimental da Embrapa Milho e Sorgo, situada na cidade de Sete Lagoas-MG.
O solo da região é classificado como Latossolo Vermelho típico, fase cerrado,
com baixo teor de fósforo. Segundo Köppen e Geiger, o clima da região é
classificado como Cwa, com índices pluviométricos anuais de 1.382,7 mm e
temperatura média anual de 21,6 ºC (Guimarães et al. 2010). O ensaio foi
estabelecido em delineamento em blocos casualizados, composto de quatro
tratamentos com quatro repetições, composto por: T1- Sem aplicação de
inoculantes, usando 100% da dose indicada de P2O5; T2- Aplicação do
inoculante na semente, usando 50% da dose recomendada de P2O5; T3-
Aplicação do inoculante no sulco do plantio, usando 50% da dose recomendada
de P2O5; T4- Aplicação do inoculante após o plantio, durante o estádio V3 da
planta de milho, usando 50% da dose recomendada de P2O5.
Os microrganismos foram crescidos em meio de cultura líquido (TSB)
durante três dias, a 28 ºC, em agitação constante de 120 rpm. Após o
crescimento, as culturas foram centrifugadas durante 10 min, a 6.000 rpm e
ressuspendidas em meio de cultura líquido (TSB). Houve o ajuste da suspensão
bacteriana à uma absorbância igual a 1, usando um comprimento de onda de
540 nm, na qual corresponde a uma densidade aproximada de 108 células mL-1.
Para o tratamento da semente foi usado uma dose recomendada de 100 mL ha-
1
com adição de um aditivo especial para inoculantes. Para a pulverização no
sulco de plantio e no estádio V3 da planta do milho, foi utilizada a dose de 200
mL do inoculante preparado para cada 100 L de água. A pulverização foi
realizada utilizado um pulverizador costal com cilindro de CO2.Foi utilizado o
híbrido de milho KWS, RB9006 VT PRO 2, sendo avaliada a produtividade média

121
para cada tratamento. Os dados foram submetidos a ANOVA, utilizando o
software estatístico R® Studio (R Core Team 2022) e quando detectada
significância, foi as médias foram submetidas ao teste de Scott- Knott 5% de
significância (p<0,05).

Resultados e Discussão
Os dados indicam que a resposta em produtividade do milho independe
do método de aplicação, uma vez que seus valores não diferiram entre os três
diferentes métodos e foram superiores aos resultados obtidos na testemunha
(Tabela 1).

Tabela 1. Produtividade do milho, em função de diferentes métodos de aplicação do

inoculante a base de microrganismos solubilizadores de fosfato, aplicados no tratamento de
semente, sulco de plantio e em estadio V3 da planta do milho.

Tratamentos Produtividade
(kg ha-1)
T1 - Sem inoculação 100% P 2.114,54 b*
T2 - Semente+50%P 3.716,71 a
T3 - Sulco+50%P 4.463,71 a
T4 - V3+50%P 4.498,91 a
*Médias seguidas da mesma com letra iguais na coluna não diferem significativamente entre
si, pelo teste Scott-Knott a 5% (P<0,05).

Na aplicação do inoculante no sulco de plantio pretende reduzir a

mortalidade das bactérias, evitando que as células fiquem expostas à altas
temperaturas na caixa de semente ou em contato direto com o tratamento
químico da semente, enfatizado por Hungria et al. (2020) e Bueno et al. (2022),
quando afirmam que a viabilidade das células é prejudicada em altas
temperaturas, atenuando sob a superfície das sementes quando se adiçiona
produtos no tratamento da semente.
A aplicação do inoculante pulverizado em estádio V3 busca a colonização
de maior número de raízes em desenvolvimento, sem que a demanda de nutriente
pela planta seja afetada. O estádio V3 do milho, é o momento em que a planta
possui três folhas completamente desenvolvidas, cerca de 15 dias após a
emergência, e se encontra em pleno crescimento radicular, os pelos radiculares
do sistema radicular nodal se encontram em crescimento e ocorre assim a
paralização do desenvolvimento das raízes seminais, momento esse que está

122
ocorrendo a definição de espigas e folhas a serem emitidas (Magalhães et al.
2008).

Conclusões
Os resultados indicam que a inoculação, combinada com a dose reduzida
de fósforo realizada durante o plantio com a aplicação direta na semente;
pulverização direta no sulco de plantio e pulverização no estádio V3 da planta de
milho, apresentaram resultados estatisticamente iguais e superiores à
testemunha agronômica com a dose total de fósforo.

Agradecimentos
À Embrapa, UFSJ e ao CNPq pela contribuição para a realização da
pesquisa.

Referências
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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Bactérias nativas de Roraima com potencial para o controle da

escaldadura do arroz

Araújo, Ramila Santana de1, Dutra, Lesliê de Cássia do Espírito Santo1,

Pereira, Gilmara Maria Duarte1, *Schurt, Daniel Augusto2

1
Universidade Federal de Roraima, 2Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária, E-mail: [email protected]

Resumo

As lavouras de arroz frequentemente são afetadas por fungos fitopatogênicos,

como o Monographella albescens causador da escaldadura, diminuindo a
produtividade e a qualidade dos grãos. Com o intuito de selecionar bactérias
para o biocontrole da doença, foram realizados testes in vitro e in vivo. Nos testes
in vitro para antibiose, utilizaram-se 316 bactérias isoladas de arroz silvestre e
comercial do estado de Roraima. Destas, 30 bactérias reduziram
significativamente o crescimento micelial de M. albescens. Através do teste de
antibiose in vitro, detectou-se o efeito inibitório entre os isolados bacterianos a
M. albescens. As bactérias selecionadas foram avaliadas em condições de casa
de vegetação no controle da escaldadura, através da pulverização de foliar de
suspensão de células bacterianas dos isolados selecionados in vitro. Neste
experimento, 15 isolados bacterianos reduziram significativamente o progresso
da escaldadura, com eficiência de até 46%. Estudos futuros deveram ser
realizados para avaliar a eficiência dos isolados em condições de campo, em
diferentes tipos de solo e clima. Dependendo dos resultados, o biocontrole
poderá ser ampliado pelo desenvolvimento de novas estratégias, como a
aplicação conjunta de múltiplos agentes de biocontrole, rotação com controle
químico e redução da supressão de inóculo inicial.
Palavras-chave: Controle biológico, Fitopatógeno, Oryza sativa.

Introdução

A cultura do arroz (Oryza sativa), presente em todos os continentes, é uma

das mais importantes da indústria alimentícia do mundo (Naves e Bassiniello,
2016). Entretanto, em várias regiões as lavouras de arroz frequentemente
enfrentam problemas que limitam a produtividade, como a incidência de doenças
causadas por fungos fitopatogênicos (Cordeiro, 2015), como o fungo
Microdochium albescens (fase anamórfica) (Thümen) M. Hern.-Restr. & Crous,
Persoonia (2016), Monographella albescens (fase teleomórfica), agente causal

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da escaldadura do arroz que reduz a produtividade e a qualidade dos grãos

(Rêgo, 2017). No mercado, não há cultivares de arroz resistentes ao patógeno.
A aplicação de produtos químicos, que possuem aspectos econômicos e
ambientais negativos, é a única forma para o controle da doença.

Diante dessa problemática, pesquisas que buscam alternativas viáveis para

a rizicultura são de extrema importância. A capacidade das plantas de arroz em
estabelecer relações com vários gêneros de bactérias tem sido relatada ao longo
dos últimos anos. Essas bactérias, denominadas Bactérias Promotoras de
Crescimento Vegetal (BPCV), colonizam o tecido vegetal sem causar dano e
estimulam o crescimento e desenvolvimento da planta hospedeira (Hungria et
al., 2010; Videira et al., 2012).

A utilização de BPCV no controle de doenças fúngicas na cultura do arroz

pode trazer vários benefícios para a planta e reduzir custos de produção, além
de diminuir os riscos ambientais. Nascente et al. (2017), revelou em seu estudo
que plantas de arroz tratadas com Serratia sp. (BRM32114) e Bacillus sp.
(BRM32110 e BRM32109) apresentaram maiores valores de taxa fotossintética
e biomassa da matéria seca de brotações, além disso, os tratamentos com
Burkolderia sp. (BRM32113), Serratia sp. (BRM32114) e Pseudomonas sp.
(BRM32111 e BRM32112) levaram à maior absorção de nutrientes pelas
brotações de arroz.

No entanto, até o momento, essa prática não pode ser adotada para a
escaldadura do arroz devido a inexistência de produtos biológicos registrados
para o controle de M. albescens. Além disso, estudos que objetivam identificar
bactérias que promovam o crescimento das plantas de arroz de Roraima ainda
são incipientes. Portanto, no presente trabalho foram realizados estudos através
de ensaios in vitro e casa de vegetação, visando avaliar populações de BPCV
associadas às plantas de arroz, visando o controle de M. albescens.

Material e Métodos

O trabalho foi realizado nos laboratórios de Fitopatologia e de Microbiologia

do Solo da Embrapa Roraima. Foram avaliadas 316 bactérias isoladas de arroz

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silvestre e comercial do estado de Roraima e que compõem a coleção de

Microrganismos da Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Roraima, Boa Vista,
RR. Todos os isolados bacterianos estão preservados em grãos de trigo e em
meio de cultura em tubo de ensaio.

Obtenção e identificação do fungo causador da escaldadura do arroz

O fungo fitopatogênico foi obtido a partir de folhas com sintomas típicos da

escaldadura em arroz (cultivar BRS Primavera) do município de Bonfim, RR.
Realizou-se o isolamento direto para obtenção da colônia fúngica, pela
transferência de propágulos para meio Ágar Batata Dextrose (BDA) em placas
de Petri, seguindo-se a incubação a 26 ºC, sob regime de 12 h de fotoperíodo.
Na identificação preliminar, a colônia micelial apresentou características
morfológicos típicas de M. albescens, com aspecto cotonoso e crescimento
inicial de cor branca, e, posteriormente, com coloração creme e massas rosadas
(Figura 4A). Além disso, quando avaliado os aspectos microscópicos da cultura,
observou-se as características típicas do fungo, como a formação de conídios
curvos, bicelulados quando maduros, hialinos e arredondados nas extremidades
(Kimati, 2005).

A patogenicidade do isolado fúngico, confirmada por meio dos postulados de

Koch, inoculando plantas de arroz com suspensão de esporos em água destilada
e esterilizada (105 esporos mL-1), mantidas em câmara úmida por 24 h. Após
sete dias, foi detectado os sintomas da doença nas folhas das plantas
semelhantes aos sintomas originais da escaldadura do arroz. O isolado foi
preservado em tubo de ensaio inclinado contendo meio de cultura BDA, sendo
mantido a 4 ºC e pelo método de Castellani (Alfenas e Mafia, 2007).

Teste in vitro de antibiose

Os 316 isolados bacterianos foram testados in vitro quanto a atividade

antagônica ao fungo M. albescens, pelo método de antibiograma em placas de
Petri contendo o meio BDA. Nas extremidades de cada placa foram semeadas
equidistantemente quatro isolados de bactérias e, posteriormente, acrescentou-

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se um disco de ágar de 0,5 cm de diâmetro, contendo o micélio de M. albescens.

Como amostra controle, foram utilizadas placas de Petri com meio BDA
inoculadas somente com M. albescens. Para cada tratamento, foram realizadas
cinco repetições. As placas foram incubadas a 27 ºC durante seis dias, sendo
avaliadas a cada 24 h através da medição do crescimento micelial com
paquímetro digital. A capacidade de antibiose foi determinada qualitativamente,
através da observação e medição o halo de inibição após seis dias de incubação,
e qualitativamente através da medição do crescimento micelial.

Teste in vivo de biocontrole

A capacidade das bactérias no biocontrole da escaldadura foi investigada

pelo método de pulverização foliar, utilizando 30 isolados bacterianos
selecionados no teste in vitro. No ensaio foram utilizadas plantas de arroz com
30 dias de idade (cultivar BRS Primavera), cultivadas em vasos de 500 mL
contendo substrato composto por solo, areia e esterco bovino curtido (1:1:1) e
adubo de acordo com a recomendação para a cultura do arroz.

As plantas foram pulverizadas utilizando suspensão bacteriana apresentando

absorbância a A540= 0,2 e em seguida foram incubadas em câmara úmida por
24 h. Como testemunha negativa, plantas foram pulverizadas somente com água
e como testemunha positiva, plantas foram pulverizadas com a suspensão do
isolado de Serratia spp. (BRM32114), cepa bacteriana descrita como promotora
de crescimento vegetal e gentilmente fornecidas pela coleção de
Microrganismos e Fungos Multifuncionais da Embrapa Arroz e Feijão.

Os tratamentos foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado

com quatro repetições.

Após o período de incubação, cada planta foi inoculada com o isolado M.

albescens, utilizando uma suspensão de esporo em água destilada e esterilizada
(105 esporos mL-1) e em seguida foram incubadas em câmara úmida por 24 h a
25 ºC, sob umidade relativa de 90%. Após sete dias da inoculação, foi
determinado a severidade da doença em cada planta (porcentagem de áreas
foliares lesionadas), utilizando escala de nota recomentado por IRRI (1996).

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Os dados coletados foram utilizados para calcular a área abaixo da curva do

progresso da doença (AACPD), através da fórmula: AACPD = ∑ [(y1 + y2)/2]*(t2-
t1), onde: y1 e y2 refere-se a duas avaliações sucessivas da intensidade da
doença realizadas nos tempos t1 e t2, respectivamente (Shaner e Finney, 1977).

Os resultados foram avaliados utilizando o software RStudio 3.5.3, através de

análise de variância, onde as médias foram comparadas pelo teste de Scott-
Knott, ao nível de 5% de probabilidade.

Resultados e discussão

O teste de antibiose in vitro, indicou inibição dos isolados bacterianos no

crescimento micelial do M. albescens. Os metabólitos produzidos pelos isolados
produziram halos de inibição e reduziram o crescimento micelial do fitopatógeno
em comparação ao controle (Tabela 1).

A capacidade de inibição do crescimento micelial de M. albescens. pelos

isolados testados auxiliam na evidenciação da capacidade de biocontrole. De
forma geral, testes de antibiose in vitro têm constituído em boa estratégia de
seleção massal de candidatos a agentes promissores, onde diversas espécies
de bactérias foram descritas capazes de sintetizar metabólitos tóxicos, como os
antibióticos, que inibem o crescimento de fitopatógenos (Guerreiro et al., 2011;
Santos, 2014; Shanmugaiah et al., 2010; Solino et al. 2017).

Tabela 1 - Avaliação de isolados bacterianos com potencial de inibição no

crescimento micelial, Halo de inibição e Índice de Velocidade de Crescimento
Micelial (IVCM) de Microdochium albescens.

Tratamento Halo (mm) IVCM (mm dia-1)

Controle 6,70 a
123 20,09 a 1,65 e
124 17,06 b 1,48 e
128 15,95 b 1,70 e
134 15,39 b 1,86 e
126 15,12 b 1,54 e
354 14,97 b 1,99 e
87 14,67 b 2,79 c

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147 14,49 b 2,33 d

144 14,33 b 1,95 e
132 14,04 c 2,47 d
84 13,85 c 2,91 c
148 13,64 c 1,93 e
76 13,63 c 2,55 d
182 13,30 c 1,79 e
347 13,20 c 1,99 e
175 13,00 c 2,12 e
191 12,74 c 2,10 e
326 12,53 c 2,68 c
98 12,25 c 2, 71 c
92 12,06 c 2,92 c
193 5,66 e 1,62 e
388 5,30 e 2,96 c
225 4,61 e 2,47 d
329 4,24 f 3,12 c
224 3,16 f 2,73 c
226 3,73 f 2,88 c
325 3,32 f 2,41 d
BRM32114 2,78 f 4,56 b
327 2,61 f 4,44 b
CV% 20,4 16,1
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott a 5%. Tratamento: BRM32114 - Serratia spp.

No ensaio realizado em casa de vegetação, entre os isolados testados, 15 se

destacaram por reduzir substancialmente a severidade da doença quando
comparado com o tratamento controle (Figura 1). Os isolados 132, 388, 175, 326,
225, 92 e 128 reduziram a severidade da doença em 16% a 26%, e os isolados
354, 98, 76, 134, 148, 84, 87 e 123 reduziram de 31% a 46% a intensidade da
doença.

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Legenda: Controle negativo (C), controle positivo com Serratia spp. BRM32114. Médias
seguidas pela mesma letra entre as colunas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott, ao
nível de 5% de probabilidade.

Figura 1. Área abaixo da curva do progresso da escaldadura (AACPD) após a inoculação com
Microdochium albescens em plantas de arroz pulverizadas com isolados bacterianos 24 h
antes das inoculação do patógeno.

Parte dos isolados bacterianos (46,6%), que inibiram in vitro o

crescimento micelial de M. albescens, não reduziram a severidade da
escaldadura em casa de vegetação. Tal resultado pode estar relacionado às
condições ambientais diferentes atuando quando ocorrer introdução deste ao
meio. Além disso, a incapacidade inibitória in vivo também é influenciada pela
resposta dos patógenos desafiados em cenário distintos. Uma vez que,
patógenos podem apresentar mecanismos para suplantar as substâncias tóxicas
sintetizadas pelo antagonista, por meio de conversão de substâncias atóxicas ou
modificando a estrutura alvo da substância (Pozzebon, 2015).

Poucos relatos na literatura são encontrados acerca do biocontrole da

escaldadura do arroz, fato que justifica em parte a ausência de produtos
biológicos registrados atualmente no mercado para o controle dessa doença
(AGROFIT, 2020). No entanto, resultados interessantes em termos de controle
da doença in vivo foram observados em estudos com isolados bacterianos do
gênero Bacillus e Pseudomonas sp. (Ludwig et al., 2009; Souza Jr. et al., 2017;
Bueno et al., 2017).

Nesse trabalho, os isolados promissores reduziram em até 46% a

severidade da escaldadura. No entanto, o método de aplicação de cada isolado

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pode influenciar de forma expressiva a capacidade de supressão da doença. Tal

fato foi relatado por Filippi et al. (2011), que investigaram a atuação de isolados
bacterianos através de três métodos de aplicação (inoculando no solo aos 15 e
2 dias antes da inoculação com o patógeno, e pulverizando foliar 2 dias antes de
inocular o fungo) no controle da brusone do arroz (Magnaporthe grisea B.
Couch). O isolado Rizo-55 apresentou menor AACPD quando pulverizado,
suprimindo 86% a severidade da doença, enquanto que o Rizo-46, inoculado no
solo 15 dias antes da inoculação do patógeno reduziu em 65% da severidade.

Dessa forma, os isolados que se destacaram como promissores para o

controle da escaldadura do arroz, devem ser testados através de outros métodos
de aplicação visando maximizar o controle da doença, como inoculação no solo
ou das sementes, com diferentes concentrações do inóculo, e pela combinação
múltipla de agentes de biocontrole. Sobretudo, para que experimentos em casa
de vegetação se revestam de confiabilidade quanto à reprodutibilidade, se faz
necessário que sejam repetidos no tempo e com maiores unidades amostrais
por tratamento. Havendo a possibilidade de pequenas variações de temperatura,
hospedeiro, concentração do inóculo, assim como agressividade do patógeno
contribuam para confirmações da eficiência dos agentes de biocontrole.

Os isolados 354, 98, 76, 134, 148, 84, 87 e 123 apresentaram-se como
potenciais microrganismos a serem utilizados no manejo integrado da
escaldadura do arroz. Estudos futuros deverão ser realizados para quantificar
seus desempenhos em condições de no campo, em diferentes tipos de solo e
clima. Esse biocontrole poderá ser ampliado pelo desenvolvimento de novas
estratégias, como aplicação da mistura múltiplos agentes de biocontrole, rotação
com controle químico e redução da supressão do inóculo inicial.

Conclusões

As bactérias isoladas de plantas de arroz inibiram in vitro o crescimento

micelial de M. albescens.

A pulverização foliar em plantas de arroz com os isolados bacterianos

selecionados in vitro, foi eficiente no controle da escaldadura das folhas do arroz.

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Caracterização da água do igarapé do Mindu e utilização de

fungos filamentosos no seu biotratamento

Silva, Isaque Ferreira1; Campos, Maria Eduarda dos Santos1; Matos, Rosangela
Santana Martins1; Souza, Ivanete Ferreira1; Silva, Ingrid Reis1

1
Centro de Biotecnologia da Amazônia
Email: [email protected]

Resumo
O Igarapé do Mindu vive uma constante ameaça de degradação de suas águas.
Uma alternativa que busca minimizar esses danos é a biorremediação, uma
tecnologia que proporciona uma qualidade significativa da água, além de possuir
baixo custo de implantação. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar
os parâmetros físico-químicos e microbiológicos de um curso do Igarapé do
Mindú e avaliar a utilização de fungos filamentosos para biorremediação deste
ambiente. Amostras foram coletadas em 3 pontos específicos e as análises
realizadas no Lab. de Microbiologia do Centro de Biotecnologia da Amazônia
(CBA). Os parâmetros físico-químicos avaliados foram: pH, temperatura,
condutividade elétrica, turbidez, Oxigênio Dissolvido (OD), Demanda Química de
Oxigênio (DQO), Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) e Compostos
Nitrogenados (NH4+). Os parâmetros microbiológicos foram principalmente
coliformes totais e Escherichia coli. Para o biotratamento, foram avaliados 5
fungos da Coleção CBA. O efluente doméstico apresentou pH na faixa de 7, e
turbidez entre 14,05 a 21,45 NTU, o que resulta em conformidade com a
legislação para esses parâmetros. A condutividade variou entre 429 e 666
µS/cm. A variável O.D ficou entre 0,64 - 1,08 mg/L. O Nitrogênio amoniacal
variou entre 7,92 e 10,22 mg/L. Os valores para DBO e DQO foram
extremamente elevados, correspondendo respectivamente entre 18,99 e 31,48
para DBO e 44,16 e 73,11 para DQO. Esses resultados indicam forte presença
de matéria orgânica proveniente de resíduos lançados no igarapé e elevado
consumo de oxigênio para o processo de oxidação da matéria orgânica. A análise
dos parâmetros físico-químicos e microbiológicos mostrou um significativo grau de
comprometimento e degradação ambiental no leito do igarapé. Após os 10 dias de
tratamento os 5 fungos filamentosos depositados na Coleção CBA, foram
capazes de melhorar os parâmetros microbiológicos da água de acordo com a
resolução do CONAMA 357/2005.

PALAVRAS-CHAVE: Amazônia; Biodiversidade; Biodegradação

Introdução
A biorremediação é uma tecnologia que utiliza microrganismos para
minimizar ou remover poluentes, entre os quais os hidrocarbonetos de petróleo,
sem afetar o equilíbrio ecológico do ambiente (Soares et al. 2011). Bactérias,
leveduras e fungos filamentosos são agentes transformadores eficazes, pois têm

135
a habilidade de degradar uma ampla variedade de substâncias orgânicas
comumente encontradas nos efluentes gerados pelas refinarias e indústrias.
Estratégias de biorremediação incluem: a utilização de microrganismos
autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de tecnologias
ativas de remediação (biorremediação intrínseca natural); a adição de agentes
estimulantes como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes (bioestimulação); e a
inoculação de consórcios microbianos enriquecidos (bioaumento) (Bento et al.
2003; Mariano et al. 2007). O benefício desses processos é a mineralização do
poluente, isto é, a transformação em gás carbônico, água e biomassa. A
assimilação de tais substâncias como fonte de carbono e/ou de energia destaca
os microrganismos como importante alternativa aos métodos convencionais de
tratamento, sendo cada vez mais empregados na resolução de problemas
ambientais (Costa et al. 2017; Francisco et al. 2018). Os microrganismos
também produzem biossurfactantes que possuem propriedades surfactante e
emulsificante, sendo adicionados ao ambiente para estimular o processo de
biorremediação, tornando os poluentes disponíveis à biodegradação (Faria
2010). Neste sentido, os microrganismos podem ser utilizados na recuperação
de águas de esgoto doméstico, na eliminação de contaminantes específicos de
água de rios, lagos e igarapés, onde a biorremediação oferece algumas
vantagens sobre outras técnicas de remedição, pois é ecologicamente correta,
não altera o equilíbrio dos ecossistemas, visando somente à biodegradação dos
compostos poluentes (Morais et al. 2016).
A bacia hidrográfica do Mindu, é a bacia de maior expressividade na
cidade, apresenta seu entorno na área urbanizada da cidade de Manaus, ocupa
1/4 do território do município, sendo seu curso principal o igarapé do Mindu
(Manaus 2008). Esta bacia hidrográfica encontra-se em grande ameaça de
poluição e contaminação de seus cursos d´água, apresentando grande volume
de dejetos orgânicos lançados sem tratamento e efluentes industriais lançados
ao longo dos mananciais que compõem a bacia (Silva et al. 2014).
Os esgotos domésticos provocam dois tipos de contaminação das águas:
1) Contaminação por bactérias - principalmente por coliformes presentes em
fezes; 2) Contaminação por substâncias orgânicas recalcitrantes, como
detergentes sulfônicos, cuja ação tóxica não é muito acentuada, mas os efeitos
secundários são graves (Archela et al. 2003). A resolução nº 357, de 17 de março

136
de 2005, Conselho Nacional do Meio Ambiente - CONAMA, dispõe sobre a
classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu
enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de lançamento
de efluentes (Brasil-Conama, 2005). Segundo levantamento divulgado pelo
Instituto Trata Brasil (2018), a Cidade de Manaus-AM, encontra-se entre os 10
piores municípios com mais deficiência na coleta de esgoto. De acordo com
esses dados, a cidade não atende toda a população e ainda colabora com sua
ineficiência no saneamento básico para que sejam lançados diretamente 89,82%
de esgoto in natura nas águas, com predominância nos córregos urbanos da
cidade, apresentando alta contaminação e poluição dos rios e igarapés da cidade
(Trata Brasil 2018). Pesquisas apontam a utilização de fungos em processos de
biorremediação como perspectivas de tratamento (Campos et al. 2018). Dessa
forma é de extrema importância a pesquisa e investimento em métodos
alternativos de tratamento de efluentes e biorremediação dessas áreas
contaminadas.

Material e Métodos
Área de Estudo
A área de estudo foi nas proximidades do Parque Municipal do Mindu,
onde as amostras foram coletadas em 3 pontos distintos: 1 (Montante - S: 03°
04' 42,4" - W: 059° 59' 56,0"; 2 (Meio Ponte - S: 03° 04' 46,6" - W: 059° 59' 55,9";
3 (Final - S: 03° 04' 49,9" - W: 059° 59' 55,2"). As coletas de água foram
realizadas conforme a Resolução ANA nº 724/2011. As amostras foram levadas
ao Laboratório de Microbiologia do Centro de Biotecnologia da Amazônia (CBA)
para realização das análises físico-químicas e microbiológicas.

Parâmetros Físicos: pH, condutividade elétrica, temperatura da água e

oxigênio dissolvido
Esses parâmetros foram avaliados no local de amostragem, com
auxílio de um medidor (sonda) multiparâmetros. Essas análises foram realizadas
em triplicata por imersão direta do eletrodo na água. A turbidez foi realizada por
espectrofotometria com medição direta sem filtração da amostra de água. A
determinação foi realizada método nefelométrico, medida por turbidímetro.
(Resolução ANA nº 724/2011).

137
Parâmetros químicos
A metodologia utilizada foi conforme descrita em APHA (Standard
methods 5220D), e os resultados comparados e analisados de acordo com as
Normas e Padrões estabelecidos pelo CONAMA 430/2011. A análise para
Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) foi realizada através da quantificação
por titulometria com tiossulfato de sódio. Para Demanda Química de Oxigênio
(DQO), o método foi realizado a partir da determinação por titulometria com
reagente oxidante permanganato de potássio. A determinação de Compostos
Nitrogenados (NH4+) foi determinada pelo método colorimétrico e Kjedahl por
titrimetria.

Caracterização Microbiológica
As análises de caracterização microbiológica foram realizadas após a
coleta de água e após o biotratamento com os microrganismos selecionados. A
quantificação de Escherichia coli e coliformes totais foi realizada pela técnica da
membrana filtrante, um método rápido e preciso para isolamento e identificação
de colônias de bactérias, conforme metodologia descrita em Standard Methods
for the Examination of Wastewater (APHA 2005). A determinação de coliformes
totais e de Escherichia coli foi realizada a partir da utilização de meios seletivos
e substrato cromogênico-fluorogênico-hidrolizáveis, empregando 100 mL de
cada amostra, onde foram filtradas através de uma membrana filtrante de 47 mm
de diâmetro e 0,45 µm de porosidade, e a utilização de funil de filtração Millipore
e uma bomba a vácuo. As Colônias encontradas foram agrupadas de acordo
com a morfologia e coloração conforme demostrado na tabela abaixo:

Tabela 1: Morfologia das colônias de coliformes totais e Escherichia coli

Meio de cultura Grupo Características morfológicas
das colônias
Agar Endo Less Coliformes Totais Colônias róseas e vermelhas
escuras com brilho
Escherichia coli Colônias verde brilhante
Agar m-FC Coliformes Colônias azuis
Termotolerantes

138
Biotratamento
Foram avaliados 5 fungos filamentosos depositados na Coleção
Microbiológica do Centro de Biotecnologia da Amazônia (CBA): CBA 2601
(Trichoderma spp.), CBA 2345 (Trichoderma spp.), CBA 2255 (Penicillium spp.),
CBA 22 (Acremonium spp.) e CBA 2236 (Acremonium spp.). Os referidos
gêneros já foram reportados na literatura, como promissores em processos de
biorremediação. Para o preparo do inóculo, foi utilizada a metodologia de Steluti
et al. (2004), com algumas modificações. Foi transferida uma alçada de micélio
do fungo para placas de Petri contendo meio BDA com cloranfenicol 500 mg/L.
As placas foram incubadas em estufa a 28 ºC por 7 dias. Foram transferidos 20
fragmentos medindo 5 mm de diâmetro para cada frasco erlenmeyer de 2L
contendo 500 mL de meio mínimo para fungos adaptado, utilizando a água
coletada do Igarapé do Mindu (Araújo et al. 2010). Os tratamentos foram
incubados por 10 dias, a 28 °C e agitação de 120 rpm (Heinz et al. 2017). Após
o período de biotratamento foram realizadas as análises dos parâmetros
microbiológicos descritos no item anterior. Os resultados obtidos foram
comparados com os resultados iniciais sem o tratamento biológico e verificados
se houve melhora dos parâmetros microbiológicos de acordo com a resolução
do CONAMA 357/2005.

Resultados e Discussão
Parâmetros Físico-Químicos
Os principais agentes poluentes encontrados no igarapé do Parque do
Mindu, em sua maioria, são de origem doméstica, sendo descartado pela
população do seu entorno, e tem uma forte influência na qualidade de suas
águas, pois isto acarreta nas alterações dos parâmetros físico-químicos de
acordo com a Resolução 357/2005 do CONAMA (Brasil 2005). Os resultados
das análises da primeira coleta realizada no entorno do Igarapé do Mindú estão
dispostos na Tabela 2.

139
Tabela 2. Resultado dos Parâmetros Físico-Químicos Avaliados
PARÂMETROS UNIDADE CONAMA Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3
FÍSICOS N° 357/2005
Condutividade µS/cm - 435,33 429,33 666
Elétrica *
PH * - 6-9 7,1 7,12 7,09
Oxigênio Dissolvido * mg/L Mín 5 0,9 1,08 0,64
Turbidez ** NTU 100 20,65 21,45 14,05
Temperatura * °C - 28 28 28
PARÂMETROS UNIDADE CONAMA N° Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3
QUÍMICOS 357/2005

Nitrogênio Amoniacal mg/L 3,7 9,36 7,92 10,22

**
Demanda Bioquímica mg/L 5 18,99 19,37 31,48
de Oxigênio **
Demanda Química de mg/L - 44,16 45,04 73,11
Oxigênio **
Razão de 0,43 0,43 0,43
Biodegradabilidade

DBO/DQO
OBS: *Determinação do parâmetro in loco / **Determinação do parâmetro pelo Laboratório

O principal parâmetro físico avaliado foi o oxigênio dissolvido (OD). Para

esta variável, os resultados encontrados variaram entre 0,64 - 1,08 mg/L, abaixo
do que estabelece a Resolução CONAMA 357/2005 para águas doces classe II
(≥5 mg/L). Logo, indica entrada elevada de matéria orgânica no igarapé. Valores
elevados indicam condição melhor da água, pois revela consumo de O2 pelos
microrganismos no processo de degradação da matéria orgânica (Machado
2012). Dentre os parâmetros químicos avaliados, o resultado encontrado para
Nitrogênio amoniacal total variou entre 7,92 e 10,22 mg/L. Os valores estão muito
acima do que especifica a Resolução 357/2005 do CONAMA para águas doces
classe II, o que indica um ambiente alterado com alta concentração de íons
amônio, resultado da degradação de matéria orgânica. O valor para Demanda
Química de Oxigênio (DQO) não é estabelecido pela Resolução 357/2005 do
CONAMA (Brasil 2005). Para a Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) o valor
estabelecido é ≤5. No entanto, segundo Morales et al. (2015), DQO e DBO são
dois parâmetros importantes para definir a qualidade da água superficial pois a
DQO representa a quantidade de oxigênio necessária para oxidar a matéria
orgânica presente na água e a DBO indica a quantidade de matéria orgânica e
quanto mais o valor de DBO se aproximar da DQO, indica que mais
biodegradável será o efluente. Como observa-se na Tabela 2, os valores
encontrados estão extremamente elevados correspondendo a 18,99 (Ponto 1),

140
19,37 (Ponto 2) e 31,48 (Ponto 3) resultados totalmente fora do padrão, o que
indica forte presença de matéria orgânica proveniente de resíduos lançados no
igarapé. Os valores de DQO representando 44,14 (Amostra 1), 45,04 (Amostra
2) e 73,11 (Amostra 3), o que indica elevado consumo de oxigênio para o
processo de oxidação da matéria orgânica. A razão de biodegradabilidade
(DBO5/DQO), tem sido utilizada para expressar a biodegradabilidade dos
efluentes, sendo este parâmetro uma ferramenta auxiliar na definição do
procedimento técnico para o tratamento de efluentes. A razão DBO5/DQO
encontrada foi de 0,43. Segundo Jardim e Canela (2004) efluentes com razão
DBO5/DQO superiores a 0,4 são biodegradáveis, e neste sentido os valores de
DBO5/DQO observados no efluente estudado, sugerem que tratamentos
biológicos podem ter sucesso quanto à redução de carga orgânica do mesmo.

Parâmetros Microbiológicos
A determinação da potencialidade de uma água transmitir doenças e de
apresentar contaminação por fezes humanas e/ou de animais pode ser efetuada
de forma indireta, através dos organismos indicadores de contaminação fecal,
pertencentes principalmente ao grupo de coliformes, cabendo à Escherichia coli
um papel preponderante (Ortega et al. 2009).
Os resultados das análises da primeira coleta realizada no entorno do
Igarapé do Mindú estão dispostos nas Tabelas 3, 4 e 5.
Segundo a Resolução do CONAMA, no 274 de 2000 a quantidade de
coliformes não deve ser excedida em "um limite de 1000 coliformes"
termotolerantes por 100 mL em 80% ou mais de pelo menos seis amostras
coletadas durante o período de um ano, com frequência bimestral.
Para água destinada ao consumo humano, a Portaria nº 1469 do
MINISTÉRIO DA SAÚDE (MS 2000) que define os padrões de potabilidade dos
principais parâmetros de qualidade da água, estabelece que os coliformes totais
e fecais sejam ausentes.
O resultado do ensaio microbiológico mostrou que nos pontos de coleta
1, 2 e 3 no pré-tratamento existem 10.200, 13.700 e 400 UFC/100 mL coliformes
termotolerante. Dessa forma, pode-se afirmar que as águas presentes no ponto
de coleta 03 se encontra em condições de balneabilidades, necessário que seja
feita um método de purificação. No entanto, os 3 pontos de coleta, não estão em

141
condições de potabilidade segundo a Portaria nº 1469 do MINISTÉRIO DA
SAÚDE (MS 2000).

Biotratamento
Após os 10 dias de tratamento do efluente doméstico com fungos
filamentosos da Coleção CBA, foram realizadas análises microbiológicas e
comparados com parâmetros microbiológicos de acordo com a resolução do
CONAMA 357/2005. Os 5 fungos foram capazes de melhorar todos os
parâmetros microbiológicos analisados. (Tabelas 3, 4 e 5).

Tabela 3. Resultado dos Parâmetros microbiológicos avaliados do Ponto 1 antes e após o

biotratamento (Fungos CBA 2601 + CBA 2345)

P1
P1
PARÂMETROS CONAMA Biotratamento
UNID Controle
MICROBIOLÓGICOS N° 357/2005 CBA 2601/
Pré Tratamento
CBA 2345
Coliformes Termololerantes (45°C) UFC/mL 1.000/100mL 10.200 99
Coliformes Totais UFC/mL 800/100mL 3.530 Ausência/100 mL

Tabela 4. Resultado dos Parâmetros microbiológicos avaliados do Ponto 1 antes e após o

biotratamento (Fungos CBA 2255 + CBA 22)

P2
P2
PARÂMETROS CONAMA Biotratamento
UNID Controle
MICROBIOLÓGICOS N° 357/2005 CBA 2255/
Pré Tratamento
CBA 22
Coliformes Termololerantes
UFC/mL 1.000/100mL 13.700 4
(45°C)
Coliformes Totais UFC/mL 800/100mL 1.620 Ausência/100 mL

Tabela 5. Resultado dos Parâmetros microbiológicos avaliados do Ponto 1 antes e após o

biotratamento (Fungos CBA 2236 + CBA 22)

P3
P3
PARÂMETROS CONAMA Biotratamento
UNID Controle
MICROBIOLÓGICOS N° 357/2005 CBA 2236/
Pré Tratamento
CBA 22
Coliformes Termololerantes
UFC/mL 1.000/100mL 400 10,5
(45°C)
Coliformes Totais UFC/mL 800/100mL 1.770 Ausência/100 mL

Conclusão
A contaminação do Igarapé do Mindú é muito preocupante, principalmente
pelo elevado nível de DQO e DBO encontrado, assim como a presença de

142
microrganismos patogênicos que podem comprometer a saúde da população ao
seu entorno.
Os 3 biotratamentos, utilizando os 5 fungos filamentosos depositados na
Coleção CBA, apresentaram potencial para biorremediação de efluentes
domésticos e foram capazes de melhorar os parâmetros microbiológicos da água
de acordo com a resolução do CONAMA 357/2005.
Existem poucos trabalhos na literatura, com a utilização prática de fungos
em processos de biorremediação de águas de igarapés. Portanto, esse estudo
pode contribuir para novos trabalhos, auxiliando no planejamento ambiental de
recursos hídricos.

AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM
e ao Centro de Biotecnologia da Amazônia – CBA.

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145
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Caracterização da população bacteriana presente em

mucilagem produzida por raízes aéreas de sorgo sacarino

Alves, Talles Henrique Pereira1; Silva, Felipe Campos1; Ribeiro, Tamara

Palhares2; Lana, Ubiraci Gomes de Paula3; Parrella, Rafael Algusto da Costa3;
Paiva, Christiane Abreu de Oliveira3

1Universidade Federal de São João Del-Rei, 2Universidade Federal de Viçosa,

3Embrapa Milho e Sorgo.
Email: [email protected]

Resumo
As principais funções das raízes é sustentar e absorver água e nutrientes para
as plantas, além de proporcionar um ambiente dinâmico e de intensa atividade
microbiana pela exsudação de compostos orgânicos. Os microrganismos
presentes nesses exsudatos podem conferir benefícios diretos e indiretos às
plantas, porém, informações sobre a composição e abundância da microbiota
nesses exsudatos são escassas. A análise metagenômica desse material nos
permite estimar a diversidade de microrganismos presentes, sendo mais precisa
para caracterizar a comunidade microbiana do que em técnicas laboratoriais de
isolamento. Em condições específicas, a exsudação presente em raízes aéreas
de alguns cereais, pode formar uma mucilagem que sugere a presença de
bactérias fixadoras de nitrogênio e promotoras de crescimento da planta.
Amostras de mucilagem de raízes aéreas de sorgo sacarino foram coletadas em
triplicata, armazenadas a -80oC e enviadas em gelo seco para análise no BGI
Genomics. As análises incluíram a extração de DNA da população bacteriana, a
amplificação parcial do gene 16S rRNA, montagem de biblioteca de DNA,
sequenciamento em larga escala e análise por bioinformática. Através da análise
metagenômica, as espécies mais encontradas foram Neorhizobium huautlense,
Pseudochrobactrum saccharolythicum, Telmatospirillum siberiense e
Xanthomonas hyacinthi, Mucilaginibacter gossypii, Flavobacterium anhuiense,
Spirosoma oryzae, bactérias da família Chitinophagaceae e do gênero
Luteolibacter. Algumas dessas espécies foram descritas em estudos como
promotoras de crescimento de plantas através de mecanismos direto e indiretos.
O conhecimento da microbiota presente na mucilagem de raízes aérea de sorgo,
através da metagenômica, se mostrou de grande importância cientifica, pois
podem auxiliar na busca por novas cepas de bactérias que promovem o
crescimento de plantas e seus mecanismos de ação, bem como o entendimento
das interações planta-ambiente- microbiota.

Palavras-Chave: Exsudatos, Metagenoma, Microbiota.

Introdução
As raízes das plantas são órgãos heterotróficos que tem como principais

146
funções a sustentação e absorção de água e nutrientes, mas também podem
proporcionar um ambiente dinâmico e de intensa atividade microbiana na
rizosfera (Lavecchia et al. 2015; Hassan et al. 2019). O suporte à atividade
microbiana se dá por meio da exsudação pelas raízes de compostos orgânicos
como aminoácidos, carboidratos, enzimas e ácidos orgânicos. A presença e
composição destes exsudatos diferem de acordo com a espécie da planta,
estágio fenológico, pH e disponibilidade de nutrientes, governando a estrutura
da comunidade microbiana existente, de acordo com as especificidades do
exsudato (Moreira e Siqueira 2002; Costa 2012; Inácio 2020).
A formação de mucilagem exsudada em torno das raízes aéreas de sorgo
sacarino, em plantas que apresentam deficiência de nitrogênio, podem evidenciar
que essa mucilagem ocorre para desenvolver microrganismos capazes de fixar
N para o sorgo, conforme foi demonstrado por Campos et al. (2015) em
experimentos variando doses de nitrogênio e potássio. Corroborando com tal
experimento, estudos realizados por Van Deynze et al. (2018) em raízes aéreas
de variedades de milho crioulo em campos pobres em nitrogênio, mostraram que
29% a 82% do nitrogênio da planta é derivado do nitrogênio atmosférico. Esses
altos níveis poderiam estar sendo suportados, em partes, pela pela produção de
mucilagem exsudada nas raízes aéreas, que formam um microbioma complexo
que abrigam bactérias fixadoras de nitrogênio. Por meio de sequenciamento
metagenômimo da mucilagem exsudada, os autores identificaram linhagens de
bactérias fixadoras de nitrogênio em abundância, confirmando a hipótese e
fomentando explorar as raízes aéreas de outros cereais, como o sorgo, são
capazes de desempenhar função semelhante.
A análise metagenômica é uma importante forma de estudo da
comunidade microbiana de uma amostra, visto que a maioria dos
microrganismos não pode ser facilmente cultivada em laboratório (Dimitrov
2009). Dessa forma, a extração do DNA diretamente da amostra permite acesso
a dados genéticos de organismos não cultiváveis e permite compreender e
estudar a dinâmica das comunidades microbianas. A metagenômica permite
estimar a diversidade microbiana presentes no ambiente sem a
necessariamente realizar etapas de isolamento e cultivo de microrganismos
previamente, sendo mais preciso a caracterização da comunidade presente no
ambiente analisado (Palheta 2017).

147
 O presente estudo teve como objetivo avaliar, através da análise
metagenômica, a microbiota associada a mucilagem exsudada de raízes aéreas
em cultivo de híbridos de sorgo sacarino, provenientes do programa de
melhoramento da Embrapa Milho e Sorgo, visando identificar a presença de
microrganismos relacionados a promoção de crescimento de plantas.

Material e Métodos
Duas amostras com três repetições cada de mucilagem exsudadas por
raízes aéreas de híbridos de sorgo sacarino, B007 e B009 (CMSXS5043), foram
coletadas no florescimento. As amostras foram coletadas em condições de
campo, armazenadas a -80oC e enviadas em gelo seco para análise no BGI
Genomics (https://www.bgi.com/global), incluindo extração de DNA da
população bacteriana, amplificação parcial do gene 16S rRNA, montagem de
biblioteca de DNA, sequenciamento em larga escala e análise por bioinformática.

Resultados e Discussão
Das seis amostras de mucilagem enviadas para análise, cinco amostras
tiveram sucesso na extração de DNA bacteriano. Dessas, apenas a montagem
da biblioteca com a amostra CMSXS5043 rep3 (3A) foi eficiente, sendo assim
autorizada para sequenciamento em larga escala e análise do metagenoma.
Os resultados das análises metagenômicas das amostras nos indicaram
que a mucilagem exsudada pela raiz de sorgo foi preferencialmente colonizada
por bactérias das classes Beta, Alfa e Gamaproteobacteria, respectivamente, que
pertencem ao filo Proteobacteria. Foram identificadas ainda bactérias das
classes Sphingobacteria e Flavobacteria, que pertecem ao filo Bacteroidetes
(Figura 1).

148
Figura 1. Abundância relativa da composição das classes bacterianas presentes na amostra
CMSXS5043 rep3 (3A) da mucilagem de raíz aérea de sorgo sacarino. Classes são classificadas
como "outras" se sua abundância for inferior a 0,5%.

Entre as espécies de bactérias mais abundantes do filo Proteobacteria,

destacam-se Neorhizobium huautlense, Pseudochrobactrum saccharolythicum,
Telmatospirillum siberiense e Xanthomonas hyacinthi. Já no filo Bacteroidetes,
Mucilaginibacter gossypii, Flavobacterium anhuiense, Spirosoma oryzae e
bactérias da família Chitinophagaceae foram as mais abundantes. Além dessas,
foram encontradas ainda bactérias do gênero Luteolibacter pertencentes ao filo
Verrucomicrobia (Figura 2).

Figura 2. Espécies de bactérias superabundantes na amostra CMSXS5043 rep3 (3A) da

mucilagem de raíz aérea de sorgo sacarino.

Algumas espécies caracterizadas nesse trabalho, através da análise

metagenômica, já foram descritas em outros estudos como promotoras de
crescimento de plantas atuando de forma direta e indireta, como é o caso do

149
Neorhizobium huautlense que podem aliviar a toxidez por metais pesados, além
de formar nódulos fixadores de nitrogênio em Sesbania herbácea (Chen et al.
2016; Wang et al. 2000). A espécie Mucilaginibacter gossypii também pode ser
usada como promotora de crescimento, visto que produz fitormônios ou enzimas
que otimizam o crescimento das plantas, permitindo o aumento da absorção de
nutrientes, como constatado por Madhaiyan et al. (2010) em plantas de algodão.
Bactérias da família Chitinophagaceae podem atuar no controle de
fitopatógenos pela produção de enzimas, que degradam a parede celular dos
fungos promovendo a supressão de doenças no solo (Faria et al. 2018), assim
como Flavobacterium anhuiense, espécie produtora de compostos orgânicos
voláteis que apresentaram atividade de biocontrole significativa contra
Phytophthora capsici em plantas de pimenta (Jeong et al. 2019).
Telmatospirillum siberiense, segundo Hausmann (2018), apresentam
genes que revelam um potencial representatividade dessa bactéria na oxidação
do enxofre.
Foi identificado na amostra também bactérias que são agente causal de
doença, como o caso da Xanthomonas hyacinthi, patógeno de plantas
hornamentais (Cohen et al. 2020). Pseudochrobactrum saccharolythicum,
segundo Long (2013), apresenta potencial para ser utilizado como
biorremediação de ambientes contaminados com Cr(VI), especialmente meios
alcalinos e salinos com Cr(VI) em concentrações baixas a médias.
O gênero Luteolibacter, apresenta cepas descritas com atividade
enzimática de β-glucosidase, urease e a fosfatase ácida envolvidas no ciclo do
carbono (C), nitrogênio (N) e do fósforo (P), respectivamente (Park et al. 2013;
Pascual et al. 2017; Kim et al. 2015).
Embora muito abundante na mucilagem, a Spirosoma oryzae não possui
informações referente às funções dessas espécies, no ambiente de cultivo, na
literatura.

Conclusões
Foram encontradas associadas à mucilagem exsudada da raiz de sorgo
sacarino, diferentes espécies de microrganismos que podem contribuir de formas
distintas para a promoção de crescimento de plantas.

150
 A bioprospecção, através da abordagem metagenômica, em mucilagem
de raízes aéreas de sorgo pode ser uma estratégia a ser seguida visando o
isolamento de novas cepas de bactérias promotoras de crescimento vegetal.
Dessa forma, esse estudo pode contribuir com futuros esforços visando
adquirir mais informações sobre a dinâmica interação das raízes aéreas,
ambiente e a microbiota desenvolvida na mucilagem.

Referências
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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Diversidade de fungos filamentosos no Campus da

Universidade Federal do Amazonas, (UFAM) Manaus, Brasil

Fernandes, Kamila Rangel Primo1; Almeida, Maria de Fátima Oliveira1; Alves,

Thalita Caroline Lima1; Bieler, Phillipe Defáveri1; Couceiro, Douglas de Moraes1;
Souza, Antonia Queiroz Lima de1; Souza, Afonso Duarte Leão de1

1Universidade Federal do Amazonas

E-mail: [email protected]; [email protected]

Resumo
A floresta do Campus da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) é
caracterizada por diferentes ecossistemas, rica na sua fauna, flora e funga. É um
patrimônio genético e científico, pouco explorada, principalmente com relação
aos microrganismos. Com destaque aos fungos, fontes de metabólitos primários
e secundários, com propriedades bioativas e mais de 20.000 substâncias
descritas. Este trabalho teve como objetivo, contribuir com o conhecimento da
diversidade dos fungos filamentosos, isolados de diferentes habitats do Campus
da UFAM, Manaus-AM. A coleta foi realizada no setor Norte e as amostras de
tecidos vegetais, frutos, solo de formigueiro, água e formigas foram submetidas
as técnicas de isolamento, purificação e preservação. Na identificação das
linhagens, foram utilizados aspectos macro e micromorfológicos, cujas imagens
obtidas foram comparadas com as literaturas especializadas. As linhagens
isoladas foram preservadas em três formas distintas para compor o banco de
isolados do Laboratório de Bioensaios e Microrganismos da Amazônia
(LaBMicrA/UFAM). Foram preservadas 195 linhagens de fungos, 42% destes
isolados em meio BDA, 26% em meio AVEIA, 23% em ISP2 e 8,7% em SB. Entre
os 195 isolados, 45% foram originados de tecidos vegetais, 19% de formigas,
18% de frutos, 12% de solo de formigueiro e 6% de água. A partir das técnicas
clássicas de identificação, foram caracterizadas 65 linhagens por gênero,
separadas em 16 grupos - Colletotrichum (29 linhagens), Penicillium (12), Xylaria
(8), Aspergillus e Trichoderma (5), Curvularia (2), Phomopsis e Pestalotiopsis (1),
além de 8 grupos não identificados. Utilizando o método de Shannon-Wiener foi
observado um alto índice de diversidade fúngica em tecidos vegetais, revelando
a sua biodiversidade através da alta frequência de isolados em diferentes
habitats e gêneros identificados.

Palavras-chave: Biodiversidade, Campus, Microbiologia.

Introdução
A diversidade fúngica é um dos pontos de destaque na ciência, com
número de gêneros e espécies supracitado apenas pelos Artrópodes. Ao longo
dos anos, a evidente ascensão de novas espécies identificadas e catalogadas,

154
acarretou no desmembramento e realocação de gêneros e mudanças de
nomenclaturas (Wijayawrdene et al. 2021).
Além de numerosos, destacam-se pelas diferenças macro e
micromorfológicas, produção de metabólitos primários e secundários e o alto
potencial biotecnológico. Estas características têm atraído olhares de
pesquisadores por todo o mundo e com grande aprofundamento científico
(Kesewani et al. 2013; Krédics et al. 2014).
Hawksworth (1991; 2001), estimou que o reino Fungi tinha
aproximadamente 1,5 milhão de espécies, habitando todos os ecossistemas da
terra, enquanto Arnold et al. (2000) estimaram 8,25 milhões de espécies
fúngicas. Recentemente, a estimativa mais aceitável está entre 2,2 a 3,8 milhões
de espécies (Hawksworth et al. 2017). De acordo com Antonelli et al. (2020), o
número de espécies já descritas é de aproximadamente 148 mil, ou seja, uma
quantidade relativamente muito pequena de fungos descritos e estudados,
independente das alternativas apresentadas e mais acertada (Devkota et al.
2023).
Ao associar os fungos à biodiversidade da floresta Amazônica, têm-se
muito a descobrir. Situada em região tropical, destaca-se por ser a maior do
planeta, possuindo diversidades de biomas e grande número de animais, plantas
e microrganimos (Accioly et al. 2018; Da Silva et al. 2018). Calderon et al. (2009)
apontam que a floresta Amazônica possui alta biodiversidade, devido a fatores
como clima e peculiaridades de solo, convergindo para uma riqueza de espécies
nunca isoladas e/ou estudadas.
Diante ao exposto, o presente estudo objetivou conhecer a diversidade de
fungos no Campus da Universidade Federal do Amazonas (UFAM/Manaus),
utilizando as técnicas clássicas de isolamento para possível identificação de
gêneros, a fim de detectar a frequência dos isolados, para formar agrupamentos
mediante as características encontradas e promover conservação e depósito dos
indivíduos na coleção de trabalho do Laboratório de Microrganismos da
Amazônia (LaBMicrA/UFAM).

155
 Material e Métodos
Coleta
Com a finalidade de promover o isolamento dos fungos, as coletas foram
realizadas em maio de 2022 no Campus da Universidade Federal do Amazonas
(UFAM), localizada em Manaus, Amazonas. Cinco pontos de coleta e seus
respectivos habitats foram mapeados: aquífero (03º'05'48.05"S, 59°57'16.74"W),
solo de formigueiro (03°05'17.02"S, 59°57'53.05"W), formigas (03°05'19.23"S,
59°57'59.19"W), frutos (03°05'24.51"S, 59°57'48.17"W) e tecido vegetal
(03°05'18.41"S, 59°57'55.83"W).

Obtenção dos isolados em tecidos vegetais, frutos e formigas

As folhas com verruga (espécie desconhecida), caule, inflorescência e
folha de Vismia guianenses (Aubl.) Choisy, folhas e frutos de Abuta grandifolia
(Mart.) Sandwith, juntamente com frutos de Pantonia insignis Mart., Eugenia
stipitata McVaugh e Spondias mombin L. e formigas, como Iridomyrmex
purpureus (Smith 1858) e Atta laevigata (Smith 1858), foram submetidas à
assepsia para eliminar os microrganismos epifíticos. Para isso, foram
previamente lavadas com água corrente e detergente neutro; a posteriori foram
submetidas a uma sequência de tratamentos com: (i) álcool a 70% por 1 min, (ii)
hipoclorito de sódio a 3% por 2 min para a folha, 4 min para o caule, frutos e
formigas, (iii) álcool a 70% por 30 s e (iv) água destilada autoclavada por 2 min.
Para todas as amostras, da última etapa de lavagem foi retirada uma alíquota de
50 μL para controle da esterilização (Araújo et al. 2002). Após o protocolo de
esterilização superficial, as amostras foram cortadas em quatro fragmentos
(entre 2 mm e 4 mm) de cada amostra (vegetais, frutos e formigas) e inoculados
em forma de matriz (2 × 2) em placas de Petri (9 mm × 15 mm), contendo meio
Ágar Batata Dextrose (BDA), meio Amido (ISP-2): Ágar, Amido, Dextrose,
Extrato de Malte e Levedura, meio Aveia (AVEIA): Dextrose, aveia em pó, extrato
de Malte e Levedura e por fim meio Ágar Sabouraud (SB): Ágar, Dextrose,
Peptona, esterilizados com adição de amoxicilina e terramicina 50 µg mL-1. As
placas com os inóculos foram mantidas em três temperaturas (18 °C: 9 dias; 26
°C: 7 dias; 40 °C: 7 dias) por um período de três semanas consecutivas (Souza
et al. 2004).

156
Obtenção dos isolados em solo de formigueiro de Atta laevigata e aquífero
(água de igarapé)
Para obtenção das colônias fúngicas foi realizada a técnica de suspensão
seriada (Clarck1995), com modificações: 25 g de amostra de solo de formigueiro
foram homogeneizadas em 225 mL de água destilada esterilizada. Ao final, 30

µL das diluições (10-2, 10-3 e 10-4) foram plaqueadas e espalhadas com auxílio
da alça de Drigalski em placas de Petri contendo meio BDA, ISP-2, AVEIA e SB,
esterilizados e acrescidos de amoxicilina e terramicina, 50 µg mL-1 e incubados
a 28 °C (±1 °C), durante 5 a 7 dias (Silva et al. 2011). Para as amostras de água
foram inoculadas 30, 40 e 50 mL da amostra diretamente em placas de Petri com
os mesmos meios citados anteriormente. A técnica de repique foi utilizada para
a purificação dos fungos de reprodução sexuada, e para os fungos assexuados,
foram utilizadas suspensões de conídios diluídos em água destilada esterilizada
(Araújo et al. 2002).

Caracterização dos fungos isolados

As análises das características morfológicas dos fungos, como textura,
pigmento difuso, cor da superfície e reverso da placa foram avaliadas de acordo
os dias de cultivo (entre 7 a 15 dias de acordo com o gênero). As análises das
microestruturas foram realizadas através da técnica de microcultivo (com
crescimento entre 72 h a 96 h, de acordo com o gênero) (Soares et al. 1987;
Souza et al. 2004). Através destes resultados, foi possível organizar os isolados
em grupos de similaridades morfológicas e indicar possíveis gêneros (Tabela 1).

Índice de diversidade
A diversidade total e de transectos foi estimada usando o índice de
Shannon-Wiener, considerando as abundâncias relativas de indivíduos por
espécie (Magurran 2004), utilizando o software PAST versão 4.0.

Resultados e Discussão
Isolados versus meio de cultivo
A predominância de crescimento das linhagens em meio BDA foi evidente.
Dentre os 195 isolados, 82 fungos (42% cresceram neste meio. O meio AVEIA,

157
ficou em segundo lugar, totalizando 51 indivíduos (26%) crescidos dos
microrganismos aferidos. Para o meio ISP-2, 45 isolados (23%) foram
contabilizados e para o meio Sabouraud apenas 17 isolados fúngicos (9%) foram
detectados (Figura 1). Esses resultados, indicam a adaptação dos isolados ao
meio de cultura BDA, um meio normalmente utilizado e que, aparentemente,
possui os micronutrientes necessários para o crescimento de fungos de diversas
origens.

Figura 1. Porcentagem de crescimento de fungos nos meios de cultura utilizados.

Isolados versus origem

A maioria das linhagens foi coletada de tecidos vegetais como linhagens
endofíticas, 45% dos isolados (88 indivíduos) (Figura 2). Por outro lado, foram
expressivas as quantidades de isolados de formiga (19%) e frutos (18%),
enquanto que as amostras de solo formigueiro e água apresentaram os menores
índices de crescimento. Este resultado está diretamente relacionado com a
relação simbiótica entre fungos e plantas, que os torna altamente difundidos e
numerosos nos tecidos vegetais (Guimarães 2006). Os fungos mais adaptados a
determinada planta podem estar sendo transmitidos por transferência vertical,
através da semente, ou por transferência horizontal, onde as colônias fúngicas
são passadas de planta para planta. Após longo período de coevolução, é
possível que condições se tornaram favoráveis à permanência ou crescimento
do fungo em tecidos específicos, o que pode justificar o maior número de
isolados dos tecidos vegetais que das outras amostras coletadas.
Por sua vez, a diversidade fúngica em formigas pode ser explicada pela
relação de mutualismo que estas desenvolveram com os fungos, cultivando-os
no interior de seus ninhos, e os carregando no interior de seus corpos,

158
promovendo a disseminação e difusão deles para reprodução (Defossez et al.
2009).

Agrupamento dos isolados

Ao total, 65 isolados foram classificados em 8 gêneros (Tabela 1) e 8
grupos cujos gêneros ainda não foram determinados, formando 16 grupos de
acordo com as suas características macro e micromorfológias, que podem
corresponder a 16 ou mais gêneros.

Figura 2. Porcentagem de crescimento de fungos nas matrizes do Campus UFAM.

Foram observadas diferenças morfológicas entre os isolados, indicando

variação fenotípica entre os grupos e mesmo entre as linhagens de um mesmo
grupo. Tais variações foram reveladas principalmente no padrão de esporulação
conidial dos isolados, como cor, densidade, distribuição (número de anéis ou
pústulas conidiogênicas) e forma dos conídios (Figura 3). Com base nestes
resultados, pode-se inferir que há diversidade de fungos no Campus da UFAM,
considerando o número de gêneros descritos. Outros trabalhos do grupo de
pesquisa também resultaram em um quadro semelhante, principalmente para
fungos endofíticos.

Tabela 1. Agrupamento do gênero filamentosos isolados e suas respectivas caracteristicas.

Total Aspectos Aspectos
Grupos Gênero
isolados macromorfológicos micromorfológicos
Coloração variando do
G1 Xylaria 9 brancos ao preto com Em análise
crescimento micelial vertical.
Coloração diversa, com Conídios cilíndricos com
G2 Colletrotrichum 30 predominância na formação ápice pontiagudo, fusiformes
de pústulas amareladas, e oblongos.

159
 cotonosas

Coloração creme, formação Conídios fusiformes, com

de pústulas circulares pretas célula basal, apresentando
G3 Pestalotiopsis 1
e micélio rasteiro. apêndice espatular e células
medianas curtas e marrons.
Coloração esverdeada em Conídios elipsóides, ovais e
G4 Trichoderma 5 formação zonada com subglobulares, na cor verde
aspecto cotonoso. escura.
Coloração predominânte no Conídios ovais e
G5 Aspergillus 5 esverdeado ou bicolor (verde subglobulares em formação
e branca), micélio rasteiro. de cachos.
Coloração creme e cinza,
G6 Fusarium 1 micélio aderido ao meio, Em análise
comformação de ascos.
Coloração esverdeada com Conídios fusiformes com
G7 Penicillium 12 micélio aderido ao meio e formação de cachos.
esporulento.
Coloração preta, micélio Conídios fusiformes, com
radial e aderido ao meio. apêndice espatular, células
G8 Curvularia 2
medianas marrom-claros a
dourados

Figura 3. Colônias representativas de seus grupos morfológico. G1: Xylaria; G2:

Colletrotrichum; G3: Pestalotiopsis; G4: Trichoderma; G5: Aspergillus; G6: Fusarium; G7:
Penicillium; e G8: Curvularia.

Na Figura 4, observa-se que Colletotrichum e Penicillium são os gêneros

mais diversos e numerosos frente as suas origens (frutos e formiga). Estes
gêneros são abundantes na natureza, de acordo com vários relatos. Assim,
Manamgoda et al. (2013) relataram que espécies de Colletotrichum podem ser
encontradas como endófitos em quase todos os grupos de angiospermas. Por
outro lado, Penicillium, constituído por mais de 300 espécies (Visagie et al.
2014), é um dos maiores e mais fascinantes grupos de fungos, retratado como
colonizador de seus nichos ecológicos e protetor de suas plantas hospedeiras
contra múltiplos estresses, exibindo diversas funções biológicas (Toghueo et al.
2020).

160
Figura 4. Diversidade de gêneros isolados por origens.

Índice de diversidade
Entre os diversos habitats amostrados, o índice de Shannon-Wiener
revelou maior diversidade em tecidos vegetais com valor acima de 3,0 (Figura
5). Essa diversidade é mais expressiva pela quantidade de indivíduos, com 1,30
no índice de Shannon H', o maior entre todas as origens estudadas, com a alta
distribuição de gêneros e possivelmente de espécies. O menor índice de
diversidade no transecto foi encontrado no habitat água, com valores de Shannon
H' iguais 0,63 revelando a menor quantidade de indivíduos isolados, e menor
distribuição de gêneros frequentes.

Figura 5. Índice de diversidade de Shannon-Wiener.

Conclusões

161
 O isolamento de fungos filamentosos e sua caracterização se mostrou
promissora, em decorrência do grande número amostral de matrizes, indivíduos
isolados e grupos de gêneros obtidos e parcialmente identificados. A macro e a
micromorfologia foi útil para diferenciação em grupos, oito dos quais foram
classificados em seus respectivos gêneros. Os resultados revelaram a
necessidade de associar como forma de complemento, dados de outras técnicas
(moleculares), juntamente aos dados existentes. Ao final, os resultados
apontaram um alto índice de diversidade fúngica na amostragem feita de
diferentes habitats da floresta do Campus da UFAM, com maior incidência de
fungos endofíticos.

Agradecimentos
Ao Centro de Apoio Multidisciplinar da Universidade Federal do Amazonas
(CAM/UFAM) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas
(FAPEAM), pelo financiamento e concessão das bolsas.

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Diversidade de macrofungos do gênero Fulvifomes Murrill

(Hymenochaetaceae, Basidiomycota) na região amazônica

Marques-Laborda, Juan Phillipe1; Peres, Rafaela Saraiva2; Jesus, Maria

Aparecida1

1Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, 2Universidade Estadual de Feira de

Santanta
E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
O gênero Fulvifomes (Hymenochaetales, Agaricomycetes, Basidiomycota)
descrito por Murrill, em 1914, está agrupado a família Hymenochaetaceae
(Donk) com 26 espécies de distribuição cosmopolita com predomínio em regiões
tropicais, subtropicais e temperadas. O presente trabalho objetivou ampliar o
conhecimento da biodiversidade fúngica na região amazônica sobre
macrofungos do gênero Fulvifomes por meio de identificação taxonômica. Os
espécimes analisados estão depositados no acervo de referência do Laboratório
de Patologia da Madeira na Coleção de fungos Lignocelulolíticos do Instituto
Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) e são provenientes de reservas
naturais dos estados do Amazonas, Pará e Roraima. Para a identificação dos
fungos foram utilizadas técnicas de taxonomia clássica para fungos poróides e
chaves dicotômicas específicas descritas em literaturas e em sites para
identificação a nível taxonômico mais completo. Foram identificados 14
espécimes de Fulvifomes. O estado do Pará apresentou maior
representatividade com nove espécimes descritos e tronco em decomposição foi
o substrato com maior preferência dos macrofungos. Fulvifomes glaucescens e
F. melleoporus são primeiros registros no estado do Amazonas, F. durissimus
no Pará e F. umbrinellus para Roraima.

Palavras-chave: Agaricomycetes, Amazônia,Taxonomia.

Introdução
O gênero Fulvifomes (Hymenochaetales, Agaricomycetes,
Basidiomycota), descrito por Murrill, em 1914, é tipificado pela espécie F.
robiniae (Murrill) Murrill agrupado à família Hymenochaetaceae. Caracteriza-se
por diferenciar dos demais gêneros da família, principalmente, pela combinação
do basidiocarpo anual, perene e efuso-reflexo, séssil para subestipitado, sistema
hifal monomítico a dimítico, ausência de seta. O basidiósporo é subgloboso de
coloração amarelada ou marrom, de parede fina e amplamente espessa (Wagner
e Fischer 2022; Dai 2010).

165
 Fulvifomes Murril é considerado sinônimo de Phellinus Quél. por vários
micologistas. Contudo, Wagner e Fischer (2002), com base em sequências de
gene rRNA de subunidade grande codificadas nuclearmente (nLSU),
segregaram Fulvifomes como um gênero em Hymenochaetaceae (Ji et al. 2017).
Com exceção do continente antártico, os macrofungos do gênero
Fulvifomes ocorrem em todos os continentes, predominantemente em regiões
tropicais, subtropicais e temperadas (GBIF 2022). No Brasil, são relatados em
todas as regiões: Norte (Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins),
Nordeste (Alagoas, Bahia, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte e
Sergipe), Centro-Oeste (Mato Grosso e Mato Grosso do Sul), Sudeste (São
Paulo) e Sul (Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina), com principais
domínios fitogeográfico a Amazônia, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica e o
Pantanal (Flora e Funga do Brasil 2022).
A nível mundial, os macrofungos pertencentes à família
Hymenochaetaceae são utilizados a bastante tempo através de costumes
milenares de povos asiáticos (Dai 2010). Contudo, o conhecimento dos
potenciais medicinais e biotecnológicos especificamente dos macrofungos
pertencentes ao gênero Fulvifomes no Brasil e no mundo é escasso.
Tendo em vista da importância taxonômica, econômica e ecológica
desses fungos, o presente trabalho tem como objetivo ampliar o conhecimento
da biodiversidade de espécies do gênero Fulvifomes na Amazônia através da
identificação taxonômica de espécimes provenientes de três estados da
Amazônia brasileira.

Material e Métodos
Os espécimes estudados estão depositados na Coleção de Fungos
Lignocelulolíticos (COTEI/INPA) do Laboratório de Patologia da Madeira do
Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA). Os macrofungos são
provenientes de diferentes áreas da região Amazônica, como Área Urbana da
cidade de Manaus (AUM) e Município de Presidente Figueiredo (PF), localizados
no estado do Amazonas; na Fazenda Cauaxi (FC) em Paragominas no estado
do Pará; na Estação Ecológica de Maracá (EEM) e no Parque Nacional do Viruá
(PNV) em Roraima. O material analisado foi coletado de diferentes substratos
lignocelulolíticos, como tronco caído em decomposição, árvores vivas e mortas.

166
 Nas análises macromorfológicas foram observadas as características do
himenóforo, da superfície do píleo, número de poros por milímetro, consistência
e aspecto do basidioma conformes recomendações de Fidalgo (1968), Ryvarden
(1991) e Teixeira (1962; 1995). E nas análises micromorfológicas, foram usados
corantes para verificar as reações bioquímicas como: reação xantocróica
(coloração marrom acastanhada) das hifas e/ou dos basidiósporos a partir da
solução aquosa de KOH (Hidróxido de Potássio a 3%), reação dextrinoide
(coloração marrom avermelhada) dos basidiósporo e/ou hifas com o reagente
Melzer ou reação amiloide (azul acinzentado) a partir do reagente azul de
algodão quando necessário para confirmar reação cianófila (Teixeira 1995; Reck
2009). Posteriormente, com o auxílio de um microscópio óptico modelo Leica
DM500 com ocular micrométrica e com captação de imagem, foi realizada a
mensuração e caracterização das estruturas taxonômicas, como sistema hifal
(monomítico ou dímítico), presença ou ausência de estruturas estéreis (seta, hifa
setal, cistídio, cistídiolo), conforme a metodologia proposta por Teixeira (1995).
Na identificação das espécies foram utilizadas descrições taxonômicas feitas por
Dai (2010), Ryvarden e Johansen (1980), Ryvarden (1991; 2004), assim como
as descrições disponíveis no site mycobank.com para confirmação das espécies
e o site indexfungorum.org para abreviação de autores e nomes científicos dos
fungos para compará-las com a identificação do material estudado com o intuito
de confirmar a espécie em questão. Por fim, foram utilizados os bancos de dados
Flora do Brasil, GBIF e specieslink.net, junto aos estudos de riquezas de
espécies desenvolvidos na Amazônia brasileira por Soares et al. (2014),
Medeiros et al. (2015), Gomes-Silva (2013) e Soares (2017) para verificar a
distribuição dos macrofungos.

Resultados e Discussão
Os espécimes estudados (14) estão distribuídos nas espécies Fulvifomes
durissimus (Lloyd) Bondartseva e S. Herrera (5), F. fastuosus (Lév.) Bondartseva
e S. Herrera (3), F. glaucescens (Petch) Y.C. Dai (1), F. melleoporus (Murrill)
Baltazar e Gibertoni (2), F. rimosus (Berk.) Fiasson e Niemelä (1), F. umbrinellus
(Bres.) Y.C. Dai (1), Fulvifomes sp. (1) (Tabela 1). Quanto a preferência dos
macrofungos pelo substrato, oito espécimes foram coletados em tronco em
decomposição (Tabela 1), evidenciando a natureza saprófita e decompositora

167
dos fungos que utilizam a matéria orgânica morta de vegetais como fonte
nutricional.
Com relação à distribuição, oito espécimes são oriundos do estado do
Pará, três de Roraima e três do Amazonas. O estado do Pará é mais
representativo em espécimes, possivelmente, o esforço amostral pode ter
favorecido maior amostragem (Tabela 1).
Fulvifomes glaucescens e F. melleoporus são relatados como primeiros
registros para o estado do Amazonas, assim como F. durissimus e F. umbrinellus
novas ocorrências para os estados do Pará e Roraima, respectivamente.

Tabela 1. Relação dos macrofungos do gênero Fulvifomes listados quanto ao local e

substrato de coleta. Reservas: AUM - Área Urbana de Manaus/AM; PF – Município de
Presidente Figueiredo/AM; FC – Fazenda Cauaxi; EEM – Estação Ecológica de Maracá; PNV
– Parque Nacional do Viruá. Substratos: TD – Tronco caído em decomposição; AM – Árvore
morta; AV – Árvore viva.
Reserva
AM PA RR
Nº de
Táxon AUM PF FC EEM PNV
Espécimes
Substrato
AM AV TD TD AV TD AM AM
Fulvifomes
- - - 4 1 - - - 5
durissimus*

F. fastuosus - - 2 1 - - - 3

F. glaucescens* - 1 - - - - - - 1

F. melleoporus* - - 1 - - - - 1 2

F. rimosus - - - - - - 1 - 1

F. umbrinellus* - - - - - 1 - - 1

Fulvifomes sp. 1 - - - - - - - 1
Total 1 1 1 7 2 1 1 1 14
*Novos registros

168
Figura 1 – A. Basidioma de Fulvifomes durissimus; B. Basidioma de F. fastuosus; C.
Basidioma de F. glaucescens; D. Basidioma de Fulvifomes sp.; E. Basidiósporo de
Fulvifomes sp.; F. Basidioma de F. melleoporus; G. Basidiósporo de F. melleoporus; H.
Basidioma de F. rimosus; I. Basidiósporo de F. rimosus; J. Basidioma de F. umbrinellus; K.
Basidióposro de F. umbrinellus. Barra de escala: A = 1 cm; B = 1 cm; C = 2 cm; D = 2 cm; E
= 10 µm; F = 1 cm; G = 5 µm; H = 2 cm; I = 5 µm; J = 1 cm; K = 5 µm. Fotos: autores.

169
Taxonomia
Fulvifomes durissimus (Lloyd) Bondartseva e S. Herrera, Mikol. Fitopatol. 26
(1): 13, 1992.
≡ Fomes durissimus Lloyd, Mycol. Writings 6(62): 943, 1920;

≡ Phellinus durissimus (Lloyd) A. Roy, Mycologia 71 (5): 1006 (1979).

Descrição: Campos-Santana et al. 2015.

Distribuição no Brasil: Norte (Amazonas) e Sul (Rio Grande do Sul) como
Phellinus durissimus (SpeciesLink 2022).
Material examinado: Brasil, Pará, Paragominas, Fazenda Cauaxi. Eleutério, A.
8 de janeiro de 2009 (LPM 4944); Eleutério, A. 19 de Maio de 2008 (LPM 5092);
Eleutério, A. 31 de agosto de 2008 (LPM 4941); Eleutério, A. 19 de Maio de 2009
(LPM 5118); Eleutério, A. 19 de Maio de 2009 (LPM 5091).
Basidioma: perene, aplanado, concentricamente zonado com zonas quase
formando camadas, solitário, com consistência de madeira, píleo mais ou menos
circular para infundibuliforme com margem aguda. Poro: 6-7 p/mm. Contexto:
homogêneo. Sistema hifal: dimítico, hifa generativa simples septada hialina a
amarelo pálido de parede fina a levemente espessa, normalmente ramificadas,
hifa esquelética dominante, marrom-ferrugem de parede espessa e lúmen
distinto, 5-8 μm de diâmetro. Seta himenial: ausente. Basidiósporo:
subgloboso, quase sempre colapsado, amarelado a amarronzada, de parede
espessa, não dextrinoide, 4-5 μm x 3-4 μm.
Comentário: Os espécimes analisados apresentam poros menores que os
descritos por Campos-Santana et al. (2015) em espécime do sul do Brasil,
que apresentam de 7 a 10 poros mm-1, porém semelhantes com os do material
descrito por Dai (2010) que apresentam de 6 a 7 poros p/mm. Os espécimes
analisados de F. duríssimos apresentam basidiósporos quase sempre
colapsados, sendo negativo para reação dextrinoide, característica também
observada por Dai (2010) em espécimes da Ásia.

Fulvifomes fastuosus (Lév.) Bondartseva e S. Herrera, Mikol. Fitopatol. 26(1):

13, 1992.
≡ Polyporus fastuosus Lév., A9nn. Sci. Nat., Bot. 2: 190, 1844;
≡ Fomes fastuosus (Lév.) Cooke, Grevillea 14(no. 69): 18 (1885);

170
≡ Phellinus fastuosus var. bullatosulcatus Corner, Beih. Nova Hedwigia 101: 85
(1991).
Descrição: Gomes-Silva (2013) e Ryvarden (2004).
Distribuição no Brasil: Norte (Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima),
Nordeste (Alagoas, Bahia, Maranhão, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do
Norte), Centro-Oeste (Mato Grosso), Sul (Paraná, Rio Grande do Sul, Santa
Catarina) como Phellinus fastuosus (Flora do Brasil 2022).
Material examinado: Brasil, Pará, Paragominas, Fazenda Cauaxi.
Eleutério, A. 17 de Maio de 2009 (LPM 5088), 20 de janeiro de 2009 (LPM 4943),
20 de janeiro de 2009 (LPM 4948).
Basidioma: anual a perene, aplanado a séssil, quando jovem a superfície
do píleo é zonada e tomentosa, ficando rimosa e craqueada com a idade.
Sistema hifal: dimítico, hifas enegrecidas em KOH. Contexto: duplex, presença
da linha negra, Seta himenial: ausente. Basidiósporo: amarelado, subgloboso,
4.5-5.0 μm x 4.0-5.0 μm.
Comentário: No espécime observou-se a presença de linha preta no
contexto, característica marcante descrita por Dai (2010), na espécie.

Fulvifomes glaucescens (Petch) Y.C. Dai, Fungal Diversity 45: 192 (2010).
≡ Phellinus glaucescens (Petch) Ryvarden, Norw. J. Bot. 19: 234 (1972).
Descrição: Dai (2010).
Distribuição no Brasil: Norte (Roraima), Sudeste (São Paulo) e Sul
(Santa Catarina) (SpeciesLink 2022).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus, Área urbana: Rua
Sumaúma. Jesus, M. A. 03 de Março de 2014 (LPM 8645).
Basidioma: anual, ressupinado. Superfície poróide: marrom
acinzentada a marrom amarelo escuro. Poro: circular a angular, 8-9 p/mm.
Contexto: marrom escuro. Sistema hifal: dimítico, hifa generativa infrequente,
de parede fina a espessa, hifa esquelética frequente, de parede espessa,
marrom escuro, com lúmen estreito. Seta himenial: ventricosa, 16-22 μm x 5-8
μm. Basidiósporo: elipsoide, amarelo pálido, cianófilo, levemente amarronzado
em KOH, 4.0-4.5 μm x 3.5-4.0 μm.
Comentário: Fulvifomes glaucescens caracteriza-se principalmente por
apresentar poros pequenos e amarelados, basidiósporo elipsóide para

171
subgloboso, pequenos, (3.2-)3.6-4(-4.5) μm x (2,7-)2.8-3,4(-3,5) μm (Dai, 2010).
Os basidiósporos analisados são maiores (4.0-4.5 μm x 3.5-4.0 μm).

Fulvifomes melleoporus (Murrill) Baltazar e Gibertoni, Mycotaxon 111: 205

(2010).
≡ Fomitiporella coruscans (Bres.) Salvador-Montoya e Popoff;
≡ Fomitiporella melleopora Murrill, 1907;
≡ Phellinus melleoporus (Murrill) Ryvarden, 1985.
Descrição: Ryvarden (2004).
Distribuição no Brasil: Norte (Amapá, Pará, Roraima), Nordeste
(Alagoas, Bahia, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte), Centro-Oeste
(Mato Grosso do Sul), Sudeste (São Paulo), Sul (Rio Grande do Sul, Santa
Catarina) (Gomes-Silva 2013; Soares 2017; Flora do Brasil 2022; SpeciesLink
2022).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Presidente Figueiredo,
Cachoeira das Orquídeas. Silva, M. A.; Day, Y. C.; Couceiro, D. M. 12 de Maio
de 2017 (LPM 11.911).
Basidioma: ressupinado, rígido e amplamente aderido ao substrato,
castanho-escuro com bordas claras, presença de uma linha escura entre o
contexto e o substrato. Poro: circular, 7-9 p/mm. Tubo: 3-4 mm. Sistema hifal:
dimítico, hifa generativa hialina a amarelo pálido, hifa esqueléticas de parede
espessada e lisa. Seta himenial: não observada. Cistídiolo: não observado.
Cristal: losangular presentes na trama, no contexto e no himênio, 12-13 μm x 5-
7 μm. Basidiósporo: globoso a subgloboso, amarelo pálido a hialino cianófilo,
alguns apresentando uma ou duas gotículas, 4-5 μm x 3-4 μm.
Comentário: O espécime analisado apresenta basidioma ungulado,
pileado, perene, solitário, concentricamente zonado com zonas largas, margem
obtusa mais clara e poros circulares com 4 a 5 poros p/mm, características
semelhantes às descritas por Dai (2010).

Fulvifomes rimosus (Berk.) Fiasson e Niemelä 1984.

≡ Phellinus rimosus (Berk.) Pilát, Annls mycol. 38: 80 (1940).
Descrição: Dai (2010).

172
 Distribuição no Brasil: Norte (Amapá, Amazonas, Pará, Roraima),
Nordeste (Bahia, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte), Sudeste
(Espírito Santo, São Paulo), Sul (Rio Grande do Sul) (Soares et. al. 2014;
Gomes-Silva 2013; Flora do Brasil 2022; Specieslink 2022).
Material examinado: Brasil, Roraima, Amajari, Estação Ecológica de
Maracá. Jesus, M. A. 29 de Setembro de 2008 (LPM 4152).
Basidioma: pileado, perene, solitário, com borda obtusa de aspecto
lenhoso e leve. Superfície do píleo sulcada concentricamente com zonas
marrom-escuras a preta, coriáceo. Superfície poróide: glabra, marrom
castanho. Poro: circular a angular, 4-5 p/mm. Tubo: concolor com a superfície
poróide, 6-7 mm de profundidade, com estratificação bem definida. Contexto:
homogêneo, cor castanho. Sistema hifal: dimítico com hifas esqueléticas
amarelo pálido com poucos septos simples de parede espessa com lúmen bem
distinguível, hifas generativas hialinas. Seta himenial: não observada. Cristal:
romboidal. Basídia: não observada. Cistídiolo: não observado. Basidiósporo:
globoso a subgloboso, amarelo claro a hialino, não dextrinoide, (4-) 4.5-5.0 μm x
4.0-5.0 μm.
Comentário: O espécime analisado apresenta basidioma ungulado,
pileado, perene, solitário, concentricamente zonado com zonas largas, margem
obtusa mais clara e poros circulares com 4 a 5 poros p/mm-1, características
semelhantes às descritas por Dai (2010).

Fulvifomes umbrinellus (Bres.) Y.C. Dai, Fungal Diversity 45: 203 (2010).
≡ Phellinus umbrinellus (Bres.) S. Herrera e Bondartseva.
Descrição: Dai (2010).
Distribuição no Brasil: Norte (Amapá, Pará), Nordeste (Alagoas, Bahia,
Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Sergipe), Centro-Oeste (Mato
Grosso), Sudeste (São Paulo), Sul (Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina)
(Gomes-Silva 2013; Flora do Brasil 2022; SpeciesLink 2022).
Material examinado: Brasil, Roraima, Estação Ecológica de Macacá.
Jesus, M. A. 24 de Setembro de 2008 (LPM 7104).
Basidioma: perene, ressupinado, rígido, marrom-acinzentado com
bordas mais claras e amadeirado quando seco. Superfície poróide: amarelada
a marrom avermelhado. Poro: inclinado, angular a sinuosos, 7-8 (9) p/mm.

173
Tubo: inclinado, castanho-escuro a amarelo, 6-9 mm. Sistema hifal: dimítico,
hifas generativas septadas simples, hifa esquelética dominante, douradas a
ferruginosa, de paredes espessas com um lúmen evidenciado, não ramificada e
septada. Seta himenial: não observada. Cristal: losangular a irregular
presentes na trama e no himênio. Basidiósporo: globoso a subgloboso, amarelo
em KOH e IKI de parede espessada e lisa, 4-5 μm x 3-4 µm.
Comentário: As características macromorfológicas e micromorfológicas
descritas para este espécime diferem das relatadas nas literaturas analisadas.
Análises moleculares futuras poderão contribuir para esclarecer as divergências
taxonômicas.

Fulvifomes sp.
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus, área urbana. Jesus, M.
A. 02 de junho de 2015 (LPM 10.939).
Basidioma: ressupinado, anual, glabro com aspecto rígido, castanho-
claro, contexto homogêneo e fino. Poro: inclinado, angular, 4-5 p/mm. Sistema
hifal: monomítico, hifas esqueléticas, septadas simples, marrom-dourado. Seta
himenial: não observada. Basídia: pequena e desgastada. Cistídio: não
observado. Cistídiolo: não observado. Cristal: losangular presente sobre a
superfície himenial. Basidiósporo: subgloboso a ovoide, dourado a hialino com
parede espessa e superfície lisa, 5.0-5.5 μm x 3.0-4.0 µm.
Comentário: As características macromorfológicas e micromorfológicas
observadas no material diferem das relatadas nas literaturas analisadas.
Análises moleculares futuras poderão contribuir para a identificação da espécie.

Conclusões
Os 14 espécimes analisados estão distribuídos em Fulvifomes durissimus,
F. fastuosus, F. glaucescens, F. melleoporus, F. rimosus, F. umbrinellus e
Fulvifomes sp.
Fulvifomes glaucescens e F. melleoporus são os primeiros registros
relatados para o estado do Amazonas, F. durissimus para o estado do Pará e
F. umbrinellus para o estado de Roraima.

174
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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Diversidade de Xylaria Hill ex Schrank (Xylariaceae) de áreas

próximas a cidade de Manaus-AM

Ferreira, Suzana Mineiro1; Cruz, Kely da Silva1; Jesus, Maria Aparecida de1

1Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia.
Email: [email protected]

Resumo
Os fungos do gênero Xylaria, pertencentes à família Xylariaceae, englobam
aproximadamente 300 espécies distribuídas em 800 epítetos específicos,
descritos muitas vezes devido à variação de forma e tamanho do estroma, que
pode ser cilíndrico, clavado a globoide, podendo ser ramificado, com coloração
negra, marrom ou amarelado. As espécies de Xylaria são cosmopolitas, habitam
principalmente em troncos e galhos em decomposição, algumas com
importância biotecnológica, como na produção de griseofulvina, uma substância
antifúngica importante no controle biológico de doenças comuns na agricultura,
além de apresentar potencial antimicrobiano contra bactérias e leveduras. A
maioria dos estudos realizados com Xylaria centralizam-se no Sul do Brasil no
decorrer dos anos, tornando necessário mais estudos nas demais regiões. Por
isso, em virtude da diversidade de fungos no bioma amazônico e sua
aplicabilidade biotecnológica, o objetivo deste trabalho foi ampliar o
conhecimento da diversidade fúngica na região através da identificação
taxonômica das espécies de Xylaria de áreas próximas a cidade de Manaus-AM.
Os fungos examinados foram coletados nas reservas da Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZFII), Museu da Amazônia (MUSA) e Reserva Florestal
Adolpho Ducke (RFAD). No total, foram identificados 24 espécimes, distribuídos
em nove espécies: Xylaria allantoidea, X. comosa, X. comosoides, X. cubensis,
X. curta, X. hyperythra, X. microceras, X. polymorpha e X. telfairii, sendo a
espécie X. comosa um novo registro para o estado do Amazonas.

Palavras-Chave: Ascomycota; Amazônia; diversidade

Introdução
Os fungos de Xylaria Hill ex Schrank estão agrupados na família
Xylariaceae Tul. e C. Tul., e devido ao seu alto grau de polimorfismo muitos
sinônimos estão descritos na literatura, contribuindo para que este grupo de
fungos seja taxonomicamente complexo. Aproximadamente 300 espécies foram
descritas em todo mundo, e mais de 800 epítetos específicos são listados em
sites online de consulta (Hamme e Guerrero 2002; Ma et al. 2022). Um total de 52
espécies de Xylaria foram registradas em território brasileiro, distribuídas em 334
espécimes. Destes, 61 registros são para a região Norte (SpeciesLink 2023).

177
 O gênero Xylaria está classificado no filo Ascomycota Caval.-Sm, classe
Sordariomycetes O.E. Erikss & Winka, ordem Xylariales Nannf. (Wijayawardene
et al. 2020). Os macrofungos de Xylaria são considerados cosmopolitas, habitam
principalmente em troncos e galhos em decomposição, mas podem ser
encontrados em frutos, sementes, folhas (endófitos), estercos, solos e ninhos de
cupins. Ademais, as espécies associadas a estes dois últimos substratos são
classificadas no subgênero Pseudoxylaria Boedijn (Wangsawat et al. 2021).
Este gênero é caracterizado pelo estroma cilíndrico, clavado e globoide,
geralmente com coloração negra, marrom ou amarelo, com endostroma sólido,
que geralmente se torna oco após a secagem. No estroma, estão os peritécios
contendo os ascos (estrutura reprodutiva) os quais são cilíndricos e possuem no
ápice um aparato apical que se torna amiloide (azul) em contato com o reagente
de Melzer. Nos ascos encontram-se oito ascósporos, de cor marrom, com fenda
germinativa retilínea, sigmóide ou oblíqua (Rogers 1985; Gucht 1995;
Wangsawat et al. 2021).
Algumas espécies como Xylaria polymorpha (Pers.) Grev., e X. hypoxylon
(L.) Grev. possuem potencial antibacteriano eficaz contra Bacillus subtilis,
Enterobacter aerogenes e Escherichia coli. Estas espécies do gênero Xylaria
também podem ser utilizadas para produção de antifúngicos, pois inibem o
crescimento de leveduras como: Candida albicans, C. glabrata and C. krusei
(Saridogan et al. 2021). Além disso, um metabólito secundário com atividade
antifúngica chamado griseofulvina já foi produzido por Xylaria sp, sendo utilizado
no controle biológico de doenças comuns em plantas, inibindo o crescimento de
patógenos, como Botrytis cinérea Pers., Corticium sasakii (Shirai) H. Matsumoto,
Puccinia recondita Roberge ex Desm. (Park et al. 2005).
No Brasil, alguns trabalhos com o gênero foram publicados ao longo dos
anos; principalmente na região Sul do país (Hamme e Guerrero 2002; Trierveiler-
Pereira et al. 2009; Cruz e Cortez 2015). Um estudo feito por Pereira (2011) em
fragmentos de Mata Atlântica no Nordeste, relatou pela primeira vez as espécies
X. arbuscula Sacc. e X. heliscus (Mont.) J.D. Rogers & Y.M para a Paraíba.
Dennis (1956) estudou algumas espécies da região Norte em herbários, e, um
levantamento preliminar de fungos da família Xylariaceae realizado na Amazônia
por Silveira e Rodrigues (1985), contribuiu para o registro pela primeira vez das

178
espécies X. microceras (Mont.) Berk., X. feejeensis (Berk.) Fr. e X. scruposa (Fr.)
Fr., para o estado do Amazonas.
Diante da diversidade e importância biotecnológica que o gênero Xylaria
apresenta, faz-se necessário contribuir com o conhecimento das espécies de
Xylaria que ocorrem na região Amazônica. Portanto, este trabalho teve como
objetivo ampliar a riqueza da diversidade fúngica na região, através da
identificação taxonômica das espécies provenientes de locais próximos a cidade
de Manaus-AM.

Material e Métodos
Os exemplares de Xylaria estão depositados no Herbário do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia e na Coleção de Fungos Lignocelulolíticos
CFL/COTEI/INPA e são provenientes de áreas próximas a cidade de Manaus-
AM, como: Estação Experimental de Silvicultura Tropical (ZFII) (latitude
2°38'17.4"S, longitude 60°09'25.8"O), Museu da Amazônia (MUSA) (latitude
3°00'26.4"S, longitude 59°56'23.4"O) e Reserva Florestal Adolpho Ducke
(RFAD) (latitude 2°57'46.9"S, longitude 59°55'22.4"O).
A identificação taxonômica foi realizada por meio de análises macro e
microscópicas, sendo a primeira com o intuito de observar e mensurar as
seguintes estruturas: Estroma - ramificado ou não ramificado, forma,
comprimento total, dimensão de porção fértil e estipe (comprimento × largura),
superfície e cor; Peritécio - forma e dimensão (altura × largura); Morfologia dos
ostíolos - umbilicada ou papilada, e disco ostiolar; cor do pigmento estromático
liberado em solução de KOH 10%, checada somente para fungos com coloração
clara estabelecida por Fournier et al. (2019). As análises microscópicas foram
feitas através de cortes transversais à mão livre da cavidade peritecial. Primeiro,
uma lâmina foi preparada com água destilada estéril para analisar pelo menos 10
ascósporos (em aumento coloração original dos mesmos, ausência ou presença
de fenda germinativa (sigmoide, retilínea, espiral) que também foi medida
quando menor que o comprimento total do ascósporo. Posteriormente, outra
lâmina foi preparada em Melzer para melhor visualizar os ascos e observar a
reação amiloide do anel apical, estas estruturas também foram mensuradas
(comprimento × largura).

179
 A identificação dos espécimes foi baseada em várias descrições
taxonômicas, como: Silveira e Rodrigues (1985), Poroca (1976) e Hamme e
Guerrero (2002) realizados no Brasil, regiões Norte, Nordeste e Sul,
respectivamente, como também de Rogers et al. (1988), da Venezuela, Dennis
(1956), com material coletado em regiões de clima tropical, depositado em vários
herbários de diferentes países, Gucht (1995) da Oceania e, por fim, Fournier et
al. (2019) da Europa. Outras informações disponíveis nos sites
http://www.mycobank.com e http://www.indexfungorum.org, também foram
acessadas.

Resultados e Discussão
Um total de 24 exemplares foi identificado, os quais estão distribuídos em
nove espécies: Xylaria hyperythra (Mont.) Mont., X. microceras (Mont.) Berk., X.
telfairii (Berk.) Sacc., X. curta Fr., X. allantoidea (Berk.) Fr., X. cubensis (Mont.) Fr.,
X. comosa (Mont.) Fr., X. comosoides Læssøe, X. polymorpha (Pers.) Grev.
Dentre estas, Xylaria comosa é novo registro para o Estado do Amazonas.
Os dados indicam que as espécies Xylaria comosa, X. polymorpha e X.
telfairii são as mais representativas, ambas com 5 espécimes. A área com maior
ocorrência de Xylaria é a Estação Experimental de Silvicultura Tropical (ZFII) com
15 espécimes, seguido da Reserva Florestal Adolpho Ducke (RFAD) com 8
(Tabela 1).
Tabela 1. Relação das espécies do gênero Xylaria que ocorrem em áreas de preservação
próximas a cidade de Manaus-AM.
Locais Total de
Taxa
ZFII MUSA RFAD espécimes
Xylaria allantoidea (Berk.) Fr. 1 2 0 3
X. comosa (Mont.) Fr. 5 0 0 5
X. comosoides Læssøe 1 0 0 1
X. cubensis (Mont.) Fr. 1 0 0 1
X. curta Fr. 0 2 0 2
X. hyperythra (Mont.) Mont. 1 0 0 1
X. microceras (Mont.) Berk. 1 0 0 1
X. polymorpha (Pers.) Grev. 4 1 0 5
X. telfairii (Berk.) Sacc. 1 3 1 5
Total 15 8 1 24
Legenda: ZFII - Estação Experimental de Silvicultura Tropical, MUSA - Museu da Amazônia,
RFAD - Reserva Florestal Adolpho Ducke.

180
Descrição taxonômica
Xylaria allantoidea (Berk.) Fr., Nov. Act. Reg. Soc. Sci. Upsal. Ser. 3, 1: 127
(1851). (Figura 1:D). Estroma não ramificado, cilíndrico curvado, clavado a
fusiforme, com ápice fértil arredondado, tornando-se oco após a secagem,
comprimento total 27-75,0 mm, porção fértil 19-68,0 × 4-14,0 mm, estipe 6-13,0
× 2-9,0 mm. Superfície marrom cobre, com rachaduras suaves. Peritécio:
subgloboso de 0,4-1,0 × 0,3-1,0 mm. Ostíolo: papilado cônico. Asco: não
visualizado. Anel apical: amiloide, 1,6-2,5 × 1,2- 2,0 µm. Ascósporos: 9,3-13,9
× 3,1-4,9 µm, elipsoide-inequilateral, cor castanho a
castanho claro. Fenda germinativa retilínea, igual ao comprimento do esporo.
(Figura 2: Q-R).
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Museu da Amazônia (MUSA),
Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 28-V-2016, (INPA 287000); 28-V-2016,
(INPA 287001). Estação Experimental de Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus,
galho decomposto, 8-V-2016, (INPA 287001).
Comentários: Xylaria allantoidea é caracterizada por apresentar estroma oco
quando seco, e ascósporos castanhos a castanho claro, com fenda germinativa
retilílea em toda extensão do esporo. Nas descrições feitas por Hamme e
Guerrero (2002) e Fournier et al. (2019) o ascocarpo possui coloração castanho
claro na fase jovem do estroma, tornando-se escura apenas na maturidade.

Xylaria comosa (Mont.) Fr., Summa Veg. Scand., sect. post.: 381 (1849).
(Figura 1: E-E'). Estroma não ramificado, ovalado, cilíndrico com ápice fértil
arredondado ou agudo, frequentemente apresentando pequenas ramificações;
comprimento total de 21-41,5 mm, porção fértil podendo ser cilíndrica 7-21,5 ×
3-16,0 mm, estipe longo, nitidamente delimitado da porção fértil e às vezes
bifurcado, 14-31,5 × 1-2,0 mm, piloso. Superfície preta, lisa, coberta por placas
amarelas ou marrons. Pigmento: amarelo oliváceo, podendo ser liberado ou
não. Peritécio: subgloboso de 0,8-1,4 × 0,5-1,2 mm. Ostíolo: papilado com
disco ostiolar branco. Asco: 210-215 µm, parte esporífica 150-170,0 × 5-7,5 µm,
estipe 40-60,0 × 2,5-3,75 µm. Anel apical: amiloide,
7,2-9,8 × 3,8-5,2 µm. Ascósporos: 23,5-33,5 × 5,8-9,8 µm, elipsoide-
inequilateral,cor marrom a marrom claro, com apêndices secundários hialinos
em cada extremidade. Fenda germinativa retilínea, igual ao comprimento do

181
esporo. (Figura 2:D,W- X).
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 8-V-2016,
(INPA 287005); 8-V- 2016, (INPA 287028); 7-V-2016, (INPA 287031); 8-V-2016,
(INPA 287033); 8-V-2016, (INPA 287040).
Comentários: Xylaria comosa é um complexo de espécies que possui placas
ou escamas na porção fértil, estipe frequentemente pubescente, extremamente
separado da parte fértil (Læssøe 1999). A característica principal de X. comosa
stricto sensu são os apêndices secundários nas extremidades dos ascopóros,
presentes em nosso material (Figura 2: J). Dennis (1956) e Hamme e Guerrero
(2002) descreveram ascósporos de (21) -26-40 µm× 7-11 µm e 29-35,9 µm ×
6,1-9 µm, tamanho um pouco maior que o descrito neste trabalho (23,5-33,5 ×
5,8-9,8 µm). Há registro de depósito desta espécie proveniente do estado
Amazonas no Herbário URM, de Pernambuco e também no Herbário-INPA
(https://specieslink.net/search), entretanto, essa é a primeira ocorrência
descrita de X. comosa para o Amazonas.

Xylaria comosoides Læssøe, Kew Bull. 54 (3): 611 (1999). (Figura 1:H)
Estroma não ramificado, ovalado, oblongo, com ápice estéril agudo;
comprimento total de 57-62,0 mm; porção fértil de17-21,0 × 6-8,0 mm,
nitidamente delimitada do estipe, com superfície com rachaduras suaves,
marrom acinzentado, contendo placas pequenas; estipe longo, com pilosidade
na base, 36-43,0 × 1-2,0 mm, endostroma oco, rompendo-se ao meio.
Pigmento: ausente. Peritécio: subgloboso de 0,9-1,2 × 0,7-1,0 mm. Ostíolo:
inconspícuo a discoide. Asco: não visualizado. Anel apical: amiloide, 6,8-8 ×
3,8-4,3 µm. Ascósporos: 38,3-54,0 × 6,2-10,0 µm, elipsoide- inequilateral,
variam de marrom a marrom claro. Fenda germinativa em espiral, igual ao
comprimento total do esporo (Figura 2:Y-Z).
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 7-V-2016,
(INPA 287027). Comentários: Xylaria comosoides é um dos taxóns dentro do
complexo de X. comosa. Caracteriza-se por apresentar ascósporos enormes de
38,3-54 × 6,2-10,0 µm, e fenda germinativa espiralada em toda dimensão do
esporo (Figura 2: Z). Estas características aqui descritas para esta espécie são

182
similares as relatadas por Læssøe (1999), que apresenta ascospóros menores,
entre (37.5-) 40-47.5 (-50.8) x (5.6-) 6.3-7.3 (-8.6). Este autor sugere que a
distribuição de X. comosoides seja predominantemente amazônica.

Xylaria cubensis (Mont.) Fr., Nov. Act. Reg. Soc. Sci. Upsal. Ser. 3, 1: 126 (1851). (Figura
1:G). Estroma não ramificado, cilíndrico, clavado, subgloboso, com ápice fértil
arredondado; comprimento total de 30-46,0 mm, porção fértil 16-33,0 × 15-16,0
mm, estipe glabroso, 13-19,0 × 5-6,0 mm. Superfície marrom escuro, quase
preto, levemente rachada. Peritécio: subgloboso de 0,7-1,0 × 0,5-0,8 mm.
Ostíolo: papilado. Asco: não visualizado. Anel apical: amiloide, 1,3-2,4 × 1,2-
1,9 µm. Ascósporos: 8- 11,1 × 3,6-5,4 µm, elipsoide-inequilateral, variam de
marrom a marrom escuro. Fenda germinativa inconspícua (Figura 2:F, U-V).
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 7-V-2016,
(INPA 287003). Comentários: A fenda germinativa inconspícua é uma
característica típica que diferencia X. cubensis das demais espécies do gênero
(Gucht, 1995), assim como os ascospóros pequenos, (8-11,1 × 3,6-5,4 µm),
muito semelhante a observada por Trierveiler-Pereira et al. (2009) de 8.5-11 ×
4-5 µm e Cruz e Cortez (2015) de 8-10.5 × 4-5 µm.

Xylaria curta Fr., Nov. Act. Reg. Soc. Sci. Upsal., Ser. 3, 1: 126 (1851). (Figura
1:F). Estroma não ramificado, cilíndrico curvado, clavado a fusiforme, com
ápice fértil arredondado; comprimento total de 13-47,0 mm, porção fértil 10-38,0
× 3-6,0 mm, estipe 3-14 × 1,5-5,0 mm. Superfície amarelo a marrom, rugosa,
rachada reticularmente, com aspecto carbonáceo. Pigmento: ausente.
Peritécio: subgloboso de 0,7-1 × 0,5-0,8 mm. Ostíolo: papilado discoide. Asco:
87,5-175,0 µm, parte esporífica 45-67,5 × 3,5-5,0 µm, estipe 37,5-120,0 × 1-2,5
µm. Anel apical: amiloide, 1,5-2,1 × 1,3-1,8 µm. Ascósporos: 8-11,6 × 3,5-4,9
µm, elipsoide-inequilateral, variam de marrom a marrom claro. Fenda
germinativa retilínea, igual ao comprimento total do esporo. (Figura 2: E,S-T)
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Museu da Amazônia (MUSA),
Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 27-V-2016,(INPA 286996); 5-V-2016,
(INPA 286997).
Comentários: O tamanho dos ascósporos (8-12 × 4-5 µm) na descrição de

183
Dennis (1956) é semelhante com o descrito neste trabalho, de 8-11,6 × 3,5-4,9
µm, os ostíolos discóides também são frequentemente mencionados na
literatura para Xylaria curta. Segundo Hamme e Guerrero (2002), os estromas
mais jovens deste táxon são castanhos, tornando-se pretos quando maduros.
Essa mesma característica também é relatada por Fournier et al. (2019), com
estromas brancos a amarelos na fase inicial.

Xylaria hyperythra (Mont.) Mont., Syll. Gen. Sp. Plan. Crypt.: 202 (1856).
(Figura 1: B-B'). Estroma não ramificado, cilíndrico, clavado a fusiforme, com
ápice fértil agudo; comprimento total de 22-23,0 mm, porção fértil 19,0 × 4-4,5
mm, estipe glabroso, facilmente quebradiço, 3-4,0 × 1-1,5 mm. Superfície
amarela, com rachaduras em tiras alongadas e manchas cor creme. Pigmento:
laranjado. Peritécio: subgloboso de 0,8- 1,0 × 0,7-1,0 mm. Ostíolo: umbilicado,
circundado por mancha preta irregular. Asco: 160-220,0 μm, parte esporífica
115-120,0 × 5-6,0 μm, estipe 40-105,0 × 2,5-3,5 μm. Anel apical: amiloide,
4,6-5,2 × 2,8-3,7 µm. Ascósporos: 16-20,0 × 5-8,5 µm, elipsoide-inequilateral,
marrom escuro. Fenda germinativa retilínea, um pouco menor que o
comprimento total do esporo, 8-11,0 µm (Figura 2:B,M-N).
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus, galho decomposto: M.A Jesus: 13-V-2013,
12871.
Comentários: Na discrição acima o estroma não possui ramificação e o ápice
é fértil agudo, enquanto que Dennis (1956) descreve o estroma de Xylaria
hyperythra como ocasionamente ramificado, com ápice fértil arredondado. No
entanto, os ascósporos do material analisado que medem 16-20,0 × 5-8,5 µm,
são semelhantes aos descritos por este autor de 16-19 × 5,5-7,0 µm, assim
como a coloração marrom escuro desta microestrutura. Estas características
similares também são relatadas por Fournier et al. (2019), com ascósporos
(13.7-) 15-18 (-19.1) × (5-) 5.3-6.8 (-7.4) µm, cor marrom escuro, assim como o
pigmento amarelo em KOH 10%, também observado no material analisado
(Figura 1:B').

Xylaria microceras (Mont.) Berk. Nov. Act. Reg. Soc. Sci. Upsal.: 128 (1851).
(Figura 1:C-C'). Estroma não ramificado, cilíndrico curvado, clavado a

184
fusiforme, com ápice fértil arredondado; comprimento total de 27-32,0 mm,
porção fértil 18-20,0 × 3-3,5 mm, estipe enegrecido 9-12,0 × 1,5-2,0 mm.
Superfície cor creme, com aspecto levemente carbonáceo e rachaduras em tiras
alongadas. Pigmento: amarelo oliváceo. Peritécio: esférico, 0,4-0,7 × 0,4-0,7
mm. Ostíolo: discoide. Asco: 70-110,0 µm, parte esporífica 50-55,0 × 5-6,0 µm,
estipe 20-55,0 × 2,5 µm. Anel apical: amiloide, 1,6-2,1 × 1,2-1,8 µm.
Ascósporos: 7,8-9,6 × 3,4-4,5 µm, elipsoide-inequilateral, cor marrom a
marrom claro. Fenda germinativa retilínea, igual ao comprimento do esporo
(Figura 2: C,O-P).
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 8-V-2016,
(INPA 286999).
Comentários: Xylaria microceras é caracterizada por possuir estroma pequeno
e cilíndrico. Silveira e Rodrigues (1985) relataram o tamanho do estroma de 40
× 2 mm, em nossa descrição o comprimento total é menor que o relatado por
estes autores, de 27-32,0 mm. Além disso, o estipe em nosso material é preto,
que corrobora com os dados descritos por Dennis (1956) para esta espécie,
assim como os ascósporos, que no material examinado medem 7,8-9,6 × 3,4-
4,5, e do autor mencionado 9-10,5 × 3,5-4,5 µm, com fenda germinativa retilínea
em ambas descrições.

Xylaria polymorpha (Pers.) Grev., Fl. Edin.: 355 (1824) (Figura 1: I-I'). Estroma
não ramificado ou ramificado na base, cilíndrico ou fusiforme curvado, clavado,
cerebriforme, poliforme, ápice fértil arredondado; comprimento total 11,5-81,0
mm, porção fértil 6-31,0 × 4-28,0 mm (partida ao meio em alguns exemplares),
estipe rugoso (5-53,0 × 1-4,0 mm), longo, podendo ser bem delimitado da
porção fértil ou não. Superfície preta, rugosa, com suaves rachaduras.
Peritécio: subgloboso de 0,4- 1,0 × 0,3-1,0 mm. Ostíolo: papilado, raramente
inconspícuo. Asco: 196,5-274,6 µm, parte esporífica 138-168,5 × 6,5-9,0 µm,
estipe 42,8-110,0 × 2,5-5,5 µm. Anel apical: amiloide, 3,5-6,6 × 2,5-5,3 µm.
Ascósporos: 18,3-30,1 × 5,4-9,4 µm, elipsoide- inequilateral, raramente
navicular, cor marrom a marrom claro. Fenda germinativa retilínea, inclinada,
menor que o comprimento do esporo, 5-10,0 µm. (Figura 2: G, A'- C').
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Museu da Amazônia (MUSA),

185
Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 27-V-2016, (INPA 286995). Estação
Experimental de Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus, tronco decomposto: K.S
Cruz: 8- V-2016, (INPA 287035); 7-V-2016, (INPA 287036); 8-V-2016, (INPA
287032); 8-V- 2016, (INPA 287007).
Comentários: A espécie é caracterizada por apresentar estroma poliforme,
com superfície fortemente enrugada. O tamanho dos ascósporos na descrição
acima, de 18,3-30,1 × 5,4-9,4 µm, diferem das dimensões citadas em Poroca
(1976), de 18,5- 24 × 6,2-9,3 µm, e Hashemi et al. (2014) (17.5-)18-24(-26) ×
(5.5-)6-8(-9) μm e Becerril-Navarrete et al. (2018), de 26-28 (-32) × 5-7 µm.
Essa diferença de tamanho sugere variações microscópicas em X. polymorpha,
com exceção da fenda germinativa retilínea menor que a extensão do esporo,
relatada por estes dois últimos autores mencionados, e também por Medel et al.
a(2008); b(2010). Os ascósporos com formato navicular mencionados em nosso
trabalho são caraterísticos para o reconhecimento desta espécie (Figura 2: B')
(Hashemi et al. 2014).

Xylaria telfairii (Berk.) Sacc., Syll. Fung. 1: 320 (1882). (Figura 1: A-A')
Estroma não ramificado, cilíndrico reto a curvado, clavado, fusiforme, com ápice
fértil arredondado; comprimento total de 22-99,0 mm, porção fértil 17-73,0 × 3-
16,0 mm, estipe 4-39,0 × 1-5,0 mm, as vezes delimitado da porção fértil.
Superfície amarela, raramente acinzentada, fortemente carbonáceo em
algumas partes do estroma. Endostroma é esponjoso ou sólido, cor creme,
geralmente oco, rompendo-se longitudinalmente. Pigmento: amarelo oliváceo,
podendo ser liberado ou não. Peritécio: subgloboso de 0,4-1,0 × 0,3-1,0 mm.
Ostíolo: papilado ou discoide. Asco: 130-170,0 µm, parte esporífica 70-148,5
× 6-7,5 µm, estipe 60-70,0 × 3,5-5,0 µm. Anel apical: amiloide, 2,8-6,0 × 2,5-
4,1 µm. Ascósporos: 14,2-25,3 × 4,2-8,0 µm, elipsoide-inequilateral, cor
marrom a marrom claro. Fenda germinativa retilínea, inclinada, menor que o
comprimento do esporo, 6-10,0 µm, raramente sigmoide. (Figura 2:A, H-L).
Espécimes examinados: BRASIL. Amazonas: Museu da Amazônia (MUSA),
Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 23-V-2016, (INPA 286993); 27-V-2016,
(INPA 287043); 05-V-2016, (INPA 287034). Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZFII), Manaus, galho decomposto: K.S Cruz: 7-V-2016,
(INPA 286994). Reserva Florestal Adolpho Ducke (RFAD), Manaus, galho

186
decomposto: M.A Jesus: 20-V- 2015,12868.
Comentários: Xylaria telfairii é caracterizada por possuir estromas amarelos,
castanhos, com formato cilíndrico-fusiforme, algumas vezes com aspecto
fortemente carbonáceo, bipartido após a secagem (Figura 1:A). A fenda
germinativa dos espécimes analisados apresentam de 6-10,0 µm, sendo
ligeiramente maior que a mencionada por Fournier et al. (2019), de 7-9,0 µm,
porém, a presença de fenda ocasionalmente sigmoide relatada por este autor
também foi visualizada neste material (Figura 2:J).

187
Figura 1. Estroma e pigmento extraído em KOH10% das espécies de Xylaria. A-A'. X. telfairii; B-
B'. X. hyperythra; C-C'. X. microceras; D-D'. X. allantoidea; E-E. X. comosa; F. X. curta; G. X.
cubensis; H. X. comosoides; I-I'. X. polymorpha. Barra de escala: A= 30 mm; B-C= 10 mm; D-F=
20 mm; G= 15 mm; H-I= 20 mm; I'= 10 mm.

188
Figura 2. Estruturas microscópicas das espécies de Xylaria. X. telfairii: A- asco em reagente
Melzer, H-fenda retilínea menor, I-fenda retilínea maior, J- fenda sigmóide, K-ascósporo gutulado,
L- anel apical; X. hyperythra: B-asco , M-fenda retilínea, N- anel apical; X. microceras: C-asco
em reagente Melzer, O- anel apical, P-fenda retilínea; X. allantoidea: Q- anel apical, R- ascósporo
com fenda germinativa retilínea; X. comosa: D- asco, W-anel apical, X- ascósporo com fenda
retilínea, e apêndices hialinos; X. curta: E-asco em reagente Melzer, S-anel apical, T- ascósporo
com fenda retilínea; X. cubensis: F-asco, U-anel apical, V- ascósporos; X. comosoides: Y- anel
apical, Z- ascósporo com fenda espiral; X. polymorpha: G-asco em reagente Melzer, A'-anel
apical, B' ascósporo com formato navicular, C'-fenda retilínea. Barra de escala: A-G= 40 µm; H-
M, R, W-Z= 10 µm; Q, N-P,S-V, A'-C'= 5 µm.

189
 Conclusão
A Estação Experimental de Silvicultura Tropical (ZFII) é a área com mais
espécies de Xylaria depositados no Herbário do Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia e na Coleção de Fungos Lignocelulolíticos CFL/COTEI/INPA. A
espécie Xylaria comosa é registrada pela primeira vez no estado do Amazonas.

Agradecimentos
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM,
pela bolsa de iniciação científica concedida à Suzana Mineiro Ferreira e também,
pelo fomento de coletas realizadas através do projeto "Ocorrência de
Macrofungos e termitas na área urbana da cidade de Manaus", Edital N.
030/2013.

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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Diversidade do gênero Fuscoporia Murrill (Hymenochaetaceae,

Basidiomycota) na Amazônia brasileira

Peres, Rafaela Saraiva1; Marques-Laborda, Juan Phillipe2; Jesus, Maria

Aparecida2

1Universidade Estadual de Feira de Santana, 2Instituto Nacional de Pesquisa da

Amazônia
E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
O gênero Fuscoporia, proposto por Murrill, acomoda espécies de Phellinus
senso lato. que apresentam basidiomas ressupinados a pileados e ocorrem
principalmente em árvores coníferas e caducifólias. Dentre as 78 espécies
reportadas para o gênero, 14 ocorrem no Brasil, com apenas cinco na Amazônia
brasileira. Neste contexto, o trabalho foi proposto com a finalidade de ampliar o
conhecimento da Funga na região Amazônica através da identificação
taxonômica do acervo de espécimes do gênero Fuscoporia depositados na
Coleção de Fungos Lignocelulolíticos do Laboratório Patologia da Madeira do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (COTEI/INPA) proveniente de
diferentes reservas naturais de três estados da Amazônia brasileira, utilizando-
se de literaturas específicas para uma determinação do epíteto específico e de
banco de dados para a verificar os nomes corretos dos autores. Entre os 53
espécimes do gênero Fuscoporia submetidos à identificação, 47 espécimes
pertencem a F. gilva, F. chrysea e F. rhabarbarina são representadas cada uma
por 2 espécimes, assim como F. scruposa e F. yunnanensis, cada com um único
representante. Em relação à distribuição, 32 espécimes de Fuscoporia são
oriundas do estado do Amazonas, 14 do estado de Roraima e sete do estado do
Pará. O substrato de maior preferência dos macrofungos foi tronco caído. Para
o estado do Amazonas e Roraima, todas as espécies estudadas são
consideradas novos registros.

Palavras-chave: Biodiversidade, Macrofungos, Phellinus s. lato, Taxonomia.

Introdução
O gênero Fuscoporia, proposto por Murrill (1907), ocorre principalmente
em árvores coníferas e caducifólias, acomoda espécies de Phellinus s. lat. com
basidiomas ressupinados a pileados, possui sistema de hifas monomíticas a
dimíticas, hifas generativas incrustadas nos dissepimentos, setas himeniais e
basidiósporos cilíndricos a elipsóides, hialinas, inamiloides, não dextrinoides, de
paredes finas e lisos. Novas espécies foram propostas por Fiasson e Niemelä
(1984), Niemelä et al. (2001), Wagner e Fischer (2001) e Dai (1999; 2010).

192
 Dentre as 68 espécies reportadas para o gênero (Chen et al. 2022), 14
ocorrem no Brasil (Silveira e Guerrero 1991; Loguercio-Leite e Wright 1995;
Coelho e Wright 1996; Gerber e Loguercio-Leite 1997; 2000; Gonçalves e
Loguercio-Leite 2001; Groposo e Loguercio-Leite 2002; Groposo et al. 2007;
Baltazar et al. 2009; Motato-Vásquez et al. 2014). No entanto, apenas seis
espécies são reportadas na Amazônia brasileira (Soares et al. 2014; Medeiros
et al. 2015; Couceiro et al. 2022). Espécies de Fuscoporia encontram-se
associadas a Angiospermas e Gimnospermas causando podridão branca,
podendo levar a morte da árvore, conferindo ao gênero grande importância
ecológica e econômica (Dai et al. 2007).
Com a finalidade de ampliar o conhecimento da Funga (Kuhar et al. 2018)
na Amazônia, o presente trabalho proposto visa a identificação taxonômica do
acervo de Fuscoporia proveniente de diferentes reservas naturais de três
estados da Amazônia brasileira.

Material e Métodos
Os espécimes de Fuscoporia estão depositados na Coleção de Fungos
Lignocelulolíticos do Laboratório Patologia da Madeira do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (COTEI/INPA). Os espécimes são provenientes de
diferentes áreas da região Amazônica, como Reserva Florestal Adolpho Ducke
(RFAD), Reserva Biológica do Uatumã (RBU), Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia (INPA), localizadas no estado do Amazonas; Estação Ecológica de
Maracá (EEM) e Parque Nacional de Viruá (PNV), ambas no estado de Roraima
e Fazenda Cauaxi (FC), no estado do Pará.
Os espécimes foram coletados em diferentes substratos lignocelulolíticos,
como: árvore morta, galho caído, galho suspenso e tronco caído.
As análises macroscópicas dos basidiomas foram realizadas com o
auxílio de anotações de observações quanto à medida do comprimento, largura,
espessura e consistência do basidioma. Características do himenóforo, da
superfície do píleo, número de poros por milímetro e de camadas de tubos foram
observadas com o auxílio de lupa estereoscópica.
Para a análise microscópica dos basidiomas, foram realizados cortes à
mão livre com o auxílio de lâmina de aço da seção himenial e abhimenial do
basidioma do fungo, seguindo a metodologia proposta por Teixeira (1995). Os

193
cortes foram montados entre lâminas e lamínulas para análise com o auxílio de
microscópio óptico para caracterização e mensuração das estruturas
reprodutivas (sistema hifal e basidiósporos) e dos elementos estéreis (setas e
cistídios). Foi utilizado o reagente de Melzer (IKI), para a verificar a reação
dextrinoide ou amiloide de basidiósporos e/ou hifa, solução aquosa de hidróxido
de potássio (KOH 3%) que hidrata as estruturas e determina a reação
xantocroica e em Azul de Algodão para verificar a reação cianófila (Teixeira
1995).
Na caracterização macroscópica foi dada prioridade para a confirmação
de exemplares que aparentemente apresentavam características de Phellinus s.
lat. A identificação dos espécimes seguiu as descrições feitas por Ryvarden
(2004), Groposo et al. (2007), Baltazar et al. (2009), Dai (2010), Pires e Gugliotta
(2016) e para verificar os nomes corretos dos autores foram utilizados os bancos
de dados Mycobank (http://www.mycobank.com) e Index Fungorum
(http://www.indexfungorum.org).
Todos os dados de coleta do fungo, como nome do coletor, substrato, data
e local de coleta foram informatizados de acordo com o programa BRAHMS
(Botanical Research and Herbarium Management System) adotado pelo
Herbário do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).

Resultados e Discussão
Foram identificados 53 espécimes do gênero Fuscoporia, sendo 47
pertencentes a F. gilva (Schwein.) T. Wagner e M. Fisch, dois a F. chrysea (Lév.)
Baltazar e Gibertoni, dois a F. rhabarbarina (Berk.) Groposo, Log.-Leite e Góes-
Neto e um pertencente a F. scruposa (Fr.) Gibertoni e Oliveira-Filho e um a F.
yunnanensis Y.C. Dai. Em relação à distribuição, 32 espécimes do gênero
Fuscoporia são oriundas do estado do Amazonas, 14 do estado de Roraima e
sete do estado do Pará (Tabela 1). Provavelmente, o número de espécimes
encontrados em cada estado deve se ao esforço amostral, sendo o maior
número do estado do Amazonas em comparação com os outros estados devido
ao número de coletas.
Tronco caído foi o substrato preferencial aos macrofungos do gênero
Fuscoporia (Tabela 2). Apesar de espécies do gênero Fuscoporia serem
reportadas geralmente em substratos em decomposição, F. gilva foi coletado em

194
 árvore viva na Fazenda Cauaxi (Pará), indicado que pode se tratar de um fungo
generalista e/ou um parasita ocasional. Além disso, essa associação confirma a
importância do seu principal papel saprotrófico na natureza (Wagner e Fischer
2002; Tchoumi et al. 2020).
F. gilva é a espécie mais representativa desse estudo (Figura 1), pois
apresenta distribuição Pantropical e ampla variação morfológica que
possivelmente pode ser um complexo de espécies crípticas (Ryvarden 2004).
Nesse caso, é interessante uma abordagem integrativa, incluindo revisão
morfológica e análises moleculares para esclarecer os limites entre as amostras
ou mesmo no gênero Fuscoporia.

Tabela 1. Relação das espécies do gênero Fuscoporia em e reservas de diferentes estados na

Amazônia brasileira.
Local de Coleta
Táxon AM RR PA Total
ZF-2 RFAD INPA RBU IR PNV EEM FC
Fuscoporia chrysea 0 0 0 0 0 2 0 0 2
F. gilva 11 4 11 3 0 4 8 6 47
F. rhabarbarina 1 0 0 0 1 0 0 0 2
F. scruposa 1 0 0 0 0 0 0 0 1
F. yunnanensis 0 0 0 0 0 0 0 1 1
Total 13 4 11 3 1 6 8 7 53
Local de Coleta: AM – Amazonas, ZF-2 - Estação Experimental de Silvicultura Tropical, RFAD –
Reserva Florestal Adolpho Ducke, INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, RBU -
Reserva Biológica do Uatumã, IR – Município de Iranduba; RR –Roraima, PNV – Parque
Nacional do Viruá, EEM – Estação Ecológica de Maracá; PA – Pará, PC – Fazenda Cauaxi.

Fuscoporia chrysea, F. gilva e F. rhabarbarina já foram reportadas para a

Amazônia brasileira Oriental no estado do Pará (Couceiro et al. 2022). No
entanto, para o estado do Amazonas e Roraima, todas as espécies são
consideradas novos registros.

195
 Tabela 2. Relação das espécies do gênero Fuscoporia em diferentes substratos
lignocelulolíticos, na Amazônia brasileira.
Substrato*
Táxon Total
AV AM TC GS GC MB
Fuscoporia chrysea 0 0 0 0 2 0 2
F. gilva 4 6 27 1 7 2 47

0 1 1 0 0 0 2
F. rhabarbarina
F. scruposa 0 0 1 0 0 0 1
F. yunnanensis 1 0 0 0 0 0 1
Total 5 7 29 1 9 2 53
*
AV = árvore viva, AM = árvore morta, TC = tronco caído, GC = galho caído, MB = madeira
beneficiada.

Figura 1. Estruturas macro e micromorfológicas de Fuscoporia gilva. A – Superfície pilear, B –

Superfície himenial, C – Setas (visualizadas em KOH 3%), D – Basidiósporos (visualizados em
KOH 3%). Barras: A e B = 6 cm, C = 20 µm, D = 12 µm.

Taxonomia

Fuscoporia chrysea (Lév.) Baltazar e Gibertoni, Mycotaxon 111: 206 (2010)

Basiônimo: Polyporus chryseus Lév., Annls Sci. Nat., Bot., sér. 3 5: 301 (1846)
Descrição: Baltazar e Gibertoni 2010.

196
Material examinado: BRASIL. Roraima: Parque Nacional do Viruá (LPM 6309,
6335).

Fuscoporia gilva (Schwein.) T. Wagner e M. Fisch., Mycologia 94(6): 1013

(2002)
Basiônimo: Boletus gilvus Schwein., Schr. naturf. Ges Leipzig 1:96, 1822.
Descrição: Ryvarden 2004 (como Phellinus gilvus).
Material examinado: BRASIL. Amazonas: Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia (LPM 2293, 5841, 12239, 2908, 2284, 2295, 12263, 12255, 12528,
12529, 4001), Estação Experimental de Silvicultura Tropical (LPM 10542, 6776,
12803, 10953, 12339, 7646, 8147, 8368, 9000, 10774), Reserva Florestal
Adolpho Ducke (LPM 3120, 3122, 3123, 12688), Reserva Biológica do Uatumã
(LPM 5222, 5227, 5228). Roraima: Estação Ecológica de Maracá (LPM 4024,
7200, 4146, 4166, 4119, 4140, 5867, 4746), Parque Nacional do Viruá (LPM
6541, 6405, 6403, 7217). Pará: Fazenda Cauaxi (LPM 4966, 5106, 5104, 2284,
4971, 5027, 4970).

Fuscoporia rhabarbarina (Berk.) Groposo, Log.-Leite e Góes-Neto, Mycotaxon

101: 61 (2007).
Basiônimo: Polyporus rhabarbarinus Berk., Ann. nat. Hist., Mag. Zool. Bot. Geol.
3: 388 (1839).
Descrição: Groposo et al. 2007.
Material examinado: BRASIL. Amazonas: Estação Experimental de Silvicultura
Tropical (LPM 12822), Iranduba, AM-070 (LPM 14002).

Fuscoporia scruposa (Fr.) Gibertoni e Oliveira-Filho, Fungal Diversity 104: 130

(2020).
Descrição: Yuan et al. 2020.
Material examinado: BRASIL. Amazonas: Estação Experimental de Silvicultura
Tropical (LPM 8146).

Fuscoporia yunnanensis Y.C. Dai, Fungal Diversity 45: 221 (2010).

Descrição: Dai 2010.
Material examinado: BRASIL. Pará: Fazenda Cauxi (LPM 3462).

197
 Conclusão
O gênero Fuscoporia está representado em diferentes reservas naturais
de três estados da Amazônia brasileira com maior representatividade no estado
do Amazonas, sendo a maior representatividade na Estação Experimental de
Silvicultura Tropical e no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia com 11
espécimes em cada reserva. F. chrysea, F. rhabarbarina, F. scruposa e F.
yunnanensis são consideradas novos registros para os estados do Amazonas e
Roraima.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Efeito da adubação do solo e inoculação com bactérias

solubilizadoras de fosfato na colonização micorrízica da caroba
(Jacaranda copaia (Aubl.) D.Don)
Rodrigues, Elen Carla Pereira de Goes1, Moreira, Francisco Wesen1, Minelli-
Oliveira, Cassiane1, Oliveira, Luiz Antonio1

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
E-mail: [email protected]

Resumo
A Caroba caracteriza-se por ser uma árvore de dossel e sub dossel. O
desenvolvimento das mudas no campo é rápido, atingindo facilmente 4-5 m aos
dois anos. Devido à importância desta espécie em plantios florestais, os estudos
acerca da otimização de sua produção em viveiro são de capital relevância. As
associações simbióticas entre plantas e microrganismos podem ser utilizadas
para auxiliar no processo de produção de mudas de Caroba. Existem evidências
suficientes dos efeitos benéficos dos microrganismos do solo e seus processos
na nutrição e crescimento das plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o
efeito da adubação com e sem a inoculação de bactérias solubilizadoras de
fosfato (BSF) no desenvolvimento de mudas de Caroba (Jacaranda copaia). O
experimento foi conduzido em casa-de-vegetação localizada no Campus III do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas. O
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado constituindo-
se de treze tratamentos com quinze repetições. Os tratamentos consistiram em
testemunha; dois níveis de P2O5 (25, 50 kg.ha-1) na forma de superfosfato triplo,
com e sem bactérias solubilizadoras de fosfato (BSF), com e sem Ca, Mg, K, N;
50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de fosfato de rocha, com e sem BSF , com e sem
Ca, Mg, K, N. A adubação fosfatada não mostrou caráter inibitório à micorrização
da espécie. A percentagem de colonização micorrízica variou entre 22,3% e
64,2%.

Palavras-chave: Fungos micorrízicos arbusculares; Argissolo da Amazônia;

associação plantas-microrganismos; metabolismo microbiano; ecologia
microbiana.

Introdução
A caroba [Jacaranda copaia (Aubl.) D.Don] é uma árvore que atinge 30 m
de altura, diâmetro de 6 até 90 cm e que apresenta copa estreita e alta (Loureiro
et al. 1979; Lorenzi 1998 e Ribeiro et al. 1999). Loureiro et al. (1979; 1997) citam
ainda que sua madeira é bastante utilizada em carpintaria, caixotaria, fabricação
de palitos de fósforo e polpa de papel.

201
 Devido à importância desta espécie em plantios florestais, os estudos
acerca da otimização de sua produção em viveiro são de capital relevância. A
diminuição do tempo de permanência das mudas no viveiro e melhoria da
qualidade das plantas são fatores importantes e que podem fazer a diferença ao
final do plantio.
As associações simbióticas entre plantas e microrganismos podem
auxiliar na produção de mudas. Existem evidências dos efeitos benéficos dos
microrganismos do solo e seus processos na nutrição e crescimento das plantas.
Eles podem ser considerados como modificadores da fertilidade do solo, por
meio de seus efeitos na disponibilidade e absorção de nutrientes (Siqueira e
Moreira 1997).
Segundo Silva Filho et al. (1993), diversos microrganismos dos solos têm
a capacidade de solubilizar fosfatos e podem contribuir para disponiblizar o
fósforo às plantas. Entretanto, a eficiência solubilizadora pode variar entre
espécies ou até mesmo entre isolados de uma mesma espécie (Chagas Jr et al.
2010; Silva et al. 2011). A inoculação de microrganismos selecionados com alta
capacidade solubilizadora de fosfato tem promovido o crescimento de diversas
plantas, devido ao melhor aproveitamento do fosfato adicionado (solúvel ou
natural) ou pela disponibilidade das formas já existentes no solo.
Outra importante simbiose entre plantas e microrganismos são as
micorrizas. A micorriza arbuscular apresenta três importantes componentes: a
raiz, as estruturas fúngicas nas células da raiz e o micélio externo no solo; este
último pode ser bastante extenso em algumas condições (Pringle et al. 2009;
Begum et al. 2019). Essa simbiose aumenta a superfície de absorção das raízes,
facilitando a absorção dos nutrientes do meio em que se encontram, como
também, protegendo as plantas de fungos patogênicos (Smith e Read 2008;
Jung et al. 2012; Begum et al. 2019).
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adubação com e sem a
inoculação de bactérias solubilizadoras de fosfato (BSF) na ocorrência de fungos
micorrízico arbusculares nas raízes da caroba.

202
 Material e Métodos
O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação localizada no
Campus III do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus,
Amazonas.
As plântulas de caroba, após atingirem aproximadamente 5 cm em
sementeira, foram transplantadas para sacos plásticos de 2 kg. Os sacos foram
preenchidos com solo classificado como Podzólico, proveniente de uma
pequena propriedade, localizada na Comunidade do Brasileirinho, zona rural de
Manaus. Cada saco plástico continha uma planta, consistindo em uma unidade
amostral.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado
constituindo-se de treze tratamentos com quinze repetições (Tabela 1). As doses
de cálcio, magnésio, potássio e nitrogênio aplicadas foram respectivamente: 5
cmolc.kg-1, 2 cmolc.kg-1, 100 mg.kg-1 e 200 kg.ha-1. O fosfato de rocha utilizado
foi o de Araxá, com concentração de 24% de P2O5. As fontes de cálcio,
magnésio, potássio e nitrogênio utilizadas foram respectivamente: sulfato de
cálcio, sulfato de magnésio, cloreto de potássio e ureia. A quantidade total de
nitrogênio e de potássio foi dividida em três partes e aplicadas no primeiro, no
trigésimo e no nonagésimo dia. Os demais nutrientes foram aplicados de uma só
vez, no início do experimento.
Foram inoculadas, logo após o transplante, quatro bactérias
solubilizadoras de fosfato (BSF), sendo elas: P317, P295, P291 e AB16, todas
provenientes da coleção do Laboratório de Microbiologia do Solo do INPA,
previamente testadas quanto à sua capacidade de solubilização. Mediantes os
cálculos realizados, verificou-se que o total de células inoculadas foram 6,25 X
105 por grama de solo.
Na determinação do percentual de micorrização, foram retiradas frações
de 1 cm das raízes mais finas submetendo-as ao processo de clarificação e
coloração segundo Kormanick et al. (1980).

Resultados e Discussão
Não houve diferença significativa entre os tratamentos para esta
característica. Ou seja, os níveis de colonização micorrízica não foram
influenciados pelas adubações adotadas. Entretanto, observa-se que a ausência

203
 de adubação (tratamento controle) leva a uma superioridade numérica (64,2%)
em relação aos outros tratamentos (Tabela 1).
De um modo geral, foi verificado que a presença do fungo nas raízes de
caroba foi bastante elevada (Figura 1). A percentagem de colonização variou de
22,3% (50 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais) a 64,2% (testemunha)
(Tabela 1). Em condições de baixa disponibilidade de nutrientes no solo, este
fato pode significar importante mecanismo de adaptação ao ambiente.
Santos e Oliveira (1994) consideram que para espécies florestais existem
poucos estudos referentes às associações micorrízicas. Estes autores
verificaram que em Pau-viola (Tabebuia cassinoide), uma espécie da família
Bignoniaceae, foi encontrado um percentual de micorrização bastante elevado,
variando de 91,5 a 96,2%. Carneiro et al. (1996), estudando Jacaranda
mimosaefolia, constataram que ela é uma espécie altamente dependente da
simbiose.

Figura 1. Hifas intra e extracelulares em raiz de J. copaia.

Aumento de 100 vezes.

Tabela 1. Efeito da adubação e da inoculação com bactérias solubilizadoras de fosfato sobre

a colonização por fungos micorrízicos arbusculares em Jacaranda copaia
Tratamentos Colonização Vesículas
(%) (N/100 seg de
raiz)
Testemunha 64,2 a 37 a
25 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) 49,9 a 249 a
-1
50 kg.ha de P2O5 (SFT) 35,5 a 85 a
Testemunha + BSF 53,6 a 44 a
-1
25 kg.ha de P2O5 (SFT) + BSF 50,7 a 57 a
-1
50 kg.ha de P2O5 (SFT) + BSF 50,0 a 469 a
25 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais 45,7 a 62 a
-1
50 kg.ha de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais 22,3 a 87 a
-1
25 kg.ha de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais + BSF 38,0 a 3a

204
 50 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais + BSF 24,3 a 0a
-1
50 kg.ha de P2O5 (FR) 56,5 a 209 a
-1
50 kg.ha de P2O5 (FR) + BSF 41,0 a 12 a
50 kg.ha-1 de P2O5 (FR) + Nutrientes adicionais + BSF 36,8 a 0,0 a
Coeficiente de Variação (%) 35,0 84,0

Obs: Médias na mesma coluna seguidas por letras iguais, não diferem entre si a 5% de
probabilidade pelo teste de Tukey. Análise de variância realizada com valores corrigidos pela
fórmula x + 0,5

Verificou-se que o pH do solo não se correlacionou significativamente com

a colonização micorrízica (P=0,13; R=0,16) (Tabela 2). Guzman-Plazola et al.
(1988) e Begum et al. (2019) citam que a acidez do solo pode não afetar a
associação micorrízica ou até mesmo proporcionar efeitos positivos desde que
o fungo esteja adaptado a este ambiente.
O fósforo solúvel presente no solo não afetou a colonização micorrízica
(P=0,11; R=0,17) (Tabela 2). Em concentrações consideradas ótimas para a
planta hospedeira não foram verificados efeitos fungistáticos ou fungicidas sobre
os propágulos do fungo na rizosfera (Siqueira e Franco 1988). Carneiro et al.
(1996) verificaram que, em plantas inoculadas com fungos micorrízicos, a
aplicação de 20 miligramas de fósforo por quilograma de solo não influenciou a
colonização nas espécies florestais estudadas.

Tabela 2. Efeito do fósforo solúvel e pH do solo sobre a colonização micorrízica em Jacaranda

copaia.
Correlações Equações R P
Hifas X P solúvel (P) Hifas = 55,54 – 2,56P 0,17ns 0,11
Hifas X pH Hifas = 155,1 – 27,9 pH 0,16ns 0,13
ns: não significativo

A colonização micorrízica não foi determinante para o crescimento em

altura (P=0,202; R=0,14), diâmetro (P=0,64; R=0,05) e matéria seca (P=0,74;
R=0,036) (Tabela 3). Não se verificou, também, correlação significativa entre a
presença do fungo e a absorção de P, Ca, K, Mg, Zn e Mn (Tabela 4).

Tabela 3. Relações entre colonização micorrízica e altura, diâmetro e peso da matéria seca
de Jacaranda copaia.
Correlações Equações R P
Altura X Hifas (H) Altura = 21,86 + 0,03H 0,14ns 0,202
Diâmetro X Hifas (H) Diâmetro = 4,84 - 0,002H 0,05ns 0,64
Peso da matéria seca (PMS) X Hifas (H) PMS=2,75 + 0,002H 0,036ns 0,74

205
 ns: não significativo

Tabela 4. Relações entre os nutrientes presentes no tecido foliar de J. copaia e a colonização

micorrízica em suas raízes.
Correlações Equações R P
Fósforo no tecido foliar (P) X Hifas (H) P=0,85 – 0,0005 H 0,04ns 0,67
Cálcio no tecido foliar (Ca) X Hifas (H) Ca=3,88 – 0,004 H 0,11ns 0,32
Magnésio no tecido foliar (Mg) X Hifas (H) Mg=2,17 – 0,004 H 0,13ns 0,22
Potássio no tecido foliar (K) X Hifas (H) K=5,38 – 0,01 H 0,10ns 0,33
Zinco no tecido foliar (Zn) X Hifas (H) Zn=44,98 - 0,22 H 0,15ns 0,17
Manganês no tecido foliar (Mn) X Hifas (H) Mn=35,38 + 0,07 H 0,09ns 0,37
ns: não significativo

As vesículas são estruturas formadas nas hifas fúngicas e consistem em

protuberâncias que ocorrem na parte terminal da hifa; esta estrutura pode se
localizar na parte mediana do córtex ou fora dele (Begum et al. 2019).
Foi encontrada correlação significativa entre hifas e vesículas fúngicas (P=0,001;
R=0,35) (Tabela 5). Isto pode ser um indício de que existiu uma simbiose bem
estabelecida, uma vez que o aumento no número de hifas foi seguido de
modificações morfológicas (vesículas) que só existiriam em condições de intensa
atividade fisiológica (Gerdemann 1968).
De um modo geral, foram observadas muitas vesículas em 100
segmentos de raiz (maior valor encontrado foi de 469 no tratamento com 50
kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + BSF) (Figura 2 a, b e c). Gerdemann (1968) menciona
que as vesículas podem se tornar tão abundantes em tecido cortical velho que a
raiz se torna distorcida e o tecido radicular pode ser parcialmente destruído.
O grande coeficiente de variação observado para número de vesículas
(84%) pode ter sido provocado por fatores de natureza genética da planta e do
fungo (Tabela 1). Desta forma, não foi encontrada diferença significativa entre os
tratamentos para esta variável.

206
 Figura 2. Vesículas fúngicas no interior do córtex radicular de J.copaia. (A) Vesículas
deformando um fragmento de raiz. Aumento de 100 vezes; (B) Numerosas vesículas no
interior do córtex radicular. Aumento de 100 vezes. (C) Vesícula em aumento de 400 vezes

Tabela 5. Relação entre percentagem de hifas e número de vesículas em Jacaranda copaia.

Correlações Equações R P
Vesículas (V) X Hifas (H) V = - 82,64 + 4,67H 0,35** 0,001
** significativo ao nível de 1% de probabilidade

Em Jacaranda copaia, o número de vesículas (Figura 2) foi

significativamente correlacionado com a altura (P=0,0006; R=0,37), diâmetro
(P=0,003; R=0,31) e matéria seca (P=0,004; R=0,31). Isto pode significar que estas
estruturas têm um importante papel para o desenvolvimento da espécie,
principalmente em solos de baixa fertilidade, uma vez que, segundo Begum et al.
(2019), estas estruturas desempenham papel de reserva e estão presentes
principalmente nas regiões mais velhas da infecção. Pode-se inferir, desta forma,
que a presença das vesículas estaria garantindo à espécie uma reserva nutricional
além daquela obtida diretamente do solo. Siqueira e Franco (1988) mencionam que
a armazenagem temporária de nutrientes na biomassa fúngica evita sua
imobilização química ou biológica e lixiviação.

Conclusões
A adubação fosfatada adotada neste trabalho (25 e 50 kg.ha-1 P2O5 ) não
teve caráter inibitório à micorrização da espécie.
A percentagem de colonização micorrízica em mudas de caroba, sob as
condições de edáficas adotadas neste trabalho, variou entre 22,3% e 64,2%.

207
 Agradecimentos
À FAPEAM, CAPES e CNPq pelos auxílios financeiros e, ao INPA, por
todo o suporte de infraestrutura para a execução dessa pesquisa.

Referências
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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Efeito da adubação e inoculação com bactérias solubilizadoras

de fosfato na colonização micorrízica da castanheira de
macaco (Cariniana micrantha)

Rodrigues, Elen Carla Pereira de Goes1; Moreira, Francisco Wesen1; Minelli-Oliveira,

Cassiane 1; Oliveira, Luiz Antonio de1

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Email:[email protected]

Resumo
A castanheira de macaco (Cariniana micrantha) é uma árvore de porte alto, cuja
madeira é utilizada em marcenaria, caixotaria, canoas, remos e cabos de
ferramentas. A produção de mudas em viveiro pode ser favorecida com
adubação com macronutrientes e se associadas com inoculação de
microrganismos benéficos, principalmente com bactérias solubilizadoras de
fosfato e fungos micorrízicos arbusculares. O presente trabalho teve como
finalidade, avaliar o efeito da adubação e inoculação com bactérias
solubilizadoras de fosfato, nas ocorrências de fungos micorrízicos arbusculares
em mudas de castanheira de macaco. O trabalho foi realizado em condições de
casa-de- vegetação usando saquinhos contendo 2 kg de solo classificado como
Argissolo no material e método está Podzólico. Constatou-se que a adubação
fosfatada (25 e 50 kg ha-1 de P2O5 ) não inibiu a micorrização so sistema
radicular da espécie. A percentagem de colonização micorrízica em mudas de
castanheira de macaco, sob as condições edáficas adotadas, variou entre 3,4 %
e 31, 8%. Houve correlação entre a micorrização do sistema radicular da
castanheira de macaco e o peso de matéria seca.

Palavras-Chave: Fungos micorrízicos arbusculares; Argissolo da Amazônia;

associação plantas-microrganismos

Introdução
A castanheira de macaco (Cariniana micrantha Ducke), pertencente à
família Lecythidaceae, caracteriza-se por ser uma árvore que ultrapassa 50 M de
altura (Loureiro et al. 1979). Possui madeira dura e muito utilizada em marcenaria,
caixotaria, canoas, remos e cabos de ferramentas (Le Cointe1934; Loureiro et
al. 1979 e Cruz 2006).
O estudo da nutrição mineral da castanheira de macaco é uma alternativa

210
para fomentar o seu cultivo em viveiro, melhorando a qualidade das mudas
produzidas. Além da adubação tradicional, a utilização de associações
simbióticas entre plantas e microrganismos pode ser uma alternativa viável para
melhorar a qualidade das mudas e reduzir a sua permanência em viveiro,
minimizando os gastos.
Dentre os microrganismos habitantes do solo benéficos às
plantas,destacam-se as bactérias solubilizadoras de fosfato (Chagas Jr et al.
2010; Silva et al. 2011), que desempenham importante papel na disponibilização
de formas inorgânicas de fosfatos (Ca-P, Al-P e Fe-P), aumentando o teor de
fósforo na solução do solo, propiciando melhor crescimento e maior rendimento
das culturas (Silva Filho e Vidor 2000).
Outra importante associação é com fungos micorrízicos arbusculares,
cuja simbiose envolve o sistema radicular da planta, as estruturas fúngicas nas
células da raiz e o micélio externo no solo, que pode ser bastante extenso em
algumas condições (Harley e Smith 1983). Essa simbiose aumenta a superfície
de absorção das raízes, facilitando a absorção dos elementos minerais do meio
em que se encontram (Paiva e Gomes 1995).
O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da adubação com e sem a
inoculação de bactérias solubilizadoras de fosfato (BSF) na ocorrência de fungos
micorrízicos nas raízes de mudas da castanha de macaco.

Material e Métodos
O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação localizada no
Campus III do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus,
Amazonas. As plântulas da castanha de macaco, após atingirem
aproximadamente 5 cm de altura em sementeira, foram transplantadas para
sacos de plástico de 2 kg. Os sacos foram preenchidos com solo classificado
como Podzólico, proveniente de uma pequena propriedade, localizada na
Comunidade do Brasileirinho, zona rural de Manaus. Cada saco plástico continha
uma planta, consistindo em uma unidade amostral.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado
constituindo-se de treze tratamentos com quinze repetições.
Os tratamentos aplicados foram:
T1- Testemunha

211
T2- 25 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo
T3- 50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo
T4- Testemunha + BSF
T5- 25 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo + BSF
T6- 50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo + BSF
T7- 25 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo + Ca + Mg + K+ N
T8- 50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo + Ca + Mg + K+ N
T9- 25 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo + Ca + Mg + K+ N+ BSF
T10- 50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de super fosfato triplo+ Ca + Mg + K+ N+ BSF
T11- 50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de fosfato de rocha
T12- 50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de fosfato de rocha + BSF
T13- 50 kg.ha-1 de P2O5 na forma de fosfato de rocha+ Ca + Mg + K+ N+ BSF
As doses de cálcio, magnésio, potássio e nitrogênio aplicadas foram
respectivamente: 5 cmolc.kg-1, 2 cmolc.kg-1, 100 mg.kg-1 e 200 kg.ha-1. O fosfato
de rocha utilizado foi o de Araxá, com concentração de 24% de P2O5.
As fontes de cálcio, magnésio, potássio e nitrogênio utilizadas foram
respectivamente: sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, cloreto de potássio e
uréia.
A quantidade total de nitrogênio e de potássio foi dividida em três partes
e aplicadas no primeiro, no trigésimo e no nonagésimo dia. Os demais nutrientes
foram aplicados de uma só vez, no início do experimento.
Foram inoculadas, logo após o transplante, quatro bactérias
solubilizadoras de fosfato (BSF), sendo elas: P317, P295, P291 e AB16, todas
provenientes da coleção do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de
Microrganismos da Amazônia (COTEI/INPA). Estas bactérias foram previamente
testadas quanto a sua capacidade de solubilização por Chagas Júnior et al.
(2010).
As bactérias foram inicialmente repicadas para placas de Petri com meio
de cultura composto de 10 g de glicose; 2 g de extrato de levedura; 0,2 g de
CaCl2; 0,5 g de KH2PO4; 0,2 g de MgSO4; 15 g de agar e 1000 mL de água.
Nestas placas permaneceram por três dias para que houvesse o crescimento
das colônias. Depois deste prazo, as bactérias foram raspadas de suas
respectivas placas e cada estirpe transferida para um erlenmeyer diferente

212
 contendo 100 mL de meio líquido, cuja constituição era similar ao meio utilizado
nas placas de Petri, exceto pelo fato de não conter agar.
Os erlenmeyers contendo a solução de meio líquido e bactérias ficaram
em agitação por 48 horas. Posteriormente, o conteúdo de cada erlenmeyer foi
misturado a 20 litros de solução salina de NaCl a 0,2%. Em cada planta foram
aplicados 50 mL desta solução.
Para se determinar o número de células bacterianas inoculadas em cada
planta foi feita uma diluição da solução inoculante (106 vezes), fazendo-se,
depois, a repicagem para placas de Petri com meio de cultura sólido de
constituição já citada. Depois de 72 as colônias crescidas foram contadas e foi
efetuado o cálculo do número de bactérias inoculadas por grama de solo,
segundo a fórmula:
Número de bactérias/grama de solo = (número de colônias crescidas X diluição) X 50
2000
Mediantes os cálculos realizados verificou-se que o total de células
inoculadas foram 6,25 X 105 por grama de solo.

Resultados e Discussão
A percentagem de colonização variou de 3,4 % (tratamento 25 kg ha-1 de
P2O5 (SFT) + nutrientes adicionais) a 31,7% (tratamento 50 kg ha-1 de P2O5
(FR)). A média obtida no tratamento controle foi de 16,0%, não diferindo dos
demais tratamentos (Tabela 1) . Esta percentagem confirma os dados obtidos
por Moreira et al. (1997) que encontraram, para esta espécie, 20,8 % de
colonização em raízes grossas (entre 0,5 mm e 2,0 mm de diâmetro) e 23,3% de
colonização em raízes finas (menos que 0,5 mm de diâmetro).

Tabela 1: Efeito da adubação e da inoculação com bactérias solubilizadoras de fosfato sobre

a colonização por fungos micorrízicos arbusculares em Cariniana micrantha
Vesículas
Colonização
Tratamentos (N/100 seg de
(%)
raiz)
Testemunha 16,0 ab 0a
25 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) 19,4 ab 0a
50 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) 6,5 ab 0a
Testemunha + BSF 16,6 ab 0,3 a

213
25 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + BSF 7,4 ab 0a
50 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + BSF 24,9 ab 0,3 a
25 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais 3,4 b 0a
50 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais 11,0 ab 0a
25 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais + BSF 5,1 b 0a
50 kg.ha-1 de P2O5 (SFT) + Nutrientes adicionais + BSF 6,2 ab 0a
50 kg.ha-1 de P2O5 (FR) 31,7 a 0,5 a
50 kg.ha-1 de P2O5 (FR) + BSF 5,7 b 0a
50 kg.ha-1 de P2O5 (FR) + Nutrientes adicionais + BSF 4,7 b 0a
Coeficiente de Variação (%) 63,0 53,0
Obs: Médias na mesma coluna seguidas por letras iguais, não diferem entre si a 5% de
probabilidade
pelo teste de Tukey. Análise de variância realizada com valores transformados em x + 0,5

A percentagem de colonização ocorrida na castanheira de macaco pode

ser considerada relativamente baixa (Figura 1). St. John (1980) e Moreira et al.
(1997) relatam que, de modo geral, a família Lecytidaceae apresenta baixos
índices de colonização micorrízica. A explicação provavelmente está associada
aà anatomia da raiz; característica marcante no sistema radicular de C. micrantha
com abundância de pelos (Figura 2). Segundo Harley e Smith (1983), em alguns
casos, a colonização micorrízica está relacionada à morfologia da raiz e a
produção de pelos radiculares pelo hospedeiro. Baylis (1975) cita que plantas
com ramificações delgadas e longas, além de numerosos pelos radiculares são
menos suscetíveis à simbiose.
O tratamento com 50 kg ha-1 de P2O5 (FR) (31,75 %) diferiu
significativamente dos tratamentos com 50 kg ha-1 de P2O5 (FR) + BSF (5,75 %),
25 kg ha-1 de P2O5 (SFT) + nutrientes adicionais + BSF (5,14%), 50 kg ha-1 de
P2O5 (FR) + nutrientes adicionais + BSF (4,75%) e 25 kg ha-1 de P2O5 (SFT) +
nutrientes adicionais (3,4%) (Tabela 1). Os tratamentos com nutrientes
adicionais apresentaram porcentagem de micorrização mais baixa,
provavelmente em virtude da adubação nitrogenada. Segundo Dommergues e
Krupa (1978) e Siqueira e Franco (1988), a micorrização geralmente é inibida em
solos com concentrações elevadas de nutrientes, principalmente fósforo e
nitrogênio.

214
 Não houve influência do fungo sobre a absorção de fósforo, cálcio,
magnésio, potássio, zinco e manganês (Tabela 2), indicando que nessa fase de
crescimento as mudas não dependem dessa associação.
O tratamento com 50 kg ha-1 de P2O5 (FR) (31,75 %) diferiu
significativamente dos tratamentos com 50 kg ha-1 de P2O5 (FR) + BSF (5,75 %),
25 kg ha-1 de P2O5 (SFT) + nutrientes adicionais + BSF (5,14%), 50 kg ha-1 de
P2O5 (FR) + nutrientes adicionais + BSF (4,75%) e 25 kg ha-1 de P2O5 (SFT) +
nutrientes adicionais (3,4%) (Tabela 1). Os tratamentos com nutrientes
adicionais apresentaram porcentagem de micorrização mais baixa,
provavelmente em virtude da adubação nitrogenada. Segundo Dommergues e
Krupa (1978) e Siqueira e Franco (1988), a micorrização geralmente é inibida em
solos com concentrações elevadas de nutrientes, principalmente fósforo e
nitrogênio.
Não houve influência do fungo sobre a absorção de fósforo, cálcio,
magnésio, potássio, zinco e manganês (Tabela 2), indicando que nessa fase de
crescimento as mudas não dependem dessa associação.
Tabela 2: Relações entre os nutrientes presentes no tecido foliar e a colonização micorrízica
em Cariniana micrantha.
Correlações Equações R P
Fósforo X Hifas (H) P=1,73 - 0,0014 H 0,04ns 0,66
Cálcio X Hifas (H) Ca=6,21 - 0,00036 H 0,0026ns 0,98
Magnésio X Hifas (H) Mg=3,10 - 0,015 H 0,21ns 0,06
Potássio X Hifas (H) K=7,84 - 0,018 H 0,07ns 0,48
Zinco X Hifas (H) Zn=33,2 + 0,16 H 0,10ns 0,35
Manganês X Hifas (H) Mn=62,64 - 0,073 H 0,05ns 0,63
ns: não significativo

O número de vesículas foi positivamente correlacionado com a

percentagem de hifas (P=0,03; R=0,23) (Tabela 3). Segundo Harley e Smith
(1983), estas estruturas estão presentes principalmente nas regiões mais velhas
infectadas. Desta forma, é possível que quanto é maior a percentagem de hifas,
mais velha é a colonização e por conseguinte, maior o número de vesículas.

215
Tabela 3: Relação entre percentagem de hifas e número de vesículas fúngicas encontradas
em Cariniana micrantha.
Correlações Equações R P
Vesículas (V) X Hifas (H) V = 0,018 + 0,005H 0,23* 0,03
* significativo ao nível de 5% de probabilidade.

Conclusões
A adubação fosfatada adotada neste trabalho (25 e 50 kg ha-1 P2O5 ) não
inibiu a micorrização das raízes da castanheira de macaco. A percentagem de
colonização micorrízica em mudas de C. micrantha, sob as condições edáficas
adotadas neste trabalho, variou entre 3,4 % e 31,8 %. As hifas dos fungos
micorrízicos não influenciaram nas absorções de P, Ca, Mg, K, Zn e Mn pelas
plantas.

Agradecimentos
À FAPEAM, CAPES e CNPq pelos auxílios financeiros e, ao INPA, por
todo o suporte de infraestrutura para a execução dessa pesquisa.

Referências
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Eficiência de bactérias endofíticas de milho, solubilizadoras de

fosfato de ferro III (FePO4) in vitro

Batista, Fernanda de Cássia1; Rodrigues, Victor Alef1; Souza, Fabiane Ferreira2;

Bini, Daniel2; Oliveira, Maycon Campos2; Marriel, Ivanildo Evódio2; Paiva,
Christiane Abreu Oliveira2

1Universidade Federal de São João del-Rei, 2Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária.
E-mail: [email protected]

Resumo
Os microrganismos solubilizadores de fosfato (MSF), que convertem fósforo (P)
inorgânico e orgânico em formas disponíveis de P, desempenham um papel
importante na ciclagem de P no solo e na nutrição das plantas. Dentre os
principais mecanismos envolvidos neste processo, destaca-se a produção de
ácidos e consequente redução do pH do meio. O objetivo deste trabalho foi
selecionar bactérias endofíticas de milho eficientes na, solubilização de fosfato
de ferro III (FePO4) in vitro. Foram testadas 15 bactérias pertencentes à Coleção
de Microrganismos da Embrapa Milho e Sorgo, pré-selecionadas para
solubilização de fosfato de cálcio. Os microrganismos foram reativados em ágar
batata dextrose (28 ºC/5 dias) e cultivados em caldo nutriente (28 ºC/3 dias).
Alíquotas de cada cultura, ajustadas para uma densidade ótica igual a 1,0 a 540
nm, foram transferidas para meio de cultivo líquido estéril, contendo FePO4 como
única fonte de P e pH 7,5 (28 ºC/10 dias). Posteriormente, as culturas foram
centrifugadas, seguido da determinação do pH e teores de P disponível.
Observaram-se diferenças significativas (p<0,05) entre as estirpes em relação à
capacidade de solubilização de P e alteração de pH no meio, com interação
significativa negativa (r=-0,6). As estirpes B1931 (Pantoea ananatis) e B2093
(Enterobacter bugande) apresentaram maior (47,06 mg L-1) e menor (8,09 mg L-
1
) liberação de P no meio, respectivamente. As estirpes B1931, B2096, B1934 e
B1923 foram as mais eficientes na solubilização de P, equivalente a 11,49%,
11,04%, 9,71% e 5,67%, respectivamente. A maior acidificação do meio de
cultura ocorreu na presença na estirpe B1923 (Klebsiella variicola) com valor de
pH igual a 2,84. Concluiu-se que as estirpes P. ananatis B1931, B2096 e B1934
apresentam características promissoras de solubilização de FePO4, associadas,
principalmente, à acidificação do meio de cultura.

Palavras-chave: Biossolubilização; Fósforo; Microrganismos; Endofíticos

Introdução
Alguns macro e micronutrientes na solução do solo apresentam-se em
formas indisponíveis para as plantas, ocasionando déficit nutricional. Para tanto,
a reposição de nutrientes nos solos ácidos e com baixa fertilidade, como é o caso
do Cerrado brasileiro, é realizada com a aplicação de elevadas quantidades de

218
fertilizantes, como os fosfatados (Batista et al. 2018), que reconhecidamente
elevam a produtividade das culturas. Segundo GlobalFert (2022), atualmente o
Brasil consume aproximadamente 61% dos fertilizantes somente nas culturas de
milho e soja. Contudo, a dependência externa de fertilizantes fosfatados
sintéticos preocupa os agricultores e a sociedade em geral, visto que as reservas
de fósforo (P) no mundo mostram possível escassez nos próximos 100 anos
(Vegro 2018; Gilbert 2009; Santos et al. 2021).
O P é o segundo elemento mineral crítico na agricultura, que apesar de
estar presente em grande abundância na natureza, é considerado um elemento
quase imóvel no solo (Hinsinger 2001; Kalayu 2019). O P pode ser encontrado
no solo na forma orgânica, como ácidos nucleicos, fosfato inositol (fitato) e
fosfolipídios; e na forma inorgânica, como os minerais primários, ou na forma de
compostos como H3PO4, H2PO4 -, HPO4 2-, PO4 3-, que variam de acordo com o
pH do solo. Do total de P presente nos solos brasileiros, uma pequena fração
está presente na forma fosfatos, sendo denominada P disponível para as plantas
(Vance et al. 2003). Devido a fixação ou adsorção de P nos solos com alto grau
de intemperismo e com elevados teores de óxidos de ferro (Fe2O3) e alumínio
(Al2O3) (Hinsinger 2001; Barroso e Nahas 2008; Vieira 2021; Yahya et al. 2021),
como ocorre na maioria dos solos brasileiros (Abreu 2014; Oliveira et al. 2009),
a disponibilidade de P para as plantas diminui, impactando negativamente o
desenvolvimento vegetal.
A fertilidade dos solos de clima tropical é considerada baixa, e isso é
normal devido aos teores reduzidos de P. Portanto, a adubação mineral
fosfatada permite explorar melhor o potencial produtivo da planta de milho,
aumentando a produtividade, uma vez que o P está envolvido em processos
essenciais como na fotossíntese, respiração, armazenamento e transferência de
energia, além de contribuir para na qualidade do grão de milho (Hinsinger 2001;
Kour et al. 2021). Porém, existem problemas no uso dos fertilizantes, tanto em
questão de eficiência quanto em questões ambientais. Santos et al. (2021)
relataram que 70% das aplicações de adubação fosfatada são perdidas pela
fixação de P e consequentemente, se tornam indisponíveis aos vegetais (Ribeiro
2018; Gomes et al. 2011), encarecendo a produção, pois mais P deve ser
aplicado. Além disso, o P e o nitrogênio têm gerado grande preocupação por
parte dos ambientalistas, devido as perdas por escoamento superficial, que

219
contamina os leitos aquíferos, podendo ocasionar o crescimento excessivo das
algas planctônicas, gerando o fenômeno conhecido como eutrofização (Wiegand
et al. 2016). Por isso, vários estudos visam o desenvolvimento de alternativas
complementares ou novas tecnologias de fertilização para que a agricultura
continue crescendo e produzindo com qualidade e de maneira sustentável (Dos
Santos e Varavalho 2011; GlobalFert 2021).
Uma das alternativas consiste no uso de microrganismos capazes de
incrementar a disponibilidade e absorção de P pelas plantas, a partir de fosfatos
em formas insolúveis no solo (Velloso 2019; Oliveira et al. 2009; Vieira Velloso
et al. 2020). Neste caso, vários grupos de microrganismos têm sido isolados e
avaliados quanto ao seu potencial para aproveitamento de fontes de baixa
solubilidade de P e sua disponibilização para as plantas (Batista et al. 2018;
Garcia-Lopez et al. 2016), visando minimizar o uso de fertilizantes fosfatados, os
custos de produção e os impactos ambientais (Garcia-Lopez et al. 2016; Batista
et al. 2018; Santos et al. 2021).
Os microrganismos solubilizadores de fosfato desempenham papel
importante nas principais etapas do ciclo do P no solo, como a dissolução-
precipitação, mineralização-imobilização e sorção-dessorção que promove o
crescimento das plantas. De modo geral, os mecanismos utilizados pelos
microrganismos transformam P inorgânico e P orgânico insolúveis, em formas
de P solúvel e regulam a ciclagem biogeoquímica do P nos agroecossistemas
(Penn e Camberato 2019). Esses mecanismos, como liberação de ácidos
orgânicos, extrusão de prótons H+ e produção de sideróforos, são capazes de
disponibilizar o P completaxado a Ca, Fe e Al no solo (Richardson e Simpsons
2011; Vassilev et al. 2014).
Dentre as principais espécies de bactérias solubilizadores de fosfatos
(BSF), destacam-se Bacillus pumilus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. megaterium,
Enterobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Burkholderia gladioli, Pantoea
ananatis, Pseudomonas sp., Serratia marcescens (Rodríguez e Fraga 1999;
Abreu 2014; Varma et al. 2017).
O uso combinado de fosfatos de rocha e BSF é considerada uma
estratégia sustentável em termos econômicos e ambientais (Richardson 2001;
Gomes et al. 2014; Rodríguez González et al. 2020), proporcionando ganhos de

220
produtividade, economia de investimentos e incremento da renda dos
agricultores.
Além disso, MSF podem auxiliar indiretamente na indução de resistência
sistêmica em plantas à patógenos e diretamente produzindo compostos que
inibem o crescimento de fungos e bactérias fitopatogênicas (Rodríguez et al.
2020). Esse conjunto de atividades demonstram o potencial desses
microrganismos como alternativas eficazes para uma agricultura sustentável,
ecologicamente correta e lucrativa (Rodríguez et al. 2020; Rizvi et al. 2017).
O objetivo desse trabalho foi selecionar bactérias endofíticas de milho
eficientes na solubilização de fosfato de ferro III (FePO4) in vitro, visando obter
isolados eficientes para utilização como inoculantes na agricultura.

Material e Métodos
Nesse estudo, foram avaliadas 15 bactérias endofíticas pertencentes à
Coleção de Microrganismo Multifuncionais e Fitopatogênicos da Embrapa Milho
e Sorgo, previamente caracterizadas como eficientes na solubilização de fosfato
de cálcio (Oliveira et al. 2009; De Abreu et al. 2017. As estirpes foram: Pantoea
dispersa (B1912); Pantoea ananatis (B1934, B1935, B1931, B2096);
Enterobacter bugande (B2093); E. asburiae (B2010, B2100, B2099, B2111,
B1928). E. cancerogenus (B1917); Rhizobium pusense (B2109); klebsiella
variicola (B1923); Klebsiella pneumoniae (B1924).
Os microrganismos foram reativados em meio BDA (Batata 200 g L-1;
Dextrose, 20 g L-1 e Ágar, 15 g L-1) empregando-se o método de estrias para
obtenção de colônias puras e em seguida, foram incubadas a 25 - 28 ºC durante
cinco dias com três repetições. Colônias isoladas foram inoculadas em caldo
nutriente, cultivadas durante três dias, a 28 ± 2 ºC e sob agitação constante de
150 rpm. Após esse período, a turbidez de cada cultura foi ajustada para uma
unidade de densidade óptica a 540 nm, correspondendo a 108 células mL-1.
Para avaliação da eficiência de solubilização de fosfato de ferro III
(FePO4), foi utilizado o meio líquido MS para solubilização (Nahas et al. 1994;
Barroso e Nahas 2005). Esse meio, contém NaCl 0,1 g L-1; NH4Cl 1,0 g L-1; KCl
0,2 g L-1; CaCl2.2H2O 0,1 g L-1; MgSO4.7H2O 1,2 g L-1; glicose 10,0 g L-1; extrato
de levedura 0,5 g L-1. Foram utilizados 40 mL de meio de cultivo distribuídos em
erlenmeyer de 125 mL contendo 2,0 g L-1 de fosfato de ferro III como única fonte

221
de P. Posteriormente, o meio foi autoclavado por 15 minutos a 121 ºC, o pH foi
ajustado para 7,5 com hidróxido de sódio (NaOH) 1 M estéril. Em seguida,
alíquotas de 200 μL de cada suspensão de células foram inoculadas em triplicata
nesse meio de cultura e incubadas durante 10 dias, sob agitação constante de
130 rpm, à temperatura de 28 ± 2 ºC. Em seguida, as culturas foram
centrifugadas por 10 minutos a 8.000 rpm e o sobrenadante filtrado em um papel
de filtro Whatman nº42.
Para determinar o P solubilizado foi aplicado o método colorimétrico de
Murphy e Riley (1962) em espectrofotômetro com o comprimento de onda de
880 nm, subtraindo-se o P solúvel contido nas amostras que foram incubadas
pelo valor de P contido na amostra controle (meio de cultura com P-Fe sem
inoculação) e utilizando-se uma curva padrão com fosfato de potássio
monobásico (KH2PO4) para quantificação do P em mg L-1. O pH foi determinado
no restante do filtrado de todas as amostras, incluindo os controles. Todos os
materiais utilizados nas medições foram previamente lavados com ácido
clorídrico 10 % (v/v), para remover qualquer resíduo de P potencial na vidraria.

Resultados e Discussão
Houve diferença significativa entre as estirpes testadas quanto a liberação
do P e pH (Tabela 1). Dentre as estirpes avaliadas, E. bugande B2093 e P.
ananatis B1931 apresentaram menor liberação de P (8,09 mg L-1) e maior
liberação de P (49,02 mg L-1), respectivamente.
As estirpes de P. ananatis B1931 e P. ananatis B2096 foram as mais
eficientes na solubilização de P com valores de 11,49 % e 11,04 % em relação
ao P total aplicado no meio de cultura, respectivamente, seguidas por P. ananatis
B1934 e Klebsiella variicola B1923 com 9,71 % e 5,67 %, respectivamente
(Tabela 1).
Houve diferenças significativas nos valores de pH com o uso de diferentes
estirpes. De modo geral, todas apresentaram redução do pH no meio de cultura,
com algumas estirpes apresentando valores de pH próximos a 2,84 para estirpe
K. variicola B1923 e 2,90 para estirpes P. ananatis B1931 e P. dispersa B1912.
Os dados revelaram uma correlação significativamente moderada e negativa (r=
-0,6) entre a solubilização de P e os valores de pH no meio de cultura para os
microrganismos testados.

222
Tabela 1- Solubilização de fosfato de ferro III (P-Fe) (mg L-1 e %) e pH final do meio de
cultura líquido inoculado com diferentes estirpes bacterianas crescidas por 10 dias.

P-Fe
Estirpes Identificação pH
(mg L-1) %
- Controle 0,002 ± 0,09 0,04 5,71 ± 0,02 l
B1931 Pantoea ananatis 47,06 ± 1,83 a 11,49 2,90 ± 0,01 b
B2096 Pantoea ananatis 45,24 ± 6,48 a 11,04 3,23 ± 0,02 f
B1934 Pantoea ananatis 39,77 ± 2,21 b 9,71 2,97 ± 0,01 c
B1923 Klebsiella variicola 23,24 ± 1,08 c 5,67 2,84 ± 0,01 a
B2010 Enterobacter asburiae 21,98 ± 0,59 c 5,36 3,38 ± 0,00 g
B1935 Pantoea ananatis 21,87 ± 0,15 c 5,34 3,03 ± 0,02 d
B1928 Enterobacter asburiae 21,33 ± 1,93 c 5,21 3,14 ± 0,01 e
B1924 Klebsiella pneumoniae 20,24 ± 0,36 c 4,94 3,52 ± 0,01 i
B1917 Enterobacter cancerogenus 20,11 ± 1,47 c 4,91 3,19 ± 0,00 f
B2111 Enterobacter asburiae 15,94 ± 0,88 d 3,89 3,47 ± 0,03 i
B2099 Enterobacter asburiae 15,27 ± 0,53 d 3,73 3,45 ± 0,01 h
B2100 Enterobacter asburiae 14,45 ± 0,26 d 3,53 3,50 ± 0,02 i
B2109 Rhizobium pusense 9,38 ± 0,61 e 2,29 3,98 ± 0,03 j
B1912 Pantoea dispersa 8,43 ± 0,93 e 2,04 2,90 ± 0,02 b
B2093 Enterobacter bugande 8,09 ± 0,30 e 1,97 3,43 ± 0,01 h
Resultados expressos a partir da média de triplicatas ± erro padrão das médias. Resultados
seguidos de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste Scott-Knott
5%. A porcentagem (%) da solubilização do P-Fe, foi calculado em relação a quantidade de
fósforo total aplicado no meio de cultura

A busca por produtos biotecnológicos à base de microrganismos que

possam aumentar o uso eficiente dos nutrientes, principalmente o P, surge como
alternativa para obtenção de uma agricultura moderna com sustentabilidade e
segurança alimentar (Oliveira-Paiva et al. 2021). Vários estudos relacionados à
microbiologia dos solos, estimatimam que 50 % das bactérias têm potencial em
solubilizar fosfato (Kafle et al. 2019; Sharma et al. 2013). Em nosso estudo, as
estirpes de P. ananatis e K. variicola foram as mais eficientes para solubilização
de fosfato férrico.
Considerando-se que o FePo4 é uma das formas de fosfato mais
prevalecente em solos tropicais e subtropicais, essas estirpes têm potencial para
formulação de inoculantes visando melhorar a produtividade da cultura do milho.
Contudo, vários estudos têm demonstrado que a disponibilidade de P no solo é
feita principalmente por microrganismos que possuem alta afinidade por rochas
fosfáticas na ordem Ca-P>Al-P>Fe-P (Barroso e Nahas 2005; Chai et al. 2011;
Marra 2011; Ribeiro 2018). Assim, o FePO4 não é a fonte mais facilmente

223
acessível pelos microrganismos. Isso deve ocorrer devido às formas distintas
dos microrganismos atuarem nos fosfatos, sendo que as fontes de FePO4 são
menos utilizadas que outras fontes. Segundo Marra (2011), duas cepas de
leguminosas nodulante foram capazes de solubilizar o fosfato de ferro III e o
fosfato de cálcio. No presente estudo, a capacidade das estirpes B1931, B1934
e B2096 em solubilizar P-Fe é bastante relevante, pois essas estirpes poderão
ser exploradas futuramente para produção de inoculantes.
Xu et al. (2019) e Yahya et al. (2021) demonstraram que a espécie P.
ananatis se destacou na solubilização do fosfato in vitro, usando meio NBRIP
enriquecido com rocha fosfática. Neste trabalho, as estirpes B. pumilus e B.
subtilis, embora com valores inferiores àqueles encontrados para P. ananatis,
também se destacaram na liberação de P, o que corroboram com estudos de
Ribeiro (2018), que encontraram maiores valores de solubilização de P para
estirpes de Bacillus sp. Examinando o ensaio quantitativo na solubilização de
fosfato de ferro III, na medida em que a cultura prosseguia, ocorreu
concomitantemente a diminuição do pH inicial (de 7,5 até 2,84) e elevação dos
valores de P liberado no meio de cultura (Tabela 1). Com relação à redução do
pH do meio, ela ocorreu muito provavelmente porque as bactérias
solubilizadoras de P secretam ácidos que degradam fontes insolúveis de P
(Chouyia et al. 2020; Penn e Camberato 2019).
Xu et al. (2019) observaram queda significativa no pH do meio com rocha
fosfática após oito dias de inoculação. Em Sousa (2010) relatou que a
acidificação através da secreção de ácidos orgânicos no meio constitui a etapa
inicial do processo de solubilização dos fosfatos.

Conclusões
Os resultados indicam que as estirpes de bactérias P. ananatis B1931,
B2096 e B1934 foram eficientes nos testes de solubilização in vitro de fosfato
de ferro III. Estudos complementares tornam-se necessários para confirmação
da capacidade dessas bactérias promoverem o crescimento de plantas em solos
contendo P-Fe.

Agradecimentos
Embrapa Milho e Sorgo; CNPq; Simbiose; UFSJ.

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Eficiência de espécies de Bacillus, Paenibacillus e

Pseudomonas na promoção de crescimento do milho (Zea
mays L.)

Diniz, Gisele de Fátima Dias1; Alves, Talles Henrique Pereira1; Rodrigues, Victor
Alef1; Silva, Felipe Campos1; Cota, Luciano Viana1; dos Santos, Vera Lúcia2; de
Oliveira-Paiva, Christiane Abreu1

1Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Milho e Sorgo, 2Universidade Federal

de Minas Gerais
E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
Bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCP) atuam diretamente em
benefício das plantas pela fixação de nitrogênio, solubilização de fosfatos,
produção de fitohormônios, entre outros mecanismos. Em muitos casos, a
combinação de duas ou mais BPCP demonstrou maior eficiência do que seu uso
individual, devido ao efeito sinérgico da combinação de diferentes mecanismos
de ação. Nesse trabalho, bactérias que foram obtidas de estigma de milho:
Bacillus velezensis (IM14 e CT02) e Pseudomonas aeruginosa (IPR45) e
bactérias obtidas de sementes de sorgo: B. velezensis (LIS05) e Paenibacillus
ottowii (LIS04), foram analisadas para características de promoção de
crescimento vegetal in vitro e avaliadas em casa de vegetação, de forma isolada
ou em combinação, para promover o crescimento do milho. Nos testes in vitro,
todos os isolados apresentaram pelo menos, quatro das seis características de
promoção de crescimento vegetal avaliadas, sendo elas produção de ácido
indol-acético (AIA), solubilização de fosfato, formação de biofilme e produção de
exopolissacarídeos (EPS). Em casa de vegetação, três bactérias, quando
utilizadas individualmente e/ou em combinação, potencializaram o crescimento
do milho, com destaque para a combinação dos dois isolados de B. vellezensis
(CT02 + IM14), que promoveram aumento significativo de 18,1% na altura, 44%
na massa seca da parte aérea, 72,4% na massa seca de raízes e 46,8% na
massa seca total em comparação com o controle não inoculado. Os resultados
sugerem que os isolados avaliados são potenciais promotores de crescimento
vegetal, podendo ser usados para aumentar o crescimento de plantas e
contribuir para a redução do uso de fertilizantes químicos.

Palavras-Chave: Biofertilizantes, Bioinoculantes, BPCP, Coinoculação.

Introdução
As bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCP) promovem o
crescimento vegetal por facilitar a aquisição de nutrientes ou por modular os
níveis de hormônios vegetais (Glick 2012). Essas características são
naturalmente encontradas em bactérias dos gêneros Bacillus, Pseudomonas e

228
Paenibacillus, que tem a capacidade de disponibilizar nutrientes presente no solo
para as plantas, como fósforo (P), nitrogênio (N) e ferro (Fe) e fornecem
hormônios vegetais, entre outros.
Existem diferentes gêneros de BPCP que podem apresentar sinergismo
e, devido aos seus diferentes mecanismos de ação, podem ser utilizadas em
combinação para maior eficiência. A aplicação combinada de bactérias
proporciona diversos benefícios no desenvolvimento das plantas, como o
aumento do sistema radicular, que permite melhor absorção de fertilizantes, além
de favorecer a planta em situações de deficiência hídrica e no aumento da
produtividade (Silva et al. 2022).
O objetivo desse trabalho foi avaliar isolados de Bacillus, Paenibacillus e
Pseudomonas quanto às características de promoção de crescimento vegetal in
vitro e, posteriormente, testar em casa de vegetação seu uso de forma individual
ou combinada para promoção de crescimento de plantas de milho.

Material e Métodos
Cepas microbianas
Os testes foram realizados com cepas de B. velezensis (LIS05, CT02 e
IM14), Paenibacillus ottowii (LIS04) e Pseudomonas aeruginosa (IPR45),
isoladas de milho e sorgo, pertencentes à Coleção de Microrganismos
Multifuncionais e Fitopatogênicos da Embrapa Milho e Sorgo (CMMF).

Fixação de Nitrogênio
A capacidade de fixar nitrogênio foi avaliada pelo crescimento dos isolados
em meio semi-sólido NFb livre de N (Kim et al. 2012). Após a incubação a 28
°C por 7 dias foi avaliada a mudança de cor no meio de verde para verde-azulado
e formação de uma película. As cepas de Azospirillum sp. (CP23 e CP34) foram
utilizadas como controle positivo.

Solubilização e mineralização de fosfatos

A capacidade de solubilizar e mineralizar fosfato foi avaliada pelo
crescimento dos isolados em meio Fitato (Richardson et al. 2001) e meio NBRIP
(Nautiyal 1999), contendo fonte de P na forma de fitato de sódio e fosfato
tricálcico, respectivamente. Após a incubação a 28°C durante 10 dias foi avaliada

229
a formação de halo transparente e calculado o Índice de Solubilização: IS =
Diâmetro do Halo (mm)/Diâmetro da Colônia (mm). Os isolados foram
classificados como estirpes de baixa solubilização IS < 2, média 2 ≤ IS ≤ 4 e alta
solubilização IS > 4 (Berraquero et al. 1976).

Produção de ácido indol-acético (AIA)

A produção de AIA foi avaliada conforme descrito por Sarwar e Kremer
(1995), com modificações. Os isolados LIS05, CT02, IM14, LIS04 e IPR45 foram
inoculados em meio caldo triptona soja (TSB) suplementado com DL-triptofano

na concentração de 1,0 mg mL-1. A incubação foi realizada no escuro a 30°C

sob agitação por 5 dias. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido
para uma microplaca, na qual adicionou-se 100 μL do reagente Salkowski. As
amostras foram incubadas em temperatura ambiente e no escuro por 20 min. A
concentração de AIA foi estimada pela leitura da OD a 530 nm em
espectrofotômetro. Uma curva padrão foi feita a partir de AIA comercial nas

concentrações 0; 10; 20; 40; 80 e 100 µg mL-1 para se determinar por

comparação a concentração de AIA obtida no meio de cultura.

Produção de exopolissacarídeos (EPS)

A avaliação da produção de EPS foi realizada de acordo com a
metodologia de Paulo et al. (2012) utilizando o meio de cultura composto por 50
g/L de sacarose, 20 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de MgSO4, 0,01 g/L de
NaCl, 0,01 g/L de FeSO4, 0,01 g/L de MnSO4, 0,02 g/L de CaCl2 e 20 g/L de
K2HPO4, pH 7,5. Discos de papel filtro (Whatman 42) foram transferidos para o
meio e inoculados com 5 µL da cultura bacteriana. As placas de Petri foram
incubadas a 30°C por 24 h e a produção de EPS foi avaliada pela ausência ou
presença de colônia mucosa ao redor dos discos. A confirmação da produção de
EPS foi realizada por meio da mistura de uma alça de platina impregnada com a
colônia em etanol absoluto, sendo considerada a formação de precipitado como
resultado positivo.

Formação de biofilme

230
 A formação de biofilme foi avaliada pelo método de Stepanovic et al.
(2007) com modificações. Os isolados foram crescidos em TSB com 1% de
glicose a 30°C por 48h em microplaca de poliestireno com capacidade para 96
amostras, em triplicada. Após esse tempo, o líquido foi removido, os poços da
placa foram lavados e secos. Posteriormente, foram adicionados em cada poço
200 µL de metanol para fixar o biofilme eventualmente presente. Após 20 min, o
metanol foi removido, a placa foi seca em temperatura ambiente e foram
adicionados 200 µL de uma solução de cristal violeta 0,5% em cada poço. Após
15 min, o corante foi removido, os poços foram lavados com água destilada e a
placa deixada em temperatura ambiente para a secagem. Por fim, foram
adicionados 200 µL de etanol absoluto e, após 30 min, foi feita a leitura das
placas em um espectrofotômetro a 570 nm. A classificação foi feita com base
nos valores de densidade óptica obtidos, sendo classificados como: não
formadores (Doa ≤ Docn); fracamente formadores (Docn ≤ Doa ≤ 2x Docn);
moderadamente formadores (2x Docn < Doa ≤ 4x Docn) ou fortemente
formadores (4x Docn < Doa). Doa = densidade óptica da absorbância e Docn =
densidade óptica do controle negativo.

Produção de amônia
Um ensaio qualitativo para produção de amônia foi realizado utilizando o
protocolo de Cappuccino e Sherman (1992). Os isolados bacterianos recém-
cultivados foram inoculados em tubos de ensaio contendo 10 ml de água
peptonada e incubados por 48h a 28°C. Após a incubação, foi adicionado 0,5 ml
do reagente de Nessler em cada tubo inoculado. O desenvolvimento de uma cor
amarela fraca indicou uma pequena quantidade de amônia produzida e um
amarelo profundo a acastanhado indicou produção máxima de amônia
(Cappuccino e Sherman 1992).

Experimento em casa de vegetação

Os experimentos foram realizados em casa de vegetação da Embrapa
Milho e Sorgo, em Sete Lagoas, MG. Sementes de milho cultivar Caimbé
desinfestadas foram colocadas por 2 horas sob agitação lenta (80rpm) nas

suspensões bacterianas padronizadas a 108 unidades formadoras de colônias

231
UFC/mL. Em seguida, as sementes foram misturadas com adesivo para
inoculantes e secas em fluxo laminar. As sementes foram plantadas em vasos de
20kg de capacidade, preenchidos com solo do tipo Latossolo Vermelho distrófico
típico.
Os tratamentos consistiram na inoculação das sementes com os isolados
bacterianos de forma individual e tratamentos com as combinações de todos as
bactérias compatíveis. Para esse teste, P. aeruginosa IPR45 não foi incluída por
ter sido incompatível com os demais isolados. Como controle negativo, foi
utilizado solução salina 0,8% NaCl. Para esse experimento foi utilizado o
delineamento experimental inteiramente casualizado com treze tratamentos e
três repetições. Após 30 dias foram avaliados a altura de planta, o diâmetro do
caule, a massa seca da parte aérea, a massa seca do sistema radicular e massa
seca total. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e a
comparação das médias dos tratamentos foi realizada pelo teste de Scott Knott
a 5% de significância (p <0,05).

Resultados e Discussão
Os resultados dos testes in vitro relacionados à promoção de crescimento
das plantas estão expressos na Tabela 1. Nenhum dos isolados foi positivo para
fixação de nitrogênio. Mesmo que tenha ocorrido uma alteração da cor verde
para azul no meio semi-sólido em alguns frascos inoculados (Figura 1b),
nenhuma formação de película foi observada como ocorreu nos meios CP34 e
CP23 inoculados com Azospirillum sp. (Figura 1c e 1d).
Todos isolados apresentaram potencial de solubilização e de
mineralização comprovado pela formação de halo transparente (Figura 2), nos
meios contendo fitato de sódio e fosfato tri-cálcio (NBRIP), que são fonte de P
orgânico e inorgânico respectivamente. Em geral a eficiência de solubilização
pelos isolados foi baixa (IS < 2) exceto por P. aeruginosa (IPR45) que foi capaz
tanto de solubilizar quanto de mineralizar fosfatos com alta eficiência (IS > 4).
Observa-se que todos os cinco isolados foram positivos para a produção
de AIA, com valores médios variando entre 2 a 5 μg.mL-1, sendo o isolado B.
velezensis LIS05 o maior produtor com média de 5,174 μg.mL-1.
A produção de EPS, indicada pela formação de precipitado em etanol e
de material mucoso envolvendo a colônia (Figura 3a) foi positiva para todos os

232
isolados testados. Além disso, os cinco isolados também foram positivos para a
formação de biofilme (Figura 3b), sendo os três isolados de Bacillus (LIS05, CT02
e IM14) classificados como fortemente formadores.
Os três isolados de Bacillus spp. e de P. aeruginosa (IPR45)
apresentaram máxima produção de amônia, indicada pela cor marrom nos poços
(Figura 3c). Somente o isolado de Paenibacillus ottowii (LIS04) não mostrou
produção de amônia em testes in vitro.

Tabela 1. Características dos isolados de Bacillus quanto aos parâmetros relacionados à

promoção de crescimento de plantas.
Isolado Fixação IS de fósforo1 Produção de Produção Formação Produção
de N Fitato AIA (µg.mL-1) de EPS de de amônia3
2
NBRIP biofilme
LIS04 - 1,0 1,0 2,601 + + -
LIS05 - 0,8 0,3 5,174 + +++ +++
CT02 - 0,7 0,2 2,666 + +++ +++
IPR45 - 4,7 4,1 2,419 + ++ +++
IM14 - 1,1 0,2 3,204 + +++ +++
1
IS - Índice de solubilização e mineralização de P em meio de cultura Fitato e NBRIP,
contendo fósro orgênico e inorgânico, respectivamente. 2Fortemente formadora de biofilme
(+++), Moderadamente formadora de biofilme (++). Fracamente formadora de biofilme(+).
3
Grau de reação para a produção de amônia com base na coloração do caldo com reagente
de Nessler: + cor amarela fraca e pequena produção, ++ cor amarela escura e quantidade
média de produção, +++ cor marrom escuro e quantidade máxima de produção de amônia,
- indica ausência de produção. AIA: ácido indol-acético. EPS: exopolissacarídeos. LIS04:
Paenibacillus ottowii, LIS05, CT02 e IM14: Bacillus velezensis e IPR45: Pseudomonas
aeruginosa.

Figura 1 – Teste de Fixação de Nitogênio. (a) Controle negativo. (b) Meio inoculado com o
isolado Bacillus velezensis IM14. (c e d) Formação de película na superfície nos controles
positivos indicada pela seta.

233
Figura 2 – Mineralização de fosfato pela formação de halo ao redor das colônias em meio
com fósforo orgânico. a) Isolado de Pseudomonas aeruginosa IPR45 e b) Isolado de Bacillus
velezensis IM14.

Figura 3 – a) Produção de EPS pelo isolado de Paenibacillus ottowii LIS04, indicado pela
formação de precipitado em etanol e de material mucoso envolvendo a colônia. b) Produção
de biofilme por todos os cinco isolados testados. c) Produção de amônia por todos os
isolados, exceto Paenibacillus ottowii LIS04.

Em relação aos parâmetros de crescimento de plantas de milho em casa

de vegetação, as plantas que foram tratadas com a combinação dos dois
isolados de B. vellezensis (CT02 e IM14) se destacaram pelo aumento
significativo (P<0,05) de quatro parâmetros avaliados, sendo eles: altura das
plantas (18,1%), massa seca da parte aérea (44%), massa seca de raízes
(72,4%) e massa seca total (46,8%). Também, a combinação de dois isolados
de B. velezensis (LIS05 + CT02) promoveu o crescimento do milho aumentando
significativamente (P<0,05) três parâmetros de crescimento vegetal avaliados,
sendo eles altura de plantas (16,6%), massa seca da parte aérea MSPA (35,2%)
e massa seca total MST (30,7%).
Houve ainda aumento significativo (P<0,05), em relação ao controle, de
três parâmetros de crescimento vegetal para o isolado de B. velezensis (IM14)
quando utilizado de forma individual, sendo eles: massa seca da parte aérea
(54,2%), massa seca de raízes (77,5%) e massa seca total (56,6%). Apesar de
não ter ocorrido diferença significativa desses parâmetros em relação aos
obtidos com a combinação de IM14 e CT02, a utilização dessa combinação
promoveu o aumento da altura das plantas, o que não aconteceu com IM14
utilizado de forma individual. Sabe-se que em uma condição natural, a promoção
de crescimento vegetal é oriunda de um efeito conjunto de características
presentes em várias bactérias simbióticas (Richard, 2019). Dessa forma, a

234
utilização das bactérias com diferentes habilidades de forma combinada se torna
importante a fim de fornecer um consórcio bacteriano que se assemelhe com a
microbiota natural e que seja mais eficiente na promoção de crescimento das
plantas como um todo (Kavamura et al. 2013).

Tabela 2. Dados de promoção de crescimento de milho obtidos após tratamento das

sementes com os isolados bacterianos individuais ou em combinação.
TRATAMENTOS Altura Diâmetro MSPA MSR MST
(cm) (cm) (g) (g) (g)
Controle 1,32 b 11,97 b 5,33 b 0,58 b 5,91 b
Paenibacillus ottowii (LIS04) 1,27 b 11,99 b 5,15 b 0,49 b 5,64 b
Bacillus velezensis (LIS05) 1,27 b 12,68 b 5,86 b 0,49 b 6,35 b
Bacillus velezensis (CT02) 1,15 b 12,57 b 5,24 b 0,50 b 5,74 b
Bacillus velezensis (IM14) 1,35 b 13,60 b 8,22 a 1,03 a 9,26 a
P. ottowii + B. velezensis (LIS04 + LIS05) 1,27 b 11,44 b 4,12 b 0,36 b 4,49 b
P. ottowii + B. velezensis (LIS04 + CT02) 1,39 b 11,18 b 5,51 b 0,44 b 5,96 b
P. ottowii + B. velezensis (LIS04 + IM14) 1,30 b 11,64 b 5,69 b 0,41 b 6,11 b
B. velezensis + B. velezensis (LIS05 + CT02) 1,54 a 12,07 b 7,21 a 0,51 b 7,73 a
B. velezensis + B. velezensis (LIS05 + IM14) 1,28 b 11,47 b 4,82 b 0,47 b 5,30 b
B. velezensis + B. velezensis (CT02 + IM14) 1,56 a 13,78 b 7,68 a 1,00 a 8,68 a
Letras diferentes na coluna indicam diferenças significativas entre os tratamentos pelo Teste
de Scott Knott a 5% de probabilidade (p <0,05). MSPA - massa seca da parte aérea; MSR -
massa seca da raiz; MST - massa seca total

Os resultados dos testes in vitro obtidos nesse trabalho, mostraram que

todos os isolados apresentaram, pelo menos, quatro das seis características de
promoção do crescimento de plantas avaliadas, sendo elas produção de AIA,
solubilização de fosfatos, produção de amônia, produção de EPS e formação de
biofilme. Ao ser produzido pelos microrganismos promotores de crescimento de
plantas, o fitohormônio AIA estimula o desenvolvimento das raízes das plantas,
especialmente as secundárias, aumentando assim a absorção de água e
nutrientes, o que consequentemente promove maior crescimento e rendimento
das plantas (Wagi e Ahmed 2019).
O P é um nutriente com elevada concentração nos solos; no entanto, se
liga facilmente a outros elementos, como ferro, alumínio e cálcio, dependendo
do pH e da mineralogia do solo, se tornando indisponível para a absorção pelas
plantas (Kalayu 2019). Microrganismos solubilizadores de fosfatos (MSF)
desempenham um papel importante na conversão de P indisponível (P orgânico
e P inorgânico) em P disponível. Os MSF secretam ácidos orgânicos que
auxiliam na disponibilização de P para as plantas, enquanto os microrganismos
mineralizadores de P secretam fosfatases para mineralizar enzimaticamente o

235
fósforo orgânico (Chen e Liu 2019). Esse efeito aumenta a disponibilidade de
fósforo para as plantas, melhorando o crescimento e o rendimento vegetal (Billah
et al. 2019).
A produção de amônia é uma característica importante dos
microrganismos antagonistas e promotores de crescimento vegetal. Se os
microrganismos produzem quantidade de amônia que excede seus próprios
requisitos, como geralmente é o caso, o excedente é excretado no ambiente,
podendo fornecer nitrogênio para a planta hospedeira promovendo o
alongamento das raízes e produção de biomassa (Marques et al. 2010).
Para o desenvolvimento de um bioproduto, é importante que os
microrganismos selecionados apresentem capacidade de sobrevivência no
ambiente a ser inserido e capacidade de colonizar a planta. A aderência
bacteriana à raiz depende de uma série de fatores, incluindo a produção de EPS,
seguido pela formação de biofilme (Bogino et al. 2013). Nesse estudo, todos os
isolados foram capazes de produzir EPS e formar biofilme in vitro. Os EPS
podem aumentar a agregação de partículas do solo e beneficiar as plantas,
mantendo a umidade do ambiente e retendo nutrientes, além de proteger o
ambiente contra o ressecamento e flutuações no potencial hídrico (Costa et al.
2018).
A formação de biofilme em torno das plantas hospedeiras é uma
característica importante que tem sido associada à capacidade de colonização
das plantas pelos microrganismos, além de funcionar como uma ferramenta de
proteção contra condições ambientais hostis (Junaid e Khan 2018). Em casa de
vegetação, os isolados de B. velezensis (IM14 e CT02), quando utilizados em
combinação se destacaram dos outros isolados, promovendo aumento na altura
de plantas, massa seca da parte aérea, massa seca de raiz e massa seca total.
Resultados semelhantes foram encontrados em um trabalho de Liu et al. 2018,
em que a mistura de dois isolados de B. velezensis aumentou significativamente
13 de 15 parâmetros relacionados ao crescimento vegetal, enquanto os isolados
individuais AP197, AP298 e o controle positivo aumentaram 8, 6 e 4 parâmetros
de crescimento, respectivamente. Isolados de B. velezensis promovem o
crescimento de plantas pela produção de AIA, fixação de N, solubilização de
fosfatos, produção de amônia e formação de biofilme (Meng et al. 2016).

236
 Conclusões
Todos os cinco isolados testados nesse trabalho apresentaram pelo
menos quatro das seis características de promoção de crescimento vegetal,
sendo elas: produção de AIA, solubilização e mineralização de P, formação de
biofilme e produção de EPS. Três isolados (IM14, CT02 e LIS05) quando
utilizadas individualmente e/ou em combinação, contribuíram para o incremento
de, no mínimo, três parâmetros de crescimento do milho. A combinação dos dois
isolados de B. vellezensis (CT02 e IM14) se destacou em casa de vegetação
promovendo aumento significativo da altura das plantas, massa seca da parte
aérea, massa seca de raízes e massa seca total. Esses resultados abrem
perspectivas para a utilização desses isolados como inoculantes para aumentar
a fertilidade do solo e o crescimento das plantas, reduzindo o uso dos fertilizantes
químicos.

Agradecimentos
À Embrapa Milho e Sorgo, à Universidade Federal de Minas Gerais, à
Simbiose e ao CNPq.

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Genômica comparativa e Potencial biossintético de

Streptomyces MAD1003, isolada de sedimentos do Rio
Madeira, para produção de metabólitos secundários

Costa, Gerodes Vasconcelos1; Queiroz, Claudia Afras de Queiroz2; Mendes, Valdir

da Costa1; Raposo, Débora de Sena3; Sousa, Thiago Fernandes4; Bandeira,
Izabel Correa4; Koolen, Hector Henrique Ferreira4; Silva, Gilvan Ferreira2

1Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 2Embrapa Amazônia Ocidental,

3Universidade do Estado do Amazonas, 4Universidade Federal do Amazonas
Email: [email protected]

Resumo
O gênero Streptomyces tem sido uma rica fonte de produtos naturais a anos,
com a capacidades biossintéticas de produzir centenas compostos bioativos, são
bactérias com grande potencial para produção de antibióticos, e outras
moléculas, com aplicações médicas, industriais e agrícolas, incluindo
antifúngicos, sideróforos, anticancerígenos, antioxidantes. Com os recentes
avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA, a mineração do genoma
tornou-se uma ferramenta para explorar produtos naturais, facilitando a
identificação de agrupamentos de genes biossintéticos (BGC). O presente
estudo teve como objetivo explorar o potencial do isolado de Streptomyce sp.
MAD1003. O genoma montado tem 6.642.326 Mb, com 6.293 possíveis regiões
codificadoras (CDS), 66 genes de RNA de transferência (tRNA). A análise
filogenômica indica que MDA1003 é filogeneticamente relacionada com
Streptomyces bauhiniae Bv016T. As similaridades entre as espécies usando
vários índices de medidas como, identidade média de nucleotídeos (ANI) foi de
96.30%, identidade média de aminoácidos (AAI) de 96,24% e valores de
hibridização digital DNA-DNA (dDDH) de 68.1% são indicativos que MDA1003
representa uma espécie. A mineração genômica combinando análise de
bioinformática para identificação de BGCs e anotação manual, permitiu a
identificação de 23 clusters envolvidos na produção de metabólitos secundários,
destes apenas 26% (6) BGCs estão relacionados a moléculas e clusters
caracterizados. A análise de sintenia dos clusters de MAD1003 com vias de
biossíntese para o sideróforos desferrionamine B e para os agentes
antimicrobiano lomofugin revelam o potencial para a produção de compostos
quimicamente semelhantes mas não iguais. O estudo usando o genoma
completo desta linhagem revela que a maioria dos BGC identificados não estão
envolvidos na produção de metabólitos secundários conhecidos, indicando que
esta possível nova espécie de Streptomyces pode ser usada na prospecção de
novos produtos naturais bioativos.

Palavras-Chave: Clusters; biossintético; Metabólitos.

240
 Introdução
As bactérias são uma importante fonte de produtos naturais, o gênero
Streptomyces tem sido uma rica fonte de produtos naturais, baseado na
descoberta anual de novas moléculas de Streptomyces a cada ano, estima se
que em se mantendo a tendência atual de descoberta o gênero pode sintetizar
cerca de 150.000 compostos antimicrobianos a mais do que os atualmente
conhecidos, sugerindo que o Streptomyces está longe de ser um recurso
esgotado (Lacey e Rutledge 2022). Além dos antibióticos, outras moléculas, com
aplicações médicas, industriais e agrícolas, incluindo compostos antibacterianos,
antifúngicos, sideróforos, anticancerígenos, antioxidantes, imunossupressores,
compostos antitumorais, compostos antiparasitários e a produção de enzimas
microbianas para a indústria (Giordano 2020).
As Streptomyces são bactérias Gram-positivas, que pertencem ao filo das
actinobactérias, sendo responsáveis por cerca de 10.100 dos 22.500 metabólitos
microbianos bioativos descobertos até agora, são bactérias com genoma com alto
teor de C+G de 69-78%, descrita pela primeira vez por Waksman e Henrici
(1943) com características fisiológicas que se assemelham às de muitas
espécies de fungos, podendo ser encontradas em diferentes ambientes,
especialmente no solo e ambientes aquáticos, sendo capazes de sobreviver em
diversos habitats (Quinn et al. 2020; Donald et al. 2022; Kuncharoen et al. 2022;
Liu et al. 2022).
Com os recentes avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA, a
mineração do genoma tornou-se uma nova maneira de explorar produtos
naturais produzidas por esses microrganismos, facilitando a identificação de
agrupamentos de genes biossintéticos (BGC), tornando possível a detecção de
novas moléculas, e possibilitando o entendimento de sua base molecular,
biossintética e funcional (Sandoval-Powers et al. 2021; Alam et al. 2022; Liu et
al. 2022).
O presente estudo teve como objetivo realizar a identificação filogenômica
de Streptomyces sp. MAD1003 e explorar o potencial biossintético do isolado por
meio de mineração genômica.

241
 Material e Métodos
Microrganismo e condições de cultivo
O isolado MAD1003 analisado neste trabalho faz parte da coleção de
cultura do Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Amazônia Ocidental.
Cadastrado no SISGEN Acesso No AB6B14F. Esta linhagem foi isolada de uma
amostra de sedimento do Rio Madeira, e cultivada em meio ISP2.

Análise filogenômica
A identificação taxonômica baseada no genoma completo foi realizada por
meio da plataforma Type (Strain) Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz.de),
uma plataforma de alto rendimento para taxonomia de procariotos que se baseia
(LPSN- List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature) disponível em
https://lpsn.dsmz.de que é uma base de dados acurada por especialistas para
nomenclatura procariótica (Meier-Kolthoff et al. 2021).
A análise filogenômica foi avaliada usando vários índices de medidas,
para a delimitação de similaridade entre as espécies mais relacionados com
base na identidade média de nucleotídeos (ANI) e identidade média de
aminoácidos (AAI), onde os cálculos dos valores médios de identidade
nucleotídica (ANI) foram determinados através software OrthoANI (Yoon et al.
2017). E valores de hibridização DNA-DNA digital (dDDH), calculada com o
Genome-to-Genome Distance Calculator (GGDC 2.1) (Sandoval-Powers et al.
2021).

Anotação do genoma
A sequência do genoma foi predita e anotada automaticamente seguindo
o pipeline do servidor RAST (https://rast.nmpdr.org/), usando a base de dados
SEED Viewer version 2.0. (Aziz et al. 2008). Comparando a qualidade da
anotação utilizando o servidor BV-BRC (Bacterial and Viral Bioinformatics
Resource Center), combinando os dados e ferramentas dos recursos do software
PATRIC (https://www.patricbrc.org) através de uma análise abrangente do
genoma. Todas as sequências do genoma das espécies tipos comparados foram
baixados do banco de dados GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome).
A análise de pan genoma e as proteínas preditas foram comparadas com a
espécie mais relacionadas de Streptomyces bauhiniae e Streptomyces

242
seoulensis e plotadas na plataforma Orthovenn2 (Xu et al. 2019). Os valores
baseados em BLAST (ANIb) e MUMmer (ANIm) foram avaliados na ferramenta
web JSpeciesWS http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws (Richter et al. 2016).

Predição de clusters gênicos biossintéticos e sintenia

O genoma foi analisado no AntiSMASH (antibiotics & Secondary
Metabolite Analysis Shell) versão 6.0 (Blin et al. 2021) para a anotação dos
clusters genes biossintéticos (BGC). Todas as sequências dos agrupamentos
preditos apresentaram similaridade com BGCs depositados no banco de dados
MIBiG (Minimum Information About a Biosynthetic Gene cluster) versão 2.0
https://mibig.secondarymetabolites.org/ (Terlouw et al. 2022).
A análise de sintenia foi feita através do alinhamento dos clusters de
genes de cada BGC depositados no banco de dados MIBiG, antiSMASH, ou
NCBI, através de gráficos de sintenia plotados no programa clinker, uma
ferramenta baseada em Python e clustermap.js, (Gilchrist e Chooi 2021).

Resultados e Discussão
Identificação filogenômica
O isolado MAD1003 havia sido identificado previamente como
Streptomyces com base no sequenciamento da região 16S do rDNA. E a análise
filogenética baseado no genoma completo confirmou o gênero e revelou que
MAD1003 forma um clado com três espécies de Streptomyces (S. bauhiniae, S.
griseoluteus, S. seoulensis) sendo Streptomyces bauhiniae Bv016T a espécie
filogeneticamente mais relacionada (Fig.2).

243
Figura 1 - Árvore filogenética obtida pelo TYGS (Type Strain Genome Server) baseada no
genoma completo do isolado MAD1003 e espécies tipo mais proximamente relacionadas

As espécies tipos comparadas foram obtidas do banco de dados LSNP

(List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature) que mantém uma lista
acurada de nomes revisados por especialistas em taxonomia de procariotos. O
gênero Streptomyces é o maior gênero da classe das Actinobacteria, com 668
espécies caracterizadas com nomes validamente publicados (Maiti e Mandal
2021).
Os valores de ANI entre o isolado e duas das espécies intimamente
relacionadas ficaram 96,13 e 95.13% (Fig. 3), onde mostra uma relação com
espécie tipo descritiva, com valores próximos aos considerados como o limite da
espécie entre (95-96%). Segundo Lee et al. (2016), esses são valores
recomendados como critério para a identidade nucleotídica média (ANI).

Figura 2 - Mapa de calor mostrando a identidade média de nucleotídeos por ortologia

(OrthoANI) entre o Isolado MAD1003 e as linhagens das espécies tipo relacionadas.

244
 A linhagem MAD1003 quando comparada com S. bauhiniae que é a
linhagem mais próxima, apresenta valores de AAI de 96.24%. Vários estudos
iniciais recomendaram um valor de ANI de aproximadamente 95-96?% como
limite para a demarcação de espécies (Goris et al. 2007; Richter e Rosselló-Móra
2009). Com o OrthoANI também foi recomendado pelos autores uma faixa
semelhante de demarcação de espécies em 95 ~ 96 (Lee et al. 2016). Contudo,
recentemente novo limite para delimitação de espécies do gênero Streptomyces
foi estabelecido em 96,7%, este limite foi baseado na análise de 80 espécies de
Streptomyces cujo o valor de dDDH de 70% não correspondeu a um valor de
ANIm de 95~96%.
MAD1003 apresentou dDDH foi de 68.1%, este valor é mais um indicativo
que esta linhagem pode representar uma nova espécie, conforme a literatura a
ponte de corte para delimitação de espécies é dDDH igual ou maior que 70%,
podendo ser consideradas novas espécies valores abaixo deste ponto de corte
(Meier-Kolthoff et al 2013). Todos os valores estão descritos (Tabela 1).

Tabela 1. Valores de médias da identidade nucleotídica (ANI), identidade média de

aminoácidos (AAI) e valores de hibridização digital DNA-DNA l (dDDH).
dDDH (d2, em dDDH (d4, em AAI ANIm ANIb
Isolado Espécie tipo
%) %) (%) (%) (%)
Streptomyces
MAD1003 68.1 68,1 96,24 96.36 95.65
bauhiniae
AAI- identidade média de aminoácidos ANIm- MUMmer ANIb- Blast+ Anotação do genoma
e análise de genes ortólogos

O genoma sequenciado possui um tamanho de 6,642,326 Mb, com 6.293

possíveis regiões codificadoras (CDS), 66 genes de RNA de transferência
(tRNA) e 8 genes de RNA ribossômico (rRNA). o conteúdo G + C do isolado foi
encontrado em uma faixa de 71.5%.
Alguns dos genes anotados estão relacionados e classificadas em
subsistemas relacionados a fatores de virulência, cada subsistema tem um
conjunto de proteínas que, juntas, implementam um processo biológico
específico ou complexo estrutural, como: aquisição e Metabolismo do Ferro com
genes relacionado para produção de sideróforo, a produção de metabólitos
secundários e resistência a antibióticos. Verificou-se que o isolado MAD1003
continha genes 25 relacionados a Resistência a antibióticos e compostos tóxicos,

245
42 genes intimamente envolvidos na aquisição de ferro no metabolismo, com
genes relacionados a produção do sideróforo Desferrioxamin B.
Foi evidenciado por Zhang et al. (2015) que a lomofungina é um antibiótico
produzidos por Streptomyces sp., com atividade antibacteriana de amplo
espectro, sintetizados pelo agrupamento de genes phz altamente conservado,
com atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem como
fungos patogênicos.
O OrthoVenn2 revelou 6293 proteínas para o isolado MAD1003, 649
clusters ortólogos, o pan genoma mostrou o genoma central intimamente
relacionado com as espécies tipos Streptomyces bauhiniae e Streptomyces
seoulensis contendo 4842 clusters de genes de cópia única.

Identificação de Clusters gênicos biossintéticos

Foram identificados 23 diferentes BGCs relacionados à produção de
metabólitos secundários no genoma da MAD1003. Diferentes classes de
metabólitos, como: NRPS (8), PKS-I (2), PKS-II (1), RiPPs (1), 2 agrupamentos
de genes contendo PKS-III, 3 classes de terpenos, entre outras moléculas
(Figura 3). Notadamente o metabolismo secundário da MAD1003 está voltado
para a biossíntese de diferentes tipos de peptídeos (8/23) e policitideos (5/23).

246
Figura 3 - Clusters gênicos biossintéticos identificados na linhagem MAD1003 relacionados a
produção de metabólitos secundários, tendo como as principais classes: NRPS (peptídeo
sintetase não ribossomal), PKS T1, T2 e T3 (policetídeo sintase tipo I, tipo II e tipo 3), terpeno
e RiPPs (peptídeos sintetizados ribossomalmente e modificados pós-traducionalmente).

Foram identificados no genoma de MAD1003 Clusters gênicos

biossintéticos (BGCs) com 100% de identidade com vias de biossintese já
caracterizadas indicando que a linhagem é geneticamente capaz de produzir as
seguintes moléculas: scabichelin (BGC 1.1), albaflavenone (24.1), ectoine (42.1),
e algumas PKS T3 ( policetídeo sintase tipo III) com 100% de semelhança predita
na plataforma AntiSMASH.
Interessantemente a NRPS do BGC 74.1, apresentou 39% de similaridade
com o BGC relacionada biossíntese do sideróforo a desferrioxamine B e
desferrioxamine E (figura 4), usado para medir a absorção do ferro, que foi
aprovada para uso clínico pela Food and Drug Administration (FDA) em 1968
(Barona-Gómez et al. 2004).
O BGC 1.2 apresentou 39% com o cluster da lomofungin, um atibiótioco
que pertence a classe "phenazine", as fenazinas são antibióticos de amplo
espectro. E estudos de Zhang et al. (2015) relatam que as fenazinas têm muitas
funções biológicas como atividades antimicrobianas, antifúngicas, antitumorais,
antimaláricas e antiparasitárias.

247
 A análise de sintenia mostrou que a composição de genes dos clusters de
MAD1003, S. bauhiniae e os genes da via de biossíntese da lomofungin
depositada no banco de dados MIBiG, indicam a habilidade para produção de
uma fenazina diferente visto que só foram identificados os genes lphzB, lpHzC,
lpHzgG, que se mostraram alta similaridade com os genes da biossíntese de
fenazina.

Figura 4 - Sintenia entre os BGC 1.2 e o BGC 74.1 de Streptomyces sp. MAD1003. A)
representa a sitenia entre Streptomyces sp. MAD1003 e da Streptomyces bauhiniae como
os clusters gênicos biossintéticos BGC0001302 junto com a estrutura química da lomofungin.
B) representa a sitenia entre Streptomyces sp. MAD1003 e Streptomyces bauhiniae como os
clusters gênicos biossintéticos BGC0000940 e as estruturas química de desferrioxamin B e
desferrioxamine E. Toda a Predição da função gênica foi a partir da base de dados MIBiG.

Conclusões
Este estudo forneceu uma análise de genômica comparativa, indicando
que o isolado MAD1003 representa uma possível nova espécie de Streptomyces
proximamente relacionada com S. bauhiniae (dDDH de 68.1 e ANI 96,3, ANIm
96,34). A mineração gênica e outro ponto importante que o trabalho permitiu foi a
identificação dos clusters biossintéticos para a produção de sideróforos como a
desferrionamine B, e do agente antimicrobianos lomofugin, facilitando a
caracterização através da sintenia, indicando que o isolado estudado pode ser
usado no processo para a produção de novos produtos naturais bioativos.

248
 Agradecimentos
Os autores agradecem às agências de fomento: FAPEAM (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas) CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Este trabalho contou com o
suporte financeiro da FAPEAM Editais: (PROSPAM 08/2021, CT&I ÁREAS
PRIORITÁRIAS 010/2021, PRODUTIVIDADE-CT&I-013/2022, Biodiversa Nº
007/2021), CAPES editais (Procad AmazonMicro, Amazônia Legal e pela
concessão de bolsa de estudo ao primeiro autor).
Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior - CAPES pela e concessão de Bolsas de estudo ao primeiro
autor no PDPG Amazônia Legal. Agradeço ao Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia- INPA, A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas- FAPEAM, agradecemos a Universidade do Estado do Amazonas-
UEA, por todo apoio durante as pesquisas, e a EMBRAPA - Amazônia Ocidental
por todo apoio.

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Identificação e análise de gene efetores do gênero

Neopestalotiopsis com base no genoma completo

Baia, Frankyrley Laison1; Sousa, Rodrigo da Silva5; Caniato, Fernanda Fátima2;

Neto, Adhemar Zerlotini4; Mendes, Valdir da Costa1; Silva, Gilvan Ferreira3

1InstitutoNacional de Pesquisa da Amazônia, 2Universidade Federal do Amazonas,

3Embrapa Informática Agropecuária, 4Embrapa Amazônia Ocidental, 5Instituto de
Tecnologia e Educação Galileo da Amazônia.
E-mails: [email protected]; [email protected]

Resumo
O grupo fungos pestaloides é composto por três gêneros distintos,
Pestalotiopsis, Neopestalotiopsis e Pseudopestalotiopsis, ambos com espécies
fitopatogênicas e de grande importância agrícola, como por exemplo N.
clavispora. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo realizar uma
análise comparativa com base no genoma completo das espécies dos isolados
de Neopestalotiopsis (M2102B, M2101, M2101E e 37M), N. clavispora (IHI
201606), e N. rosae frente aos resultados das análises das espécies Ps. theae,
P. fici e N. formicidarum de genes que codificam efetores e proteínas
degradadoras de carboidratos (Cazymes). O secretoma foi predito a partir do
genoma das espécies utilizando a plataforma de bioinformática SignalP 5.0,
Phobius e TMHMM 2.0, ScanProsite (Motivo: PS00014 ER_Targeting), e o
PredGPI. A predição de candidatos a efetores, foi realizada na plataforma R
(Pacote Biostrings), EffectorP 1.0 e ScanProsite motivo: [YFW]-x-C. A anotação
funcional foi feita na plataforma dbCAN HMMER e Merops. Na predição do
secretoma foram identificadas 462, 422, 1285, 430, 911 e 1133 sequências para
N. rosae, Neopestalotiopsis sp. (M2102B), Neopestalotiopsis sp. (M2101),
Neopestalotiopsis sp. (M2101E), N. clavispora e Neopestalotiopsis sp. (37M)
respectivamente, e em Ps. theae (1217), P. fici (1368) e N. fomicidarum (1154).
Na predição de efetores foram preditos 294, 262, 738, 263, 540 e 700 efetores
para N. rosae, Neopestalotiopsis sp. (M2102B), Neopestalotiopsis sp. (M2101),
Neopestalotiopsis sp. (M2101E), N. clavispora e Neopestalotiopsis sp. (37M),
respectivamente. Em Ps. theae, P. fici e N. formicarum foram identificados 698,
826 e 695, respectivamente. Na análise funcional no dbCAN foram identificadas
6 famílias de cazymes, sendo a maioria Glicosideos Hidrolases (GH), Enzimas
para Atividades Auxiliares (AA) e Esteráses de Carboidratos (CE). Já no Merops,
a maioria foram preditas como peptidases não homologas e peptidases não
atribuídas, além de inibidores de peptidase não atribuido, e com homologia,
Epóxido hidrolases (EHs), gama glutamil transpeptidase (GGT), Prolil tripeptidil
peptidase, Carboxipeptidases, além de outras peptidases. Os resultados
apresentados condizem com o modo de vida das espécies, e quanto aos
efetores, todos estão completamente relacionados ao processo de infecção e
colonização a partir da degradação do tecido do hospedeiro.

Palavras-Chave: Enzimas; Genes; Proteínas.

252
 Introdução
O grupo pestalotioides que incluem espécies pertencentes aos gêneros
Pestalotiopsis, Neopestalotiopsis e Pseudopestalotiopsis, podem ser
encontradas como saprófitas, endofíticas ou fitopatogênicas. As espécies do
gênero Neopestalotiopsis possuem grande importância agrícola principalmente
as espécie fitopatogênica, como por exemplo a Neopestalotiopsis clavispora (N.
clavispora) foi relatada como um patógeno causador de podridão pós-colheita e
doenças do tronco, além disso foi relatada como causadora da doença do cancro
e morte em mirtilos no Chile, além disso, na Espanha foi relatado podridão de
raiz e coroa em morangos, onde foram observados como sintomas como
rachaduras e feridas dos frutos. Também há relatos de N. clavispora causando
podridão de frutos de Rosa sterilis na Cidade de Guizhou na China (Espinoza
2008; Chamorro 2016; Shi et al. 2022).
Os fungos fitopatogênicos utilizam diversas estratégias no processo de
infecção e colonização da planta, como por exemplo produção de metabólitos
secundários tóxicos e proteínas efetoras que afetam o hospedeiro modificando
a estrutura e função da célula, além de impedir a resposta imune do hospedeiro
(Lo Presti et al. 2015). E com o advento das tecnologias de sequenciamento de
nova geração e com a facilidade de obtenção de genomas e transcriptomas
tornou-se possível a predição e análise in silico de enzimas relacionadas a
patogenicidade ou virulência e de moléculas efetoras as quais possuem papel
fundamental na infecção e isso tornou-se uma alternativa no controle de
doenças, sendo estas baseada no bloqueio ou distúrbio da ação das proteínas
efetoras (Máximo 2018).
Com isso, o objetivo deste trabalho foi realizar uma análise comparativa
com base no genoma completo dos isolados de Neopestalotiopsis sp. (M2102B,
M2101, M2101E e 37M), Neopestalotiopsis clavispora (IHI 201606) e
Neopestalotiopsis rosae frente ao resultados das análises das espécies
Pseudopestalotiopsis theae, Pestalotiopsis fici e Neopestalotiopsis formicidarum
de genes que codificam efetores e proteínas degradadoras de carboidratos
(Cazymes) visando obter informações sobre os mecanismos utilizados por estes
patógenos durante a infecção.

253
 Material e Métodos
O acesso ao patrimônio genético foi autorizado pelo SISGEN Nº
AB6B14F. O secretoma foi predito a partir dos genomas dos isolados de
Neopestalotiopsis sp. (M2102B), Neopestalotiopsis sp. (M2101),
Neopestalotiopsis sp. (M2101E), Neopestalotiopsis clavispora (IHI 201606),
Neopestalotiopsis sp. (37M) e Neopestalotiopsis rosae, todos disponíveis na
Plataforma NCBI, para utilizar como base comparativa na discussão dos
resultados, pelo fato de não existir trabalhos com o grupo Pestalotioides usando
essa abordagem selecionamos as espécies Pseudopestalotiopsis theae,
Pestalotiopsis fici e Neopestalotiopsis formicidarum para serem analisadas junto
as espécies.

Predição do Secretoma
Para a predição do secretoma foi utilizada a metodologia usada por Neu
e Debener (2019) utilizando três plataformas de bioinformática em conjunto,
sendo a primeira o SignalP 5.0 (Petersen et al. 2011) usada para predição de
Peptideos Sinal (SP), em seguida utilizou-se o servidor web Phobius (Kall et al.
2004) para confirmação das sequências com SP. Para finalizar utilizou-se, o
servidor web TMHMM 2.0 (PredHel:0 e PredHel:1 nos primeiros 60 aminoácidos)
(Krogh et al. 2001) para excluir proteínas de membrana. Para excluir sequências
que contêm um SP, mas permanecem no retículo endoplasmático, utilizamos o
servidor da web ScanProsite (Motivo: PS00014 ER_Targeting) (de Castro et al.
2006), e por fim usou- se o servidor web PredGPI para predição de proteínas
secretadas que contêm uma âncora GPI.

Predição de Efetores
A predição dos efetores, foi realizada na plataforma R (Pacote Biostrings)
para seleção de sequências com comprimento máximo de 200 aminoácidos e
conteúdo mínimo de cisteína de 3%. O software EffectorP 1.0 foi usado em
paralelo na predição de candidatos a efetores. E o servidor web de ScanProsite
foi usado na seleção deproteínas cuja sequências apresentam nos primeiros 90
aminoácidos o motivo: [YFW]- x-C, estas são confirmadas como candidatas a
efetor.

254
Análise Funcional dos Efetores
A anotação funcional do secretoma previsto foi extraída de toda a
anotação do genoma. Para uma anotação mais detalhada de enzimas que
degradam carboidratos, o banco de dados CAZy (Lombard et al. 2014) e o
servidor web dbCAN HMMER (Yin et al. 2012) são usados. Além disso, a
Plataforma MEROPS (Rawling et al. 2018) foi usada para predição de
peptidases.

Resultados e Discussão
Predição do Secretoma
Na predição do secretoma utilizando as 5 plataformas, foram identificadas
462 de 18.402 sequências, 422 de 17.365 sequências, 1285 de 18.928
sequências, 430 de 17.325 sequências, 1203 de 23.044 sequências e 1223 de
16.004 sequências de proteínas analisadas para N. rosae, Neopestalotiopsis sp.
(M2102B), Neopestalotiopsis sp. (M2101), Neopestalotiopsis sp. (M2101E), N.
clavispora e Neopestalotiopsis sp. (37M) respectivamente como possíveis
candidatos a efetores (Figura 01). Em comparação com as espécies Ps. theae
(1137), P. fici (1238) e N. formicidarum (1344), espécies também selecionadas
da plataforma NCBI, com exceção de N. formicidarum que o genoma foi
disponibilizado pela Embrapa, os resultados do secretoma foram bem próximo a
exceção das espécies N. rosae, Neopestalotiopsis sp. (M2102B) e
Neopestalotiopsis sp. (M2101E) que em relaçãoas demais espécies acima
citadas tiveram resultados bem diferentes, mas quando comparadas uma com a
outra, os resultados são extremamente próximos, sugerindo que essas espécies
possam ter algum grau de proximidade genealógica, no entanto, Queiroz e
Santana (2020), afirmaram que o estilo de vida influência de maneira significante,
em que espécies endofítica tendem a apresentar número baixo de efetores em
relação as espécies biotróficas, mas não se aplicando a espécie endofítica P.
fici.

255
 Número de sequências

Espécies

Figura 1. Secretoma das espécies – (NP: Não patógeno; PT: Patógeno).

Predição de Efetores
Na predição de efetores utilizando o pacote do R Biostrings, Effector P e
Scan Prosite (Motivo: [YFW] -x-C) foram preditos 194 efetores para N. rosae, 261
para Neopestalotiopsis sp. (M2102B), 738 para Neopestalotiopsis sp. (M2101),
263 para Neopestalotiopsis sp. (M2101E), 728 para N. clavispora e 738 para
Neopestalotiopsis sp. (37M) (Figura 02). Em comparação com as 3 espécies
"tipo" que foram identificados 665, 739 e 802 para Ps. theae, P. fici e N.
formicarum respectivamente, os resultados foram próximos, com exceção das
espécies N. rosae, Neopestalotiopsis sp. (M2102B) e Neopestalotiopsis sp.
(M2101E) que tiveram resultados divergentes assim como no secretoma,
podendo também está intimamente relacionada ao modo de vida, conforme
descreveu Queiroz e Santana (2020).

256
Número de sequências

Espécies

Figura 2. Quantitativo efetores das espécies (NP: Não patógeno; PT: Patógeno).

Análise Funcional dos Efetores

Na análise funcional dos efetores utilizando o dbCAN foram identificados
6 tipos de família de cazymes dentre as espécies sendo Glicosideos Hidrolases
(GH), Enzimas para Atividades Auxiliares (AA), Esteráses de Carboidratos (CE),
Polissacarídeos Líases (PL), Glicosil Transferases (GT) e Módulos de Ligação a
Carboidratos (CBM). Dentre todas as espécies com exceção de
Neopestalotiopsis sp. (M2101E) as cazymes de maior abundância são da família
das Glicosideos Hidrolases (GH) que são um grupo de enzimas que hidrolisam
a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos. Dentre as espécies que
apresentaram pequena quantidade de efetores (N. rosae, Neopestalotiopsis sp.
(M2102B)) a segunda com maior quantidade de cazymes fazem parte da família
Esteráses de Carboidratos (CE) que são enzimas que catalisam sacarídeos
liberando grupos acil ou alquil ligados por ligação éster a carboidratos. Já entre
as demais espécies a segunda maior quantidade de cazymes está situada na

257
família das Enzimas para Atividades Auxiliares (AA) que um grupo generalizado
de módulos catalíticos envolvidos na degradação da parede celular vegetal, esta
possui a capacidade potencial de se ligar e ajudar o GH, PL e CE a terem acesso
aos carboidratos incrustado na parede celular da planta. Vale ressaltar que a
maioria das espécies com exceção de Neopestalotiopsis sp. (37M), N.
clavispora, Neopestalotiopsis sp. (M2101E) e Neopestalotiopsis sp. (M2101)
apresentaram 1 unidade cada, de efetor pertencente a família das Glicosil
Transferase (GT) que são enzimas que catalisam a transferência de porções de
açúcar de moléculas doadoras ativadas para moléculas aceptoras específicas,
formando ligações glicosídicas. A maioria espécies com exceção de N.
clavispora, Neopestalotiopsis sp. (M2101B) e N. rosae, apresentaram efetores
pertencentes a família de Módulos de Ligação a Carboidratos (CBM) que ao
ligar-se ao carboidrato e direcionar a maquinaria catalítica para seu substrato,
aumentando assim a eficiência catalítica da enzima. Quando comparadas com
Ps. theae, P. fici e N. formicidarum, observa-se que os resultados foram
parecidos onde GH foi a maior quantidade, seguido de CE, e presença de GT e
CBM em quantidade mínima (Figura 3).

258
Número de Cazymes

Espécies

Figura 3. Quantitativo da Análise Funcional das espécies - (NP: Não patógeno; PT:
Patógeno).

Comparativo Efetores
Na análise comparativa observou-se que todas as linhagem compartilham
entre si 87 efetores, onde a maioria dos genes compartilhados entre as espécies
patogênicas e não patogênicas estão envolvidos em processos catabólicos,
como por exemplo, catabolismo da celulose, do DNA, Lignina, Pectina,
Polissacarideos e da Xilana que é um polissacarídeo complexo encontrado nas
paredes celulares das plantas (Biely et al. 2012) (Figura 4).
Quando comparado os efetores das espécies patogênicas, observa-se
um total de 367 efetores compartilhados por estas cinco linhagens, onde há
proteínas preditas como participante do ciclo celular meiótico, na regulação da
transcrição, também preditas proteínas que atuam na destruição da parede

259
celular do hospedeiro, como por exemplo a Tanase, que atua na hidrólise de
parte dos compostos fenólicos presentes em tecidos vivos ou em decomposição,
mais especificamente os taninos hidrolisáveis (Scalbert 1991), e a Quercetina
2,3-dioxigenase ou quercetinase, a qual está envolvida na degradação de
flavonóides, especificamente pertencentes ao grupo flavonol (Iacazio 2005;
Tranchimand et al. 2005). Já nas espécies não patogênicas observou-se um total
de 122 efetores compartilhados entre si, dentre esses genes identificou se
aquele que participam do processo biológico de degradação da parede celular
do hospedeiro, como o catabolismo do Xilano o qual é um componente da parede
celular. Quando avaliadas as singularidades de cada espécie, apenas
Pseudopestalotiopsis fici W106-1 (54 efetores) e Neopestalotiopsis sp. nov.
ML1664 (1 efetor) apresentaram genes especificos da espécie, como por
exemplo, genes relacionados ao processo biossintético da esterigmatocistina,
que é um metabólito secundário encontrado em fungos e está relacionada à
produção de substâncias tóxicas chamadas aflatoxinas bem como na regulação
do crescimento fúngico (Purchase e Van Der Watt 1968).

Figura 4. Análise comparativa efetores das espécies - (NP: Não patógeno; PT: Patógeno).

Conclusão
Os resultados apresentados condizem com o modo de vida das espécies,
e quanto aos efetores, todos estão completamente relacionados ao processo de
infecção e colonização, devido a função as quais foram identificadas, pois grande
parte está relacionada ao processo de degradação do tecido do hospedeiro, visto
que no quantitativo de sequências preditas no secretoma, e quanto ao número
de efetores preditos, observou-se que as espécies Neopestalotiopsis
formicidarum (CMIAINPA 2616), Neopestalotiopsis sp. nov. (PM2101E),
Neopestalotiopsis sp. nov. (37M), Neopestalotiopsis sp. nov. (IHI 201606) e

260
Neopestalotiopsis sp. nov. (CYF27), todas patogênicas, apresentaram um
número maior de sequências de secretoma e de efetores, frente as espécies não
patogênicas Neopestalotiopsis sp. nov. (ML1664), Neopestalotiopsis sp. nov.
(PM2101E), Neopestalotiopsis sp. nov. (PM2102B) e Pseudopestalotiopsis fici
(W106-1).

Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas pelo suporte financeiro e concessão de Bolsas de estudo obtido a
partir do programa Biodiversa (Edital Nº 007/2021). Ao Conselho Nacional de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e
CAPES-Amazônia Legal.

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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Investigação de extratos brutos de fungos endofíticos no

controle do Aedes aegypti e Sclerotinia sclerotiorum

Ferreira, Maria Eduarda Gonçalves1; Menezes Júnior, Orivaldo Teixeira de2;

Costa, Maria Beatriz Silva3; Demosthenes, Liane Cristine Rebouças2; Espindola,
Laila Salmen4; Souza, Antônia Queiroz Lima de5; Oliveira Camila Martins de1

1Universidade Federal de Rondonópolis, 2Instituto de Ciências Exatas e Tecnologia –

Itacoatiara/AM, 3Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho - São José do Rio
Preto/SP, 4Universidade de Brasília, 5Universidade Federal do Amazonas
Email: [email protected]

Resumo
Aedes aegypti é um vetor transmissor de diversos vírus causadores de
arboviroses, como a dengue, febre amarela, chikungunya e zika. A principal
medida de controle desse mosquito é a aplicação de inseticidas químicos que
podem induzir a geração de populações resistentes a, ao mesmo tempo, causar
danos ao meio ambiente. Os fungos endofíticos, importantes produtores de
metabólitos secundários com diferentes estruturas químicas, devem ser
pesquisados para serem utilizados no no controle de vetores que transmitem
doenças ao seres humanos, como o Ae. Aegypti, e no controle de patógenos
indutores de doenças em plantas. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi
avaliar a atividade larvicida do extrato bruto do fungo endofítico FAT50 contra
larvas de Ae. aegypti e, simultaneamente, a atividade antagônica do fungo
endofítico do gênero Guignardia (FAT37) contra o fitopatógeno Sclerotinia
sclerotiorum, agente causal do mofo branco. Foram avaliados dois fungos
endofíticos, um codificado como FAT50 e outro FAT37 isolados da planta
Passovia stelis. O endofítico FAT50 foi testado contra larvas do Ae. aegypti em
placas com 12 poços, cada um contendo 3 mL de água e 10 larvas de 3°
estádio de Ae. Aegypti. Em cada poço foram adicionados o extrato previamente
solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO) para uma concentração de 250 μg mL-
1
(massa de extrato/volume de DMSO). A leitura de mortalidade foi realizada em
24, 48 e 72 h e as larvas que não reagiram ao estímulo mecânico foram
consideradas mortas. No ensaio antagônico do endofífico FAT37 contra o S.
Sclerotiorum, realizada em triplicata, em planca de Petri contendo nmeio BDA,
um disco do fungo endofítico de aproximadamente 1 cm de diâmetro foi depositado
em um dos lados de placa Petri e o fitopatógeno que foi inserido no lado oposto
da placa, mantendo-as em estufa a 28°C, e concluindo o ensaio quando a placa
controle foi coberta totalmente pelo fitopatógeno. O extrato do fungo FAT50
apresentou 100% de mortalidade das larvas logo nas primeiras 24h de
exposição. No teste de antagonismo, o endofítico FAT37 apresentou efeito
inibitório parcial sobre o crescimento micelial do fitopatógeno. No entanto, novos
estudos devem ser conduzidos para esclarecer o potencial inibitório do fungo
FAT37, bem como realizar o isolamento dos compostos químicos presentes no
extrato bruto do fungo FAT50.

Palavras-chave: Controle biológico, Dengue, Antagonismo.

263
 Introdução
Há grande diversidade de doenças causadas por pragas urbanas,como o
mosquito Aedes aegypti, principal vetor de transmissão do vírus da Dengue e
também dos vírus causadores da febre amarela, Zika e Chikungunya (Teich et
al. 2018). A Dengue é a arbovirose mais prevalente no mundo, cujo vírus
pertence à família Flaviviridae, do gênero Flavivírus. Circulam quatro sorotipos
do vírus, que aumenta significativamente as formas graves e letais da doença. A
doença pode ser assintomática ou evoluir para quadros mais graves, como
hemorragia e choque levando a morte (Teixeira et al. 1999).
Segundo o boletim epidemiológico divulgado pelo Ministério da Saúde, os
casos de Dengue,no início de 2022 quase dobraram comparado ao mesmo
período de 2021. Até abril de 2022 foram registrados quase 400 mil casos
prováveis de Dengue, representando aumento de 95% em relação ao mesmo
período do ano anterior (Boletim Epidemiológico da Secretaria de Vigilância em
Saúde 2022).
O controle de epidemias causadas pelos vírus veiculados pelo Ae. aegypti
é realizado a partir da redução da população do mosquito na sua forma adulta
ou pupa, principalmente com aplicação de inseticidas químicos. Entretanto, a
utilizaçãodestes em larga escala, pode causar o desequilíbrio ecológico, uma
vez que afetammúltiplos organismos, além do Ae. aegypti, e contaminar a água
e o solo (Fonseca et al. 2019). Para contornar esse problema, uma alternativa é
a utilização de agentes de controle biológicos, dentre estes fungos endofíticos,
capazes de produzir diversas substâncias bioativas.
Doenças que afetam os vegetais são anomalias causadas geralmente por
microrganismos, como vírus, fungos e bactérias. As doenças causadas por
fungos fitopatogênicos são um dos problemas enfrentados pelos agricultores,
pois ocasionam perda na produtividade e na qualidade da produção (Dalsasso
2017). Os fitopatógenos induzem doenças em vegetais pela ação de enzimas e
toxinas, secretadas durante o processo infeccioso e colonização, que modificam
ometabolismo celular (Souza-Neto 2016). Dessa forma, favorecem apenas o seu
próprio desenvolvimento e dificultam a absorção de água e nutrientes pelo
hospedeiro, assim como a divisão celular e a permeabilidade das membranas.
Essas alterações acarretam a perda de vigor podendo ocasionar até a morte da
planta (Dalsasso 2017).

264
 O fungo Sclerotium sclerotiorum (Lib. ) de Bary, um patógeno necrotrófico
e homotálico, pertence à subdivisão Ascomycotina, classe Discomycetes, família
Sclerotiniaceae, ordem Helotiales e filo Ascomycota (Grabicoski 2012). Em
condições adequadas para o seu desenvolvimento, induz a doença conhecida
como mofo branco, podendo causar danos significativos à culturas de grande
importância econômica, como batata, feijão, soja, alface (Tupich et al. 2017).
A perda na produção causada pelo mofo branco, é elevado e varia de
acordocom a fase que a cultura é afetada. Se a infecção ocorrer no período de
pré-florescimento da soja, a perda pode atingir 100% da produção. Se a
infecção ocorrer no estádio de floração precoce, há rompimento prematuro de
vagens e há produção de grãos pequenos, podendo ocasionar até 70% de
perdas (Kuhn 2007). A eficácia dos fungicidas foliares aplicados para controlar a
doença, depende de vários fatores, como o tempo de aplicação, a fenologia das
plantas, as condições climáticas, o ciclo da doença, a cobertura de
pulverização e a duração da proteção. Apesar dos defensivos agrícolas
controlarem adequadamente o fitopatógeno, podem causar impactos
ambientais, como contaminação dos mananciais hídricos e dos solos e indução
de resistência no fitopatógeno (Dias et al. 2019).
O controle biológico utilizando microrganismos se destaca, pois consiste
na utilização de um organismo introduzido ou um habitante natural, antagônico,
capaz de reduzir as atividades metabólicas e a população de um fitopatógeno
(Leite et al. 2013; Mayer et al. 2016).
Assim, os fungos endofíticos por produzirem diversas moléculas bioativas,
podem ser úteis como agentes de controle biológico, abrangendo o estádio
larvicida do Ae. aegypti e o fitopatógeno S. Sclerotiorum, os quais acarretam
grandes prejuízossócio-econômicos para a sociedade.Dessa forma, o objetivo
desse trabalho foi avaliar a atividade larvicida do extrato bruto do fungo endofítico
FAT50 contra larvas de Ae. aegypti e o atividade antagonismo do fungo
endofítico do gênero Guignardia (FAT37) contra o fitopatógeno Sclerotinia
sclerotiorum, agente causal do mofo branco.

Material e Métodos
Foram avaliados dois fungos endofíticos, um codificado como FAT50,
utilizado no ensaio larvicida e outro, pertencentes ao gênero Guignardia

265
(FAT37), no teste antagônico contra S. sclerotiorum. Os fungos endofíticos foram
isolados da planta Passovia stelis (L.) Kuijit conforme adaptação das
metodologias descritas por Maier et al. (1997) e identificados através de
semelhanças macro e micromorfológicas.
Os fungos (endofítico e fitopatógeno) estavam conservados em água
destilada. A reativação destes foi efetuada utilizando placas de Petri contendo o
meio de BDA (batata-dextrose- ágar), previamente esterilizado por 20 minutos a
121°C, em autoclave.
Para o ensaio larvicida, o fungo endofítico FAT50 foi reativado em placas
de Petri contendo meio de cultura BDA. Após o crescimento micelial, o fungo foi
transferidoe cultivado em frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 300 mL de
caldo de batata e dextrose, à temperatura de a 28 ºC, de forma estacionária.
Após esse período, a cultura foi filtrada e o caldo foi submetido a uma partição
líquido-líquido com acetado de etila (3 x 150 mL). A fase orgânica foi concentrada
para a obtenção do extrato bruto que foi submetido ao ensaio larvicida.
As larvas de Ae. aegypti foram obtidas da colônia de linhagem Rockfeller
mantida no insetário ArboControl do Laboratório de Farmacologia da
Universidade de Brasília, cuja manutenção obedece aos protocolos
estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde (World Health Organization
2013).
O ensaio larvicida foi realizado em placas com 12 poços, cada um
contendo 3mL de água e 10 larvas de 3° estádio de Ae. aegypti. O extrato
foi previamente solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO) para uma concentração
de 250 μg mL-1 (massa de extrato/volume de DMSO) e, em seguida, adicionado
aos poços contendo as larvas. Preparou-se um controle negativo com DMSO na
concentração de 5% e o ensaio procedeu-se em quadruplicata. A leitura de
mortalidade foi realizada em 24, 48 e 72 h e as larvas que não reagiram ao estímulo
mecânico (leve agitação na água) foram consideradas mortas. Para ser
considerado ativo, o extrato deve causar mortalidade de no mínimo 80% da
população larval (World Health Organization 2013).
No ensaio antagônico, o fungo S. sclerotiorum foi cedido pelo grupo de
pesquisa em fitopatologia do Instituto de Ciências Exatas e Tecnológicas da
Universidade Federal do Amazonas.

266
 A avaliação antagônica foi realizada em triplicata de modo visual. A
interação entre o fungo endofítico e o fitopatógeno foi registrado seguindo a
classificação de Wheeler e Hocking (1993). Metodologia adaptada de Das e
Narzary (2017). Assim, um plug do fungo endofítico de aproximadamente 1 cm de
diâmetro foi depositado em um dos lados de uma placa Petri de 90 mm de
diâmetro contendo meio BDA, mantendo 1 cm de distância da borda, juntamente
com o fitopatógeno que foi inserido no lado oposto da placa (Fig. 1A). Como
testemunha, o fitopatógeno foi inoculado no centro de outra placa Petri (Fig. 1B).

Figura 1. Representação esquemática do ensaio antagonista.

Todas as placas foram mantidas em estufa a 28°C, e o ensaio foi concluído

quando a placa controle foi coberta totalmente pelo fitopatógeno.

Resultados e Discussão
No ensaio larvicida, constatou-se que o extrato de FAT50 foi ativo contra
larvasde 3º estádio de Ae. aegypti, causando a morte de 100% das larvas após
24 h de exposição. No controle positivo com DMSO, não houve morte larval,
indicando a atividade larvicida ocasionada pelo extrato fúngico.
Em estudos realizados por Júnior (2021), o extrato do Guignaridia sp.
causou a mortalidade de 85% das larvas em apenas 48 h e quando o tratamento
foi estendido para 72 h, ocasionou a a morte de 92,5% das larvas. Com o extrato
de Colletotrichum, a mortalidade foi inferior a 80% nas primeiras 48 hde
exposição, após 72 h.de exposição, a mortalidade atingiu 85%.
No teste de antagonismo, houve ação inibitória do fungo endofítico do
gênero Guignardia FAT37 impedindo o crescimento do fitopatógeno (Fig. 2). Os
metabólitos secundários produzidos pelo endofítico e difundidos no meio de
cultura provavelmente foram responsáveis para impedir o avanço de
crescimento micelial do S. sclerotiorum. A utilização do cocultivo também é uma

267
estratégia eficiente para explorar a diversidade química de fungos endofíticos,
pois ativa a expressão de genes que se encontravam silenciados induzindo a
produção de compostos químicos que os tornammais efetiva a competição por
espaço e nutrientes (Boga et al. 2022).
Thambugala et al. (2022) avaliando a ação inibitória de cinco estirpes de
fungos endófiticos, Colletotrichum gloeosporioides, C. siamense, Daldinia
eschscholtzii, Pseudopestalotiopsis chinensis e Phyllosticta capitalensis,
isoladas de folhas de Camellia sinensis, contra dos fitopatógenos Fusarium sp.,
Lasiodiplodia theobromae, Pestalotiopsis sp. e S. sclerotiorum, em ensaio de
cocultivo in vitro, constataram que todos os endófiticos exibiram atividade
antifúngica contra os fitopatógenos, apresentando zonas de inibição que
variaram de 4 a 18 mm de diâmetro entre as culturas. As estirpes dos endofíticos
D. eschscholtzii e C. gloeosporioides apresentaram maior efeito antagônico,
inibindo o crescimento micelial de S. sclerotiorum em 67,30% e 51,54%,
respectivamnete. Os fungos avaliados apresentaram efeito antagônico variando
entre moderado na faixa de 55% contra Fusarium sp., C. siamense e P.
chinenses. A inibição do crescimento micelial de Pestalotiopsis sp. por todos os
isolados endofíticos testados foi inferior a 25%.

Figura 2. . Reverso do meio de cultura indicando a ação do isolado FAT37 do fungo endofítico
inibindo o crescimento micelial do fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum.

Conclusões
O extrato bruto do fungo endofítico codificado FAT50 causou a morte de
100% das larvas de Ae. Aegypti, após 24h de exposição, indicando o potencial

268
da aplicação de extratos de fungos endofíticos para controle de vetores que
transmitem patógenos causadores de doenças em seres humanos.
Houve ação inibitória do fungo endofítico do gênero Guignardia FAT37
inibindo parcialmente o crecimento micelial do fitopatógeno S. Sclerotiorum.
Novos estudos devem ser conduzidos para esclarecer o potencial
inibitório do fungo FAT37, bem como realizar o isolamento dos compostos
químicos presentes no extrato bruto do fungo FAT50.

Agradecimentos
Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biodiversidade e
Produtos Naturais (INCT-BioNat ) pelo suporte financeiro é à Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Mato Grosso – FAMPEMA pela concessão da
bolsa.

Referências
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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Levantamento de fungos filamentosos em áreas de cultivo em

municípios da bacia do baixo e médio Amazonas

Vilamil, Edriely Souza1; Macêdo, Rosinara da Silva1; Neves, Suelem Cristina

Albuquerque1; Moreira, Railson Nogueira1; Demosthenes, Liane Cristine
Rebouças1

1
Universidade Federal do Amazonas.
Email: [email protected]

Resumo
O solo é um componente indispensável para a manutenção da qualidade
ambiental, constituindo-se em um dos principais habitats para o desenvolvimento
dos microrganismos envolvidos na decomposição da matéria orgânica, ciclagem
de nutrientes e aquelas mais específicas, como a fixação biológica de nitrogênio.
Este trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade de fungos filamentosos
presentes em amostras de solo oriundos de área de cultivos de frutíferas da
Bacia do Baixo e Médio Amazonas. Para realização deste levantamento, foram
feitas coletas nos municípios de Itapiranga, Maués, Silves, Parintins, Urucurituba
e Urucará. Em cada município foram escolhidas duas propriedades rurais para
a realização das coletas das amostras. Os fungos identificados e suas
características morfológicas foram apresentados na forma descritiva e
sumarizados em tabelas. Foram obtidos 65 isolados de fungos filamentosos dos
quais 27 foram identificados da maneira clássica, com base na sua morfologia,
como pertencentes ao Filo Ascomycota, Ordens Eurotiales e Hypocreales, e
gêneros: Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces Trichoderma e Fusarium. As
informações obtidas através do isolamento e identificação trouxeram maiores
esclarecimentos sobre a população de fungos filamentosos contribuindo para o
conhecimento da microbiota da região.

Palavras-chave: Biodiversidade, Microbiota solo, Amazonas

Introdução
O uso intensivo dos solos para as explorações agrícolas, sem considerar
as práticas de manejo e conservação, pode levar à modificação de suas
características e, consequentemente, alterar a presença de diferentes
comunidades biológicas presentes no solo. Dentre estas populações biológicas,

271
a presença de vários tipos de microrganismos, e mais especificamente, os
fungos filamentosos. Pode-se encontrar comunidades mistas de fungos
filamentosos atuando em vários processos, como biodeterioração e
biodegradação, contribuindo para ciclagem de nutrientes, dentre outros
processos, e consequentemente, para a manutenção dos ecossistemas (Borges
et al. 2011).
A abundância e a diversidade de fungos são vitais para a funcionalidade
do solo, pois diferentes organismos possuem diferentes características
fisiológicas e ecológicas, garantindo, assim, a ocorrência dos mais diferentes
processos nos solos frente às variações ambientais (Bever et al. 2012; Macedo
et al. 2023). A perda ou a redução dessa diversidade compromete a
funcionalidade do solo.
O solo é um componente imprescindível da qualidade ambiental, pois é
um dos principais habitats para o desenvolvimento dos microrganismos
envolvidos na decomposição da matéria orgânica, quebrando cadeias
carbônicas longas e liberando moléculas que servem de fonte de nutrientes para
as plantas e para outros organismos presentes na matriz do solo. São também
importantes para regular a presença de espécies de fungos desejáveis
(simbióticos, entomopatogênicos e os micoparasitas), na supressão de doenças
causadas por outros microrganismos, na promoção do crescimento de plantas e
na contribuição da fertilidade e estrutura do solo (Kirk et al. 2004; Farooq et al.
2021).
A elevada heterogeneidade dos solos permite a ocorrência de diferentes
habitats que irão influenciar diretamente na diversidade e abundância dos
microrganismos que nele habitam (Vos et al. 2013). Podem-se avaliar essas
transformações pela quantificação do número de microrganismos presentes,
diversidade de espécies ou por sua atividade. Os microrganismos respondem
rapidamente às variações ambientais e têm sido utilizados como indicadores
biológicos importantes nas transformações que ocorrem no solo (Farooq et al.
2021; Macedo et al. 2023).
O conhecimento da micota do solo, além de fundamental para o
levantamento taxonômico das populações que ali se encontram, pode levar ao
descobrimento de processos metabólicos utilizados por estes organismos que
poderão ser importantes em aplicações biotecnológicas. A utilização de fungos

272
como agentes de biocontrole em doenças de plantas está sendo muito estudado
como, o uso de Trichoderma, um fungo tipicamente presente em solos em várias
regiões, mais comumente encontrados em solos com maior teor de matéria
orgânica (Dias et al. 2013; Santos et al. 2023).
Os atributos microbiológicos são indicadores sensíveis às alterações
causadas pelos sistemas de manejo utilizados, podendo indicar a qualidade do
solo e suas funções relacionadas a sustentação da atividade agrícola e
ambiental. De acordo com Almeida et al. (2008) e Farooq et al. (2021), diferentes
manejos de cobertura vegetal no cultivo do mamoeiro influenciaram na
respiração basal e atividade de fosfatase ácida, além de afetar a atividade e
população de microrganismos nas camadas mais profundas do solo. Em culturas
comerciais, é fundamental o conhecimento dos efeitos das práticas agrícolas na
dinâmica das comunidades de fungos do solo, em função das transformações
que esses microrganismos promovem. Além disso, a avaliação da diversidade
de fungos é uma ferramenta importante na busca de uma agricultura sustentável,
que permita a manutenção da biodiversidade do solo (Carvalho 2008). Assim
sendo, as informações a respeito da presença, diversidade e identificação dos
fungos filamentosos do solo presentes em áreas de cultivo de frutíferas na região
Amazônica, podem servir como indicadores do estado do solo com aplicabilidade
no seu monitoramento e conservação.
Nesse trabalho, objetivou-se avaliar a diversidade de fungos filamentosos
presentes em amostras de solo de área de cultivos de frutíferas em municípios
da bacia do baixo e médio Amazonas.

Material e Métodos
Os estudos foram realizados no Laboratório de Química do Instituto de
Ciências Exatas e Tecnologia da Universidade Federal do Amazonas.
As amostras de solo foram coletadas nos municípios de Itapiranga,
Maués, Silves, Parintins, Urucurituba e Urucará situados na bacia do baixo e
médio Amazonas. Em cada município, foram selecionadas duas propriedades
rurais para as coletas em dois pontos diferentes da propriedade. A coleta foi
efetuada em três pontos aleatórios próximos ao caule das frutíferas (raio de 2
m), e coletado cerca de 500 g de solo da camada superficial (até 10 cm de
profundidade), acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados e

273
levadas ao Laboratório de Química do ICET onde se realizou o isolamento. O
isolamento foi feito segundo a metodologia proposta por Clark (1965) modificada,
em que foram pesados 25 g de solo, em seguida diluído em 225 mL de água
destilada autoclavada. Realizou-se uma diluição em série e das diluições 10-³ e
10-4 foi retirada uma alíquota de 200 µL para ser espalhada em placas de Petri
contendo meio de cultura BDA (batata, 200 g L-1; dextrose, 20 g L-1; ágar, 17 g
L-1, acrescido 100 mg L-1 de cloranfenicol).
As colônias fúngicas distintas foram purificadas através da técnica de
esgotamento por estrias no mesmo meio mencionado anteriormente, incubadas
a 26ºC, em estufa BOD, durante três dias. Após a purificação, as amostras foram
transferidas para placas de Petri com meio BDA para identificação, observando-
se as características macroscópicas (textura, coloração e diâmetro das colônias)
e microscópicas (microestruturas). Os isolados obtidos foram identificados à
nível de gênero segundo suas características morfológicas, culturais e
micromorfológicas, de acordo com Barnett e Hunter (1972). Para tanto, foram
preparadas lâminas das estruturas reprodutivas dos fungos em azul de algodão
em lactofenol e observadas ao microscópio óptico. Isolados representativos de
cada gênero identificado foram preservados em triplicata em microtubos sob o
método Castellani (Castellani 1939). As caracteristicas morfológicas foram
fotografadas.
Para os estudos morfológicos, discos de micélio de 5 mm² de diâmetro de
colônias puras dos fungos obtidos foram repicados individualmente, para o
centro de placas de Petri, contendo o meio BDA para observação e registro
fotográfico das características em cultura. A avaliação foi feita, para cada isolado,
observando e registrando características macromorfológicas da colônia. Os
dados obtidos foram sumarizados em gráficos, tabelas e apresentados na forma
descritiva. O acesso aos isolados foi registrado no Sistema Nacional de Gestão
do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen,
Cadastro Nº AC9B370).

Resultados e Discussão
A partir das amostras de solo analisadas foram obtidos 65 isolados de
diferentes gêneros. Esses isolados apresentaram diferenças na coloração e

274
aspecto do micélio, velocidade de crescimento e produção de pigmentos
observados pela alteração de coloração no meio de cultura (Figura 1).

Fotos: Vilamil (2020).

Figura 1. Características culturais de fungos filamentosos isolados de amostras de solo
Maués Urucurituba

O número de isolados por local de coleta variou de 32 obtidos no

município de Maués, 24 de Urucurituba e nove de Parintins. A diferença entre o
número de isolados obtida por município (Figura 2) variou em função da
presença de contaminantes, como leveduras e actinomicetos, em razão da
utilização de meio cultura simples (BDA) sem nenhuma propriedade seletiva, que
permitiu o crescimento de vários tipos de microrganismos, dificultando a
obtenção de isolados puros resultando em descarte de muitos isolados.

275
Fonte: Vilamil (2020).
Figura 2. Distribuição de isolados de fungos de acordo com o local de coleta.

Entre os 65 isolados obtidos, 27 foram identificados à nível de gênero com

base em sua morfologia, sendo esses pertencentes ao filo Ascomycota, a
maioria pertencente à ordem Eurotiales, sendo mais frequente os fungos dos
gêneros Aspergillus, Penicillium e Paecilomyces, e em menor frequência fungos
da ordem Hypocreales, com representantes dos gêneros Trichoderma e
Fusarium (Figura 3). Os gêneros identificados são habitantes típicos do solo de
áreas cultivadas e sistemas agroflorestais.
Os fungos do gênero Aspergillus, mais frequentes nesse levantamento,
são conhecidos por suas propriedades metabólicas e poder de biodegradação,
vasta presença em diversos biomas, tanto em regiões de clima tropical,
subtropical (Moreira e Siqueira 2006) quanto em ambientes secos e úmidos (Bills
et al. 2007).

276
Fonte: Vilamil (2020).
Figura 3. Número de isolados para cada gênero de fungos.

A distribuição dos gêneros de fungos presentes no solo pode variar em

função de muitos fatores, como clima, tipo de solo, vegetação, quantidade de
matéria orgânica, manejo realizado na área, utilização de pesticidas entre outros
(Prade et al. 2007). A elevada presença de isolados de Aspergillus pode ser
explicada pela sua capacidade em secretar enzimas hidrolíticas que confere a
habilidade em utilizar vários substratos, inclusive materiais ligninocelulósicos,
muito presentes em áreas com plantios de frutíferas. Na Figura 4 é apresentada,
a imagem microscópica de estruturas reprodutivas de dois gêneros encontrados
neste levantamento.

Foto: Demosthenes (2020). Objetiva: 40x

277
Figura 4. Conídios de Aspergillus spp., conidióforo e conídios de Penicillium spp.

Os dados obtidos se assemelham aos resultados relatados por Abdel-

Sater et al. (2016) que avaliaram a diversidade de fungos filamentosos e
leveduras em solos com plantios de videiras e citros no Egito e encontraram,
com maior frequência fungos do gênero Aspergillus, Penicillium, Fusarium e
Humicola. Segundo Cannon e Sutton (2007), várias características contribuem
para a diversidade de fungos presentes no ambiente, como fatores abióticos
(temperatura, umidade, precipitação e insolação), variedade florística reduzida,
agregação e tamanho das partículas do solo, manejo inadequado das áreas
cultivadas e tempo de cultivo também podem contribuir para a redução da
diversidade desses organismos (Borges et al. 2011).
Costa et al. (2017), avaliaram a diversidade de fungos filamentosos do
solo de uma área de sistema agroflorestal em Pernambuco, e identificaram 110
espécies, sendo os mais frequentes e dominantes, fungos do gênero Penicillium,
Aspergillus e Trichoderma, demonstrando a capacidade de adaptação de
espécies deste gênero, além da presença de muitos gêneros raros. Segundo
Costa (2017), a composição florística diversa dos sistemas agroflorestais, o
menor impacto de práticas agrícolas e maior semelhança à ambientes naturais
resulta em alterações na composição do solo determinando uma maior
diversidade de nichos para fungos decompositores contribuindo para essa maior
diversidade. A presença de diferentes gêneros também indica que outras
funções ecológicas estão sendo realizadas, como a presença de isolados do
gênero Trichoderma que atuam como antagonistas e isolados do gênero
Fusarium, que são espécies fitopatogênicas. Os aspectos morfológicos das
colônias são apresentados nas Tabelas 1, 2 e 3. Ainda são necessários a
identificação de todas as espécies obtidas, pela via clássica e molecular, e uma
avaliação por maior período de tempo para se obter dados mais robustos sobre
a diversidade de fungos nos solos da região.

Tabela 1. Caracterização macromorfológica dos isolados de Maués.

Identificação Frutífera Coloração do micélio
Verso Reverso
MAU-01 Mangueira Branco Branco
MAU-02 Mangueira Branco Branco
MAU-03 Mangueira Branco Branco

278
 MAU-04 Castanheira Verde escuro Amarelo
MAU-05 Castanheira Cinza Roxo
MAU-06 Castanheira Cinza e branco Marrom
MAU-07 Cajueiro Verde escuro Cinza escura
MAU-08 Cajueiro Verde escuro Branco e amarelo
MAU-09 Cajueiro Verde claro Cinza
MAU-10 Ingazeiro Verde claro Branco
MAU-11 Goiabeira Rosa Branco
MAU-12 Goiabeira Verde claro Cinza

Tabela 2. Caracterização macromorfológica dos isolados de Urucurituba.

Identificação Frutífera Coloração do micélio
Verso Reverso
URU-01 Gravioleira Marrom Laranja
URU-02 Gravioleira Verde escuro Verde e branco
URU-03 Gravioleira Cinza escuro Marrom
URU-04 Cupuaçuzeiro Preto Branco
URU-05 Cupuaçuzeiro Verde Branco
URU-06 Laranjeira Marrom e branco Vermelho escuro
URU-07 Laranjeira Cinza claro Marrom claro
URU-08 Cacaueiro Cinza Vermelho e amaelo
URU-09 Bananeira Cinza Preto
URU-10 Bananeira Verde escuro Amarelo e verde
URU-11 Bananeira Verde claro Amarelo

Tabela 3. Identificação e aspecto macromorfológico dos isolados de Parintins.

Identificação Frutífera Coloração do micélio
Verso Reverso
PAR-01 Tucumazeiro Verde escuro Cinza Claro
PAR-02 Tucumazeiro Branco e Verde Branco e Preto
PAR-03 Biribazeiro Branco Branco e Amarelo
PAR-04 Gravioleira Verde Branco

Conclusões
Foram obtidos 65 isolados, sendo mais frequentes as espécies do filo
Ascomycota, ordens Eurotiales e Hypocreales. Os fungos do gênero Fusarium,
Paecilomyces, Penicillium e Trichoderma e Aspergillus foram os mais
frequentemente isolados.

Agradecimentos
À Universidade Federal do Amazonas, pelo apoio na realização deste
estudo, e à FAPEAM, pela concessão da bolsa de iniciação científica.

279
 Referências
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281
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Mineração genômica de Bacillus velezensis MPUR 51.6 voltada

a identificação de genes relacionados ao biocontrole e
promoção de crescimento vegetal

Amorim, Ana Beatriz Araújo1; Sousa, Thiago Fernandes 2; Silva, Gilvan Ferreira3

1InstitutoFederal de Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas, 2Universidade

Federal do Amazonas, 3Embrapa Amazônia Ocidental
E-mails: beatrizamorim51@gmail; [email protected]; [email protected]

Resumo
Bactérias do gênero Bacillus constituem grande parte dos produtos para o
biocontrole de pragas e doenças em plantas, sendo de grande importância para
a promoção de uma agricultura mais sustentável pela minimização de impactos
ambientais e pela substituição de pesticidas químicos. Nesse sentido, Bacillus
velezensis FZB42 é reconhecido como uma linhagem modelo para biocontrole e
promoção de crescimento de plantas devido a alta produção de fitormônios e de
potentes metabólitos secundários antifúngicos. No presente trabalho, foi
analisado o potencial genômico de MPUR 51.6 isolada de sedimento do rio
Purús. A análise filogenômica revelou proximidade com 91.8% de dDDH de
MPUR 51.6 com a linhagem FZB42 e a análise de sintenia confirma a presença
de clusters gênicos biossintéticos (BGCs) para produção dos antimicrobianos
macrolactina H, bacilaeno, bacilibactina, bacilisina, dificidina e surfactina. Além
disso, foi identificado um BGC específico da linhagem MPUR 51.6 para produção
de um antibiótico tiopeptídico no qual não está caracterizado nos bancos de
dados. Foram identificados genes relacionados ao metabolismo do ácido indol-
3-acético (AIA) demonstrando o potencial da linhagem na produção de
fitormônios. Por fim, os ensaios de antagonismo com MPUR 51.6 demonstrou
resultados positivos para inibição de Fusarium fabacearum CPAA 10621,
Colletotrichum scovilei INPA 2917 e Colletotrichum spaethianum INPA 2908.
Esses resultados confirmam o potencial de MPUR 51.6 aplicação na agricultura
e caracterização de novos produtos naturais. Este trabalho também demonstra
o uso de recursos genéticos amazônicos para prospecção de novos ativos
biológicos.

Palavras-Chave: Bacillus, BGCs, fitormônios.

Introdução
Bacillus velezensis é uma bactéria Gram-positiva reconhecida como
modelo de agente de biocontrole, sendo alvo de inúmeras investigações
recentes para melhor compreender suas propriedades (Fan et al. 2018). O
potencial antimicrobiano de B. velezensis é atribuído à produção de compostos

282
bioativos, como lipopeptídeos, surfactantes e enzimas. Seu amplo espectro de
atividade contra diversos fitopatógenos torna B. velezensis uma alternativa
promissora aos pesticidas químicos, contribuindo para uma agricultura mais
sustentável e segura (Chowdhury et al. 2015).
Para se ter uma ideia do potencial metabólico de B. velezensis, a linhagem
FZB42 produz sete moléculas fungicidas (fengicina, bacilomicina D,
bacilibactina, dificidina, bacilisina, amylocyclicina e plantazolicina). Esse isolado,
já foi aplicado como biocontrolador de Fusarium graminearum em trigo,
Xanthomonas oryzeae em arroz, Phytophthora sojae em soja, Sclerotinia
sclerotiorum em tomate, Rhizoctonia solani em alface e muitas outras espécies
de importância econômica (Erlacher et al. 2014; Wu et al. 2015; Farzand et al.
2019; Hanif et al. 2019; Han et al. 2021).
Além do potencial de biocontrole, B. velenzensis também tem potencial
para promoção de crescimento vegetal muito devido a vias alternativas para
produção de ácido indol acético (AIA) (Myo et al. 2019). Análises com a deleção
dos genes trpABDE (genes relacionados ao precursor de AIA triptofano), ysnE
(AIA transacetilase) e yhcX (nitrilase) mostram que nos mutantes houve tanto
uma diminuição drástica de AIA produzido quanto perda de capacidade em
promover o crescimento vegetal (Idris et al. 2007).
No presente trabalho, foi obtido o genoma completo de uma linhagem de
Bacillus velezensis dos sedimentos do rio Purús. As comparações genômicas
revelam alta similaridade com o isolado modelo de biocontrole FZB42. Nesse
sentido, focamos na análise de genes compartilhados entre esses isolados a fim
de identificar genes de interesse para o biocontrole e promoção de crescimento,
bem como identificar variações entre esses isolados.

Material e Métodos
Obtenção do isolado MPUR 51.6
1g de sedimento do rio Purús (Amazônia) foi diluído em 10 mL de água
destilada ultrapura. 50 µL dessa diluição foi plaqueada em meio ISP2 por dois
dias a uma temperatura de 28°C. A colônia foi isolada e conservada em ISP2 +
20% de glicerol.

283
Sequenciamento do genoma completo, análise filogenômica e análise de
cluster gênicos biossintéticos (BGCs)
A extração de DNA foi realizada seguindo as recomendações do protocolo
CTAB 2%, e o sequenciamento foi realizado por meio da plataforma Illumina
usando 150 de pair ended. A análise filogenômica foi realizada pela plataforma
TYGS (https://tygs.dsmz.de/) e a identificação de clusters gênicos biossintéticos
foi realizada por meio da plataforma antiSMASH
(https://antismash.secondarymetabolites.org/#!/start).

Análise comparativa via orthovenn e sintenia

A análise de sintenia foi realizada usando o pipeline clinker &
clustermap.js (Gilchrist et al. 2021). Para isso, os arquivos Genbank de BGCs já
caracterizados foram extraídos pelo repositório MIBIG. Os arquivos genbank dos
BGCs de MPUR 51.6 foram obtidos por meio do antiSMASH. A comparação nos
BGCs e as buscas de similaridade foram baseadas no algoritmo TBLASTX em
clinker e a visualização da sintenia foi realizada pelo clustermap.js.

Análise de antagonismo in vitro

Placas contendo o meio BDA (200 g/L Batata; 20 g/L Dextrose; 15 g/L de
ágar) foram inoculadas com o isolado MPUR 51.6 a uma distância de oito
centímetros das bordas em conjunto com o fitopatógeno, no qual foi inoculado
no centro da placa. Após as inoculações as placas foram incubadas a 28°C por
sete dias. O controle foi realizado com a inoculação do fitopatógeno no centro da
placa e sem a inoculação de MPUR 51.6. Os fitopatógenos testados foram:
Fusarium fabacearum CPAA 10621, Colletotrichum scovillei INPA 2910,
Colletotrichum spaethianum 2908.

Resultados e Discussão
A análise filogenômica permitiu a identificação de MPUR 51.6 como
pertencente à espécie Bacillus velezensis FZB42 com 91.8% de dDDH em
relação ao isolado FZB42 (Figura 1). A análise de cluster gênico biossintético
revelou 15 BGCs correspondentes a quatro PKS, duas à produção terpenos, três
híbridos, quatro NRPS, um RiPP e um BGC não classificado (Other). 5 BGCs

284
foram identificados com 100% de similaridade com BGCs relacionados à
produção de macrolactina H, bacilaeno, bacilibactina, bacilisina, dificidina e
surfactina. As análises de sintenia confirmam o potencial para produção desses
compostos que são em sua maioria antifúngicos (Chowdhury et al. 2015) (Figura
2).

Figura 1 - Filograma com base no genoma completo mostrando as relações de MPUR 51.6
com isolados de Bacillus velezensis. O isolado obtido neste estudo está marcado de
vermelho.

285
Figura 2 - Análise de sintenia de cluster gênicos biossintéticos entre MPUR 51.6 e FZB42.
A) Sintenia de BGCs relacionados a produção de bacilibactina; B) Sintenia de BGCs
relacionados a produção de bacilisina; C) Sintenia entre BGCs relacionados a produção de
dificidina; D) Sintenia dos BGCs relacionados a produção de bacilaeno; E) Sintenia dos BGCs
relacionado a produção de surfactina; F) Sintenia dos BGCs relacionado a produção de
macrolactina H.

Além disso, foi identificado um BGC não compartilhado entre MPUR 51.6
e FZB42 relacionado a um peptídeo ribossomal pós traducionalmente
modificado. Esses resultados indicam que o isolado amazônico obtido nesse
trabalho, além das características desejáveis de biocontrole, possui mais um

286
cluster biossintético no qual até o presente momento permanece não identificado
e que possui características de um BGC relacionado a produção de antibióticos
tiopeptídicos (Figura 3).

Figura 3 - Análise de sintenia entre regiões homólogas de MPUR 51.6 e FZB42 revelando a
inserção de um BGC organizado em operon (genes em cinza) para a produção de
tiopeptídeos no genoma de MPUR 51.6.

A análise comparativa entre MPUR 51.6 e FZB42 mostra 15 proteínas não

compartilhadas. Quando realizado o blast para a identificação da função foram
observados hit com proteínas de fagos nos scaffolds 2, 3 e 5 (Figura 4). Em
adição quando prospectados genes relacionados à produção de AIA, todos os
genes foram localizados, o que indica que o isolado MPUR 51.6 pode promover
o crescimento de plantas (Tabela 1).

Figura 4 - Análise de proteínas ortólogas preditas com base no genoma dos isolados MPUR
51.6 e FZB42 mostrando 3148 proteínas compartilhadas e 31 proteínas específicas.

287
Tabela 1- Genes de Bacillus velezensis FZB42 e Bacillus velezensis MPUR 51.6 associados
à biossíntese de triptofano e ao metabolismo do ácido indol-3-acético (AIA).
Código da Identidade dos acessos
Acesso das proteínas
Função predita do gene enzima de proteínas de FZB2
de FZB42
(EC) com MPUR
51.6 (pb / identidade%)
Enzimas relacionadas à
produção de Triptofano
trpE CAL26225.1 Antranilato sintase 4.1.3.27 512/515 (99%)
Antranilato
trpD CAL26226.1 2.4.2.18 335/338 (99%)
fosforibosiltransferase

Triptofano subunidade α
trpA CAL26231.1 4.2.1.20 261/265 (98%)
sintase
Triptofano subunidade β
trpB CAL26229.1 4.2.1.20 396/400 (99%)
sintase
Proteínas homólogas
envolvidas na
biossíntese de AIA
YedL CAL26203.1 N-acetiltransferase 2.3.1 170/173 (98%)
NADP-dependente indol-3-
YozC CAL26192.1 1.2.1.3 67/67 (100%)
acetaldeído desidrogenase
YhcX CAL26199.1 Nitrilase 3.5.5.1 511/512 (99%)

O ensaio de cultura pareada revelou a produção de antifúngicos, sendo

MPUR 51.6 capaz de inibir o crescimento micelial de todos os fitopatógenos
testados, com destaque para a inibição de INPA 2910 no qual foi observada a
maior redução (Figura 5). Colletotricum scovillei INPA 2910 foi isolado como um
patógeno causando podridão de fruto em pimenta-de-cheiro (Capsicum
chinense), esse fitopatógeno representa ameaça a diversas variedades de
pimenta no mundo todo (Kanto et al. 2014; Oo et al. 2017).

288
Figura 5 - Ensaio qualitativo do potencial para produção de antifúngico em Bacillus velezensis
MPUR 51.6 contra diferentes espécies de fitopatógenos.

Esses resultados em conjunto demonstram que o isolado amazônico de

Bacillus velezensis possui características para o biocontrole e promoção de
crescimento. Além disso, genes específicos foram identificados e podem ser a
chave para caracterização de novos produtos naturais bem como novos ativos
biotecnológicos.

Conclusões
O isolado MPUR 51.6 pertence a espécie Bacillus velezensis. A linhagem
possui 15 BGCs envolvidos na biossíntese de produtos naturais. Com base nos
BGCs que apresentaram alta similaridade foi possível predizer o potencial para
produção de macrolactina H, bacilaeno, bacilibactina, bacilisina, dificidina e
surfactina. Um BGC específico da linhagem MPUR 51.6 relacionado a
antibióticos tiopeptídicos foi identificado. Além disso, genes relacionados à

289
produção de AIA foram localizados no genoma, indicando que o isolado MPUR
51.6 pode promover o crescimento de plantas. Os testes de antagonismo contra
diferentes fitopatógenos revelam a produção de antifúngicos.

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291
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Mineração genômica de Penicillium labradorum INPA-AP10:

prospecção de Produtos Naturais em linhagem isolada de
sedimentos do rio Amazonas

Silva, José Carlos Ipuchima1; Neves, Kiandro de Oliveira Gomes2; Queiroz,

Claudia Afras de3,5; Yamagishi, Michel Eduardo Beleza4; Koolen, Hector
Henrique Ferreira5; Silva, Gilvan Ferreira6

1Universidade do Estado do Amazonas, 2Universidade Federal do Amazonas, 3Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia, 4Embrapa Digital, 5Universidade do Estado do
Amazonas, 6Embrapa Amazônia Ocidental
E-mail: [email protected]

Resumo
A procura por produtos naturais (PN) de origem microbiana vem aumentando
nos últimos anos. Nesse sentido, fungos do gênero Penicillium ganham destaque
pela capacidade de biossintetizar uma ampla diversidade de metabólitos
secundários que podem ser aplicados na indústria farmacêutica e na agricultura.
Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi realizar mineração genômica de
agrupamentos gênicos relacionados à biossíntese de PN de Penicillium
labradorum INPA-AP10, uma linhagem isolada de sedimentos do rio Amazonas.
Inicialmente o DNA genômico foi extraído pelo método CTAB 2% e sequenciado
na plataforma Illumina©. Após a montagem do genoma foi realizada a predição
de BGC’s (Biosynthetic Gene Clusters) com o antiSMASH 7.0, na versão para
fungos. Foram identificados 35 BGC’s sendo 10 PKS (policetídeo sintase), 5
NRPS (sintase de peptídeo não ribossomal), 5 NRPS-like, 6 terpenos, 2
betalactonas, 4 Fungal-RiPP e 3 BGC’s híbridos (NRP-metallophore/ NRPS,
betalactone/NRPS, T1PKS/NRPS-like). Quatro clusters preditos (BGC: 3, 8, 10
e 29) exibiram altos níveis de similaridade (≥70%) com vias de biossíntese já
caracterizadas e disponíveis na base de dados MIBiG (Minimum Information
about a Biosynthetic Gene cluster), enquanto 2 (BGC: 13 e 23) exibiram
similaridade moderada (30-70%) e 3 (BGC: 1, 2 e 6) mostraram baixa
similaridade (1-29%), 26/35 clusters não apresentam nenhuma similaridade com
BGC’s conhecidos. Apesar de alguns clusters apresentarem alta similaridade, a
análise de sintenia revela que esses BGC’s não conseguem formar os PN
correspondentes às vias já caracterizadas, indicando que a linhagem INPA-AP10
pode produzir novas moléculas ou sintetizar PN com estrutura química
semelhante. A partir dos BGC’s que apresentaram alta similaridade foi possível
predizer o potencial para produção do sideróforo dimetil coprogênio e nidulanina
A. Este estudo revela o alto potencial de P. labradorum INPA-AP10 para
produção de novos metabólitos secundários ou para PN não conectados a suas
vias de biossíntese. Sendo este o primeiro estudo genômico de P. labradorum
voltado à prospecção de metabólitos secundários.

Palavras-chave: genômica, BGC, mineração, Penicillium.

292
 Introdução
A adaptação dos microrganismos a diversos ambientes, bem como a
necessidade de defesa contra outros organismos, resultou no surgimento de
compostos bioativos com ampla diversidade química. Essa diversidade de
produtos naturais (PN) biossintetizados por microrganismos pode ser utilizada
na agricultura e em diferentes segmentos da indústria, como a de cosméticos,
farmacêutica, entre outros (Brakhage 2013; Katz et al. 2016).
Dentre os microrganismos capazes de sintetizar PN estão os fungos, que
são bastante conhecidos pela capacidade de produzir uma grande variedade de
moléculas biologicamente ativas, tais como: antiparasitários, antibacterianos,
antifúngicos, antitumorais e imunossupressores (Gaynes 2017).
No reino Fungi, espécies do gênero Penicillium são encontradas
comumente na vegetação em decomposição, no solo e no ar. Este gênero é
conhecido historicamente pela produção de antibióticos, como a penicilina que
possui atividade antibacteriana de amplo espectro, como o antitumoral ácido
clavárico e a micotoxina ácido penicílico (Houbrake 2016; Perrone 2017).
A biossíntese de produtos naturais em microrganismos, na maioria das
vezes, está associada a agrupamentos gênicos responsáveis por sua
biossíntese, também conhecidos como Biosynthetic Gene Clusters (BGC). A
identificação de BGC’s associados a moléculas de interesse é um campo
crescente, e essa abordagem tem recebido o nome de "mineração genômica", e
pode ser realizada com base em ferramentas de bioinformática como o
antiSMASH (Madema et al. 2021).
A plataforma antiSMASH é de acesso público e está disponível online
desde 2011, utilizada para detectar e caracterizar BGC’s em genomas de
bactérias, fungos e plantas. A versão 6.0 do software é capaz de identificar 71
tipos diferentes de clusters depositados no MIBiG (Blin et al. 2021). A base de
dados MIBiG apresenta 2502 BGC’s cujos metabólitos secundários apresentam
a via de biossíntese caracterizada com base em experimentos que combinam
abordagem química e de genômica funcional (como gene Knockout, expressão
heteróloga entre outras) utilizada para predizer a função de cada gene membro
do BGC (Terlouw et al. 2023).
Os BGC’s são localizados no genoma por meio de ferramentas que
identificam a presença de genes que codificam enzimas para as principais

293
classes de metabólitos secundários, estes genes são chamados de “gene core”
(Coussement et al. 2020). A identificação das classes de metabólitos
secundários com base nos BGC’s e a predição de PN por meio da composição
de genes presentes no agrupamento, representa um avanço na bioprospecção
de moléculas a partir de genomas completos sequenciados (Abbasi et al. 2020;
Albarano et al. 2020; Lin et al. 2020).
A mineração ainda possibilita a identificação dos chamados clusters
órfãos, que estão relacionados à biossíntese de moléculas novas, revela BGC’s
que estão silenciados, além daqueles que são crípticos. Os BGC’s crípticos
apresentam baixa expressão o que dificulta a identificação química das
moléculas relacionadas a esse tipo de BGC. (Seyedsayamdost et al. 2020).
Consequentemente, o acúmulo de informações genômicas têm mostrado
que a capacidade metabólica de muitos microrganismos é amplamente
subestimada, visto que em condições de laboratório a maioria dos BGC’s estão
silenciados ou são crípticos (Medema et al. 2021). Contudo a mineração
genômica combinada com técnicas de cultivo como OSMAC ou ferramentas de
edição gênica pode possibilitar o desbloqueio dessas vias de biossíntese e dessa
forma explorar o potencial metabólico contido em cada genoma.
Deste modo, o objetivo deste trabalho foi realizar a mineração do genoma
de P. labradorum INPA-AP10 a fim de explorar seu potencial biotecnológico para
a biossíntese de PN.

Material e Métodos
O organismo selecionado para o presente estudo foi uma linhagem de P.
labradorum isolado de amostras de sedimentos do rio Amazonas pela Embrapa
Amazônia Ocidental, e depositado na coleção microbiológica do Instituto
Nacional de Pesquisa da Amazônia – INPA, com o código INPA-AP10. Cadastro
de Acesso ao patrimônio genético Nº AB6B14F.
A espécie fúngica foi cultivada em caldo Batata Dextrose por 7 dias a 28°C
e rotação de 150 rpm. Em seguida, a extração do DNA genômico foi realizada
com CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) 2% de acordo com a
metodologia de Doyle e Doyle (1987).
O genoma completo do isolado INPA-AP10 foi sequenciado na plataforma
Illumina com read length: 2 x 150 (Paired End). A montagem “de novo” foi

294
realizada utilizando o SPAdes (Prjibelski et al. 2020). O genoma completo de P.
labradorum INPA-AP10 apresentou um tamanho total de 26.3 Mb, com 205
scaffolds, 52% de conteúdo G/C, N50 de 631.997pb e L50 de 15.
Com base no genoma completo, a mineração genômica do isolado INPA-
AP10 foi realizada usando a ferramenta antibiotics and Secondary Metabolites
Analysis SHell (antiSMASH), versão 7.0 para fungos (fungiSMASH), com
parâmetros de acordo com Blin et al. (2021).
Para os BGC’s que apresentaram 100% de similaridade, foi realizada a
análise de sintenia, por meio do pipeline Clinker & clustermap.js (Gilchrist &
Chooi, 2021), com traduções de aminoácidos de genes em cada cluster
extraídas e alinhadas usando o pacote BioPython (versão 3.1), a fim de
determinar a identidade entre os genes dos BGC’s preditos para a linhagem e os
BGC’s de referência depositados no MIBiG. Os domínios de PKS e NRPS foram
determinados por meio das plataformas PKS/NRPS Analysis Web-site
(http://nrps.igs.umaryland.edu/) e InterPro (www.ebi.ac.uk/interpro/).
Foram considerados novos clusters aqueles que inicialmente não
apresentaram nenhuma similaridade com BGC’s disponíveis no banco de dados
MIBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster), e com base em
análise manual e sintênica também foram considerados BGC’s relacionados a
novos PNs aqueles cuja a santeria não indicou correspondência em todos os
genes presentes de vias biossintéticas já caracterizadas e com moléculas
identificadas quimicamente (Medema et al. 2015; Epstein et al. 2018).

Resultados e Discussão
Foram identificados 35 BGC’s, sendo as PKS as mais abundantes com 10
cluster localizados no genoma, destes 9 são PKSs (policetídeo sintase) do Tipo
I e uma PKS Tipo 3, seguido por NRPS (peptídeo sintetase não ribossomal),
NRPS-like (BGC’s semelhante a NRPS), terpenos, betalactonas, e fungal-RiPP
(peptídeos sintetizados ribossomalmente e modificados pós-traducionalmente),
além dos BGC’s híbridos (BGC’s que combinam genes pertencente a mais de
uma classe ou que apresenta um gene que codifica proteínas com domínios
oriundo de diferentes classes) NRP-metallophore/NRPS, PKS T1/NRPS-like e
betalactona/NRPS (Figura 1).

295
 Dos 35 BGSs preditos (Tabela 1) 4 exibiram altos níveis de similaridade
(≥70%) com BGC’s depositados no banco de dados MIBiG, dois exibiram
similaridade moderada (30-69%) e 3 tiveram baixa similaridade (1-29%) e os 26
restantes não apresentaram similaridade com BGC’s conhecidos, indicando que
o genoma de P. labradorum INPA-AP10 74,2 % dos BGC estão relacionado a
biossíntese de novos produtos naturais ou moléculas caracterizadas
quimicamente, mas que não possui os genes relacionados a sua biossíntese
ainda descritos ou depositados na base de dados MIBiG.

Figura 1 - Mineração genômica de Penicillium labradorum INPA-AP10. Em (A) distribuição

de 35 BGC’s identificados e distribuídos com bases na classe de produtos naturais
relacionadas ao gene core: NRPS, PKS T1 e T3, terpeno, NRPS-like, betalactona, Fungal-
RiPP e híbridos. Em (B) similaridade mensurada com base no número de genes que
apresentam correspondência com vias de biossíntese já caracterizadas e depositadas na
base de dados MiBIG que abriga anotações e metadados de BGC’s e seus produtos
moleculares, foi considerada alta similaridade (≥70%), média moderada (30-69%), baixa
similaridade (1-29%), sem similaridade (0%).

Policetídeo sintase (PKS) foi o tipo de BGC predominantemente

encontrado no genoma de P. labradorum INPA-AP10, e representa 28,5% dos
BGC’s, sendo 9 PKS T1 e uma PKS T3, estes clusters estão envolvidos na
biossíntese de policetídeos (PK), uma classe de PN que utilizam actil-CoA e
malonil-CoA como blocos construtores. Estes metabólitos possuem ampla
importância farmacológica apresentando atividades antimicrobianas
(eritromicina), antifúngica (anfotericina), antiparasitária (avermectina),
antitumoral (sofaren A), inibidor do crescimento vegetal (resorcilida), entre outros
(Paulo, Sigrista e Oliveira 2019).
As PKS são classificadas em altamente redutoras, parcialmente redutoras
e em não redutoras, de acordo com o nível de redução que realizam. Estas
enzimas também são classificadas em Tipo 1 (PKS T1), Tipo 2 (PKS T2) e Tipo

296
3 (PKS T3) de acordo com a composição e organização estrutural de seus
domínios funcionais (Herbst, Townsend e Maier 2018).
Entre as PKSs identificadas no genoma, o BGC-1 apresentou 18% de
similaridade ao cluster responsável pela síntese do policetídeo 1 RES-1214-2.
Já o BGC-24 apresentou 66% de similaridade, possuindo 4 dos 6 genes
responsáveis pela síntese de 2 trans-resorcilida (Figura 2).

Tabela 1. Clusters gênicos biossintéticos (BGC’s) preditos com base no genoma de P.

labradorum INPA-AP10.
Comprimento % BGC mais
BGC Tipo MIBiG ID***
pb** Similaridade semelhante
1 PKS T1 43,955 18 RES-1214-2 BGC0000121
2 PKS T1 46,645 18 aurofusarina BGC0002709
3 Terpeno 24,214 100 ácido clavárico BGC0001248
4 Betalactona 24,241 0 - -
5 NRPS 52,272 0 - -
6 Terpeno 21,495 12 azasperpyranone A BGC0002267
7 Betalactona 31,183 0 - -
NRP-
8* 96,388 100 dimetil coprogênio BGC0001249
metallophore,NRPS
9 PKS T1 48,148 0 - -
10 NRPS-like 43,833 100 colina BGC0002276
11 PKS T1 39,929 0 - -
12 NRPS 46,436 0 - -
13 Terpeno 21,538 60 esqualestatina S1 BGC0001839
14 PKS T1 77,412 0 - -
15 NRPS 46,308 0 - -
16 NRPS 64,234 0 - -
17 NRPS-like 43,358 0 - -
18 NRPS-like 44,38 0 - -
19 Terpeno 22,17 0 - -
20 PKS T1 38,87 0 - -
21 Fungal-RiPP 36,603 0 - -
22 Terpeno 21,188 0 - -
23 PKS T1 38,666 66 trans-resorcilida BGC0001246
24 PKS T1 62,432 0 - -
25 Terpeno 23,929 0 - -
26 NRPS-like 43,288 0 - -
27 PKS T1 36,618 0 - -
28 NRPS-like 43,293 0 - -
29 NRPS 58,565 75 nidulanina A BGC0001699
30 Fungal-RiPP-like 60,901 0 - -
31 Fungal-RiPP-like 35,452 0 - -

297
32* PKS T1, NRPS-like 50,792 0 - -
33* Betalactona, NRPS 26,795 0 - -
34 PKS T3 10,669 0 - -
35 Fungal-RiPP-like 6,098 0 - -

*BGC híbrido; **comprimento em pares de base; ***representa o código do BGC cuja similaridade
foi identificada no MIBiG.

Outro cluster com 18% de similaridade (BGC-2) é o responsável pela

biossíntese da 3 aurofusarina e foi analisado (Figura 2). Com base na
composição de genes observada na sintenia é possível inferir que as moléculas
sintetizadas por estes clusters na linhagem INPA-AP10 não serão iguais aos
compostos 1, 2 e 3, embora possa apresentar o esqueleto principal da molécula
estruturalmente similar, isto porque o gene "core" que é o responsável pelo
"chassi" da molécula é compartilhado entre os BGC’s depositados no MIBiG e
os da linhagem aqui estudada.

Figura 2 - Análise sintênica de três clusters de policetídeo sintase (PKS) relacionados a

síntese de (1) RES-1214-2, (2) trans-resorcilida, (3) aurofusarina, com BGC’s de P.
labradorum INPA-AP10. O percentual de similaridade entre os genes está apresentado nas
caixas pretas acima das linhas cinzas, quando mais escura a linha maior é a identidade entre
os genes, as cores das setas representam a função proteica predita. Os domínios das PKSs
estão apresentados acima do gene core de cada BGC: cetoredutase (KR), cetossintase (KS),
proteína carreadora de acil (ACP), aciltransferase (AT), desidratase (DH), enoilredutase
(ER), aciltransferase da unidade iniciadora (SAT), Product template (PT) que catalisa a
ciclização da molécula, tioesterase (TE), Ppant (PP).

298
 O policetídeo RES-1214-2 é um antagonista não peptídico da endotelina
1 (ET1), um potente vasoconstritor de longa duração que foi isolado de caldo de
cultivo do fungo Pestalotiopsis sp. RE-1214. Foi observado in vitro a seletividade
de RES-1214-2 sobre a ligação de ET-1 ao receptor de endotelina tipo A (Ogawa
et al. 1995).
O BGC de RES-1214-2 de Pestalotiopsis sp. está localizado em um locus
com 36.243 nucleotídeos (nt) e composto por 16 genes. A análise de sintenia
deste cluster identificou correspondência para três genes do BGC-1 de P.
labradorum INPA-AP10 (Figura 2), sendo um deles o gene core ptaA que codifica
uma PKS não redutora, o gene ptaB uma betalactamase e o gene ptaM, codifica
uma halogenase que catalisar a cloração na biossíntese de RES-1214-2 (Xu et
al. 2014a).
Trans-resorcilida é um inibidor específico da 15-hidroxiprostaglandina
desidrogenase, uma enzima chave no catabolismo das prostaglandinas, isolada
de Acremonium zeae (Sarocladium). Os resorcilídeos são fitotóxicos e inibem o
alongamento das raízes das mudas. Esses metabólitos secundários pertencem
à subclasse lactona do ácido resorcílico de 12 membros da família benzenodiol
lactona (Xu et al. 2014b).
O BGC de trans-resorcilida do fungo endofítico A. zeae é composto por
seis genes, localizado em um locus de 28.428 pares de bases (pb). O gene resS1
codifica uma PKS altamente redutora (hrPKS) e o gene resS2 codifica uma PKS
não redutora (nrPKS). Além das PKS interativas (iPKSs) o BGC possui o gene
resE que codifica uma proteína transportadora de membrana da Superfamília
facilitadora principal - MFS (Xu et al. 2014b).
O pigmento aurofusarina é uma naftoquinona homodimérica produzida
por fungos do gênero Fusarium e frequentemente associada a infecções
ocorridas em trigo. Possui propriedades antibióticas contra fungos filamentosos
e leveduras. Sua biossíntese depende da presença do gene PKS12 que codifica
uma nrPKS (Westphal et al. 2018).
O BGC de aurofusarina de Fusarium graminearum PH-1 possui 11 genes,
está situado em um locus de 25.000 pb e apresentou 18% de similaridade com
o BGC - 2 predito para P. labradorum INPA-AP10. O gene gip1 de F.
graminearum codifica uma enzima lacase que é necessária para a biossíntese
da aurofusarina (Frandsen et al. 2006).

299
 As sintetases de peptídeos não ribossômicos (NRPS) são mega enzimas
multimodulares que incorporam uma ampla gama de substratos (aminoácidos,
proteínas, ornitina e hidroxiácidos) para formar peptídeos lineares ou cíclicos
sem o envolvimento de ribossomos. As NRPS fúngicas são responsáveis pela
biossíntese de peptídeos não ribossomais (NPS) com um amplo espectro de
atividades biológicas na medicina e na agricultura (Chen, Lin e Chung 2013).
No genoma de P. labradorum INPA-AP10 foram encontrados dois clusters
com alta similaridade a BGC’s relacionados a NRPs conhecidos: 4 dimetil
coprogênio e 5 nidulina A (Figura 3).
A via biossintética de dimetil coprogênio de Alternaria alternata possui
apenas o gene NPS6, composto por 6.120 pb, que codifica uma NRPS, cuja
similaridade foi de 100% com o gene core do BGC-8, híbrido NRPS/NRPS-like
de P. labradorum INPA-AP10. A presença de genes adicionais no BGC-8 pode
indicar a ocorrência de modificações pós-NRPS na molécula, o que levaria a
biossíntese de um metabólito diferente do dimetil coprogênio. Além disso, na
análise da composição de domínio de ambas NRPS foram possíveis identificar
um domínio de tiolação (T) adicional no gene NPS6 de A. alternata.
Fungos do gênero Alternaria são conhecidos por produzirem sideróforos
dimetil coprogênio para adquirir ferro extracelular. Os coprogênios contêm um
anel dicetopiperazina (ácido dimérico) que é formado pela união de duas
unidades N 5 ‐acil‐ N 5 ‐hidroxi‐ornitina por meio de uma ligação peptídica. Uma
unidade adicional de acil ornitina é ligada ao anel por meio de uma ligação éster
(Chen, Lin e Chung 2013).
O BGC-29 produz o tetrapeptídeo cíclico nidulanina A (Figura 3). Este
composto é encontrado em todas as espécies de Aspergillus e Penicillium. Foi
caracterizado originalmente em A. nidulans e até o momento não há nenhuma
propriedade ou função conhecida para este metabólito secundário. Porém, a
nidulanina A, está envolvida na síntese de fungisporina, que por sua vez
demonstrou possuir propriedades antibacterianas (Andersen et al. 2013).

300
Figura 3 - Análise sintênica de dois clusters relacionados a biossintese dos peptideos não
ribossomais (NRP) (4) dimetil coprogênio, (5) nidulanina A, com clusters de P. labradorum
INPA-AP10. O percentual de similaridade entre os genes está apresentado nas caixas pretas
acima das linhas cinzas, quando mais escura a linha maior é a identidade entre os genes, as
cores das setas representam a função proteica predita. Os domínios das NRPSs estão
apresentados acima do gene core de cada cluster onde: (A) indica o domínio de adenilação,
(T) tiolação, (E) epimerização, (C) condensação.

Conclusões
A partir da mineração do genoma de P. labradorum INPA-AP10 foi
possível identificar 35 clusters gênicos biossintéticos envolvidos na biossíntese
de produtos naturais. Com base nos BGC’s que apresentaram alta similaridade
foi possível predizer o potencial para produção do dimetil coprogênio (sideróforo)
e nidulanina A. Os resultados também indicam que apesar de alguns clusters
apresentarem alta similaridade, as análises de sintenia revelam que a
composição gênica diferente das vias de biossintese do MIBiG indicando que na
linhagem INPA-AP10 produz moléculas diferentes, com possível esqueleto
principal da molécula estruturalmente similar. Além disso, cerca de 75% dos
BGC’s não apresentam nenhuma similaridade com as vias de biossíntese
disponíveis na base de dados, indicando que esses clusters podem estar
relacionados à síntese de novas moléculas ou moléculas embora já descritas e
elucidada quimicamente, ainda não se conheça a composição gênica da via de
biossíntese impossibilitando a correlação.

Agradecimentos
Os autores agradecem às agências de fomento: FAPEAM (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas) CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Este trabalho contou com o

301
suporte financeiro da FAPEAM Editais: (PROSPAM 08/2021, CT&I ÁREAS
PRIORITÁRIAS 010/2021, PRODUTIVIDADE-CT&I-013/2022, Biodiversa Nº
007/2021 e pela concessão de bolsa de estudo ao primeiro autor), CAPES editais
(Procad AmazonMicro e Amazônia Legal).

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Monilíase do cacaueiro e cupuaçuzeiro: impactos e desafios na

Amazônia
Leite, Rodrigo Serpa Vieira1; Gasparotto, Luadir2
1
Ministério da Agricultura e Pecuária; 2Embrapa Amazônia Ocidental.
E-mail para correspondência: [email protected];
[email protected]

Resumo
A monilíase (Moniliophthora rorei) é a doença do cacaueiro e cupuaçuzeiro mais
importante na América Latina. Os hospedeiros são as espécies do gênero
Theobroma e Herrania. Descrita no início do século 19 e constatada, mais
recentemente, em 2021 e 2022, no Acre e Amazonas, respectivamente, nas
áreas de fronteira com a Bolívia, Colômbia e Peru. A doença se manifesta sob
vários sintomas que progridem para parte externa do fruto quando surgem os
sinais, caracterizados pela formação de um pseudoestroma branco, seguido por
abundante esporulação e mumificação dos frutos. Os esporos são disseminados
pelo vento, respingos de chuva, insetos, animais silvestres e pessoas. Umidade
relativa superior a 80% e temperatura na faixa de 20 °C a 28 °C são as condições
mais favoráveis para germinação dos esporos, penetração e esporulação. O
patógeno infecta os frutos em qualquer estádio de desenvolvimento, cujos
sintomas se expressam entre 30 a 90 dias após a infecção e as perdas podem
atingir 100% da produção. O controle cultural é a principal medida entre todos
os métodos de controle da monilíase. Os demais métodos de controle, como
biológico, resistência e químico, devem ser adotados sempre associado ao
manejo cultural.
Palavras-chave: Moniliophthora roreri, Theobroma, Herrania, Alto Solimões.

Introdução

A monilíase do cacaueiro (Theobroma cacao L.) e do cupuaçuzeiro

[Theobroma grandiflorum Willd. Ex. Spreng.) Schum], causada pelo fungo
Moniliophthora roreri (Cif.) H.C. Evans, é a doença mais destrutiva dessas
espécies, cujas perdas podem atingir 100% da produção. Desde o primeiro relato
na Colômbia, em 1817, o patógeno disseminou pelos países vizinhos do Brasil
(Peru, Venezuela, Bolívia), Equador, Panamá, Costa Rica, Nicarágua, Honduras,
El Salvador, Guatemala, Cuba, Belize, México e Jamaica (Bastos et al., 2016;
Phillips-Mora, 2017). No Brasil, foi constatada, em 2021, nos municípios de

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
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Cruzeiro do Sul e Mâncio Lima, estado do Acre, e, em outubro de 2022, nos

municípios de Tabatinga e Benjamin Constant, estado do Amazonas.

Importância econômica

A monilíase é considerada uma doença devastadora para o cacaueiro e

cupuaçuzeiro, cujo potencial de danos está associado às condições climáticas
de cada região. O patógeno infecta os frutos em qualquer estado de
desenvolvimento e em condições favoráveis pode causar perdas de até 100%
da lavoura.

No Peru, as perdas estimadas variam de 40% a 60%, mas podem atingir

100% em lavouras onde não se controla a doença (Rios-Ruiz, 2004) e, na
Colômbia, chega a afetar 40% da produção, equivalendo a perda de 28 mil
toneladas de amêndoas (Gil, 2016). Rios-Ruiz (2004) relatou que no Equador,
em 1957, as perdas atingiram 90% da produção e total abandono dos plantios;
enquanto que, na Costa Rica, em 1982, as perdas variaram entre 60% a 90%.
Nesses países, apesar de serem adotadas medidas de controle e de convivência
com a doença, além dos altos custos aos produtores, ainda há redução na
produção. A intensidade do ataque do patógeno está relacionada diretamente
com a idade do plantio e o total de frutos afetados mantidos na área.

Na região Norte do Brasil, os prejuízos econômicos não serão diferentes

dos registrados nos países vizinhos. Devido à ocorrência natural de diversas
espécies dos gêneros Theobroma e Herrania na região do Alto Solimões, o
manejo da doença é um desafio. Soma-se a isso, o fato das áreas de cacaueiros
serem localizadas, majoritariamente, nas várzeas do Rio Solimões e de seus
afluentes, bem como a idade dos plantios, com plantas com mais de 50 anos e
até 12 metros de altura, propiciando ambiente com alta umidade e
sombreamento, favoráveis ao patógeno. A situação é a mesma com os
cupuaçuzeiros, cuja maioria das plantas encontram-se dispersas em fundos de
quintais e em pequenos plantios nos roçados, altamente afetadas pela vassoura-

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
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de-bruxa e com a maioria de produtores extrativistas e com pouca tradição

agrícola.

Etiologia e epidemiologia

O fungo M. roreri é um basidiomiceto, que possui hifas hialinas, com

diâmetro de 4 µm a 5 µm, paredes finas septadas com presença de doliporo nos
septos das hifas (Bastos et al., 2016). Os esporos são hialinos, com formatos
esféricos a elípticos, medem 7 µm a 14 µm, catenulados com cerca de 2 a 30
unidades. O desenvolvimento dos esporos nas cadeias é basipetal, ou seja, são
liberados apenas os esporos maduros situados nas suas extremidades.

Nascimento (2014) relata que patógeno infecta os frutos em qualquer

estádio de desenvolvimento, contudo, os frutos com até 90 dias de idade são
mais suscetíveis. O fungo se dissemina com facilidade e, em um fruto infectado,
pode produzir até sete bilhões de esporos na superfície necrosada. Os esporos
são disseminados pelo vento, respingos de chuva, insetos, animais silvestres e
pessoas. A liberação e dispersão dos esporos são favorecidas por tempo quente
e seco, encontrando-se maiores concentrações de esporos na atmosfera entre
10 h e 15 h. Umidade relativa superior a 80% e temperatura na faixa de 20 °C a
28 °C são as condições mais favoráveis para infecção, penetração e esporulação
do fungo (Leandro-Muñoz, 2017).

Além do cacaueiro e cupuaçuzeiro, o M. roreri infecta também o cacau-

azul (Theobroma angustifolium D. C.), macambo (Theobroma bicolor L.),
Theobroma mammosum Cuatrec. & J. León, cupuí (Theobroma subincanum
Mart), cacauí (Theobroma speciosum Willd ex Spreng), cabeça-de-urubu
(Theobroma obovatum Klotzsch), Theobroma simiarum Donn. Sm., Theobroma
sylvestre Mart, Theobroma gileri Cuatrec., cacau-jacaré (Herrania balaensis H.
Preuss), Herrania nitida (Poepp.) R. E., Herrania pulcherrima Goudot e Herrania
purpurea (Pittier) R. E. Schult (Bastos et al., 2016).

Sintomas

Como patógeno hemibiotrófico, M. roreri apresenta duas fases de vida

durante o processo infeccioso. Inicialmente, se comporta como biotrófico,

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
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colonizando internamente os frutos do cacaueiro e do cupuaçuzeiro. Nessa fase,

os sintomas são comumente observados internamente nos frutos.
Posteriormente, o patógeno passa à fase necrotrófica, quando se visualiza os
sintomas externos. A manifestação de sintomas se dá entre 30 a 90 dias após a
infecção.

No cacau, a doença se manifesta sob vários sintomas que permitem o

diagnóstico precoce, como deformações (Figura 1A), ilhas verdes (Figura 1B),
pontos oleosos (Figura 2), manchas chocolate (Figura 3) e alteração no peso dos
frutos. O fungo coloniza e destroi a parte interna do fruto, avança e todos esses
sintomas, progridem para a parte externa, quando surgem os sinais do patógeno,
caracterizados pela formação de um pseudoestroma branco, seguido por
esporulação abundante (Figura 4), levando-os a mumificação (Figura 5). Muitas
vezes, os sintomas da monilíase são confundidos com os sintomas da vassoura-
de-bruxa. Entretanto, a exposição do fruto afetado, durante 48 h em câmara
úmida, é suficiente para dirimir as dúvidas, pois haverá abundante esporulação,
no caso de infecção por M. roreri, o que não ocorre com o M. perniciosa.

No cupuaçu, pelo fato dos frutos serem recobertos por uma camada fina
de pó de coloração marrom, torna-se difícil a visualização de sintomas que
antecedem a esporulação externa. Os sintomas externos na casca são manchas
de coloração marrom, visualizados quando se processa a raspagem da casca
dos frutos, para eliminar a camada de pó fino marrom (Figura 6). Do ponto de
vista prático, a presença do patógeno é notada quando há formação do
pseudoestroma e a subsequente esporulação (Figura 7). Quando o patógeno
exaure o conteúdo interno dos frutos, aparecem rachaduras e fendilhamento na
casca (Figura 8). Quando o patógeno coloniza a parte internos dos frutos causa
podridão (Figura 9 A) e, em estádio avançado de desenvolvimento, a polpa
apresenta lesões internas de aspecto seco, tornando imprestáveis a polpa e as
sementes (Figura 9 B).

Nos frutos do macambo, M. roreri esporula (Figura 10 A) e causa podridão

da polpa e amêndoas (Figura 10 B) e no cupuí, fendilhamento da casca (Figura
11).

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A B
Fotos: Rodrigo S. V. Leite

Figura 1. Fruto jovem do cacaueiro com deformações (A) e maduro com sintomas
denominados ilhas verdes (B), decorrentes da infecção por Moniliophthora roreri.

A
B
Figura 2. Frutos do cacaueiro com
sintomas denominados pontos
oleosos (A), necrose da parte
interna (B), correspondente ao
sintoma externo, e necrose interna
C generalizada (C), causados por
Moniliophthora roreri.
Fotos: Ana Francisca Ferreira

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A B

Figura 3. Frutos do cacaueiro com

lesões necróticas, irregulares,
denominadas “manchas chocolate”
(A e B), e com início da formação do
pseudoestroma (C) causadas por
Moniliophthora roreri.

Fotos: Rodrigo S. V. Leite

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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
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A B

C D
Fotos: Rodrigo S. V. Leite

Figura 4. Frutos do cacaueiro recobertos por pseudoestroma (massa de esporos) (A) e por
esporos de Moniliophthora roreri (B, C e D).

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A B C
Fotos: Rodrigo S. V. Leite

Figura 5. Frutos mumificados do cacaueiro recobertos por esporos do Moniliophthora roreri (A,
B) e planta com 100% de perdas na produção (C).

A B C
Fotos: Admilson de Brito (A e B) e Rodrigo S. V. Leite (C).

Figura 6. Frutos do cupuaçuzeiro apresentando lesões necróticas, causadas por

Moniliophthora roreri, visíveis após a raspagem do pó marrom que cobre a casca,
principalmente nas regiões recobertas pelo pseudoestroma.

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Fotos: Rodrigo S. V. Leite

Figura 7. Frutos do cupuaçuzieo com intensa esporulação do Moniliophthora roreri.

Fotos: Rodrigo S. V. Leite

Figura 8. Frutos do cupuaçuzeiro mumificados, com rachadura e fendilhamento causados por

Moniliophthora roreri.

A B
Fotos: Paulo S. B. Albuquerque (A) e Rodrigo S. V. Leite (B)

Figura 9. Frutos do cupuaçuzeiro com sinais da monilíase (A); fruto em estádio avançado da
monilíase, com podridão interna seca da polpa e das sementes colonizadas por Moniliophthora
roreri (B).

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A B
Fotos: Rodrigo S. V. Leite

Figura 10. Frutos do macambo com esporulação superficial (A); e com o interior totalmente
colonizado por Moniliophthora roreri (B).

Figura 11. Fruto do cupuí com fendilhamento, causado

por Moniliophthora roreri.
Foto: Rodrigo S. V. Leite

Controle
O controle cultural é a espinha dorsal entre todas as medidas de controle
da monilíase do cacaueiro e cupuaçuzeiro. Dessa forma, o manejo da doença,
deve ser adotado com mais de uma estratégia, simultaneamente. Nos países em
que a doença está presente a mais tempo, os tratos culturais têm apresentado
bons resultados. Nesse caso, o plantio deve ser mantido livre de plantas
daninhas e as plantas conduzidas com a copa aberta e porte baixo (inferior a 3,5
m), a fim de permitir maior aeração e penetração de radiação solar, reduzindo a
umidade. Como o M. roreri é um patógeno extremamente virulento, nas
condições da Amazônia, principalmente no ecossistema de várzea, o desafio
para continuar o cultivo do cacaueiro e do cupuaçuzeiro passará pelo
estabelecimento de novos sistemas de produção, devendo ser revistos o
espaçamento entre as plantas, a condução das plantas com copas abertas e

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porte baixo, a adoção de podas fitossanitárias e eliminação precoce de frutos

doentes. Em novos plantios, na entressafra, após a poda de limpeza, seria
interessante a aplicação da calda sulfocálcica (CS) ou a bordalesa (CB), que
além de atuar como fungicidas erradicantes, servem de fonte de nutrientes para
as plantas, pois a CS contém enxofre e cálcio e a CB contém cobre e cálcio.

No cacau, como os sintomas iniciais são bem característicos, recomenda-

se a catação de frutos sintomáticos, amontoando-os em pequenas pilhas
recobertas por folhas e ramos, oriundos das podas, realizando-se, desta forma,
a compostagem dos frutos doentes. Outra alternativa é colocá-los em sacos de
plástico pretos, resistentes e deixados sobre o solo. Complementarmente, pode-
se aplicar calda de ureia, na concentração de 15% a 20%, nos frutos
sintomáticos recolhidos, que além de evitar a esporulação, acelera o seu
apodrecimento. Os frutos que apresentam esporulação, devem ser colhidos
individualmente, envolvendo-os com um saco para evitar que os esporos sejam
lançados ao ar durante a operação. Nesse caso, a compostagem desses frutos
deve ser feita, preferencialmente, fora do plantio.

O trabalho direcionado ao controle biológico, começou no início desse

século, usando micoparasitas isolados ou em “cocktails”, com resultados
promissores se adotado em conjunto com os tratos culturais. Diversos isolados
de espécies dos gêneros Trichoderma, Bacillus e Clonostachys foram capazes
de reduzir a esporulação de M. roreri. Na Costa Rica, testes com misturas de
espécies desses gêneros têm demonstrado resultados promissores. Entretanto,
os problemas na frequência de aplicação e formulação precisam ser
solucionados antes da comercialização.

Embora existam fungicidas eficientes para controlar a doença, a

aplicação, nas condições da Amazônia “sempre úmida” é técnica, econômica e
socialmente inviável. Técnica pelo fato dos cacaueiros estarem localizados em
áreas de várzeas, possuem mais de 50 anos de idade e atingem até 12 m de
altura. No caso dos cupuaçuzeiros, as plantas estão dispersas em fundos de
quintais ou em diminutas populações nos roçados. Além disso, há risco de
contaminação dos mananciais de água. Econômica, pelo fato da produtividade
ser extremamente baixa e não cobre os custos desse método de controle.
Socialmente, porque os agricultores na quase totalidade são extrativistas, com

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baixo nível de estudo e, praticamente, sem acesso à tecnologia e

acompanhamento técnico.

O controle genético é o mais desejável, pois acarreta menor emprego de

mão-de-obra e de recursos financeiros por parte dos agricultores. Entretanto,
essa medida ainda não é possível devido à dificuldade em se obter fontes de
resistência que apresentem resultados efetivos e duradouros. As pesquisas
realizadas até o momento, privilegiaram a seleção de clones de cacaueiros, que
apresentam tolerância a doença. Híbridos selecionados, principalmente na
Costa Rica, apresentam tolerância e não resistência, propriamente dita. O
principal efeito sobre a doença, é retardar a expressão dos sintomas e início da
esporulação. Posteriormente, os híbridos acabam se comportando como
suscetíveis.

Cabe salientar que a portaria publicada pelo Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento (Brasil, 2022), declara os municípios de Cruzeiro do
Sul, Mâncio Lima, Rodrigues Alves, Marechal Thaumaturgo e Porto Walter no
estado do Acre e todo o estado do Amazonas, como área sob quarentena para
a praga quarentenária ausente M. roreri, ficando proibido o trânsito de materiais
vegetais das espécies do gênero Theobroma e Herrania e outras hospedeiras
de M. roreri provenientes da área sob quarentena para as demais unidades da
federação até que seja declarada a erradicação dos focos confirmados da praga.
Amêndoas de cacau oriundas de área sob quarentena só podem sair se forem
classificadas como tipo 1 ou 2 (Brasil, 2008). Dessa forma, todos os trabalhos de
pesquisa obrigatoriamente deverão ser realizados apenas nos municípios do
Acre, que estão sob quarentena, e em Atalaia do Norte, Benjamin Constant e
Tabatinga no Amazonas, onde há focos da doença.

Referências
Bastos, C.N.; Luz, E.D.M.N.; Silva, S.D.V.M.; Magalhães, D.M.A.; Albuquerque,
P.S.B. 2016. Doenças do cacaueiro. In: Amorim, L.; Rezende, J.M.A.; Bergamin
Filho, A.; Camargo, L.E.A. (Eds.) Manual de Fitopatologia: doenças das plantas
cultivadas. 5ª Edição. Agronômica Ceres, Ouro Fino/MG. Cap. 20. p. 175-191.
Brasil. 2008. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução
Normativa nº 38, de 23 de junho de 2008. [Estabelece o Regulamento Técnico

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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

da Amêndoa de Cacau, definindo o seu padrão oficial de classificação, com os

requisitos de identidade e qualidade, a amostragem, o modo de apresentação e
a marcação ou rotulagem]. Diário Oficial da União, seção 1, 24 jun. 2008.
Disponível
em: https://sistemasweb.agricultura.gov.br/sislegis/action/detalhaAto.do?metho
d=visualizarAtoPortalMapa&chave=250964455. Acesso em: 25 out. 2023.
Brasil. 2022. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de
Defesa Agropecuária. Portaria SDA nº 703, de 21 de novembro de 2022.
[Declara os municípios de Cruzeiro do Sul, Mâncio Lima, Rodrigues Alves,
Marechal Thaumaturgo e Porto Walter no estado do Acre e todo o estado do
Amazonas, como área sob quarentena para a praga quarentenária
ausente Moniliophthora roreri]. Diário Oficial da União, edição 219, seção 1, p.
4, 22 nov. 2022. Disponível em: https://www.gov.br/agricultura/pt-
br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/sanidade-vegetal/planos-de-
contingencia-pragas-
ausentes/PORTARIA_SDA_N__703__DE_21_DE_NOVEMBRO_DE_2022___
PORTARIA_SDA_N__703__DE_21_DE_NOVEMBRO_DE_2022___DOU___I
mprensa_Nacional.pdf. Acesso em: 25 out. 2023.
Gil, J.G.R. 2016. Pérdidas económicas associadas a la pudrición de la mazorca
del cacao causada por Phytophthora spp. e Moniliophthora roreri (Cir y Pai)
Evans et al., em la hacienda Theobroma, Colômbia. Revista de Protección
Vegetal 1(1):42-49.
Leandro-Muñoz, M.E.; Tixier, P.; Germon, A.; Rokotobe, V.; Phillips-Mora, W.;
Maximova, J.; Avelino, J. 2017. Effects of microcliamatic varaiables on the
symptoms ans signs onset of Moniliphthora roreri, causal agent of Moniliophthora
pod rot in cacao. Plos one 12(10): 01844638. 18p. Disponível em:
<https://doi.org/10.1371/journal.pone.01844638>. Acesso em: 24 Mar. 2023.
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introdução de Moniliophthora roreri no Brasil. Dissertação de mestrado.
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Phillips-Mora, W. 2017. Biología de la moniliasis del cacao y desarrollo de
genotipos resistentes. Revista Mexicana de Fitopatología 35(17):S7-S9.
Suplemento.
Rios-Ruiz, R.A. 2004. Epidemiologia e manejo da monilíase do cacaueiro no
Peru. Tese de doutorado. Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa/MG,
80p.

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Monitoramento de comunidades fúngicas rizosféricas e

endofíticas associadas a estádios fenológicos da soja

Matsumura, Aida T. S1; Matsumura, Akio S.1; Martins Jr, Marcos Cardoso2; Da
Silva, Márcia Eloísa1; Grassotti, Tiela Trapp1; Costa, Letícia Da Fontoura Xavier1;
Matsumura, Akira S.1

1ICBBIOAGRITEC Ltda., 2Universidade do Estado de Santa Catarina

E-mails: [email protected]; [email protected]

Resumo
A soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma das culturas de maior importância
econômica no mundo, destacando-se o Brasil como o maior produtor mundial do
grão. A produtividade do cultivar está intimamente relacionado à interação
benéfica entre solo-planta-microbiota. Estudar esses processos tornam-se
indispensáveis a fim de incrementar a produção agrícola. Desta forma, o
presente estudo foi realizado com o objetivo de documentar a diversidade de
fungos rizosféricos e endofíticos em diferentes estádios fenológicos de plantas
de soja no estado do Rio Grande do Sul, Brasil. A área experimental foi tratada
antes da semeadura com um consórcio de espécies de Trichoderma (ICB
Nutrisolo Trichoderma, RS, Brasil). Foram selecionados dois talhões ao acaso,
onde 30 subamostras constituiram um pool, durante os períodos antes do plantio,
floração (63 dias) e maturação (152 dias). As maiores biodiversidades fúngicas
foram encontradas nas porções rizosféricas de plantas aos 152 dias (40,7%) e
63 dias (39,9%). Trichoderma spp. foi identificado na rizosfera aos 63 dias
(21,3%) e endofiticamente aos 152 dias (20,6%). Embora Fusarium sp. tenha
sido isolado com maior prevalência de forma endofítica aos 63 dias (20,1%), sua
presença foi reduzida aos 152 dias (7%), podendo ser associada, possivelmente,
à presença de Trichoderma spp., encontrado endofiticamente nestas plantas.
Assim, estudos do microbioma de plantas são fundamentais para o
desenvolvimento de bioprodutos ou para implementação de estratégias de
controle biológico.

Palavras-Chave: Glycine max; Trichoderma, produtividade

Introdução
A soja [Glycine max (L.) Merr] é uma das culturas mais importantes do
mundo, sendo o Brasil o maior produtor mundial. Possui área plantada de
40.921,9 milhões de hectares durante a safra 2021-2022, com o Rio Grande do
Sul produzindo 9.727,7 milhões de toneladas do grão (Embrapa Soja 2023).
Ainda, projeções do agronegócio estimam que a área de soja ultrapasse 45,3
milhões de hectares em 2029 (MAPA 2023). Frente ao panorama da expansão

318
da agricultura brasileira, a produtividade continuará sendo o fator impulsionante
na produção.
Desta forma, o uso de microrganismos tem sido considerado uma
estratégia biotecnológica promissora a fim de incrementar o desenvolvimento
agrícola. Fungos, como as espécies do gênero Trichoderma quando presentes no
solo, disponibilizam nutrientes inacessíveis às plantas como fósforo (Borges-
Chagas et al. 2015; Bononi et al. 2020; Matsumura et al. 2023), manganês e zinco
(Altomare et al. 1999). Ainda, promovem o crescimento pela produção de auxinas
e metabólitos como 6PP, que favorecem o desenvolvimento das raízes,
proporcionando maiores rendimentos no cultivo (Contreras-Cornejo et al. 2011;
Matsumura et al. 2021). É caracterizado como altamente oportunista,
colonizando variados ambientes de distintas formas, desde epifíficos,
rizosféricos até endofíticos (Tseng et al. 2020).

O presente estudo foi realizado com o objetivo de documentar a

diversidade de fungos rizosféricos e endofíticos em diferentes estádios
fenológicos de plantas de soja do Rio Grande do Sul, Brasil.

Material e Métodos
Coleta das amostras
Plantas de soja (variedade Pioneer 95R90) foram obtidas de lavoura que
possui sistema de rotação de cultura (soja, arroz e pousio), localizada no
município de Jaguarão, Rio Grande do Sul, Brasil, durante a safra de 2020/2021.
As culturas receberam como enriquecimento um consórcio de espécies de
Trichoderma spp. (ICB Nutrisolo Trichoderma, RS, Brasil) antes da semeadura,
juntamente ao tratamento convencional, em área total. A fim de se obter uma
amostragem mais representativa da lavoura, foram selecionados dois talhões ao
acaso, onde 30 subamostras constituiram um pool, durantes os períodos de solo
(antes do plantio), floração (63 dias) e maturação (152 dias).

Análise de fungos rizosféricos

Partículas rizosféricas de raízes das plantas e solo (10 g) foram maceradas
em 90 mL de solução salina 0,85% com Tween 80 a 0,1% e realizadas diluições
seriadas decimais até 10-4 com plaqueamento em meio BSA, em triplicata. Após,

319
incubadas a 26 ± 1 oC e fotoperíodo de 12 horas durante 14 dias. As unidades
formadoras de colônia foram analisadas e quantificadas a partir do quinto dia, e
identificadas a partir do sétimo dia de cultivo.

Análise de fungos endofíticos

As amostras de raízes foram processadas de acordo com Araújo et al.
(2002), onde seis fragmentos de cada raiz foram depositados em meio BSA. As
placas foram incubadas em estufa BOD a 26 ± 1 oC e fotoperíodo de 12 horas
durante 14 dias. As identificações foram iniciadas a partir do sétimo dia de cultivo.

Caracterização macro e micromorfológica dos fungos

Para a identificação dos fungos filamentosos foram observadas
características macroscópicas (coloração e textura das colônias) e microscópicas
(microestruturas) a partir de fragmentos das bordas das colônias coradas em azul
de metileno. Os fungos que não apresentaram estruturas de reprodução foram
identificados como fungos de micélio estéril pelo morfotipo das colônias (Barnett
e Hunter 1999).

Resultados e Discussão
A partir do microbioma das plantas, tanto na superfície (ectosfera) como
no seu interior (endosfera), é possível identificar os microrganismos associados
em seus diferentes tecidos. Através desse conhecimento, é possível presumir as
possíveis funções que estes expressam, frente a distintas condições ambientais
e qual seu papel na sanidade das plantas e produção agrícola. Nos últimos anos,
as relações entre planta-microrganismos-solo têm recebido muita atenção e
pesquisas vem sendo desenvolvidas no Brasil (Pimentel et al. 2006; Bernardi-
Wenzel et al. 2012), na Argentina (Russo et al. 2016), na China (Yang et al. 2018)
e nos Estados Unidos (Strom et al. 2020).
Do total de 599 isolados de fungos provenientes de amostras de solo,
rizosfera e endofíticos, 559 foram identificados a nível de espécie e 40 não
puderam ser macro e/ou micromorfologicamente identificados devido à ausência
de estruturas reprodutivas passíveis de reconhecimento ao microscópio óptico
(Tabela 1). Os microrganismos identificados totalizaram oito gêneros fúngicos.
Das espécies identificadas na rizosfera e no solo, 67,6% são sapróbias e 25,7%

320
podem possuir potencial fitopatogênico, as quais foram identificadas como
pertencentes ao gênero Fusarium. Enquanto Aspergillus foi identificado na fase
de pré-plantio, outros gêneros como Curvularia, Mucor, Penicillium e
Trichoderma e Aspergillus niger e A. ochraceus foram constatadas apenas após
o plantio.

Tabela 1. Frequência de fungos isolados de solo, rizosfera e endofíticos e suas variações

conforme estádios fenológicos de plantas de soja

As maiores taxas de biodiversidade fúngica nas porções rizosféricas de

plantas de soja foram aos 152 dias (40,7%) e 63 dias (39,9%) de idade.
Comunidades fúngicas rizosféricas variam de acordo com o desenvolvimento da
planta, que depende das condições ambientais e abióticas (Lumibao et al. 2020).
Sua composição é formada por complexas interações entre microrganismos, o
hospedeiro vegetal e o ambiente, embora os mecanismos subjacentes não sejam
totalmente compreendidos (Trivedi et al. 2020). Estima-se que dentre as fases
fenológicas analisadas, a floração seja responsável por recrutar maior número e
maior diversidade de microrganismos. Pimentel et al.(2006) verificaram que o
número de isolados fúngicos obtidos a partir de folhas e caule de soja diminuíram
conforme aumentou da idade das plantas.

321
 Os fungos Trichoderma spp., Fusarium sp. e Mycelia sterilia foram
recuperados como endofíticos. Dentre eles, destaca-se o gênero Trichoderma,
que aos 63 dias apresentou apenas associação rizosférica com as plantas de
soja (21,3%). No entanto, aos 152 dias, a abundância deste fungo reduziu na
rizosfera (5,3%) e se manifestou de forma endofítica (20,6%). Trichoderma é um
habitant natural do solo. provavelmente coloniza raízes de plantas e
posteriormente se torne endofítico.
Observou se que houve redução de Fusarium sp. endofítico (73,5%).
Plantas de soja são suscetíveis ao Fusarium sp., que pode causar a síndrome
da morte súbita, uma das doenças mais importantes na América do Norte e do Sul
(Westphal et al. 2014). Apesar de Fusarium sp. ter sido constatado em todas as
fases fenológicas analisadas neste estudo, a presença desse fitopatógeno não
sugestiona uma doença, como demonstrado por Russo et al. (2016) ao
identificarem Fusarium sp. endofítico na rizosfera e raiz de plantas saudáveis de
soja. O tratamento do solo do formulado biológico com o consórcio de cepas de
Trichoderma spp. pode ter fornecido subsídios às plantas para que estas não
fossem afetadas pela morte súbita, apesar de não ter sido determinado se os
isolados de Fusarium spp. eram avirulentos e/ou benéficos para a planta ou
patógenos latentes. Estudos prévios sobre a comunidade endofítica de soja
também encontraram estes mesmos gêneros de fungos em plantas de soja no
Brasil (Bernardi-Wenzel et al. 2012), Argentina (Russo et al. 2016), China (Yang
et al. 2018) e Egito (Sallam et al. 2021). As cepas endofíticas de Fusarium spp.
obtidas nesse estudo devem ser testadas posteriormente quanto à capacidade
de induzir sintomas de doença em soja.
Há evidências que a capacidade de um microrganismo em promover o
crescimento da planta está ligada à sua competência na rizosfera e crescer
endofiticamente no interior do tecido do vegetal (Stewart e Hill 2014). As
interações Trichoderma-raiz envolvem reconhecimento, aderência, penetração,
colonização e transferência de nutrientes da raiz. Esses fungos penentram nas
raízes das plantas, através dos tricomas, produzindo estruturas semelhantes a
apressórios (Mukherjee et al. 2013), onde crescem intercelularmente na
epiderme da raiz e no córtex, induzindo as células vegetais circundantes a
depositar material da parede celular e produzir compostos fenólicos. Essa
associação aumenta significativamente o crescimento da raiz e do rebento,

322
aumentando a absorção de macro e micronutrientes e a proteção contra
patógenos (Shoresh et al. 2010).
A habilidade em penetrar nas raízes e se desenvolver endofiticamente é
uma característica das espécies de Trichoderma descrita nos trabalhos de
Tseng et al. (2020), que, além de demonstrar crescimento endofítico,
Trichoderma sp. também apresentou capacidade predatória contra Alternaria
brassicicola. Fungos endofíticos possuem potencial para controle de
fitopatógenos em soja (Bernardi-Wenzel et al. 2012) e influenciam positivamente
o desenvolvimento da planta e a germinação de sementes (Radhakrishnan et al.
2013).
Nos últimos anos, pesquisas voltadas para o esclarecimento do papel
desempenhado pelas comunidades associadas as plantas têm aumentado na
área agrícola devido a crescente evidência de que estas comunidades de
microrganismos podem afetar o desenvolvimento, produtividade e resiliência dos
cultivos (Berg et al. 2013; Bulgarelli et al. 2013; Mendes et al. 2014). Inclusive,
estudos demonstram que o microbioma pode ter um efeito direto na fenologia
das plantas (Wagner et al. 2014).
Assim, o conhecimento e manipulação do microbioma vegetal pode levar
ao desenvolvimento de tecnologias e práticas agrícolas mais sustentáveis, como
o controle de patógenos (Andrews 1992; Bloemberg e Lugtenberg 2001),
aumento da produção agrícola (Bakker et al. 2012) e redução do consumo de
agroquímicos (Adesemoye et al. 2009).

Conclusões
O monitoramento e a identificação da diversidade de fungos rizosféricos e
endofíticos em diferentes estádios fenológicos de plantas de soja, indicam a
possibilidade de atuação direta na microbiota quando aplicados em campo, dada
à multiplicidade de interações que podem ter com a planta, com o patógeno e
com a comunidade microbiana associada. Assim, estudos do microbioma de
plantas são fundamentais para o desenvolvimento de bioprodutos ou para
implementação de estratégias de controle biológico.

323
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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Obtenção de cultura micelial e atividade biológica de fungos

Basidiomycota da região de Santarém, Pará, Brasil

Silva, Ana Luiza Figueira1; Vieira, Nayra Quetlen Avinte1; Silva, Graciely
Gonsalves1; Aguiar, Aline Lima1; Ferreira, Rayane Bonfim1; Santana, Marcos
Diones Ferreira1; Canto, Eveleise Samira Martins1

1Universidade Federal do Oeste do Pará,

E-mails:[email protected], [email protected].

Resumo
A Amazônia apresenta uma grande diversidade de fungos com potencial para
atividade biológica. Seu potencial de uso está atrelado, em grande parte, à
obtenção de culturas miceliais, meio pelo qual é possível obter substâncias de
interesse e aplicá-las na biotecnologia. Dessa forma o presente estudo teve
como objetivo obter culturas de fungos basidiomicetos da região de Santarém,
Pará, Brasil e observar a produção de enzimas fenoloxidase. Os fungos
coletados foram identificados e isolados em meio de cultura BDA para a
obtenção de culturas miceliais puras. Em seguida, discos de micélio foram
inoculados em BDA acrescido de ácido tânico para revelar a produção das
enzimas fenoloxidase. Foram obtidas quatro culturas miceliais dos fungos
Pleurotus sp., Psathyrella sp., Gymnopilus sp. e Lentinus sp., sendo esta última
cultura a de crescimento mais lento em relação as demais. A cultura de Letinus
sp. apresentou o maior halo de oxidação para presença de fenoloxidase e
Pleurotus sp. a que com menor halo. Esse estudo de base contribui para
aumentar o conhecimento sobre biodiversidade de fungos da região, sobretudo
quanto a produção de enzimas úteis em processos biotecnológicos.

Palavras-chave: Basidiomicetos Amazônicos, Atividade biológica, Cultura

micelial.

Introdução
A biodiversidade de fungos da região Amazônica concentra uma das
maiores potencialidades biotecnológicas do Brasil, sendo que entre os diversos
grupos de microrganismos documentados, os basidiomicetos são os fungos mais
utilizados na bioprospecção (Patrício et al. 2023). Esse grupo de fungos
apresenta a capacidade de produzir metabólitos de interesse econômico, como
por exemplo, as enzimas oxidativas capazes de degradar poluentes com grande
potencial para a biorremediação de ambientes contaminados com metais
pesados, pesticidas e efluentes industriais (Soares et al. 2011; Vieira Leonel et
al. 2018; Mendonza et al. 2022).

327
 Dentre as enzimas de importância industrial, destacam-se as enzimas
fenoloxidase produzidas por macrofungos basidiomicetos, as quais são listadas
entre as maiores famílias de enzimas fúngicas como as lacases, lignina
peroxidase e manganês peroxidase (D’ Souza et al. 1999). As enzimas são
produzidas pelos fungos durante o processo de decomposição da madeira, e têm
a capacidade de degradar alguns compostos fenólicos e xenobióticos com
estrutura química muito complexa, porém podem ser disponibilizadas por meio
de culturas miceliais, sendo muito úteis em estudos biotecnológicos (Santana et
al. 2019; Lima 2019; Silva 2021).
Nesse cenário, tem-se a Amazônia como um dos biomas mais ricos em
biodiversidade de fungos do mundo (Hawksworth e Lücking 2017; Gates et al.
2021; Devkota et al. 2023). Contudo, a escassez de estudos sobre a micobiota
nos trópicos e subtrópicos dificulta o entendimento do vasto potencial desses
organismos e suas possíveis aplicações nos diversos campos da ciência, sendo
emergencial direcionar esforços na obtenção de culturas miceliais das espécies
Amazônicas.
Dessa forma, este estudo teve como objetivo obter culturas miceliais de
fungos basidiomicetos da Amazônia paraense e observar a produção das
enzimas fenoloxidase.

Materiais e métodos
Os fungos foram coletados nas áreas verdes da Universidade Federal do
Oeste do Pará, localizado na cidade de Santarém, região Oeste do Estado do
Pará, segundo metodologia de Figueiredo et al. (2020) e a identificação
morfológica foi de acordo com a literatura especializada (Menolli Jr et al. 2014;
Silva Júnior 2015; Silva e Fortuna 2020). A obtenção das culturas das espécies
ocorreu a partir do inóculo de fragmentos do contexto dos basidiomas ainda
frescos, retirados em condições assépticas, e transferidos para placas de Petri
(90 mm Ø) contendo 20 mL de meio Batata Dextrose Ágar (BDA), acrescido do
antibiótico Cloranfenicol para evitar contaminação bacteriana.
As placas de Petri foram incubadas por cinco dias em estufa Demanda
Biológica de Oxigênio (BOD) com temperatura de 28±2°C com repiques até a
obtenção das culturas puras e observações diárias a procura de grampos de
conexão, estrutura que garante isolamento de um basidiomicetos. Todas as

328
culturas foram armazenadas em triplicatas em placas de Petri na geladeira do
Laboratório de Micologia e Bioensaios (LAMIB) da UFOPA.
Para avaliar a produção da enzima fenoloxidase, foram retirados dois
discos de micélio de 5 mm de diâmetro das bordas das culturas puras e
transferidos para placa de Petri de 90 mm de diâmetro contendo 20 mL de meio
BDA, acrescido de ácido tânico (0,5%) e em seguida mantidas em a 27°C por 48
horas em BOD. As amostras com um halo marrom acastanhado foram
consideradas positivas por indicarem a degradação o ácido tânico. Os halos
foram mensurados com o auxílio de uma régua milimetrada. A atividade
enzimática também foi classificada de acordo com a intensidade da tonalidade
do halo de oxidação em três níveis: fraco, médio e forte. A tonalidade fraca indica
que o fungo teve baixa produção da enzima, a tonalidade média indica produção
moderada da enzima e a tonalidade forte indica alta produção da enzima com
halos mais intensos.

Resultados e Discussão
Foram obtidas culturas dos gêneros Pleurotus (Fr.) P. Kumm., Psathyrella
(Fr.) Quél., Gymnopilus P. Karst. e Lentinus (L.) Fr. Ao todo foram obtidas 12
culturas miceliais armazenadas no Laboratório de Micologia e Bioensaios
(LAMIB) da UFOPA. As culturas apresentam bom desenvolvimento em meio
BDA (Figura 1), embora as representantes de Gymnopilus tenham um
crescimento mais lento em relação as demais.

329
Figura 1. Fungos basidiomicetos da região de Santarém, Pará, Brasil, e aspecto das culturas
miceliais obtida em meio Batata Dextrose Ágar (BDA). A-B= Pleurotus sp., C-
D= Psathyrella sp., E-F= Gymnopilus sp., G-H= Lentinus sp.

A formação de halos de degradação do ácido tânico nas culturas mostrou

que as cepas desses gêneros apresentam possível potencial para a produção
de enzimas fenoloxidase (Figura 2). As culturas de Lentinus sp. apresentaram
halo de oxidação com maior intensidade, sendo classificadas como forte,
segundo a avaliação visual. Enquanto as culturas de Gymnopilus sp. e Psatyrella
sp. apresentaram halo de degradação mediano e as culturas de Pleurotus sp.
apresentaram halo de menor intensidade de oxidação, sendo classificadas
fracas para a produção das enzimas.

330
 A B

Figura 2. Aspecto visual da produção das enzimas fenoloxidase produzidas por fungos
basidiomicetos da região de Santarém, Pará, Brasil. A= Pleurotus sp., B= Psathyrella sp., C=
Gymnopilus sp., D= Lentinus sp.

É apresentado na Tabela 1 a diferença entre a intensidade e os diâmetros

dos halos de oxidação do ácido tânico formados pelas culturas miceliais.

Tabela 1. Aspecto visual e diâmetro dos halos de oxidação nas culturas de macrofungos
Basidiomycetes da região de Santarém, Pará, Brasil.
Oxidação do substrato

Táxon Intensidade do halo Halo de oxidação (mm)1

Gymnopilus sp. Médio 19,5

Lentinus sp. Forte 35,5
Pleurotus sp. Fraco 15,8
Psathyrella sp. Médio 22
1-Média de duplicatas por cultura micelial.

A obtenção de culturas é muito importante para que possa explorar o

potencial biotecnológico dos fungos basidiomicetos amazônicos. Sales-Campos
et al. (2022) e Athayde et al. (2010) na tentativa de melhorar a obtenção de
culturas e potencializar o crescimento micelial em diferentes linhagens de fungos
amazônicos, testaram a influência de fatores condicionantes de desenvolvimento
de cultura fúngicas. Embora o presente tenha obtido culturas no meio tradicional
de cultivo de fungos (BDA), é primordial conhecer a biodiversidade amazônica,

331
com foco nas espécies que ocorrem no estado do Pará, pois isso subsidia
avanços no conhecimento sobre desenvolvimento, manutenção e prospecção
das espécies.
O potencial na produção de enzimas fenoloxidase para fungos
amazônicos foi apresentado por Souza et al. (2008) que testaram algumas
linhagens de basidiomicetos, das quais 50% apresentaram halo de oxidação do
ácido tânico. Assim como no estudo de Souza et al. (2008), Santos (2009),
culturas miceliais de Pleurotus sp. não apresentaram produção da enzima,
similar aos resultados desse estudo, pois com oxidação fraca é possível que
essa diferença possa estar na metodologia utilizada. Santos et al. (2022) também
relatou estudos semelhantes aos encontrados aqui para as atividades oxidativas
desse gênero.
Para as demais linhagens estudas Lentinus sp., Gymnopilus sp. e
Psathyrela sp. foram confirmadas na literatura a produção potencial das enzimas
fenoloxidase e a diferença na intensidade da oxidação também é descrita
(Tsigan et al. 2022). Esse aspecto sugere que espécies que estejam colonizando
diretamente substratos lignocelulósicos, apresentam diferentes graus de
oxidação do ácido tânico em meio de cultura como observado por Santana et al.
(2016).
Assim, os achados desse estudo incentivam a busca por expansão do
conhecimento sobre a biodiversidade e a produção de enzimas, visto que, são
metabólitos muito importantes nos processos biotecnológicos. Além disso, a
otimização da obtenção de culturas miceliais ainda exige pesquisa com ciência
de base desse estudo, principalmente pelo fato de que esforços de pesquisa em
culturas miceliais não são impedidos pela sazonalidade das espécies
Amazônicas.

Conclusões
As culturas miceliais de Gymnopilus sp., Lentinus sp., Pleurotus sp. e
Psathyrella sp. são facilmente cultiváveis em meio de cultura a base de batata e
apresentaram capacidade de produzir enzimas fenoloxidase, mesmo que em
diferentes graus de intensidade, abrindo pressupostos para otimização da
obtenção dessas enzimas para estudos biotecnológicos.

332
 Referências
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Ocorrência de macrofungos lignocelulolíticos em pontes de

madeira na rodovia Álvaro Maia (Br-319), Amazonas, Brasil

Jesus, Maria Aparecida de1; Costa, Jéssica2; Paula, Estevão Vicente Cavalcanti
Monteiro de3; Silva, Ademir Castro3

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 2Universidade Federal do
Amazonas, 3Universidade do Estado do Amazonas
Email: [email protected]

Resumo
O projeto INCT- madeiras da Amazônia com a participação do
INPA/UFAM/UEA/USP promoveu uma Expedição técnico-cientifica para avaliar
pontes de madeiras do Igarapé Beleza (271,52 Km) e Igarapé Bandeirão (263,24
Km) construída na BR-319. Analisou-se a ocorrência e a distribuição de
macrofungos lignocelulolíticos nas diferentes estruturas de madeiras e a
biodegração das mesmas nas referidas pontes. Foram identificadas 33 espécies
de macrofungos distribuídas nas estruturas de ambas pontes. Em ambas pontes,
ocorreram os macrofungos Auricularia delicata, Flavodon flavus, Oligoprus sp.,
Panus crinitus, Perenniporia medulla-panis, Pycnoporus sanguineus,
Schizophyllum commune e Trametes sp. As estruturas longarinas e tabuleiros
da ponte Igarapé Beleza foram atacadas por macrofungos pertencentes a
Polyporales, com destaque para Earliella corrugata quecresceu nas longarinas
e no balancim. Enquanto que o pilar de sustentação foi bastante degradado por
Fuscoporia gilva (Hymenochaetaceae). Enquanto que na ponte do Igarapé
Bandeirão, o balancim, guarda- roda e longarina apresentaram ataque fúngico
intenso com degradação. Spongipellis delectans, primeiro registro para a região
Amazônica e Trametes roseola primeiro registro para o estado do Amazonas. Do
ponto de vista estrutural, a utilização de madeiras com baixa durabilidade e a falta
de estratégias construtivas favoreceram o intenso ataque de fungos
lignocelulolíticos. Recomenda-se o uso de madeira pré-tratadas,
preferencialmente da mesma espécie,e com alta resistência a fim de suportar as
ações mecânicas, abióticas, bióticas visando prolongar a vida útil das pontes
localizadas na BR-319.

Palavras-Chave: Amazônia, Durabilidade da madeira, Fungos xilófagos

Introdução
A rodovia Álvaro Maia conhecida como BR-319, oficialmente é uma
rodovia federal diagonal brasileira com extensão de 877 km (DNIT 2016). É a
única ligação por via terrestre disponível entre Manaus e Porto Velho e o restante
do Brasil. Apesar de ser uma rodovia ativa, a BR-319 não é plenamente trafegável
(DNIT 2016; Paiva e Pereira 2021), pois mais de 400 Km da rodovia estão
sem capa asfáltica. Os limitados investimentos na infraestrutura e manutenção,

335
os elevados índices pluviométricos e o tráfego de veículos com excesso de
peso sãopontos cruciais para o comprometimento da trafegabilidade da BR-319
(DNIT 2016).
A construção de pontes de madeira é uma prática comum ao longo de
estradas vicinais do Brasil (Milani e Kripka 2012). Ao longo da BR-319, existem
cerca de 51 pontes de madeira. A vantagem em utilizar este material está na
economia quando a madeira está disponível próximo da obra, em qualidade e
quantidades aceitáveis. A madeira é um recurso renovável de baixo valor, as
estruturas são fáceis de se montar e com baixo custo de construção (Borsatti
2013). A desvantagem do uso da madeiraem pontes, principalmente na região
amazônica, é que estão expostas aumidade, altos indicies pluviométrico, altas
temperaturas e as ações bióticas (DNIT 2016; Paiva e Pereira 2021). Nestas
condições, quando utilizadas sem um tratamentoprévio, as madeiras tornam-se
suscetíveis ao ataque de agentes xilófagos (fungos lignocelulolíticos e insetos)
reduzindo a vida útil da estrutura (Jesus et al.1988).
Os fungos estão amplamente distribuídos no ambiente, representam a
biomassa microbiana dominante em muitos ecossistemas florestais.
Ecologicamente, os macrofungos (Basidiomycetes) exercem um importante
papel na manutenção do ecossistema, por serem sapróbios, atuam na cadeia
alimentar decompondo matéria vegetal morta, reciclando os nutrientes. A
degradação promovida pelos macrofungosem madeiras pode causar dois tipos
de podridões: podridão brancaresultante da degradação da lignina, celulose e
hemicelulose do substrato deixando amadeira com aparência esbranquiçada e
esponjosa, como os do gênero Trametes Fr. (Polyporaceae) (Mariano et al.
2020). Já os fungos da podridão parda, como Gloeophyllum sepiarium que
degrada a celulose e hemicelulose, deixam o substrato em forma de cubos de cor
marrom.
É de suma importância manter e prolongar a vida útil das pontes de
madeira. Para isso, torna se crucial classificar as madeiras de acordo com as suas
propriedades tecnológicas e quanto ao risco de degradação por macrofungos
degradadores de madeira (Stefani et al. 2016; Rashidi et al. 2021). Este estudo
faz parte da Expediçãotécnico-cientifica para avaliações de pontes de madeiras
construídas na BR319/ Projeto - Madeiras Amazônicas
INCT/INPA/FAPEAMCNPq com a participação de uma equipe multidisciplinar

336
composta por profissionais de várias instituições visando identificar os problemas
estruturais nas pontes de madeiras, sugerir um programa de manutenção, e
capacitar profissionais para dimensionar, construir e recuperar pontes.Portanto,
o presente trabalho visou avaliar a ocorrência de macrofungos lignocelulolíticos
(Basidiomycetes) nas estruturas de madeiras e a biodegração das mesmas nas
pontes Igarapé Beleza e Bandeirão, localizadas no sistema viário da BR-319.

Material e Métodos
Local de estudo
Neste estudo, avaliou-se as estruturas de madeiras de duas pontes ao
longo daBR-319 (Estado do Amazonas) em agosto de 2021. A primeira ponte
vistoriada foi a do Igarapé Bandeirão (latitude 4°44'11.2"S, longitude
61°18'08.6"O), com 30 m decomprimento e localizada no km 263 (Figura 1 A e
B). A segunda ponte vistoriada foi a do Igarapé Beleza (latitude 4°47'29.1"S,
longitude 61°21'03.2"O), com 24 m decomprimento e localizada no km 271,50.

Análise de biodeterioração das pontes

As pontes são compostas por tabuleiro, vigas principais e secundárias,
pilarese fundações. A inspeção das pontes de madeira foi conduzida de forma
sistemática, ordenada, utilizando o método visual com registros fotográficos.
Foram inspecionadas a presença de fungos lignocelulolíticos em todas as
estruturas de madeiras que compõem a ponte como balancim (peça de madeira
de apoio das longarinas), guarda-corpo, guarda-roda, longarina, pilares, tabuleiro
e transversina (Figura 1).
Todas os elementos estruturais das pontes foram numerados para que não
houvesse equívocosquanto a sua localização. Na análise de biodeterioração foi
considerado a presença de macrofungos lignocelulolíticos nas estruturas, as
condições do ataque (ausente, superficial, moderado, intenso, perda quase total
da resistência) e o nível de degradação da madeira (ausência de sintomas de
degradação, degradação superficial, degradação evidente, degradação intensa
ou colonização interna por fungos).
Os macrofungos foram coletados e colocados em sacos de papel e
anotados a data, locais de coleta, a ponte, a estrutura na qual o fungo estava
presente. As amostras dos fungos foram identificadas conforme as descrições

337
das espécies em Ryvarden (1976; 1978), Ryvarden e Stene-Johansen (1980),
Hallenberg e Eriksson (1985), Gilbertson e Ryvarden (1986), Hjortstam et al.
(1987). Também, os sites Mycobank (http://www.mycobank.org) e Index
fungorum (http://www.indexfungorum.org/) foram acessados visando a
confirmação da espécie e dos nomes dos autores. Os espécimes foram
depositados na Coleção de Fungos de Interesse Agrossilvicultural/COTEI/INPA.

Figura 1 – Vista lateral e corte transversal do projeto de ponte de madeira utilizado pelo
DNIT nas rodovias da Amazônia.

Resultados e Discussão
Um total de 59 macrofungos (Agaricomycetes), estavam distribuídos nas
pontes Bandeirão (n=21) e Beleza (n=38). O maior número de macrofungos
ocorreu nas longarinas (9) e tabuleiros (7) da ponte Igarapé Beleza e no guarda-
rodas (10) e balancim (8) da ponte Igarapé Bandeirão (Tabela 1). Uma
diversidade de 33 espécies ocorreu nas estruturas das pontes, a maioria
pertence às famílias Polyporaceae e Corticiaceae. Auricularia delicata, Flavodon
flavus, Oligoporus sp., Panus crinitus, Perenniporia medulla-panis,
Schizophyllum commune, Schizopora cárneo lutea, Pycnoporus sanguineus e
Trametes sp., ocorreram em ambas pontes (Tabela 1).
Com relação ao ataque dos macrofungos na ponte Igarapé Beleza,
observou- se que as longarinas e tabuleiros foram as partes mais atacadas por
macrofungos lignocelulolíticos da família Polyporaceae (Tabela 1). Com destaque
para E. corrugata que ocorre em toda a extensão de ambas estruturas causando
degradação intensa (Figura 2 A e B). Alguns tabuleiros apresentaram

338
degradação moderada e as transversinas apresentaram degradação superficial
(Figura 2 C e D). Nos tabuleiros predominou E. corrugata e P. sanquineus
(Figura 2 E), enquanto que S. delectans e P. medulla-panis nas transversinas.
O pilar substituído de sustentação da ponte Igarapé Beleza foi colonizado por
Fuscoporia gilva que causou degradação intensa (Figura 2 F).

339
Tabela 1. Relação dos macrofungos que ocorrem nas estruturas de madeira da ponte Igarapé Beleza e Igarapé Bandeirão localizadas na BR 319,
Amazonas, Brasil.
Ponte Igarpé Beleza Ponte Igarapé Bandeirão
Total
Táxon Substrato Substrato

B GC GR L P TB TV B GC GR L P TB TV

AGARICOMYCETES

AURICULARIACEAE

Auricularia delicata (Mont.: Fr.) Henn. 2 1 3

Auricularia mesenterica (Dicks.) Pers. 1 1

Auricularia polytricha (Mont.) Sacc. 1 1

CORTICIACEAE 0

Hypochmicium sp. 1 1

Phanerochaete calotricha (P. Karst.) J.

1 1
Erikss. & Ryvarden

Phanerochaete cf. cacaina (Bourdot &

1
Galzin) Burds. & Gilb

Phanerochaete sp. 1 1

HYMENOCHAETACEAE

Fuscoporia gilva (Schwein.) T. Wagner & M.

1 1
Fisch

Fulviformes cf. cesatii 1 1

Sclerotus extensus (Lév.) Xavier de Lima 1 1

340
MERULIACEAE

Flavodon flavus (Klotzsch) Ryvarden 1 1 2

PANACEAE

Panus crinitus (L.) Singer 1 2 2 2 7

POLYPORACEAE 1 1

Oligoporus sp. 1 1

Antrodia albobrunnea (Romell) Ryvarden 1 1 1 2 5

Cont Tabela 1

Earliella corrugata (Pers.) Murrill 1 1 2

Favolus brasiliensis (Fr.) Fr. 1 1

Gloeophyllum sepiarium (Wulfen) P. Karst. 1 1

Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo 1 1 2

Microporellus sp. 1 1

Perenniporia medulla-panis (Jacq.) Donk 1 1 2

Perenniporia sp. 1 1 2

Piptoporus cf. solomienses (Dubois) Pilát 1

Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill 1 1 2

Rigidoporus cf. crocatus delectans (Pat.).

1
Murril

Schizopora carneolutea (Rodway &

1 1
Cleland) Kotl. & Pouzar

341
 Schizopora paradoxa (Schrad.) Donk 1 1 2

Schizopora flaviporia (Cooke) Ryvarden 1

Spongipellus delectans (PK). Murril 1

Trametes roseola Pat. & Har 1 1

Trametes sp. 1 2 3

Tyromyces sp. 1 1

SCHIZOPHYLLACEAE

Schizophyllum commune Fr. 1 1 2

Total 2 1 1 9 4 8 4 8 0 11 4 0 5 1 58
Legenda: B: balancim; GC: guarda-corpo; GR: guarda-roda; L: longarina; P: pilar de sustentação TB: tabuleiro; TV: transversina.

342
Figura 2 – Aspecto geral da parte inferior da Ponte Igarapé Beleza atacada por Earliella
corrugata (A). Longarina atacada E. corrugata (B) e P. medulla-panis nas transversinas (C),
corticiaceae degradandoo pilar de sustentação da ponte (D). P. sanquineus crescendo na
transversina (E), Pilar de sustentação substituído com ataque intenso de F.gilva (F). Aspecto
geral da parte inferior da Ponte Beleza (G), estruturas atacadas por vários fungos na parte
inferior (H), P. sanguinesus atacando a parte externa do Balancim (I), Balancim da ponte
Igarapé Bandeirão degradada por fungos corticioides lignocelulolíticos (J), Estrutura Guarda-
roda da ponte do Igarapé Beleza com ataque de T. roseola (K), Ataque intenso de P. cacaina
(L), P. cf. solomienses entre as estruturas de balancim (M), Pilar de sustentação da ponte
Igarapé Bandeirão com ataque intenso de fungo corticioides (N).

Por outro lado, na ponte Igarapé Bandeirão, as estruturas como balancim,

guarda roda e longarina foram as mais atacadas pelos fungos, portanto com uma
intensa degradação (Figura 2), sendo que balancim foi o mais atacado pelas
espécies principalmente de Auricularia delicata, A. mesentérica, Schizopora
carneo lutea, S. flavipora e S. paradoxa, além de Panus crinitus. Enquanto que
nas estruturas de guarda-rodas, P. crinitus, Hexagonia hydnoides e Trametes

343
roseola foram as mais dominantes. Já Antrodia albobrunnea ocorre em várias
partes dos tabuleiros.
Schizophyllum commune desenvolveu tanto nos tabuleiros como nas
longarinas expostos ao sol. As longarinas também foram atacadas por G.
saepiarium e S. paradoxa. Os fungos corticioides cresceram nas longarinas e
pilares de sustentação (Figura 2 J, L,N).
As estruturas de madeiras expostas ao sol, principalmente, as partes
laterais de ambas pontes foram atacadas por P. crinitus, G. saepiarium, P.
sanquineus, H. hydnoides, S. commune e Trametes sp. (Figura 2 I e M). Essas
espécies sãoconhecidas como macrofungos de clareira, preferindo ambientes
com alta incidência solar (Jesus 1988).
A quantidade de macrofungos xilófagos nas duas pontes, pode estar
associada às condições atmosféricas, que desempenham papel principal no
desenvolvimento dos macrofungos. Aliado ao fato das pontes estarem
localizadas na BR-319 queatravessa a região amazônica, estando expostas a
umidade, altos índices pluviométricos e altas temperaturas. Além de todos os
fatores bióticos que favorecema proliferação dos fungos (Mariano et al. 2020).
As duas pontes vistoriadas apresentavam tabuleiros com frestas
facilitando a livre passagem da água da chuva até as transversinas e longarinas
(Figura 2 A, G, H),facilitando a retenção de água nestas estruturas, contribuindo
para o desenvolvimento dos fungos. Os pilares de sustentação de madeira de
ambas as pontesestavam engastados diretamente no solo (Figura 2 F, N). O
contato direto da madeira com o solo pode ter favorecido infestação dos
macrofungos. Estas estruturas têm a função de transmitir os esforços da
superestrutura para a infraestrutura (fundações). A degradação dos pilares de
sustentação pode comprometer a segurança da ponte com relação ao tráfego
dos veículos e pedestres (Milani e Kripka 2012).
Numa perspectiva prática, é importante ressaltar que o número expressivo
de espécies de macrofungos xilófagos é outro fator a ser considerado quanto ao
aspecto geral da biodegradação das estruturas das madeiras de ambas as
pontes analisadas, sendo que muitas delas apresentam: 1) medula, isto é um
aspecto do centro do tronco que se desenvolve a partir da planta. Esse vestígio
serve de penetraçaõ de fungos xilófagos que irão iniciar uma sucessão de ataque
ao tecido xilemático, 2) presença de casca e alburno, 3) grã cruzada (se for

344
usada para suportar grande resistência), 4) rachaduras no topo da estrutura que
contribuem para diminuir a resistência mecânica, e favorecer entrada dos fungos.
Somados a estes fatores, ambas as pontes são compostas por diferentes
espécies de madeira colocadas aleatoriamente sem classificação prévia quanto
a suaresistência e risco de degradação. É o caso do balancim, proveniente de
cincoespécies diferentes de madeiras manufaturadas e utilizadas de maneira
inadequada. Os diferentes níveis de biodegradação fúngica indicam que as
madeiras são de baixa durabilidade e sem pré-tratamento. Entretanto, o
recomendado o uso das mesmas espécies de madeira para cada estrutura e com
tratamento adequado.
Salienta-se que a composição de espécies de macrofungos nas duas
pontes seja maior do que a registrada, pois alguns espécimes não foram
identificados devido ataque de insetos, acúmulo de poeira resultante do tráfego
intenso de carros e a impossibilidade de coletar espécimes que cresceram nas
partes mais altas da ponte. Estes fungos foram registrados apenas por fotografia.
Recomenda-se para futuras ações, o uso de madeiras de alta
durabilidade, tendo em vista a grande ocorrência de macrofungos degradadores
de madeira em ambientes amazônicos. Por outro lado, é reconhecida a
importância das pontes de madeira, principalmente na região amazônica, onde
há grande disponibilidade de madeiras com alta durabilidade que podem ser
exploradas de maneira sustentável e podendo contribuir para prolongar a vida útil
das pontes localizadas na BR-319 (Jesus et al. 1988b).

Conclusões
Uma diversidade de 33 espécies de macrofungos lignocelulolítico está
distribuída nas pontes Igarapé Beleza e Igarapé Bandeirão construída na
Rodovia Álvaro Maia conhecida como BR-319. Entre as espécies, destaca-se
Auricularia delicata, Flavodon flavus, Oligoporus sp., Panus crinitus, Perenniporia
medulla-panis,Schizophyllum commune, Schizopora cárneo lutea, Pycnoporus
sanguineus, Trametes sp. que ocorrem nas duas pontes. Na ponte Igarapé
Bandeirão, o balancim, guarda roda e longarina apresentaram ataque fúngico
intenso com degradação. Já naponte Igarapé Beleza, as longarinas e tabuleiros
foram as partes mais atacadas pelos macrofungos xilófagos. Enquanto que os
pilares de sustentação estavam engastadosdiretamente no solo apresentando

345
degradação intensa causada por Fuscoporia gilvae Phanerochaete cacaina, o
que pode comprometer a segurança do tráfego dos veículos e pedestres nas
pontes. A falta de estratégias construtivas para evitar concentração de água em
pontos vitais da estrutura da ponte e a utilização de madeiras sem considerar a
resistência e durabilidade favoreceu o intenso ataque dos fungos
lignocelulolíticos nas pontes de madeiras localizadas na rodovia Br-319.

Agradecimentos
Fundação de Amparo a Pesquisas do Estado do Amazonas - FAPEAM,
pelo fomento ao Projeto - Madeiras Amazônica - INCT/INPA/CNPq e o apoio do
Departamento Nacional de Infraestrutura de Transportes- DNIT por viabilizar as
atividades nas pontes.

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Paenibacillus polymyxa induz a síntese de glutationa redutase

nomilho e reduz a podridão do colmo

Marins, Mikaely Sousa1; Diniz, Gisele de Fátima Dias2; Alves, Talles Henrique
Pereira3; Silva, Dagma Dionísia2; Paiva, Christiane Abreu de Oliveira2; Pfenning,
Ludwig Heinrich1; Cota, Luciano Viana2

1Universidade Federal de Lavras, 2Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Milho

e Sorgo, 3Universidade
Federal de São João Del-Rei.
Email: [email protected]

Resumo
Na natureza, a associação entre o milho e Fusarium verticillioides não implica
necessariamente na produção de micotoxinas. Essa associação pode-se tornar
indesejada quando o fungo causa doença na cultura ou produz fumonisinas nos
grãos. A ação de Paenibacillus polymyxa como agente de controle biológico
(BCA) e como rizobactéria promotora decrescimento de plantas (PGPR) é bem
documentada na literatura. O objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de
P. polymyxa em reduzir a severidade da podridão do colmo causada por F.
verticillioides no milho e acompanhar a produção de glutationa redutase em
resposta de defesa da planta a infecção do fungo. No experimento foi utilizada a
cepa LIS03 previamente selecionada, com capacidade comprovada de inibir o
crescimento do patógeno in vitro em diferentes substratos. O experimento foi
conduzido em casa de vegetação, as sementes foram microbiolizadascom LIS03
no momento do plantio e cinco dias antes da inoculação do patógeno foi feita a
pulverização das plantas com LIS03. Foi avaliada a incidência e a severidade da
podridão do colmo, após inoculação com F. verticillioides e tratamentos com a
bactéria P. polymyxa LIS03. Avaliou-se também, a produção da enzima de
defesa glutationa redutase (GR) em folhas de milho. Plantas que receberam
tratamentos com P. polymyxa LIS03 apresentaram redução na severidade da
podridão do colmo e aumento na atividade da enzima GR. Os resultados
demonstram que a bactéria P. polymyxa (LIS03) possui eficiencia em modular o
sistema de defesa de plantas de milho ativando a rota da GR com respostas
rápidas frente a infecção causada por F. verticillioides.

Palavras-Chave: Controle Biológico; Indução de resistência sistêmica; Enzimas

de defesa.

Introdução
A cultura do milho (Zea mays L.) é afetada por várias doenças, que
causamredução e perdas de produtividade, mas também comprometem a
qualidade do produto e derivados. Fusarium verticilloides é um fungo que atinge

348
as plantas nas fases de pré- e pós-colheita, induzindo a podridão do colmo,
espigas e raízes. Também, produz metabólitos secundários altamente tóxicos
como as fumonisinas, micotoxinasque causam doenças em humanos e animais
(Aguado et al. 2019; Franco et al. 2019; Naz et al. 2021). O manejo químico é
frequentemente utilizado para o controle de fungos em campo, no entanto, este
manejo de forma isolada pode induzir o aumento da produção de micotoxinas
nos grãos, alem de prejudicar o meio ambiente causando poluição do solo e dos
recursos hídricos (Bressan e Figueiredo 2003; Guimarães et al. 2020a, b).
A aplicação de microrganismos benéficos para controlar patógenos em
camporepresenta uma alternativa viável e complementar aos métodos químicos.
O tratamento de sementes e a pulverização com agentes de controle biológico
podem proteger as plantas de milho contra a infecção de F. verticillioides e reduzir
o conteúdo de fumonisinas nos grãos (Pereira et al. 2012; Guimarães et al.
2020a). Os mecanismos utilizados pelos antagonistas incluem competição com
o patógeno por espaço e nutrientes, produção de metabólitos secundários que
inibem o crescimentodo patógeno e/ou indução de resistência da planta (Köhl et
al. 2019).
A bactéria P. polymyxa produz uma gama de compostos interessantes ao
controle biológico, dentre eles destacam-se a fusaricidina e a polimixina. A
fusaricidina é um metabólito secundário que possui ação antifúngica a fungos
filamentosos (Qiu et al. 2019). A inibição de F. verticillioides por fusaricidina já foi
comprovada (Han et al. 2017). A polimixina pode comprometer o
desenvolvimento das hifas de F.verticillioides e reduzir a produção de fumonisina
(Kim et al. 2010).
No processo de indução de resistência sistêmica (ISR) as respostas de
defesasão preparadas para hipersensibilizar as plantas à infecção de patógenos
ou ataque de pragas, as vias de sinalização ativadas são as do ácido jasmônico,
etileno e ácidosalicílico (Grady et al. 2016; Galletti et al. 2020). A ativação da
imunidade basal é mediada pelo aumento da expressão de genes relacionados
a produção de enzimas de defesa como catalase (CAT), peroxidase (POD),
superóxido dismutase (SOD) e glutationa redutase (GR) (Alquéres et al. 2013;
Jiang et al. 2019).
O objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de um isolado
previamente selecionado de P. polymyxa em reduzir a severidade da podridão

349
do colmo induzida por F. verticillioides em milho e avaliar a resposta de defesa
da planta quantificando aenzima glutationa redutase (GR).

Material e Métodos
Cultura bacteriana e preparação de microconídios fungícos
A cepa de P. polymyxa (LIS03) obtida da Coleção de Microrganismos
Multifuncionais e Fitopatogênicos (CMMF) da Embrapa Milho e Sorgo foi
reativada emmeio batata ágar dextrose (BDA-Kasvi) e incubada a 25 °C por 48
horas. A seguir, uma colônia pura da bactéria foi transferida para meio líquido
caldo de soja tripticaseína (TSB-Kasvi) e incubada por 72 horas a 25 °C em
agitação de 120 rpm. Aconcentração do inóculo bacteriano foi ajustada para 108
UFC.mL-1 por densidade ótica.
O isolado de Fusarium verticillioides obtido da Coleção Micológica de
Lavras (CML 2743) foi reativado em meio BDA e incubado a 25 °C por 7 dias.
Para preparo do inóculo, dois discos de 5mm retirados da colônia foram
transferidos para meio líquido de Batata Dextrose e incubados por 48h a 25 °C
sob agitação de 150rpm paraprodução de conídios. A suspensão foi filtrada e a
concentração de conídios ajustada em câmara de Neubauer para 105
conídios.mL-1 (Guimarães et al. 2020a, modificado).

Efeito de Paenibacillus polymyxa na severidade da podridão do colmo

O experimento foi instalado na casa de vegetação da Embrapa Milho e
Sorgo utilizando vasos de 5 kg contendo solo de cerrado horizonte B. Trinta dias
antes do plantio foi feito a calagem do solo com calcário dolomítico 2t.ha-1. No
solo foi adicionado adubação convencional NPK (08-28-16) e adubação de
cobertura 1g de ureia por vaso 15 e 30 dias após o plantio. O experimento foi
conduzido utilizando o híbrido DKB 390, as sementes dos tratamentos 1 e 2 foram
submetidas a um processode microbiolização com a cepa LIS03. A bactéria foi
multiplicada como citadoanteriormente, a proporção de inóculo foi 7,5 mL.kg-1 de
sementes e adição de 0,5 g de adesivo Bioma Fix (Bioma). Os tratamentos
foram: 1- Semente microbiolizada + pulverização de LIS03. 2- Semente
microbiolizada + pulverização de LIS03 + fungo. 3- Controle negativo (água). 4-
Controle positivo (fungo).

350
 A pulverização da cepa LIS03 ocorreu após as plantas atingirem o estágio
fenológico V4, utilizando os mesmos parâmetros para preparo da calda de
pulverização descritos anteriormente. Cinco diasapós a aplicação do antagonista
foi feito a inoculação no colmo das plantas com 2 mL da suspensão de esporos
do fitopatógeno utilizando seringa estéril. Para a quantificação enzimática, foram
feitas coletas de material vegetal aos 6 e aos 12 dias após inoculação do
patógeno. As lesões do colmo foram avaliadas 25 dias após a inoculação
utilizando a escala diagramática desenvolvida por Nicoli et al. (2015). A
porcentagem de redução da podridão foi calculada pela fórmula proposta por
Abbott (1925) (T-t)*100/T, onde "T" representa a porcentagem da podridão do
colmo no tratamento controle e "t" a porcentagem da podridão do colmo dos
tratamentos com oantagonista.

Quantificação da atividade da enzima glutationa redutase (EC 1.8.1.7)

Os tecidos vegetais foram macerados em almofariz com adição de
nitrogênio líquido para obtenção de um pó fino, este foi transferido para tubos
Eppendorfs volume 2 mL preenchendo ¼ do volume, os extratos enzimáticos
(EE) foram obtidos através da adição de 40 µL de Polivinilpirrolidona (PVP) e
tampão de extração Tris HCl 50 mMpH 7,6 até completar o volume do tubo. As
amostras foram agitadas em vórtex a 3000rpm por 1 min. Em seguida, os tubos
foram centrifugados a 9300 g por 5 min, o sobrenadante foi transferido para um
tubo novo e utilizado para quantificação de proteínas totais (Bradford 1976) e
glutationa redutase (GR). A reação para quantificação de proteínas totais
consistiu em 10 µL de EE, 20 µL de tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,0
e 170 µL do reagente Bradford. A quantificação das proteínas ocorreu em
espectrofotômetro Epoch (Biotek) a λ 595 nm utilizando o software Gen5 Data
Analysis (Biotek).
A atividade da GR foi determinada através do método descrito por
Schaedle e Bassham (1977) em que a oxidação de NADPH é monitorada em
espectrofotômetro no comprimento λ 340 nm. As reações consistiramde 40 µL de
EE, 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,6), NADPH 0,15 mM, MgCl2 3 mM e
glutationa (GSSG) 1 mM. As proteínas totais foram quantificadas pelo método
de Bradford (1976) onde foi obtida uma curva padrão de proteínas totais com
albumina de soro bovino (BSA) nas concentrações de 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5;

351
3,0; 3,5; 4,0 e 4,5 Ug de proteína. Essa curva padrão foi utilizada para
transformar as leituras das amostras correspondentes aos EE nas leituras do
espectrofotômetro em dados de concentração de proteína solúvel. Assim, os
valores foram transformados em unidades de enzimas (U) para a enzima
estudada.

Análise de estatística
Os dados foram testados quanto a normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk
e homogeneidade pelo teste de Bartlett e submetidos a análise de variância
(ANOVA). Quando os tratamentos foram significativos e atenderam aos
pressupostos, as médiasforam comparadas pelo teste de Tukey (p <0,05). As
análises foram desenvolvidas utilizando o software R studio versão 1.4.1106.

Resultados e Discussão
Na avaliação da severidade da podridão do colmo identificamos que as
plantasinoculadas com F. verticillioides apresentaram 44,5% de severidade da
doença, enquanto as plantas que receberam tratamentos com o isolado (LIS03)
apresentaram apenas 29,94% de severidade da doença, perfazendo uma
redução de 32,72%. Plantas que foram tratadas com o antagonista também
apresentaram redução das lesões no lado externo do colmo e com pouco ou
nenhum micélio. As plantas do tratamento controle negativo (T4) apresentaram
apenas a lesão causada pela seringa (Figura 1). A nossa hipótese é que a
bactéria inoculada na semente colonizou o sistema radicular da planta. Essa
microbiota das raízes juntamente com a colonização epífita, feita cinco dias
antes da inoculação do patógeno, estimulou o sistema imonulógico das plantas
no sentido de oferecer respostas melhores para a defesa à inoculação de F.
verticillioides promovendo, assim a redução da severidade da podridão do colmo.
A fim de identificar algum perfil de indução de resistência sistêmica,
quantificamos a produção da enzima glutationa redutase e identificamos um
elevado perfil de produção da enzima nas plantas que receberam tratamentos
com a bactéria e posteriormente foram desafiadas com a inoculação de F.
verticillioides (T2). Após 6 e 12 dias da inoculação do patógeno (dai) plantas
tratadas com LIS03 e desafiadas com F. verticillioides apresentaram um
incremento na atividade da GR de 23 e 82%, respectivamente, quando

352
comparadas com plantas que foram apenas desafiadas como patógeno (Figura
2).
Du et al. (2022) demonstraram a supressão da murcha de Fusarium em
pepino utilizando a inoculação das sementes com P. polymyxa NSY50. O pré-
tratamento das sementes de pepino ativou o metabolismo da glutationa
melhorando a capacidade antioxidante das plantas. Timmusk et al. (2019)
evidenciaramque a pulverização das espigas de trigo foi eficiente em formar
biofilme com polissacarídeos competentes ao antagonismo de Fusarium
graminearum. A pulverização das espigas feita uma semana antes da inoculação
do patógeno protegeu os grãos da infecção.

Figura 1. Lesões do colmo induzidas pela inoculação de F. verticillioides. A-D: (T4) controle
positivo (fungo). E-H: (T2) microbiolização de semente com LIS03 + pulverização de LIS03 +
infecção com fungo. I-L: (T3) controle negativo (água).

353
Figura 2. Atividade da enzima glutationa redutase. T1: microbiolização de semente com
LIS03 +pulverização de LIS03. T2: microbiolização de semente com LIS03 + pulverização de
LIS03 + infecçãocom fungo. T3: controle negativo (água). T4: controle positivo (fungo).
Conclusão
O isolado da bactéria P. polymyxa (LIS03) é um eficiente antagonista para
a podridão do colmo de F. verticillioides na cultura do milho. Aplicações desta
bactéria via semente e via pulverização suprimiram a severidade da doença e
estimularam a atividade da enzima antioxidante glutationa redutase.

Agradecimentos
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
superior, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Universidade Federal
de Lavras.

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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Potencial para promoção de crescimento de plantas em

bactériasendofíticas da rabo-de-guariba

Bandeira, Izabel Correa1; Sousa,Thiago Fernandes3; Lima, Ícaro Nascimento2;

Mendes, Valdirda Costa2; Costa, Gerodes Vasconcelos da2; Silva, Gilvan Ferreira
da1

1Embrapa Amazônia Ocidental, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,

3Universidade Federal do Amazonas
Email: [email protected]

Resumo
Apesar de o fósforo ser abundante na natureza, mais de 40% dos solos
cultiváveis mundiais apresentam baixa produtividade relacionada com a falta
desse nutriente. Asaplicações constantes de fertilizantes químicos usadas para
contornar esse problemageram impactos negativos ao meio ambiente como a
eutrofização de corpos d'água. Atualmente, o uso de Bactérias Promotoras de
Crescimento de Plantas (BPCP) tem sido uma forma alternativa, econômica e
sustentável de reduzir o uso de fertilizantes químicos, visto que essas bactérias
podem apresentar características para solubilização de fosfato e outros
nutrientes, produção de fitohormônios e indução de resistência na planta contra
fitopatógenos. Neste trabalho, foram analisados os isolados BRG2 e BRG7
quanto ao seu potencial de solubilização in vitro de fosfatos inorgânicos em meio
PVK com fontes de alumínio e ferro. Além disso, a partir da obtenção do genoma
completo desses isolados foi realizada uma prospecção de genes relacionados
à promoção de crescimento de plantas. Os índices de solubilização (IS) obtidos
para os dois isolados indicam uma elevada eficiência de solubilização, com
IS>18 para fonte de alumínio e IS>20 para fonte de ferro. A identificação
filogenômica de BRG2 revelou uma nova espécie de Paraburkholderia com
dDDH <70% em relação as espécies tipo mais próximas. Em adição, foram
identificados genes relacionados à produção do fitohormônio ácido indol acético,
ACC desaminase, fosfatase inorgânica, produção de celulose e aril-polienos.
Esses resultados indicam que a espécie possui grande potencial para a
promoção do crescimento de plantas e futuramente pode ser testada como um
bioinoculante em solos ricos em fosfato inorgânico de alumínio ou ferro.

Palavras-Chave: Fosfato; Biocontrole; Mineração genômica

Introdução
A deficiência nutricional é um dos principais problemas que afetam o
crescimento das plantas, impactando a produção agrícola mundial (Pandey
2015). Ofósforo é o segundo nutriente de maior importância, pois faz parte da
estrutura de ácidos nucleicos, coenzimas, fosfolipídios e fosfoproteínas, estando
diretamente envolvido nas reações de energia, fotossíntese e respiração celular

357
(Mendes et al.2014). E apesar de ser abundante na natureza, mais de 40% dos
solos cultiváveis mundiais apresentam baixa produtividade relacionada com a
falta desse nutriente (Vance 2001).
Solos tropicais são grandes exemplos desse problema, e isso acontece
devidoa elevada capacidade de adsorção das formas disponíveis de fósforo em
superfícies argilosas (Barros et al. 2005). A formação de diferentes complexos
com o fósforo disponível é influenciada também pelo pH do solo, ocorrendo em
solos ácidos a formação de complexos com óxidos de alumínio e ferro, e em
solos alcalinos com óxidos de cálcio (Shen et al. 2011; Aliyat et al. 2020). Esse
problema é contornado por meio de aplicações constantes de fertilizantes
químicos, gerando impactos negativos ao meio ambiente como a eutrofização de
corpos d'água.
Uma alternativa econômica e sustentável para redução do uso de
fertilizantes químicos é a prospecção de Bactérias Promotoras de Crescimento
de Plantas (BPCP). Essas bactérias apresentam características fisiológicas para
solubilização de fosfato, fixação de nitrogênio, produção de sideróforos,
antimicrobianos e fitohormônios, e podem ser usadas para o manejo e fertilização
de plantas (Qassim et al. 2018; Valle-Romero et al. 2023).
Nesse cenário, destaca-se o gênero Paraburkholderia pela capacidade de
atuar no biocontrole de fitopatógenos, biofertilização, biorremediação e por
possuir baixa capacidade de causar doenças em humanos e plantas (Angus et
al. 2014; Sawana et al. 2014; Estrada-De Los Santos et al. 2016; Dias et al.
2019). Devido a essas características, técnicas de mineração de genomas e
engenharia genética tem sido aplicadas para a seleção, melhoramento de
linhagens e expressão heteróloga de produtos naturais de interesse
biotecnológico para formulação de potentes biopesticidas (Xheng et al. 2020;
Donoso et al. 2017; Petrova et al. 2022).
Nesse sentido, o presente trabalho investigou traços funcionais de
solubilização de fosfato, identificação de genes relacionados ao metabolismo
secundário e a promoção de crescimento vegetal em uma nova espécie de
Paraburkholderia.

358
 Material e Métodos
Isolamento seletivo de bactérias endofíticas solubilizadoras de fosfato
A coleta ocorreu no dia 24 de abril de 2022 sendo selecionados caules
rastejantes sadios da samambaia amazônica Phlebodium decumanum (rabo-de-
guariba) inquilina de um tronco de Handroanthus impetiginosus (Ipê-roxo)
localizado na Embrapa Amazônia Ocidental (Rodovia AM 010, km 29, Manaus-
AM). As amostras foram lavadas com água e detergente neutro, seguido de
desinfestação superficial do material vegetal em álcool 70% por 1 minuto,
hipoclorito de sódio a 2% por 1 minuto, álcool 70% por 30s e três lavagens em
água destilada estéril. Em seguida, foram inoculados pequenos fragmentos em
placa de Petri com meio de cultura PVK e CAS Ágar e incubadas a 28°C.

Análise do índice de solubilização de fosfato

Colônias purificadas foram inoculadas em placas de Petri com três tipos
de meio PVK modificado para avaliar a solubilização de fosfato inorgânico de
cálcio, alumínio e ferro (Ca3(PO4)2, AlPO4 e FePO4), o experimento foi realizado
em triplicatae incubado a 28°C. O diâmetro da colônia e o halo de solubilização
foram medidos em24 e 48 horas, e usados para calcular o Índice de Solubilização
(Kirui et. al. 2022).

Identificação filogenômica e mineração de genes relacionados a

promoção decrescimento de plantas
A análise filogenômica foi realizada pelo TYGS Type (Strain) Genome
Server disponível em https://tygs.dsmz.de, utilizando genomas de espécies tipo
disponíveis (Meier-Kolthoff 2019). A anotação funcional de genes foi realizada
pelo servidor do RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology)
disponível em https://rast.nmpdr.org/, para a detecção de genes alvos também
foi utilizado a ferramenta de BLAST dentro do servidor (Aziz et al. 2008). A
identificação de Clusters de Genes Biossintéticos (BGC's) foi feita pelo
AntiSMASH, disponível em https://antismash.secondarymetabolites.org/,
comparados com dados da literatura para identificação de prováveis BGC's
envolvidos na interação bactéria-planta, e paraa determinação da conservação
de genes nos BGC's alvos com os BGC's de espéciesde interesse foi utilizado o
pipeline clinker & clustermap.js (Gilchrist et al. 2021).

359
 Os isolados brg2 e brg7 avaliados nesse trabalho se destacaram por
apresentar atividade positiva para produção de sideróforos, além de elevada
capacidade de solubilização de fosfatos de alumínio e ferro (Figura 1).

Figura 1. Elevada capacidade de solubilização de fosfato de alumínio e ferro (IS >18) 48 horas
após ainoculação em meio PVK com bromocresol green. IS = Índice de Solubilização.

A análise do índice de solubilização (IS) em 24 horas de cultivo apresentou

altaeficiência para as fontes de alumínio e ferro de ambos isolados, com valores
de índiceacima de 10 (Tabela 1). Os índices de solubilização de AlPO4 e FePO4
em 48 horasde ambos isolados mostram-se cinco e seis vezes maiores do que
os reportados por Sembiring (2022) para Burkholderia cepacia, Burkholderia
cenocepacia e Burkholderia seminalis e por Xuan (2018) para Burkholderia
cepacia, consideradas bactérias com alta eficiência de solubilização.

Tabela 1. Índice de solubilização (diâmetro do halo solubilizado/diâmetro da colônia)

Paraburkholderia sp. nov BRG7
Fontes de fosfato 24h 48h 24h 48h
Alumínio IS=11,3 IS=18 IS=12,6 IS=19
Ferro IS=11 IS=20 IS=12,3 IS=21
Cálcio baixo baixo baixo baixo

A análise filogenômica no TYGS indicou que o isolado brg2 é uma nova

espéciedentro do gênero Paraburkholderia com dDDH de 33.8 e 33.7 com as

360
espécies tipo mais proximamente relacionadas de Paraburkholderia eburnea e
Paraburkholderia bannensis, respectivamente. O genoma da nova espécie
apresenta ~8Mb de tamanhoe conteúdo G+C de 63%. Bactérias presentes no
mesmo clado filogenético como linahgens de Paraburkholderia tropica são
reconhecidas como promotoras de crescimento de sorgo, cana-de-açucar,
tomate e outras espécies vegetais (Silva et al. 2018; Kuramae et al. 2020; Vio et
al. 2022).

Figura 2. Análise filogenômica utilizando o TYGS, onde o retângulo em vermelho destaca

a novaespécie isolada neste trabalho.

A mineração genômica de BCG's feita no antismash revelou 11 clusters

de genes, sendo um de PKS, quatro para produção de terpenos, um NRPS, um
RiPP, um híbrido e dois não classificados (Other). Dentre esses clusters o 52.1
(Figura 3) exibiu relação com a biossíntese de aril-polienos, pigmentos
semelhantes aos carotenoides com capacidade protetiva de danos induzidos
pela luz e espécies reativas de oxigênio que podem causar estresse dentro de
tecidos vegetais (Graciela et al. 2019).

361
Figura 3. Análise de sintenia para a biossíntese de aril-polienos.

A anotação gerada pelo RAST indicou no genoma de Paraburkholderia sp.

nova presença de uma via completa para a produção de L-Tryptophano (Tabela
2), produção de AIA pela via TAM e de celulose por meio do operon bcs.

Tabela 2. Genes de Paraburkholderia sp. nov BRG2 para biossíntese de triptofano, ácido
indol-3-acético (AIA), ACC desaminase, fosfatase e celulose.
Função predita Código enzima
Enzimas relacionadas à produção de Triptofano
trpE Antranilato sintase 4.1.3.27
trpD Antranilato fosforibosiltransferase 2.4.2.18
trpA Triptofano subunidade α sintase 4.2.1.20
trpB Triptofano subunidade β sintase 4.2.1.20
trpC Indol-3-glicerol fosfato sintase 4.1.1.48
Enzimas relacionadas à produção de AIA, celulose, fosfatase e degradação do etileno
YedL N-acetiltransferase 2.3.1.-
YhcX Nitrilase -
AldA Aldeído desidrogenase 1.2.1
Monoamina oxidase 1.4.3.4
ACCD ACC desaminase 3.5.99.7
PPA1 Pirofosfatase inorgânica 3.6.1.1
BCS Operon Celulose Sintase
Beta-1,4-Glucanase (celulase) 3.2.1.4

Os genes para produção de celulose, síntese de ácido indol acético (IAA)

e ACC desaminase estão diretamente relacionados a capacidade de
Paraburkholderia spp. de colonizar e promover o crescimento de plantas. A

362
presença do gene para 1- aminociclopropano-1-carboxilato mostra que a nova
espécie pode ser capaz dediminuir o nível de etileno nas plantas hospedeiras,
mediando respostas de resistênciae tolerância ao stress ambiental (Esmaeel et
al. 2018). A detecção de do gene ppa1 para pirofosfatase inorgânica corrobora
com os dados in vitro obtidos para solubilização de fosfatos inorgânicos e a
região vizinha indica a presença de genes que podem também estar
relacionados a essa atividade biológica.

Conclusões
Os isolados avaliados neste estudo exibem alta eficiência para
solubilização defosfatos inorgânicos de alumínio e ferro. A obtenção do genoma
de BRG2 indicou queeste isolado é uma nova espécie de Paraburkholderia spp. e
apresenta diversos genescom funções relacionadas a promoção do crescimento
de plantas, como produção de aril-polienos, fosfatase inorgânica, AIA, ACC
desaminase e celulose. Esses resultadosindicam que a espécie possui grande
potencial de promover o crescimento de plantase futuramente pode se tornar um
bioinoculante como a espécie Paraburkholderia tropica que está no mesmo clado
na análise filogenômica do TYGS.

Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas pelo suporte financeiro e concessão de Bolsas de estudo obtido a
partir do programa Prospam (Edital Nº 008/2021). Ao Conselho Nacional de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e
CAPES-Amazônia Legal.

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Predição in silico de efetores de Fusarium decemcellulare,

agentecausal do superbrotamento do guaranazeiro

Chagas, Steffany Souza1; Zerlotini Neto, Adhemar2; Silva, Gilvan Ferreira3;

Caniato, Fernanda Fatima1

1Universidade Federal do Amazonas, 2Embrapa Informática Agropecuária, 3Embrapa

Amazônia Ocidental
Emai: [email protected], [email protected]

Resumo
O guaranazeiro é uma planta nativa da Amazônia de grande importância
econômica e social para o estado do Amazonas, onde a sua produção vem sendo
comprometida por doenças fúngicas, como o superbrotamento causado por
Fusarium decemcellulare. No presente estudo conduzimos a predição in silico
de efetores no secretoma deste importante patógeno do guaranazeiro. As
análises foram conduzidas no genoma completo dos isolados CPAA-F200 e
CPAA-F307 de F. decemcellulare (SISGEN Nº A6DEE0E), visando identificar
candidatos a efetores potencialmente relacionados à sua patogênese que
possam contribuir para o seu controle. O número de proteínas preditas como
secretadas foram (CPAA-F200: 1335 vs. CPAA-F307: 1316). Do secretoma
predito dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F. decemcellulare, 537
proteínas foram declaradas candidatas a efetoras por possuíremcaracterísticas
comuns a efetores, incluindo: comprimento de sequência (≤200 aa) & conteúdo
de cisteína ≥ 3% (CPAA-F200: 158 e CPAA-F307: 162) e presença do motivo
Y/W/FxC (CPAA-F200: 129 e CPAA-F307: 144). Foram incluídos como
candidatos a efetores aqueles resultantes da predição pelo EffectorP (CPAA-
F200: 455 e CPAA-F307: 441) e aqueles que apresentam identidade de
sequência com efetores conhecidos da PHI-base (CPAA-F200: 11 e CPAA-
F307: 5). Foram identificadas proteínas com domínios presentes nos efetores já
descritos na literatura:Ecp6, LysM3, Ecp2, FGL1, AGLIP1, AvrLm4, MoCDIP4,
MgSM1 e AVR-Pita edomínios associados à patogênese em outros fungos:
domínio CFEM (common in fungal extracellular membranes, PF05730), domínio
CVNH (CyanoVirin-N, PF08881).O estudo mostrou a capacidade dos isolados
(repetido no texto acima) CPAA- F200 e CPAA-F307 de F. decemcellulare
suprirem candidatos a efetores que direcionarão a continuidade do estudoacerca
dos seus envolvimentos na patogênese deste importante patógeno do
guaranazeiro.

Palavras-Chave: Paullinia cupana var. sorbilis; interação planta-patógeno;

hiperplasia floral.

Introdução
Guaraná, também chamado de guaraná-da-amazônia (Paullinia cupana

367
var. sorbilis) é uma espécie nativa da região Amazônica conhecida por suas
propriedades estimulantes e medicinais, que tem sido usado por séculos por
tribos indígenas da Amazônia (Schimpl et al. 2013). As propriedades
farmacêuticas do guaraná como estimulante, tônico e afrodisíaco vêm sendo
disseminadas mundialmente desde o primeiro relato do seu uso por índios,
levando a inclusão do guaraná ao grupo de plantas medicinais, resultando no
aumento do seu uso e comercialização (Schimpl et al. 2014). As sementes são a
parte comercialmente útil da planta e é a parte da plantaonde a cafeína (1,3,7-
trimetilxantina) é encontrada em maior concentração, que podevariar de 2,5 a
6,5% de cafeína por peso seco, dependendo do genótipo (Schimpl et al. 2014).
Assim, a propriedade estimulante do guaraná é atribuída à cafeína, que é
também o principal ingrediente de bebidas energéticas, e é considerada seguro
pela FDA (US Food and Drug Administration).
Apesar da importância econômica e social do guaraná para o estado do
Amazonas, o estado não figura no ranking de maior produtor brasileiro desde
1988 e a produção do estado chega a ser até 2,3% menor que o primeiro
colocado que é o estado da Bahia (IBGE 2021). As doenças fúngicas são um
dos fatores que limitam a produção de guaraná no Amazonas, entre elas
destacamos a antracnose causada pelo Colletotrichum guaranicola e o
superbrotamento causado Fusarium decemcellulare. Em 2017 porém, foi isolado
de clones comerciais resistentes à antracnose um novo fungo patogênico,
desconhecido até o momento, o Pseudopestalotiopsis gilvannii e um outro fungo
até o momento desconhecido por causar doenças em plantas, o
Neopestalotiopsis formicidarum (Gualberto et al. 2021). Estes dois últimos
resultam em sintomas semelhantes ao da antracnose causada pelo C.
guaranicola.
O F. decemcellulare, agente causal do superbrotamento do guaranazeiro,
afetaas inflorescências e as brotações vegetativas produzindo sintomas como
hipertrofia e/ou hiperplasia floral, superbrotamento das gemas vegetativas e
florais, que chegama causar perda de até 100% da produção (Araújo et al. 2006;
Queiroz et al. 2020). Diante das perdas que este fungo inflige ao guaranazeiro,
o sequenciamento do seu genoma foi conduzido visando obter informações
sobre os mecanismos moleculares relacionados à patogenicidade deste fungo.
Neste sentido conduzimos análises in silico visando a predição do secretoma de

368
dois isolados de F. decemcellulare, o CPAA-F200 e CPAA-F307, com foco nas
proteínas secretadas denominadas efetoras, uma vez que as proteínas efetoras
secretadas pelos fungos patogênicos atuam promovendo a colonização,
alterando a fisiologia ou modulando a resposta imune dohospedeiro.
O objetivo desse trabalho foi realizar a predição in silico do secretoma e
candidatos a efetores do F. decemcellulare (CPAA-F200 e CPAA-F307), agente
causal do superbrotamento do guaranazeiro.

Material e Métodos
Microrganismos
Foram usadas sequências do genoma de dois isolados patogênicos de
F. decemcellulare (CPAA-F200 e CPAA-F307) da coleção de microrganismos
da Embrapa Amazônia Ocidental. O acesso ao patrimônio genético foi
autorizado pelo SISGEN Nº A6DEE0E.

Predição gênica
A predição gênica dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F.
decemcellulare foi conduzida no software Funannotate
(https://funannotate.readthedocs.io/en/latest/in Fudex.html). Os produtos da
traduçãoin silico dos genes preditos foram utilizados na predição do secretoma
e candidatos aefetores.

Predição de proteínas secretadas

Predições in silico de localização subcelular foram realizadas usando
ferramentas de bioinformática visando a definição do secretoma predito dos
isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F. decemcellulare. Foi adotado o
pipeline utilizado por Neu e Debener (2019) com modificações. A predição do
peptídeo sinal na região N-terminal foi conduzida utilizando o SignalP v.6.0
(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0) e Phobius
(https://phobius.sbc.su.se/index.html). Proteínas de membrana foram
identificadas utilizando duas ferramentas para predição de alfa-hélices,
TMHMM v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) e Phobius. Admitimos
como critério de inclusão nesta etapa as sequências que tiveram no máximo uma
α-hélice predita pelo TMHMM dentro dos primeiros 60 aa e nenhuma hélice

369
transmembrana predita pelo Phobius. As sequências de proteínas mantidas até
esta etapa foram escaneadas quanto a presença de sequência sinal de
direcionamento para retículo endoplasmático (Prosite: PS00014) usando a
ferramenta ScanProsite (http://prosite.expasy.org/). As sequências contendo
sinal de direcionamento para retículo endoplasmático foram então removidas
do conjunto de proteínas preditas como secretadas. Finalmente, as sequências
de proteína mantidas na etapa anterior foram submetidas ao PredGPI
(http://gpcr.biocomp.unibo.it/ predgpi/) visando distinguir as proteínas que se
ancoram na membrana externa e as liberadas no meio extracelular. Foram
removidas do conjunto de proteínas preditas como secretadas aquelas
classificadas pelo PredGPI como prováveis e altamente prováveis de serem
ancoradas por GPI.

BLASTp contra a PHI-base

As proteínas preditas no secretoma dos isolados CPAA-F200 e CPAA-
F307 de F. decemcellulare foram submetidas ao BLASTp contra a PHI-base
(http://www.phi-base.org), que é uma base curada composta especificamente
por genes experimentalmente demonstrados quanto ao envolvimentoem alguma
patogênese. Especificamente, foi feito o download da base dados PHI- base
4.10. A base de dados foi refinada pela aplicação de filtros visando manter
somente os acessos da base cujos hospedeiros eram plantas. Então, o BLASTp
localfoi conduzido utilizando as sequências preditas como secretadas contra a
base de dados refinada usando o pacote do R "rBLAST" v.0.99.2
(https://github.com/mhahsler/rBLAST/blob/master/README.md).

Predição de candidatos a efetores

A predição de candidatos a efetores foi conduzida com base no conjunto
de proteínas preditas como secretadas. Foram declaradas como candidatos a
efetores aquelas que atendiam a pelo menos um dos seguintes critérios:
comprimento de sequência ≤ 200 aminoácidos (aa) & conteúdo decisteína ≥ que
3%, aquelas preditas como efetores pelo EffectorP e aquelas que apresentaram
o motivo Y/W/FxC na região N-terminal. A predição quanto ao comprimento de
sequência e conteúdo de cisteína foi conduzida no pacote do R "Biostrings"
v.2.60.1 (http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Biostrings.html),

370
enquanto o escaneamento para o motivo Y/W/FxC na região N-terminal foi
realizada usando o ScanProsite (http://prosite.expasy.org/). Finalmente foi
conduzida a predição de efetores pelo EffetorP3.0 (https://effectorp.csiro.au/).
Foram também incluídas no conjunto de candidatas a efetores aquelas que
apresentaram identidade com sequências do fenótipo mutante "effector" da PHI-
base.

Anotação funcional do secretoma e candidatos a efetores pelo Gene

Ontology (GO)
A anotação do gene ontology (GO) das proteínas do secretoma predito
e dos candidatos a efetores dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F.
decemcellulare foi realizada no Blast2GO (https://www.blast2go.com/). O
heatmap com principais termos de função molecular, processo biológico e
componente celular foi plotado usando o pacote do R "pheatmap" v1.0.12
(https://CRAN.Rproject.org/package=pheatmap).

Resultados e Discussão
A predição gênica dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F.
decemcellulare resultou em 16230 e 15965 genes, respectivamente. Para
estabelecer quais dos genes preditos eram prováveis de codificar proteínas
secretadas, nós iniciamos a predição secretoma selecionando aquelas com
presença de peptídeo sinal usando oSignalP 6.0 (CPAA-F200: 1720 e CPAA-
F307: 1702), com peptídeo sinal e ausência de domínio transmembrana pelo
Phobius (CPAA-F200: 2016 e CPAA-F307: 1959) e com nenhuma ou uma hélice
transmembrana predita nos primeiros 60 aa pelo TMHMM 2.0 (CPAA-F200:
13443 e CPAA-F307: 13187) (Figura 1). As predições conjuntas pelo SignalP,
Phobius e TMHMM resultaram na filtragem de 1442 e 1441 proteínas para o
CPAA-F200 e CPAA-F307, respectivamente.

371
Figura 1. Pipeline de predição do secretoma dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F.
decemcellulare.
Os números dentro dos boxes indicam o número de proteínas preditas em cadapasso adotando a
ordem (CPAA-F200|CPAA-F307).

A predição de proteínas com a presença de sequência sinal

direcionamento para ao retículo endoplasmático (RE) pelo ScanPROSITE
identificou (CPAA-F200: 19 e CPAA-F307: 21) que foram removidas do conjunto
de proteínas preditas como secretadas, o que atualizou o número de proteínas
preditas como secretadas para 1423 e 1420 para o CPAA-F200e CPAA-F307,
respectivamente. Estas foram submetidas ao predGPI que identificou (CPAA-
F200: 107 e CPAA-F307: 104) proteínas preditas como prováveis e altamente
prováveis e de serem ancoradas por GPI que foram removidas do conjunto de
proteínas preditas como secretadas (Figura 1). O secretoma predito do CPAA-
F200 e CPAA-F307 identificou 1335 e 1316 proteínas, o que correspondeu a
aproximadamente 8,24% do total de proteína putativas do genoma dos isolados
em estudo, o que foi relativamente superior aos 6% preditos no secretoma de
Diplocarponrosae (Neu e Debener, 2019) usando pipeline similar.
O secretoma dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 foram examinados
para proteínas pequenas secretas (SSP- small secreted protein) ricas em
cisteína, característica compartilhada, por exemplo, entre os efetores Avr2, Avr4,
Avr4E, Avr9,Ecp1, Ecp2, Ecp4 e Ecp5 do patógeno do tomateiro, Cladopsorium

372
fulvum (Stergiopoulos e Wit 2009) mas não limitados a eles. Foram identificadas
(CPAA- F200: 158 e CPAA-F307:162) proteínas pequenas secretas (≤ 200 aa)
ricas em cisteína (≥ 3%). O escaneamento do secretoma para o motivo Y/F/WxC
resultou em (CPAA-F200: 129 e CPAA-F307:144) candidatos a efetores.
Somente dois candidatosa efetores do isolado CPAA-F200 contendo o motivo
Y/F/WxC apresentou também comprimento de sequência ≤ 200 aa & conteúdo
de cisteína ≥ 3%, enquanto para CPAA-F307 nenhum candidato a efetor
compartilhou essas características. Foram incluídos na lista de candidatos a
efetores (CPAA-F200: 455 e CPAA-F307:441) preditos EffectorP. O número total
de proteínas que atenderam a pelo menos um dos três critérios adotados foi
(CPAA-F200: 526 e CPAA-F307:532), enquanto o número de candidatos a
efetores preditos simultaneamente pelos três critérios adotados foi (CPAA-F200:
37 e CPAA-F307: 39). O BLASTp contra a PHI-base identificou (CPAA-F200: 11
e CPAA-F307: 5) candidatos com identidade com sequências associadas ao
fenótipo "effector", mas não atenderam a nenhum dos critérios de predição
usados e foram também adicionadas à lista final de candidatos a efetores (Figura
2), que totalizou 537 candidatos para ambos CPAA-F200 e CPAA-F307.

Figura 2. Predição in silico dos candidatos a efetores no secretoma dos isolados CPAA-
F200 (A) eCPAA-F307(B) de Fusarium decemcellulare.

Foram encontrados candidatos a efetores no secretoma dos isolados

CPAA- F200 e CPAA-F307 de F. decemcellulare contendo domínio de efetores
conhecidos, incluindo CPAA-F200: 10 e CPAA-F307: 7 com o domínio LysM

373
(PF01476) dos efetores Ecp6 de ambos Passalora fulva e Fusarium oxysporum
(Bolton et al. 2008); VdLysM, de Verticillium dahliae (Kombrink et al. 2017) e
LysM3 de Penicillium expansum (Levin et al. 2017). Ecp6 atua sequestrando
fragmentos de quitina liberados da parede celular do fungo driblando assim o
sistema de defesa do hospedeiro (Jonge et al. 2010); CPAA-F200: 4 e CPAA-
F307: 3 com o domínio Hce2(PF14856) do efetor Ecp2 de Cladopsorium fulvum
que atua na indução de necrose (Laugé et al. 1997); CPAA-F200:5 e CPAA-
F307: 3 com o domínio Lipase 3 (PF01764) do efetor FGL1 de Fusarium
graminearum (Blümke et al. 2014; Voigt et al. 2005) e do efetor AGLIP1 de
Rhizoctonia solani (Li et al. 2019). CPAA-F200 e CPAA-F307: 4 com o domínio
PAN-1 (PF00024) do efetor CBEL de Phytophthora parasitica var. nicotianae
(Mateos et al. 1997) que atua mediando interações proteína-proteína e proteína-
carboidrato (Tordai et al. 1999); CPAA-F200 e CPAA-F307: 1 com o domínio
glicosil hidrolase 10 (PF00331) do efetor AvrLm4 de Leptosphaeria maculans
(Huang et al. 2006); CPAA-F200 e CPAA-F307: 7 com o domínio glicosil
hidrolase 61 (PF03443) do efetor MoCDIP4 de Magnaporthe oryzae (Chen et al.
2013). O efetor MoCDIP4 de Magnaporthe oryzae se une ao complexo protéico
OsDjA9-OsDRP1E mitocondrial para assim inibir a resposta de defesa do arroz
(Xu et al. 2020); CPAA-F200: 2 e CPAA-F307: 5 contendo o domínio NPP1
(necrosis- inducing Phytophthora protein 1, PF05630) do efetor PaNie de
Pythium aphanidermatum que desencadeia morte celular programada (Veit et al.
2001); CPAA-F200:1 e CPAA-F307:2 com domínio da família da cerato platina
(PF07249) doefetor MgSM1 de Magnaporthe oryzae (Yang et al. 2009); e CPAA-
F200 e CPAA- F307: 2 contendo domínio melatoprotease M35 (PF02102) do
efetor AVR-Pita de Magnaporthe oryzae (Kang et al. 2001).
Encontramos também entre os candidatos a efetores, domínios
associados à patogênese em outros fungos, estes incluem: CPAA-F200: 2 e
CPAA-F307:1 com o domínio CFEM (PF05730), que tem importante papel em
fungos patogênicos como Magnaporthe oryzae (Choi 1997), Aspergillus
fumigatus (Vaknin et al. 2014), Botrytiscinerea (Zhu et al. 2017); CPAA-F200 e
CPAA-F307:4 com o domínio CyanoVirin-N (CVNH, PF08881). Foi demonstrado
que as CVNHs da planta Ceratopteris richardii e dos fungos Tuber borchii e
Neurospora crassa foram capazes de se ligar a vários carboidratos (Koharudin
et al. 2008).

374
 A análise do gene ontology usando o Blast2GO categorizou as proteínas
do secretoma predito e candidatos a efetores quanto ao envolvimento em
processo biológico (P), função molecular (F) e componente celular (C). Os
resultados foram bastante similares entre os isolados CPAA-F200 e CPAA- F307
de F. decemcellulare (Figura 3). O secretoma dos dois isolados apresentou
aproximadamente 34% de proteínas associadas a processos biológicos, 59%
associadas a função molecular e 6% associadas a componente celular (Figura
3A e C). Já entre os candidatos a efetores, aproximadamente 37-39% foram
associados aprocessos biológicos, 49-51% com função molecular e 11% com
componente celular (Figura 3B e D).

Figura 3. Frequência das categorias do gene ontology no secretoma predito (A e B) e dos

candidatosa efetores (C e D) dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F. decemcellulare.
Função molecular (F), Processo Biológico (P) e Componente Celular (C).

Na categoria função molecular, foram anotados 41 termos para ambos

CPAA-F200 e CPAA-F307, enquanto na categoria processo biológico foram
anotados 24 e 22 termos para os isolados CPAA-F200 e CPAA-F307,
respectivamente. Finalmente, nacategoria componente celular foram anotados
cinco termos para ambos CPAA-F200 e CPAA-F307. O heatmap com os
principais termos estão apresentados na Figura 4. Em função molecular, a
maioria dos candidatos a efetores estava envolvida predominantemente com
atividades hidrolíticas. Entre os candidatos a efetores foram encontradas glicosil
hidrolases contendo o motivo Y/F/WxC. glicosil hidrolases contendo o motivo
Y/F/WxC, detectadas no secretoma dos fungos Sclerotinia sclerotiorum e
Botrytis cinerea (Heard et al. 2015). Em processos biológicos, a maioria dos

375
candidatos a efetores estavam envolvidos com metabolismo de carboidratos
(incluindo enzimas degradadoras da parede celular vegetal) e proteólise. Em
componente celular, a maioria dos candidatos a efetores estava envolvida em
região extracelular.

Figura 4. Principais funções do gene ontology para as categorias Função Molecular (F), Processo
Biológico (P) e Componente Celular (C) entre os candidatos a efetores dos isolados CPAA-F200
e CPAA-F307 de F. decemcellulare. Foram listados os termos mais frequentes de cada domínio.

Conclusões
O secretoma predito dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F.
decemcellulare resultou em 1335 e 1316 proteínas putativas. O total de 537
proteínasputativas do secretoma dos isolados CPAA-F200 e CPAA-F307 de F.
decemcellulare foram declarados candidatos a efetores por possuírem
características compartilhadas por efetores conhecidos, que direcionarão a
continuidade do estudo acerca dos seus envolvimentos na patogênese deste
importante patógeno do guaranazeiro.

376
 Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas pelo suporte financeiro ao estudo (Edital Nº 002/2021 - Amazônidas)
e pela concessão de bolsa AT-I para a primeira autora, e ao Conselho Nacional
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad
AmazonMicro.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Predição in silico de efetores do patógeno foliar do

guaranazeiro Neopestalotiopsis formicidarum (Maharachch.,
K.D. Hyde & Crous, 2014)

Pereira, Virgínia Maria da Silva1; Zerlotini Neto, Adhemar2; Silva, Gilvan Ferreira3;
Caniato, Fernanda Fatima1

1Universidade Federal do Amazonas, 2Embrapa Informática Agropecuária, 3Embrapa

Amazônia Ocidental
E-mail: [email protected]

Resumo
A cultura do guaraná é de grande importância para a socioeconômica do
Amazonas. Entretanto, o guaranazeiro não tem alcançado o seu potencial
produtivo no Amazonasdevido, entre outros, doenças fúngicas. Não obstante as
doenças fúngicas já conhecidas, dois fungos do grupo dos pestalotióides foram
identificados como agentes causais de doença no guaranazeiro:
Pseudopestalotiopsis gilvanii e Neopestalotiopsis formicidarum que causam
lesões foliares necróticas que progridem para queda da folha. Diante da
disponibilidade do rascunho do genoma do N.formicidarum torna-se possível o
seu escaneamento em busca de fatores relacionados à sua patogenicidade e
alvos de controle. Análises de bioinformática foram realizadas visando a
identificação de candidatas a efetores no secretoma do N. formicidarum
(CMIAINPA2917). A predição do secretoma foi iniciada pelo escaneamento das
14941 proteínas putativa do genoma do CMIAINPA2917 para detecção do
peptídeo sinal usando ambos SignalP6.0 e Phobius, associada à ausência de
domínio transmembrana conduzida pelo Phobius e TMHMM2.0, que resultou em
1270 proteínas preditas. Foram removidas 14 proteínas com motivos
direcionados ao retículo endoplasmático e 122 proteínas com probabilidade de
possuírem âncora GPI, o que resultou em 1148 proteínas preditas como
secretadas. Do secretoma predito de N. formicidarum, 423 proteínas foram
declaradas candidatas a efetores por possuírem características comuns a
efetores, como: comprimento de sequência (≤200 aa) & conteúdo de cisteína ≥
3% e presença do motivo YWF-x-C. As informações obtidas gerou uma lista de
candidatas a efetores que podem direcionar as etapas seguintes do estudo
acerca dos seus envolvimentos na patogênese do N. formicidarum. Serão
avaliadas quanto a expressão gênica diferencial visando compor a lista com as
candidatas a efetores mais prováveis para seguir para a etapa de validação
gênica.

Palavras-Chave: Paullinia cupana var. sorbilis; interação planta-patógeno;

necrose foliar.

380
 Introdução
A cultura do guaraná Paullinia cupana var. sorbilis (Mart.) Ducke
(Sapindaceae) destaca-se entre as mais importantes para socioeconômica do
estado do Amazonas (Schimpl et al. 2013). Até o ano agrícola de 1988, o estado
do Amazonas ocupou a posição de maior produtor de guaraná do Brasil, e desde
então tem ocupado a segunda posição no ranking dos estados produtores de
guaraná. Na safra de 2019, o estado do Amazonas respondeu por 31,1% da
produção nacional. A produtividade na referida safra de 2019 foi de 218 Kg/ha,
ficando abaixo da média nacional que foi 274Kg/ha (IBGE 2021). O potencial
produtivo não tem sido alcançado no estado devido às limitações causadas,
entre outros, por fatores bióticos e abióticos. Um dos principais fatores bióticos
enfrentados pela cultura do guaranazeiro no estado do Amazonas são as
doenças fúngicas, que aqui encontraram condições favoráveis para o seu
desenvolvimento como altas temperaturas e umidade (Fisch 1990).
Entre as doenças fúngicas que causam perdas à cultura do guaraná
destacamos as já conhecidas antracnose causada por Colletotrichum
guaranicola e superbrotamento causado por Fusarium decemcellulare.
Recentemente, outros dois fungos: Pseudopestalotiopsis gilvanii e
Neopestalotiopsis formicidarum foram identificados como causadores de doença
no guaranazeiro. Os sintomas foliares apresentados pelo guaranazeiro são
similares ao da antracnose, com lesões amarronzadas que começam a se
manifestar dois dias após inoculação, evoluindo para a completa necrose do
tecido foliar inoculado e desfolha. Além de serem patogênicos para o
guaranazeiro, P. gilvanii e N. formicidarum, tambem causam doença em outras
espécies tropicais de importância econômica, causado grandes danos no açaí
(Euterpe oleracea e Euterpe precatoria), dendê (Elaeis guineenses), seringueira
(Hevea brasiliensis) e banana (Musa paradisiaca var. pacovan). No entanto, para
as cinco espécies de plantas testadas, P. gilvanii não foi patogênico para
seringueira e banana, enquanto N. formicidarum não foi patogênico somente
para seringueira (Gualberto et al. 2021). Espécies dos gêneros Pestalotiopsis,
Neopestalotiopsis e Pseusopestalotiopsis tem se destacado nos últimos anos
como sendo um novo grupo de fungos fitopatogênicos que ameaçam diversas
culturas ao redor do mundo (Ismail et al. 2013; Ren et al. 2013; Lazarotto et al.
2014; Chen et al. 2018; Belisário et al. 2020).

381
 Diante destas novas ameaças ao cultivo do guaranazeiro, torna-se
necessárioelucidar os mecanismos moleculares relacionados à patogenicidade
destes fungos, bem como identificar alvos de controle. Visando a identificação
destes fatores, o sequenciamento do genoma completo do isolado de N.
formicidarum (CMIA, INPA2917) fez-se necessário para a predição in silico do
secretoma e candidatas a efetores deste importante patógeno do guaranazeiro.
O objetivo desta pesquisa foi realizar a predição in silico do secretoma e
candidatas a efetores do novo patógeno foliar do guaranazeiro, o N.
formicidarum.

Material e Métodos
O isolado (CMIAINPA2917) do N. formicidarum pertencente a coleção de
microrganismos da Embrapa Amazônia Ocidental (SISGEN Nº AB6B14F) teve
seu genoma completo sequenciado na plataforma Illumina Hiseq com reads pair-
end (2 x150 pb).
Após a montagem do genoma, a estimativa do número de genes
codificadoresde proteínas no genoma de N. formicidarum (CMIAINPA2917) foi
obtida usando o software Funannotate
(https://funannotate.readthedocs.io/en/latest/index.html).
A predição de proteínas candidatas a efetores foi conduzida no secretoma
predito do isolado (CMIAINPA 2917). Para a predição do secretoma do isolado
INPA2917 foi adotado o pipeline descrito por Neu e Debener (2019) com
modificações. Para tanto, as proteínas putativas do isolado CMIAINPA2917
foram escaneadas quanto a presença de peptídeo sinal na região N-terminal
usando o SignalP v.6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-
6.0) e Phobius(phobius.sbc.su.se/data.html), sendo mantidas as sequências de
proteínas com peptídeo sinal predito na região N-terminal por ambas ferramentas.
Na etapa seguinte,as sequências de proteínas foram submetidas à predição de
hélice transmembrana pelo TMHMM v.2.0
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) e domínio transmembrana pelo
Phobius. Foram mantidas nesta etapa as proteínas escaneadas pelo TMHMM
com no máximo uma hélice predita dentro dos primeiros 60 aa e ausência de
domínio transmembrana pelo Phobius "Phobius-noTM". Para excluir sequências
que têm como endereço o retículo endoplasmático, todas as proteínas preditas

382
nos passos anteriores foram escaneadas para sequências sinal de
direcionamento para o retículo endoplasmático, PS00014 usando o
ScanProsite (http://prosite.expasy.org/). Foi realizada a predição de âncora GPI
entre as proteínas mantidas até a etapa anterior, usando o PredGPI
(http://gpcr.biocomp.unibo.it/predgpi/) visando separar as proteínas
extracelulares daquelas ancoradas na membrana externa. As proteínas
ancoradas na membrana externa utilizam da ligação de uma unidade Glicosil
Fosfatidil Inusitol (GPI) à região C-terminal, o que permite que toda a proteína,
exceto a âncora, localizada no espaço extracelular. A predição realizada pelo
PredGPI classifica as proteínas de acordo com presença de âncora GPI em
"Highly probable", "Probable", "Weakly probable" e "Not GPI-anchored". As
proteínas preditas como "Highly probable" e "Probable" de conterem a âncora
GPI foram removidas do conjunto de proteínas preditas como secretadas.
A predição das proteínas candidatas a efetores foi conduzida no
secretoma predito do isolado (CMIAINPA2917). Foram declaradas como
candidatas a efetores aquelasque atendiam pelo menos a uma das seguintes
características compartilhadas entre efetores conhecidos como comprimento de
sequência ≤ 200 aminoácidos & conteúdode cisteína ≥ que 3% e presença do
motivo YWF-x-C na região N-terminal. Foram incluídas aquelas preditas como
efetores pelo EffectorP. A predição quanto ao comprimento de sequência e
conteúdo de cisteína foi conduzida no pacote do R
"Biostrings"v.2.60.1(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Biostrin
gs.html). A predição de efetores pelo EffectorP foi conduzida no EffetorP3.0
(https://effectorp.csiro.au/) e o escaneamento para o motivo YWF-x-C foi
realizado no ScanProsite (http://prosite.expasy.org/).

Resultados e Discussão
Foram preditos 14.941 genes codificadores de proteínas no rascunho do
genoma do isolado de N. formicidarum (CMIAINPA2917) que após a tradução in
silico foram usados na predição secretoma. Inicialmente foram selecionadas
aquelas com presença de peptídeo sinal na região N-terminal pelo SignalP 6.0
(1461 proteínas), e aquelas com peptídeo sinal e ausência de domínio
transmembrana pela predição do Phobius (1829 proteínas), e aquelas com
nenhuma ou uma hélice transmembrana predita dentro dos primeiros 60 aa pelo

383
TMHMM 2.0 (11998 proteínas). Combinados, SignalP, Phobius e TMHMM
totalizaram 1270 proteínas preditas como secretadas,que foram mantidas para
as etapas seguintes da predição do secretoma (Figura 1).

Figura 1. Pipeline adotado para predição do secretoma de N. formicidarum (CMIAINPA2917).

As proteínas mantidas nas etapas anteriores foram submetidas ao

escaneamento para motivos de direcionamento ao retículo endoplasmático no
ScanProsite, o que possibilitou identificar quatorze proteínas contendo os
seguintes motivos (AQEL:1, HNEL:1, HDEL:3, RDEL:4, KDEL:5), que foram
removidas do conjunto de proteínas preditas como secretadas.
O PredGPI foi usado para predição de proteínas ancoradas por GPI e
assim distinguir entre as proteínas secretadas daquelas que se ancoram na
membrana externa. Foram preditas 122 proteínas como altamente prováveis e
prováveis de conterem uma âncora GPI, sendo excluídas das análises
posteriores, restando 1148 proteínas que foram classificadas com uma baixa
probabilidade ou nenhuma probabilidade de conter uma âncora GPI.
Todas as 1.148 proteínas do secretoma predito de N. formicidarum (CMIA
INPA2917) foram submetidas à predição de candidatas a efetores. Destas, 356
foram preditas como candidatas a efetores pelo EffectorP, 105 foram

384
identificadas com o motivo YWF-x-C nos primeiros 80 aa da região N-terminal e
91 foram identificadas com comprimento de sequência (≤200 aa) & conteúdo de
cisteína ≥ 3%.Vinte e uma proteínas candidatas a efetores atenderam aos três
critérios estabelecidos; 26 proteínas foram preditos simultaneamente pelo motivo
YWF-x-C e EffectorP; 61 foram preditos simultaneamente pelo EffectorP e
comprimento desequência (≤200 aa) & conteúdo de cisteína (≥ 3%). Nenhuma
proteína candidata a efetor compartilhou exclusivamente os dois critérios:
presença motivo YWF-x-C e comprimento de sequência (≤200 aa) & conteúdo
de cisteína (≥ 3%). As demais 725 não atenderam a nenhum dos critérios
estabelecidos e foram excluídas da lista de candidatas a efetores (Figura 2).

Figura 2. Predição in silico das proteínas candidatas a efetores do secretoma do fungo patogênico
N.formicidarum.

Domínio PFAM presentes em efetores já caracterizados foram

encontrados em 30 proteínas de N. formicidarum. Estas incluem três proteínas
contendo o domínio LysM (PF01476) dos efetores Ecp6 de ambos Passalora
fulva e Fusarium oxysporum (Bolton et al. 2008); VdLysM, de Verticillium dahliae
(Kombrink et al. 2017) e LysM3 de Penicillium expansum (Levin et al. 2017). Sete
candidatas apresentam o domínio Hce2 (PF14856) do efetor Ecp2 originalmente

385
descrito em Passalora fulva (Lauge et al. 1998) com atuação putativa na indução
de necrose (Stergiopoulos et al. 2010). O domínio Lipase 3 (PF01764) do efetor
FGL1 de Fusarium graminearum e do efetor AGLIP1 de Rhizoctonia solani foi
localizado em cinco proteína (Voigt et al. 2005; Blümke et al. 2014; Li et al. 2019).
Uma candidata a efetor contendo o motivo GH12 (glicosil hidrolase da família 12,
PF01670) do efetor PsXEG1 de Phytophthora sojae (Ma et al. 2017). Na
interação P. sojae - soja, a soja em sua defesa produz uma proteína inibidora de
glucanase, a GmGIP1, que se liga à PsXEG1 produzido pelo P. sojae visando
bloquear sua virulência. Entretanto, o contra-golpe de P. sojae é a produção de
PsXLP1, que é um análogo de PsXEG1 que perdeu a atividade enzimática, que
atua driblando o sistema de defesa da soja se ligando com mais eficiência em
GmGIP1 (Ma et al. 2017). Neste estudo, quatorze proteínas apresentam o
domínio AA9 (PF03443) do efetor MoCDIP4 de Magnaporthe oryzae (Chen et al.
2013), que induz morte celular em arroz, facilitando a sua colonização.
Entre as candidatas a efetores foram também identificadas proteínas
contendodomínio PFAM conservados de conhecidos fatores de virulência: duas
cerato ulmina (PF06766), que são hidrofobinas (HPs) com possível envolvimento
em diversos processos, como formação de estruturas aéreas de fungos, fixação
em superfícies hidrofóbicas, interação com o meio ambiente e proteção contra o
sistema de defesa do hospedeiro. Em Fusarium graminearum, os mutantes
deletados FgHyd2 eFgHyd3 e o mutante triplo FgHyd234 sofreram uma redução
na capacidade das hifasde penetrar através da interface água e ar e se anexar a
superfícies hidrofóbicas, como as de tecido das espigas de trigo (Quarantin et al.
2019). Duas candidatas a efetorescontendo o domínio CFEM (PF05730), que
possui oito resíduos de cisteína na região N-terminal. Em Botrytis cinerea, o
mutante deletado de BcCFEM1 afetou a virulência, a produção de conídios e a
tolerância a estresse, mas não a germinação conidial (Zhu et al. 2017), os
mutantes deletados ΔCFEM-Bcin07g03260 inoculados em tomate apresentaram
uma significante redução e progressão da lesão necrótica (Arya et al. 2020), mas
diferentemente do mutante BcCFEM1, o ΔCFEM-Bcin07g03260 que
apresentaram significante redução da germinação conidial. Duas candidatas a
efetores com domínio de reconhecimento de quitina (PF00187), que são comuns
em fitopatógenos, cujo papel seria conferir proteção celular do fungo de
quitinases produzidas por plantas hospedeiras (Van Den Burg et al. 2006). Três

386
proteínas foramidentificadas com o domínio Cyanovirin-N (PF08881) que atuam
sequestrando fragmentos de quitinas liberadas pela quitinases produzidas pela
planta e camuflando assim a detecção do patógeno pela planta, facilitando
assim a sua invasão. Candidatas a efetores contendo o motivo Cyanovirin-
N foram identificados em Colletotrichum lentis (Bhadauria et al. 2017).

Conclusões
A predição in silico do secretoma de N. formicidarum (CMIAINPA2917)
resultou em 1148 proteínas putativas.
A análise in silico de candidatas a efetores do isolado e N. Formicidarum
(CMIAINPA2917) indica 423 candidatas a efetores, selecionadas por possuírem
características comuns a efetores conhecidos. Todavia, estudo de expressão e
validação gênica serão ainda necessários para avaliação do real envolvimento
das candidatas a efetores selecionadas na patogênese de N. formicidarum no
guaranazeiro

Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas pelo suporte financeiro ao estudo (Edital Nº 008/2021 - PROSPAM) e
pelaconcessão de bolsa AT-I para a primeira autora. Ao Conselho Nacional de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Produção de biossurfactantes por Trichoderma spp. obtidos de

solos da Amazônia

Menezes, Nadionara Costa1; Rodrigues, Suziane Pinto2; Oliveira, Luiz Antonio

de1

1InstitutoNacional de Pesquisas da Amazônia. 2 Universidade do Estado do Amazonas

Email: [email protected]

Resumo
Os fungos do gênero Trichoderma fazem parte da população microbiana do solo,
raramente são patogênicos a animais e plantas. Pesquisas demonstraram sua
habilidade no processo de biorremediação de solos contaminados e produção
de emulsificantes. Assim, este estudo tem como objetivo avaliar o potencial de
produção de biossurfactantes pelos Trichoderma spp., tendo o petróleo como
única fonte de carbono. Foram avaliadas dez cepas fungícas quanto a produção
de biossurfactantes por meio da avaliação da atividade de emulsificação em
petróleo. Todos os 10 Trichodermas apresentaram valores de índices de
emulsificação satisfatórios no meio de cultivo, sendo no meio INPA de 28,37%
e, no meio BH de 18,38%, bem como não houveram alterações expressivas nas
medidas de pHs em ambos os meios de cultura. Deste modo, os testes
realizados sugerem que os Trichoderma spp. podem ser utilizados para a
produção de biossurfactantes, sendo necessários mais estudos, a fim de obter
microrganismos alta capacidade para atuar na biorremediação de ambientes
contaminados.

Palavras-Chave: Biorremediação; Emulsificantes; Petróleo

Introdução
O emprego de microrganismos na remediação de ambientes impactados
requer mecanismos para estimular e desenvolver a atividade microbiana na
degradação de compostos de petróleo (Savage et al. 2010; Cruz e Marsaioli,
2012; Cáuper et al. 2021). O aumento significativo da degradação dos
hidrocarbonetos presentes no meio também pode ser influenciado pela produção
de biossurfactantes. Estes por sua vez, são compostos de origem microbiana
que apresentam propriedades surfactantes, atuando na diminuição da tensão
superficial e possuindo alta capacidade emulsificante, podendo realizar misturas
de hidrocarbonetos em água (Cáuper et al. 2018). Identificar essa população
microbiana é o primeiro passo para desenvolver técnicas de descontaminação

390
dos solos regionais e ecossistemas terrestres da Amazônia, caso ocorra
derramamentos de petróleo ou seus derivados.
Dentre esses microrganismos, estão os fungos do gênero Trichoderma
que além da alta capacidade adaptativa em colonizar solos ácidos utilizando
diferentes fontes de carbono e nitrogênio, secretam diversas enzimas de
interesse biotecnológico. Diferentes trabalhos têm demonstrado a eficiência
deste gênero como potencial degradador e mineralizador de hidrocarbonetos do
petróleo (Delabona 2015). Assim, a utilização desses fungos pertencentes ao
gênero Trichoderma pode tornar-se uma alternativa viável e segura para a
biorremediação de solos contaminados, uma vez que raramente são
patogênicos às plantas e/ou animais, inclusive ao homem, sintetizam enzimas
com elevado potencial biotecnológico (Mukherjee et al. 2013; da Silva Patekoski
e Pires-Zottarelli 2016), e ainda, são fundamentais no manejo agrícola
sustentável na Amazônia. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de
produção de biossurfactantes pelos fungos Trichoderma spp. tendo o petróleo
como única fonte de carbono.

Material e Métodos
Produção de biossurfactantes
Para realização dos experimentos foram utilizados 10 isolados de
Trichoderma da Coleção de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural
(CMIAINPA), selecionados como bons degradadores após ensaios com
hidrocarbonetos derivados de petróleo (nafta, gasolina, querosene, óleo diesel e
óleo lubrificante). Para início dos testes, os fungos foram plaqueados em meio
BDA (caldo de 200 g.L-1 de batata, 18 g.L-1 de dextrose e 18 g.L-1 de ágar) e após
seu crescimento transferidos para tubos de ensaio contendo caldo nutriente (BD)
e incubados por 24h a 28 ± 2 ºC em pH 7,0.
Posteriormente, foi realizada a suspensão de células de cada cepa e
padronizadas em Câmara de Neubauer a 1x105 esporos/mL-1, sendo então
transferidos para frascos do tipo Erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL de
meio mineral INPA (MgSO4.7H2O (0,4 g.L-1), Ca(CH3COO-)2.H2O (0,02 g.L-1),
KH2PO4 (1,5 g.L-1), K2HPO4 (0,5 g.L-1), (NH4)2SO4.7H2O (2,5 g.L-1), FeCl3.6H2O
(0,05 g.L-1), FeSO4.7H2O (0,05 g.L-1), ZnSO4.7H2O (0,01 g.L-1), CuSO4.5H2O
(0,01 g.L-1), MnSO4.7H2O (0,01 g.L-1), Na4SeO3 (0,01 g.L-1) e ágar (15g.L-1))

391
(Moura e Oliveira, 2017) ou meio Bushnell Haas - BH - Bushnell Haas (0,2 g.L-1
de MgSO4, 0,02 g.L-1 de CaCl2, 1,0 g.L-1 de KH2PO4, 1,0 g.L-1 de K2HPO4, 1,0
g.L-1 de NH4NO3, 0,05 g.L-1 de FeCl3), pH 7,0, acrescido de 1,0 mL de petróleo
de Urucu; os controles foram frascos contendo os meios de cultura líquido com
petróleo sem a presença dos fungos. Os Erlenmeyers foram incubados a 28 ± 2
ºC em agitador orbital (SOLAB Cientifica) a 150 rpm por cinco dias. A produção
de biossurfactantes foi avaliada frente as determinações das atividades
emulsificantes.

Determinação da atividade emulsificante

A atividade emulsificante foi avaliada a partir do índice de emulsificação
para cada isolado e meio mineral, realizada em triplicata. Em tubos de ensaio
adicionou-se 3,5 mL do extrato bruto de cada isolados de Trichoderma
juntamente com 3,5 mL de petróleo de Urucu, misturando-os em agitador Vórtex
a 700 rpm por 2 min. e conservados em repouso.
A leitura do índice de emulsificação foi realizada após 24h com
paquímetro digital, a partir da altura da camada de emulsão (CE) formada e da
altura total (altura da emulsão mais altura da camada remanescente do óleo), de
acordo com a Equação: IE % = (CE x 100) / hemulsão. Onde: IE% = índice de
emulsificação; CE = camada da emulsão; hemulsão = altura total da emulsão mais
óleo. E para constatar a estabilidade da emulsão formada, às 48h, seguindo
métodos adaptados de Martins et al. (2006).
Todas as leituras foram realizadas subtraindo o valor do branco pelo da
amostra, obtendo assim, atividade emulsificante. E os pHs da fase aquosa de
cada amostra foi medido às 24h e 48h para verificar se houve interferência neste
parâmetro químico. De forma a elucidar o processo de avaliação da atividade de
emulsificação, a Figura 1 apresenta uma representação esquemática detalhada.

Análise dos dados

Os dados experimentais foram analisados estatisticamente usando o
programa IBM SPSS Statistics, versão 27.0.1, para Windows. Para isso, os
dados foram submetidos a um teste de homogeneidade de variância mediante a
prova de Levene, depois de comprovar a normalidade com a prova de Shapiro-
Wilk. Foi utilizada a análise de variância (ANOVA) com os dados e, quando o

392
teste F foi significativo, procedeu-se uma análise de comparação de médias pelo
teste Tukey a 5%.

Figura 1. Representação esquemática do teste de atividade emulsificante.

Resultados e Discussão
Ao analisar índice de emulsificação exposto na Figura 2, pode-se observar
que no meio mineral INPA as emulsões se mantiveram estáveis para todas os
extratos durante o período avaliado. Em 24h de incubação o maior IE% foi
apresentado pela cepa INPA F29 (IE = 13,77) e o menor por INPA F25 (IE =3,01).
Após 48h, os extratos obtidos de Trichoderma CMIAINPA F28 (IE = 28,37) e
INPA F33 (IE = 27,96) apresentaram os maiores índices, enquanto que a
linhagem do Trichoderma CMIAINPA F25 apresentou a menor produção
(IE=14,85).
Por outro lado, no meio mineral BH apenas cinco tratamentos
apresentaram estabilidade durante o período de avaliação, são eles: CMIA F23,
F25, F31, F36 e F38, sendo que em 24h , o isolado CMIA F08 apresentou o
maior índice (IE=18,38) e em 48h, a cepa CMIA F38 apresentou IE = 16,54.
Ao comparar a atividade de emulsificação considerando-se os meios
nutritivos testados, observa-se que no meio INPA houve uma maior produção de
biossurfactantes pelos Trichoderma. Essa diferença entre os meios de cultura foi
demonstrada ao conferir qual dos dois meios formou camadas mais espessas e
estabilidade de emulsificantes do tipo água em óleo de 24h para 48h.

393
 Para Rahman e Gakpe (2008), os biossurfactates têm a capacidade de
emulsificar e solubilizar hidrocarbonetos, aumentando sua biodisponibilidade
para os microrganismos, o que potencializa sua taxa de biodegradação.

Figura 2. Índice de Emulsificação (IE) das cepas de Trichoderma spp. na presença de

petróleo nos meios minerais INPA e BH, após 24h e 48h de incubação.

Os resultados obtidos neste estudo, podem ser considerados altos

quando comparados com alguns outros presentes na literatura. Caúper (2018)
ao testar a produção de biosssurfactantes por Trichoderma spp. nos meios de
cultura BH e INPA, em 48h alcançou índices de emulsificações de 23,42% em
meio BH e 23,94% em INPA.
Com base nos resultados apresentados na Tabela 1, os extratos brutos
não apresentaram alterações expressivas nas medidas de pH. Após 24h de
incubação, ao utilizar o meio INPA o pH variou entre 5,70 e 6,00 e no meio BH
de 7,10 a 7,43. Às 48h a variação de pH no meio INPA manteve-se entre 5,70 e
6,00 e em BH de 7,17 a 7,53.
A faixa de pH está diretamente relacionada a tensão superficial
desempenhada pelo biossurfactante sobre o contaminante, visto que uma
variação de pH significativa ocasionaria precipitação do biossurfactante e a
elevação na tensão superficial (Adams et al. 2015). Assim, o pH ideal para
remediação microbiana está próximo a neutralidade, ou seja, 6,5 a 7,5 e o pH
ótimo levemente alcalino, sendo um pouco maior que 7,00.

394
 Os resultados obtidos neste estudo indicam que os fungos Trichoderma
têm potenciais para produção de biossurfactantes. Contudo, são necessários
testes adicionais para confirmar a possibilidade do uso desses isolados para o
uso em remediação de ambientes contaminados.

Tabela 1. pH nos meios de cultura INPA e BH acrescido de petróleo.

Obs.: Letras diferentes indicam diferenças significativas pelo teste de Tukey a 5 %;

minúsculas nas colunas para comparar os valores dentro de cada tratamento e maiúsculas
nas linhas para comparar os meios. * pH inicial (0h) da fase aquosa foi igual a 7,0.

Conclusões
Os resultados indicam que fungos Trichoderma spp. testados podem ser
utilizados na produção de biossurfactantes com estabilidade de pH e de
emulsificação; As maiores atividades emulsificantes foram dos extratos obtidos
dos Trichoderma CMIA INPA F28 (IE = 28,37) e INPA F33 (IE = 27,96) em meio
de cultura INPA e INPA F38 (IE=16,54) em meio BH, após 48h de avaliação. A
maior produção de biossurfactantes foi obtida no meio mineral INPA ao se utilizar
o petróleo como fonte de carbono.

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396
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Produção de peptídeos da classe dos peptaibols por

Trichoderma amazonicum

Castro, Gleucinei dos Santos1; Silva, Gilvan Ferreira da2; Koolen, Hector
Henrique Ferreira3

1Universidade do Estado do Amazonas, 2Embrapa Amazônia Ocidental. 3Universidade

do Estado do Amazonas.
Email: [email protected]

Resumo
Fungos pertencem a um grupo de microrganismos que produz vários produtos
naturais biologicamente ativos. As espécies do gênero Trichoderma possuem
potencial para produzir moléculas da classe dos antibióticos denominados
peptaibols. Esses microrganismos são capazes de produzir essas biomoléculas
com extensa diversidade de sequências. Sua singularidade reside em ter
aminoácidos não canônicos, como o ácido α-aminoisobutírico (Aib) e Isovaline
(Iva). A atividade antimicrobiana e antifúngica desses peptídeos é atribuída à
indução de canais iônicos na bicamada lipídica dos organismos-alvo. Os
peptídeos fúngicos são explorados por suas aplicações biotecnológicas na
medicina humana e na proteção de plantas. Tendo em vista o potencial
biotecnológico desses organismos e a diversidade de espécies com importância
química, este estudo visou a caracterização química de peptaibols produzidos
por um fungo amazônico. Neste estudo, o sequenciamento de peptaibols de 11
resíduo produzidos por Trichoderma amazonicum foi realizado por meio de
cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem de alta
resolução (LC-MS/MS). O estudo foi conduzido com T. amazonicum, isolado do
fruto do açaí-do-amazonas (Euterpe precatoria). Evidenciou-se, o potencial
químico da espécie, e possibilitou a biossíntese de moléculas potencialmente
novas.

Palavras-chave: Espectrometria de massas, Peptídeos não ribossomais,

Fungos amazônicos

Introdução
Fungos endofíticos podem ser definidos, de maneira geral, como aqueles
que em determinado período de sua vida, colonizam seus hospedeiros (plantas)
sem causar sintomas visíveis de doenças (Pamphile et al. 2017; Rana et al.
2019). Esses microrganismos adentram nos tecidos vegetais por diversas
fissuras naturais, como estômatos ou ferimentos nos tecidos (Peixoto et al.
2004).

397
 Dentre os fungos mais frequentemente encontrados como endofíticos,
destacam-se as espécies do gênero Trichoderma que ocorrem em diferentes
ecossistemas, colonizando vários substratos, como solo e madeira em
decomposição(Samuels et al. 2006; Zhang et al. 2007; Druzhinina et al. 2011;
Druzhinina et al. 2012; Chaverri e Samuels 2013). Além disso, certas espécies
são conhecidas como endofíticas de insetos e patógenos facultativos de
humanos, demonstrando uma alta adaptabilidade a vários nichos ecológicos
(Ruano-Rosa et al. 2016). A habilidade desobreviver a diversos ambientes facilita
a presença desse fungo em várias regiões do planeta, devido aos seus
mecanismos físico-químico na produção de enzimas e antibióticos permitindo
eficiente utilização do substrato (Almeida et al. 2007; Jaklitsch 2009; Atanasova
et al. 2013).
Espécies de Trichoderma são relatadas como predadores de
fitopatógenos e seu processo de biocontrole envolve diferentes mecanismos ou
uma combinação destes, como produção de antibióticos, micoparasitismo e
competição por nutrientes (Mukherjee et al. 2013; Sood et al. 2020; Poveda et
al. 2021; Ali et al. 2022). Um dos mecanismos de biocontrole utilizado pelos
Trichoderma é a produção de peptídeos conhecidos como peptaibols, que agem
na bicamada lipídica e bactérias efungos (Chávez et al. 2017; Ramada et al.
2018). Os peptídeos não ribossomais (NRPs) consistem em um grande grupo de
metabólitos secundários que são biossíntetizados por mega enzimas
multimodulares, conhecidas como peptídeos sintetases não ribossômicas
(NRPSs) (Daniel e Rodrigues Filho 2007).
Tendo em vista o crescente interesse nesta classe de moléculas
promissoras,bem como o potencial de Trichoderma em produzí-las, este estudo
objetivou a caracterização do perfil químico peptaibols produzidos por T.
amazonicum MMSRG 38A, uma espécie pouco estudada sobre seu potencial
biotecnológico.

Material e Métodos
O isolamento do fungo MMSRG38A foi realizado mediante metodologia
previamente descrita (Souza et al. 2004), de Euterpe precatoria e armazenados
na micoteca do grupo de pesquisa em metabolômica e espectrometria de
massas MMSRG.

398
 A extração de DNA seguiu o método CTAB (Doyle e Doyle 1987) usando
micélio cultivado em BDA por 3 dias a 28 °C em 125 rpm. As reações em cadeia
da polimerase (PCR) foram utilizadas para amplificação da região do espaçador
interno transcrito (ITS) e sequências parciais dos genes elongation factor 1-α (tef-
1α) foram preparadas utilizando o kit Easytaq (Synapse Biotechnology) com dois
pares de primers: ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATG) (White et al. 1990), e iniciadores EF-1αF
(ATGGGTAAGGARGACAAGAC) e EF-1αR (GGARGTACCAGTSATCATGTT);
(O'donnell et al. 1998). A condição de PCR para amplificação de todos os loci foi:
desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, 35 ciclosde desnaturação a 95 °C por
45 segundos, temperatura de hibridização a 57 °C por 45 segundos, extensão a
72 °C por 1 min, extensão final a 72 °C por 5 min. Os produtos de PCR foram
submetidos a eletroforese em gel de agarose (1,5%) para confirmação do
comprimento do amplicon usando o marcador de 1kb (Invitrogen). A sequência
consenso para cada locus foi obtida com base no sequenciamento das fitas
forward (F) e reverse (R) utilizando-se o programa MEGA 7. O alinhamento das
sequências obtidas foi realizado utilizando-se a ferramenta nucleotide BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
O isolado T. amazonicum (MMSRG 38A) foi inoculado em frascos do tipo
Erlenmeyers contendo 20 g de arroz parboilizado autoclavado. Incubado por um
período de 14 dias à temperatura ambiente (25 ºC). O material fúngico foi extraído
pormaceração a frio diretamente com acetato de etila (AcOEt) durante a noite,
obtendo- se o respectivo extrato (Fotso et al. 2018).
As análises LC-MS/MS foram realizadas com um cromatógrafo de sistema
de cromatografia líquida Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 acoplado a um
espectrômetro de massa de alta resolução Thermo Scientific TM Q Exactive TM
Plus(Waltham, MA, EUA). As análises de cromatografia líquida foram realizadas
usando um Ascentis C18 Coluna expressa (100 × 4,6 mm; 2,7 µm) (com uma
coluna de proteção) (Supelco, Bellefonte, PA, EUA) com formato de amônio
(0,1% p/v) (fase móvel A): acetonitrila/ácido fórmico (0,1% p /v) (fase móvel B) a
uma taxa de fluxo de0,5 mL/min no modo de eluição gradiente da seguinte forma:
B -15% (0-1 min); B 15-95% (1-16 min); B 95% (16-21 min); B 95-15% (21-22
min) e B 15% (22-30 min). A temperatura do forno foi mantida a 40 °C. Os
parâmetros de ionização da fonte foram: tensão de spray 3,9 kV; temperatura

399
capilar 300 °C; Nível S-Lens 50, gás de bainha 50, gás auxiliar 15. As amostras
foram analisadas na faixa de massa de varredura dem/z 150 a 1000 na resolução
de 35000 (varredura completa positiva e negativa) seguido por MS2 dependente
de dados (experimentos ddMS2 Top3) usando uma resolução de 17500 e
energia de colisão normalizada (NCE) escalonada em 35-50%.

Resultados e Discussão
A identificação molecular preliminar com base na região, do fator de
alongamento da tradução tef1-α, localizou o isolado MMSRG 38A no clados
harzianum, resultando na identificação do isolado MMSRG 38A como sendo a
espécie T. amazonicum (Fig. 1). A literatura mostra que essa espécie é uma
eximia produtora de enzimas como quitinase (Tameswari 2016) além de
promover crescimento de plantas (Matarusu 2022).

Figura 1. Árvore filogenética do marcador tef1-α gerada pela análise Neighbor joining. O isolado
MMSRG 38A obtidos neste estudo está destacado com um quadrado vermelho.

As altas m/z observadas em diversos picos do cromatograma de íons

totais de T. amazonicum (MMSRG 38A) indicou que esta espécie nas condições
avaliadas foi capaz de produzir compostos da classe dos peptídeos (Fig. 2). Os
compostos eluindo nos referidos tempos apresentaram m/z 1175,7764,
1189,7917, 1220,8339 e 1262,8805 respectivamente. A busca na literatura
pelas duas últimas substâncias fúngicas com as mesmas m/z não apresentou
resultados consistentes, o que nos levaa supor que se trata de novas moléculas.

400
A interpretação manual dos espectros de íons produtos indicou mistura complexa
de NRPs da classe dos peptaibols. Alguns dos picos que possuem relação com

peptaibols apresentaram moléculas protonadas[M+H]+.

Figura 2. Cromatograma de íons totais dos compostos anotados. Os números indicam

compostos anotados em ordem crescente de tempo de retenção (RT).

A análise de fragmentação por meio do experimento de varredura de íons

produtos permitiu a identificação de dois peptaibols (Fig. 3 e 4). A identificação
para as sequências de amino ácidos dos peptaibols hipomuricinas, analisou-se
a fragmentação do composto com m/z 1175.7764 [M+H]+, C58H102N12O13, 1.8
ppm), como modelo para o peptaibols hipomuricina A4 (Fig. 3). No espectro de
varredura deíons produtos, observam-se majoritariamente íons da série b, os
quais compreenderam os íons de b10 a b3, seguindo na direção da porção C-
terminal paraa N-terminal. Na porção C-terminal, as fragmentações m/z 1175
m/z 961 (b10, - 214 u) confirmaram que esta porção é o aminoálcool leucinol
com um resíduo de prolina. Posteriormente, foram observadas perdas
características de resíduos de aminoácidoscomo alpha aminoisobutirico (Aib, -
85 u), leucina/isoleucina (Lxx, - 113 u), (Pro- 97 u), (Aib, - 85 u) e (Lxx, - 113 u)
(Fig. 3). Além destes, o íon b1 de m/z 128.07 possibilitou a caracterização da
porção N-terminal, uma vez que corresponde ao agrupamento dos resíduos Aib-
Gln com o grupo amino acetilado. Desta forma, a sequência da hipomuricina A3
foi determinada como Ac-Aib-Gln-Vxx-Lxx-Aib-Pro-Lxx-Lxx-Aib-Pro- Leuol.

401
Figura 3. MS/MS do peptaibol hipomurocina A3.

Figura 4. MS/MS do peptaibol hipomurocina A4.

Trichoderma amazonicum MMSRG 38A é um produtor de peptaibols de

11 resíduo da série das hipomurocinas que apresentam atividades antibióticas,
anti- helmínticas e citotóxicas como as hypomurocins A e B (Becker et al. 1997;
Ayers et al. 2012). A literatura relata o grande potencial de espécies de
Trichoderma em produzir de peptaibols de 11, 14 e 18 resíduos.

402
 Conclusões
A avaliação do perfil metabólico por espectrometria de massas do isolado
T. amazonicum MMSRG38A indicou a presença de moléculas conhecidas, como
as hipomurocinas A3 e A4, e a presença de moléculas cujas estruturas ainda
permanecem desconhecidas, como os íons 1220 e 1264. Esses resultados
reforçam a necessidade de buscar novos metabólitos de diferentes biomas
brasileiros para fornecer novas entidades químicas que possam ser úteis na
medicina e na agricultura.

Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas pelo suporte
financeiro e concessão de bolsas de estudo obtido a partir do programa
Biodiversa (Edital Nº 007/2021). Ao Conselho Nacional de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e CAPES-Amazônia
Legal.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Prospecção de produtos naturais de interesse biotecnológico

com base na análise genômica de Streptomyces sp. MAD 27

Neves, Kiandro de Oliveira Gomes1; Silva, José Carlos Ipuchima1; Queiroz,

Claudia Afras2; Yamagishi, Michel Eduardo Beleza3; Koolen, Hector Henrique1;
Silva, Gilvan Ferreira2

1Universidade do Estado do Amazonas, 2Embrapa Amazônia Ocidental, 3Embrapa

Agricultura Digital
Email: [email protected]

Resumo
As bactérias do gênero Streptomyces são responsáveis pela biossíntese de
aproximadamente 75%dos antibióticos existentes, bem como outras moléculas
de interesse econômico. Recentemente, o sequenciamento de nova geração
(NGS) tem facilitado a descoberta de novos produtos naturais, por meio da
exploração da capacidade biossintética dos organismos por meio da análise de
genomas completos. A abordagem de mineraçãode genomas permite analisar o
genoma completo e predizer agrupamentos gênicos, conhecidos como BGC
(Biosynthetic gene cluster), responsáveis pela produção de metabólitos
secundários (MS). Desta forma, este estudo teve como objetivo realizar a
mineração genômica de Streptomyces sp. MAD 27 visando a identificação de
BGCs relacionados à produção de MS de interesse biotecnológico. Foi possível
identificar 45 BGCs, desses, 80% (36) que apresentam de moderada a nenhuma
similaridade com cluster gênicos depositados na base de dados MIBiG (Minimum
Information about a Biosynthetic Gene cluster). Entre os MS preditos há dois
policetídeos (PK): tetracenomycin C e flaviolin, um peptídeo sintetizado por
ribossomo e modificado pós-tradução (RIPP): thioholgamide A e B, e um terpeno
que foi a geosmin. Estes MS possuem aplicação medicinal, associados a
atividadeantitumoral e de auto-oxidação, além de ambiental, como controle de
contaminação hídrica. Dessa forma, os resultados obtidos demonstram o
potencial biotecnológico deStreptomyces sp. MAD 27 e fornecem suporte para
futuros estudos metabolômicos ede engenharia genética voltados à criação de
protocolos para produção de bioinsumoe a caracterização de novos MS.

Palavras-Chave: Metabólitos; Genoma; Mineração.

Introdução
Os microrganismos são foco de estudos relacionados à produção de
moléculas bioativas, estas também são conhecidas como metabólitos
secundários (MS) ou produtos naturais (PN) e estão normalmente atuando na
adaptação ao meio e/ou na defesa contra possíveis predadores ou competidores
(Demain e Fang 2000; Machado et al. 2017).

406
 Os MS são amplamente utilizados na produção de fármacos e de produtos
de interesse socioambiental (Newman e Cragg 2020). Atualmente as tecnologias
de sequenciamento de nova geração (NGS) combinadas com desenvolvimento
e aprimoramento de ferramentas de bioinformática, tornou possível a predição
de MS, a partir do genoma completo microrganismos por meio de mineração
genômica (Albarano et al. 2020).
Estudos com mineração genômica indicam que em microrganismos a
maioria dos MS é sintetizado por um conjunto de proteínas cujos genes estão
fisicamenteagrupados. A este conjunto de genes, dá-se o nome de BGC que
vem do inglês Biosynthetic gene clusters (BGCs), e inclui genes que codificam
enzimas relacionadasà via de biossíntese, e podem conter também genes para
proteínas reguladoras comofatores de transcrição e/ou repressores, bem como
transportadores relacionados à molécula sintetizada pelo BGC (Hahk-Soo e
Eung-Soo 2021).
A identificação dos BGCs de um genoma microbiano permite conhecer
todo o conjunto de metabólitos secundários que o referido microrganismo é
capaz de sintetizar, mesmo aqueles que são pouco expressos ou silenciados em
condições de laboratório. A caracterização de BGCs além de permitir a
identificação de MSs, conectando os genes à química por meio da similaridade
de genes pertencentes às vias metabólicas já conhecidas e depositadas no
banco de dados MIBiG (Terlouw et al. 2023).
Também é possível identificar novos produtos naturais relacionados aos
BGC sem nenhuma similaridade aos já conhecidos e caracterizados. Além disso,
as informações genéticas contidas nos BGCs permitem explorar o arsenal
metabólico pormeio do desbloqueio das vias silenciadas, com base na expressão
heteróloga, engenharia genética ou refatoração dos BGCs, ampliando dessa
forma adescoberta e utilização de moléculas interesse (Li et al. 2021; Sharma e
Salwan 2021;Chiang et al. 2023).
Dentre os microrganismos mais estudados, em relação ao potencial
biotecnológico presente em seu genoma, é possível destacar as bactérias do
gêneroStreptomyces, pois estão associadas à produção de 75% dos antibióticos
disponiveis no mercado (Lee et al. 2020). Entre suas características genômicas,
as espécies de Streptomyces apresentam BGCs que codificam enzimas que

407
contribuem para produção de MS, das mais diversas classes como terpenos,
policetídeos, peptídeos não ribossomais entre outras (Nett et al. 2009).
Desta forma, o objetivo deste estudo foi realizar a mineração genômica de
Streptomyces sp. MAD 27 visando a identificação de BGCs relacionados à
produçãode MS de interesse biotecnológico.

Material e Métodos
Neste estudo, o isolado de Streptomyces sp. MAD27, obtido de
sedimentos do Rio Madeira, Amazonas, Brasil, foi selecionado com base na
produção de compostos antimicrobianos identificados previamente in vitro.
Cadastro de Acesso ao patrimôniogenético Nº. AB6B14F.
O genoma completo foi sequenciado usando a plataforma Illumina com
read length: 2 x 150bp (Paired End). A montagem "de novo" foi realizada com o
montador SPAdes (Prjibelski et al. 2020), e resultou em 8,6 milhões de pares de
bases (pb) comcobertura de 294X e 907 scaffolds com N50 de 33243 pb e L50
de 80 pb. O maior scaffold apresentou tamanho de 188267 pb.
A identificação de BGCs foi realizada em janeiro de 2023 por meio da
plataforma AntiSMASH (https://antismash.secondarymetabolites.org/#!/start),
versão 7.0 (beta). Os dados obtidos foram agrupados de acordo com as classes
de MS e relacionados à literatura para identificação da função das substâncias
preditas na linhagem Streptomyces sp. MAD 27. O desenho das estruturas
químicas das substâncias preditas foi realizado por meio do software
ChemDraw Pro 12.0, a partir dos smiles presentes no banco MIBiG.
A análise de sintenia foi realizada usando o pipeline clinker &
clustermap.js (Gilchrist e Chooi 2021). Para isso, os arquivos Genbank de BGCs
já caracterizadosforam extraídos pelo repositório MIBIG. Os arquivos genbank
dos BGCs de MAD 27 foram obtidos por meio do antiSMASH. A comparação nos
BGCs e as buscas de similaridade foram baseadas no algoritmo TBLASTX em
clinker e a visualização da sintenia foi realizada pelo clustermap.js.

Resultados e Discussão
A partir da análise genômica, foram identificados 45 BGCs, desses, 20%
(9) possuem alta similaridade (≥70%) com vias de biossíntese já caracterizadas,
9% (4) apresentam similaridade moderada (30-69%), 42% (19) apresentam

408
baixa similaridade (1-29%) e 29% (13) não apresentaram nenhuma similaridade
(0%) com os BGCs presentes base de dados MIBiG.
Segundo Blin et al. (2021), por meio do BGC é possível predizer o
potencial biossintético de uma linhagem. No genoma da linhagem MAD 27, foram
identificadosBGCs relacionados a 12 classes de metabólitos secundários (Figura
1). As três classes mais abundantes foram: policetídeos sintase (PKS),
peptídeos não ribossomais sintase (NRPS), peptídeos sintetizados por
ribossomos e modificados pós-traducionalmente (RIPP) e terpenos, estas
classes correspondem a 69% (31) dosBGCs.

Figura 1 - Mineração genômica de Streptomyces sp. MAD 27. Em (A) Distribuição dos 45
clusters gênicos biossintéticos (BGC) identificados e distribuídos com bases na classe de
produtos naturais relacionados ao gene core. Em (B) similaridade mensurada com base no
número de genes que apresentam correspondência com vias de biossíntese já
caracterizadas e depositadas na base de dados MIBiG (Minimum Information about a
Biosynthetic Gene cluster).

As PKS correspondem a 25% (11) dos BGCs, muitos deles associados a

substâncias descritas na literatura com atividade citotóxica, antimicrobiana e
herbicida(Tabela 1). Dentro desta classe há a predição para a tetracenomicin C,
um importanteanticancerígeno aromático que inibe a tradução peptídica por meio
da ligação à subunidade ribossômica grande (Nguyen et al. 2021), além de
flaviolin, um pigmentoproduto da auto-oxidação do THN (Izumikawa et al. 2003).

409
Tabela 1 - Clusters gênicos biossintéticos (BGC) de metabólitos do tipo PKS previstos no
genoma de Streptomyces sp. MAD27 usando antiSMASH 7.0 (beta).

Dentre os NRP, para 21% (9), não houve predição para nenhum MS
(Tabela 2), embora tenha sido encontrado cluster similares a MS com atividade
antibiótica e ligadas ao sistema imune. Como não houve similaridade completa
entre os BGCs do tipo NRPS com a base de dados MIBiG, porém, não significa
que a linhagem não produz MS a partir de NRPS, sugerindo estudos químicos
para corroborar com os resultados obtidos.

410
Tabela 2 - Aglomerados de genes biossintéticos de metabólitos do tipo NRPS previstos no
genoma de Streptomyces sp. MAD27 usando antiSMASH 7.0 (beta).

Os RIPP e Terpenos (Tabela 3) representam duas classes de metabólitos

com13% (6) e 11% (5), respectivamente, dos BGCs de Streptomyces sp. MAD
27, com predição, no caso dos RIPP, para thioholgamide A e B, um MS de
interesse medicinalpara o combate de diferentes tipos de câncer (Dahlem et al.
2020), e, na classe dos terpenos, o MS geosmin associado a contaminação de
efluentes e o característico cheiro de "terra molhada" (Cane et al. 2006).

411
Tabela 3 - Aglomerados de genes biossintéticos de metabólitos do tipo RIPP e terpenos previstos
no genoma de Streptomyces sp. MAD27 usando antiSMASH 7.0 (beta).

Na classe das PKS, NRPS, RIPP e terpeno encontramos a predição para

quatro MS. A partir da análise de sintenia entre os BGCs da Streptomyces sp.
MAD 27 e os BGCs de referência na base de dados MIBiG (Figura 2), foi possível
comparar a composição gênica entre as vias de biossíntese e inferir que a
linhagem estudada tem todos os genes necessários para a biossíntese
do MS predito.

412
Figura 2 - Análise de sintenia entre clusters identificados em Streptomyces sp. MAD 27 e
aqueles relacionados a vias de biossíntese já caracterizadas. (1) Sintenia entre o BGC 28.1
de MAD 27 e o BGC0000275 de Streptomyces glaucescens. (2) Estrutura química de
tetracenomycin C. (3) Sintenia entre o BGC 11.1 de MAD 27 e o BGC0001802 de
Streptomyces malaysiense. (4) Estrutura química de thioholgamide A. (5) Sintenia entre o
BGC 75.1 de MAD 27 e o BGC0002127 de Streptomyces coelicolor A3(2). (6) Estrutura
química de flaviolin. (7) Sintenia entre o BGC 114.1 de MAD 27 e o BGC0002127 de S.
coelicolor A3(2). (8) Estrutura química de geosmin. (9) Predição da função gênicaa partir da
base de dados MIBiG.

A partir da análise de sintenia é possível predizer que ha chance de

biossíntese por Streptomyces sp. MAD 27, para os MS thioholgamide A e B,
flaviolin e geosmin, pois apresentam maior nível de identidade gênica (> 80%).
Apesar de tetracenomycin C apresentar 100% de semelhança predita na
plataforma AntiSMASH, o mesmo nãoé visto na análise de sintenia, podendo ser
resultado de um erro de predição do AntiSMASH, o que pode ser verificado com
outras abordagens químicas e de bioinformática. Todos os clusters gênicos
associados a metabólitos secundários, com aplicação biotecnológica, são
importantes, sendo a análise do genoma o primeiro passo para a descoberta de
novos bioativos (Hahk-Soo e Eung-Soo 2021). Dessa forma, as informações com
base na mineração genômica apresentadas aqui são, portanto, uma etapa tanto
para seleção como para decidir os BGCs a serem exploradosna busca de novos
produtos naturais e de moléculas que possam trazer soluções aos setores
agrícola, clínico e farmacêutico e fomentar a utilização dos metabólitos
secundários nos setores sociais aos quais possuem aplicação (Albarano et al.
2020).

413
 Além disso, a caracterização dos BGCs identificados fornece subsidios
para o uso de abordagem como: engenharia genética voltada a refatoração de
genes visando desbloqueio de vias, expressão heteróloga de BGCs que
combinadas com ensaios químicos e biológicos tornarão possível identificar
novos PNs e suas aplicações biotecnológicas.

Conclusão
Neste trabalho foi possível identificar os BGCs da linhagem Streptomyces
sp. MAD 27 é predizer com base no genoma que a linhagem (MAD 27) é capaz
de realizar a síntese de: tetracenomycin C, thioholgamide A e B, flaviolin e
geosmin, que são produtos naturais com atividades biológicas já reportada.
Embora alguns BGCs tenhasido conectados as moléculas mencionadas, 80% do
genoma, possui pouca ou nenhuma similaridade com vias já caracterizadas,
indicando a possibilidade de estarem relacionados à biossíntese de novos
produtos naturais ou podem estar lincado a moléculas já conhecidas cujos genes
responsáveis pela rota metabólica ainda não foram identificados.

Agradecimentos
Os autores agradecem às agências de fomento: FAPEAM (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas) CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Este trabalho contou com o
suporte financeiro da FAPEAM Editais: (PROSPAM 08/2021, CT&I ÁREAS
PRIORITÁRIAS 010/2021 e PRODUTIVIDADE-CT&I- 013/2022), CAPES
editais (Procad AmazonMicro, AmazôniaLegal, e pela concessão de bolsa de
estudo ao primeiro autor).

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416
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Prospecção genômica de quitinases de Bacillaceae isoladas de

sedimentos de rios amazônicos

Teixeira, Charles Araújo1; Queiroz, Claudia Afras de2; Sousa, Thiago Fernandes1;
Silva, Gilvan Ferreira da3

1Universidade Federal do Amazonas, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,

3Embrapa Amazônia Ocidental.

Email: [email protected]

Resumo
A família Bacillaceae é composta por organismos aeróbios e anaeróbios
facultativos, presentes no solo rizosférico, capazes de crescer rapidamente em
resposta ao carbono orgânico disponível. Conhecidos por produzir metabólitos
secundários e que podem ser usados como agentes de biocontrole. As espécies
do gênero Bacillus se destacam por suas propriedades de promover o
crescimento de plantas e pela capacidade de produção de enzimas quitinolíticas
que inibem a ação de fitopatógenos. Neste estudo realizou-se prospecção
genômica em busca de sequências com atividade quitinolítica em seis genomas
de fungos isolados de rios amazônicos pertencentes à família Bacillaceae.
Através da busca por homologia identificaram 32 sequências de proteínas,
classificadas em seis grupos: GH5 (2), GH6 (2), GH12 (1), GH18 subgrupo D
(23), LPMO10 (2) e metaloprotease (2). Os resultados indicam o potencial de
isolados amazônicos da família Bacillaceae na prospecção de quitinases e
revelam alta distribuição de quitinases do tipo GH18 nos genomas desses
isolados.
Palavras-chave: Bacillus, Biocontrole, fitopatógenos.

Introdução
Os organismos pertencentes à família Bacillaceae são amplamente
distribuídos, em sua maioria heterotróficos aeróbios ou anaeróbios facultativos,
apresentam crescimento rápido em resposta ao carbono orgânico disponível,
comumente encontrados em solo rizosférico, e são conhecidos pela produção
de metabólitos secundários que podem ser utilizados como agentes de
biocontrole (Mandic-Mulec et al. 2015).
Desta família, destacam-se as espécies do gênero Bacillus pela ampla
gama de estudos envolvendo seus mecanismos de promoção do crescimento de
plantas e inibir à ação de fitopatógenos, onde cerca de 4 a 15% do seu genoma
pode estar envolvido com a síntese de metabólitos antimicrobianos e enzimas
degradadoras, responsáveis pelo biocontrole (Dimkić et al. 2022).

417
 Entre as enzimas degradadoras, estão as quitinases que atuam na parede
celular de fungos, cutículas de artrópodes e ovos de nematóides (Dukariya e
Kumar 2020). Segundo o banco de dados CAZy, as quitinases são divididas
conforme seu mecanismo de ação, onde as quitinases (EC 3.2.1.14) atuam,
aleatoriamente, clivando as cadeias de quitina em sítios internos e as β-N-
acetilhexosaminidases (EC 3.2.1.52) hidrolisam a quitina da extremidade não
redutora da molécula, removendo resíduos de N-acetilglucosamina (Martínez-
Zavala et al. 2020).
As glicosil hidrolases (GH) são divididas em famílias de acordo com suas
sequências proteicas, onde as degradadoras de quitina são GH18, GH19, GH23
e GH48, com atividade de quitinase (EC 3.2.1.14), e GH3, GH5, GH18, GH20,
GH84, GH116, com atividade β-N-acetilhexosaminidases (EC 3.2.1.52)
(Martínez-Zavala et al. 2020).
Entre as quitinases mais comuns em Bacillus, as glicosil hidrolases da
família 18 se destacam, as GH18 possuem uma região catalítica que consiste
em um domínio barril (β/α) da triosefosfato isomerase (TIM), com três subgrupos,
sendo eles A, B e C, onde A possui domínio de inserção de quitina (CID),
formando sulco do tipo túnel profundo, B possuem além do CID um loop de
formação em telhado, formando um túnel profundo parcialmente fechado, as do
subgrupo C possuem apenas o barril TIM formando uma fenda rasa e ainda
existem as do subgrupo D que são as quitinases transglicosilantes (Oyeleye e
Normi 2018).
O uso de bactérias deste gênero para o biocontrole, em especial de
fitopatógenos, é promissor, visto que a biossíntese da quitinase, em alguns
isolados, pode estar associado a mecanismos de degradação de corpos de
frutificação fúngicos, e não a simples presença de quitina no meio, evidenciando
a aplicação de Bacillus para este fim (Schönbichler et al. 2020).
O presente trabalho propõe prospectar genes responsáveis pela
biossíntese de quitinases em bactérias da família Bacillaceae isoladas de
sedimentos de rios amazônicos a fim de caracterizar filogeneticamente as
enzimas encontradas e possibilitar a elucidação do potencial de aplicação destas
no biocontrole de fitopatógenos.

418
 Material e Métodos
Os microrganismos foram previamente isolados e testados
qualitativamente quanto à degradação de quitina. Para isso, os isolados foram
inoculados em meio de quitina coloidal (MQC) como única fonte de carbono. A
formação de halos de degradação indica linhagem positiva para produção de
quitinases.
A partir dos isolados com atividade quitinase positiva (MAD 1010, MAD
202, MAD 41, SOL 105, SOL 140, SOL 196), seus genomas foram analisados
com o objetivo de identificar o gênero e a espécie, utilizando o programa TYGS
(https://tygs.dsmz.de/).
A identificação dos genes responsáveis pela atividade quitinolítica foi
realizada por meio de busca no genoma via BLAST usando proteínas
quitinolíticas já caracterizadas. Para tanto, os genomas dos isolados amazônicos
foram anotados usando a plataforma RAST- Rapid Annotations using
Subsystems Technology
(https://rast.nmpdr.org/rast.cgi?page=JobDetails&job=1242927). As proteínas
homólogas resultantes, foram submetidas ao BLAST no NCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar a família da enzima e a
relação com sequências presentes no banco de dados. As proteínas também
foram examinadas individualmente usando o InterPro
(https://www.ebi.ac.uk/interpro/). As análises filogenéticas foram conduzidas por
meio de Neighbor-Joining com auxílio do software MEGA.

Resultados e Discussão
No genoma de Priestia megaterium SOL 196 foram identificadas sete
enzimas para degradação de quitina, e classificadas em GH18 (6) e LPM10 (1).
As linhagens de Bacillus cereus diferiram quanto às classes e números de
quitinases localizadas, no isolado MAD 202 foram identificadas quatro quitinases
sendo duas pertencentes a GH18 e duas pertencentes a metaloprotease (família
60). O isolado MAD 41 apresentou nove quitinases classificadas em GH05 (1),
GH06 (1), GH18 (6) e LPM10 (1). O isolado SOL 105 apresentou apenas duas
quitinases da família GH18. Em B. subtilis MAD 1010, foi identificada apenas
uma quitinase da família GH05, em contraste B. velezenzis SOL 140 no qual

419
foram identificadas nove quitinases classificadas em GH06 (1), GH12 (1) e GH18
(7) (Tabela 1; Figura 1).

Tabela 1. Genomas de Bacillaceae com sequências de quitinases

Isolados Identificação Potencial nova espécie Atividade N° de quitinases

MAD 41 Bacillus cereus - + 9

MAD 202 B, cereus - + 4
MAD 1010 B. subtilis - + 1
SOL 105 B. cereus - + 2
SOL 140 B. velezensis - + 9
SOL 196 Priestia megaterium - + 7
Total 32

Os seis genomas analisados, foram identificados como pertencentes à

família Bacillaceae, e classificados em nível de espécie: P. megaterium (SOL
196), B. cereus (MAD 202, MAD 41 e SOL 105), B. subtilis (MAD 1010) e B.
velezensis (SOL 140). Todos os isolados apresentaram >70% de dDDH.
As duas GH5 localizadas apresentam módulo de ligação a carboidrato do
tipo 3 (CBM3) e domínio de fibronectina tipo III (FN3) característicos de
quitinases dessa família (Nakamura et al. 2020). As sequências de GH6
identificadas apresentam domínios FN3 e CBM3, semelhantes aos presentes
nas GH5, e as sequências de GH12 apresentam domínio ConA-like no qual faz
parte do domínio de lecitinas.
Além dessa GHs, foram detectadas duas sequências de proteínas com
atividade quitinase, sendo elas as mono-oxigenases de polissacarídeos líticos
do tipo LPMO10 que podem atuar oxidando ligações glicosídicas da quitina
(Agger et al. 2014), uma com CMB2 e domínio de ligação a quitina (CBD2) e a
outra mais simples com o LPMO10.
As metaloproteases da família 60, geralmente estão associadas a
módulos de ligação a carboidrato característicos de quinases que em conjunto
auxiliam na colonização de vertebrados. Dessa forma, esta enzima pode estar
associada a bactérias com potencial de infecção do trato respiratório, incluindo
o humano (Nakajang et al. 2012).

420
Figura 1 – Diversidade de enzimas quitinolíticas da família GH18 identificadas no genoma de
isolados amazônicos da família Bacillaceae.

Conclusões
Detectaram-se 32 quitinases em organismos da família Bacillaceae
isolados de rios amazônicos. Entre as enzimas com atividade de degradação de
quitina presentes nos genomas amazônicos, as da família GH18 foram as mais
frequentes.
Este estudo fornece um dataset de enzimas caracterizadas e disponibiliza
bases para estudos posteriores acerca das suas atividades e aplicações na
agricultura.

Agradecimentos
À FAPEAM programa Biodiversa (edital Nº 007/2021).
Ao CNPq - programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica 2022-
2024 (PIBIC Nº 21/2022).
À CAPES (Procad AmazonMicro e CAPES-Amazônia Legal).

421
 Referências
Agger, J.W.; Isaksen, T.V.; Várnai, A.; Vidal-Melgosa, S.; Willats, W. G. T.;
Ludwig, R.; Horn, S. J.; Eijsink, V. G. H.; Westereng, B. 2014. Discovery of LPMO
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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Prospecção genômica do isolado Bacillus sp. MAD202 como

potencial na indústria agrícola

Nascimento, Maria Giovana Cavalcante do1; Sousa, Thiago Fernandes1;

Queiroz, Cláudia Afras de3; Silva, *Gilvan Ferreira2

1Universidade Federal do Amazonas, 2Embrapa Amazônia Ocidental, 3Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia
E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
Produzir alimentos com qualidade e em quantidade suficiente para atender ao
crescimento populacional tornou-se um grande desafio. Esta meta exige o
desenvolvimento de tecnologias racionais que otimizem o uso de recursos
naturais, ampliando a capacidade produtiva, além de estratégias para redução
das perdas de produção. Visando isso, nos últimos anos houve um grande
aumento de uso de bioprodutos, uma vez que apresentam vantagem para
atividades agrícolas como controle de fitopatógenos, sobretudo, bioprodutos a
partir de culturas bacterianas como o uso do gênero Bacillus, que já possui
diversas aplicações no mercado. Com isso, neste trabalho propõe a revisão do
genoma do isolado de Bacillus e testes de co-culltivo contra fitopatógenos a fim
de avaliar seu potencial para atividades da indústria agrícola. Para
caracterização e filogenia foram utilizadas as ferramentas Antismash e TYGS,
enquanto para anotação do genoma foram usados o Rast, BLASTp, além de
testes contra fitopatógeno de culturas amazônicas Moniliophthora perniciosa
(Mp01), Fusarium decemcellulare (fdc 307), Fusarium sp. (MCT10621) e
Colletotrichum scovillei (2910). Em suma, a análise mostrou que o isolado B.
thunrigiensis possui potencial do uso em biorremediação de cádmio, produção
de sideróforo e inibição contra fitopatógenos de diferentes culturas.

Palavras-Chave: Fitopatógenos; Sideróforo; biorremediação

Introdução
Bactérias do gênero Bacillus são microrganismos que habitam inúmeros
habitats, conhecidos como produtores de uma ampla gama de compostos
antagonistas, e possuem cerca de 5 a 8% do genoma total dedicado a
biossíntese de metabólitos secundários (Fira et al. 2018). Além disso, muitas
espécies desse gênero são excelentes biocontroladores de pragas e doenças
agrícolas. (Albuquerque 2018).
A eficiência dos bioprodutos a base de Bacillus também está relacionada
à capacidade de espécies em realizar biossolubilização de nutrientes essenciais
como o fósforo, fixar nitrogênio e produzir substâncias estimulantes (hormônios

423
e agentes de biocontrole) (Fernandes e Oliveira et al. 2019). O manejo de
doenças mediadas por microrganismos apresenta-se como alternativa para a
redução do uso de agroquímicos (Ryan et al. 2008; Alvindia et al. 2009; Zhang
et al. 2016; Albuquerque 2018), este manejo, de modo geral agem
significativamente por antibiose e, de maneira eventual, podem apresentar
comportamentos de parasitismo e competição.
A antibiose produzida, geralmente, têm amplo espectro de ação, de forma
que na inibição dos fungos a produção de substâncias tóxicas é mais efetiva do
que qualquer outro mecanismo de ação envolvido (Kupper et al. 2003; Lanna
Filho et al. 2010), visando isso, atualmente é possível identificar 14 bactérias e
12 fungos registrados na USEPA (U. S. Environmental Protection Agency)
destinados ao controle das enfermidades em plantas, a maioria destes
microrganismos são atualmente comercializados em bioprodutos (Lanna Filho et
al. 2010).
Nesse sentido, o sequenciamento e análise de genomas completos de
microrganismos pode fornecer informações valiosas para triagem de
microrganismos com potencial para biocontrole ou promoção de crescimento.
Análises in silico via ferramentas de bioinformática auxiliam na identificação de
vias metabólicas relacionadas a produção de hormônios vegetais, metabólitos
secundários e detoxificação de metais pesados, permitindo o uso de
microrganismos conforme os potenciais identificados (Balbinot 2020).
Neste estudo, foi realizada a análise genômica de uma bactéria MAD 202
do sedimento do Rio Madeira (AM) usando filogenômica para identificação da
espécie e anotação e caracterização de genes relacionados à produção de
metabólitos secundários e genes de resistência a metais pesados.
O objetivo deste trabalho foi realizar a prospecção genômica do isolado
Bacillus sp. MAD202 como potencial na indústria agrícola, com base na
identificação filogenômica da espécie, anotação e caracterização de genes
relacionados à produção de metabólitos secundários e genes de resistência a
metais pesados.

424
 Material e Métodos
Identificação e Mineração Genômica
A caracterização do genoma do isolado foi realizada a partir da plataforma
antiSMASH (antibiotics and Secondary Metabolites Analysis SHell)
(https://antismash.secondarymetabolites.org/) conforme os padrões (Blin et al.
2019) que visam a identificação de conjuntos de genes responsáveis por uma
via metabólica com base em referências contidas do banco de dados MiBIG, em
conjunto as anotações genicas foram realizadas a partir da plataforma RAST
(Rapid Annotation using Subsystem Technology) (https://rast.nmpdr.org/) (Aziz
et al. 2008). O pipeline Clinker foi usado para as análises de sintenia.
A partir da notação dos genes, as enzimas de interesse foram submetidas
e comparadas manualmente junto a ferramenta BLASTp
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) (Eric, Nicholas e Theophilus 2014). Ainda foram
realizadas análise taxonômicas visando a determinação linhagens monofiléticas
por meio da ferramenta TYGS (Type (Strain) Genome Server) com base no
parâmetro de hibridização de DNA-DNA (Meier-Kolthoff e Göker 2019).

Avaliação da atividade antifúngico fitopatógeno

Para avaliação do potencial antifúngico foi realizado co-cultivo contra os
fitopatógenos Moniliophthora perniciosa (Mp01 - fitopatógeno de cultura do
cacau), Fusarium decemcellulare (Fdc 307 - fitopatógeno de cultura do guaraná),
Colletotrichum scovillei (2910 - fitopatógeno de plântulas de pimentão e
pimentas) e Fusarium sp. (MCT1062 - fitopatógeno de fruto tomate) com base
na metodologia de (Anith, Nysanth e Natarajan 2021) por 15 dias.

425
Figura 1: método de co-cultivo modificado. Fonte DOI: 10.1111/lam.13495

Resultados e Discussão
Identificação filogenética do isolado Bacillus sp MAD202
Com base na literatura, valores da metodologia hibridização DNA-DNA
(dDDH) acima de 70% apontam equivalência de espécie. A análise de
filogenômica do isolado MAD 202 apresentou maior valor de dDDH na fórmula
d4 com a espécie tipo Bacillus thuringiensis ATCC 10792, com dDDH de 82.68%
e com Bacillus cereus ATCC 14579, com 70.5%, indicando que o isolado de
Bacillus thurigienses, pertencente ao grupo Cereus.
Este grupo inclui várias espécies de Bacillus com filogenia intimamente
relacionada. Os membros mais bem estudados do grupo, Bacillus anthracis, B.
cereus e B. thuringiensis, este último devido a sua característica inseticida
relacionada principalmente à presença de cristais protéicos produzidos durante
seu processo de esporulação compostos principalmente por δ-endotoxinas
conhecidas como proteínas Cry, as quais possuem ação inseticida contra insetos
pertencentes a diversas ordens, mas principalmente Coleoptera, Diptera,
Hymenoptera e Lepidoptera, sendo atualmente comercializada para uso de
biopesticidas (Horta et al. 2017). Baseado nisso foram feitas investigações
quanto ao uso isolado de Bacillus sp. MAD202 para uso de atividade agrícola.
Entre as 6101 Sequências de Codificação no genoma do isolado MAD 202
apenas 23% (1381) foram classificadas em subsistemas na ferramenta de
anotação, em qual os recursos se distribuem em sua grande maioria entre

426
Aminoácidos e derivados, carboidratos, metabolismo de proteína e cofatores,
respectivamente.

Figura 2 - Arvore filogenética MAD 202 através do genoma Anotação de genoma e

caracterização de BGCs

Figura 3 - Classificação de subsistemas de Bacillus sp. (MAD 202)

427
Figura 4 - Demonstração do subsistema de resistência

Por meio desta análise, é possível identificar diversos genes relacionados

a resistência antimicrobianos e metais pesados, sobretudo de cádmio,
apresentando um gene de resistência e outros vinte e dois ligados a resistência
de cobalto, zinco e cadmio.
A destoxificação de cádmio se deve a uma ATPase (CadA), responsável
pelo efluxo do metal para fora da célula. Este metal, no interior das células, causa
danos irrecuperáveis para a produção de espécies reativas de oxigênio, redução
de taxa de crescimento, diminuição da densidade da parede da célula e causa
morte celular (Lee et al. 2001; Fidelis 2013). Além disso, o cádmio é um
contaminante ambiental e é capaz de se acumular na cadeia alimentar,
causando danos no aparelho digestório dos infectados. Portanto, a identificação
de genes de resistência a esses metais pode ajudar na elaboração de estratégias
para a biorremediação de ambientes terrestres e aquáticos.
A análise de BGCs identificou 13 BGCs, relacionados a produção de
NRPs (4), lanthipeptídeos, laderano, Ripp, sideróforos, terpeno e betalactona.Os
BGCs relacionados aos sideróforos foram os únicos que tiveram 100% de
similaridade com BGCs já caracterizados no repositório MIBiG. Esses foram

428
relacionados a produção de petrobactina (figura 5) e bacilibactina (figura 6) Os
demais BGCs apresentaram menos de 80%, demonstrando ser vias ainda não
caracterizadas.
A produção de sideróforos é benéfica para as plantas ao disponibilizar o
íon Fe, auxiliando na nutrição (mecanismo direto) ou reduzindo a competitividade
dos patógenos transmitidos pelo solo ao limitar este nutriente (mecanismo
indireto), além de atuar também na biorremediação (Tank et al. 2012; Sah e
Singh 2015; Saha et al. 2015; Pahari et al. 2017; Veloso 2019).

Figura 5: Sintenia entre os genes relacionados com a biossíntese de petrobactina e BGCs

(biosythetic gene clusters) localizados em Bacillus thuringiensis MAD 202, Bacillus
thuringienses ATCC 10792 e Bacillus cereus ATCC 14579

Figura 6: Sintenia entre os genes relacionados com a biossíntese de bacillibactina e BGCs

(biosythetic gene clusters) localizados em Bacillus thuringiensis MAD 202, Bacillus
thuringienses ATCC 10792 e Bacillus cereus ATCC 14579

Avaliação da atividade antifúngico fitopatógeno

Os testes in vitro apresentaram resultados positivos quanto ao potencial
antifúngico em co-cultivo contra os fitopatógenos Moniliophthora perniciosa
(Mp01), Fusarium decemcellulare (fdc 307), Fusarium sp. (MCT10621) e

429
Colletotrichum scovillei (2910), sendo observado a inibição do crescimento
micelial via produção de metabólitos secundários.

Figura 7 - Teste de co-cultivo MAD202 x Fitopatógenos

Conclusões
O presente trabalho identificou que o isolado Bacillus sp MAD 202 é B.
thuringiensis. A análise genômica revela potencial para resistência e
destoxificação do metal pesado cádmio, como também apontam clusters
voltados para a produção de sideróforos, enquanto a análise de antagonismo
mostrou atividades antifúngicas de B. thuringiensis contra Moniliophthora
perniciosa (Mp01), Fusarium decemcellulare (fdc 307) e Colletotrichum scovillei
(2910).

Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas pelo suporte financeiro e concessão de Bolsas de estudo obtido a
partir do programa Biodiversa (Edital Nº 007/2021). Ao Conselho Nacional de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro,
CAPES-Amazônia Legal e a EMBRAPA Amazônia Ocidental pelo apoio a
pesquisa.

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Regulador transcricional LaeA em Trichoderma spp:

identificação e arquitetura genômica

Fernandes, Joelma dos Santos1,4; Queiroz, Claudia Afras1,4; Sousa, Thiago

Fernandes2,4; Hanada, Rogério Eiji1; Koolen, Hector Henrique Ferreira3; Silva,
Gilvan Ferreira4

1InstitutoNacional de Pesquisa da Amazônia, 2Universidade Federal do Amazonas,

3Universidade do Estado do Amazonas, 4Embrapa Amazônia Ocidental.
E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
Ferramentas de bioinformática e sequenciamento de genomas são cada vez
mais eficientes e com menor custo e tem contribuído com a identificação de um
vasto número de grupos de genes relacionados à síntese metabólica. A
identificação de genes relacionados a vias metabólicas por meio de mineração
não é suficiente para obtenção de metabólitos secundários, visto que estes
clusters gênicos podem estar silenciados ou crípticos. Neste sentido, o uso de
fatores de transcrição capazes de ativar genes responsáveis pela biossíntese
pode ser uma estratégia para desbloqueio de vias silenciadas. O fator de
transcrição LaeA é considerado um regulador importante para desbloquear a
expressão de metabólitos crípticos ou silenciados, já constatado em vários
fungos. Este trabalho teve como objetivo localizar e realizar análise sintênica de
LaeA em 16 isolados de Trichoderma. A análise ocorreu com a busca da
sequência que codifica o regulador global LaeA e cerca de cinco genes a
montante e a jusante ao LaeA nos genomas dos 16 isolados, utilizando o
software Genious Prime. A arquitetura foi analisada com base na sintenia via
pipeline Clinker & Clustermap.js. Os resultados indicam que dentre alguns dos
genes que flanqueiam o laeA, estão enzimas relacionadas com a síntese de
metabólitos primários e secundários. Grupos de genes específicos inseridos com
alta similaridade também foram observados em quatro isolados, que podem ter
se integrado na região por meio de eventos de recombinação e inserção de
genes. Essas análises evidenciam a alta identidade do gene laeA nos dezesseis
isolados, demonstrando ser um gene conservado em Trichoderma sp.

Palavras-chave: Trichoderma, Sintenia, Regulador LaeA.

Introdução
O sequenciamento de nova geração tem permitido a obtenção de
genomas completos de microrganismos com menor custo. E a disponibilidade de
ferramentas de bioinformática cada vez mais eficientes para estudos genômicos
e metabolômicos tem contribuído na identificação de um vasto número de genes

433
relacionados à síntese metabólica, confirmando o potencial biotecnológico de
vários microrganismos como fonte de novas moléculas (Gluck-Thaler et al. 2020;
Martínez-Cárdenas et al. 2021; Song et al. 2022).
Os microrganismos são produtores de várias moléculas de interesse
biotecnológico, e entre os fungos, o gênero Trichoderma destaca-se pela
produção de diversos metabólitos de importância farmacêutica e agronômica
(Zingeilinger et al. 2016; Sun et al. 2022). Contudo, um arsenal de metabólitos
secundários detectados via análise genômica tem revelado que a capacidade
para produção de moléculas é bem maior do que o observado em condições de
laboratório, que acabam não sendo sintetizados por falta de conhecimento das
condições ambientais de síntese e/ou dos mecanismos de regulação genética
que fazem com que em determinadas condições essas vias estejam silenciadas
ou sejam críptica, apresentando uma expressão muito baixa do metabólito, não
sendo possível detectar as moléculas nas análises químicas (Zingeilinger et al.
2016).
A identificação de compostos bioativos relacionados a vias silenciadas ou
crípticos está sendo ampliada com estratégias de mineração de genoma, que
auxiliam na busca por vias metabólicas, também chamados de Clusters Gênicos
Biossintéticos (do inglês Biosynthetic Gene Clusters - BGCs) com base em
genomas completos (Bok et al. 2006). Porém, conforme mencionado acima a
identificação de BGCs no genoma não significa que em condições de laboratório
os genes que compõem determinada via estejam sendo expressos, uma vez
que, fatores ambientais podem influenciar na ativação desses BGCs. Neste
contexto, a indução da expressão de BGCs silenciados ou crípticos pode ser
uma alternativa ao desbloqueio dessas vias.
Em Aspergillus spp. foi identificado e analisado o gene laeA que codifica
uma proteína nuclear (LaeA- S-adenosil-L-metionina dependente de
metiltransferase) conhecida como regulador transcricional global do
metabolismo secundário (Bok et al. 2004). A deleção e superexpressão deste
gene levou a descoberta de novas moléculas e tem contribuído para o
entendimento de vários fatores relacionados à regulação epigenética do
metabolismo em Aspergillus spp. e outras espécies de fungos filamentosos (Bok
et al. 2004; Karimi-Aghcheh et al. 2013; Jiang et al. 2016; Yu et al. 2019). Em
Penicillium dipodomyis YJ-11 a superexpressão de LaeA induziu alterações

434
morfológicas evidentes e variações metabólicas com a ativação de BGCs
silenciados (Yu et al. 2019).
Segundo Bok et al. (2006) apenas fungos filamentosos têm possíveis
ortólogos de LaeA com regiões conservadas, como a S-adenosil-L-metionina
dependente de metiltransferase identificada em isolados de Trichoderma neste
estudo. Análise da sintenia de genes agrupados a família de genes ortólogos
pode contribuir com novos insights sobre a evolução e a conservação genômica,
e assim gerar informações críticas sobre o contexto da evolução genômica.
Tendo em vista o papel funcional do regulador transcricional LaeA para a
expressão de BGCs silenciados ou crípticos, este trabalho teve como objetivo
analisar a composição e arquitetura dos genes que flanqueiam o fator de
transcrição LaeA em diferentes isolados de Trichoderma, com intuito de verificar
a conservação gênica da região.

Material e Métodos
A realização do presente estudo ocorreu com a seleção de dezesseis
isolados de Trichoderma (Tabela 1) obtidos na sua grande maioria do bioma
amazônico. Os isolados selecionados tiveram seus genomas sequenciados e
analisados. O acesso ao patrimônio genético é o SISGEN: N°AB6B14F.
O sequenciamento dos genomas foi realizado na plataforma Illumina com
read length: 2 x 150 (Paired End) com cobertura de 100x. Os genes foram
anotados por meio do plugin AUGUSTUS (Stanke e Morgenstern, 2005) do
software Geneious Prime versão 2022.2.2 (https://www.geneious.com) usando
Fusarium graminearum como referência e a predição funcional dos genes foi
realizada pelas plataformas PFAM e NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome). Após a anotação dos genomas foi
realizada a localização das sequências homólogas ao laeA e cerca de cinco
genes a montante e a jusante com maior identidade foram selecionados e
analisados.
A análise de sintenia da região a montante e a jusante aos genes
homólogos ao laeA nos dezesseis isolados foi realizada por meio do pipeline
clinker & clustermap.js (Gilchrist et al. 2021). Para isso, arquivos genbank das
sequências homólogas ao laeA foram obtidos via fungiSMASH (Blin et al. 2019).

435
 Tabela 1: Acesso de culturas de Trichoderma spp. de diferentes Coleções Microbiológicas
Amazônicas.
Isolado Código Hospedeiro/substrato Local Coleção Microbiológica
Coleção de Microrganismos de
T2475 INPA2475 Scleronema micranthum Amazonas Interesse Agrossivilcutural
CMIAINPA
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 8 CPAA-TM8 Sedimento Rio Madeira/AM
Ocidental
Central de coleções
TM 12 MMSRG-12 Mauritia flexuosa (Fruto) Amazonas
Microbiológicas - UEA
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 14 CPAA-TM14 Sedimento Rio Madeira/AM
Ocidental
Central de coleções
TM 15 MMSRG-15 Mauritia flexuosa (Fruto) Amazonas
Microbiológicas - UEA
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 26 CPAA-TM26 Sedimento Rio Purus/AM
Ocidental
Euterpe precatória Central de coleções
TM 38A MMSRG-38A Amazonas
(Casca externa) Microbiológica - UEA
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 42 CPAA-TM42 Sedimento Rio Purus/AM
Ocidental
CPAA-Embrapa Amazonia
TM 44 CPAA-TM44 Sedimento Rio Purus/AM
Ocidental
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 45 CPAA-TM45 Sedimento Rio Purus/AM
Ocidental
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 58 CPAA-TM58 Sedimento Rio Juruá/AM
Ocidental
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 63 CPAA-TM63 Sedimento Rio Juruá/AM
Ocidental
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 64 CPAA-TM64 Sedimento Rio Juruá/AM
Ocidental
CPAA-Embrapa Amazônia
TM 67 CPAA-TM67 Sedimento Rio Juruá/AM
Ocidental
Central de coleções
TM 85 MMSRG-85 Botrylloides giganteus Mar/SP
Microbiológicas - UEA
Central de coleções
TM 94 MMSRG-94 Sedimento Rio Amazonas
Microbiológicas - UEA

A filogenia dos dezesseis isolados foi realizada com base na sequência

parcial do fator de elongação 1-α (EF 1α). Os alinhamentos múltiplos das
sequências de nucleotídeos foram gerados utilizando-se a ferramenta
CLUSTALW (Thompson et al. 1994), implementado pelo programa MEGA 7
(Kumar et al. 2016). As análises filogenéticas foram obtidas por meio da análise
concatenada do locus e os ramos internos foram avaliados com 1000 repetições
de bootstrap.

Resultados e Discussão
A análise do gene que codifica um ortólogo do regulador global LaeA e
seus genes a montante e a jusante nos dezesseis isolados do gênero
Trichoderma, revelou que LaeA apresenta identidade acima de 80% na maioria
436
dos isolados analisados (Figura 1), demonstrando tratar-se de um regulador
transcricional conservado neste gênero. Os genes a montante e a jusante ao
gene laeA apresentaram a mesma organização, com exceção de alguns isolados
que apresentaram variações, sendo possível observar aglomerados específicos
de genes introduzidos na região por eventos de recombinação ou inserção.
A montante do gene laeA foram observados aglomerados intergênicos
nos isolados de Trichoderma TM 63 e TM 67, se tratando de um grupo de genes
que não são observados nos demais (Figura 1). As sequências de aminoácidos
destas proteínas apresentaram identidade com proteínas hipotéticas do gênero
Trichoderma. Outro grupo intergênico a montante do gene laeA também foi
observado nos isolados de Trichoderma TM 26 e TM 45 (Figura 1). Neste grupo
são observados quatro genes inseridos na região, sendo que um deles codifica
uma amidohidrolase e os outros genes são relacionados a proteínas hipotéticas.
Os demais genes a montante ao laeA estão presentes em quase todos os
isolados, dentre eles alguns codificam proteínas relacionadas ao metabolismo
primário e secundário, e algumas ainda não tem as proteínas analisadas em
espécies de Trichoderma, porém possuem similaridade com proteínas de outros
microrganismos.
Um dos genes, o primeiro a montante ao laeA, codifica uma proteína que
possui homologia com um transportador de pantotenato Liz1 em Fusarium
sporotrichioides. Em estudos realizados em Schizosaccharomyces pombe, o
Liz1 pode ser o único transportador de pantotenato de membrana plasmática
funcional (Stolz et al. 2004). Outro gene, o segundo a montante ao LaeA, está
relacionado a uma proteína com domínio do tipo SnoaL em Trichoderma
simmonsii. SnoaL pertence a uma família de pequenas ciclases de policetídeos,
que catalisam etapas de fechamento de anel na biossíntese de antibióticos
produzidos por policetídeos em Streptomyces spp. (Sultana et al. 2004; Ferrara
et al. 2021). Já Ferrara et al. (2021), observaram que a ciclase SnoaL em
Aspergillus carbonarius atuando na regulação positiva da biossíntese de
ocratoxina A (OTA), que é uma micotoxina bem conhecida com ampla
distribuição em alimentos e rações.
Também foi observado um gene, o quarto a montante ao laeA,
conservado em todos os 16 isolados de Trichoderma, e de acordo com análises
realizadas no banco de dados do NCBI (Blast) codifica uma proteína chamada

437
Switch 2 em Trichoderma asperellum, ortólogo de RAD26 da superfamília SNF2
em Fusarium solani. Trata-se de subunidade catalítica do complexo SWI/SNF
que atua para alterar a estrutura da cromatina (Durr et al. 2006; Ceballos e Heyer
2011).
Na região a jusante ao gene laeA foram observados dois genes
conservados entre os dezesseis isolados. O primeiro a jusante, apresenta
homologia com citocromo P450 em Trichoderma spp., um importante grupo de
enzimas relacionadas ao metabolismo primário e secundário, e metabolismo de
xenobióticos (Lah et al. 2011; Chadha et al. 2018). Bansal e Mukherjee (2016),
ao analisar o genoma de três espécies de Trichoderma (T. reesei, T. atroviride e
T. virens) observou que o citocromo P450 está sempre nas proximidades de
clusters de genes relacionados ao metabolismo secundário, como NRPS, PKS e
aglomerados de ciclase terpênica.
O segundo gene a jusante, compartilhado em todas as espécies
analisadas, codifica uma proteína homóloga a proteína de ativação chamada E1-
like em Trichoderma reesei, que faz parte de uma superfamília central para a
conjugação de ubiquitina (Ub), biossíntese de cisteína, tiamina e vários
metabólitos secundários em diversos organismos (Burroughs et al. 2009).
Segundo Burroughs et al. (2009), as proteínas semelhantes a E1 estão mais
próximas das desidrogenases dependentes de NAD(P)/FAD e das
metiltransferases dependentes de S-AdoMet, com atividade de
fosfotransferência por “invenção” catalítica. Os demais genes a jusantes ao laeA
ainda não tem sua caracterização bem definida em fungos.
Além da análise de sintenia dos genes que flanqueiam o regulador LaeA,
as correlações filogenéticas entre os 16 isolados de Trichoderma foram
avaliadas com base no gene tef1-α (Figura 2) com intuito de observar a
arquitetura dos genes encontrados na análise sintênica e filogenia.

438
Figura 1. Localização e comparação da sequência do gene ortólogo ao laeA (S-adenosil-L-
metionina dependente de metiltransferase) e dos genes a montante e a jusante ao regulador
transcricional em dezesseis isolados de Trichoderma.

Na análise filogenética, o isolado Trichoderma TM2475 identificado como

Trichoderma agriamazonicum sp. nova (Sousa et al. 2023) e o isolado
Trichoderma TM58 ficaram agrupados com alto suporte de bootstrap (Figura 2)
e apresentam arquitetura de genes semelhantes (Figura 1). O mesmo foi
observado com os isolados de Trichoderma TM 12 e TM 15 que ficaram
agrupados e apresentam genes com quase 100% de identidade (Figura 1 e 2).
Os isolados de Trichoderma (TM 26 e TM 45) estão agrupados no mesmo
clado e próximos também na análise sintênica. Observa-se um grupo de quatro
genes inseridos na região e todos estes apresentam 100% de identidade (Figura
1). Já os isolados de Trichoderma TM 63 e TM 67 que também apresentam
similaridade na arquitetura de genes não estão filogeneticamente próximos.

439
Figura 2. Árvore filogenética baseada em Neighbor joining usando o barcode tef1-α de dezesseis
isolados de Trichoderma amazônicos.

Conclusão
A análise da arquitetura da região onde está localizado o laeA juntamente
com a filogenia, evidenciam que a região a jusante e a montante são
conservadas em Trichoderma spp., embora em alguns isolados foram
observadas inserção gênica e inserção de DNA intergênico a montante ao laeA.
Além disso, em todos os isolados a montante foi identificado o gene Switch 2,
subunidade catalítica do complexo SWI/SNF que atua para alterar a estrutura da
cromatina, a jusante foi localizada o gene P450 que codifica grupos de enzimas
relacionadas ao metabolismo primário e secundário, e o E1-like gene que
codifica a proteína de ativação relacionadas ao metabolismo secundário.

Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e CAPES-Amazônia
Legal pelo apoio financeiro e concessão de Bolsas de estudo. À Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas por meio do programa Biodiversa
(Edital N°007/2021).

440
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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Seleção de isolados de Trichoderma spp. para controle

biológicode Sclerotium rolfsii em tomateiros

Willerding, André Luis1; Coelho Netto, Rosalee Albuquerque1; Assis, Luiz Alberto
Guimarães1; Silva, Gilvan Ferreira2; Sousa, Sandra Barbosa1; Freitas, Sara3;
Blind, Ariel Dotto3; Figueiredo, José Nilton Rodrigues3; Hanada, Rogério Eiji1

1InstitutoNacional de Pesquisas da Amazônia, 2Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária, 3Universidade Paulista, Manaus
Email: [email protected]

Resumo
Doenças causadas por patógenos habitantes do solo são de difícil controle e
causamsérios prejuízos na produção de espécies olerícolas no Amazonas. A
pesquisaavaliou seis isolados amazônicos de Trichoderma spp. que mostraram
potencial em experimentos anteriores no controle de podridão-de-Sclerotium
(Sclerotium rolfsii) em tomateiro (Solanum lycopersicum). O experimento em
campo (Estação Experimental Alejo von der Pahlen, do Inpa) serviu para avaliar
o efeito dos isolados de Trichoderma spp. na redução da severidade e da
incidência da doença e relacionar na produção de tomates. Os seis isolados
testados foramidentificados molecularmente ao nível de espécie. A possibilidade
de utilização de isolados de Trichoderma spp. para o controle de doenças
importantes na produção de hortaliças no estado permitirá um melhor e mais
seguro manejo das doenças, ampliando a possibilidade aumento de renda dos
agricultores. Um dos principais impactos está relacionado ao desenvolvimento
de um bioinsumo à base de Trichoderma que contribuirá para o controle biológico
na produção de hortaliças no Amazonas. Outro impacto é relacionado à adoção
de controle biológico com consequente redução de gastos com defensivos
agrícolas, e com a produção de modoecologicamente sustentável, o que agrega
valor à produção dos agricultores orgânicos. A partir dos resultados desse
trabalho, um novo bioinsumo a ser desenvolvido poderá ofertar aos agricultores
condições melhores de manejar as doenças e aumentar a qualidade da
produção. Após os experimentos, o isolado do tratamento T-3 apresentou a
melhor resposta como controle biológico nas condições testadas, mostrando-se
potencialmente promissor. Novos trabalhos deverão ser realizados para
constatar essa eficiência para se chegar em um nível de maturação tecnológica
TL-6 visando um produto biotecnológico comercial.

Palavras-Chave: Controle biológico; Sclerotium rolfsii; Trichoderma spp.

Introdução
Culturas olerícolas no Amazonas são afetadas por diversas doenças
causadas por patógenos habitantes do solo. Neste ambiente, o controle é difícil

443
porque muitos patógenos produzem estruturas de resistência, que podem
sobreviver por anos, mesmo na ausência de plantas hospedeiras. Além disso,
há o alto custo dos fungicidas, o desenvolvimento de resistência, consequências
indesejáveis do uso desses produtos aos organismos não alvos e o aumento das
preocupações com relação ao ambiente e à saúde do solo (Panth et al. 2020).
Doenças causadas por fungos habitantes do solo ocorrem em reboleiras
e estão diretamente relacionadas com a densidade de inóculo (Barakat et al.
2006). Rotação de culturas reduz o potencial de inóculo no solo, porém, após o
cultivo de uma espécie suscetível, o potencial de inóculo se recupera
rapidamente, e a doença volta aos níveis altos, mesmo após períodos longos de
rotação (Boine et al. 2014; Brantner e Chanda 2021).
O controle biológico tem se mostrado como uma das melhores alternativas
no manejo de doenças de plantas e usado no controle de microrganismos
patógenos habitantes do solo e nematoides (Brantner e Chanda 2021). Dos
biocontroladores utilizados, grande parte das aplicações têm sido com diferentes
isolados de Trichoderma spp. Comercialmente no Brasil, 34 produtos para
controle biológico à base de Trichoderma spp., estão registrados no Ministério
da Agricultura, Pecuária eAbastecimento (Agrofit 2021).
Isolados de Trichoderma spp. competem com os patógenos por
nutrientes, espaço, produzem metabólitos que modificam as condições
ambientais, ativam mecanismos de defesa e promovem o crescimento das
plantas (Benítez et al. 2004).Estes mecanismos diretos ou indiretos podem agir
coordenadamente e sua importância no processo do controle biológico depende
do isolado de Trichoderma spp., do fungo antagonista, da cultura hospedeira e
das condições ambientais como disponibilidade de nutrientes, pH e temperatura.
No estado do Amazonas, o fitopatógeno Sclerotium rolfsii causa doenças
em hospedeiras como pimentão (Capsicum annuum L.), tomate (Lycopersicum
esculentum Mill.) e cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal.). As perdas causadas
pela podridão-de-Sclerotium podem chegar a mais de 50% (Fery e Dukes Sr.
2002). No Brasil, apesar da escassez de dados sobre perdas na produção
decorrentes dessas doenças, estas são consideráveis, pois muitas vezes
atingem agricultores familiares sem muitos recursos para combater.
Um dos principais impactos deste trabalho está relacionado ao
desenvolvimento de um bioinsumo à base de Trichoderma spp. que contribuirá

444
para o controle biológico na produção de hortaliças no Amazonas. Há também
um impacto econômico e ambiental relacionado à adoção de controle biológico
pelos agricultores com consequente redução de gastos com a aquisição de
defensivos agrícolas aliadoa uma produção orgânica, o que agrega valor aos
produtos, pois o controle biológico garante a produção de alimentos seguros.
Para os agricultores, permitirá um melhor manejo das doenças, ampliando a
possibilidade do aumento de renda.
Os objetivos desse trabalho foram selecionar isolados de Trichoderma
eficientes no controle da podridão-de-Sclerotium (Sclerotium rolfsii) em tomateiro
para utilização como biofungicida.

Material e Métodos
A pesquisa foi desenvolvida nos laboratórios de fitopatologia, do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia - Inpa, e na Estação Experimental Alejo von
derPahlem, do Inpa, em Manaus. O isolado de Sclerotium rolfsii e seis isolados
de Trichoderma spp. foram obtidos na Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do Inpa e foram identificados seguindo os protocolos
específicos (Bric et al. 1991; Carbone e Kohn 1999; Blin et al. 2021; Cai e
Druzhinina 2021).
Foi avaliada a capacidade de controle da podridão-de-Sclerotium com
isolados de Trichoderma spp. em tomateiro em um experimento fatorial em
blocos casualizados, com quatro repetições, sendo seis isolados (T-1 a T-6) de
Trichoderma e duas doses (15 g e 30 g de inóculo por cova) com três
testemunhas (T-7, T-8 e T-9), descritos na Tabela 1, com avaliações da
incidência da doença aos 15, 28 e 70 dias após o transplante das mudas.
Cada unidade experimental foi constituída por parcela com 15 plantas (3
fileirascom 5 plantas), com 4 repetições, totalizando 60 plantas por tratamento-
dose (Dose 1= 15 g; Dose 2 = 30 g). Nos tratamentos testemunha (T-7 e T-8)
foram avaliadas apenas a dose comercial dos produtos, totalizando 60 plantas
cada tratamento e o mesmo para a testemunha sem controle (T-9), foram 4
unidades amostrais com 15 plantas cada, totalizando 60 plantas. A adubação foi
orgânica e química e baseada nas análises do solo, realizadas no Inpa. O inóculo
de S. rolfsii foi preparado em arrozhidratado por imersão em água e autoclavado
(2x) em sacos de polipropileno. Dois discos (0,5 cm de diâmetro) de colônia

445
foram transferidos para cada saco e incubadopor 20 dias, a 26 ºC, e inoculado
no solo 15 dias antes do plantio, para uniformizar o crescimento do fungo. O
inóculo dos isolados de Trichoderma spp. cresceu em meio Czapek-Dox
conforme Rezende (2017) e depois inoculado no arroz nas mesmas condições.

Resultdos e Discussão
Identificação dos isolados de Trichoderma
A Tabela 1 relaciona o material biológico utilizado e identificado além do
fungicida comercial.
Tabela 1: Material biológico e fungicida comercial.
Tratamento Isolado Espécie
T-1 INPA 2473 Trichoderma endophyticum
T-2 INPA 2951 Trichoderma asperelloides
T-3 INPA 2957 Trichoderma rugulosum
T-4 INPA 2959 Trichoderma asperellum
T-5 INPA 2961 Trichoderma asperellum
T-6 INPA 2475 Trichoderma albovelutina
T-7 Biocontrolador Tricho-turbo ® (Trichoderma asperellum) (Biovalens
comercial Ltda.)
T-8 Fungicida Metiltiofan® (tiofanato-metílico) (Sipcam Nichino Brasil
S.A.)
T-9 Testemunha Sem controle da doença

Apesar de ocorrer a aplicação de doses diferentes (D-1 = 15g inóculo e

D-2 = 30g), houve diferença significativa entre as doses apenas para os
Tratamento 3.2 e 2.2, ambos com a dose mais reforçada e mantendo o controle
na incidência da doença em torno de 22%. O tratamento T-8 foi superior aos
demais tratamentos e os isolados Inpa ficaram agrupados de maneira
intermediária com as diferentes doses, pois não diferenciaram entre si e foram
inferiores estatisticamente aos demais tratamentos. Notar o desempenho dos
isolados INPA comparado com o biocontrole comercial (T- 7), o que demonstra
o potencial dos isolados locais, muito provavelmente pela adaptação às
condições do solo.

446
Tabela 2. Incidência de podridão-de-esclerócio em tomateiros tratados com doses de 15 g e 30
g de inóculo de Trichoderma (arroz colonizado) aplicado na cova, no momento do transplante
das mudas. onde: (T-1 INPA 2473; T-2 INPA 2951; T-3 INPA 2957; T-4 INPA 2959; T-5 INPA
2961; T-6 INPA 2475; T-7 Biocontrolador comercial; T-8 Fungicida; T-9 Testemunha).
Tratamento Plantas infectadas (%)SK (p<0.05)
T-8 7% A
T-3.2 20% A
T-2.2 22% A
T-4.1 38% B
T-4.2 40% B
T-5.1 42% B
T-3.1 43% B
T-6.2 43% B
T-5.2 47% B
T-1.2 48% B
T-2.1 52% B
T-6.1 52% B
T-7 60% B
T-1.1 65% B
T-9 65% B
Letras iguais indicam que não há diferenças significativas em teste Scott Knott (p< 0,05).

De maneira geral, houve uma distribuição equitativa da eficiência entre as

doses diferentes quando comparados os tratamentos, destacando-se os dois
com doses reforçadas. Quando se analisa somente os tratamentos,
independente das doses aplicadas, os tratamentos T-3.2 e T-2.2, as doses
maiores (30 g) obtiveram as menores incidências. Os outros tratamentos não
apresentaram diferenças significativas. Para os tratamentos T-4 e T-5 ocorreu
ao contrário. Desta forma, há a necessidade de aprimorar qual dose correta pode
ser aplicada, o que pode indicar o uso da menor dose, pensando do ponto de
vista econômico. Mas novos experimentos determinarão as concentrações de
esporos nas soluções de cultura a ser aplicadas futuramente, visando à
aplicação comercial.
Após 70 dias, a incidência da doença variou de 7 casos de incidência (T-
8) a 79 plantas infectadas (T-1) o que demonstrou uma variabilidade quanto à
capacidade de controle dos isolados, pois isolados de Trichoderma spp.
apresentam grande variação genética inter e intraespecífica com relação à
produção de metabólitos ou mecanismos envolvidos na inibição de patógenos
(Shanmugam et al. 2008). Quandose analisa em termos absolutos, tende-se a
considerar que o tratamento T-7 bem inferior e menos eficiente do que os
isolados (T-1 a T-6).
Quando comparadas as relações entre os casos de incidência e o total de
plantas analisadas pelo teste Scott Knott, o tratamento com fungicida (T-8)

447
apresentou a menor relação de plantas infectadas (7/30), correspondendo a 12%
do total das plantas do tratamento. O isoladodo tratamento T-3 apresentou uma
média de 43% de incidência da doença ao longo do período de avaliação, a
menor entre os isolados testados. O tratamento com Trichoderma comercial
apresentou 62% de suas plantas infectadas (37/60). O tratamento T-1
apresentou 79/120 plantas infectadas (66%), a maior média de incidência ou a
menor eficiência apresentada (Figura 1).

Figura 1. Incidência de podridão-de-sclerotium em tomateiro cultivado em solo infestado com

Sclerotium rolfsii e tratado com isolados de Trichoderma spp. aos 70 dias do transplante.
Onde: (T-1 INPA 2473; T-2 INPA 2951; T-3 INPA 2957; T-4 INPA 2959; T-5 INPA 2961;
T-6 INPA 2475; T-7 Biocontrolador comercial; T-8 Fungicida; T-9 Testemunha). Letras iguais
indicam que não há diferenças significativas em teste Scott Knott (p< 0,05).

Ao fim da avaliação somente o tratamento com fungicida (Metiltiofan® -T-

8) foisuperior aos demais no controle da doença. Porém, percebe-se uma ligeira
superioridade dos tratamentos envolvendo quase todos os isolados testados de
Trichoderma (T-3, T-2 e T-4) quando comparados ao Trichoderma comercial (T-
7).
Os isolados T-5, T-6 e T-1 apresentaram baixa eficiência no experimento
realizado quando comparado aos demais isolados. Esses resultados
demonstram a potencialidade dos outros isolados (T-3, T-2 e T-4) para o
controle da doença em tomateiro sob condições de solos amazônicos. Ainda há
muito trabalho no sentido de melhorar a eficiência desses isolados, além de
proporcionar novas formas de aplicação (solução com concentração de esporos

448
pré-determinada, por exemplo), além de entender as condições ambientais de
solo que proporcionem um crescimentoe ação antagonista melhor.
O experimento foi conduzido por 70 dias de avaliação no controle da
doença, porém também ocorreram avaliações prévias aos 15 e 28 dias. Nessas
duas primeiras avaliações, o tratamento com Trichoderma comercial (T-7) se
apresentou mais eficiente que os isolados do Inpa e ainda houve mais duas
reaplicações no tratamentoT-7 conforme recomendação do fabricante a cada 10
dias ao longo do experimento, conforme recomendação do fabricante. Nesse
sentido, percebe-se que o biocontrole comercial não mantém a eficiência ao
longo do tempo, necessitando de reaplicações, mas diminuindo a eficiência ao
final do experimento. Para os seis isolados, não houvereaplicações dos isolados
Inpa para se igualar ao T-7. No entanto, a não reaplicação mostrou a
potencialidades dos isolados testados em relação a resiliência no solo. Pois,em T-
7 com reaplicação, houve um decaimento da eficiência quando comparado aos
demais Trichoderma que não forma reaplicados, especialmente após 21 dias de
tratamento.
Quando se analisa a evolução dos tratamentos de controle do
fitopatógeno, percebe-se um decaimento no controle. O tratamento com
Trichoderma comercial diminuiu a eficiência após 28 dias em relação ao controle
da doença, mesmo com reaplicações a cada dez dias. Ao se analisar a evolução,
o tratamento T-3 esteve sempre entre os melhores tratamentos e termina o
experimento apenas inferior ao fungicida químico (T8) (Figura 2).

Figura 2. Incidência de podridão de sclerotium em tomateiros cultivados em solo infestado

com Sclerotium rolfsii e tratados com isolados de Trichoderma spp.

449
 Na avaliação do efeito dos tratamentos na produção de frutos verificou-se
queo tratamento T-8 e o T-3.2, os mesmos que promoveram melhor controle da
doença, e apresentaram uma produção estatisticamente superior aos demais.
Entre os Trichoderma estudados, novamente o T-3 apresentou a melhor
produção média de tomate (kg), demonstrando o seu potencial (Figura 3). Todos
os demais tratamentos ficaram inferiores. Quando se compara a incidência, os
melhores tratamentos no controle, foram os mais produtivos.

Figura 3. Produção de frutos em tomateiros tratados com isolados de Trichoderma e cultivados

em soloinfestado com Sclerotium rolfsii. onde: (T-1 INPA 2473; T-2 INPA 2951; T-3 INPA 2957; T-
4 INPA 2959;T-5 INPA 2961; T-6 INPA 2475; T-7 Biocontrolador comercial; T-8 Fungicida; T-9
Testemunha). a,b significam que letras iguais nos tratamentos não diferem significativamente em
teste Scott Knott a 5%.

Conclusão
O isolado do tratamento T-3 apresentou a melhor performance? como
controle biológico nas condições testadas, mostrando-se potencialmente
promissor.

Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)
pela assistência financeira via Edital: Edital N. 008/2021 - PROSPAM/FAPEAM.
Projeto: Isolados de Trichoderma spp. para o controle de doenças em cultivos
de interesse econômico no estado do Amazonas.

450
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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
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Soybean productivity with Trichoderma asperellum seed

treatment in different regions of the Brazilian Cerrado

1 1
*Chagas Junior, Aloisio Freitas , Chagas, Lillian França Borges

1
Universidade Federal do Tocantins
E-mails: [email protected]

Resumo

The purpose of this study was to evaluate the efficiency of the product containing
Trichoderma asperellum 201 in soybean field productivity in different regions of the
Brazilian Cerrado. Thirty-five experiments were conducted in the states of Bahia and
Tocantins, in different municipalities, in the 2017/2018, 2018/2019 and 2019/2020
seasons. The treatments used were the seed treatment with T. asperellum and a control
(without inoculation of Trichoderma). The seeds were inoculated (TS) with product
containing T. asperellum, at a dose of 5 g per kg of seeds, formulated with a minimum
concentration of 2 x 108 CFU g-1, with graphite as an inert material in the formulation. In
all fields in the states of Bahia and Tocantins, positive effects (p<0,05) of inoculation of
the T. asperellum were observed in the productivity of different soybean cultivars. In the
Bahia state fields, productivity gains varied between seasons, with an average
productivity gain of 8.01% seen for the 2017/2018 crop, 3.97% for the 2018/2019 crop,
and 9.23% for the 2019/2020 crop. In Tocantins, the average productivity, considering all
experiments, was 13.02%.

Palavras-chave: Plant growth promoter, Fungus, Glycine max (L.) Merrill, Productions.

Introdução

Soybean (Glycine max (L.) Merrill) production is one of the economic activities
that has grown the most in recent years in Brazil (Sousa e Bittencourt, 2019). Represents
the main Brazilian agricultural commodity, its importance in the economy is since Brazil
is the largest exporter of the complex (grain, bran, and oil) and the first world producer
(Conab, 2020).
The Matopiba region is an extremely important agricultural frontier in Brazil. Over
the past ten years, Matopiba has accounted for almost 10% of the country's grain
production, and its three main products - soybeans, corn, and cotton - have at least
doubled their production in this period (Input, 2021; Embrapa, 2021).

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The increase in the world’s population and climate change represents a challenge
for global agricultural production. There is a need to intensify agricultural production in a
sustainable way and find solutions to combat abiotic stress, pathogens, and pests.
Plants are associated with complex microbiomes, which can be defined as the
set of genes found in association with organisms that colonize a given environment
(Murillo-Cuevas et al., 2019). Growth-promoting microorganisms can be useful to
mitigate modern agriculture challenges in the coming years that aim to increase
sustainable food production, with proper environmental protection (Ferreira et al., 2018).
The microbiome potentially to promote plant growth and vegetable organism
tolerance to phytopathogen parasitism and may represent a promising sustainable
solution to improve crop yield. Among the several microorganisms found naturally in the
soil, fungal species of the Trichoderma genus figure out as the most studied and a are
known components of biofungicides (Karaoglu et al., 2018; Alekseeva et al., 2019).
The Trichoderma species are classified as saprophytes, free-living that can live
both in the soil, especially in tropical regions, eventually endophytic, with asexual
reproduction, having their importance being proven for use in agriculture. They are
usually studied as biocontrol agents (Monte et al, 2019; Ramada et al., 2019; Pascholati
et al., 2019) and present plant growth promoting activities (Daz et al., 2017; Woo e Pepe,
2018; Mendoza-Mendoza et al., 2018). In plants, some Trichoderma strains produce
secondary metabolites such as 3-indoleacetic acid (IAA), which acts in promoting the
growth of vegetative parts (Chagas et al., 2017a).
T. asperellum has been reported as a plant growth promoter through its
phosphate solubilization capacity and indole acetic acid (IAA) synthesis, with a positive
effect on increasing biomass, nitrogen content, nodulation and productivity, using
granulated formulation (Chagas Junior et al., 2019a,b).
The promotion of plant growth by the action of Trichoderma is complex and
involves biochemical processes, enzyme production (Monte et al., 2019; Ramada et al.,
2019), production of hormones and growth factors, besides the provision of nutrients,
mainly phosphates. The ability of such microorganisms to perform phosphate
solubilization has been adopted to replace or reduce the use of soluble phosphate
fertilizers (Chagas et al., 2017a; Bononi et al., 2020).
Brazil has a huge potential for production and use of inoculants and biopesticides,
however, among the aspects that justify the low exploration of this sector, is the limited
availability of commercial products based on Trichoderma legally registered in the
Ministry of Agriculture, Livestock and Supply - MAPA (Agrofit). Even though in recent
years legal regulations have promoted a broader adequacy of these products in relation
to conventional chemicals, important limitations still remain, such as: isolated with poor
adaptation to different agroecosystems (Bernardo et al., 2019), as well as formulations
more appropriate for use in seed inoculation.
Seeds can be treated with different products, such as chemicals, fungicides, and
insecticides, and formulated based on fungi and bacteria for biological control and
promotion of plant growth. The use of Trichoderma-based formulas for seed treatment
has been widely studied, being used as a biocontrol agent and to promote plant growth.
There are different formulations based on Trichoderma in the national and international
market that are used according to the purpose of the treatment, highlighting the seed
treatment considered less costly and more effective.

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Therefore, the objective of this work was to evaluate the efficiency of the
Trichoderma asperellum, in powder formulation, on soybean productivity in the field, in
different regions.

Material e Métodos

Thirty-five experiments were conducted in the Brazilian states of Bahia and

Tocantins, in different municipalities, in the seasons of 2017/2018, 2018/2019 and
2019/2020, in the period from october to march, with different edaphoclimatic conditions,
in Macro-regions 4 (Edaphoclimatic Region 404: Municipalities of Cariri, Crixas, Gurupi,
Ipueiras, Jaú do Tocantins and Formoso do Araguaia, Tocantins; edaphoclimatic region
405: Municipalities of Barreiras, Correntina, Formoso do Rio Preto, Luiz Eduardo
Magalhães and São Desidério, Bahia) and 5 (edaphoclimatic regions 501: Municipalities:
Bom Jesus, Santa Maria, Fortaleza do Tabocão, Darcinópolis, Piraquê, Barrolândia and
Porto Nacional, Tocantins) (MAPA Normative Instruction No 1 of 02/02/2012, according
to the locations in Table 1 and Figure 1.
Table 1. Location and weather conditions of the different experiments with Trichoderma
asperellum in soybean seeds treatment.
State Local Types *Climate / Temp./ Rain. Location

of soil

1 DYL Aw / 25.2 oC / 571.2 mm 11o46'52,8''S 45o49'59''W

2 DYL Aw / 25.4 oC / 968.8 mm 11o78'13''S 45o83'32''W

3 DYL Aw / 24.9 oC / 932.2 mm 12°52'34.0"S 45°59'52.7"W

4 DYL Aw / 26.4 oC / 935.7 mm 11°51'41.2"S 46°14'41.2"W

Bahia
5 DYL Aw / 26.9 oC / 686.2 mm 11°50'30.4"S 46°20'48.3"W
2017/2018
6 DYL Aw / 27.5 oC / 653.7 mm 11 46'27.0"S 46°13'24.6"W
seasons
7 DYL Aw / 26.0 oC / 103.2 mm 10o76'22''S 45o66'30''W

8 DYL Aw / 25.1 oC / 1019.7 mm 10o70'19''S 45o69'03''W

9 DYL Aw / 25.8 oC / 1140.5 mm 10o34'47''S 45o41'06''W

10 DYL Aw / 25.8 oC / 1006.0 mm 10o63'76''S 45o40'54'W '

11 DYL Aw / 25.6 oC / 634.8 mm 13°19'30.8"S 45°59'19.4"W

Bahia
12 DYL Aw / 25.2 oC / 649.9 mm 13°07'14.8"S 46°02'10.9"W
2018/2019
13 DYL Aw / 25.6 oC / 643.8 mm 12°31'06.5 "S 46°09'21.8"W
seasons
14 DYL Aw / 25.2 oC / 470.9 mm 12o77'06''S 46o03'15''W

15 DYL Aw / 25.3 oC /697.0 mm 13o44'09''S 46o14'15''W

Bahia
16 RQo Aw / 27.0 oC / 604.0 mm 13o45'10''S 46o12'16''W
2019/2020
17 DYL Aw / 25.6 oC / 906 mm 11o16'13''S 45o59'35''W
seasons
18 DYL Aw / 24 oC / 1028 mm 12o14'41''S 45o50'02''W

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19 DYL Aw / 25.1 oC / 863 mm 11o48'04''S 45o50'27''W

20 LVAd Aw / 28.1 oC / 1063.6 mm 11°47'45.9"S 49°06'08.4"W

21 LVAd Aw / 28.1 oC / 795.5 mm 08o58'09''S 48o00'21''W

22 LVAd Aw / 28.1 oC / 838.4 mm 09º03'23''S 48o04'25''W

23 LVAd Aw / 27.6 oC / 747.5 mm 08o57'00''S 47o55'50''W

24 LVAd Aw / 28.1 oC / 848.5 mm 11°54'46.0"S 49°03'36.2"W

25 LVAd Aw / 27.9 oC / 947.8 mm 11°48'57.2"S 49°07'54.9"W

26 LVAd Aw / 27.4 oC / 596.4 mm 12o21'37''S 48o37'17''W

Tocantins
27 LVAd Aw / 28.5 oC / 939.9 mm 11o06'30''S 48o58'53''W
2019/2020
28 DRYL Aw / 27.2 oC / 732.9 mm 10°32'24.7"S 48°20'13.4"W
seasons
29 DRYL Aw / 28.7 oC / 1096.2 mm 10°30'42.6"S 48°18'47.5"W

30 OQN Aw / 28.4 oC / 977.2 mm 9°06'37.4"S 48°36'06.8"W

31 OQN Aw / 28.4 oC / 953.9 mm 9°04'49.6"S 48°34'57.0"W

32 DRL Aw / 26.8 oC / 1330.1 mm 6°45'25.2"S 47°47'53.3"W

33 PAd2 Aw / 27.4 oC / 1291.9 mm 6°42'57.6"S 48°19'47.2"W

34 DRYL Aw / 28.4 oC / 914.6 mm 11°08'58.4"S 48°28'54.9"W

35 DRYL Aw / 28.3 oC / 925.3 mm 9°58'19.5"S 48°32'12.8"W

*Weather stations near each region: INMET (2021) and AGRITEMPO (2021). Climate according to Köppen
e Geiger. Temp. = Average temperature for the period. Rain. = Average rainfall for the period. DYL =
Dytrophic Yellow Latosol. DRL = Dytrophic Red Latosol. DRYL = Dystrophic Red Yellow Latosol. RQo = Ortic
Quartzrenic Neosol. YU2 = Yellow Ultisol 2.

Figure 1: Distribution of experiments in the states of Tocantins and Bahia, Brazil.

In the areas where the experiments were installed, the experimental plots had a
minimum of nine planting lines, 6.0 x 4.0 m, and 0.5 m of spacing between the planting
lines.

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In the different areas where the experiments were implemented, fertilization

followed the recommendations for the different locations and harvest, being carried out
by the owners of the areas, using different chemical fertilizers and formulations.
Different soybean cultivars were used, chosen by the farms. In all experiments
the seeds were chemically treated with different fungicides and insecticides, with a
product based on methyl thiophanate and fipronil, as recommended by the
manufacturers. In all experiment’s soybean seeds were previously inoculated with
rhizobium, with bacteria belonging to the species Bradyrhizobium japonicum (SEMIA
5079 and SEMIA 5080), using dosages according to the recommendations of the
manufacturers, ranging from 400 to 500 mL per ha.
The T. asperellum 201 strain was isolated from Cerrado soil in Tocantins. A
preliminary identification was made according to the morphological characteristics based
on specialized bibliography and with the aid of an optical microscope. Then, the genetic
characterization was performed by sequencing the TEF (translation elongation factor)
region and identified by the access codes in GenBank (Species Identification: T.
asperellum GJS 04-217; GenBank access: DQ381958; Similarity: 99%).
The treatments used were the seed inoculation of Trichoderma asperellum 201
and an absolute control (without inoculation of Trichoderma). The seeds were inoculated
with T. asperellum 201, at a dose of 5 g per kg of seeds, formulated with a minimum
concentration of 2 x 108 CFU g-1, with graphite as an inert in the formulation. The T.
asperellum was mixed in the seeds on the day of planting, after the inoculation of
rhizobium, being made in a seed mixing inoculator.
All the experiments had a random blocks design with four repetitions. During the
crop development, all the necessary phytotechnical and phytosanitary management
were done as recommended by Henning (2009).
Grain production was obtained in the four central lines rows of each plot with a
useful area of 10 m2, after the physiological maturation of the plants. The harvest was
carried out manually, harvesting all the plants from the useful area, and the grains were
processed in threshing machines, adjusting the grains moisture to 13%. Afterwards, the
productivity was estimated in kg per hectare.
The hypothesis of equality between the means of the two treatments evaluated
was made by the F test of the analysis of variance for p = 0.05, using the SISVAR
statistical program (Ferreira, 2019). Comparison of means was performed only at
inoculation or not within each experiment, with no comparison between places or
seasons.

Resultados e Discussão

Bahia 2017/2018
In the experiments in Bahia, 2017/2018 crop, in all treatments with T. asperellum
the productivity was significantly higher (p<0.05) compared to the control without
inoculation (Table 2). In these different areas, productivity gains ranged from 3.37 to
21.49% in relation to non-inoculation control, with an average increase in productivity, in
relation to control treatment, of 8.01%

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Table 2. Soybean productivity with Trichoderma asperellum in seeds treatment, in

different localities in Bahia, Brazil, 2017/2018 season1
Location Cultivar Treatments Productivity kg ha-1

T. asperellum 4100 a
1 M 8349 ipro Control 3750 b
CV (%)2 1.32
T. asperellum 4227 a
2 M 8349 ipro Control 3891 b
CV (%) 1.21

T. asperellum 5606 a
3 M 8349 ipro Control 5369 b
CV (%) 0.75

T. asperellum 5157 a
4 M 8349 ipro Control 4989 b
CV (%) 0.77

T. asperellum 4037 a
5 M 8372 ipro Control 3323 b
CV (%) 2.03

T. asperellum 2828 a
6 M 8372 ipro Control 2678 b
CV (%) 1.47
T. asperellum 4460 a

7 M 8349 ipro Control 4217 b

CV (%) 1.06
T. asperellum 3860 a
8 M 8349 ipro Control 3633 b
CV (%) 1.09
9 M 8349 ipro T. asperellum 4447 a

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Control 4146 b
CV (%) 0.99
¹
Means followed by the same small letter, in the columns, for each location/experiment, do not
differ between themselves by the Tukey test at 5%.2 Coefficient of variation.

Bahia 2018/2019
For the 2018/2019 crop, in all treatments with T. asperellum the productivity was
significantly higher (p<0.05) compared to the control without inoculation (Table 3). In
these different areas productivity gains ranged from 2.28 to 5.04% compared to the
control without inoculation, with the average increase in productivity compared to the
control treatment being 3.97%.

Table 3. Productivity of soybean with Trichoderma asperellum in seeds treatment, in

different locations in Bahia, Brazil, 2018/2019 season1
Location Cultivar Treatments Productivity kg ha-1
T. asperellum 4673 a
10 Dow 5G8015 ipro Control 4472 b

CV (%)2 0.71
T. asperellum 4541 a
11 FTR 3178 ipro Control 4323 b

CV (%) 0.77
T. asperellum 4078 a
12 CD 2851 ipro Control 3899 b
CV (%) 0.37
T. asperellum 5706 a
13 CD 2851 ipro Control 5579 b
CV (%) 0.19
¹
Means followed by the same small letter, in the columns, for each location/experiment, do not
differ between themselves by the Tukey test at 5%.2 Coefficient of variation.

Bahia 2019/2020
For the 2019/2020 crop, in all treatments with T. asperellum the productivity was
significantly higher (p<0.05) compared to the control without inoculation (Table 4). In
these different areas, the productivity gains ranged from 1.89 to 25.55% in relation to the

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control without inoculation, with the average increase in productivity, in relation to the
control treatment, of 9.23%

Table 4. Productivity of soybean with Trichoderma asperellum in seeds treatment, in

different locations in Bahia, Brazil, 2019/2020 season1
Location Cultivar Treatments Productivity kg ha-1
T. asperellum 4160 a
14 FTR 2128 ipro Control 4065 b
CV (%)2 0.87
T. asperellum 4298 a
15 FTR 2128 ipro Control 4218 b
CV (%) 0.67
T. asperellum 4725 a
16 M 8349 ipro Control 4507 b
CV (%) 0.56

T. asperellum 2449 a
17 M 8349 ipro Control 2196 b
CV (%) 2.30

T. asperellum 3871 a
18 M 8349 ipro Control 3084 b
CV (%) 3.48

T. asperellum 3794 a
19 M 8349 ipro Control 3603 b
CV (%) 1.05
¹
Means followed by the same small letter, in the columns, for each location/experiment, do not
differ between themselves by the Tukey test at 5%.2 Coefficient of variation.

Tocantins 2019/2020
For the 2019/2020 crop, in Tocantins, in all treatments with T. asperellum the
productivity was significantly higher (p<0.05) compared to the control without inoculation
(Table 5). In these different areas, productivity gains ranged from 7.37 to 29.46% in
relation to the control without inoculation, with an average increase in productivity, in
relation to control treatment, of 13.02%

Table 5. Productivity of soybean with Trichoderma asperellum in seeds treatment, in

different locations in Bahia, Brazil, 2019/2020 season1

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Location Cultivar Treatments Productivitykg ha-1

T. asperellum 4004 a

20 CZ 58B28 Control 3694 b

CV (%)2 1.89
T. asperellum 5473 a

21 DM 82i78 ipro Control 4785 b

CV (%) 2.26
T. asperellum 3957 a

22 FTR 4288 Control 3653 b'

CV (%) 1.54
T. asperellum 4655 a
DM 82i78 ipro
23 Control 4211 b
ipro
CV (%) 2.94
T. asperellum 4252 a
24 N 7660 Control 3911 b
CV (%) 0.89
T. asperellum 3280 a
25 M 8644 ipro Control 2806 b
CV (%) 1.71
T. asperellum 2956 a
26 M 8644 ipro Control 2634 b
CV (%) 2.63
T. asperellum 3398 a
27 LG 601777 Control 3059 b
CV (%) 1.69
T. asperellum 3699 a
28 Bonus Control 3357 b

CV (%) 2.09
T. asperellum 3645 a
29 Challenge Control 3009 b
CV (%) 2.94
T. asperellum 3006 a
30 Extrema Control 2322 b
CV (%) 4.45

460
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T. asperellum 3675 a
31 Bonus Control 3119 b

CV (%) 2.97
T. asperellum 2891 a
32 M 8644 irpo Control 2557 b

CV (%) 6.33
T. asperellum 3972 a
33 M 8644 irpo Control 3591 b

CV (%) 1.34
T. asperellum 4464 a
34 TMG 1180 Control 4126 b

CV (%) 1.32
T. asperellum 3585 a
35 Challenge Control 3339 b
CV (%) 1.71
¹
Means followed by the same small letter, in the columns, for each location/experiment, do not
differ between themselves by the Tukey test at 5%.2 Coefficient of variation.

In all regions in the State of Bahia and Tocantins, positive effects of inoculation of
the T. asperellum were observed in the productivity of different soybean cultivars.
Regarding the Bahia state, productivity gains varied between seasons, with an average
productivity gain of 8.01% for the 2017/2018 crop, 3.97% for the 2018/2019 crop, and
9.23% for the 2019/2020 crop. For Tocantins the average productivity, considering all the
experiments, was 13.02%. These increases in productivity would lead to possible
economic gains with increased productivity.
The positive responses for productivity, in different regions and different soybean
cultivars, ware related to the ability of the fungus Trichoderma to promote vegetable
growth through different mechanisms, such as the production of phytohormones and
nutrient solubilization capacity (Chagas et al., 2017c; Bononi et al., 2020). These effects
can bring improve in plant development, increase of seedling emergence rate, root
system, aerial part, chlorophyll content, size and/or number of flowers and/or fruits
(Mendoza-Mendoza et al., 2018). The positive effects of Trichoderma on roots increase
the absorption area, favoring the nutrient use efficiency, which consequently improve
yields.
The growth promotion effect is also attributed to the role of Trichoderma to
solubilize phosphates and micronutrients, mediated by the release of siderophores and
secondary metabolites, or by modifications in the content of ethylene and auxins which
stimulate plant development (Silva et al., 2019)
Some authors have reported positive results with Trichoderma inoculation in
soybean, like Chagas et al. (2017a), Gonçalves et al. (2018) and Chagas Junior et al.

461
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

(2019a, b) who concluded that Trichoderma acts as a promoter of vegetable growth

positively affecting biomass and soybean productivity.
Plants containing this microorganism associated with their roots or in the
rhizosphere tend to improve their ability to survive and absorb nutrients in adverse
situations. Consequently, these plants have a productive advantage over those with an
absence of Trichoderma in their roots (Contreras-Cornejo et al., 2016).
Some of the factors that determine the success of Trichoderma inoculation
include abiotic and biotic conditions. Therefore, selected isolates to compose inoculants
and formulations need to be able to produce satisfactory results under field conditions
with the ability to promote vegetable growth, resulting in increased productivity. This is
related to the fact that establishment and development under field conditions are critical
for the microorganism because they are exposed to different reactions from the host and
the environment, which can result in more effective control or promotion of a more
variable vegetable growth than can be achieved with chemicals. In the current study, the
use of T. asperellum 201 showed significant results regarding the productivity of the
different cultivars in the different regions and provided results regarding the benefits for
soybean growing areas with the use of this formulation in soybean seed inoculation.
These positive responses in soybean yield in different regions may be related to
adaptation to specific biotic and abiotic conditions, from which the isolate T. asperellum
201 was isolated. Factors such as temperature, soil type, aeration, pH, humidity, and
nutrients interfere in the development of fungi of this genus (Silva et al., 2020). Thus,
bioagents collected in the same environment or under similar climatic conditions as
where they will be used are more likely to adapt and be more effective.
The experiments, in different regions and crops, showed the positive effect of the
product containing T. asperellum with potential as a vegetable growth promoter, and
targeting for use of inoculant in this powder formulation, as a vegetable growth promoter
inoculant in strategic crops such as soybeans, according to the results of this research,
achieving new areas in potential for the use of the product (inoculants).
The use of the product, with active ingredient based on T. asperellum 201 as a
plants growth promoter, to increase agricultural production will probably be one of the
most important strategies for the agricultural sector. This is due to the emerging demands
for reducing the dependence on chemical fertilizers, in addition to pesticides, and the
need for sustainable agricultural development.
The results showed in the present study demonstrate that this fungus, a promoter
of vegetable growth, presents itself as a technology for soybean cultivation and the effect
on productivity. Thus, this microorganism, used as a growth-promoting inoculant, could
have an important impact in achieving sustainable agriculture and protecting the
environment, as well as the formulation, in the ease of application in the treatment of
soybean seeds.
These effects of Trichoderma as a vegetable growth promoter have also been
reported for other crops, as for example, it has been reported that the treatment of rice,
wheat and tomato seeds with Trichoderma increases the photosynthetic rate, the weight
of the plants, the length of their roots and shoots and the number of leaves and leaf area
(Domínguez et al, 2016), as well as in the biomass increment of maize (Chagas et al.,
2017b), tomato (Rubio et al., 2017), papaya (Chagas Junior et al., 2020), rice (Chagas
et al., 2017a,b; Silva et al., 2019) and cowpea Chagas et al., 2016).

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

The benefits of the ecological processes performed by fungi of the genus

Trichoderma as a plant growth promoter have contributed to achieving sustainability in
the agricultural sector. The technology of inoculation of microorganisms, such as the
fungus Trichoderma, of biotechnological interest in agriculture is a resource of major
economic importance, besides the contribution to reducing the use and consequent
impact of agrochemicals. Sustainable agriculture requires the use of strategies that allow
for an increase in productivity without damaging the environment, opening new
perspectives to contribute to the development of new technologies, methods, and
strategies in agribusiness. The processes mediated by microorganisms become
essential in the preservation and conservation of natural resources.

Conclusões

The inoculation of soybean with the product in this formulation containing

Trichoderma asperellum 201, in the dosage of 5 g per kg of seed, showed an increase
in the productivity of soybean cultivated in the different regions in the states of Bahia and
Tocantins.
The product, with an active ingredient based on T. asperellum 201, can be
recommended as an inoculant plant growth promoter for soybeans.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Transformação genética de Trichoderma sp. com GFP e análise

de micoparasitismo contra Fusarium decemcellulare

Fernandes, Joelma dos Santos1,3; Silva, Ingride Jarline Santos2,3; Queiroz,

Claudia Afras1,3; Sousa, Thiago Fernandes2,3; Hanada, Rogério Eiji1; Silva, Gilvan
Ferreira3

1InstitutoNacional de Pesquisa da Amazônia, 2Universidade Federal do Amazonas,

3Embrapa Amazônia Ocidental.
E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
O gênero Trichoderma possui uma ampla diversidade de espécies com
capacidade de sintetizar diversos metabólitos eficazes no biocontrole de pragas
agrícolas. Além disso, estes também são capazes de agir contra outros fungos
por meio da ação micoparasitária. A utilização de linhagens transformadas com
proteínas fluorescentes é considerada uma ferramenta útil na diferenciação dos
microrganismos. Este trabalho teve como objetivo obter linhagens de
Trichoderma sp.(INPA 2475) expressando a proteína fluorescente verde (Green
fluorescent protein - GFP) para análise de micoparasitismo em Fusarium
decemcellulare transformado geneticamente com proteína fluorescente
vermelha (Red fluorescent protein - RFP). Nos resultados obtidos evidenciamos
que, o método de transformação genética mediado por polietileno glicol (PEG) é
um método eficiente. Dentre os transformantes obtidos foi selecionado um
transformante geneticamente estável, com características morfofisiológicas
semelhantes a linhagem selvagem. A linhagem transformante, assim como a
selvagem apresentou desenvolvimento mais rápido que o F. decemcellulare.Na
análise de micoparasitismo após cinco dias de cultivo in vitro as hifas dos fungos
entrelaçavam-se e em algumas regiões observou-se pareamento das hifas com
simetria mais linear quando cultivadas em meio de cultura BDA, já em meio de
cultura SNA as hifas apresentaram forma ondulada ou enrolada. Concluímos
que, a estratégia de obtenção de protoplastos e transformação do Trichoderma
sp. (INPA 2475) via PEG mostrou-se uma metodologia eficiente, com obtenção
de transformantes geneticamente estáveis. Quanto ao antagonismo foi
observado o enovelamento das hifas do transformante antagonista na interação
com o fitopatógenoindicando mecanismo típico de micoparasitismo.

Palavras-Chave: Trichoderma sp.; Transformação com GFP; Micoparasitismo

Introdução

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

O gênero Trichoderma possui uma ampla diversidade de espécies com

capacidade de sintetizar diversos metabólitos que despertam interesse
econômico, principalmente na área agronômica (Khan et al. 2020).
Metabólitos secundários produzidos por espécies deste gênero representam
uma ampla variedade de compostos químicos podendo ser voláteis, fixos intra e

468
extracelular. São responsáveis pela proteção das plantas contra patógenos,
disponibilização de nutrientes, solubilização de minerais e atividades
farmacológicas, características que conferem uma alternativa ao uso de
pesticidas (Patil et al. 2016).
Algumas espécies de Trichoderma são capazes de induzir o sistema de
defesae promover o crescimento de plantas. Conseguem crescer rapidamente,
sendo um fator favorável na competição com fitopatógenos (Pascale et al. 2017;
Sood et al. 2020; Ferreira e Musumeci 2021). Possuem capacidade de
micoparasitar outros fungos não apenas pela síntese de metabólitos importantes
para o biocontrole de fitopatógenos, mas também pela ação de interação por
meio do estrangulamento de hifas (Kubicek et al. 2011; Mukherjee et al. 2022).
Um dos obstáculos para analisar a interação planta-fungo ou antagonista-
fitopatógeno é diferenciar o(s) fungo(s) de interesse dos demais fungos
presentes noambiente (Lu et al. 2004). E para resolver esta dificuldade utilizam-
se a técnica de transformação genética com proteínas fluorescentes GFP (green
fluorescent protein) ou RFP (red fluorescent protein) (Mukherjee et al. 2022).
Estas também são chamadas de proteínas repórteres, são utilizadas como
biomarcadores na análise dainteração entre organismos de interesse (Inglis et
al. 1999; Lu et al. 2004; Armesto et al. 2012). O método tem como vantagem não
necessitar de substrato algum ou cofatores adicionais durante a análise de
interação. Os fungos expressando GFP ou RFP podem ser facilmente analisados
por meio da microscopia de epifluorescência ou microscopia eletrônica confocal
e de fluorescência (Lu et al. 2004).
O objetivo desta pesquisa foi obter linhagens de Trichoderma sp.
(CMIAINPA 2475) expressando a proteína fluorescente verde (GFP) para
utilização na análise de micoparasitismo contra fitopatógeno Fusarium
decemcellulare (CPAA-Fdc307), agente causal de superbrotamento,
transformado geneticamente com o gene dsRed que codifica RFP.

Material e Métodos
Microrganismos e Condições de Cultivo
O fungo filamentoso Trichoderma sp. (CMIAINPA 2475) foi isolado como
endófito deScleronema micranthum Ducke no Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia (INPA), Manaus/AM, Brasil. O cultivo deste isolado foi realizado em

469
meio BDA (10g/Ldextrose, 16g/L ágar e 250g/L batata) e em meio SNA (1g/L
KH2PO4, 1g/L KNO3, 0,5g/L MgSO4, 0,5g/L KCl, 0,2g/L Glicose, 0,2g/L Sacarose
e 20g/L de ágar) a 25 °C com fotoperíodo de 12 horas para análise da estrutura
das hifas e micoparasitismo.
Para o preparo da suspensão de conídios utilizada no processo de
obtenção de protoplastos foi realizada a raspagem de placas com 7 dias de
crescimento da colôniado fungo, a suspensão obtida foi colocada em meio TB3
(200g/L de sacarose, 3g/L depeptona e 3g/L de extrato de levedura) e filtrada
com gaze. Cerca de 25 mL da suspensão a 106 conídios/ml foi transferida para
um frasco com 250 mL de meio TB3e colocado sob agitação a 120 rpm, 25 ºC
durante cerca de 15h. O acesso ao patrimônio genético foi realizado de acordo
com a solicitação SISGEN cadastro de Acesso No AB6B14F.

Vetor utilizado na transformação genética de Trichoderma sp. (CMIAINPA-

2475)
Foi utilizado o vetor pSC001(GFP-higromicina), sendo que, para evitar a
sua linearização foi realizada a amplificação do cassete, que contém o gene
repórter gfp (green fluorescent protein) controlado pelo promotor PtrpC e o gene
de resistência aoantibiótico higromicina B fosfotransferase (hph) controlado pelo
promotor PtoxA- 5`UTR.
Na reação de amplificação foram adicionados cerca de 25 ng do vetor
pSC001para reação com volume final de 50 µL, sendo 1,5 µL de cada primer (10
µM) (T3 5' GCAATTAACCCTCACTAAAG 3', T7s 5'
GTAATACGACGCACTATAG 3'), 5 µL de tampão 10X (500 mM KCl; 100 mM
Tris -HCl pH 8,4; 1% Triton X-100), 1,5 μL dNTP(0,8 mM), 1U de DNA polimerase
(DNA Polimerase High Fidelity - Cellco) e água destilada. As condições de PCR:
94 °C por 2 min., 40 ciclos a 94 °C por 15 seg., 66 °C por 30 seg., 68 °C por 1
min., 68 °C por 5 min. A visualização dos produtos amplificados foi realizada por
meio de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, coradocom brometo de etídio
(etBr).

Obtenção de Protoplastos
Os protoplastos foram produzidos por meio da massa micelial obtida da
suspensão de esporos cultivados durante 15 h. A massa micelial foi filtrada e
470
lavada com 100 mL de água destilada e em seguida lavada com 10 mL de
KCl 1,2 M. Posteriormente, 500 mg de massa seca foi ressuspendida em 12,5
ml de KCl 1,2 M contendo 250 mg de Driselase (D9515 - Sigma Aldrich) e 200
mg de enzima Lysing Enzyme (L1412 - Sigma Aldrich), mantido em agitação a
80 rpm a 30 °C durante 3 a 4 horas.
O desenvolvimento dos protoplastos foi conferido por meio da
microscopia. Após digestão total da massa micelial, foi realizada a filtração dos
protoplastos em filtro de nylon estéril de 40 μm, removendo os fragmentos de
hifas. Em seguida os protoplastos foram centrifugados a 3.200 rpm durante 10
min. e descartado osobrenadante cuidadosamente para que fosse adicionado
12,5 mL do tampão STC (940 mg/L de Sacarose, 10 ml/L de Tris-HCl (1 M pH
8,0), 50 ml/L de CaCl2 1 M), repetindo o processo de centrifugação e descarte do
sobrenadante novamente. O pellet foi ressuspendido em 1 ml de STC e
transferido para um microtubo e centrifugado durante 5 min. a 5.000 rpm. E por
fim, o pellet foi novamente ressuspendido em STC, misturado cuidadosamente
e diluído para concentração de 107 protoplastos/ml.

Teste de dose letal para seleção dos possíveis transformantes

Foram testadas diferentes concentrações de higromicina B (0 µg, 100 µg,
200 µg e 300 µg) com a linhagem selvagem. Pequenos fragmentos de meio de
cultura com micélios foram colocados em placas com meio de cultura BDA
suplementado com higromicina B e cultivados durante 15 dias. As placas foram
analisadas com 3, 7e 15 dias de cultivo. E para a transformação foi escolhida
como dose legal 300 µg/mL.

Transformação genética de Trichoderma sp. (CMIAINPA 2475) via PEG

O isolado Trichoderma sp. (CMIAINPA 2475) foi transformado com o
cassete contendo GFP-higromicina (GFP-Hyg). A transformação genética foi
realizada com 100 μL da suspensão de protoplastos a 107 protoplastos/ml em
tubos de 15 ml, juntamente com 90 μL de STC e 10 μL (15 a 20 μg) do cassete
amplificado por PCR.No controle negativo foi utilizado água no lugar do DNA. O
conteúdo de cada tubo foimisturado e incubado a temperatura ambiente por 20
min. Em seguida, adicionado 1 ml de polietilenoglicol (PEG) 8000 40% em cada
tubo, misturado e incubado a temperatura ambiente por mais 20 min. Após foi
471
acrescentado 5 ml de TB3 líquido aostubos e colocados sob agitação a 80 rpm,
em overnight.
A seleção dos possíveis transformantes foi realizada pela adição de cerca
de 2,5 ml da suspensão deixada emovernight em 50 ml de meio seletivo TB3
semi-sólido (3 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de peptona, 200 g/L de sacarose
e 4 g/L de Ágar) suplementado de 300 μg/ml de antibiótico higromicina B.
Também foram preparadas placas para o controle, positivo(sem antibiótico) e
negativo (com antibiótico). Aguardou-se o desenvolvimento dos transformantes
por cerca de dois dias.

Caracterização dos Transformantes

A extração do DNA total de Trichoderma sp. CMIAINPA 2475 foi realizada
de acordocom o método de CTAB (Doyle e Doyle, 1997). Em seguida, foi tratado
com RNAse (Invitrogen), quantificado em NANODROP e gel de agarose a 0,8%.
A confirmação dos possíveis transformantes foi realizada pela detecção do gene
de resistência a higromicina-B via PCR, com os primers hph forward - 5'
TTCGATGTAGGAGGGCGTGGAT 3' e reverse - 5'
CGCGTCTGCTGCTCCATACAAG 3'. A confirmação do gene repórter gfp
ocorreu pormeio dos primers gfp forward - 5' ACGTAAACGGCCACAAGT 3' e
reverse - 5' TGCTCAGGTAGTGGTTGT 3'. Preparadas reações com volume
final de 15 μL, contendo 50 ng de DNA total dos transformantes e do selvagem
(controle), 1 μL de primers forward e reverse (0,3 μM) específico para o gene de
interesse, 1,5 μL tampão 10X (500 mM KCl; 100 mM Tris -HCl pH 8,4; 1% Triton
X-100; MgCl2 (1,5 mM)), 1,6 μL dNTP (0,8 mM), 1U de enzima Easytaq (Synapse
Biotechnology) e água destilada.As condições de PCR foram as seguintes: 94 °C
por 3 min. para desnaturação inicial,seguido de 35 ciclos a 94 °C por 30 seg., 66
°C (hph) e 56 °C (gfp) por 30 seg. para anelamento dos primers, 72 °C por 1 min.
e extensão final a 72 °C por 10 min. A quantificação foi realizada por meio de
eletroforese em gel de agarose a 1,5%.

Teste de estabilidade mitótica

A análise de estabilidade mitótica dos transformantes foi realizada por
meio decinco repicagens sucessivas em meio de cultura BDA sem antibiótico. E
então transferidas as linhagens transformadas para o meio seletivo na
472
concentração de 300 µg de higromicina B. Após este período as linhagens
transformantes foram novamente analisadas quanto às características
morfofisiológicas comparadas com a linhagem selvagem.

Detecção da proteína fluorescente verde (GFP)

O microscópio de epifluorescência Axio Imager M2 (Zeiss) do Laboratório
de Biologia Molecular da Embrapa Amazônia Ocidental foi utilizado para
detecção das proteínas fluorescentes nas linhagens transformadas.

Interação antagonista - fitopatógeno

A análise ocorreu por meio do co-cultivo dos transformantes Trichoderma
sp. (CMIAINPA-2475/GFP) e F. decemcellulare (CPAA-Fdc307/RFP) em placas
com BDA e SNA durante cinco dias, o mesmo procedimento foi realizado com
as linhagens selvagens como controle. Nas placas, entre os fungos, foram
colocadas lamínulas esterilizadas para crescimento das hifas na superfície e
posteriormente fossemobservadas em microscópio confocal Leica TCS SP8 do
Laboratório do Centro Multiusuário para Análise de Fenômenos Biomédicos
(CMABIO) da Universidade do Estado do Amazonas - UEA. Além das lamínulas
pequenos fragmentos foram retirados dos meios de cultura da região de
interação dos fungos e colocados em lâminas para análise microscópica.
O acesso ao patrimônio genético foi realizado de acordo com a solicitação
SISGEN cadastro de Acesso No AB6B14F.

Resultados e Discussão
A combinação de 250 mg de Driselase e 200 mg de enzima Lysing Enzyme
emtampão KCl 1,2 M possibilitou a digestão do micélio e obtenção eficiente de
protoplastos.
O teste de letalidade com higromicina revelou que na concentração de
100 µg o desenvolvimento ocorreu normalmente semelhante a placa sem
antibiótico, com 200 µg foi possível observar uma pequena redução no
desenvolvimento, e com 300 µg foiobservada uma alta redução do crescimento
quando comparada a dose de 200µg. O tamanho das colônias com 7 dias em
300 µg é o equivalente ao observado na placa sem antibiótico com três dias de

473
crescimento. Portanto, a concentração de 300 µg foi utilizada na seleção dos
possíveis transformantes com dois dias de crescimento.
O resultado demonstra que, esta linhagem diferentemente de muitas
espécies de Trichoderma, nas quais já foram realizados testes de antibiótico
(Mach et al. 1994;Calcáneo-Hernández et al. 2020), é capaz de se desenvolver
com o dobro ou até o triplo da concentração de higromicina B. O que chama
atenção para a possível capacidade de detoxificação de aminoglicosídeos.
No processo de transformação genética do Trichoderma sp. CMIAINPA
2475 mediado por polietileno glicol (PEG) foram obtidos transformantes
geneticamente estáveis e confirmada a presença das sequências dos genes
contidos no cassete (gfp-hph) por meio da caracterização molecular. Dentre os
transformantes um foi selecionado para análise do processo de interação in vitro,
utilizando como antagonista o isolado 2475 (figura 1A e 1D) e o fitopatógeno F.
decemcellulare CPAA-Fdc307 transformado com RFP (figura 1B e 1E).
Na análise da interação in vitro, as linhagens transformadas de
Trichoderma sp. (INPA 2475) quando comparadas à linhagem selvagem após
cinco dias de cultivo, mantiveram a capacidade de desenvolvimento rápido,
inibindo o desenvolvimento do F. decemcellulare (Figura 1C). As imagens da
microscopia mostram claramente a interação das hifas dos dois isolados
transformados (Figura 1F, 1I, 1L e 1M). As hifasde ambos entrelaçam de forma
mais alongada, havendo vários pontos onde as hifas ficam lado a lado quando
cultivadas em meio BDA (Figura 1G e 1H). Quando cultivados em meio SNA, as
hifas de Trichoderma sp. (CMIAINPA 2475) apresentaram forma ondulada ou
enrolada (Figura 1J), sendo possível observar hifas verdes enroladas fortemente
na massa de hifas vermelhas do F. decemcellulare (Figura 1L e1M).
Algumas espécies de Trichoderma são capazes de realizar
micoparasitismo (Rodríguez et al. 2021; Mukherjee et al. 2022), inclusive em
espécies de Fusarium. Conforme relatos de Amira et al. (2017), além do
pareamento de hifas do T. harzianum(Ths97) e F. solani (Fso14) foi observado o
enlace das hifas do antagonista as do fitopatógeno, havendo também a inibição
do crescimento in vitro de Fso14. A atividademicoparasitária de T. atrovirde a F.
oxysporum f. sp. lycopersici, agente causal de doença em tomateiro, com
significativa inibição do fitopatógeno 92,11% também temsido reportado (Nofal
et al. 2021).

474
 Neste trabalho observou-se o enovelamento das hifas típico de
micoparasitismo, principalmente quando o cultivo ocorre em meio SNA, porém
nas imagens analisadas não foram observados pontos de penetração e saída de
hifas doantagonista no fitopatógeno durante o período de cinco dias de co-cultivo
em meio BDA, conforme evidenciados em outros estudos (Mukherjee et al. 2022;
Nofal et al. 2021).

Figura 1. Interação in vitro entre Trichoderma sp. (INPA 2475) e F. decemcellulare (CPAA-
Fdc307), após cinco dias de cultivo em BDA e SNA. Em A: colônia do Trichoderma sp. (CMIAINPA
2475) transformadocom GFP; em B: colônia do F. decemcellulare transformado com RFP; C: co-
cultivo do Trichoderma sp. (CMIAINPA2475) e F. decemcellulare, transformados; D: hifa de
Trichoderma sp. CMIAINPA 2475) expressando GFP, em BDA; E: hifa e conídios de F.
decemcellulare expressando RFP, em BDA; F: micélio de ambos os fungos transformados com
proteínas fluorescentes; G e H: pareamento das hifasde Trichoderma sp. CMIAINPA 2475) e F.
decemcellulare selvagens, respectivamente, em BDA; I: entrelacedas hifas dos transformantes,
em BDA; J: hifa Trichoderma sp. (CMIAINPA 2475) em meio SNA; L e M: entrelace das hifas
Trichoderma sp. (CMIAINPA 2475) em meio SNA (microscopia eletrônica confocal e
fluorescência).

475
 Conclusão
A estratégia de obtenção de protoplastos e transformação do
Trichoderma sp.INPA2475 via PEG mostrou-se uma metodologia eficiente, com
obtenção de transformantes geneticamente estáveis. Quanto ao antagonismo foi
observado o enovelamento das hifas do transformante antagonista na interação
com o fitopatógenoindicando mecanismo típico de micoparasitismo.

Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior CAPES-Procad AmazonMicro e CAPES-Amazônia
Legal pelo apoiofinanceiro e concessão de Bolsas de estudo. À Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas por meio do programa Biodiversa
(Edital N°007/2021).

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Ação larvicida de leveduras do gênero Rhodotorula da

Amazônia para o controle de Aedes aegypti

Katak, Ricardo de Melo3; Fonseca, Raissa Sayumy Kataki2; Muniz, Veranilce

Alves1; Oliveira, Juan Campos1; Souza, João Vicente Braga2; Souza, Érica
Simplício2; Roque, Rosemary Aparecida3.

1Universidade Federal do Amazonas, Universidade do Estado do Amazonas2, 3Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia.
E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
Os mosquitos vetores de doenças causam danos imensuráveis e apresentam
um grande problema para Saúde pública. O Aedes aegypti é um dos mosquitos
que causa uma grande preocupação, principalmente por ser o vetor principal dos
arbovírus dengue, chikungunya e Zika no qual requer estratégias para o seu
controle. Neste estudo, testamos o potencial larvicida de quatro leveduras
(RTC46, RAB41, RTC42, RTC41) isoladas de amostras de frutas e amostras
ambientais para o controle de populações de A. aegypti em condições de
laboratório. As linhagens foram cultivadas nos diferentes intervalos (3, 5 e 6 dias)
no meio YEPD, em 30°C sob agitação de 180 rpm. Após a exposição das larvas
ao cultivo das leveduras, apenas uma linhagem (RTC46) causou mortalidade
nas larvas com o cultivo do 6º dia. A mortalidade cumulativa da linhagem RTC46
foi de 75, 90 e 100 % nos intervalos de 24, 48 e 72 horas de exposição,
respectivamente. Nos cultivos do 3° e 5° dia não foi observada nenhuma
mortalidade nos experimentos até 72 h de avaliação. Os diferentes intervalos de
cultivo das leveduras comparados com a linhagem Bacillus thuringiensis
israelenses mostraram diferenças na sua eficácia. Estudos mostraram que o
gênero Rhodotorula apresenta uma grande exigência nutricional para produção
de seus metabólitos. Com isso, a baixa eficácia larvicida dos intervalos do 3° e
5° dia pode estar relacionado à baixa produção de princípios ativos. Diante disso,
estudos sobre a otimização e a padronização de seus cultivos serão de
fundamental importância para utilizar esses microrganismos como agentes de
controle biológico. Dessa forma, explorar a biodiversidade Amazônica em busca
de novos agentes entomopatogênicos pode ser uma oportunidade para
encontrar novos agentes de controle biológico de culicideos no Brasil.

Palavras-Chave: Controle biológico, Agentes entomopatogênicos, Metabólitos.

479
 Introdução
Aedes aegypti é o principal vetor dos arbovírus, como dengue, Zika,
chikungunya e febre amarela urbana que afetam significativamente a saúde
pública (Weaver et al. 2018; WHO 2020). Os esforços para prevenir a
transmissão ou fornecer tratamento para essas arboviroses por meio do
desenvolvimento de vacinas eficazes ou medicamentos antivirais permanecem
amplamente ineficazes (Rezza et al. 2017; Katzelnich et al. 2020).
A prevenção ou redução dessas arboviroses tem dependido
historicamente de esforços direcionados ao controle dos mosquitos vetores, na
maioria das vezes pela redução de criadouros e aplicações de inseticidas
(Wilson et al. 2020). Diante disso, o sucesso evolutivo e a ampla distribuição dos
mosquitos podem ter sido significativamente influenciados por relações
simbióticas com microrganismos (Ricci et al. 2012). As leveduras também têm
sido isoladas de diferentes insetos como abelhas, besouros, crisopídeos e
vespas (Gibson et al. 2009). Esses microrganismos muitas das vezes oferecem
proteção para seus hospedeiros artrópodes contra o parasitismo de diversos
patógenos (Ricci et al. 2011).
As leveduras endossimbiontes também podem influenciar as
características comportamentais dos insetos, como a busca por hospedeiro e a
seleção de locais de oviposição (Ricci et al. 2011). Por outro lado, algumas
leveduras podem ter efeitos prejudiciais sobre as larvas dos mosquitos. Por
exemplo, a espécie Rhodotorula glutinis pode afetar negativamente o mosquito
como sua sobrevivência larval e a sua pupação (Monkany et al. 2003). Steyn et
al. (2016) demonstraram que algumas espécies de leveduras podem ser
antagônicas para larvas de mosquitos, como por exemplo, as leveduras da
espécie Cryptococcus gattii apresenta um impacto negativo no ciclo de vida de
larvas Culex pipiens.
Devido a poucos relatos de leveduras causando patogenicidade em
insetos, principalmente em A. aegypti, essa pesquisa teve como iniciativa avaliar
o potencial antagônico de leveduras do gênero Rhodoturla sp. isoladas de frutas
e amostras ambientais da região Amazônica para o controle de populações de
A. aegypti, em ambientes controlados. A busca de novos agentes
entomopatogênicos é de fundamental importância para o controle biológico de
insetos vetores de doenças, uma vez que os microrganismos são fontes

480
promissoras de metabólitos com diversos potenciais biotecnológicos (Dahmana
et al. 2020).
A levedura Rhodotorula não forma esporos e apresenta baixa capacidade
fermentativa, se espalha facilmente no ambiente e sua coloração pode modificar
de acordo com ambiente de propagação, variando entre vermelha, laranja,
amarela e rosa (Gomez-Lopez et al. 2005; Wirth e Goldani 2012). Este gênero
possui boa atividade em substratos de baixo custo e o seu crescimento pode
ocorrer através da utilização de substratos como, caldo de cana, sobra de
comida, farinha de feijão, milho, grãos e caldo de caju hidrolisado (Aksu e Eren
2005; Branco 2010).
Esse é o primeiro relato de atividade larvicida de leveduras do gênero
Rhodoturula em larvas de A. aegypti em condições de laboratório. Portanto, o
objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antagônico de leveduras do gênero
Rhodoturola contra larvas de A. aegypti em condições de laboratório. Sendo
assim, mais estudos serão necessários para caracterização de seus princípios
ativos, concentrações letais e mecanismos de ação.

Material e Métodos
Reativação das leveduras
Foram utilizadas quatro leveduras cedidas pelo Laboratório de Micologia
do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia-INPA. Essas leveduras foram
isoladas por Fonseca (2022) de frutas amazônicas de amostras ambientais. As
leveduras utilizadas foram a RAB41 isolada da água e as RTC41, RTC42,
RTC46 isoladas do cacau (Theobroma cacao). As amostras eram mantidas em
meio ágar YEPD (extrato de levedura - peptona - dextrose - ágar) a 4° C.

Criação de insetos, em condições de laboratório

A criação dos insetos ocorreu conforme Lima e Vale (2007). A fonte de
carboidratos (solução de sacarose a 10%) foi mantida diariamente e as fêmeas
realizaram repasto sanguíneo duas vezes por semana, durante 30 minutos com
a utilização de hamster - Mesocricetus auratus Waterhouse, 1839 (Rodentia:
Cricetidae), anestesiado conforme o procedimento aprovado pelo Comitê de
Ética no Uso de Animais do INPA (029/2021).

481
Ensaios biológicos
Os bioensaios foram realizados de acordo com as diretrizes da WHO
(2005), conforme Katak et al. (2021). Cada linhagem de levedura foi inoculada
em 100 ml de meio YEPD (extrato de levedura - peptona - dextrose) e incubada
a 30°C e 180 rpm. Os cultivos das leveduras foram realizados em diferentes
intervalos (3º, 5º e 6º dia), no qual foram avaliados separadamente, com o intuito
de verificar a patogenicidade das leveduras em larvas de A. aegypti. A
mortalidade das larvas à exposição dos cultivos das leveduras foi avaliada em
três dias consecutivos. A cada dia, cinco copos foram preparados para cada
linhagem testada, cada copo contendo 10 larvas de A. aegypti de terceiro instar,
9 ml de água destilada, 1 mg de comida (ração para gato) e ~24 x108 células/
mL do cultivo das linhagens (levedura mais meio) dos diferentes intervalos de
cultivo. As larvas mortas foram contadas em cada copo em 24, 48 e 72 h após a
exposição. A linhagem padrão Bacillus thuringiensis isralensis (Bti) foi obtida da
reativação do produto comercial Vectobac® WG e, foi utilizada como controle
positivo para validar nosso protocolo e avaliar comparativamente a atividade
larvicida.

Resultados e Discussão
As figuras da reativação das leveduras mostraram as características
fenotípicas como a pigmentação e os aspectos das colônias (Figura 1). As
identificações fenotípicas, bioquímicas e moleculares (dados não mostrados) foi
realizada por Fonseca (2022), no qual atribuíram essas linhagens como
leveduras do gênero Rhodotorula sp.

Figura 1. Reativação de linhagens de leveduras e observações dos aspectos morfológicos

das colônias

482
Atividade larvicida
A exposição de larvas de A. aegypti aos diferentes intervalos de cultivo de
linhagens de leveduras (~24 x108 células/ mL) revelou que apenas uma linhagem
RTC46 causou mortalidade acima de 50% em 72 horas. As demais linhagens
(RAB41, RTC42 e RTC41) não apresentaram atividade larvicida em nenhum dos
intervalos de cultivo até 72 horas de exposição. Os valores de mortalidade foram
comparados com o controle positivo, no qual apresentou 100% de mortalidade
em todos os intervalos de cultivo. Em relação ao controle negativo, não foi
observado nenhuma mortalidade até 72 h de avaliação.

Tabela 1: Porcentagem de mortalidade das larvas de Aedes aegypti expostas ao cultivo de

linhagens de leveduras isoladas.
Linhagens Substrato 3º dia 5º dia 6º dia
24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h
Vectobac® Controle
100 100 100 100 100 100 100 100 100
WG Bti Positivo
RTC46 Cacau Amostra 5 5 5 10 10 10 75 90 100
RAB41 Água Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0 0
RTC42 Cacau Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0 0
RTC41 Cacau Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Controle 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CN
negativo
Controle positivo: Bti: -Bacillus thuringiensis israelenses (produto comercial). CN: controle
negativo (H2O).

Os resultados obtidos dos diferentes intervalos de cultivos mostraram

nitidamente as diferenças na atividade biológica da linhagem promissora RTC46.
O cultivo do 6° dia mostrou que a linhagem RTC46 matou 79, 90 e 100 % nos
intervalos de 24, 48 e 72 horas, respectivamente (Figura 2). O perfil de
mortalidade para a linhagem padrão Bti foi o mesmo em todos os intervalos de
cultivo, matando 100% das larvas em 24 horas. Os demais intervalos de cultivo
(3° e 5° dia) da linhagem RTC46 apresentaram baixa mortalidade até 72 horas
de exposição (Figura 2).

483
 Vecto RTC46 CN Vecto RTC46 Vecto RTC46 CN
3º dia CN 6º dia
3º dia 5º dia 5º dia 6º dia

Figura 2: dados de mortalidade cumulativa de larvas expostas ao cultivo da linhagem RTC46

e Vectobac® em diferentes intervalos de cultivo.

Apenas uma linhagem de levedura apresentou patogenicidade para as

larvas de A. aegypti no maior tempo de cultivo, no qual esses achados são
promissores para essa pesquisa. As investigações dos diferentes intervalos de
cultivo, substratos e tempo de exposição das larvas aos cultivos das leveduras,
podem fornecer respostas mais eficazes da plausibilidade biológica desses
microrganismos. A baixa mortalidade das larvas expostas aos cultivos das
leveduras do 3° e 5° dia pode estar associados à ausência ou baixa produção de
metabólitos ativos. Estes aspectos são esperados para as leveduras do gênero
Rhodotorula, uma vez que esses microrganismos apresentam uma dependência
estrita dos rendimentos de produção e das condições de crescimento, como, por
exemplo, conteúdo nutricional, pH e temperatura (Valduga et al. 2009).
Diante disso, mais investigações acerca das fermentações dessas
linhagens em diferentes meios de cultivo podem fornecer conhecimentos
fundamentais desses microrganismos, principalmente de uma variedade de
moléculas com potencial inseticida que podem ser produzidas. Mussagy et al.
(2021) mostraram que a levedura R. glutinis em combinação com diferentes
meios de cultivo melhorou a produção de carotenoides e lipídeos, no qual podem
ser usados para fins cosméticos, farmacêuticos e alimentícios.
Em relação às atividades inseticidas desses microrganismos pode ser
uma nova oportunidade para encontrar novos agentes entomopatogênicos e
moléculas inseticidas. Spencer et al. (1997) já demonstraram que R. glutinis

484
pode causar patogenicidade em Cx. quinquefasciatus quando estão expostas a
altas concentrações de cultivo desses microrganismos.
Embora os microrganismos entomopatogênicos, como as bactérias
Bacillus thuringiensis, Lysinibacillus sphaericus e os fungos Beauveria bassiana
e Metharhizium anisopliae sejam os microrganismos mais estudados e utilizados
para o controle de mosquitos vetores de doenças, novos agentes microbianos
são importantes para serem descobertos e implementados em programas de
controle biológico (Lovett et al. 2019; Falqueto et al. 2021). Por se tratar de
estudos pioneiros, discussões sobre a toxicidade de leveduras frente às larvas
de A. aegypti são escassos na literatura. Ao contrário das bactérias e fungos
filamentosos, elas são pouco estudadas e conhecidas para causar
patogenicidade em insetos, inclusive em mosquitos da família Culicidae.
Esses são os primeiros achados de infecção de Rhodoturola sp. em larvas
de A. aegypti causando patogenicidade em condições de laboratório. A linhagem
que apresentou atividade larvicida deve ser investigada em outros estudos como
a otimização de seus cultivos, caracterização de seus princípios, concentrações
letais e mecanismos de ação, no qual podem ser bons agentes de controle
microbiano para populações de A. aegypti. Vários estudos têm demonstrado o
potencial biotecnológico da levedura do gênero Rhodotorula, sugerindo-a como
um dos microrganismos mais promissores para processos industriais de
alimentos e ações farmacêuticas (Kot et al. 2016; Squina et al. 2005). O perfil
fenotípico como os aspectos das colônias, principalmente a coloração e os
pigmentos dessas linhagens (Figura 3), foi um incentivo para investigar o
potencial da patogenicidade desses microrganismos contra larvas de A. aegypti.
Com isso, observamos a ação antagônica da linhagem RTC46 para populações
de A. aegypti em condições de laboratório, no qual podem apresentar diversos
mecanismos de ação contra esse vetor.

485
Figura 3: Morfologia da colônia da linhagem RTC46 isolada do cacau (Theobrama cacao).

Explorar a biodiversidade Amazônica em busca de novos agentes

entomopatogênicos pode ser uma nova oportunidade para encontrar novos
agentes e formulações larvicidas para o controle de culicideos no Brasil.

Conclusões
A linhagem de Rodotorula sp. apresentou maior eficácia larvicida para
larvas de A. aegypti. Os diferentes intervalos de cultivo mostraram diferenças
na eficácia das linhagens, sendo o cultivo do 6º dia o mais promissor. Esses
dados são promissores para o desenvolvimento de novos bioinseticidas para o
controle de populações de A. aegypti.

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488
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

A funga documentada: o Herbário HSTM e a descentralização

doconhecimento micológico no Estado do Pará, Brasil

Soares, Daniel Marinho1,3; Santana, Marcos Dione Ferreira1,2; Canto, Eveleise

Samira Martins1,2

1Universidade Federal do Oeste do Pará, 2Instituto de Ciências e Tecnologia das Águas-

ICTA.
Email: [email protected]

Resumo
Foi compilada uma lista de espécies de macrofungos documentadas para a
região Oeste do Pará, Brasil, depositadas no Herbário HSTM, da Universidade
Federal do Oeste do Pará. Como resultado, cerca de 1.103 registros de
macrofungos foram acessados, distribuídos em 11 ordens, 75 gêneros e 166
espécies, das quais Polyporaceae, Geastraceae e Hymenochaetaceae são as
famílias com maior númerode registros. As amostras são oriundas de Unidades
de Conservação e representam a diversidade regional de grande valor para a
Amazônia. O Herbário HSTM abriga uma importante coleção de macrofungos
que cresce anualmente e contribuiu para o aumento de conhecimento e
representatividade de parte da diversidade amazônica paraense, sendo uma
coleção descentralizada no Estado do Pará que disponibiliza seu acervo à ampla
consulta.

Palavras-Chave: coleção científica; conservação; macrofungos paraenses

Introdução
As coleções biológicas são ferramentas essenciais para se conhecer a
biodiversidade de uma região (Crozier 1997). Elas auxiliam no desenvolvimento
de pesquisas, tecnologias, ensino-aprendizagem e subsidiam políticas públicas
quanto àconservação das espécies e biomas onde são instaladas (Canhos 2001;
Kury et al. 2006). Em relação aos herbários, a fronteira do conhecimento sobre
a flora e a funga faz com que o conhecimento científico oriundo das coleções
seja dinâmico e permanente, justificando a crescente relevância local, regional e
nacional (Barbosa et al. 2003).
No Brasil, cerca de 547 coleções e sub-coleções estão disponíveis para
acessono banco de dados SpeciesLink com mais de 16.144.003 de registros,
sendo que desses, apenas 380.440 são registros de fungos
(http://splink.cria.org.br). Esse número é desafiador se considerar a escassez

489
de estudos sobre a micobiota nos trópicos e subtrópicos, onde acredita-se
encontrar a maior riqueza de espécies ainda desconhecida (Hawksworth 1991;
Hawksworth 2001; Hawksworth 2012). Consequentemente, a falta de
conhecimento acentua as lacunas de distribuição e ocorrência dos fungos no
Brasil, sobretudo na região Norte do país e limita o avanço do conhecimento
sobre a micodiversidade.
A partir desse cenário e considerando a importância das coleções
científicas, o Herbário HSTM, da Universidade Federal do Oeste do Pará
(UFOPA), ativo desde o ano 2000 (Almeida, Giacomin 2015), criou em 2016 a
coleção de macrofungos em resposta às atividades acadêmicas e de pesquisa,
e principalmente, devido ao déficitde conhecimentos sobre o grupo, em áreas
pouco amostradas na Amazônia (Maia et al. 2015), como na região Oeste do
Pará. Este estudo objetiva listar as espécies de macrofungos depositadas no
Herbário HSTM e documentar a funga conhecida na região Oeste do Pará.

Material e Métodos
O banco de dados do Herbário HSTM foi consultado no sistema JABOT
(http://hstm.jbrj.gov.br), para levantamento do número de registros depositados
na coleção de macrofungos. As exsicatas foram analisadas e as espécies foram
confirmadas com auxílio da literatura especializada (Ryvarden et al. 1980; Miller
et al. 1988; Sunhede 1989; Ryvarden 1991; 2004; Calonge 1998; Sarasini 2005;
Cabral et al. 2014; Sousa et al. 2014), sendo a nomenclatura das famílias,
gêneros e espécies constantemente atualizada seguindo as bases de dados do
CABI (2022) e do CBS (2022).

Resultados e Discussão
Atualmente estão registrados no Herbário HSTM 1.103 amostras de
macrofungos, distribuídos em 11 ordens, 75 gêneros e aproximadamente 166
espécies, sendo Polyporaceae (23,8% dos registros), Geastraceae (20,78% dos
registros) e Hymenochaetaceae (12,9% dos registros) as famílias com maior
númerode registros. A lista de espécies documentadas para a região Oeste
do Pará é apresentada na Tabela 1, com seus respectivos números de exsicatas
disponíveispara consulta.

490
Tabela 1: Lista de espécies de macrofungos registradas para a região Oeste do Pará, Brasil,
depositadas no Herbário HSTM por ordem de espécies mais representadas.
Número deExsicatas
Espécies
Geastrum schweinitzii (Berk. & M.A. Curtis) Zeller 99
Geastrum sp. 86
Cyathus limbatus Tul. & C. Tul. 40
Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo 34
Rigidoporus lineatus (Pers.) Ryvarden 31
Trametes elegans (Spreng.) Fr. 31
Hymenochaete damicornis (Link) Lév. 28
Lycoperdon fuligineum Berk. & M.A. Curtis 28
Cyathus sp. 20
Fuscoporia gilva (Schwein.) T. Wagner & M. Fisch. 20
Trametes modesta (Kunze ex Fr.) Ryvarden, 20
Lenzites betulina (L.) Fr. 19
Ganoderma sp. 18
Pycnoporus sp. 18
Flavodon flavus (Klotzsch) Ryvarden 17
Hexagonia variegata Berk. 17
Amauroderma praetervisum (Pat.) Torrend 16
Rigidoporus biokoensis (Bres. ex Lloyd) Ryvarden 16
Datronia caperata (Berk.) Ryvarden 14
Marasmius sp. 14
Perenniporia medulla-panis (Jacq.) Donk 14
Pterula sp. 13
Atroporus diabolicus (Berk.) Ryvarden 12
Favolus tenuiculus P. Beauv. 12
Lentinus crinitus (L.) Fr. 12
Phallus indusiatus Vent. 12
Polyporus guianensis Mont. 12
Cyathus setosus H.J. Brodie 11
Hymenochaete luteobadia (Fr.) Höhn. & Litsch. 11
Phylloporia chrysites (Berk.) Ryvarden 11
Xylaria sp. 11
Amauroderma schomburgkii (Mont. & Berk.) Torrend 10
Amauroderma sprucei (Pat.) Torrend 10
Geastrum lloydianum Rick 9
Amauroderma omphalodes (Berk.) Torrend 8
Fomitiporia punctata (P. Karst.) Murrill 8
Geastrum entomophilum Fazolino, Calonge & Baseia 8
Microporellus dealbatus (Berk. & M.A. Curtis) Murrill 8
Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill 8
Amauroderma partitum (Berk.) Wakef. 7
Atroporus rufoatratus (Berk.) Palacio, Reck & Robledo 7
Camillea cyclops Mont. 7
Lentinus velutinus (Ces.) Trotter 7
Lenzites sp. 7
Microporellus obovatus (Jungh.) Ryvarden 7
Pterula stipata Corner 7
Amauroderma calcigenum (Berk.) Torrend 6
Camillea bilabiata Speg. 6
Chlorophyllum molybdites (G. Mey.) Massee 6
Fomitopsis roseoalba A.M.S. Soares, Ryvarden & Gibertoni 6

491
 Geastrum albonigrum Calonge & M. Mata 6
Ganoderma resinaceum Boud. 5
Amauroderma sp. 4
Coltricia cinnamomea (Jacq.) Murrill 4
Favolus sp. 4
Fuscoporia callimorpha (Lév.) Groposo, Log.-Leite & Góes-Neto 4
Fuscoporia rhabarbarina (Berk.) Groposo, Log.-Leite & Góes-Neto 4
Geastrum aculeatum B.D.B. Silva & Baseia 4
Geastrum echinulatum T.S. Cabral, B.D.B. Silva & Baseia 4
Geastrum hirsutum Baseia & Calonge 4
Geastrum javanicum Lév. 4
Lycoperdon arenicola (Alfredo & Baseia) Baseia, Alfredo & M.P. Martín 4
Mycobonia flava (Sw.) Pat. 4
Perenniporia ochroleuca (Berk.) Ryvarden 4
Polyporus leprieurii Mont. 4
Polyporus udus Jungh 4
Pterula brunneosetosa Corner 4
Trametes versicolor (L.) Lloyd 4
Trametes sp. 4
Trogia cantharelloides (Mont.) Pat. 4
Xylophallus xylogenus (Mont.) E. Fisch 4
Amauroderma rude (Berk.) Torrend 3
Auricularia delicata (Mont. ex Fr.) Henn 3
Auricularia nigricans (Sw.) Birkebak, Looney & Sánchez-García 3
Camillea leprieurii (Mont.) Mont. 3
Cyclomyces tabacinus (Mont.) Pat. 3
Cymatoderma caperatum (Berk. & Mont.) D.A. Reid 3
Dichomitus cavernulosus (Berk.) Masuka & Ryvarden 3
Dichomitus setulosus (Henn.) Masuka & Ryvarden 3
Lycoperdon sp. 3
Marasmiellus sp. 3
Nigroporus sp. 3
Perenniporia stipitata Ryvarden 3
Phallus sp. 3
Phellinus robustus (P. Karst.) Bourdot & Galzin 3
Phylloporia spathulata (Hook.) Ryvarden 3
Polyporus varius (Pers.) Fr. 3
Porogramme albocincta (Cooke & Massee) J. Lowe 3
Schizophyllum commune Fr. 3
Scleroderma dictyosporum Pat 3
Stereopsis hiscens (Berk. & Ravenel) D.A. Reid 3
Coltricia focicola (Berk. & M.A. Curtis) Murrill 2
Datronia sp. 2
Earliella scabrosa (Pers.) Gilb. & Ryvarden 2
Fomes fasciatus (Sw.) Cooke 2
Fulvifomes imbricatus L.W. Zhou 2
Ganoderma australe (Fr.) Pat. 2
Geastrum rusticum Baseia, B.D.B. Silva & T.S. Cabral 2
Geastrum setiferum Baseia 2
Gymnopus montagnei (Berk.) Redhead 2
Haddowia longipes (Lév.) Steyaert 2
Microporellus iguazuensis Rajchenb. 2
Neodictyopustlanticae 2
Phellinus fastuosus (Lév.) S. Ahmad 2
Phellinus sp. 2
Pleurotus sp. 2
Podoscypha nitidula (Lloyd) D.A. Reid 2
Podoscypha parvula (Lloyd) D.A. Reid 2
Polyporus alveolares 2
Polyporus grammocephalus Berk 2

492
 Scleroderma duckei B.D.B. Silva 2
Trichaptum byssogenum (Jungh.) Ryvarden 2
Amauroderma aurantiacum (Torrend) Gibertoni & Bernicchia 1
Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill 1
Ophiocordyceps sobolifera (Hill ex Watson) G.H. Sung 1
Panus neostrigosus Drechsler-Santos & Wartchow 1
Phellinus undulatus (Murrill) Ryvarden 1
Phellinus wahlbergii (Fr.) D.A. Reid 1
Phlebopus beniensis (Singer & Digilio) Heinem. & Rammeloo 1
Sphaerobolus stellatus Tode 1
Stereopsis radicans (Berk.) D.A. Reid 1
Trametes leonina (Klotzsch) Imazeki 1
Trametes pubescens (Schumach.) Pilát 1
Trichaptum perrottetii (Lév.) Ryvarden 1
Xylophallus clavatus T.S. Cabral, M.P. Martín, C.R. Clement, K. Hosaka &Baseia
1
A lista completa está disponível no banco de dados do Herbário HSTM
(http://hstm.jbrj.gov.br).

A maior parte das amostras, 839 exsicatas, são provenientes dos

arredores da Hidrelétrica de Curuá-Una, o que corresponde a 73,3% das
exsicatas encontradas na coleção de macrofungos do HSTM. Do restante, 163
(14,2%) são oriundas da FlorestaNacional (FLONA) do Tapajós, 80 (7,0%) são
da Reserva Extrativista (RESEX) Tapajós-Arapiuns, 62 (5,4%) são de amostras
coletadas na zona urbana da cidade deSantarém e o restante é proveniente de
outras localidades, como o Parque Nacional (PARNA) da Amazônia.
Todas as exsicatas encontram-se armazenadas devidamente etiquetadas
em envelopes padronizados e disponíveis a ampla consulta no banco de dados
do sistema JABOT (http://hstm.jbrj.gov.br). A figura 1 representa parte da funga
paraense documentada até o presente momento.

493
Figura 2. Parte da diversidade de macrofungos documentada para a região Oeste do Pará,
Brasil. 1) Calvatia cf. cyathiformis; 2) Chlorophyllum cf. molybdites; 3) Cyathus sp.; 4)
Leucocoprinu s cf. brunneoluteus; 5) Macrolepiota sp.; 6) Morganella sp. 1; 7) Morganella sp.
2; 8) Clavaria zollingeri; 9) Clavulinopsis aurantiocinnabarina; 10) Entoloma panniculus; 11)
Marasmius cf. griseoradiatus; 12) M. haematocephalus; 13) M. cf. rhabarbarinus; 14) M.
rotuloides; 15) Trogia cantharelloides; 16) Gymnopus montagnei; 17) Coprinellus
disseminates; 18) Oudemansiella sp.; 19) Hygrocybe sp.; 20) Schizophyllum commune.
Todas as imagens são de responsabilidades dos autores e foram obtidas nos locais de
coleta.

494
 Discussão
Com a maioria das coleções concentradas na Capital Belém do Pará, das
poucas descentralizadas, o HSTM é a única coleção com um acervo para
macrofungos cadastras em bancos de dados (http://sweetgum.nybg.org;
http://splink.cria.org.br). Assim, deve-se considerar que poucos estudos
abordam a micodiversidade na Amazônia, sobretudo em localidades pouco ou
ainda não amostradas e a riqueza documentada poça ser ainda maior
(Hawksworth 2001; Maia et al. 2015).

Conclusões
O Herbário HSTM abriga cerca de 166 espécies de macrofungos da
região Oeste do Pará, tornando-se um depositário significativo da riqueza
biológica da Amazônia brasileira. Além de contribuir para a dinâmica e a
produção de conhecimento, o herbário também expande os estudos sobre
micologia no estado do Pará, armazenando exemplares de importantes gêneros
de macrofungos, principalmente das famílias Polyporaceae, Geastraceae e
Hymenochaetaceae.

Agradecimentos
A cordenação geral do Herbário HSTM da UFOPA.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Atividade antiparasitária de Streptomyces spp. contra o

Trypanosoma cruzi

Gonçalves, Franque Ferreira1; Jarline, Ingride Santos da Silva2; Silva, Gilvan

Ferreira da3; Lima, João Marcelo Silva1; Procópio, Rudi Emerson de Lima1

1Universidade do Estado do Amazonas, 2Universidade Federal do Amazonas, 3Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Email: [email protected]

Resumo
Os medicamentos disponíveis para as tripanossomíases são poucos e
apresentam toxicidade, e o surgimento de parasitas resistentes tem dificultado o
tratamento, os Streptomyces tem sido nas últimas décadas uma fonte valiosa
para desenvolver medicamentos eficazes contra várias doenças. Neste trabalho
observamos que Streptomyces isolados dos Rios Madeira e Purus, foram
capazes de inibir o crescimento de Trypanosoma cruzi in vitro e a análise foi
realizada considerando-se a redução do desenvolvimento da infecção
estabelecida, promovida pelo composto testado, em relação ao cultivo de células
infectadas pelo parasito na ausência de extratos. Sendo que os isolados APUR
32.5; APUR 36.3; MPUR 40.3 e MPUR 36.1, foram os que apresentaram
melhores resultados e podem ser selecionadas para avalição da citotoxicidade
das linhagens para utilização em futuros estudos. A tripanossomíases é
considerada uma doença negligenciada, portanto, novos compostos contra o
T. cruzi são importantes com melhores perfis de eficácia e segurança.

Palavras-Chave: Tripanossomíases; Doença de Chagas; Extratos naturais.

Introdução
O protozoário hemoflagelado parasita Trypanosoma cruzi é o patógeno
responsável pela tripanossomíase americana, mais conhecida como doença de
Chagas, uma doença com grande abrangência e com predomínio em regiões
pobres, e como consequência disso se tornou uma das doenças tropicais
negligenciadas, apesar de ocasionar um impacto socioeconômico alto. A doença
foi descoberta há mais de um século, em 1909, pelo pesquisador e médico
brasileiro Carlos Chagas (Salassa 2019).
Na doença de Chagas o ciclo de vida do T. cruzi inicia na forma
tripomastigotas liberados nas fezes do inseto infectado e após a invasão é
envolto por um vacúolo parasitóforo transitório, pois o parasita consegue escapar

498
e se multiplicar no citosol, diferenciando-se novamente na forma tripomastigota
que será liberada na lise celular, podendo migrar dessa forma para as células
vizinhas ou serem consumidas por outroinseto vetor (Moretti et al. 2019).
As principais formas de transmissão do protozoário incluem via vetorial,
oral, congênita e transfusão sanguínea (Zingales 2017). A vetorial ocorre após a
picada do inseto infectado ou contato direto com suas fezes na mucosa ocular. A
transmissão oral se dá pelo consumo de alimentos como açaí e caldo-de-cana
mal higienizados, contendo fezes de insetos infectados. A congênita acontece
pela transferência do protozoário de mães infectadas para o feto, com risco
agravado por parasitemia elevada, em mães HIV positivas. A transmissão por
transfusão sanguínea, relatada em 1952, levou à triagem obrigatória dos
hemocomponentes para infecção por T. cruzi (Bern 2011).
As actinobactérias são responsáveis por gerar um grande número de
compostos metabólitos secundários, e essas substâncias bioativas são
regularmente utilizadas na indústria farmacêutica (Al-Shaibani et al. 2021). O
gênero Streptomyces é uma grande fornecedora para produtos bioativos,
químicos e medicamentos há décadas principalmente de antibióticos (Procópio
et al. 2012). Mas o seu potencial biológico pode ser muito maior e produzir
aproximadamente milhares de novos compostos bioativos (Lacey et al. 2022). O
objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antiparasitária de Streptomyces
isolados dos rios Madeira e Purus contra Trypanosoma cruz in vitro.

Material e Métodos
Isolados e condições de cultivo
Neste trabalho foram utilizadas sete linhagens de actinomicetos (APUR
32.5, MAD 42, APUR 39.1. APUR 36.3, MPUR 21.2, MPUR 40.3, MPUR 36.1)
isolados de sedimentos do Rio Madeira e Purus, pertencentes à coleção de
microrganismos da Embrapa Amazônia Ocidental. Estas linhagens foram
previamente identificadas por meio do sequenciamento da região 16S do
rRNA como pertencentes ao gênero Streptomyces. As culturas estavam
preservadas em glicerol 15% e mantidas a -80°C (Jose e Jha 2017). Para a
preparação do pré-inóculo, os isolados foram cultivados em Erlenmeyer
contendo 50 mL de meio de cultura ISP2 (4 g/L extrato de levedura; 10 g/L extrato
de malte; 4g/L dextrose) (Shirling e Gottlieb 1966) por 7 dias sob agitação de 150

499
rpm a 280C. Após o crescimento, cada isolado foi centrifugado e o sobrenadante
foi liofilizado e enviado para o laboratório de Genômica Funcional de Parasitos -
GFP do Instituto René Rachou (IRR) - Fiocruz Minas. O extrato foi diluído em
DMSO (20mg/mL) para os testes de inibição de T cruzi.

Manutenção das células L929 e da cepa Tulahen do T. Cruzi

Para a manutenção da cepa Tulahuen de T. cruzi, foi empregado um
método conforme descrito por Romanha (2010), foi utilizado a cepa
geneticamente modificada para expressar o gene da β-galactosidase. Essa
transformação permitiu o monitoramento e a quantificação do crescimento
parasitário. Células de camundongos (L929) cultivadas em meio RPMI 1640 e
suplementado com SBF 10% e 2mM de glutamina foram semeadas em garrafas
de 25 cm2, 1,5x105 células/garrafa. As célulasforam incubadas em estufa a 37ºC
e 5% de CO2 durante 7 dias.

Ensaio de inibição de crescimento do T. cruzi

O ensaio in vitro com as formas amastigotas intracelulares e
tripomastigotas do T. cruzi foi realizado de acordo com Buckner et al. (1996). O
meio de cultura foi trocadopor 180 µL de RPMI e 20 µL do composto a ser testado
em triplicata, para as diferentes concentrações (3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100
µg/mL), e incubado em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 96 horas, os resultados
foram expresso como inibição do crescimentode acordo Oliveira et al. (2006) e a
análise foi realizada considerando-se a redução do desenvolvimento da infecção
estabelecida, promovida pelo composto testado, emrelação ao cultivo de células
infectadas pelo parasito na ausência de extratos. Os testes antitripanossoma
foram realizados em triplicatas no instituto René Rachou / FIOCRUZ em Belo
Horizonte MG.

Resultados e Discussão
Dos sete Streptomyces testados, quatro apresentaram atividade contra o
T. cruzi (APUR 32.5; APUR 36.3; MPUR 40.3 e MPUR 36.1), como pode ser
observado na Tabela 1. Os Streptomyces APUR 32.5, MAD 42 e MPUR 21.2 não
apresentaram atividade antiparasitária em nenhuma das concentrações
testadas. O ensaio in vitro foi realizado com formas amastigotas intracelulares e
500
tripomastigotas do T. cruzi. A ação dos compostos sobre as formas intracelulares
foi avaliada considerando a redução do desenvolvimento da infecção, em relação
ao cultivo de células infectadas pelo parasito na ausência de extratos. Os
resultados na Tabela 1 referem-se à atividade antiparasitária dos Streptomyces
testados contra ambas as formas evolutivas do parasito, amastigotas
intracelulares e tripomastigotas.

Tabela 1. Atividade antiparasitária dos Streptomyces nas diferentes concentrações testadas.

Streptomyces Concentração Atividade1 (%) IC50 sobre o parasita2 CC50 sobre L9293
isolados (μg/mL) (μg/mL) (μg/mL)

APUR 32.5 100* 50* 25 12,5 100 100 100 100 < 3,12 Análise ao Indicado para
6,25 3,12 100 microscópio indica ensaio de
100 altatoxicidade citotoxicidade

APUR 36.3 100¥ 50* 25* 100 100 100 100 < 3,12 Análise ao Indicado para
12,5 6,25 3,12 97,5 microscópio indica ensaio de
53,9 alta citotoxicidade
toxicidade

MPUR 40.3 100* 50* 25* 96,2 80,3 47,6 27,8 26,83 -
12,5* 6,25* 7,4 9,4
3,12*
MPUR 36.1 100* 50 25 12,5 100 99,9 48,7 53,4 10,79 Indicado para
6,25 3,12 41 ensaio de
14,5 citotoxicidade

Benzonidazol 3,81 μM - 3,81 μM (1 μg/mL) 2.381 μM (625

(1μg/mL) μg/mL)

1Porcentagem de redução das formas amastigotas e tripomastigotas sob ação do composto.

2
Concentração do composto que reduz em 50% o crescimento parasitário. 3Concentração do
compostoque induz 50% de morte celular. 4IC50 do composto sobre as células dividido pelo IC50
do composto sobre o parasito. Os valores de IC50 foram calculados através de interpolação linear. ¥
~
100% de morte das células hospedeiras L929. * ~ 50% de morte das células hospedeiras L929.

O isolado MPUR 40.3 apresentou atividade antiparasitária com IC50 a

partir da concentração 26,83 μg/mL. O isolado APUR 39.1 apresentou excelente
efetividade antiparasitária em todas as concentrações, com redução de 100% da
atividade parasitária contra ambas as formas evolutivas do parasito (amastigotas
intracelulares e tripomastigotas) a partir da concentração mínima testada de
3,12 μg/mL. Na análise ao microscópio, indicou alta toxicidade ou efetividade
frente às células infectadas por T. cruzi. O isolado foi altamente tóxico para as
células de camundongos, sendo recomendada a realização de ensaio para

501
avaliar citotoxicidade. O isolado APUR 36.3 apresentou alta efetividade
antiparasitária com IC50 a partir da concentração mínimatestada 3,12 μg/mL e
redução de 100% a partir da concentração 12,5 μg/mL. Na análise ao
microscópio, indicou alta toxicidade, sendo recomendada a realização de ensaio
para avaliar citotoxicidade. O isolado MPUR 36.1 apresentou IC50 a partir da
concentração 10,79 μg/mL e redução de 100% na concentração máxima testada
de100 μg/mL.
A partir dos resultados obtidos, foi possível observar que os Streptomyces
testados apresentaram diferentes resultados, desde a ausência de atividade
contra T.cruzi (APUR 32.5, MAD 42 e MPUR 21.2), até 100% de inibição na
menor concentração testada (APUR 32.5). Rolón et al. 2006 também
demonstrou que compostos derivados de Streptomyces possuem a capacidade
de inibir in vitro o crescimento do T. cruzi. Além de Rolón et al. 2006, outros
autores, como Lima et al. (2012) e Ferreira et al. (2019), também demonstraram
a atividade antiparasitária de compostos derivados de Streptomyces contra T.
cruzi. Quanto à utilização de cepas não geneticamente modificadas, Andrade et
al. (2014) trabalharam com cepas de T. cruzi não modificadas geneticamente e
também observaram atividades antiparasitárias de compostos isolados de
Streptomyces.
A utilização do gênero Streptomyces nas pesquisas por bioativos é
amplamente conhecida, pela sua característica de produção de metabólitos
secundários diferentes. Dependendo da localização do habitat do Streptomyces,
ainda é uma área com grande potencial paranovas substâncias com atividade
farmacológica.

Conclusões
Foi possível observar que os extratos aquosos dos Streptomyces testados
contra T. cruzi in vitro, apresentaram diferentes porcentagem de inibição (de 0 a
100%). Além disso, os compostos mais promissores deverão ser isolados e
identificados para aprofundar o conhecimento sobre sua atividade
antiparasitária, e avaliar a citotoxicidade destes compostos de Streptomyces,
para uma possível atividade terapêutica.

502
 Agradecimentos
À Fundação de Amparo a Pesquisas do Estado do Amazonas - FAPEAM
e ao Instituto René Rachou - FIOCRUZ.

Referências
Al-Shaibani, M.M.; Radin Mohamed, R.M.S.; Sidik, N.M.; Enshasy, H.A.E.; Al-
Gheethi, A.; Noman, E.; et al. 2 0 2 1 . Biodiversity of Secondary Metabolites
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Costa, M. D. B.; et al. 2014. Screening of Streptomyces spp. for antitrypanosomal
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681.

Buckner, F.S.; Verlinde, C.L.M.J.; La Flamme, A.C.; Van Voorkhis, W.C. 1996.
Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi
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Ferreira, L.M.; Teixeira, T.A.; Bezerra, J.W.A.A.; Da Silva, M.C.; Da Silva, L.M.A.;
Santos, R.F.A.; Costa, M. D. B. 2019. Streptomyces sp. CBMAI 2042 as a source
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562-567.

Kuester, E.; Williams, S. T. 1964. Selection of media for isolation of

Streptomycetes. Nature 202(4928): 928-929.

Lacey, H.J.; Rutledge, P.J. 2022. Recently Discovered Secondary Metabolites

from Streptomyces Species. Molecules 27(3): 887.

Lima, L.M.; Bernardo, L.R.; Dantas, L.F.; Battistuzzi, F.G.; Ferraz, A.O.; Mota,
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Moretti, N.S.; Mortara, R.A.; Schenkman, S. 2020. Trypanosoma cruzi. Trends in

Parasitology 36(4): 404-405.

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Diseases,16: 466-471.

503
Rolón, M.; Velázquez, E.; Fuentealba, C.; Muñoz, S.; Pereira, I.; Vera, L.; et al.
2006. Antimicrobial and trypanocidal activities of Streptomyces spp. isolated from
Araucaria araucana rhizosphere. World Journal of Microbiology and
Biotechnology 22(5): 433-438.

504
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Autenticação e avaliação da síntese de enzimas de interesse

industrial por representantes do gênero Aspergillus

Barbosa, Elliza Emily Perrone1; Pimenta, Laynah1; Batista, Samara Cláudia

Picanço1Brito, Ana Kézia Pimentel de1; Nobrega, Jordane Pimentel2; Menezes,
Adryene Mota de3; Caetano, Thyago Souza3; Martim, Salomão Rocha4; Teixeira,
Maria Francisca Simas1

1Universidade Federal do Amazonas, 2Universidade Federal de Pernambuco, 3Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia, 4Universidade Nilton Lins, 5Universidade Federal
do Amazonas
Email: [email protected]

Resumo
O mercado mundial de enzimas vem crescendo anualmente e por isso novas
fontes são necessárias para atender à demanda industrial. Os fungos têm se
destacado na síntese de enzimas hidrolíticas de origem microbiana por
apresentam diversas vantagens, como a diversidade bioquímica e capacidade
de manipulação. Desse modo, esta pesquisa teve por objetivo autenticar
espécies de Aspergillus associando a avaliação da síntese de enzimas
hidrolíticas. As culturas viáveis e puras foram obtidas em ágar CYA [Czapek 0,5%
(p/v) suplementado com extrato de levedura 0,5%(p/v)], em placa de Petri. Para
a autenticação das espécies foram realizados cultivos em ágar Czapek-Dox +
Extrato de Levedura (CYA), ágar Czapek-Dox (CZ) e Ágar Extrato de Malte
(MEA). A avaliação da viabilidade das espécies foi realizada com base nas
características macromorfológicas, micromorfológicas e estruturas reprodutivas.
A síntese e a determinação da atividade de amilase, celulase e protease foi
realizada em meio sólido, pelo método do bloco de gelose. Apenas para
revelaçãoda síntese amilase ou celulases foi utilizado vapor de iodo, soluções
de vermelho do Congo (0,1%, p/v) e NaCl 1M, respectivamente. A atividade das
enzimas foi expressacom base no diâmetro do halo, em milímetros. Os valores de
atividade enzimática, emmédia, para A. flavus foi de 10,46 ± 0,0 mm a 15,27 ±
0,6 mm e, para A. melleus, 9,1± 0,0 mm a 14,50 ± 0,1 mm. Os resultados
confirmaram a viabilidade de A. flavus DPUA 516 e A. melleus DPUA 323, assim
como, a eficácia como fontes de amilases,celulases e proteases.

Palavras-Chave: biotecnologia; biossíntese; hidrolases

Introdução
Enzimas são reconhecidas por serem biocatalisadores com alta
especificidade e capacidade bioquímica, propriedades que favorecem a
realização de investigação e busca por esses catalisadores. Enzimas de origem

505
microbiana estão ganhando notoriedade e sendo valorizadas pela ótima
diversidade bioquímica dos microrganismos, alta facilidade de manipulação,
baixo custo de produção, quando comparadas as enzimas de origem vegetal e
animal (Robinson 2015; Rigo et al. 2021).
O aumento exponencial das enzimas e crescimento no mercado se deve
a capacidade em relação ao substrato. Em 2019, o mercado mundial de enzimas
foi estimado em aproximadamente US$10,0 bilhões, com crescimento anual de
7,1%, e com aumento previsto de US$14,9 bilhões em 2025 (Munhoz 2020).
Enzimas são empregados em vários setores, na indústria de alimentos,
farmacêutica, cosméticos, couro, têxtil e de detergentes. Entre as fontes de
enzimas, os fungos se destacam pelas eficientes características fisiológicas,
adaptação de crescimento em condições in vitro, e são importantes produtores
de enzimas hidrolíticas, tais como proteases, amilases e celulases (Barbosa et
al. 2020Souza et al. 2020; Pimenta et al. 2021).
Representantes do gênero Aspergillus possuem aproximadamente 340
espécies, distribuídas no mundo, de hábito sapróbio, com habilidade de
crescimento em diferentes substratos. A alta capacidade de adaptação
fisiológica desses organismos permite que sintetizem enzimas com atividade
biológica relevante para indústria, se destacando em diversos processos
biotecnológicos. (Klich e Pitt 1988; Samson et al. 2004; Silva et al. 2017; Oliveira
Filho et al. 2022).
Além da capacidade de síntese enzimática, espécies de Aspergillus
apresentam diversas variações micromorfológicas e macromorfológicas. Em
processos biotecnológicos que utilizam microrganismos é essencial o uso de
culturaspuras e viáveis. Neste sentido, a autenticação microbiana é uma etapa
fundamental que permitirá a estabilidade de produção de enzimas em processos
industriais(Attili-Angelis et al. 2022).
Em função da importância biotecnológica e fisiológica dos representantes
do gênero Aspergillus, esta pesquisa teve por objetivo autenticar e avaliar a
produção decelulases, proteases, amilases por Aspergillus flavus DPUA 516 e
Aspergillus melleus DPUA 323.

506
 Material e Métodos
Microrganismos
Neste estudo foram selecionadas duas espécies do gênero Aspergillus
sendo, Aspergillus flavus DPUA 516 e Aspergillus melleus DPUA 323. Os
microrganismos foram cedidos do acervo da Coleção de Culturas DPUA, da
Universidade Federal do Amazonas - UFAM. As culturas viáveis e puras foram
obtidas em ágar CYA [Czapek 0,5% (p/v) suplementado com extrato de levedura
0,5% (p/v)], em placa de Petri de 90 mm x 15 mm, a 25 °C por sete dias (Klich e
Pitt 1988; Prado et al. 2021).

Autenticação e manutenção das espécies

Para a autenticação das espécies conservadas em óleo mineral foram
realizados cultivos em ágar Czapek-Dox + Extrato de Levedura (CYA), ágar
Czapek-Dox (CZ) e Ágar Extrato de Malte (MEA), em placas de Petri (90 mm x
15 mm). As culturas foram mantidas a 25 °C durante sete dias. A confirmação
da viabilidade das espécies de Aspergillus foi analisada com base nas
características macromorfológicas como: diâmetro, coloração, textura,
topografia, difusão de pigmento, presença de exsudato, cor do reverso Além das
características micromorfológicas, como as estruturas de reprodução, aspecto
das hifas e conídios utilizando o corante azul de Lactofenol sob microscópio
óptico (Raper e Fennell 1977; Klich e Pitt 1988).

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ENZIMAS DE INTERESSE INDUSTRIAL

Atividade enzimática qualitativa de amilase, celulase e protease

Para a avaliação da atividade enzimática de amilase, celulase e protease
pelas espécies de Aspergillus foi utilizada a técnica do bloco de gelose (Prado et
al. 2017; Barbosa et al. 2023). Das culturas obtidas em ágar Czapek-Dox +
Extrato de Levedura (CYA), ágar Czapek-Dox (CZ) e Ágar Extrato de Malte
(MEA) foram transferidos fragmentos miceliais de 8 mm de diâmetro e inoculados
na superfície deágar Amido, ágar Carboximetilcelulose e ágar leite. As placas
foram mantidas a 37 ºC por 18 horas. Para evidenciar a atividade de celulases
foram utilizadas soluções reveladoras: vermelho do Congo (0,1%, p/v) e NaCl
1M e, para amilases, vapor de iodo. Na determinação qualitativa de enzimas

507
proteolíticas não foi necessário o uso de solução reveladora. Após 18 horas a
atividade enzimática foi determinada pelo diâmetro do halo em milímetros
(Coelho et al. 2021).

Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva média, desvio
padrão, gráficos e os cálculos de atividade enzimática (R2 ≥ 95%) por análise de
variância (Anova) e teste Tukey (p<0,05) para comparação de médias, utilizando
o software Minitab ® versão 17.0.

Resultados e Discussão
Os resultados da autenticação das espécies de Aspergillus estão
representados nas figuras 1 e 2. Ambas as espécies cresceram em todos os
meios testados. Os cultivos foram realizados em meio de cultura padrão CYA
(Czapek-Dox+ Extrato de Levedura), CZ (Czapek-Dox) e MEA (Ágar extrato de
malte), respectivamente. Nos testes realizados, as análises macromorfológicas
e micromorfológicas confirmaram a identificação de Aspergillus flavus DPUA 513
e Aspergillus melleus DPUA 323.

Figura 1. Aspectos macromorfológicos de Aspergillus flavus DPUA 516: (A) Czapek-Dox +

Extrato deLevedura [CYA], (B) Czapek-Dox [CZ], (C): Extrato de Malte [MEA], 7
dias, 25ºC.

508
Figura 2. Aspetos macromorfológicos de Aspergillus melleus DPUA 323 em diferentes meios
de cultivo: Czapek-Dox + Extrato de Levedura [CYA], (B) Czapek-Dox [CZ], (C) Extrato de
Malte [MEA], 7 dias,25ºC.

As colônias de A. flavus nos cultivos em CZ, CYA, e MEA apresentaram 57

mm, 62 mm, 53 mm de diâmetro após sete dias de crescimento, a 25ºC,
respectivamente. Nos cultivos em CYA a coloração de micélio apresentou-se
esverdeada (verde oliva),com textura cotonosa e lanosa, ausência de pigmento
e exsudato, com formação de ondulações (rugas) no verso da placa. O cultivo
em CZ, A. flavus demonstrou micélio esverdeado com áreas esbranquiçadas,
centro umbilicado, textura cotonosa, ausência de exsudato e difusão de
pigmento no meio. No entanto, em MEA apresentou micélio basal, esverdeado,
com zonas concêntricas, fino bordas amareladas, superfície da colônia rugosa,
ausência de exsudato e difusão de pigmento no meio.
Nos cultivos em A. melleus as colônias em CZ, CYA, e MEA,
apresentaram 19,5 mm, 25 mm, 21,5mm de diâmetro, respectivamente. Em
CYA a colônia rugosa, exibiu coloração amarela-cremoso, no centro e, branca
nas bordas, centro umbilicado,ausência de exsudato e difusão de pigmento. Em
CZ e MEA as colônias apresentaramcoloração amarela no centro e branca nas
bordas, umbilicada, cotonosa e lanosa, ausência de pigmento e exsudato.
Dados similares foram obtidos por Prado et al. (2021), Oliveira Filho et al.
(2022) e Benchaya et al. (2022) que verificaram culturas de diferentes espécies
de representantes do gênero Aspergillus, bem como Aspergillus flavus
preservadas em água destilada e óleo mineral.
Os fungos necessitam de macro e micronutrientes para realizar as
atividades metabólicas. A diferença nas características morfológicas das

509
espécies de fungos se dá devido as características nutricionais presente na
formulação dos meios de cultivo, tendo em vista que a relação c:n
(carbono/nitrogênio) são fatores cruciais para a mudança na fisiologia dos
fungos, apresentando assim diferentes características fenotípicas visíveis
quando submetidos a diferentes fontes de crescimento (Griffin 1994; Walker e
White 2018, Pimenta et al. 2021).
Além das fontes nutricionais, estão aliadas ao crescimento fúngico fatores
físicos, como temperatura, luminosidade, aeração, osmolaridade, pH,
temperatura, estes que são fundamentais para também expressar diferentes
características morfológicas e fisiológicas de diferentes espécies de fungos
(Griffin 1994; Gompertz et al. 2015; Rodrigues 2018; Barbosa et al. 2020).
Os estudos de Tsang et al. (2018) e Holiachuk e Kosylovych (2021)
afirmaram que as espécies de Aspergillus são geralmente classificadas pelas
suas características morfológicas, e que estudos fisiológicos dos representantes
desses gêneros, bem como estudos taxonômicos fornecem ótimos
apontamentos sobre a evolução das espécies do gênero.
As características micromorfológicas das espécies de Aspergillus estão
ilustradas na figura 3. Nesta pesquisa, foi possível observar que ambas as
espécies estudadas expressaram características típicas do gênero, como hifas
septadas,conidióforo, vesícula, esterigmas e conídios (Figura 3).
Klich e Pitt (1988) denominaram características fundamentais para A.
flavus, tais como vesícula na extremidade do conidióforo, esterigmas e conídios
em forma de cadeia, apresentando conídios globosos a elipsoidais, com paredes
finas a finamente rugosas, características nas quais foram observadas nesta
pesquisa (Figura 3-A). Aoanalisar as estruturas microscópicas reprodutivas de
A. melleus DPUA 323 foi observado conidióforo com paredes espessas, conídios
globosos a subglobosos, esterigmas, vesícula, características as quais também
foram descritas por Domsch, Gams e Anderson (2007) (Figura 3-B).

510
Figura 3. (A) Estruturas de reprodução característica de Aspergillus flavus DPUA 516 e (B)
Aspergillus melleus DPUA 323, observadas sob microscópio óptico (Aumento 100x e 40x,
respectivamente).

Na figura 4 está demonstrada a atividade de amilases, celulases e

proteases por A. flavus DPUA 516 e A. melleus DPUA 323. As espécies
avaliadas sintetizaram enzimas hidrolíticas em todos os meios testados,
verificando-se 44,44% de valores significativos para amilase, celulase, protease.
Em média, os halos de degradação enzimática variaram de 10,46 ± 0,0 mm a
15,27 ± 0,6 mm para A. flavus e, para A. melleus foi de 9,1 ± 0,0 mm a 14,50 ±
0,1 mm.
Com base nos dados obtidos, a atividade enzimática significativa para
amilases(15,27 ± 0,6 mm), celulases (13,5 ± 0,1 mm) e proteases (15,0 ± 0,1 mm)
foi observadanos cultivos de A. flavus, nos meios CYA e YES (Figura 4). Nos
estudos realizados por Benchaya et al. (2022) e Oliveira Filho et al. (2022) A.
flavus e Aspergillus clavato flavus expressaram atividade de proteases igual a
20,33 e 21,5 mm, em média. Freires(2019) demonstrou síntese de amilase de
34,6 mm, para o gênero Aspergillus. Souza et al. (2020) cita que, A. oryzae
apresentou degradação enzimática significativa de celulases igual a 17,3 mm,
em média.
Nos cultivos de Aspergillus melleus os resultados significativos da
atividade enzimática foram observados nos meios YES e CYA, para amilase
(11,1 mm ± 0,1), celulase (12,46 mm ± 0,1), protease (14,5 mm ± 0,1), em média.
Em outras pesquisas, a exemplo de Prado et al. (2021) verificaram para A.
melleus atividade enzimática deproteases, em média, 22,17 ± 1,0 mm. Souza et

511
al. (2020) verificaram atividade enzimática de amilase e celulase para A.
subolivaceo e Aspergilus sp., em média, 14,3 mm e 19,0 mm, respectivamente.
Dados similares foram obtidos por Brito et al. (2021) e Coelho et al. (2021) em
meios sintéticos ou naturais para espécies de cogumelos comestíveis.

Figura 4. Média de atividade enzimática qualitativa de enzimas hidrolíticas de A. flavus DPUA

516 e A.melleus DPUA 323. Letras iguais não diferem estatisticamente pelo método de Tukey
(p<0,05).

Com base nos dados obtidos observou-se que a atividade enzimática

significativa foi determinada principalmente nos cultivos em CYA e YES (Figura
4), ambos formulados com extrato de levedura, fator que influenciou
positivamente na atividade enzimática. Dados da literatura mostram que a
utilização de fatores de crescimento, tais como o extrato de levedura, são
excelentes fonte de vitaminas do complexo B, aminoácidos, que auxiliam a
grande maioria dos fungos, por possuírem outros diferentes fatores que auxiliam
no crescimento e na reprodução dos fungos (Barnes et al.1975; Wenzel et al.
2021).

Conclusões
A. flavus DPUA 516 e A. melleus DPUA 323 apresentam características
clássicas de viabilidade, tanto com base nas características morfológicas quanto
nasde reprodução. Além disso, as análises mostram que são espécies que
sintetizam enzimas hidrolíticas extracelulares de importância industrial,

512
amilases, celulases e proteases, especialmente quando cultivadas em meios
enriquecidos com extrato de levedura (CYA e YES). Tais enzimas podem ser
utilizadas em diversos processos industriais para a produção de alimentos,
medicamentos, cosméticos e detergentes.

Agradecimentos
Ao Laboratório de Micologia Médica e Industrial e à Coleção de Culturas
DPUA da Universidade Federal do Amazonas - UFAM. Ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia - PPGBIOTEC/UFAM. À Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES. Aos colegas
colaboradores, graduandos, mestres e doutores.

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Caracterização morfológica de Aspergillus spp. com

divergênciataxonômica da Coleção de Microrganismos de
Interesse Agrossilvicultural do INPA

Silva, Isabelly Guimarães Oliveira1; Ferreira, Suzana Mineiro2; Oliveira, Luiz

Antonio2; Jesus, Maria Aparecida2
1Universidade Federal de Pernambuco, 2Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia.
Email: [email protected]; [email protected].

Resumo
O acervo de fungos da Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural - INPA inclui culturas de vários gêneros de fungos anamorfos,
sendo Aspergillus um dos com maior numero de linhagens. Por apresentarem
um grande interesse bioeconônimo, devido a suas aplicabilidades
biotecnológicas, a identificação e preservação de suas linhagens é de extrema
importância para estudos de cunho taxonômico e biotecnológico. Dessa forma,
o objetivo deste trabalho foi avaliar e identificar as linhagens de Aspergillus
presentes na coleção. A reativação das cepas foi realizada a partir daquelas
preservadas em baixa temperatura e água destilada utilizando um fragmento
de meio BDA (Batata, Dextrose e Ágar), sendo incubadas na estufa a 26°C.
Aquelas que estavam contaminadas ou inativas, optou-se por utilizar as
linhagens preservadas em sílica-gel e/ou óleo mineral, empregando o mesmo
procedimento de reativação. Após a obtenção das culturas puras, estas foram
identificadas de acordo com as características macroscópicas (cultivo em meio
CYA e MEA) e microscópicas das colônias (microcultivo). Um total de 129
linhagens foi reativado, destas, 16 cepas foram caracterizadas
morfologicamente, pertencentes as seguintes espécies A. caelatus (4), A.
flavus (1), A. fumigatus (1), A. niger (4) e A. tamarii (6). As culturas puras foram
preservadas nos seguintes métodos: baixa temperatura, água destilada
(Castellani), sílica-gel e óleo mineral. A identificação e preservação das
linhagens possibilita o acesso das mesmas para estudos de taxonomia e/ou
biotecnologia pouco explorados na região amazônica.

Palavras-Chave: Coleção de culturas; Fungo anamorfo; Amazônia

Introdução
Aspergillus é um gênero anamorfo descrito para a ordem Eurotiales
(classe Eurotiomycetes, filo Ascomycota) (Houbraken e Samson 2011). Um
aumento significativo de espécies foi descrito desde 2014, elevando o número
para 446 espécies aceitas (Houbraken et al. 2020). Atualmente sua classificação

516
infragenérica está distribuída em 6 subgêneros (Aspergillus, Circumdati,
Cremei, Fumigati, Nidulantes e Polypaecilum) e 27 seções propostas por
Houbraken et al. (2020). Essas seções formam um único clado monofilético,
mostrando que o Aspergillus é um grupo diversificado de fungos.
O gênero Aspergillus está entre os fungos mais abundantes do mundo,
sendo amplamente distribuídos na natureza, isto porque não são muito seletivos
às condições de crescimento abiótico (Krijgsheld et al. 2013; Tsang et al. 2018).
São comumente isolados de solos e plantas caídas, sendo bastante abundantes
em regiões de clima tropical e subtropical (Klich 2002). Em relação à sua forma
de vida,a maioria das espécies é sapróbia, e várias patogênicas de animais e
humanos (Houbraken et al. 2014). Muitas espécies são conhecidas por seus
potenciais biotecnológicos e alimentares, sendo utilizadas para a produção de
vários metabólitoscomo enzimas, ácidos orgânicos, produtos farmacêuticos ou
até mesmo como agentes na fermentação de alimentos (Samson et al. 2014).
No acervo de fungos da Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural - CMIAINPA estão depositadas várias linhagens de Aspergillus
isoladas de diversas espécies florestais de importância econômica da Amazônia.
As culturas estão preservadas em diferentes métodos mantidas em baixa
temperatura, água destilada esterilizada (Castellani), sílica-gel e óleo mineral
(Coelho et al. 2007). Contudo, é necessário melhorar a operacionalidade da
coleção com a catalogação, informatização dos dados e identificação de cada
isolado, para que possam ser acessadas na realização de diferentes projetos de
cunho científico.
Objetiva-se atualizar o banco de dados do acervo, reativar e caracterizar
morfologicamente as linhagens de Aspergillus da Coleção de Microrganismos de
Interesse Agrossilvicultural do INPA.

Material e Métodos
Inicialmente foi realizado um levantamento das linhagens de Aspergillus
depositadas na Coleção de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural do
INPA. Para a reativação das linhagens, optou-se primeiramente por utilizar as
amostras conservadas em baixa temperatura e água destilada. Em ambos os
métodos, foi retirado um inóculo das amostras e repicado em tubos de
epperdorffs (2 ml) contendo um fragmento de meio de cultivo Batata-Dextrose-

517
Ágar (BDA), sendo incubados em estufa a 26 °C até que fosse possível a
observação dos corpos de frutificação característico do fungo. Aqueles que não
apresentaram contaminação foram repicados três inóculos em pontos
equidistantes sobre meio BDA em placas Petri (45 x 10 mm), as quais foram
incubadas a 26 °C, em média por 5 dias, até a formação das três colônias. Para
aquelas linhagens que não cresceram ou estavam contaminadas optou-se por
utilizar as amostras preservadas em sílica-gel e/ou óleo mineral. As amostras
foram submetidas ao mesmo procedimento de reativação em baixa temperatura
e água destilada.
A identificação das linhagens que apresentavam divergência taxonômica
em relação a espécie foi feita com base nas características micro e
macroscópicas. Para a análise microscópica foi utilizada a técnica de
microcultivo proposta por Riddell (1950), modificada. Já as características
macroscópicas das culturas de Aspergillus foram observadas a partir do repique
de três pontos em placas de Petri (90 x 15 mm),com Ágar Extrato de Malte (MEA)
e Ágar Czapek-Dox + Extrato de Levedura 0,5% (p/v) (CYA), as quais foram
incubadas em estufa a 26 °C, por 5-7 dias. Os nomes dos fungos foram
acessados no Mycobank (http://www.mycobank.org), visando aconfirmação
da espécie e dos nomes dos autores. Também, as seguintes literaturasforam
utilizadas na identificação das linhagens (Klich e Pitt 1988; Abarca et al. 2004;
Hedayati et al. 2007; Samson et al. 2007; Frisvad et al. 2019; Le Pape et al.
2019). Por fim, todas as linhagens foram presevardas em triplicatas nos
seguintes métodos de preservação: baixa temperatura, água destilada
(Castellani), óleo mineral e sílica-gel. Para a guarda do acervo nos diferentes
métodos de preservação, todas as amostras foram devidamente etiquetadas
com o número de registro da cepa na coleção e a data da reposição.
Posteriormente, todos os dados foram atualizados no banco de dados da CMIA
INPA.

Resultados e Discussão
Do total de 162 linhagens depositadas no acervo de Aspergillus na
Coleção Microbiológica - INPA, 129 linhagens foram reativadas, sendo que 71
culturas puras foram obtidas daquelas conservadas em baixa temperatura e
outras 44 provenientesdas mantidas em água destiladas. Poucas linhagens (8 e

518
6) foram recuperadas de amostras no óleo mineral e sílica-gel (Tabela 1),
respectivamente. De modo que houverecuperação de 79,6% das linhagens do
acervo de Aspergillus, sendo que somente 20,4% mostrou-se inviável
culturalmente, independente do método de preservação nas quais foram
mantidas.

Tabela 1. N ú m e r o de linhagens de Aspergillus depositadas e reativadas em cada método

depreservação.
Método de preservação N° de linhagens N° de linhagens
Depositadas Reativadas
Baixa temperatura (Tubo) 116 71
Água destilada (Castellani) 55 44
Óleo mineral 50 8
Sílica-gel 97 6
Total 162 129

Com este estudo, dentre as 129 linhagens preservadas na coleção, 16

cepas foram caracterizadas morfologicamente e estão distribuídas em A.
caelatus (4), A. flavus (1), A. fumigatus (1), A. niger (4) e A. tamarii (6).
Os métodos de conservação utilizados para preservar as linhagens de
Aspergillus mostraram-se eficazes, visto que a maioria das cepas manteve suas
características originais após reativação. As linhagens inativadas podem ser
resultantes da inoculação incorreta da cultura, o que provavelmente não garantiu
a estabilidade das características morfológicas. Ainda assim, os dados indicam
que o método de conservação em água destilada é o mais indicado para a
conservação de fungos do gênero Aspergillus, seguido de baixa temperatura,
principalmente por promoverem a conservação a longo prazo das culturas (Girão
et al. 2004) e uma análise fenotípica e genotípica mais satisfatória do acervo.
O uso de técnicas de genética molecular para estudar a taxonomia desses
fungos vem sendo recomendado, no entanto as características morfológicas e
culturais foram utilizadas para a identificação devido a sua simplicidade,
acessibilidade e viabilidade. Ambas as características macro e
micromorfológicas das linhagens de Aspergillus fornecerão dados
complementares para a identificação polifásica que vem sendo realizada,
principalmente para aquelas linhagens com possíveis potenciais biotecnológicos
e de interesse taxonômico, segue descrição das caracteriticas de importância
taxônomicas das linhagens de Aspergillus depositados na CMIA INPA.

519
Taxonomia

Aspergillus caelatus B.W. Horn, Mycotaxon 61: 186 (1997).

Características Macroscópicas: Diâmetro da colônia em CYA atinge 46 - 49
mm, em 7 dias a 26 °C; superfície da colônia flocosa, com abundante
esporulação ecoloração amarela a verde oliva; topografia sulcada radialmente;
micélio branco; reverso alaranjado sem pigmentos difusíveis; esclerócio não
observado (Fig. 1.B). Diâmetro da colônia em MEA, 7 dias a 26 °C: 44 - 48 mm;
superfície flocosa a granulada, com esporulação densa no centro e coloração
amarelo e verde oliva; topografia plana com estrias circulares; micélio branco;
reverso incolor a amarelo opaco; pigmentos solúveis ausentes; esclerócio não
observado (Fig. 1.B).
Características Microscópicas: Cabeças conidiais tipicamente radiadas, com
formas bisseriais e unisseriadas; estirpes hialinas, de parede áspera, 348,7 -
966,1 µm (Me: 615,3 µm) de comprimento (Fig. 2.D); vesículas globosas a
subglobosas, hialinas, 24,7 - 44,5 µm (Me: 31,5 µm) de diâmetro; métulas
hialinas, 4,5 - 11,0 x 3,6- 6,5 µm (Me: 8,0 x 4,9 µm); fiálides hialinas, 7,0 - 14,4
x 3,9 - 6,8 µm (Me: 9,4 x 5,2 µm); conídios globosos a subglobosos, 4,4 - 6,9 x
4,3 - 7,1 (Me: 4,8 x 4,7 µm), paredeespessa a tuberculada (Fig. 2.I).
Linhagens examinadas: Brasil, Amazonas, Manicoré, castanha-do-brasil.
Gomes, P.(CMINPA 1567, CMINPA 1568, CMINPA 1571, CMINPA 1585).
Distribuição: Predominantes em climas subtropicais e tropicais (Frisvad et al.
2019).
Habitat: Solos, sementes de amendoim e castanhas (Le Pape et al. 2019).
Comentários: Aspergillus caelatus é microscopicamente semelhante a A.
tamarii, apresentando conídios grandes com parede espessa a tuberculada,
ambas apresentam coloração amarela a verde oliva. Dessa forma, os métodos
fenotípicos semostraram limitados para separar essas espécies. Contudo, nas
condições de cultivorealizadas, foram observadas diferenças no aspecto de suas
colônias. A. caelatus apresenta conidióforos com comprimentos diferentes em
toda região da colônia (Fig. 1.B). As colônias de A. Tamarii apresentam os
conidióforos com tamanhos desiguais ocorrem somente na região central da
colônia (Fig. 1.C). Estes caracteres podem ser empregados na diferenciação

520
dessas duas espécies. A. caelatus é de grande ocorrência na castanha-do-Brasil
(Calderari et al. 2013).

Aspergillus flavus Link, Magazin der Gesellschaft Naturforschenden Freunde

Berlin3 (1): 16 (1809).
Características Macroscópicas: Diâmetro da colônia em CYA 56 - 57 mm, em 5
diasa 26 °C; superfície da colônia flocosa a granulada; coloração amarela a oliva;
topografia sulcada radialmente; micélio branco; reverso alaranjado sem
pigmentos difusíveis; esclerócio não observado (Fig. 1.A). Diâmetro da colônia
em MEA, 5 dias a 25°C: 49 - 55 mm; superfície granulada, com esporulação
densa no centro; coloração verde musgo a amarelo; topografia plana com estrias
circulares; micélio branco; reverso amarelo opaco; pigmentos solúveis ausentes;
esclerócio não observado (Fig. 1.A).
Características Microscópicas: Cabeças conidiais radiadas a colunares, com
formas bisseriais e unisseriais; estirpes hialinas, de parede áspera, 343,5 - 605,9
µm(Me: 478,4 µm) de comprimento; vesícula esférica a alongada, hialinas, 28,2
- 44,9 µm (Me: 35,9 µm) de diâmetro (Fig. 2.A); métulas hialinas, 3,3 - 8,6 x 3,5
- 5,6 µm (Me: 5,4 x 4,1 µm); fiálides hialinas, 5,5 - 7,9 x 3,3 - 4,6 µm (Me: 7,0 x 3,9
µm); conídios globosos a elipsoidais, 3,2 - 5,4 x 2,5 - 5,0 µm (Me: 4,4 x 4,0 µm),
parede lisa a equinulada (Fig. 2.F).
Linhagens examinadas: Brasil, Amazonas, Manicoré, castanha-do-brasil.
Gomes, P.(CMINPA 1569).
Distribuição: cosmopolita ampla distribuição mundial, predominantes em climas
subtropicais e tropicais (Hedayati et al. 2007).
Habitat: Aspergillus flavus vivem como saprófitas no solo, sendo um importante
reciclador de nutrientes. Tem sido relatado em um grande número de sementes
oleaginosas e nozes. Também é reportado como patógeno de inseto e animais
(Frisvad et al. 2019).
Comentários: Aspergillus flavus é caracterizado pelas colônias amarelo-
esverdeadas. Em comparação com o descrito por Klich e Pitt (1988), as
linhagens examinadas nesse estudo apresentam métulas e fiálides de menor
tamanho, 3,3 - 8,6 µm (vs 8 - 10 µm) e 5,5 - 7,9 µm (vs 8 - 12 µm),
respectivamente. Além da coloração da colônia, A. flavus difere de A. tamarii e
A. caelatus pois apresenta conídios de parede lisa a equinulada e de tamanho

521
menor (3,2 - 5,4 x 2,5 - 5,0 µm). São comumente encontrados na castanha-do-
Brasil (Calderari et al. 2013).

Aspergillus fumigatus Fresenius, Beitr., Mykologie 3: 81 (1863).

Características Macroscópicas: Diâmetro da colônia em CYA 49 - 55 mm, em 7
dias a 26 °C; colônias com textura aveludada a granulada; esporulação
distribuída uniformemente; região central com coloração turquesa acinzentado e
margens brancas; topografia sulcada radialmente a plana; micélio branco;
reverso marrom opaco; sem pigmentos difusíveis; esclerócio não observado
(Fig. 1.D). Diâmetro da colônia em MEA, 7 dias a 26 °C: 37 - 38 mm; textura
das colônias como em CYA exceto que seja consistentemente plano; conídios
turquesa acinzentado; micélio branco; reverso incolor; pigmentos solúveis
ausentes; esclerócio não observado (Fig.1.D).
Características Microscópicas: Cabeças conidiais predominantemente
colunares, unisseriada; estirpes hialinas, de parede lisa, 407,9 - 918,4 µm (Me
641,7 µm) de comprimento; vesícula piriformes, hialinas, 14,1 - 28,5 µm (Me: 20,4
µm) de diâmetro;fiálides hialinas, 5,6 - 7,0 x 2,4 - 4,3 µm (Me: 6,2 x 2,4 µm),
sobre a metade superior da vesícula, curvando-se de modo que todas as fiálides
são paralelas umas às outras(Fig. 2.B); conídio globoso a oval, 2,4 - 3,4 x 2,4 -
3,1 (Me: 2,9 x 2,7 µm), parede lisaa finamente rugosa (Fig. 2.G).
Linhagens examinadas: Brasil, Amazonas, Manaus, no tronco da Parkia
multijuga. Carvalho, R. S. 19 de agosto de 1987 (CMINPA 108).
Distribuição conhecida: Fungo cosmopolita, distribuído mundialmente (Pringle
et al. 2005).
Habitat: Solos, alimentando-se de detritos orgânicos. É um patógeno de
humanos e animais (Pringle et al. 2005).
Comentários: Aspergillus fumigatus é distinguida das demais espécies do
gênero por apresentar colônias de coloração turquesa acinzentada, fiálides
curvando-se paralelamente e conídios pequenos. A linhagem desse estudo
apresenta características semelhantes as descritas por Klich e Pitt (1988) e
Samson et al. (2007), contudo, com estipe de tamanho maior 407,9 - 918,4 µm
(vs 200 - 400 µm).

522
Aspergillus niger Tiegh., Annales des Sciences Naturelles Botanique 8: 240
(1867).
Características Macroscópicas: Diâmetro da colônia em CYA 55 - 60 mm, em 7
diasa 26 °C; superfície da colônia flocosa a granulosa; com esporulação densa;
conídios pretos a marrom escuro; topografia sulcada radialmente; micélio
branco; reverso amarelado, pequenas gotículas de exsudato hialino a escuro são
visíveis; esclerócio não observado (Fig. 1.E) Diâmetro da colônia em MEA, 7
dias a 26 °C: 50 - 58 mm; superfície da colônia granulada; com esporulação
densa; conídios pretos a marrom escuro; topografia relativamente sulcada a
plana; micélio branco; reverso amarelado; pigmentos solúveis ausentes;
esclerócio não observado (Fig. 1.E).
Características Microscópicas: Cabeças conidiais radiadas,
predominantemente bisseriais; estirpes hialinas a marrom mais claro perto do
ápice, de parede grossa e lisa, 494,4 - 988,8 µm (Me: 720 µm) de comprimento
(Fig. 2.C); vesícula globosa, hialinas, 42,7 - 71,2 µm (Me: 58,3 µm) de diâmetro;
métulas cobrindo praticamente todas a superfície da vesícula, às vezes
apresentando um único septo; conídios globosos a subglobosos, 3,2 - 4,4 x 2,8
- 4,2 (Me: 3,8 x 3,5 µm), parede áspera com cumes irregulares e barras (Fig.
2.H).
Linhagens examinadas: Brasil, Amazonas: Presidente Figueiredo, madeira em
uso,Jesus, M. A. 25 de janeiro de 1984 (CMINPA, 32); Manaus: no tronco da
Parkia multijuga. Carvalho, R. S. 18 de agosto de 1987 (CMINPA 132); tronco de
árvore caído. Hanada, R. E. e Abreu, R. L. S. 12 de setembro de 2000 (CMINPA
598, CMINPA 1450).
Distribuição conhecida: Distribuídos mundialmente (Abarca et al. 2004).
Habitat: Aspergillus niger ocorre em uma grande variedade de substratos,
considerados fungos decompositores. É um dos fungos mais comumente
relatados em alimentos (Abarca et al. 2004).
Comentários: As linhagens examinadas apresentam aspectos macro e
micromorfológicos similares as descritas para A. niger por Klich e Pitt (1988).

Aspergillus tamarii Kita, Centralbl. Bakteriol., Abt. 2: 433 (1913).

Características Macroscópicas: Diâmetro da colônia em CYA 45 - 46 mm, em 6
dias a 26 °C; superfície da colônia flocosa a granulada; com conidióforos

523
desiguais em comprimento, dando a colônia uma textura grosseira; conídios
amarelos a verde oliva;topografia sulcada radialmente; micélio branco; reverso
alaranjado, pigmentos solúveis ausentes; esclerócio não observado (Fig. 1.C).
Diâmetro da colônia em MEA,6 dias a 26 °C: 33 - 36 mm; superfície granulada,
com conidióforos centrais longos; coloração verde musgo; topografia plana com
estrias circulares; micélio branco; reverso branco a amarelo opaco; pigmentos
solúveis ausentes; esclerócio não observado (Fig. 1.C).
Características Microscópicas: Cabeças conidiais radiadas, com formas
unisseriadas e bisseriais presentes na maioria dos isolados; estirpes hialinas, de
parede áspera, 613 - 1.192 µm (Me: 955 µm) de comprimento; vesícula globosa,
hialinas, 16,0 - 52,6 µm (Me: 31 µm) de diâmetro (Fig. 2.E); métulas cobrindo
praticamente toda a superfície da vesícula 7,1 - 10,7 x 3,5 - 5,9 (Me: 8,8 x 5
µm); fiálides hialinas, 6,3 - 15,2 x 3,3 - 7,8 µm (Me: 10,4 x 5,4 µm); conídios
globosos a subglobosos, 4,5 - 8,1 x 3,9 - 7,6 (Me: 6 x 5,6 µm), com parede
espessa e grosseiramente rugosa (Fig. 2.J).
Linhagens examinadas: Brasil, Amazonas, Manicoré, castanha-do-brasil.
Gomes, P. (CMINPA 1559, CMINPA 1565, CMINPA 1580, CMINPA 1596,
CMINPA 1597, CMINPA 1611).
Distribuição conhecida: Ocorre mais comumente em regiões tropicais e
subtropicais (Frisvad et al. 2019).
Habitat: Solos, sementes de amendoim (Frisvad et al. 2019)
Comentários: Como mencionado acima, A. tamarii e A. caelatus apresentam
poucas diferenças micro e macromorfológicas. Em geral, as linhagens desse
estudo apresentam características semelhantes as descritas por Klich e Pitt
(1988), a única diferença é a grande variação de tamanho das vesículas 16,0 -
52,6 µm (vs 20,0 - 45,0µm). A. tamarii é comumente encontrada em castanha-
do-Brasil (Calderari et al. 2013).

524
Figura 1. Aspecto das colônias de Aspergillus com 5-7 dias em meio de cultivo CYA e MEA de
A. flavus(CMINPA 1569) (A), reverso (A'); A. caelatus (CMINPA 1567) (B), reverso (B'); A.
tamarii (CMINPA 1580) (C), reverso (C'); A. fumigatus (CMINPA 108) (D), reverso (D') e A.
niger (CMINPA 1450) (E), reverso (E').

525
Figura 2. Características microscópicas dos conidióforos e conídios de Aspergillus flavus
(CMINPA, 1569) (A e F); A. fumigatus (CMINPA, 108) (B e G); A. niger (CMINPA, 1450) (C
e H); A. caelatus (CMINPA, 1567) (D e I) e A. tamarii (CMINPA, 1580) (E e J). Barra de
escala: 10µm.

Conclusões
Das 162 linhagens de Aspergillus depositadas na CMIA-INPA, 129 foram
recuperadas e estão preservadas em diferentes métodos: baixa temperatura,
água destilada esterilizada, sílica-gel e óleo mineral. Houve uma perda de 20,4%
das linhagens, independente do método de preservação nas quais foram
mantidas. Dentreas 128 linhagens de Aspergillus preservadas na CMIA-INPA,
16 destas estão caracterizadas morfologicamente e distribuídas em A. caelatus
(4), A. flavus (1), A. fumigatus (1), A. niger (4) e A. tamarii (6).

526
 Agradecimentos
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazona - FAPEAM,
pela bolsa de apoio técnico concedida à Isabelly Guimarães Silva e pelo apoio
financeiro por meio do projeto Coleção Microbiológica de Interesse
Agrossilvicultural do INPA e ao Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovações -
MCTI, pela bolsa de apoio técnico concedida à Suzana Mineiro Ferreira.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Conhecendo o metaboloma de um fungo isolado de Annona

jahnii saff. do norte da Amazônia Brasileira

Xavier, Luciana Araújo1; Porto, Carla2; Flach, Adriana1; Pilau, Eduardo

Jorge2; Costa, Luiz Antonio Mendonça Alves da1

1Universidade Federal de Roraima, 2Universidade Estadual de Maringá.

Email: [email protected]

Resumo
Espécies de Annona são notadamente promissoras no isolamento de
metabolitos extremamente úteis para aplicação biotecnológica. No entanto, a
espécie Annona jahnii Saff. ainda é pouco explorada e o estudo de seus
endofíticos é inédito. Estes microrganismos representam um recurso com imenso
potencial na obtenção de novas e bioativas moléculas e permitirá a preservação
da planta hospedeira. Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar uma análise
exploratória por Molecular Networking(MN) do metaboloma de extratos fúngicos
de um endofítico isolado de A. jahnii. Para isso, extratos acetato de etila do meio
de cultivo e etanólico do micélio foram obtidos.Estes extratos foram injetados em
um cromatógrafo líquido de ultra alta eficiência (UHPLC) acoplado ao
espectrômetro de massa de alta resolução. Uma análise do metaboloma destes
extratos foi feita a partir da rede molecular gerada com os dados MS/MS. A rede
molecular apresentou 1.570 entidades químicas, sendo 541 detectadas no
extrato do meio de cultivo, 964 no extrato do micélio e 65 em ambos osextratos.
Estes resultados indicam que o extrato do micélio apresenta uma maior
diversidade de metabólitos e que os extratos, apesar de serem obtidos de uma
mesma linhagem fúngica, representam misturas metabólicas complexas e
distintas. Um total de doze compostos foram identificados putativamente. As
classes identificadas incluem alcaloides, dipeptideo, meroterpenóide e
diterpenóide indólico. Os metabólitos desreplicados são representantes que
apresentam significativas propriedades biológicas. Por fim, os resultados
demonstram que a abordagem de MNaliada aos dados UHPLC/ESI-MS/MS, é
eficiente para obtenção rápida e significativade dados do metaboloma destes
extratos. Permitiu comparar os extratos obtidos do meio e micélio, indicando qual
pode ser aquele que representa um maior potencial para aplicação
biotecnológica.

Palavras-Chave: Desreplicação; Endofítico; Metabolômica

Introdução
As plantas são recursos amplamente explorados para obtenção de
produtos biotecnológicos, aplicados nas mais diferentes áreas, destacando-se
na indústria farmacêutica. No entanto, a exploração destes recursos vegetais

529
pode levar à extinção das espécies de plantas em muitos locais (Kumar et al.
2013). Além disso, algumas plantas são raras ou de crescimento lento, fatores
estes que limitam o uso destes recursos (Wen et al. 2022). Neste contexto, os
fungos endofíticos, se apresentam como uma excelente alternativa para suprir a
necessidade por compostosbioativos diversos (Strobel et al. 2004).
A extensa diversidade de fungos endofíticos associado a uma única planta
hospedeira, aumenta significativamente a existência de microrganismos ainda
não descoberto e, portanto, não explorados (Stone et al. 2004). Estes recursos
são, fontecomplexa de produtos naturais, e seu elevado número torna desafiador
a identificação e caracterização dos compostos bioativos. O Molecular
Networking se apresenta como uma ferramenta útil na avaliação destes extratos
complexos, mostrando eficáciana comparação de perfis químicos de linhagens
fúngicas e na anotação de moléculasconhecidas em extratos brutos (Yang et al.
2013).
Desta forma, diante da necessidade de ampliar a publicação de dados
sobre ometaboloma da microbiota amazônica, este trabalho teve por objetivo a
exploração metabolômica não direcionada dos extratos micelial e de meio de
cultivo de uma linhagem fúngica isolada de A. jahnii. A abordagem de Molecular
Networking foi aplicada para a desreplicação dos compostos e comparação do
perfil destes extratos ainda inexplorados.

Material e Métodos
Para a obtenção dos extratos, a linhagem fúngica F573 (Penicillium),
isolada de A. jahnii foi selecionada randomicamente dentro da Coleção de
Microrganismos do Grupo de Pesquisa GBQF da Universidade Federal de
Roraima. O fungo foi cultivadoem meio líquido de batata dextrose, suplementada
com 0,2% de extrato de levedura (BDL) (Souza et al. 2004). O meio de cultivo
inoculado permaneceu em condições esterilizadas a uma temperatura de 27ºC
durante 20 dias. Após este período, o micélio foi separado do meio líquido por
filtração a vácuo. O meio líquido foi submetido à extração líquido-líquido com
acetato de etila, usando-se um volume de solvente correspondente a 30% do
volume do meio líquido, procedimento realizado em triplicata. Ao micélio foi
adicionado álcool etílico suficiente para cobrir toda a massa micelial, armazenado
em frasco fechado por 24 horas. Após este período, realizou-se a extração

530
lavando-se o material com igual volume de álcool etílico (3x). Os extratos foram
secos com sulfatode sódio anidro Na2SO4, filtrados e o solvente evaporado sob
pressão reduzida a 40ºC, usando um evaporador rotativo.
Dados MS/MS foram obtidos a partir da injeção dos dois extratos em um
cromatógrafo líquido de ultra alta eficiência UHPLC (Shimadzu, Nexera X2,
Japão) equipado com coluna Acquity UPLC CHS C18, com dimensões 1.7 μm,
2.1 × 100 mm(Waters, USA) e espectrômetro de massa de alta resolução (HRMS)
Impact II (BrukerDaltonics Corporation, Germany) com geometria Q-TOF e fonte
de ionização electrospray. As condições de análise para a separação dos
componentes, foram de acordo com o descrito por Xavier et al. (2022). Os
arquivos obtidos foram tratados de acordo com Wang et al. (2016) e transferidos
para a plataforma do Global Natural Products Social Molecular Networking
(GNPS) para gerar o Molecular Networking (MN), após a subtração do solvente
e do branco (extrato apenas do meio de cultivo). Os valores de parâmetros
aplicados de acordo com Xavier et al. (2022) para obtenção do MN que foi
visualizado usando o software Cytoscape (Shannon et al. 2003). A desreplicação
preliminar dos metabólitos foi realizada a partir da comparação dos espectros
obtidos com espectros das bibliotecas do GNPS.

Resultados e Discussão
A exploração metabolômica dos extratos do micélio (EM) e do meio de
cultivo (EC) da linhagem fúngica foi realizada pela abordagem de Molecular
Networking (MN) e possibilitou inicialmente a comparação dos dois extratos
fúngicos. O MN gerado a partir dos dados MS/MS obtidos, resultou em 1.570
entidades químicas (nodes), distribuídas conforme apresentado na Figura 1.
Observa-se que o extrato EM resultou em uma maior diversidade química,
apresentando mais de 60% de entidades moleculares exclusivas.

531
Figura 1: Total de entidades químicas detectadas exclusivamente em cada extrato e o total de
entidadeiguais detectadas em ambos os extratos

O MN apresentou ainda cerca de 4% de entidades químicas idênticas (65

nodes) detectadas em ambos os extratos. Este resultado indica que estes
metabólitos produzidos no micélio, provavelmente foram secretados
parcialmente para o meio líquido. Além das entidades químicas exclusivas e
compartilhadas por cada extrato, oMN permitiu observar 1.179 nodes distribuídos
em 25 clusters (Figura 2).

Figura 2: Rede molecular contendo os clusters onde observa-se entidades químicas de

ambos osextratos conectadas entre si, devido à similaridade estrutural.

532
 Nestes clusters, o node de um extrato se conecta ao node de outro
extrato, devido à similaridade das estruturas químicas, que são pertencentes à
mesma classe metabólica. Assim é possível observar, por exemplo, metabólitos
do extrato micelial que são análogos a compostos obtidos exclusivamente do
meio líquido. Apesar dessas similaridades, extratos oriundos de meios de cultivo
e do micélio de fungos, normalmente apresentam atividades biológicas bem
distintas. Vigneshwari et al. (2019), verificaram em seus estudos, que os extratos
miceliais foram mais promissores, apresentando maior atividade antimicrobiana.
Estes resultados demonstram que apesar dos extratos serem oriundos de um
mesmo fungo, representam material metabólico bem distinto, requerendo
estudos individuais mais detalhados.
Além do estudo comparativo do perfil metabólico dos dois extratos,
realizou-sea desreplicação de doze metabólitos fúngicos, usando a biblioteca do
GNPS para a anotação dos compostos. Este quantitativo de compostos
identificados putativamente, aponta que estes extratos apresentam um elevado
quantitativo de compostos inéditos. Ainda é possível afirmar a necessidade de
maiores divulgações de dados do metaboloma de fungos, com o intuito de
auxiliar futuros estudos de materiais desta natureza, ampliando a desreplicação
dos compostos.
O maior número de compostos desreplicados são pertencentes a classe
dos alcaloides. A Figura 3 apresenta três alcaloides conectados entre si pela
semelhançaestrutural. Destes, o viridicatol e a viridicatina estão presentes nos
dois extratos, commaior abundância em EC, observada no gráfico de pizza que
apresenta a porcentagem relativa do metabólito na amostra. O terceiro
metabólito está presente apenas no EC (node totalmente rosa). Alcaloides
pertencentes a rota biossintética da viridicatina, apresentam comumente,
importantes propriedades biológicas, como atividade anticâncer e anti-
inflamatória (Ko et al. 2015; Kashapov et al. 2020).

533
Figura 3: Cluster contendo os alcaloides: A) 3,4-dihidroxi-4-fenil-1,3-dihidroquinolina-2-
ona, B)viridicatol e C) viridicatina

Outros dois alcaloides pertencentes à mesma rota biossintética foram

identificados putativamente nos dois extratos, com maior predominância no
extrato EC (Figura 4). A ciclopenina, metabólito que segundo Wang et al. (2020)
pode apresenta importante efeito anti-inflamatório para doenças
neurodegenerativas. E o ciclopenol que apresenta atividades antimicrobiana
contra Escherichia coli, Bacillus subtilis e Micrococcus luteus (Hamed et al.
2019).

Figura 4: Cluster contendo os alcaloides ciclopenol (m/z 311,091) e ciclopenina (m/z 295,97)
detectados em ambos os extratos.

534
 Outros metabólitos identificados putativamente são apresentados na
Tabela 1. Além dos alcaloides, compostos pertencentes às classes dipeptideo,
meroterpenóide e diterpenóide indólico também foram identificados
putativamente. Classes essas com compostos representantes com alta
aplicabilidade biotecnológica. Os compostos aqui identificados, são um grande
indicativo do potencial deste endofítico na produção de moléculas bioativas. O
estudo comparativo dos extratos ainda possibilitou confirmar que o extrato
etanólico micelial apresenta uma maior riqueza e diversidade metabólica.

Tabela 1: Compostos identificados putativamente no extrato do micélio (EM) e no extrato do

meio de cultivo (EC).
Compostos Fórmula Extratos
molecular
Dehidrociclopeptina C17H14N2O2 EM
Triprostatina B C21H25N3O2 EC e
EM
Fusaperazina E C19H24N2O3S EC e
EM
Roquefortina D C22H25N5O2 EC e
EM
Valactamida E C24H44N2O4 EM
Andrastina D C26H36O5 EC
Penitrem A C37H44ClNO6 EM

Conclusões
A análise exploratória não direcionada do metaboloma dos extratos
micelial e do meio de cultivo de fungos endofíticos foi extremamente útil, pois
possibilitou novos insights que ajudarão no direcionamento de trabalhos futuros.
A técnica de Molecular Networking apontou de forma rápida e eficaz o extrato
mais promissor na obtenção de metabólitos inéditos e/ou bioativos e com maior
diversidade metabólica. O trabalho apresenta um recurso biológico inédito,
obtido de fonte ainda pouco explorada, e os resultados constatam que o fungo
endofítico exibe alto potencial na produção de metabólitos de interesse
biotecnológico.

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537
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Efeito dos meios de cultura na produção de amilases e

proteases de rizobactérias amazônicas

Medeiros, Rosângela Pereira1; Moura, Luciana Aparecida Santos1; Minelli-

Oliveira, Cassiane2; Oliveira, Luiz Antonio de 2; Oliveira Júnior, Paulo Rocha1

1Universidade Paulista, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

E-mail: [email protected]

Resumo
Rizobactérias são bactérias encontradas na rizosfera das plantas, região do solo
que está sob a influência do sistema radicular. Elas apresentam a capacidade
de sintetizar diversas enzimas de importância econômica. No entanto,
observações em laboratório têm mostrado que, muitas delas podem perder parte
ou totalmente desse potencial biotecnológico, principalmente devido ao cultivo
contínuo em meios de cultura. Essa pesquisa foi realizada com o intuito de
avaliar como os meios de cultura comumente utilizados podem afetar o
crescimento das colônias e a produção de amilases e proteases de rizobactérias
isoladas de ambientes amazônicos. Foram realizados experimentos de
laboratório com 10 rizobactérias usando meios de cultura com fontes de carbono
diferentes (manitol, amido e glúten) por três gerações para avaliar o efeito que
causam na manifestação das amilases e proteases produzidas por essas
bactérias. O cultivo das rizobactérias por três gerações em meio contendo
manitol favoreceu seus crescimentos nesse meio. Em meio contendo amido,
esse aumento de crescimento ocorreu da primeira para a segunda geração,
havendo uma redução dos números de bactérias com crescimentos elevados
nesse meio quando se analisou a terceira geração. No meio contendo amido
houve também, um aumento das bactérias capazes de degradar essa fonte de
carbono da primeira para a segunda geração, mas se crescidas por três
gerações nesse meio, elas perdem essa característica biotecnológica, um
resultado inesperado. Os crescimentos e as capacidades de degradação do
glúten dessas rizobactérias foram favorecidos se crescidas por até três gerações
no meio de cultura contendo esse componente. O crescimento dessas bactérias
no meio de cultura contendo amido e glúten foi favorecido até a segunda
geração. A prática de crescer essas rizobactérias no meio contendo amido e
glúten por três gerações provocou o aparecimento de halos de degradação em
cinco delas. Os dados dessa pesquisa mostram que o crescimento contínuo, por
gerações, em meios de cultura contendo componentes químicos de interesse
biotecnológico, pode favorecer a manutenção e até aumento de bactérias com
potencial biotecnológico.

Palavras-Chave: Metabolismo microbiano; ecologia microbiana; enzimas

microbianas

538
 Introdução
Rizobactérias são bactérias encontradas na rizosfera das plantas, região
do solo que circunda a raiz e está sob a influência do sistema radicular. São de
vida livre ou associadas aos tecidos das plantas. Crescem na zona de influência
das raízes que vai desde sua superfície até uma distância de 1 a 3 mm (Luz
1996).
Algumas dessas rizobactérias têm elevado potencial de degradação de
hidrocarbonetos de petróleo, produção de hormônios de crescimento vegetal,
fosfatases, nitrogenases, hidrogenases, amilases, proteases e lipases
(Willerding et al. 2012; Alves et al. 2017; Brito et al. 2017 a,b; Hara e Oliveira
2019; Oliveira e Minelli-Oliveira 2019; Minelli-Oliveira et al. 2019; 2020; Lima et
al. 2020).
Pesquisas realizadas em laboratórios têm mostrado que suas
características de crescimento e morfológicas podem apresentar diferenças
dependendo do meio de cultivo e, a produção de enzimas pode ser alterada por
serem cultivadas por diversas gerações em alguns desses meios, resultando, às
vezes, na perda total ou parcial do seu potencial biotecnológico.
Em vista disso, essa pesquisa foi realizada para avaliar como os meios de
cultura contendo manitol, amido e/ou glúten afetam as atividades das amilases
e proteases em dez rizobactérias amazônicas.

Material e Métodos
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de
Microrganismos da Amazônia/ LEBMAM, no INPA. Foram escolhidas dez
rizobactérias que apresentaram em pesquisas anteriores, capacidade de
produzir amilases e proteases.
Os meios de cultura testados foram o meio YMA (yeast manitol agar,
Vincent 1970), com manitol como fontes de carbono e, substituindo-o por amido
ou glúten, havendo, portanto, três meios de cultura diferentes. As avaliações
consistiram no crescimento das bactérias ao longo do tempo, usando a
metodologia de Oliveira e Magalhães (1999). Os índices de degradação dessas
fontes de carbonoforam avaliados usando a metodologia de Berraquero et al.
(1976). Por esse método, os diâmetros das colônias e dos halos de degradação
foram medidos com um paquímetro digital, permitindo calcular o Índice de

539
Degradação do Amido (IDA, no meio contendo amido) ou o Índice de
Degradação do Glúten (IDG, no meio contendo glúten). Para saber se o fato de
crescer em um meio específico por diferentes gerações levam as bactérias a
reduzirem a ação das enzimas envolvidas, foram avaliadas três gerações de
cada uma em cada um dos meios para então comparar seus crescimentos
segundo Oliveira e Magalhães (1999) e índices de degradação amilolítica e
proteolítica segundo Berraquero et al. (1976). Para isso, cada uma delas foi
repicada por três gerações emcada um dos meios e seus crescimentos foram
avaliados nos meios com amido ou glúten, bem como seus índices de
degradação de ambos, verificando quais as bactérias alteraram seus
crescimentos e/ou seus índices de degradação de uma ou de ambas as fontes
de carbono. Para fins de delineamento experimental, usou-se um inteiramente
casualizado contendo dez rizobactérias, três gerações e quatro repetições em
cada um dos três meios de cultivo.

Resultados e Discussão
Ao se analisar os crescimentos das dez rizobactérias no meio YMA
(Tabela 1) segundo a metodologia de Oliveira e Magalhães (1999), observou-se
que na primeirageração, as R275 e R354 foram as que apresentaram melhores
crescimentos, pois apresentaram a nota máxima (4,0) já nas primeiras 24 horas
de cultivo e, as R261, R 290 e R338 os piores, não atingindo a nota 3,00 até às 48
horas de cultivo. O ato de crescer novamente essas bactérias nesse meio
(gerações 2 e 3) resultou emmelhores crescimentos, com a R261 aumentando seu
crescimento de 1,38 (geração 1) para 2,25 (geração 2) e para 3,50 (geração 3) após 48
horas de crescimento. A rizobactéria R338 mostrou resultado semelhante. Apenas a
R290 não mostrou um crescimento acima de 3,00, considerado por Oliveira e
Magalhães (1999), o limite inferior de crescimento elevado no meio de cultura.

540
 Quando essas bactérias foram colocadas para crescer no meio contendo
amidocomo fonte de carbono (Tabela 2), observou-se que apenas cinco das dez,
na geração 1, mostraram crescimento elevado, com notas acima de 3,00,
aumentando para oito rizobactérias na segunda geração com notas elevadas,
acima de 3,0, pelos critérios de Oliveira e Magalhães (1999), mas apresentando
uma queda de crescimento ao se analisar a terceira geração, quando apenas
três das dez rizobactérias mostraram crescimentos elevados nesse meio, isto é,
notas acima de 3,0 segundo Oliveira e Magalhães (1999).

Outro resultado inesperado foi o fato de ocorrer uma redução de bactérias

produtoras de halos de degradação do amido, uma vez que na primeira geração,
três apresentaram IDA, quatro apresentaram IDA na segunda geração, mas
nenhuma mostrou IDA na terceira geração, sugerindo mais estudos com essas
bactérias para entender essa perda de habilidade de degradar o amido mesmo
quando crescidas no mesmo meio por gerações.

541
 Ao se analisar os dados da geração 1 dessas bactérias no meio contendo
glúten (Tabela 3), observou-se que cinco das dez rizobactérias mostraram
crescimentos elevados, acima de 3,00, já nas primeiras 24 horas de incubação
no meio de cultura. Após 48 horas de crescimento nesse meio, apenas as
bactérias R261 e R283 mostraram crescimentos inferiores a 3,00. Dessas dez,
quatro mostraram degradação visível do glúten (IDG). Na geração 2, o pré-
crescimento no meio com glúten favoreceu quatro das rizobactérias (R261,
R281, R283 e R338), que mostraram notas maiores que na geração 1 usando os
critérios de Oliveira e Magalhães (1999). Mas afetou negativamente os
crescimentos das R290, R292 e R295, que apresentaram notas de crescimentos
menores quando comparadas aos da geração 1. Ao se analisar o crescimento
das bactérias de terceira geração crescidas nesse meio, observou-se que houve
um efeito negativo apenas nas 24 horas de crescimento no meio. Após 48 horas,
todas apresentaram crescimentos elevados (notas acima de 3,0 nesse meio).
Quanto aos Índices de Degradação do Glúten (IDG), apenas quatro
(R275, R290, R292 e R295) apresentaram halos visíveis de degradação no
início, primeira geração, aumentando para sete no final do experimento, geração
3 e tempo de 48 horas, mostrando que a manutenção de seus crescimentos
nesse meio favoreceu essacaracterística biotecnológica.
Os resultados dessa pesquisa confirmam e consolidam os obtidos por
outros autores, como Oliveira et al. (2022 a,b,c), alertando para as possíveis
perdas ou modificações das características biotecnológicas provenientes dos
cultivos contínuosno laboratório usando meios de cultura não apropriados para
os fins desejados.

542
 Conclusões
A prática de crescer essas rizobactérias no meio contendo amido e glúten
por três gerações provocou o aparecimento de halos de degradação em cinco
delas.
Os dados dessa pesquisa mostram que o crescimento contínuo, por
gerações, em meios de cultura contendo componentes químicos de interesse
biotecnológico, pode favorecer a manutenção e até aumento de bactérias com
potencial biotecnológico.

Agradecimentos
À FAPEAM e CNPq pelos auxílios financeiros e, ao INPA, por todo o
suporte de infraestrutura para a execução dessa pesquisa.

Referências
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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Estudo taxonômico de macrofungos ressupinados,

(Polyporales, Basidiomycetes) da região Amazônica

Lima, Marly Castro1; Jesus, Maria Aparecida1; Abreu, Raimunda Liége Souza1

1Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia
Email: [email protected]

Resumo
A família Polyporaceae Fr. ex Corda, pertence ao filo Basidiomycota, classe
Basidiomycetes, subclassse Agaricomycetidae e Ordem Polyporales. Os
representantes dessa família, são popularmente conhecidos como "orelha-de-
pau", devido ao hábito sapróbio de suas espécies. Polyporaceae apresenta
características peculiares para sua identificação, e a mais marcante apresentada
pela maioria dos indivíduos é a presença do himenóforo tubular que termina em
forma de poros, sendo conhecidos principalmente como políporos ou fungos
poroides. O conhecimento da diversidade e taxonomia de fungos da família em
estudo na região Amazônica é ainda escasso. Diante da necessidade de mais
estudos sobre as espécies de fungos poliporáceos, a pesquisa realizada teve
como objetivo ampliar o conhecimento da biodiversidade da região Amazônica.
Os espécimes foram analisados macro e micro morfologicamente de acordo com
as técnicas padrões usadas no estudo taxonômico dos gêneros. As fotografias
das microestruturas foram obtidas em estereomicroscópio Leica DM500,
equipados com câmera digital Leica EC3 e software LAS EZ. As mensurações
foram processadas por meio do software ImageJ, obtido gratuitamente em
(https://imagej.nih.gov/ij/). Os nomes científicos dos fungos seguem o banco de
dados MycoBank e index Fungorum. Todos os exemplares estudados foram
depositados na Coleção de Fungos Lignocelulíticos do INPA que possui 146
espécimes, dentre estes 64 espécimes, foram identificados e estão distribuídos
em sete gêneros e 11 táxons, conhecidos para o Brasil. Todos os macrofungos
foram encontrados em diferentes locais da região Amazônica: Campus do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Museu da Amazônia
(MUSA), Reserva Florestal Adolpho Ducke (RFAD), Estação Experimental de
Silvicultura Tropical (ZF2), Zona Urbana de Manaus e no Estado de Roraima,
nas reservas Estação Ecológica de Maracá (EEM) e Parque Nacional de
Viruá(PNV). O local que apresentou maior representatividade de 38 espécimes
dos macrofungos ressupinados foi a Estação Experimental de Silvicultura
Tropical do INPA. Neste trabalho são relatadas duas possíveis espécies novas
do gênero Grammothele e do gênero Megasporoporia com base em caracteres
morfológicos, e um novo registro de Hymenogramme javensis para a Amazônia.

Palavras-Chave: Basidiomycota; Polyporaceae; Região Amazônica

546
 Introdução
O conceito Polyporaceae Fr. ex Cord, foi originalmente descrito por Fries
(1838) como uma família para a ordem Aphyllophorales (Alexopoulos e Mims
1979) com o objetivo de acomodar todos os fungos de himenóforos poróides.
Logo depois, Ryvarden (1991) segregou morfologicamente Polyporaceae sensu
lato, reunindo os demais gêneros e desconsiderando a ordem Aphyllophorales
por enfatizar um sistema de classificação artificial (Cui et al. 2019). Atualmente,
a família de macrofungos Polyporaceae está classificada no filo Basidiomycota,
classe Basidiomycetes, subclassse Agaricomycetidae, Ordem Polyporales e
compreende 85 gêneros e cerca de 1.112 espécies descritas (Wijayawardene
2020).
A família de macrofungos é caracterizada por basidiomas sazonais a
perenes, ressupinados a pileados e estipitados que variam de tonalidades do
branco, violáceos, rosados ao marrom escuro, de consistência, que pode ser
esponjosa, carnosa, coriácea, corticóide ou lenhosa apresentando poros
angulares a alveolados, dispostos radialmente, himenóforo tubular a lamelar e
basidiósporos globosos a alantoides de parede lisa, presença ou ausência de
cistídias (Gilbertson e Ryvarden 1986; Ryvarden 1991; Kirk e Cannon 2008). O
sistema hifálico consiste no conjunto de hifas generativas, dimítico ou trimítico
Teixeira (1995). As hifas generativas geralmente são hialinas, com paredes finas
e podem apresentar septo simples ou com grampos de conexão. Enquanto as
hifas esqueléticas são geralmente longas de parede espessa, sem septos,
ramificadas ou não, e as hifas conectivas são geralmente curtas, ramificadas, de
parede fina e entrelaçadas às esqueléticas (Lira 2016).
Estudos filogenéticos de fungos ressupinados têm contribuído para a
reclassificação de gêneros e espécies de fungos corticióides (Parmasto 1995;
Boidin et al. 1998; Larsson et al. 2004). Mesmo com os trabalhos realizados por
Lim (2001), Kim e Jung (2000), Hibbett e Binder (2002), E. Langer (2002) e
(Koljalg et al. 2000; 2001; 2002), ainda há necessidade de mais estudos
moleculares de macrofungos poliporáceos, principalmente para aquelas espécies
que apresentam divergências taxonômicas (Binder 2005).
Os macrofungos são amplamente distribuídos em áreas de clima tropical,
subtropical e temperados (Tokumasu et al. 1988). Suas espécies são
encontradas principalmente como saprófitos, causadores de podridão marrom

547
(removem celulose e hemicelulose), causando limitadas modificações na lignina
e causadores de podridão branca ( degradam celulose, hemiceluose e lignina),
sendo denominadas lignocelulíticos (Gilbertson e Ryvarden 1986). Estes fungos
produzem uma série de enzimas, entre elas, estão as fenol-oxidases, aplicadas
em processos biotecnológicos, principalmente em tratamento de efluentes, pois
degradam corantes e substâncias aromáticas (Scortegagna 2013).
No Brasil o primeiro estudo de macrofungos poróides foi realizado por Rick
S. J. (Fidalgo 1962). O início dos estudos taxonômicos sobre esses
basidiomicetos ocorreu na Mata Atlântica, nos Estados da Bahia (Rick 1907;
1924; 1938a; 1938b; 1959a; 1959b; 1960), de Pernambuco (Torrend 1920a;
1920b; 1922; 1926; 1935; 1938; Cavalcanti 1976; Lucena 1980; Góes-Neto
1994), do Rio Grande do Sul (Theissen 1911; 1912) e de Santa Catarina
(Baltazar e Gibertoni 2009; Gibertoni et al. 2007; Gibertoni 2008). As
contribuições taxônomicas mais importantes para a região Norte, localizam-se no
Estado do Amapá (Sotão et al. 1991; 2003; Gugliotta et al. 2014), no Amazonas
(Gomes-Silva e Gibertoni 2009) e no Pará (Medeiros et al. 2015; Fonseca 2016;
Couceiro 2019).
Em vista da pouca informação sobre a diversidade de fungos poroides
ressupinados, esta pesquisa teve como objetivo ampliar o conhecimento
taxonômico de macrofungos ressupinados (Polyporaceae) na região Amazônica.

Material e Métodos
As exsicatas de Polyporaceae estão depositadas na Coleção de Fungos
Lignocelulolíticos (COTEI/INPA). Os macrofungos são provenientes de
diferentes locais do Estado do Amazonas, Campus do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA), Museu da Amazônia (MUSA), Reserva Florestal
Adolpho Ducke (RFAD), Estação Experimental de Silvicultura Tropical (ZF2),
Zona Urbana de Manaus e no Estado de Roraima, nas reservas: Estação
Ecológica de Maracá (EEM) e Parque Nacional de Viruá (PNV).
O estudo de taxonomia clássica dos fungos foi realizado no Laboratório
de Patologia da Madeira INPA através de análises macroscópicas, observando
as estruturas fúngicas de acordo com as descrições de Teixeira (1995). A cor do
basidioma foi comparada com as descritas na carta de cores de Kornerup e
Wanscher (1961). Para observação microscópica do fungo, foram feitos cortes à

548
mão livre com o auxílio de uma lâmina de aço, que foram colocados entre lâmina
e lamínula em reagente Melzer (IKI). Com o auxílio de microscópio óptico com
ocular micrométrica foi feita a caracterização e mensuração das estruturas
microscópicas. Para a verificação de reações químicas, foram utilizadas a
solução aquosa de KOH (Hidróxido de Potássio - solução à 3%) e em alguns
casos, Floxina 1% para observação de estruturas hialinas e a solução de Melzer
para verificar a reação dextrinóide de hifas e/ou dos basidiósporos. Para a
identificação das espécies foram utilizadas literaturas taxonômicas com
descrições taxonômicas sul-americanas e brasileiras dos principais gêneros
propostos por Ryvarden e Johansen (1980), Ryvarden (1972; 1973; 1975;
1978; 1991; 2002; 2005; 2007; 2010), Ryvarden e Gilbertson (1993; 1994),
Gorjón et al. (2020), Wijayawardene et al. (2020), Vasquez (2013), dentre outras.
As fotografias das microestruturas foram obtidas em estereomicroscópio Leica
DM500, equipados com câmera digital Leica EC3 e software LAS EZ. As
mensurações foram processadas por meio do software ImageJ, obtido
gratuitamente em (https://imagej.nih.gov/ij/). Os nomes científicos dos fungos
seguem o banco de dados MycoBank (http://www.mycobank.org) e
(http://www.indexfungorum.org/).
Todos os espécimes estudados, foram informatizados de acordo com o
programa Brahms (Botanical Research and Herbarium Management System)
adotado pelo Herbário do INPA com os seguintes dados: nome do coletor,
substrato, local e data de coleta.

Resultados e Discussão
Um total de 64 espécimes de Polyporaceae foi identificado, e elas estão
distribuídas em 11 espécies, listadas na Tabela 1.
Observa-se que H. javensis ocorre com maior número de exemplares,
sendo este descrito pela primeira vez para a Região Amazônica, seguido por
Rigidoporus lineatus, R. biokoensis, Grammothele lineata, Megasporoporia
setulosa e Tinctoporellus epimiltinus, enquanto que Grammothele sp.1,
Grammothele sp.2, Rigidoporus microporus, R. ulmarius e Schizopora paradoxa
são representados por um único exemplar (Tabela 1). Um novo registro de
Hymenogramme javensis é descrito para a Amazônia (Figura 1).

549
Tabela 1. Relação das espécies de macrofungos ressupinados e sua preferência de substratos
lignocelulolíticos em diferentes locais

TAXONOMIA
Hymenogramme javensis Mont. & Berk., London J. Bot. 3:330 (1844)
Basidioma ressupinado, até 0.3 mm de espessura, superfície himenial
esbranquiçada a marrom claro (E4), margem branca (A1), estéril, inserção do
himenóforo, denso com cristais anastomosados, acima do himênio e
ligeiramente mais escuro, poros angulares 4.0 × 7.0 p/mm. Sistema Hifal
monomítico. Hifas generativas com clamps de conexão, hialinos, de parede fina
e lisa. Cistídias ausente. Cistidíolos subulados, abundantes ao longo himênio.
Dendrohifas ausente. Basídias clavadas, 16.0-26.0 × 4.0-6.0 µm, com 4
sterigmas. Basidiósporos elipsóide, 4.0 - 6.0 × 4.0 µm, hialino, liso e de
paredes finas.
Habitat e distribuição: palmeira, tronco caído. Conhecido apenas na Indonésia
e nas Filipinas.
Comentários: H. javensis é caracterizado macroscopicamente pelo aspecto
esbranquiçado do basidioma quando jovem. O himenóforo denso, consiste em
cristais esteréis, anastomosados e a configuração do himênio, torna-o diferente
dos demais gêneros de acordo com Ryvarden e Johansen (1980). Não há
relatos de H. javensis para o Brasil, de acordo com Flora Brasil 2020, sendo
este o primeiro registro para o Estado do Amazonas e Roraima com ampla

550
distribuição na Estação Ecológica de Maracá e Estação Experimental de
Silvicultura Tropical.
Espécimes examinados: Brasil, Roraima: Caracaraí, 5 setembro 2008, leg.
M.A. Jesus 4706, 27 setembro 2008, leg. D.M. Couceiro 4702, 4703, 4704, 28
setembro 2008, leg. M.A. Jesus 4705. Brasil, Amazonas, Manaus.
Estação Experimental de Silvicultura Tropical (ZF2), 13 abril 2013, leg. W.G.
Fernandes 13047, 13133, 14 Abril 2013, leg. M.A. Jesus 13056, 15 fevereiro
2012, leg. D.M. Couceiro 12500, 19 dezembro 2012, leg. V.I.S. Bastos 13054,20
dezembro 2012, leg. D. Castro, 13042, 25 junho 2013, leg. M.A. Jesus 12513,
13045, 13051, leg.D.M. Couceiro 13044, 26 junho 2013, leg. H.D. Lima 13043,
leg. V.I.S. Bastos, 13053.

Figura 1- Hymenogramme javensis: A. basidioma ressupinado; B. superfície dos poros; C.

basídia clavada; D. dendrohifas; E. basidiósporos elipsóides. Barra de escala: A e B= 2 cm; C,
D, E= 15 μm.

Conclusões
O estudo contribuiu com descrições e imagens das espécies estudadas
para a região Amazônica. Acredita-se que essa pesquisa auxiliará novos estudos
da família no Estado do Amazonas, por ser um dos poucos trabalhos com
macrofungos ressupinados, devido á complexidade taxonômica do grupo. Os
resultados abordados neste estudo, ampliam o conhecimento da riqueza de

551
espécimes de macrofungos (Polyporaceae) e a distribuição geográfica das
espécies na região. A espécie H. javensis é descrita pela primeira vez para a
região Amazônica.

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Identificação de cluster gênicos biossintéticos nas linhagens

de Streptomyces MPUR-28.3 e MPUR-51.7

Souza, Rafael Pinto1; Costa, Denise Xavier¹; Lopes, Eraldo Ferreira2; Queiroz,
Claudia Afras3; Yamagishi, Michel Eduardo Beleza3; Silva, Gilvan Ferreira3

1Universidade Federal do Amazonas; 2Instituto de Saúde e Biotecnologia; 3Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Amazonas
E-mails: [email protected]; [email protected]

Resumo
Em virtude da resistência dos patógenos aos fármacos e as inúmeras doenças
sem tratamentos, têm-se buscado novas moléculas, sendo os microrganismos
uma importante fonte. Os Streptomyces spp. são responsáveis por cerca de 70%
das moléculas com atividade biológica diversa, tais como, antitumorais,
antiparasitários, antifúngicos e antimicrobianos. As análises in sílico de genomas
completos por ferramentas de bioinformática tem facilitado a prospecção de
produtos naturais pela descoberta de novas vias para produção de moléculas
conhecidas como "biosynthetic gene clusters” (BGC’s). O objetivo deste trabalho
foi identificar BGC’s em dois isolados de Streptomyces sp. obtidos de sedimentos
do rio Purus. Foram selecionadas as linhagens MPUR-28.3 e MPUR-51.7 e a
identificação dos BGC’s foi realizada com auxílio da ferramenta antiSMASH.
Desta forma, foram identificados para MPUR-28.3 39 BGC’s, sendo
majoritariamente 14 “clusters” para "non-ribosomal peptide synthase" (NRPS), 6
"polyketide synthases" (PKS). Para MPUR-51.7 foram identificados 45 BGC’s,
destes,13 “clusters” para NRPS, 9 PKS. Foram identificados clusters que
apresentaram 100% de similaridade com vias de biossíntese já caracterizadas e
funções conhecidas, estes são responsáveis pela biosíntese de antimicin,
albaflavone, desferrioxamin B, ectoine, geosmin, SGR polycyclic tetramate
macrolactams (PTMs) e naringenin. Ademais, os dados indicam que mais de
80% dos BGC’s estão relacionados a vias de biossíntese ainda não reportadas
na literatura, indicando que estas linhagens podem produzir novas moléculas.
Portanto, por meio da mineração genômica foi possível identificar em ambos os
isolados biomoléculas com ampla atividade biológica, destacando-se as
anticancerígenas, antifúngicas, antibacterianas, antioxidantes, as quais são de
importância industrial, agrícola, ambiental, médica, veterinária e de alimentos.

Palavras-Chave: Bioinformática; Biomoléculas; Biotecnologia

Introdução
A Amazônia é conhecida mundialmente por sua floresta, rios e lagos (Val

556
et al. 2021). A biodiversidade da Amazônia é um dos patrimônios mais
importantes no Brasil, pois possui ao menos 15% da biota mundial e maior
sistema fluvial do mundo. Ademais, abriga milhares de espécies produtoras de
moléculas ainda desconhecidas (Valli et al. 2018).
Atualmente a humanidade sofre com o desenvolvimento da resistência
dos microrganismos aos fármacos, principalmente de ação antibacteriana, além
da existência de inúmeras doenças sem tratamentos, sendo necessário a
identificação de novas biomoléculas com capacidade de tratá-las. Embora
muitos patógenos multirresistentes sejam bactérias, a solução para o problema
também pode ser encontrada nos microrganismos, dada a grande diversidade
destes, eles são também uma das principais fontes para a descobertas de novas
biomoléculas (Abadi et al. 2019).
Entre os microrganismos, bactérias do gênero Streptomyces (Filo
Actinobacteria) são consideradas o grupo mais importante em termos da
produção de metabólitos secundários. Muitas espécies de Streptomyces embora
tenham genomas 3 ou 4 vezes menor que os fungos são capazes de realizar a
síntese de maior número de moléculas. Estima-se que cerca de 35 mil
antibióticos produzidos por actinobactérias, 70% são oriundos de Streptomyces
spp. (Gohain et al. 2020). Além de antibióticos os metabólitos produzidos
apresentam ampla atividade biológica, como: antitumorais, antiparasitários,
antifúngicos e inseticidas, podendo ser aplicados na agricultura, indústria
farmacêutica e cosmética entre outras (Rodrigues et al. 2006; Procópio et al.
2012; Terra et al. 2021).
A partir do sequenciamento do genoma completo dos microrganismos, as
análises in silico, utilizando ferramentas de bioinformática, possibilitam a
identificação de diversas vias metabólicas conhecidas na literatura internacional
como "biosynthetic gene clusters” (BGC’s). A identificação do potencial para
produção de metabólitos secundários com bioatividade a partir do genoma tem
revolucionado a prospecção de produtos naturais de origem microbiana (Zhao et
al. 2020).
Os metabólitos secundários são produzidos por uma lógica biossintética,
onde as enzimas envolvidas no processo são codificadas em genes
espacialmente próximos aos genomas. Esses genes responsáveis pela
formação do esqueleto principal da molécula conhecidos como gene "core" e

557
estão distribuídos em diferentes classes químicas, como as polyketide synthases
(PKS), nonribosomal peptide-synthetase (NRPS) e ribosomally synthesised and
post-translationally modified peptides (RiPPs). Além dos genes relacionados à
biossíntese os BGC’s também podem conter genes relacionados ao transporte
e fatores de transcrição, bem como genes adicionais, que codificam enzimas que
atuam na incorporação de grupos funcionais no esqueleto principal da molécula,
tais como: metiltransferases, redutases, halogenases e mono-oxigenases
(Rutledge e Challis 2015; Herbst et al. 2018).
O objetivo do trabalho foi avaliar o potencial biotecnológico através da
identificação dos biosynthetic gene clusters em duas linhagens Streptomyces
MPUR-28.3 e MPUR-51.7 isolados sedimentos do rio Purus, Amazonas.

Material e Métodos
As duas amostras de Streptomyces sp. MPUR-28.3 e MPUR-51.7,
utilizadas neste estudo foram isoladas de sedimentos do rio Purus, Amazonas.
As amostras pertencem a coleção de microrganismos da Embrapa Amazônia
Ocidental. O acesso ao patrimônio genético foi autorizado pelo Sistema Nacional
de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado
(SISGEN) nº AB6B14F.
As análises in silico foram realizadas com base no genoma completo. Para
tanto, o sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina - HiSeqX - PE 150
cycle, com read length (comprimento de leitura) de 2 x 150 (Paired End), com
cobertura estimada 100x.
A identificação dos BGC’s, assim como a determinação das classes das
moléculas e as suas funções foram realizadas com auxílio de ferramentas online
de mineração genômica: <https://antismash.secondarymetabolites.org>, em
inglês, Antibiotics and Secondary Metabolites Analysis Shell (antiSMASH
bacterial version 7.0). A ferramenta possibilita identificar o potencial
biotecnológico dos “clusters” com base em 70 classes de moléculas disponíveis
no banco de dados. Cada BGC’s foi classificado conforme o tipo de produto
natural codificado dentro do grupo de gene (Medema et al. 2011; Blin et al. 2021).

Resultados e Discussão

558
 Por meio da análise do genoma completo pela plataforma antiSMASH
foram identificados 39 BGC’s para o isolado MPUR-28.3 e 45 BGC’s para o
isolado MPUR- 51.7. No isolado MPUR-28.3 foram identificados 14 “clusters”
relacionados com vias de síntese de NRPS (36%), 6 PKS, sendo 4 T1PKS (10%),
1 T2PKS (3%) e 1 T3PKS (3%), 5 Terpene (13%), 4 Hybrid (10%), 4 RiPP (10%),
2 Siderophore (5%), 1 Ectoine (3%), 2 Lanthipeptide (5%), 1 Lap (3%), como
apresentado na figura 1a.
A linhagem MPUR-51.7 apresentou maior número de BGC’s, destes 13
“clusters” estão relacionados com vias de síntese de NRPS (29%), 9 PKS, sendo
7 T1PKS (10%), 1 T2PKS (2%) e 1 T3PKS (2%), 5 Terpene (11%), 5 Hybrid
(11%), 4 RiPP (9%), 3 Siderophore (7%), 1 Ectoine (2%), 1 Lanthipeptide (2%),
1 Lap (2%), 1 Lassopeptide (2%), 1 RRE (2%), como apresentado na figura 1b.

Figura 1. Distribuição das classes de BGC’s preditos por antiSMASH nos genomas dos isolados
MPUR-28.3 (a) e MPUR-51.7 (b). A similaridade baseia-se na correspondência das vias de
biossínteses já caracterizadas e disponíveis em bancos de dados. Os BGC’s hybrids são
compostos por genes pertencentes a mais de uma classe, nestas linhagens, são
majoritariamente constituídos por NRPS e PKS. Non-ribosomal peptide synthase (NRPS);
polyketide synthases (PKS) tipo 1, 2 e 3; post- translationally modified peptide product (Ripp);
linear azol(in)e-containing peptides (Lap); RRE-element containing cluster (RRE).

Importante destacar que dos 39 BGC’s preditos para o isolado MPUR-

28.3 e dos 45 BGC’s preditos para o isolado MPUR-51.7, respectivamente 15
(38%) e 19 (42%) “clusters” não possuem similaridades com os disponíveis em
bancos de dados. Logo, 24 (62%) e 26 (58%) possuem similaridades com os

559
disponíveis em bancos de dados, sendo que, destes últimos apenas 7 (29%) e
6 (13%) apresentam 100% de similaridade com “clusters” biossintéticos com
funções já determinadas (tabela 1) e os demais “clusters” possuem similaridade
variando de 5 a 80%.
Segundo Álvarez-Álvarez (2015), “clusters” gênicos biossintéticos que
codificam novos produtos bioativos são de grande importância industrial,
ambiental e agrícola. Com base na alta similaridade de alguns “clusters” com
ortólogos disponíveis em bancos de dados podemos predizer diversas
biomoléculas, que em sua maioria podem estar silenciadas em condições de
laboratório ou não são expressas devido à ausência das condições mínimas
necessárias, seja nutricional, fisiológicos ou em resposta a elicitores.

Tabela 1. Produtos preditos pelo antiSMASH nos genomas dos isolados de Streptomyces MPUR-
28.3 e MPUR-51.7.

BGC’s MPUR-28.3 MPUR-51.7

Antimycin + +
Albaflavenone + +
Desferrioxamin B + -
Ectoine + +
Geosmin + +
SGR PTMs + +
Naringenin + +
Obs.: (+) 100% de simariladidade; (-) similaridade menor que 100%.

Os primeiros estudos com o antibiótico antimycin (ANT) datam 1960, este

é sintetizado por microrganismos do gênero de Streptomyces sp. (Tappel 1960),
porém a descoberta do agrupamento de genes que codifica a biossíntese da
antimicina foi em 2011, é um notável metabólito secundário híbrido, composto
pelas classes NRPS e PKS, constituindo uma ampla família de produtos naturais
com 44 compostos distintos (Yan et al. 2012; Wenhao et al. 2022).
Segundo Tzung et al. (2001), Seipke e Hutchings (2013), Wenhao et al.
(2022) a antimicina A tem como modo de ação a inibição do citocromo C redutase
na cadeia de transporte de elétrons. Ela interrompe a respiração mitocondrial e
esgota os níveis celulares de ATP, logo, é amplamente utilizada como piscicida
na indústria de criação de bagres. Também possui potente atividade contra
insetos, ácaros, nematóides, fungo, fitopatógenos. Mais recentemente tem

560
atraído a atenção como um inibidor potente e seletivo das proteínas
antiapoptóticas mitocondriais Bcl-2 e Bcl-xL as quais são super produzida em
células cancerígenas que são resistentes a agentes quimioterápicos indutores
de apoptose, de modo que as antimicinas têm grande potencial como drogas
anticancerígenas usadas em combinação com quimioterápicos existentes.
A albaflavone, pertence à classe dos terpenos, é um antibiótico
sesquiterpênico tricíclico, é biossintetizada por diversas espécies de bactérias
do gênero Streptomyces (Moody et al. 2012).
De acordo Zheng et al. (2016) foi possível avaliar a atividade citotóxica de
dois compostos contra quatro linhagens de células tumorais humanas, BGC-823,
HCT116, HeLa e HepG2. Ambos os compostos, mesmo que em baixas
concentrações, mostraram citotoxicidade contra quatro linhagens de células
tumorais humanas.
A desferrioxamin B, é um importante produto natural pertencente a uma
ampla família de desferrioxaminas. É um sideróforos hidroxamato não peptídico,
sua expressão é regulada pelo ferro, as quais também atuam no transporte de
ferro. As principais espécies responsáveis pela síntese desses compostos
pertecem aos gêneros Streptomyces, Nocardia e Micromonospora (Keberle
1964; Schupp et al. 1987; Arulprakasam e Dharumadurai 2021).
Segundo Barona-Gómez et al. (2004), Chiani et al. (2010) a
desferrioxamin B tem sido usada clinicamente para o tratamento da sobrecarga
de ferro em humanos. Devido a várias condições, tais como sobrecarga de ferro
transfusional em pacientes com talassemia ou anemias sideroblásticas. Essa
molécula é comercializada como Desferal. Além dessa função, considerável
atenção tem sido dedicada devido à importância nutricional, regulação genética,
fator de virulência e função de absorção dessas moléculas. Compreender esses
processos, pode facilitar o desenvolvimento de potenciais novas biomoléculas,
tais como agentes antibacterianos.
Moléculas da classe das ectoine, são capazes de proteger enzimas,
membranas e células inteiras contra estresses hiperosmótico causados por
exposição ao sal, aquecimento, congelamento e dessecação. Atualmente,
também é usada como hidratante em cosméticos e produtos para cuidados com
a pele (Lippert e Galinski 1992; Motitschke et al. 2000), o que a torna um
importante e crescente produto para diversas aplicações biotecnológicas.

561
 Segundo Cánovas et al. (1989), Prabhu et al. (2004) o derivado hidroxila
da ectoína, o hidroxiectoína, tem atuado como um agente protetor de proteínas
que, em várias aplicações, possui propriedades superiores às da ectoína.
Complementarmente Sheikhpour et al. (2019) realizou um estudo in vitro
apoptótico em células de câncer de pulmão que obtiveram pela primeira vez que
tanto a ectoína e hidroxiectoína inibiram o rápido e irregular crescimento das
células cancerígenas.
O terpeno geosmin é um metabólito volátil responsável pelo cheiro
característico do solo úmido, da terra recém-arada, bem como, pelos sabores
desagradáveis na água potável e nos alimentos (Jiang et al. 2007). Ela é
produzida por vários microrganismos, incluindo a maioria de espécies de
Streptomyces e algumas espécies de cianobactérias e fungos. A detecção e
eliminação deste metabólito é de considerável importância econômica devido à
sua associação com mofo ou sabores indesejados na água potável, vinho, peixe
entre outros alimentos (Gerbereh e Lechevalier 1965; La Guerche et al. 2005).
Os SGR Polycyclic Tetramate Macrolactams (PTMs) são uma classe
amplamente distribuída de produtos naturais com importantes atividades
biológicas, como propriedades antifúngicas, antibióticas e antioxidantes (Luo et
al. 2013).
A naringenin, intermediário precursor de diferentes tipos de flavonoides,
logo é um importante antioxidante por atuar como agente anti-inflamatório,
quimioprotetor e antitumoral. Além dessa grande importância nas indústrias
farmacêutica, também é empregado na indústria alimentícia e cosmética, sendo
sintetizado naturalmente em fungos, plantas, mas são raros em actinomicetos,
(Álvarez-Álvarez et al. 2015; Shrestha et al. 2021).
De acordo com Dung e Thuan (2021) a naringenina pode ser um
medicamento promissor para reduzir os níveis plasmáticos de lipídios,
lipoproteínas, colesterol total e LDL-colesterol, contribuindo positivamente para
saúde de pacientes com hipertensão, dislipidemia e infarto do miocárdio.

Conclusões
As análises in silico dos isolados MPUR-28.3 e MPUR-51.7, por meio da
plataforma antiSMASH identificou biomoléculas com amplas atividades.
Destacando- se as atividades anticancerígenas, antifúngicas, antibacterianas,

562
antioxidantes, as quais são de importância industrial, agrícola, ambiental,
médica, veterinária e de alimentos.

Agradecimentos
Os autores agradecem à FAPEAM pelo suporte financeiro, CNPq,
CAPES- Procad, CAPES-Amazônia Legal.

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Isolamento e patogenicidade de bactérias cultiváveis isoladas

dociclo biológico de Aedes aegypti para o controle deste vetor

Oliveira, Juan Campos1; Katak, Ricardo de Melo2; Rocha, Elerson Matos3; Muniz,
Veranilce Alves1; Silva, William Ribeiro2; Carmo, Edson Junior1; Roque,
Rosemary Aparecida2; Astolfi-Filho, Spartaco1

1Universidade Federal do Amazonas, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,

3Universidade Estadual Paulista
Email: [email protected]

Resumo
A microbiota dos mosquitos é compreendida por diversos microrganismos, como
bactérias, fungos e vírus de grande importância para o hospedeiro, estando
associada a diversos fatores, como habitat larval, ambiente e espécie. Diversos
estudos sobre a microbiota bacteriana de Aedes aegypti tem enfatizado somente
na diversidade de bactérias presentes nos intestinos de fêmeas adultas. Com
isso, bactérias presentes em outros órgãos do mosquito, além das fases do ovo,
larva e pupa, permanecem pouco estudadas. A presença da comunidade
bacteriana nas fases biológicas desses mosquitos podem ser uma chave para
desvendar novas estratégias de controle biológico deste vetor.. Neste estudo, foi
usado o método dependente de meio de cultivo para isolar bactérias oriundas de
ovos, larvas, pupas e fêmeas adultas de A. aegypti em condições de laboratório
e um screening larvicida das linhagens obtidas, para avaliar a patogenicidade
das bactérias contra o seu vetor. Foram obtidas 426 bactérias cultiváveis, as
quais foram analisadas pelas suas características morfológicas de parede
celular, sendo 309 gram negativas e 117 gram positivas. Todas as bactérias
foram positivas para o teste de catalase. No total de 426 bactérias, 30 linhagens
bacterianas apresentaram patogenicidade para larvas de A. aegypti. Além disso,
as características como a borda,estrutura, cor e brilho, foram avaliadas. Estudos
posteriores como a identificação molecular são de fundamental importância para
conhecer a microbiota e as possíveis bactérias patogênicas para este vetor.

Palavras-Chave: Aedes aegypti; microbiota; controle vetorial

Introdução
O mosquito Aedes aegypti Linnaeus 1762, tem alta capacidade fisiológica
para obter e transmitir arbovírus, dentre estes, os vírus da dengue, zika,
chikungunya e febre amarela urbana, os quais ocasionam milhares de
infecções e mortes anualmente (WHO 2017; Souza-Neto et al. 2019). Para
alguns desses arbovírus existem vacinas com eficácia variável (Da Silveira et al.
2019), porém, outros carecem de vacinas e o tratamento é limitado, podendo
causar a morte do paciente.

566
 O aumento dos casos de arboviroses são muitas vezes em caráter
emergenciale difícil prevenção, deste modo, o controle populacional do vetor é a
principal ferramenta para prevenir e reduzir a cadeia de transmissão dos
arbovirus (Weaver 2018). Neste sentido, é necessário medidas de controle
eficazes, seguras e ecologicamente corretas, como por exemplo, bioinseticidas
oriundos de microrganismos.
O A. aegypti apresenta o ciclo biológico holometábolo e no decorrer das
fases, há interações ecológicas com inúmeras bactérias. A maior parte da
diversidade bacteriana associada às larvas é obtida do ambiente aquático, pois,
as larvas alimentam-se da matéria orgânica e microrganismos presentes na
água dos criadouros (Coon et al. 2014; Akorli et al. 2019). Na fase adulta, as
bactérias são adquiridas de forma transestadial (Lindh et al. 2008), ou por meio
das fontes alimentícias (Saab et al. 2020).
As bactérias associadas ao A. aegypti adulto despertam o interesse
cientifico, devido à influência que ocasionam na biologia do hospedeiro, (Gaio et
al. 2011; Caragata et al. 2019). Análises da infecção experimental de bactérias
no tubo digestivo de fêmeas adultas deste mosquito, demonstraram que a
proliferação dos microrganismos afetou a longevidade e o sistema imunológico
do inseto (Wu et al. 2019).
A maioria das pesquisas envolvendo a microbiota bacteriana associada
ao A. aegypti analisaram as bactérias que colonizam o trato digestivo, no
entanto, todos osórgãos deste mosquito são colonizados por bactérias (Gusmão
et al. 2007; Saraiva et al. 2016). Além disso, há pouco conhecimento sobre o
comportamento dasbactérias associados aos seus hospedeiros. Neste sentido,
este trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade das bactérias isoladas
do ciclo biológico do A. aegypti em condições de laboratório.

Material e Métodos

Coleta de Aedes aegypti no campo

A população de A. aegypti utilizada neste estudo, foi obtida a partir de
larvas coletadas em único ponto (-3.0726016,-59.9284962) da região Leste de
Manaus. A zona administrativa apresenta alta densidade vetorial, considerando
os resultados doLevantamento Rápido do Índice de Infestação por A. aegypti

567
(LIRAa), realizado pela Secretaria Municipal de Saúde do Amazonas
(SEMSA/Prefeitura de Manaus 2020). As coletas foram realizadas em setembro
de 2020 (estação seca), com autorização do SISBIO/74091-1/2020-2021.

Criação de insetos, em condições de laboratório

A criação dos insetos ocorreu conforme o Procedimento Operacional
Padrão (POP) do LCBBMD - Manutenção de larvas e adultos de Aedes no
insetário. Os adultos foram identificados a partir de caracteres morfológicos
externos, com auxílio de microscópio estereoscópico ZEISS Stemi 2000 50X e
chaves de identificação: Forattini (2002), Harbach (2022) e Wrbu (2022). A fonte
de carboidratos (solução desacarose a 10%) foi mantida diariamente e as fêmeas
realizaram repasto sanguíneo duas vezes por semana, durante 30 minutos com
a utilização de hamster - Mesocricetus auratus Waterhouse, 1839 (Rodentia:
Cricetidae), anestesiado conforme o procedimento aprovado pelo Comitê de
Ética no Uso de Animais do INPA (029/2021).

Isolamento de bactérias
O isolamento bacteriano foi realizado em placa de Petri (9 cm), utilizando
osseguintes meios de cultivo: ISP2 (10 g - Amido; 10 g - Extrato de Malte; 4 g -
Extrato de Levedura; 4 g - Dextrose; 10 g - Agar), Nutriente Agar - NA (3 g - Beef
Extract; 5 g - Peptone; 15 g - Agar) e Lúria Bertani - LB (10 g - Enzymatic Digest
of Casein; 5 g - Yeast Extract; 10 g - Sodium Chloride; 10 g - Agar), preparados
conforme recomendações dos fabricantes. Para impedir a contaminação por
fungos foi adicionado diretamente 20 µm.mL-1 de Fluconazol em cada placa.
Neste procedimento foram usadas três amostras de cada estágio (ovos, larvas
de quarto estádio, pupas e fêmeas adultas) de A. aegypti, os quais foram imersos
em álcool 70% e água destiladaesterilizada, durante 1 minuto. As amostras foram
maceradas em microtubos e, posteriormente, foi adicionado 1,5 mL de água
destilada esterilizada, foi agitado vigorosamente em aparelho vórtex por 3 min.
A partir da solução final, 50 μl foram utilizados no isolamento bacteriano. As
placas de Petri contendo as amostras foram armazenadas em estufa B.O.D a
29 °C e mantidas por um período 72 horas para o crescimento das bactérias.

568
Caracterização morfológica e preservação de isolados bacterianos
Colônias bacterianas morfologicamente distintas foram selecionadas para
subcultura nos meios de cultivo (NA, LB e ISP2), objetivando a purificação pela
técnicade esgotamento por estrias cruzadas. As amostras foram armazenadas
em estufa B.O.D a 29 °C durante 24h para o crescimento das bactérias. A
confirmação da purezados isolados foi realizada pela técnica de coloração de
Gram em lâminas, utilizando- se o kit Laborclin®. As lâminas foram observadas
em microscópio óptico (100x de aumento). As colônias isoladas foram
caracterizadas de acordo com o tipo de paredecelular, (Gram - ou +) teste de
catalase e a morfologia externa (forma, borda, cor e brilho) observadas em
placas de Petri. Os isolados foram preservados nos meios de cultivo (NA, LB e
ISP2) líquido, com adição de 20% de glicerol (v/v) em microtubos de 2 mL e
armazenados à -80ºC. Os procedimentos foram realizados conforme descrito por
Rocha et al. (2021) e Katak et al. (2021), com modificações.

Análises da abundância das bactérias isoladas

A média de isolados bacterianos obtidos para cada amostra (ovos, larvas,
pupas e fêmeas adultas) foi analisada no teste de normalidade de Lilliefors
(amostrasK) e, posteriormente, no teste t de Student (p ≤ 0,05), com auxílio do
programa estatístico BioEstat versão 5.3 para Windows (Ayres et al. 2007).

Atividade larvicida
Primeiramente, as bactérias foram reativadas em placas de Petri com
meios de cultivo, conforme o isolamento bacteriano. As amostras foram
armazenadas em estufa B.O.D a 29 °C durante 24 h para o crescimento das
colônias e amostras foram adicionada em tubos de ensaio de 20 mL, contendo
5 mL do meio de cultivo líquido (NB, LB e ISP2) e armazenados em estufa
rotativa a 29 °C e 180 rpm, durante 72 h até atingir o número quatro da escala
de Macfarland, (12x108 células/ml) para o crescimento das linhagens e utilização
nos bioensaios. Os ensaios biológicos foram realizados em triplicata com 10
larvas de terceiro estádio da geração F1 de A. aegypti oriundas dos espécimes
provenientes do campo, 9 ml de água e a concentração de 1ml (12x108 cells/ml)
do cultivo bacteriano, conforme descrito por Soares-da-Silva et al.(2017) e Katak
et al. (2021), com modificações. A linhagem padrão utilizada neste estudo como

569
controle positivo, foi obtida a partir da reativação do produto biológico Vectobac
WG -Bacillus thuringiensis var. israelensis em meio Nutriente Ágar.

Resultados e Discussão
Isolamento bacteriano
As bactérias cultiváveis isoladas das amostras (ovos, larvas, pupas e
fêmeas adultas) de A. aegypti avaliadas nos três meios de cultivo (NA, LB e ISP2)
foram selecionadas com base nas características das colônias, incluindo o
tamanho, forma,cor e consistência de semelhança. A partir das análises de cerca
de ± 2.000 isolados iniciais, foram obtidas 426 bactérias (Tabela 1). A maior média
(55.7 ± 7.2) de isolados ocorreu nas larvas, verificando-se diferença estatística
significativa entre a média (29.3 ± 2.3) obtida nos ovos (p = 0.0011), nas pupas
(24.3 ± 7.6) (p < 0.001) e em fêmeas adultas (32.7 ± 7.5) (p = 0.0026),
constatando-se o dobro do valor. Todavia, não houve diferença significativa (p >
0.05) entre a média de linhagens obtida entre as seguintes amostras: i) ovos e
pupas, ii) ovos e fêmeas adultas, iii) pupas e fêmeas adultas.

Tabela 1. Total de linhagens bacterianas obtidas em cada amostra (ovos, larvas, pupas e
fêmeasadultas) do mosquito nos três meios de cultivo (NA, LB e ISP2).
Linhagens bacterianas

Tipo de amostra NA LB ISP2 Mín. Máx. Mean ± sd Total

Ovos 28 32 28 28 32 29.3 ± 2.3 a 88

Larvas 51 64 52 51 64 55.7 ± 7.2 b 167

Pupas 33 21 19 19 33 24.3 ± 7.6 a 73

Fêmeas adulta 25 33 40 25 40 32.7 ± 7.5 a 98

*SD: Desvio Padrão. Letras diferentes na mesma coluna diferem de acordo com Student's t teste
(p ≤0.05).

Outras bactérias não são passiveis de isolamento por meio do protocolo

e meios de cultivo utilizados provavelmente complementam as comunidades
bacterianas cultiváveis. Estudos sobre a composição e diversidade microbiana
cultivável associada aos mosquitos do gênero Aedes na Amazônia Brasileira,
ainda são escassos. Deste modo, há necessidade de conhecer os meios de
obtenção das bactérias, relação com a capacidade vetorial, modulação no

570
desenvolvimento de patógenos, além da interferência na biologia destes
mosquitos (Hedge et al. 2018; Tuanudom et al. 2021).
No decorrer do ciclo biológico, após a eclosão do ovo, as larvas entram
em contato com a água e posteriormente alimentam-se da matéria orgânica e
microrganismos presentes no criadouro (Coon et al. 2014; Akorli et al. 2019).
Destemodo, as bactérias constituintes da microbiota associada a este mosquito,
podem ser adquiridas de diferentes maneiras, como exemplo, por meio da
herança vertical a partir das gerações, ou pela aquisição contínua do meio
ambiente (Akorli et al. 2019; Juma et al. 2021).

Caracterização morfológica dos isolados bacterianos

A análise das características da parede celular das 426 linhagens,
determinou que 309 são Gram negativas e 117 Gram positivas. Todas as
linhagens mostraram reação positiva para o teste de catalase. As colônias
bacterianas variaram de (i) formacircular a irregular, com (ii) bordas lisas, lobada,
onduladas e denteadas, (iii) estruturas granular, lisas, rugosas, papiladas.
Considerando as características morfológicas dascolônias, estas apresentaram
cor e brilho que variaram de incolor, translucido, branca, pigmentada e
transparente. Os perfis de riqueza dos morfotipos bacterianos são consistentes
com o número de bactérias no total das amostras agrupadas, pois, observou-se
que os 10 morfotipos apresentados, demonstraram alta variabilidade morfológica
com predominância de cocos negativos e em menor quantidade cocos positivos
(Figura 1).

571
Figura 1: Perfil dos morfotipos bacterianos dos isolados

Nas últimas décadas, a diversidade microbiana vem sendo elucidada

principalmente por técnicas moleculares, como por exemplo, o sequenciamento
de regiões do gene16s rRNA (Dueholm et al. 2022). Entretanto, as análises
morfológicas, organização celular, mecanismos de respostas a fontes de
nitrogênio, carbono, oxigênio, pH, temperatura e outros fatores, permitem uma
análise prévia da diversidade e auxiliam na seleção de microrganismos para
pesquisas posteriores.

Atividade larvicida
A análise da patogenicidade de 426 bactérias, demonstrou que 30
linhagens ocasionaram mortalidade das larvas de A. aegypti com valores maior
ou menor que 50% em leituras nos intervalos de 24 a 72h (Tabela 2). Dentre
estas, 14 linhagens ocasionaram 100% de mortalidade em 24h, sendo, 3
oriundas das amostras de ovos, 6 de larvas, 1 da pupa e 4 de adultos. O perfil
de toxicidade comparado a linhagem padrão Vectobac® WG-Bacillus
thuringiensis var. isralensis foi semelhante a esses achados.

572
Tabela 2. Linhagens bacterianas com potencial patogênico para larvas de terceiro estádio de
Aedes aegypti.
Mortalidade (%)
Linhagens 24 h 48 h 72 h Linhagens 24 h 48 h 72 h
O4LB 100 - - L49ISP2 100 - -
O10LB 88 100 - L49ISP2 43 88 100
O1LB 77 93 100 L7LB 100 - -
O30NA 100 - - P14LB 46 100 -
O33NA 66 80 100 P10NA 100 - -
O36NA 100 - - P22NA 10 66 80
L20LB 100 - - A19ISP2 100 - -
L35LB - 60 90 A20ISP2 - 33 77
L10NA 23 66 98 A21ISP2 100 - -
L65LB 100 - - A4ISP2 56 100 -
L69NA 26 70 100 A10NA 46 88 100-
L88LB 100 - - A32LB 100 - -
L63NA 46 100 - A25LB 26 77 100
L55NA 100 - - A33LB - 33 90
L90LB - 33 93 A21NA 100

A maior parte das bactérias associadas aos mosquitos apresentam

comportamento simbióticos (Wang et al. 2017), porém a reintrodução de
bactérias no mosquitos pode ocasionar patogenicidade ao próprio hospedeiro
(Bahia et al. 2014). Deste modo, comunidades bacterianas naturais podem
constituir fontes de recursos para a descoberta de agentes de biocontrole como
novos mecanismos de ação e desenvolvimento de bioinseticidas.

Conclusões
Bactérias cultiváveis isoladas do ciclo biológico do mosquito A. aegypti
apresentam alta diversidade morfológica. O potencial patogênico das linhagens
bacterianas testadas demonstrou que 30 linhagens apresentam atividade
larvicida e necessitam de estudos posteriores A identificação das bactérias por
métodos moleculares é necessário para melhor conhecimento sobre as
principais bactérias constituintes dessa microbiota, além do potencial patogênico
para uso no controle do próprio hospedeiro.

Referências
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Bahia, A.C.; Dong, Y.; Blumberg, B.J.; Mlambo, G.; Tripathi, A.; Ben, M.; Hidalgo,
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574
Wang, S.; Dos-Santos, A.L.; Huang, W.; Liu, K.C.; Oshaghi, M.A.; Wei, G.;
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575
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Levantamento da coleção de macrofungos do Herbário INPA

Lima, Marly Castro1; Cabral, Tiara Sousa2; Gordiano, Ruby Vargas-Isla1;

Hopkins, Michael John Gilbert1; Ishikawa, Noemia Kazue1; Oliveira, Jadson José
Souza de1,3
1Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 2Universidade Federal do Amazonas,
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis3.
Email: [email protected]; [email protected]

Resumo
As coleções biológicas são fundamentais para preservação e manutenção de
registros de amostras das espécies, na determinação de padrões da distribuição
geográfica e na variação temporal da biodiversidade. No entanto, a
desatualização taxonômico-sistemática e os erros e inconsistências nos
registros virtuais, afetam a qualidade dos dados. São frequentes as perguntas:
Quantas coleções de macrofungos estão depositadas no herbário? De quantas
espécies? Quantas são espécime-tipo? etc. Neste estudo, realizou-se o
levantamento de espécimes de macrofungos depositados no herbário INPA com
o objetivo de avaliar a qualidade dos dados disponibilizados e servir como fonte
de informação para consultas por taxonomistas e demais estudiosos que
procuram os dados básicos vinculados à coleção. Os dados foram obtidos a partir
da plataforma speciesLink e do banco de dados local do herbário INPA, via
programa BRAHMS. Os erros detectados foram identificados, categorizados e
quantificados para futuras correções. O total de 25.146 registros de espécimes
depositados representa 744 gêneros e 2.212 espécies, sendo 725 dos registros
são espécimes tipos. O maior número de amostras depositadas é oriundo da
região Norte destacando-se o estado do Amazonas com coletas realizadas em
28 municípios. A maioria dos espécimes depositados estão classificados nos
filos Basidiomycota e Ascomycota.

Palavras-chave: Biodiversidade, Fungos, Registros.

Introdução
Coleções biológicas são fontes preponderantes de conhecimento sobre
organismos vivos, apresentando desde informações como a composição da
biota de diferentes locais, a distribuição de populações e a variação temporal da
biodiversidade ( Peixoto et al. 2016). Dentre os acervos, destacam-se as
coleções botânicas que desempenham papel fundamental na preservação e
manutenção de registros que relacionam os dados aos mais variados aspectos de

576
determinada espécie, ligando-os a uma correta identificação baseado no
conjunto de características morfológicas correlacionadas aos fatores ecológicos
(Dias 2019).
No Brasil, há registro de cerca de 200 herbários ativos dos quais 19 estão
na região Norte. Dentre esses, o herbário do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia (Inpa), indexado com acrônimo INPA (Thiers 2023), está entre os cinco
maiores do Brasil (Vieira 2016), o herbário foi inaugurado em 1954 com o objetivo
de atuar como centro regional de documentação da Flora Amazônica Brasileira
(Rodrigues e Silva 1981). O herbário foi o primeiro da região Norte a estabelecer
a primeira coleção botânica na mesma data em que o Inpa foi instituído
oficialmente em Manaus e o primeiro instituto na América Latina. Em pouco
tempo após a inauguração, ultrapassou a marca de 100 mil exemplares e, por
esse motivo, recebeu a denominação de Herbário Nacional (Forero 1975).
A coleção botânica do Inpa possui 298.111 espécimes registrados no
banco de dados local gerenciado com o BRAHMS (Botanical Research and
Herbarium Management System), sendo considerado o terceiro mais antigo da
região Norte do Brasil (Hopkins 2015). Atualmente, o acervo botânico do Inpa
está registrado junto à Rede Brasileira de Herbários (Sociedade Botânica do
Brasil) e ao Index Herbariorum, tornando-se um dos acervos científicos pioneiros
na informatização e registros fotográficos das exsicatas disponibilizados online
no site do INCT- speciesLink (http://splink.cria.org.br/).
A estrutura do herbário INPA ocupa dois edifícios, o primeiro conhecido
como "Herbário I" onde estão armazenadas as amostras da coleção de plantas
espermatófitas e o segundo, "Herbário II", onde estão armazenadas as coleções
de macrofungos, briófitas, pteridófitas e as duplicatas de amostras botânicas que
compartilham espaço com o Centro de Referência em Informação Ambiental
(Cria 2022). O "Herbário II" também serve para identificações taxonômicas em
parceria com Inventário Florestal Nacional (IFN). No entanto, apesar do aumento
significativo de amostras depositadas nos últimos anos, não há registrado o
número exato de contribuições dos espécimes catalogados.
Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo realizar um levantamento
dos macrofungos depositados no Herbário INPA para servir como fonte de
informação para consulta de taxonomistas e demais estudiosos que procuram
os dados básicos vinculados à coleção de macrofungos.

577
 Material e Métodos
Realizou-se o levantamento dos registros de fungos incorporados ao
herbário INPA através do banco de dados local gerenciado pelo programa
BRAHMS para obter informações sobre a coleção de macrofungos. Também
realizou-se consulta às bases de dados digitais disponíveis na internet: Rede
speciesLink (speciesLink network 2023) do Centro de Referência em Informação
Ambiental (CRIA) (http://www.cria.org.br), Rede Brasileira de Herbários (RBA)
(https://www.botanica.org.br/catalogo-da-rede-brasileira-deherbarios/), Index
Herbariorum (http://sweetgum.nybg.org/science/ih/) e o site do Inpa
(https://antigo.inpa.gov.br/).
O número de espécimes encontrados no banco de dados local foi
analisado e comparado com os dados do speciesLink considerando o número
de espécimes encontrados no herbário, o material tipo, à procedência dos
espécimes. Esses relacionados aos grupos taxonômicos (sistema utilizado pelo
herbário) de fungos representados, às localidades amostradas, aos coletores,
bem como à informatização do acervo e a distribuição de coletas por áreas.
"INPA" refere-se ao acrônimo oficial do herbário registrado no Index Herbariorum
e "Inpa" é a sigla da instituição mencionada.

Resultados e Discussão
No total, via speciesLink, foram contabilizados 25.146 registros com a
inclusão de duplicatas no banco de dados do herbário, oriundos de coletas em
diferentes estados do Brasil e em regiões de outros países. Para todas as
informações dos exemplares depositados na coleção de macrofungos,
procederam-se a verificação e correção das informações. Em todo o acervo,
verificou-se registros com mais de um tipo e/ou categoria de erro. No total, não
foram considerados informações de 454 novos registros a partir de agosto do ano
anterior (Figura 1).

578
Figura 1. Número de registros catalogados, nos últimos 15 anos.

Na coleção do herbário INPA, o maior número de amostras de

macrofungos depositadas é oriundo da região Norte, distribuídos nos estados:
AM (59,46%), PA (13,88%), RR (13,53%), RO (5,63%) e AC (4,84%), seguido
das regiões Centro-Oeste: MT (1,05%); Nordeste: PE (0,60%), PB (0,09%), BA
(0,57%) e CE (0,04% e Sudoeste: SP (0,17%) (Figura 2). O Amazonas, estado
que sedia o herbário INPA, destaca-se por contribuir com maior número de
coleções depositadas, com boa parte das coletas realizadas em 28 municípios.
Naturalmente, a esmagadora maioria das coleções no herbário INPA são coletas
efetuadas na Amazônia e, portanto, servindo com acervo majoritariamente
representando a biodiversidade do bioma.

Figura 2. Distribuição dos espécimes encontrados em diferentes locais do Brasil.

0,60% Depósito de espécimes

1,05% 0,57% 0,17%
0,09% Estados
4,84% 0%
Amazonas
5,63%
Pará

Roraima

Rôndonia
13,53%
Acre
59,46% Mato
13,88%
Grosso
Pernambuc
o

579
 No estado do Amazonas, encontra-se uma parcela considerável de
coletas realizadas nos últimos anos, próximo de cursos fluviais e dos maiores
municípios do estado, principalmente Manaus, com 10.279 registros, seguidos
de Barcelos com 1.679 registros, via (BRAHMS) (Tabela 1). Via speciesLink, entre
os 25.146 espécimes coletados, 2.212 estão identificadas ao nível de espécie,
744 ao nível de gênero, 239 ao nível de família, 92 ao nível de ordem, quatro ao
nível de filo, e 9.500 espécimes estão sem identificação a não ser como fungos
(Figura 3).
Tabela 1. Distribuição dos municípios e número de coletas efetuadas no estado do
Amazonas, obtidos no banco de dados local, via programa BRAHMS (Botanical Research
and Herbarium Management System).

580
Figura 3. Distribuição do número de registro por classificação ou nível hierárquico
taxonômico, obtidos do banco de dados local via BRAHMS.

Os dados obtidos em branco indicam ausência de informação no banco

de dados e, consequentemente, a falta de identificação taxonômica em herbários
virtuais. Isso reflete que tais espécimes depositados necessitam ser estudados
e que podem representar novos táxons a serem descobertos para a ciência, ou
espécies ou outros níveis taxonômicos não citados anteriormente para o estado
do Amazonas e/ou os demais, ou espécies só conhecidas pelos materiais-tipo ou
espécimes clássicos. Considerando o primeiro registro de coleta em 1913, a
maior parte das coletas foi realizada a partir da década de 1960 até os dias
atuais, totalizando 535 amostras, concentrando 3,75% de todas as coletas. No
entanto, o maior número registrado foi em 1984 com 1.470 registros. Vale
destacar que as informações, via speciesLink, se referem aos dados disponíveis
(Figura 4).

581
Figura 4. Contribuições em coletas, desde o primeiro depósito em 1913.

Via BRAHMS, constatou-se que a maior parte da coleção se encontra

organizada por filos (sistema utilizado pela coleção INPA, por classificação
baseada em Alexopoulos et al. (1996). Atualmente, a classificação dos filos foi
submetida a mudanças drásticas e, consequentemente, os filos Deuteromycota
e Zygomycota não são mais aceitos entre os micologistas e, por isso, estão
alocados na categoria de filo indeterminado (Tedersoo et al. 2018;
Wijayawardene et al. 2020) (Figura 5). Deste acervo, 725 exemplares são
considerados "tipos nomenclaturais" e estão organizados separadamente da
coleção geral. Desses tipos, estima-se que haja 272 holótipos, 66 isótipos, 167
parátipos, 1 lectótipo, 1 neótipo, 18 e 200 tipos aguardando verificação. O filo
Basidiomycota representa 63,31% do material "tipo" depositado, seguido do filo
Ascomycota com 36,69%.

Figura 5. Porcentagens de registros classificados por filo (sistema adotado pelo herbário
INPA) obtidas no banco de dados local via BRAHMS.

Os gêneros Marasmius e Mycena possuem o maior número de

exemplares depositados na coleção. Marasmius foi o mais representativo com

582
688 espécimes, com 118 identificados ao nível de espécie, 166 ao nível de
gênero e 404 espécimes estão não identificados. Enquanto Mycena possui 166
registros com 52 identificados ao nível de espécie e 114 ao nível de gênero
(Figura 6).

Figura 6. Gêneros representativos deposítados nas coleções do herbário INPA.

As informações encontradas no banco de dados utilizado pelo herbário

INPA via BRAHMS apresentam mais erros taxonômicos e geográficos do que
erros da categoria taxonômica, ocorrendo em baixa proporção de registros. Por
isso, foram extremamente comuns erros nas amostras analisadas,
especialmente, para os campos referentes a filo, classe, ordem e família.
Observou-se, que a ausência dessas informações, em muitos casos, pode ter
ocorrido por essas serem tidas como "óbvias" para o grupo dos fungos e não há
preocupação com a sua digitalização.
Contudo, a não inclusão de informações pode comprometer os resultados
de buscas no banco de dados e nas plataformas digitais online, gerando dados
subestimados e não condizentes com a realidade. Salienta-se que tanto a
disponibilização de registros com informações inconsistentes quanto registros
com informações incompletas ou ausentes na coleção física e virtual podem
prejudicar as buscas realizadas, implicando na redução da quantidade de
informação disponível para responder determinada pergunta. Isso leva a
conclusões errôneas e maior dispêndio de tempo para realizar a pesquisa devido
à necessidade de organização e limpeza dos dados antes de sua utilização.

583
 Conclusões
Foram encontradas 25.146 amostras de macrofungos depositadas no
herbário INPA, sendo que 454 não constam no site do speciesLink, com
espécimes do filo Basidiomycota mais representados no acervo. No geral, a
coleção de fungos do Inpa apresenta boa qualidade e atualização dos dados,
mas é notória a redução de informações acompanhando o aumento do número
de coletas e registros contendo erros na inserção de dados dentro do banco de
dados local via BRAHMS. Considerando que o herbário INPA está entre os cinco
maiores do Brasil e atua como centro regional, nacional e mundial de
documentação da diversidade botânica e fúngica da Amazônia Brasileira, é
imprescindível que as informações sejam disponibilizadas com mínimo de erros
possíveis.

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585
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Linhagens de Paecilomyces spp. (Eurotiales, Ascomycetes)

depositadas na Coleção Microbiológica – INPA

Silva, Isabelly Guimarães1; Nóbrega, Jordane Pimentel2; Ferreira, Suzana

Mineiro1; Jesus, Maria Aparecida1

1
Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, 2Universidade Federal de
Pernambuco.
Email: [email protected]; [email protected]

Resumo
O gênero Paecilomyces vem despertando grande interesse bioeconômico, devido
aosseus potenciais ecológico, patológico, fitopatológico e biotecnológico. Dessa
forma, o isolamento, identificação e manutenção ex situ desse grupo de fungos
éimprescindível para o conhecimento da diversidade, ocorrência e distribuição
deste gênero. Com isso, o propósito deste trabalho foi reativar as culturas de
Paecilomyces depositadas na Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do INPA, e identificar por meio de características macro e
micromorfológicas linhagens de P. variotii. As culturas preservadas em baixa
temperatura e em óleo mineral foram submetidas a um processo de reativação.
Um total de 151 linhagens viáveis foi recuperado das 199 culturas preservadas
na Coleção Microbiológica - INPA, e cinco linhagens apresentaram
características semelhantes às descritas para P. variotii. As culturas reativadas
viáveis foram preservadas em repique contínuo, óleo mineral e em sílica-gel. A
manutenção da coleção contribui para o conhecimento da diversidade de
espécies de Paecilomyces presentes na região da Amazônia, possibilitando o
acessodas culturas para futuros estudos de taxonomia e/ou biotecnologia.

Palavras-Chave: Coleção de culturas; Fungo anamorfo; Taxonomia

Introdução
O gênero Paecilomyces foi descrito por Bainier em 1907, tendo como
espécietipo P. variotii Bainier, e inclui fungos que produzem conidióforos
irregularmente ramificados, termotolerantes, com fiálides com base inflada que
se estreitam abruptamente em um pescoço fino, e produzem conídios marrom-
oliva em cadeias (Samson 1974; Houbraken et al. 2020). Este grupo de fungos
têm distribuição mundial, ocorrem em diferentes substratos lignocelulolíticos,
como também no solo, plantas e em ambientes de laboratórios (como
contaminante). Atuam como parasitas de vegetais, animais, insetos e humanos,

586
além de serem associados à decomposição de produtos alimentares (Li et al.
2020; Senthilkumar et al. 2020).
Revisões taxonômicas com análises moleculares demonstraram que
Paecilomyces é um grupo polifilético em duas subclasses, Sordariomycetidae e
Eurotiomycetidae (Luangsa-ard et al. 2004). Adicionando dados moleculares e
extrólitos, Samson et al. (2009) revisaram a taxonomia e a nomenclatura dos
táxons aceitos e propuseram Paecilomyces como um gênero monofilético dentro
da ordem Eurotiales, visto que a espécie tipo deste gênero e seus parentes
termofílicos pertencem a esta ordem. Atualmente o gênero possui 157 espécies
registradas no Mycobank (www.mycobank.org), no entanto, muitos deles são
sinônimos taxonômicos ou táxons questionáveis. Filogeneticamente, o gênero
Paecilomyces agrupa apenas 12 espécies delimitadas por combinações de
marcadores moleculares, sendo este, um grupo irmão de Thermoascus, e ambos
pertecem à família Thermoascaceae (Spetik et al. 2022).
No gênero Paecilomyces a espécie mais estudada é P. variotii devido à
sua patogenicidade, à capacidade de contaminação de produtos alimentícios e
de causar doenças oportunistas em humanos e animais, entretanto, esta espécie
também apresenta potencial de aplicação em áreas industriais, agrícola,
farmacológica e em biorremediação (Laguna et al. 2015; Mioso et al. 2015; Li et
al. 2020). A manutenção ex situ do acervo de Paecilomyces na Coleção de
Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural - INPA é fundamental para o
desenvolvimento de estudos que visama identificação por taxonomia morfológica
e molecular das espécies para se conhecer a diversidade, ocorrência e
distribuição do gênero Paecilomyces na região amazônica.
O objetivo deste trabalho foi reativar culturas de Paecilomyces spp.,
atualizar o banco de dados da Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do INPA e identificar por meio de características macro e
micromorfológicas as linhagens de P. variotii.

Material e Métodos
Inicialmente, as 129 culturas de Paecilomyces preservadas em repique
contínuo a 5 a 8°C foram submetidas a reativação a partir de fragmentos de meio
de cultivo Batata-Dextrose-Ágar (BDA) (1 x 1 cm), os quais foram colocados
sobre a cultura mantida em tubos de ensaio, sendo incubados em estufa, a 26 °C,

587
por um período até que fosse observadocrescimento micelial característico do
fungo armazenado no meio. Em seguida, os fragmentos do meio colonizados
foram transferidos para tubos de Eppendorf (2mL) contendo meio BDA. Os tubos
de Eppendorf foram mantidos em estufa, a 26°C. As colônias que não
apresentaram contaminação foram repicadas em placas de Petri (30x 10 mm)
com meio BDA, e foram mantidas a 26 °C por um período até o micélio ocupar
toda a superfície no meio da placa.
As linhagens que não foram possíveis de se recuperar daquelas
depositadas em repique contínuo, optou-se por utilizar as amostras preservadas
em óleo mineral visando minizar a perda da linhagem do acervo. Primeiramente
foi feito o descarte do óleo presente nas amostras em ambiente estéril, e o
restante absorvido em papel filtro esterilizado. Após isso, inóculos das culturas
foram transferidos para tubos de Eppendorf contendo meio BDA, como também,
papel filtro esterilizado embebido com caldo glicosado foi colocado nos tubos de
ensaio contendo as colônias anteriormente preservadas. Tanto os tubos de
ensaio como os tubos de Eppendorf foram mantidos em temperatura ambiente
até que fosse observado crescimento micelial. As culturas reativadas foram
submetidas, posteriormente, ao mesmo processo de reativação do método de
preservação em repique contínuo. Paras as linhagens que não cresceram ou
estavam contaminadas optou-se por utilizar as amostras preservadas em sílica-
gel.
As linhagens de Paecilomyces foram caracterizadas morfologicamente
utilizando a técnica de microcultivo proposta por Riddell (1950), modificada. Para
tal, montou-se uma câmara úmida em uma placa de Petri (60 x 10 mm) contendo
duas lamínulas, sobre as quais foi colocado fragmento de meio BDA (1,0 x 1,0
cm), sendo distribuídos quatro pequenos inóculos nas laterais, e sobre fragmento
de meio foi depositada uma lamínula. Papel filtro esterilizado três vezes e
umedecido foi colocadona placa de Petri, com o intuito de manter a câmara de
microcultivo úmida. As placasforam mantidas em estufa, a 26 °C, por 3-4 dias.
Para a análise microscópica, as lamínulas colonizadas com o fungo foram
coradas com azul de metileno segundo metodologia de Lacaz et al. (1998) com
o intuito de visualizar e medir as estruturas microscópicas. As imagens das
microestruturas foram captadas em um microscópio Leica DSM500.

588
 A análise macroscópica proveniente do microcultivo, foi feita através de
três inóculos equidistantes, colocados em placa de Petri (90 x 15 mm) com Ágar
Extrato de Malte (MEA), como também em meio Ágar Czapek-Dox + Extrato de
Levedura 0,5% (p/v) (CYA) a fim de checar as diferenças macro morfológicas
identificadas na análise microscópica para as linhagens que apresentaram
divergência taxonômica comparadas a descrição do gênero Paecilomyces. As
placas foram incubadas em estufa, a 26 °C, por 6-7 dias.
A confirmação do gênero e/ou da espécie da cultura foi baseada nas
descrições macroscópicas e microscópicas descritas para o gênero
Paecilomyces (Samson 1974) e nas disponibilizadas no site Mycobank
(http://www.mycobank.org). Todas as linhagens foram preservadas em triplicatas
nos seguintes métodos de preservação: repique contínuo em meio BDA,
mantidos em baixa temperatura (5 a 8º C), óleo mineral, também em meio BDA,
e sílica-gel, ambos mantidos em temperatura ambiente. Para o depósito no
acervo, todas as amostras das linhagens foram devidamente etiquetadas com o
número de registro da cepa na coleção e a data da reposição. Posteriormente,
todos os dados e imagens decada linhagem de Paecilomyces foram inseridos no
banco de dados da CMIA-INPA.

Resultados e Discussão
A Coleção Microbiológica - INPA mantinha 199 linhagens de
Paecilomyces, armazenadas há aproximadamente 10 anos. Destas foram
recuperadas 151 culturas viáveis independentemente dométodo de preservação,
e as 48 restantes foram perdidas por contaminações externas ou perda de
viabilidade de crescimento. Recuperou-se 37 culturas das 129 que estavam
preservadas em repique contínuo, o que corresponde apenas a 28,7% do acervo
preservado no método citado. As demais linhagens foram recuperadas puras e
viáveis a partir de amostras preservadas em óleo mineral (113) e sílica-gel (1).
Dessa forma, a maioria das linhagens recuperadas foram aquelas mantidas em
óleo mineral, o que indica ser um método eficiente para a preservação deste
gênero.
A maioria das culturas reativadas está identificada apenas em nível de
gênero, representando 70,9% das linhagens do acervo de Paecilomyces na
Coleção. Somente as seguintes espécies constam no acervo: P. niveus (1) e

589
P. variotii (42). Neste estudo,das 42 linhagens registradas como P. variotii, cinco
foram caracterizadas morfologicamente como P. variotii. No entanto, essas
linhagens apresentam diferençano tamanho das fiálides e dos conídios quando
comparadas às descritas por Samson (1974) e Samson et al. (2009), em que as
fiálides apresentam comprimento e larguramenores do que os registrados, assim
como o diâmetro dos conídios. Já as estruturas, como hifas, conidióforos e
clamidósporos, são semelhantes às descritas para P. variotii (Tabela 1).
As características morfológicas de cinco linhagens de Paecilomyces
variotii armazenadas na Coleção Microbiológica - INPA são apresentadas na
Figura 1. Nota-se que as características morfológicas destas linhagens de
Paecilomyces são semelhantes às descritas para os representantes de P. variotii,
entretanto, para confirmar a espécie faz-se necessário realizar análises que
incluam técnicas de biologia molecular, visto que P. variotii foi separado em
outras espécies (P. brunneolus, P. formosus e P. variotii), por meio de análises
filogenéticas (Samson et al. 2009). Todas as linhagens que apresentaram
divergência taxonômica com o gênero estão sendo submetidas às análises
molecularese filogenéticas, visando a confirmação das espécies, espécies novas
e gêneros afins presentes no acervo, particulamente as linhagens de
Paecilomyces spp. que constam na Figura 2.
O presente estudo continuará em execução visando a confirmação das
espécies e/ou gêneros afins através da análise molecular, tendo em vista que o
acervo constitui um verdadeiro patrimônio científico, tecnológico e econômico,
portanto é de suma importância ser identificado e preservado. Neste sentido,
espera-se conhecer omaior número de isolados da Coleção Microbiológica que
gerará informações sobre a diversidade das linhagens deste acervo de fungo
anamorfo da região amazônica.

Tabela 1. Características morfológicas das linhagens de P. variotii armazenadas na

ColeçãoMicrobiológica - INPA em comparação com a espécie descrita.
Estrutura Característica das Linhagens* Característica de P. variotii**
Textura pulverulenta, coloração Textura pulverulenta, coloração amarelo, amarelo-
Colônia amarelo a amarelo-oliva; reverso oliva ou amarelo marrom; reverso: amarelo a
amarelo. amarelo-marrom.
Cilíndrico com um longo pescoço;
Cilíndrico a elipsoidal com um longo pescoço; 12-
Fiálide 10,3-19,2 × 2,0-3,5 µm (Me = 14,4
20 × 2,5-5,0 µm regularmente.
× 2,6 µm);

590
 Amarelo; Elipsoidal, cilíndrico; 3,0-
Amarelo; Predominantemente elipsoidal ou
Conídio 6,8 × 1,7-4,1 µm (Me = 4,5 × 2,6
cilíndrico; 3,3-6,1 × 1,5-4,4 µm.
µm).
Globoso a ovóide; 4,1-9,0 µm de
Clamidósporo Globoso a ovóide; 4,0-10,0 µm de diâmetro
diâmetro (Me = 6,7 µm).
*Linhagens analisadas (CMINPA 17, 1029, 1261, 1344 e 1397) **Segundo a descrição de
Samson (1974) e Samson et al. (2009)
Taxonomia

Paecilomyces variotii Bainier, Bull. Soc. Mycol. France 23: 27. 1907. Figura
1. Características Macroscópicas: apresenta em meio Ágar Extrato de Malte
(MEA) crescimento micelial rápido, atingindo diâmetro de 90 mm em 6 dias, a
26 °C, com textura pulverulenta e crescimento de micélio aéreo inicialmente
branco; coloração variando entre amarelo, amarelo-oliva e amarelo-marrom
(Fig. 1.A), reverso amarelo a amarelo-marrom (Fig. 1.B), algumas vezes
marrom escuro; exsudato ausente na maioria das vezes, e são transparentes
quando presentes.
Características Microscópicas: Hifa vegetativa hialina com paredes grossas
e lisas,algumas vezes apresenta grânulos amarelos, largura de 3,0-5,5 µm,
mas hifas infladas chegam a medir até 20 µm. Conidióforos dispostos de
diferentes formas, podendo ser monoverticilado (Fig. 1.C), biverticilado (com
métula) (Fig. 1.D), terverticilado de complexa ramificação (fiálide, metula, ramo
e estipe) (Fig. 1.E), e divaricata (irregularmente ramificado) (Fig. 1.F); 35-90
µm de comprimento, ocasionalmente com até 150 µm de comprimento; Fiálides
com tamanhos variados de 12-20 × 2,5-5,0 µm na maioria das vezes,
ocasionalmente com até 35 µm decomprimento, forma cilíndrica e afinando
abruptamente no ápice em um longo pescoço. Conídios hialino a amarelo,
paredes lisas (Fig. 1.I); formato subgloboso, cilíndrico e elipsoidal, mas
algumas linhagens apresentam formato de clava; dimensões variando em 3,2-
5,0 × 2,0-4,0 µm em algumas cepas, a 3,5-15,0 × 2,0-5,0 em outras cepas.
Clamidósporos: usualmente presentes (Fig. 1.G-H); coloração marrom a
marrom escuro; paredes lisas e grossas; formato globoso, subgloboso a
ovóide; diâmetro de 4,0-8,0 µm, algumas vezes com até 10 µm de diâmetro.
Linhagens examinadas: Brasil, Amazonas, Manaus, tronco de árvore caído.
Hanada, R. E. e Abreu, R. L. S. 27 de maio de 2004 (CMINPA 17, CMINPA
1029, CMINPA 1261, CMINPA 1344, CMINPA 1397).
Distribuição conhecida: Fungo cosmopolita, distribuído mundialmente

591
(Spetik et al. 2022).

Figura 1. Características macro e microscópicas das linhagens de Paecilomyces variotii

armazenadasna Coleção Microbiológica - INPA. Colônia em Ágar Extrato Malte (MEA) (A),
reverso (B). Tipos de ramificação do conidióforo (C-F): monoverticilado (C), biverticilado (D),
terverticilado (E) e divaricata (F). Clamidósporos (G e H). Conídios (I). Barra de escala: 15
µm.

Figura 2. Características macro e microscópicas de Paecilomyces sp. (CMINPA 1293).

Colônia cultivada em MEA: (A) Frente, (A) Verso. Colônia cultivada em CYA: (B) Frente, (B')
Verso. (C) Conidióforo. (D) Ramo principal. (E) Conidióforo e conídios. Barra de escala: 10
μm.

592
 Conclusões
O processo de reativação das 199 linhagens de Paecilomyces
depositadas na Coleção de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural -
INPA permitiu a recuperação de 151 culturas que estavam preservadas em
diferentes métodos.Destas 151 linhagens reativadas, cinco são caracterizadas
morfologicamente como representantes de P. variotii.

Agradecimentos
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM,
pela bolsa de iniciação científica concedida a Jordane Pimentel Nóbrega, e
também pela bolsa de apoio técnico concedida a Isabelly Guimarães Silva e
Suzana Mineiro Ferreira.

Referências
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593
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594
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Manutenção de culturas de macrofungos (Basidiomycetes) da

Coleção de Microrganismo de Interesse Agrossilvicultural –
INPA

Jesus, Maria Aparecida1; Silva, Isabelly Guimarães2; Ferreira, Suzana Mineiro3;

Nogueira, Renata Geovana Costa1; Oliveira, Luiz Antonio1

1Instituto
Nacional de Pesquisa da Amazônia, 2Universidade Federal de Pernambuco,
3Universidade Federal do Amazonas.

Email:[email protected]

Resumo
Os macrofungos (Basidiomycetes) exercem relevantes funções na ecologia,
economia e biotecnologia devido a sua grande aplicabilidade. A preservação e
identificação deste grupo de fungos é importante para o conhecimento da
diversidade. Este estudo teve por objetivo reativar e preservar as culturas de
macrofungos (Basidiomycetes) em diferentes métodos de preservação na
Coleção de Microrganismos de Interesse Agrossivicultural - INPA. As culturas
foram reativadas, até se obter as colônias puras, em seguida foram analisadas
macroscopicamente e microscopicamente. Um total de 123 linhagens de
Basidiomycetes da Coleção foram selecionas para este estudo, deste total, 85
cepas foram reativadas e devidamente depositadas em três réplicas nos
métodos de preservação: repique contínuo, água destilada estéril e óleo mineral.
Dentre as culturas reativadas, aquelas de Pleurotus eryngii, P. ostreatus e
Pleurotus spp. apresentam potencial alimentar e outras como as de Coriolopsis
sp., Pycnoporus sanguineus, Trametes modesta, T. versicolor, Trametes spp.
são as que apresentamalto potencial biotecnológico.

Palavras-Chave: Basidiomycetes; Coleção de culturas; Métodos de

preservação

Introdução
No Reino Fungi, o filo Basidiomycota agrega 18 classes, 68 ordens, 241
famílias, 1.928 gêneros e 41.2170 espécies (He et al. 2019). Os macrofungos
(Basidiomycetes) são aqueles que apresentam basidiomas visíveis a olho nu e
tem uma estrutura reprodutiva macroscópica conhecida como cogumelos e
orelhas-de-pau, produzem esporos de origem sexual denominada basídio
(Mattos 2020), caráter taxonômico que separa estes macrofungos do grupo dos
Ascomycetes.

595
 Com relação ao aspecto ecológico, os macrofungos exercem um
importante papel na manutenção do ecossistema, por serem sapróbios, atuam
na ciclagem de nutrientes, decompondo matéria orgânica em decomposição,
reciclando os nutrientes. Neste grupo de fungos, várias espécies são
fitopatogênicas, pois atacam árvores vivas. Um exemplo é Coriolopsis gallica (Fr)
Ryv., que causa da podridão em raízes ou troncos destruindo as células do
lenho, o que interrompe as funções fisiológicas da árvore e resulta em sua
deterioração, podendo levá-la à morte (Cibrian-Tovar et al. 2007). Por outro lado,
os macrofungos possuem um complexo enzimático, sendo as enzimas, os
principais constituintes desses complexos e algumas destas podem ser aplicadas
tanto para biorremediação de solos como para o tratamento de efluentes
industriais ena produção de etanol (Silva 2004; Ahmed et al. 2020). Algumas
espécies de macrofungos são utilizadas na fermentação, na produção de ácido
cítrico, entre outros (Tortora et al. 2012). Também, os macrofungos produzem
metabólitos de importância biotecnológica, tais como, polissacarídeos,
glicoproteínas e proteínas com propriedades imunomoduladoras, antitumoral,
anticancerígena e antiviral, dentre outras (Rahi e Malik 2016). Diversas espécies
destes fungos do acervo são comestíveis, como por exemplo, Lentinus edodes
(Berk.) Pegler (Polyporaceae), Panus strigellus Berk. (Panaceae) e Pleurotus
ostreatus (Jacq. Fr.) Kummer (Pleurotaceae).
As linhagens de macrofungos (Basidiomycetes) incorporadas ao acervo da
Coleçãode Microrganismos de Interesse Agrossivicultural - INPA, são recursos
genéticos que podem ser utilizadas para fins de desenvolvimento científico e
tecnológico, sendo a manutenção ex-situ por meio da reativação, importante
para preservar a diversidade das espécies fúngicas e garantir o acesso das
mesmas para pesquisas futuras.
O objetivo desta pesquisa foi reativar e conservar as características
morfológicas das culturas de basidiomicetos depositadas em diferentes métodos
de preservação na Coleção de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural do
INPA.

Material e Métodos
A prioridade na reativação foi dada para 123 culturas dos macrofungos
(Basidiomycetes) conservadas no método água destilada esterilizada (Castellani

596
1939), quando a cultura apresentava inviabilidade cultural, buscou-se outra
cultura da mesma linhagem mantida em outros métodos de preservação. Para
tal, colocou-se o inóculo da colônia do macrofungo sobre um papel filtro 1.5 cm
× 1.0 cm dentro do microtubo. Após sete dias, foram retirados os papéis
colonizados, e colocados em meio de cultura Ágar Extrato de Malte (MEA) em
placa de Petri (20 x 10 mm), e mantidos na estufa a 25 °C até apresentarem
crescimento micelial.
Culturas preservadas em repique contínuo mantidas a 6 °C foram
submetidas ao processo de reativação. Um fragmento de meio de cultivo MEA foi
colocado sobre a colônia do macrofungo em tubos de ensaio, os quais foram
mantidos em estufa, a 25 °C, até que fosse observado crescimento micelial sobre
o MEA. Em seguida, o fragmento de meio de cultivo colonizado foi inoculado em
placa de Petri (20 x 10 mm) com meio de cultivo MEA, em seguida foram
incubadas a 25 °C até o crescimento do micélio sobre o meio de cultura na placa
de Petri.
Para reativar de culturas conservadas no método de óleo mineral,
primeiramente, o óleo contido nos tubos foi descartado, e o excesso foi retirado
com o auxílio de papel filtro esterilizado, as amostras da colônia do fungo foram
transferidas para placas de Petri (20 x 10 mm) com papel filtro esterilizado
embebido com caldo glicosado, em seguida, as placas de Petri foram incubadas
a 25 °C até que se observasse o crescimento fúngico.
Já na reativação de amostras preservadas em sílica-gel, os inóculos
foram transferidos para microtubos contendo um fragmento de meio de cultivo
MEA, em seguida, foi adicionado papel filtro (diâmetro de 5 mm) esterilizado
embebido com caldo glicosado, com o intuito de estimular o crescimento fúngico.
Os microtubos foram incubados em estufa, a 25 °C, até o crescimento micelial.
Das culturas obtidas isto é, aquelas sem descaracterização fenotípica ou
contaminação, foram retirados três inóculos, e depositados de forma
equidistântes em três pontos das placas de Petri (30 x 10 mm) contendo meio
MEA, as quais foram incubadas a 25 °C até que o micélio ocupasse toda a
superfície do meio de cultura, com o intuito de se confirmar as características
culturais da linhagem ou a presença de qualquer tipo de contaminação, sendo
que naquelas com contaminação foram adicionados papéis filtro estéreis 15 mm
x 10 mm embebidos com caldo glicosado sobre a colônia, em seguida a placa

597
de Petri foi mantida a 25 °C até o crescimento micelial sobre os papéis. Os papéis
colonizados foram colocados no meio de cultivo MEA e as placas de Petri foram
mantidas a 25 °C por um período, até o micélio ocupar toda a superfície do meio
na placa. Novas avaliações para confirmar a ausência de qualquer tipo de
contaminação foram realizadas, até que se obtivesse a colônia pura.
Posteriormente, um inóculo da cultura pura foi repicado próximo da
margem daplaca de Petri (60 x 10 mm) contendo meio MEA, sendo incubada a
25 °C, até que o micélio ocupasse toda a superfície do meio de cultura. As várias
fases do crescimento da colônia do fungo foram fotografadas. Lâminas com
corante vermelho congo foram feitas visando observar as microestruturas da
colônia, principalmente o sistema hifal das culturas, os tipos de hifas generativas
e esqueléticas presentes no micélio, a presença de ansas e cada tipo. As
imagens das microestruturas foram captadas em um microscópio Leica DSM500.
A confirmação do gênero da cultura foi baseada nasdescrições macroscópicas
e microscópicas da colônia dos fungos descritas em Stalpers (1978) e nas
disponibilizadas no site Mycobank (http://www.mycobank.org), como também
comparadas com as relatadas em literatura específica tanto em culturas como
em exsicatas dos gêneros de macrofungos. Por fim, todas as linhagens foram
preservadas em triplicatas nos seguintes métodos de preservação: repique
contínuo, água destilada esterilizada (Castellani) e óleo mineral. Para o depósito
no acervo, todas as amostras das linhagens foram devidamente etiquetadas com
o número de registro da cepa na coleção, assim como a data da reposição.
Posteriormente, todos os dados e imagens de cada linhagem foraminseridos no
banco de dados da CMIA-INPA.

Resultados e Discussão
Um total de 208 linhagens de macrofungos está incorporado na Coleção
de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural - INPA. Deste total, 123
culturas foram submetidas ao processo de reativação, recuperou se 85 linhagens
que estavam mantidas no acervo por um periodo de cerca de 5 anos, com
recuperação de 41 mantidas no metodo em água destilada esterilizada
(Castellani 1939), 30 das culturas mantidas em óleo mineral, 11 das mantidas
em repique continuo e somente 3 das culturas preservadas em silica gel (Figura
1). Observa se uma perda de B das culturas de macrofungos (Basidiomycetes)

598
selecionadas para o estudo. Homolka (2014) relata que o método de preservação
em óleo mineral e de água destilada são os mais apropriados para culturas
miceliais, que é o caso do acervo de macrofungos. A vantagem do método de
preservação em óleo está na redução de infestações de ácaros, com
desvantagem em relação às taxas de crescimento das culturas, que podem
diminuir à medida que o periodo de armazenamento aumenta.

Figura 1. Número de linhagens de macrofungos (Basidiomycetes) depositadas na Coleção

Microbiológica - INPA reativado a partir de diferentes métodos de preservação

A perda das culturas destes fungos ocorreu independentemente do

método de preservação nas quais foram mantidas, isto é, nenhum dos métodos
de preservação das linhagens é 100% eficiente e sem desvantagens na
conservação para qualquer grupo desses fungos. Dellartti (2014) relata que os
métodos de preservação disponíveis permitem preservar os acervos fúngicos,
porém, nenhum deles tem mostrado ser totalmente eficiente na manutenção,
considerando a biodiversidade das espécies fúngicas, o que se torna um grande
desafio de gestão de coleção de microrganismos.
A alta porcentagem (30,9 %) na perda de linhagens pode estar
relacionada com a desidratação do meio de cultura repicagem apresentada pela
maioria das culturas mantidas em repique contínuo a 6 oC . Além disso, os tubos
de ensaio que estavam com vedação inadequada, além da contaminação, são
os possíveis fatores que podem ter contribuído com a perda de culturas. Estes
aspectos são apontados como os maiores causadores de perdas em coleção de

599
fungos (Sola et al. 2012; Meyer et al. 2022). No sentido de minimizar as perdas,
o acervo de culturas de macrofungos devem ser preservadas nos diferentes
métodos:
A literatura disponível com enfoque na descrição morfológica de cultura
de macrofungo (Basidiomycetes), está relacionada basicamente com a descrição
do basidiocarpo (Homolka 2014; Matt 2020). São apresentadas as
características macro e morfológicas das culturas de basidiomicetos na Figura
2. Nota-se que o micélio das colônias difere para cada espécie, assim como sua
cor, com destaque para o laranja vermelho da cultura de P. sanguineus (Figura
2:D). Também, o sistema hifal das culturas é bem característico para cada
gênero, principalmente pelo tipo de ansa da hifa generativa (Figura 2: E-L). As
informações sobre as características morfológicas das linhagens são pré-
requisitos para identificação molecular da espécie, a qual é de suma importância
principalmente para o conhecimento da diversidade deste grupo de fungos
depositados na coleção. Por outro lado, há muitos desafios a serem superadosna
utilização das técnicas moleculares para a identificação desses fungos. Segundo
Sarwar et al. (2019), há uma escassez de sequências de DNA em bancos de
dados devido à complexidade dos gêneros desse táxon, o que impossibilita a
identificação de alguns macrofungos (Basidiomicetes).

Figura 2: Características macroscópicas e microscópicas das linhagens de macrofungos:

Basidiomycetes (CMINPA, 1841) (A-A' e E-F); Panus sp. (CMINPA, 1870) (B-B' e G-H);

600
Basidiomycetes(CMINPA, 320) (C-C' e I-J); Pycnoporus sanguineus (CMINPA, 1858) (D-D' e K-
L). Barra de escala: E,F,I-L=10 µm; G-H 8 µm.
Todas as 85 linhagens de macrofungos (Basidiomycetes) recuperadas
estão incorporadas na CMIA-INPA, listadas na Tabela 1 nos seus respectivos
táxons e possíveis aplicabilidades biotecnológicas. Observa-se que o número de
linhagens difere para cada táxon. As linhagens com potencial alimentar são as mais
representativas do acervo, dentre estas destacam se as das especies de Lentinula
raphanica (Murrill) J.L, Pleurotus djamor (Rumph. ex Fr.) Boedijn, P. ostreatus
(Jacq. Fr.) Kummer, Lentinus edodes (Berk.) Pegler, Lentinus crinitus (L.) Fr., os
quais possuem um grande potencial alimentar por apresentarem bons valores
nutricionais com altos teores de proteínas, fibras, mineraise baixas quantidades
de lipídeos podendo ser incorporados à alimentação humana e animal (Timm
2018), como também se destacam por suas inúmeras aplicabilidades
biotecnológicas, citadas na Tabela 1, agregando um valor socioeconômico à
estas espécies. Além dessas, outras que causam podridão branca, como as
espécies Coriolopsis sp., Pycnoporus sanguineus, Trametes modesta, T.
versicolor e Trametes spp. também são de ampla aplicação biotecnológica
(Alonso et al. 2007; Silva 2022). Dentre as culturas, as pertencentes ao gênero
Trametes são eficientes produtores de lacase e as do gênero Gloeophyllum são
empregadas em testes de durabilidade natural de madeira (Alves 2010; Costa et
al. 2011).

601
Tabela 1. Distribuição das 85 linhagens nos diferentes taxons de macrofungos (Basidiomycetes)
depositadas na Coleção Microbiológica - INPA e suas respectivas aplicabilidades
biotecnológicas.
Taxa N° de linhagem Possível Aplicabilidade Referências
Potencial medicial Miao et al. (2020)
Auricularia sp. CMINPA 1508 Potencial alimentar Timm (2018)
Atividade antibacteriana Moussa et al. (2022)
Potencial alimentar Riquelme et al. (2019)
Boletus sp. CMINPA 1232 Atividade antibacteriana Moussa et al. (2022)
Potencial medicinal Bisanção et al. (2022)

Coriolopsis spp. CMINPA 1688,192 Processo de biorremediação

Agrawal et al. (2021)
Atividade antibacteriana Santos (2017)
Favolus sp. CMINPA 1553
Potencial alimentar Gamboa-Trujillo et al. (2019)
Nanotecnologia Zawadzka et al. (2021)
Gloeophyllum striatum (Sw.) Murrill CMINPA 470 Biodegradação da madeira Costa et al. (2011)
Produção de enzimas Carvalho (2005)

Grifola frondosa (Dicks.) Gray CMINPA 1621 Potencial medicinal

Bisanção et al. (2022)
Atividade antibacteriana Aguiar et al. (2018)
CMINPA 1618, 405,
Lentinula edodes (Berk.) Pegler Potencial medicinal Zhou et al. (2009)
546, 1618
Potencial alimentar Timm (2018)
CMINPA 1702,
Lentinula raphanica (Murrill) J.L. Mata R.H.
1704 1810, 1826, Potencial alimentar Sanuma et al. (2016)
Petersen
1818, 1841, 1842
Produção de enzimas Magalhães et al. (2019)
CMINPA 1533,
Lentinus crinitus (L.) Fr. Atividade antibacteriana Moussa et al. (2022)
1864
Potencial alimentar Sanuma et al. (2016)
Biocatalizador Barros-Filho et al. (2009)
Lentinus strigellus Berk CMINPA 1464
Potencial medicinal Cota et al. (2008)
CMINPA 1855,
1856, 1925, 1926,
Lentinus spp. Potencial alimentar
1955, 1956, 1923,
1924 Timm (2018)
Potencial medicinal Khatua et al. (2017)
Macrocybe sp. CMINPA 1231 Atividade antibacteriana Gaur e Rao (2017)
Produção de alimentos Inyod et al. (2022)

Panellus sp. CMINPA 1647 Potencial medicinal

Inoue et al. (2013)

Panus lecomtei (Fr.) Corner CMINPA 1671 Produção de enzimas

Peláez et al. (2016)
Potencial alimentar Sanuma et al. (2016)
Panus strigellus (Berk) Overh. CMINPA 1531
Produção de enzimas Cardoso et al. (2018)
CMINPA 1556,
Panus spp. Potencial alimentar
1622, 1870 Sanuma et al. (2016)
CMINPA 1706,
Phellinus spp. Atividade antibacteriana
1937, 1938 Moussa et al. (2022)
Potencial medicinal Acharya et al. (2017)
Pleurotus djamor (Rumph. ex Fr.) Boedijn CMINPA 1963
Potencial alimentar Jesus et al. (2011)
Pleurotus eryngii (DC.) Quél CMINPA 1619 Potencial medicinal
Ma et al. (2014)602
Potencial medicinal Bisanção et al. (2022)
CMINPA 474, 542, Atividade antibacteriana Moussa et al. (2022)
Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kummer
544, 1620 Biorremediação Chun et al. (2019)
 CMINPA 1556,
Panus spp. Potencial alimentar Sanuma et al. (2016)
1622, 1870
CMINPA 1706,
Phellinus spp. Atividade antibacteriana
1937, 1938 Moussa et al. (2022)
Potencial medicinal Acharya et al. (2017)
Pleurotus djamor (Rumph. ex Fr.) Boedijn CMINPA 1963
Potencial alimentar Jesus et al. (2011)
Pleurotus eryngii (DC.) Quél CMINPA 1619 Potencial medicinal Ma et al. (2014)
Potencial medicinal Bisanção et al. (2022)
CMINPA 474, 542, Atividade antibacteriana Moussa et al. (2022)
Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kummer
544, 1620 Biorremediação Chun et al. (2019)
Potencial alimentar Jesus et al. (2011)
CMINPA 1682, Potencial alimentar Timm (2018)
Pleurotus spp.
1735 Produção de enzimas Araújo et al. (2021)

CMINPA 682,1709, Atividade antibacteriana

Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill Vanderlinde e Onofre (2010)
1858, 1551
Produção de enzimas Souza et al. (2008)
Atividade antibacteriana Moussa et al. (2022)
CMINPA 1644,
Schizophyllum commune Fr. Potencial medicinal Zhang et al. (2013)
1720, 1871
Potencial alimentar Timm (2018)
CMINPA 1692,
Trametes elegans (Spreng.) Fr. Atividade antibacteriana Moussa et al. (2022)
1698, 1699
Produção de materiais Bartolome et al. (2020)
Trametes modesta (Kunze ex Fr.) Ryvarden CMINPA 1737
Produção de enzimas Li et al. (2016)
Atividade antibacteriana e
Yamaç e Bilgili (2006)
CMINPA 406, 695, antifúngica
Trametes versicolor (L.) Lloyd
1964 Biodegradação da madeira Costa et al. (2011)
Potencial medicinal Habtemariam et al. (2020)
CMINPA 1686,
Produção de enzimas Souza et al. (2008)
1857, 1873, 1668,
Trametes spp.
1681, 1689, 1695,
Biossorvente
1850, 1552 Araújo et al. (2015)

Tyromyces sp. CMINPA 1557 Atividade antibacteriana

Santos (2017)
CMINPA 1630,
Agaricales Underw. 1713,1715, 1846, -
1862 -
CMINPA 347, 1741,
1869, 320, 1210,
Basidiomycetes -
1685, 1694, 1721,
1733, 1851 -
Total 85 - -

Conclusões
Das 123 linhagens de macrofungos submetidas à reativação cultural,
somente 85 foram recuperadas e estão preservadas nos métodos de repique
contínuo, óleo mineral e água destilada esterilizada.

Agradecimentos

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazona - FAPEAM

pelo apoio financeiro por meio do projeto Coleção Microbiológica.
603
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Obtenção de cultivo monospórico de fungos mitospóricos

Aspergillus e Paecilomyces depositados na Coleção
Microbiológicado INPA

Ferreira, Suzana Mineiro1; Silva, Isabelly Guimarães1; Jesus, Maria Aparecida

de1

1Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia.
Email: [email protected], [email protected]

Resumo
A manutenção de microrganismos em coleção requer métodos que garantam a
purezadas linhagens, para isso o cultivo monospórico tem sido bastante aplicado
como um meio de garantir a estabilidade morfológica das espécies, visando
manter suas características genéticas e fenotípicas, mesmo após repiques
sucessivos e armazenamento por longo período. Com base nisso, o objetivo deste
trabalho foi obter culturas monospóricas para a manutenção da coleção
microbiológica e posterior identificação molecular das linhagens dos gêneros
Aspergillus e Paecilomyces. A reativação das amostras foi feita a partir daquelas
conservadas no método de repiquescontínuos, em baixa temperatura, as quais
foram inoculadas em placas de Petri com meio de cultura BDA, sendo mantidas
em estufa durante 4 a 5 dias. Em seguida, um fragmento da colônia foi retirado
e transferido para microtubos contendo 1,5 mL de água esterilizada, os quais
foram agitados por inversão para a suspensão conidial, seguido de diluição
seriada até a 10-6. Alíquotas de 85 µL da menor concentração deconídios foi
semeada em placa com meio BDA com auxílio de dois grânulos de sílica-gel (4-
8 mm), sendo posteriormente incubadas a 26 ºC. Sob microscópio
estereoscópio, um dos conídios germinados isoladamente foi coletado com
estilete etransferido para placas contendo meio BDA, as quais foram incubadas
até o crescimento total da colônia. Um total de 122 culturas monospóricas foi
obtido, sendo47 de linhagens de Aspergillus e 75 de Paecilomyces. Todas as
linhagens de origem monospórica foram preservadas em duplicatas no método de
repique contínuo, e água destilada esterilizada, ambos em baixa temperatura.

Palavras-Chave: Aspergillus; Paecilomyces; Monoconidial

Introdução
Caracterizados principalmente pelo seu modo de vida assexual, os fungos
mitospóricos utilizam a produção de conidióforos e conídios para se propagarem
(Kendrick 2000). Dentre seus representantes estão os gêneros Aspergillus P.
Micheliex Haller e Paecilomyces Bainier (Aspergillaceae, Ascomycota), os quais

609
possuem potenciais ecológicos, patológicos e biotecnológicos, tornando
indispensável a manutenção destes microrganismos em condições ex situ
(Abreu e Tutunji 2004; Wijayawardene et al. 2020).
Na Coleção de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural do INPA
estão depositadas 129 culturas de Aspergillus e 151 de Paecilomyces. São
isolados de vários substratos de diferentes locais do bioma amazônico. Com o
intuito de garantir a estabilidade morfológica e genética destas cepas, e visando
meios eficientes para a manutenção das mesmas, algumas técnicas vêm sendo
aplicadas, entre elas a obtenção de cultura monoconidial, que consiste em obter
cultura fúngica de um único conídio a partir de diluições seriadas (Santos-
Ebinuma et al. 2013; Henao-Henao et al. 2018).
Os isolados de origem monospórica são essenciais para garantir a
uniformidade morfológica e genética das linhagens, uma vez que culturas
multiespóricas podem perder suas características morfológicas quando
submetidos à sucessivos repiques, causando um aumento na variabilidade
genética devido a mecanismos de recombinação gênica promovidas pelo
intercâmbio de genes entre conídios ou anastomose de hifas (Roca et al. 2005;
Castro-Prado et al. 2007; Santos-Ebinuma et al. 2013; Silva et al. 2019). A técnica
de cultivo monospórico também pode ser empregada para purificação de fungos
mitospóricos (Souza et al. 2019).
Este trabalho teve por objetivo estabelecer um método simples e prático
para a produção de culturas monospóricas de fungos mitospóricos, que é um
pré-requisito essencial para identificação molecular de fungos, além de manter
resguardada a qualidade cultural dos acervos fúngicos em condições ex situ.

Material e Métodos
O experimento foi realizado no Laboratório Patologia da Madeira do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, com as linhagens que
apresentavam divergências taxonômicas dos gêneros Aspergillus e
Paecilomyces depositados na Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural, visando a identificação molecular das espécies ou mesmo de
outros gêneros afins. Os fungos filamentosos preservados no método de repique
contínuo, em baixa temperatura (26 ºC), foram cultivados entre quatro e cinco
dias em placas de Petri com meio BDA para reativação, e, em seguida, um

610
fragmento da colônia foi colocado em um microtubo de centrifugação (2 mL),
contendo 1,5 ml de água destilada esterilizada para a suspensão conidial, a qual
foi agitada por inversão e posteriormente diluída.

Diluição seriada e cultivo monospórico

A diluição em série foi feita a partir da solução mais concentrada (Figura
1:A). Desta, um volume de 100 µL foi acrescido em microtubos com capacidade
de 1,5 mL,contendo 900 µL de água destilada esterilizada, até a 10-6 série. Em
seguida, uma alíquota de 85 µL da solução mais diluída (Figura 1:B), foi semeada
levemente com oauxílio de dois grânulos de sílica-gel (4-8 mm) (esterilizada)
sobre o meio de cultivo para distribuir a solução em todo o meio na placa de Petri
através do rolamento manualdas sílicas (Figura 1:C). As placas foram incubadas
a 26 ºC e após 24 horas, os conídios germinativos foram observados sob
microscópio estereoscópico (100x). Um único conídio isolado foi transferido para
o centro de placa de Petri (20 x 10 mm), contendo BDA, e incubada a 26 ºC até o
crescimento total em toda superfície da placa.

Figura 1. Ilustração das etapas de diluição seriada e semeadura da suspensão conidial em

meio decultivo. A= solução mais concentrada; B= solução mais diluída; C= semeadura.

611
 As características macro e micro morfológicas das colônias monospóricas
dosfungos foram analisadas e comparadas com as fotos das culturas de cultivo
multiespórico, armazenadas no banco de imagem da Coleção de
Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural do INPA, visando verificar se
houve alteração nas características culturais da linhagem.

Padronização de inóculos e preservação

Um total de 6 inóculos miceliais (6 mm de diâmetro) foi retirado da cultura
monospórica com o auxílio de uma ponteira invertida, e transferidos para uma
placa de Petri (55 x 15 mm) que foi mantida a 26 °C, até o crescimento completo
do fungo.Os inóculos foram conservados em dois métodos de preservação: água
destilada esterilizada e repique contínuo, ambos em baixa temperatura.
Para a preservação em água destilada esterilizada dois inóculos foram
colocados em 1,5 mL de água destilada esterilizada, contidos em microtubos do
tipo eppendorf (2 mL). Após isso, os microtubos foram depositados em duplicata,
emantidos em refrigerador (5 a 8°C). Outro inóculo foi utilizado para preservação
em repiques contínuos, o qual foi colocado em tubo de ensaio (15 × 150 mm)
contendo meio BDA inclinado, e mantidos em estufa a 26 °C durante 4 dias. Após
o crescimento, sem qualquer contaminação, os tubos com as colônias foram
depositados em duplicata e mantidos em baixa temperatura (5 a 8°C). Todos os
fungos conservados tanto em água destilada esterilizada, como em repique
contínuo, foram depositados na Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do INPA.

Resultados e Discussão
Um total de 122 culturas monospóricas foram obtidos a partir das
linhagens de Aspergillus (47) e Paecilomyces (75), e preservadas em duplicata
nos métodos de preservação em repique contínuo e água destilada estéril.
A técnica de cultivo monospórico das linhagens de Aspergillus e
Paecilomyces empregada neste estudo com modificação, é semelhante à
descrita em Henao-Henao et al. (2018), os quais utilizaram as mesmas diluições
seriadas, como também aplicaram este método como pré-requisito para
identificação molecular de fungos mitospóricos.

612
 Atualmente, após a seleção de 86 linhagens monospóricas da CMIA-
INPA, distribuídas entre Aspergillus e Paecilomyces, e posterior análise
preliminar das sequências nucleotídicas, 45 amostras foram identificadas a nível
de espécie (dados ainda não publicados). As demais sequências estão em
processo de identificação, sendo necessárias mais análises de outras regiões
específicas do DNA. Esses dados ressaltam a importância da obtenção de
culturas monospóricas com intuito de garantira pureza genética das linhagens.
Este estudo contribui na disponibilização de material para consulta
referente a obtenção de cultivos monospóricos, principalmente para fins de
identificação molecular de diferentes táxons. Ressalta-se que os trabalhos
realizados com enfoque na metodologia do cultivo monospórico são mais
relacionadas a fungos fitopatogênicos (Fracchia et al. 2001; Basílio et al. 2007;
Serra et al. 2008; Paula et al. 2014). Salientamos que para garantir a
confiabilidade e autenticidade das cepas depositadas em coleções
microbiológicas, é fundamental aplicar estratégias que certifiquem a pureza dos
isolados fúngicos, o que é possível através da obtenção de linhagens
monospóricas (Cañedo e Ames 2004).

Figura 2. Culturas monospóricas, macrocultivo e conidióforos de Paecilomyces (CMINPA

1334) e Aspergillus (CMINPA 1612). Paecilomyces: A= cultivo monospórico, B= macrocultivo
multiespórico emmeio MEA com 7 dias de incubação, F= Conidióforo; Aspergillus: C= cultivo
monospórico, D= macrocultivo multiespórico em meio MEA com 7 dias de incubação, E=
Conidióforo. Barra de escala =10 µm.

613
 Conclusões
A obtenção de 122 cultivos monospóricos distribuídos entre Aspergillus e
Paecilomyces tem relevância para a manutenção da Coleção Microbiológica-
INPA, e posterior identificação molecular das linhagens, viabilizando o acesso
das culturas para estudos de aplicação biotecnológica.

Agradecimentos
Ao Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovações - MCTI, pela bolsa de
apoio técnico concedida à Suzana Mineiro Ferreira e à Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado do Amazona - FAPEAM, pela bolsa de apoio técnico
concedida à Isabelly Guimarães Silva e pelo fomento da Fapeam para o projeto
Coleção Microbiológica deInteresse Agrossilvicultural do INPA.

Referências
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615
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Ocorrência de macrofungos corticióides (Basidiomycetes,

Corticiaceae) na Região Amazônica

Pereira, William Wallace da Silva1; Sousa, Sabrina Sinara Portela de2; Costa,
Flavio Fabian3; Jesus, Maria Aparecida de1

1Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 2Universidade Federal de Pernambuco,

3
Universidade Federal do Amazonas.
Email: [email protected]; [email protected]

Resumo
Os macrofungos não poroides são aqueles caracterizados por basidioma
ressupinado e ausência de poros. Dentre as famílias que fazem parte deste
grupo, destaca-se a Corticeaceae (Basidiomycetes) pelas suas características
macroscópicas distintas, como a cor e forma da superfície do basidioma e por
características microscópicas singulares a essa família. A distribuição de
Corticiaceae é cosmopolita, porém poucas são as espécies citadas para o Brasil.
O trabalho proposto tem como objetivo de identificar o acervo de macrofungos
(Corticiaceae) da Coleção de Fungos Lignoceluliticos-INPA, com a finalidade de
contribuir com futuros estudos taxonômicos destes macrofungos nas diferentes
áreas da região amazônica, e assim conhecer sua diversidade e distribuição na
região. Para a identificação foram observadas as características macroscópicas
tais como: cor, textura e forma do basidioma, e características microscópicas
analisadas a partir de cortes ou raspagens feitos á mão livre do basidioma em
KOH3%, com o auxílio de chaves dicotômicas específicas para a família, além
dos sites que disponibilizam as descrições das espécies, como mycobank e
indexfungorum, visando a confirmação da espécie. Foram identificados 38
espécimes, distribuídos em 7 genêros e 14 espécies. A espécie de maior
representatividade foi Phanerochaete sordida e dentre os gêneros, Trechispora
está representado com maior número de espécies. O substrato de maior
preferência dos macrofungos foram galhos caídos. O estudo contribuiu para o
conhecimento da ocorrência de 14 espécies de macrofungos corticioides no
Brasil. Destas, destacam se Aleurodiscus fennicus, Peniophora violaceolivida,
Phanerochaete calotricha, Phlebia lilascens, e Trechispora invisitata, como
primeiro registro para o Brasil: Gloeocystidiellum convolvens, G. ochraceum, P.
cinerea, P. sordida, Phlebiopsis gigantea, P. roumeguerii, T. cohaerens, T.
farinacea e T. mollusca com novos registrospara o Brasil.

Palavras-Chave: Amazônia; Biodiversidade; Corticiaceae.

616
 Introdução
A família Corticiaceae foi proposta pelo micologista alemão Wilhelm
Gustav Franz Herter em 1910, pelas características dos corpos de frutificação
ressupinados, himenóforo liso, isto é não poróide. Esses fungos por muito tempo
foram agrupados em Thelephoracea (Fries 1821), um grupo artificial cuja
classificação se baseava em características macromorfológicas e
micromorfológicas (Greslebin 2001).
Corticiaceae foi classificada com base, principalmente nas características
macroscópicas, caracterizada pelo basidioma ressupinado, ou seja,
completamente aderente ao substrato, apresentando diversas texturas como
aracnóide, pelicular, felpudo, ceráceo, membranáceo, coriáceo, gelatinoso,
cartilaginoso e cortiço, porém alguns corpos de frutificação são pequenos e finos,
e raramente duros. Em relação aobasidioma, estes podem ser efuso-reflexos,
cupuliformes-discoides e dimidiados aestipitados, sendo pouco visíveis a olho
nu. Possuem uma coloração normalmente, cinza, amarelo, creme e em alguns a
tonalidade varia entre vermelho, verde e azul, sendo a cor uma característica
essencial distintiva entre os macrofungos desta família (Hjortstam et al. 1987;
Jung 1987).
Os macrofungos (Corticiaceae) são causadores de danos em árvores
vivas, favorecendo o avanço da deterioração e, consequentemente, o ataque de
outros organismos que podem levar a morte da árvore, mas além da degradação
da madeira, os fungos da família Corticiaceae, também podem ser patogênos,
micoparasitas, nematófagas e micorrizicos (Greslebin 2001; Brazolin 2010).
A grande maioria das espécies de fungos corticioides é descrita para o
continente europeu em uma série de livros escritos por Eriksson e Ryvarden
(1975), Eriksson e Ryvarden (1976), Eriksson et al. (1978), Eriksson et al. (1981),
Eriksson et al. (1984) Hjortstam et al. (1987) e Eriksson et al. (1988). Poucas são
as espécies citadas para o Brasil, com ressalva as relatadas por Theiszen (1911),
Hjortstam e Bononi (1986), Jesus (1988), Jesus (1996), Gorjon e Jesus (2012).
O objetivo desse trabalho foi identificar o acervo de macrofungos
(Corticiaceae) da Coleção de Fungos Lignoceluliticos- INPA.

617
 Material e Métodos
Os macrofungos da família Corticiaceae são provenientes de coletas
realizadas no Museu da Amazônia (MUSA) (10) espécimes, Estação
Experimental de SilviculturaTropical (ZF-II) (8), Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia (INPA) - Campos I (5), Bosque da Ciência (INPA) (5), no Setor Sul
da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) (5) e ruas de avenidas (5) no
Estado do Amazonas.
As coletas foram realizadas com o auxílio de um instrumento cortante
(faca), para remover os fungos aderidos ao substrato, tais como, árvores vivas,
árvores mortas, galhos caídos e troncos caídos. Cada amostra dos macrofungos
foi colocada dentro de saco de papel Kraft, em seguida foi montada a exsicata
com o número de registro eanotadas as informações do local de coleta, tipo de
substrato (data de coleta e coletor). A identificação taxonômica foi realizada
com base na observação e mensuração de estruturas microscópicas como hifas
(generativas, esqueléticas ou de conexão); elementos estéreis (cistídio); e
estruturas reprodutivas (basídio e basidiósporo), observadas com o auxílio de
um microscópio óptico trinocular (Leica DM2500).
A classificação das espécies de Corticiaceae foi baseada nas descrições
de Eriksson e Ryvarden (1975), Hallenberg e Eriksson (1985), Hjortstam et al.
(1987), dentre outras, além dos sites que disponibilizam as descrições das
espécies (http://www.mycobank.org) e (http://www.indexfungorum.org/), visando
a confirmação da espécie.

Resultados e Discussão
Um total de 38 espécimes de Corticiaceae foi estudado, as espécies estão
listadas na Tabela 1. Phanerochaete sordida está representado com 11
exemplares. Dentre os gêneros, Trechispora está representado com maior
número de espécies, são elas: Trechispora cohaerens, T. farinacea, T. invisitata
e T. mollusca.
Um total de 10 espécimes é proveniente do Campus do Instituto Nacional
de Pesquisas da Amâzonia, 10 do Museu da Amazônia (MUSA) e 8 da Estação
Experimental de Silvicultura Tropical (ZF-II). Os espécimes dos macrofungos
foram coletados nos substratos: árvores vivas (8), árvores mortas (1), galhos

618
caídos (19) e troncos caídos (10), apresentando preferência por galhos caídos
(19) e troncos caídos (10), conforme a Tabela 1.
Tabela 1: Relação de espécies de Corticiaceae da região Amazônica, distribuídas em
diferentes substratos: Legenda: AM - árvore morta; AV - árvore viva; GC - Galho caído; TC -
Trono caído. AU - Área Urbana; ZF-II - Estação Experimental de Silvicultura Florestal ZF-II -
INPA.
Local de Substrato
Taxon Total
coletas A.V A.M G.C T.C
Aleurodiscus fennicus Laur. INPA 1 1
Aleurodiscus spp. INPA, AU 1 3 2 6
Gloeocystidiellum convolvens (P. Karst.) Donk ZF 1 1
G. ochraceum (Fr.) Donk AU 1 1
Peniophora cinera (Pers.) Cooke AU 1 1 1 3
P.violaceolivida (Sommerf.)Massee AU, INPA 2 2
Phanerochaete calotricha (P.Karst.) J.Erikss. &
ZF-II, INPA 2 2
Ryvarden
MUSA, ZF,
P. sordida (P. Karst.) J. Erikss. & Ryvarden 1 6 4 11
AU, INPA
Phlebia lilascens (Bourdot) J. Erikss. &
ZF-II 1 1
Hjortstam
Phlebiopsis gigantea (Fr.) Donk ZF-II 1 1
P. roumeguerii (Bres.) Jülich e Stalpers MUSA 1 1 2
Trechispora cohaerens (Schwein.) Jülich &
MUSA 2 2
Stalpers
T. farinacea (Pers.) Liberta AU 1 1
T. invisitata (H.S.Jacks.) Liberta ZF 1 1
T. mollusca (Pers.) Liberta INPA 2 1 3
Total 8 1 19 10 38

Descrição das Espécies

Aleurodiscus fennicus Laur., Ann. Bot. Soc. Zool. Bot. Fenn. Vanamo 10 (4):
11 (1939) (Figura 1- M).
Descrição: Eriksson et al. (1973).
Distribuição no Brasil: Primeiro registro no Brasil (Flora do Brasil 2023; Species
Link 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Bosque da Ciência-INPA,
Pereira, W.W.S, 14 de outubro de 2022 (CFL, 14064).
Basidiocarpo: arredondado, muitas vezes confluentes formando manchas
irregulares, com coloração esbranquiçada, textura cerácea, macia, compacta.
Himênio: liso, rachado, cinza claro. Sistema hifal: monomítico com seções
simples, de paredes finas. Pseudocistidio: embutido, flexuoso-cilíndrico a
subclavado, presença de gotula (62 x 8 µm). Basídio: flexuoso-subclavado a
clavado (24-60 x 7- 13 µm), presença de 2 a 4 grandes esterigmas.
Basidiósporo: ovoide a ovoide- elipsoide, liso, de parede fina (13-17 x 8-10
µm), amiloide. Presença de acantofise cilíndrica a subclavada, muito abundante,
619
apicalmente com numerosa protuberância em alguns semelhantes a
dendrohyphidia (Figura 2- G', H e I').
Comentário: Os basídios do material examinado são semelhantes aos descritos
porEriksson et al. (1973), porém alguns basídios são menores 24-60 x 7-13 µm
(vs 60-70 x 10-12 µm), assim como os esporos 13-17 x 8-10 µm (vs 15-8 µm).

Gloeocystidiellum convolvens (P. Karst.) Donk, Fungus 26: 9 (1956) (Figura

1- L). Descrição: Eriksson e Ryvarden (1975).
Distribuição no Brasil: Norte (Roraima) (Specieslink 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical ZF-II, Bastos. V, 17 de dezembro de 2012 (CFL 7506).
Basidiocarpo: ressupinado, efuso, moderadamente grande, inicialmente
adnado, posteriormente destacável, branco a amarelado. Himênio: aveludado
pelo cistídio projetado. Sistema hifal: monomítico, hifa sem grampo de conexão,
não cianófila, várias hifas fortemente incrustadas (ou cistídio) com matérial
cristalino; Cistídio: incrustado numeroso, cônico, (40-50 x 6-10 µm),
primeiramente liso e parede fina, depois incrustada apicalmente com uma
camada de cristal; Gloeocistídio: numeroso,sinuoso, com parede fina, (50-100
x 7-12 µm), preenchido com protoplasma oleoso, granular. Basídio: clavado
estreitamente, (20-25 x 4-5 µm), com 4 esterigmas, sem ansa basal;
Basidiósporo: elipsoide, amiloide (4-5 x 2 µm) (Figura 2- D', E' e F').
Comentário: O espécime analisado apresenta descrições semelhantes as feitas
paraa espécie por Erikson e Ryvarden (1975).

Gloeocystidiellum ochraceum (Fr.) Donk, Fungus 26: 9 (1956) (Figura 1- B).

Descrição: Eriksson e Ryvarden (1975).
Distribuição no Brasil: Sul (Paraná) (Flora do Brasil 2023; Specieslink 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Instituto Federal do Amazonas
(IFAM), Jesus, A.M, 09 de janeiro de 2011 (CFL 7382).
Basidiocarpo: ressupinado, frequentemente apresenta grande dimensão,
adnado, consistência cerácea a princípio, com tempo mais firme e quando seca
consideravelmente dura. Himênio: liso a tuberculado, ocráceo a marrom-ocre.
Sistema hifal: monomítico, hifa de parede fina a grossa, cianofílica, sem grampo
de conexão. Gloeocistídio: parede delgada, com conteúdo oleoso, granular (34-

620
35 x 4-5 µm). Basídio: clavado (16-20 x 4-5 µm), com 4 estigmas e sem grampo
basal. Basidiósporo: subgloboso, parede lisa, amiloide (4-5 x 3 µm) (Figura 2-
C, De E).
Comentário: O espécime examinado é semelhate ao descrito por Eriksson e
Ryvarden (1975), no entanto, o gloeocistídio 34-35 x 4-5 µm (vs 40-60 x 4-5
µm), o basídio 16-20 x 4-5 µm (vs 20-30 x 4-5 µm) e o basidiósporo 4-5 x 3 µm
(vs 4-6 x 3 µm) são menores.

Peniophora cinerea (Pers.) Cooke, Grevillea 8 (45): 20 (1879) (Figura 1- I).

Descrição: Eriksson et al. (1978).
Distribuição no Brasil: Sudeste (São Paulo) e Sul (Paraná, Rio Grande do Sul)
(Florado Brasil 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Mini Campus- UFAM, Pereira,
W.W.S, 30 de agosto de 2022 (CFL, 14008, 14009, 14021).
Basidiocarpo: ressupinado, adnado, ceráceo, coloração de cinza violáceo a
acinzentado. Himênio: levemente rachado, liso ou tuberculada. Sistema hifal:
monomítico, com presença de grampos, de parede fina, hialina, subiculo
geralmente ausente ou presente com uma camada fina, hifa na horizontal,
espessa, densamente unida, com parede acastanhada. Cistídio: incrustado,
cilíndrico ou cônico afinando no ápice agudo ou obtuso, base de parede fina,
depois com parede espessa,pigmentado de marrom na base (20-60 x 5-11 µm).
Basídio: hialino, subcilíndrico, deparedes fina (25-35 x 2-7 µm), presença de 2
a 4 esterigmas, com grampo basal. Basidiósporo: alantoide a subcilíndrico,
lisos, hialino, com parede fina, não amiloide (4-5 x 2-3 µm) (Figura 2- V, W e X).
Comentário: Os cistídios observados são maiores 20-60 x 5-11 µm (vs 20-30 x
5-10µm), enquanto, que os basídios e esporos são menores 25-35 x 2-7 µm (vs
30-40 x 5-6 µm), 4-5 x 2-3 µm (vs 2.5 x 3.5 µm) em relação aos da espécie descrita
por Eriksson et al. (1978).

Peniophora violaceolivida (Sommerf.) Massee, Bot. Journal of the Linnean

Society 25: 152 (1889) (Figura 1- D).
Descrição: Eriksson et al. (1978).
Distribuição no Brasil: Primeiro registro no Brasil (Flora do Brasil 2023; Species
Link2023).

621
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Bosque da Ciência-INPA,
Pereira, W.W.S., 17 de junho de 2022 (CFL 14039); Área urbana, Santos, J.F.B.,
19 de abril de 2014 (CFL 10301).
Basidiocarpo: ressupinado, adnado, acinzentado com variações de tonalidades
de avermelhado ou violáceo, corpos jovens para cinza pálido amarelo.
Himênio: levemente rachado, liso ou as vezes tuberculato. Sistema hifal:
monomítico, com a presença de grampo, parede espessada marron. Hifa
subhimenial com parede fina aespessada, entrelaçada, disposta verticalmente.
Cistídio: de dois tipos a) cistídio encrustado, cônico a subfusiforme, base sendo
de parede fina, hialina, depois com parede espessa, incrustada (17-60 x 5-12
µm), b) sulfocistídio de parede fina, hialina,subclavado a oblongo, preenchido
com protoplasma granular (32-47 x 3-8 µm). Basídio: hialino, de parede fina,
clavado a subclavado (25-50 x 5-10 µm), presença de 2 a 4 esterigmas, com
grampo basal. Basidiósporo: alantoide, liso, hialino, de parede fina (6-8 x 2-4
µm) (Figura 2- H., I. e J.).
Comentário: Os basidiocarpos dos fungos examinados apresentam cistídios
encrustados maiores 17-60 x 5-12 µm (vs 15-25 x 6-9 µm), assim como os
basídios 25-50 x 5-10 µm (vs 30-40 x 5-6 µm) com relação aos citados por Erikson
et al. (1978).

Phanerochaete calotricha (P. Karst.) J. Erikss. L Ryvarden, Cortic. N. Eur.

(Oslo) 5:997 (1978) (Figura 1- F).
Descrição: Eriksson et al. (1978).
Distribuição no Brasil: Primeiro registro no Brasil (Flora do Brasil 2023;
Specieslink2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical ZF, Bastos. V, 26 de junho de 2013 (CFL 12924); Instituto
Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) Campus I, Couceiro, D. M., 07 de
julho de2014 (CFL 10203).
Basidiocarpo: ressupinado, efuso, membranáceo. Himênio: liso, de margem
esbranquiçada a amarela ou ocrácea, com rizomorfo notável. Sistema hifal:
monomítico, hifa simples septada, não incrustada. Cistídio: numeroso, cilíndrico
com uma parte distal mais estreita, terminando em um ápice obtuso a obtuso
estreito, (52-65 x 5-6 µm), projetando (23-29 µm), parede fina, sem incrustação,

622
sem grampo basal.Basídio: (20-28 x 4-5 µm), com 4 esterigmas e um septo
basal simples. Basidiósporo: estreitamente elipsoide, (4-5 x 2 µm), liso, parede
fina, e não amiloide(Figura 2- N, O e P).
Comentário: Os cistídios são menores 52-65 µm (vs 40-70 µm), assim como, os
basídios 20-28 µm (vs 25-30 µm) em relação aos descritos por Erikson et al.
(1978).

Phanerochaete sordida (P. Karst.) J. Erikss. & Ryvarden, Cortic. N. Eur. (Oslo)
5: 1023 (1978) (Figura 1- K).
Descrição: Eriksson et al. (1978).
Distribuição no Brasil: Norte (Roraima, Amazonas), Sudeste (São Paulo) e Sul
(Paraná, Rio Grande do Sul) (Species Link 2023; Flora do Brasil 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Museu da Amazônia (MUSA),
Couceiro, D.M/Cruz, K.S (CFL 12884), 05 de maio de 2016 (CFL 12883), 27 de
abril de 2016 (CFL 12885), 27 de abril de 2016 (CFL 12892), 16 de fevereiro de
2016 (CFL12923); Estação Experimental de Silvicultura Tropical ZF, Bastos, B,
25 de junho de2013 (CFL 12922); Jesus, M.A, 13 de abril de 2014 (CFL 10350);
Couceiro, D.M, 12 de fevereiro de 2016 (CFL 10678). Bosque da Ciência-INPA,
Pereira, W.W.S, 24 de agosto de 2022 (CFL14024,14026); Mini Campus- UFAM,
Pereira, W.W.S, 30 de agosto de 2022 (CFL 14013).
Basidiocarpo: ressupinado, adnado, membranáceo a crustáceo, inicialmente
esbranquiçado, e depois tornando se creme. Himênio: rachado, liso. Sistema
hifal: monomítico, subiculo com textura espaçada, hifa subicular, parede
espessa, ramificada, hialina, com septação simples e sem a presença de
grampo. Hifa subhimenial com parede fina, textura densa, hialina, lisa ou
incrustada com grânulo hialino, ramificada,com septação simples. Cistídio: com
diferentes formatos, geralmente cilíndrico afinando para o ápice agudo ou obtuso
(55-75 x 5-15 µm), parede fina sendo espessana base, totalmente incrustado.
Basídio: hialino, clavado, com parede fina (15-21 x 5µm), presença de 2 a 4
esterigma, sem grampo. Basidiósporo: elipsoide, liso, hialino, com parede
fina, não amiloide (4-6 x 3-4 µm) (Figura 2- A', B' e C').
Comentário: Os fungos examinados apresentam os basídios e esporos menores
15-21 x 5 µm (vs 25-30 x 4-5 µm), 4-6 x 3-4 µm (vs 5-7 x 2.5-3 µm) em relação
aos descritos em Eriksson et al. (1978).

623
Phlebia lilascens (Bourdot) J. Erikss. & Hjortstam, The Corticiaceae of North
Europe6: 1123 (1981) (Figura 1- C).
Descrição: Eriksson et al. (1981).
Distribuição no Brasil: Primeiro registro no Brasil (Flora do Brasil 2023;
Specieslink2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical - ZF, Jesus, M.A, 17 de dezembro de 2012 (CFL 12968).
Basidiocarpo: efuso-reflexo, ceráceo quando fresco e crustáceo quando seco.
Himênio: suave para tubercular, de cor variável dependendo do teor de água e
do estado de crescimento, amarelado, pálido ocráceo a marrom. Sistema hifal:
monomítico, hifa hialina, parede fina, entrelaçada em uma matriz gelatinosa
densa. Cistídio: ausente. Basídio: clavado estreitamente, (23-28 X 4-5 µm),
parede fina, com 4 estigmas e um grampo basal. Basidiósporo: estreitamente
elipsóide (3-5x 1-2 µm), liso, parede fina (Figura 2- F e G).
Comentário: O espécime analisado apresenta as descrições semelhantes as
feitas para a espécie de Eriksson et al. (1981).

Phlebiopsis gigantea (Fr.) Jülich, Persoonia 10 (1): 137 (1978) (Figura 1- E).
Descrição: Eriksson et al. (1981).
Distribuição no Brasil: Norte (Amazonas), Sul (Rio Grande do Sul), Sudoeste
(São Paulo) (Specieslink 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical ZF-II, Jesus, M. A, 14 de março de 2013 (CFL 12398).
Basidiocarpo: ressupinado, adnado, espesso. Himênio: liso, minuciosamente
aveludado, branco acinzentado a lustroso. Sistema Hifal: monomítico, septado
simples, parede fina a levemente espessa no subículo. Cistídio: cônico de (50-
80 x 10-13 µm), parede espessa, fortemente incrustado com grandes cristais na
parte apical, projetando-se até 40 µm além da superfície himenial. Basídio:
estreitamente clavado para sub-cilíndrico, (25-30 x 4-5 µm), com 4 esterigmas e
septo simples na base. Basidiósporo: são estreitamente elipsoides, achatado
adaxialmente, (3-7 x 2-3 µm), liso, de parede fina, não amiloide (Figura 2- K, L
e M).

624
Comentário: O fungo examinado apresenta o cistídio menor 50-80 x 10-13 µm
(vs 60-90 x 10-20 µm) e os basídios maiores 25-30 x 4-5 µm (vs 16-22 x 4-5 µm)
em relação as descrições de Eriksson et al. (1981).

Phlebiopsis roumeguerii (Bres.) Jülich e Stalpers (1980) (Figura 1- G).

Descrição: Eriksson et al. (1981).
Distribuição no Brasil: Sul (Rio Grande do Sul) (Specieslink 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical ZF-II, Jesus, M. A, 14 de março de 2013 (CFL 12888); Área
urbana, Bastos, V., 08 de março de 2015 (CFL 14086).
Basidiocarpo: ressupinado, intimamente adnado, efuso. Himênio: pálido
esbranquiçado, ou acinzentado, no corpo de frutificação velho densamente
rachado, margem determinada, não fimbriada. Sistema hifal: monomítico, com
parede fina naparte himenial, caso não, a parede é mais espessa e densamente
entrelaçada, com asistema hifal vertical. Cistídio: numeroso, cônico, (50-90 x
10-15 µm), incrustado na parte apical que também é preenchido por uma
matérial cristalino, com a parte basal ausente de incrustações. Basídio: dilatado
apicalmente, sem a presença de grampo basal, com 4 esterigmas(15-20 x 5 µm).
Basidiósporo: oblongo estreitamente elipsoide (5-7 x 3 µm), liso, com parede
fina, não amiloide e não cianófilo (Figura 2- Q, R e S).
Comentário: A coloração do basidioma examinado é diferente da descrita por
Eriksson et al. (1981), com a coloração marrom claro e o seu himênio tuberculato.
Assim como o basídio foi menor 15-20 x 5 µm (vs 18- 30 x 4-5 µm) e o esporo
maior 5-7 x 3 µm (vs 4-6 x 2-3 µm).

Trechispora cohaerens (Schwein.) Jülich & Stalpers, Verhandelingen

Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Afdeling Natuurkunde
74: 257 (1980) (Figura 1- J).
Descrição: Eriksson et al. (1988).
Distribuição no Brasil: Sudeste (São Paulo) (Specieslink 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Museu da Amazônia (MUSA),
Couceiro, D.M/Cruz, K.S, 05 de maio de 2016 (CFL 12902), (CFL 10258).
Basidiocarpo: ressupinado, efuso, branco para ocre. Himênio: liso a granular e
mais ou menos poroso, esbranquiçado a ocráceo, margem fibilosa. Sistema

625
hifal: monomítico, liso, nodoso-septado, de parede fina a grossa geralmente
ampuliforme nos septos; Cistídio: ausente. Basídio: cilíndrico, ligeiramente
contraído, (17-20 x 5-7µm), com grampo basal, e 4 esterigmas. Basidiósporo:
são subgloboso para elipsoide, (3-4 x 2-4 µm), liso, de parede ligeiramente
espessa, não amiloide (Figura 2- Y e Z).
Comentário: Os basídios observados são maiores 17-20 x 5-7 µm (vs 9-17 x 3-5
µm),comparados com os descritos por Eriksson et al. (1988).

Trechispora farinacea (Pers.) Liberta, Taxon 15: 318 (1966) (Figura 1- H).
Descrição: Eriksson et al. (1988).
Distribuição no Brasil: Norte (Roraima, Amazonas, Pará), Nordeste
(Pernambuco), Sudoeste (São Paulo) e Sul (Rio Grande do Sul, Paraná)
(Specieslink 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Área urbana, Jesus, M.A, 25
de fevereiro de 2014 (CFL 12976).
Basidiocarpo: ressupinado, efuso, frágil, fino a moderadamente espesso.
Himênio: liso a granulado, poroso, esbranquiçado a ocráceo, presença de
cordões. Sistema hifal: monomítico, hifa subicular, de parede fina, reta, com
septo ampuliforme, hifa subhimenial mais ampla, ramificação rica, com grampo
de conexão em todos os septos. Basídio: cilíndrico, geralmente de cintura ou
sinuoso, (9-17 x 2-5 µm), com 4 esterigmas e um grampo basal. Basidiósporo:
subgloboso para elíptico, densamente verrucoso, com a verruga uniformemente
espalhadas ao redor do esporo, (2-4 x 2-3 µm), e parede levemente espessa
(Figura 2- T e U).
Comentário: Os basídios observados são maiores 9-17 x 2-5 µm (vs 11-14 x 4-5
µm),comparados com os descritos por Eriksson et al. (1988).

Trechispora invisitata (H.S. Jacks.) Liberta, Taxon 15: 318 (1966) (Figura 1-
N). Descrição: Eriksson et al. (1988).
Distribuição no Brasil: Primeiro registro no Brasil (Flora do Brasil 2023;
Mycobank 2020; Specieslink 2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Estação Experimental de
Silvicultura Tropical ZF, Jesus, M. A, 25 de abril de 2014 (CFL 12975).
Basidiocarpo: ressupinado, efuso, muito fino a moderadamente espesso,

626
farináceo. Himênio: branco acinzentado a amarelado, margem branca,
aracnoide, frequentemente fibrilosa e com cordões que se estendem pelo
subículo e além da margem. Sistema hifal: dimítico, hifa esquelética raramente
ramificada, com muito pouco septo, hifa subicular de parede fina, às vezes
provida de cristal em forma de agulha, hifa subminial de parede fina, célula
pequena, ramificação rica, geralmente inflada ou triangular na aparência.
Basídio: cilíndrico, de cintura leve,(7-13 x 3-5µm), com 4 estigmas com ansa.
Basidiósporo: subgloboso, densamente verrugoso com pouca verruga na
região apical (3-4 x 2-4 µm) (Figura 2- J', K' e L'). Comentário: Os esporos
observados são menores 3-4 x 2-4 µm (vs 4-5 x 3-4 µm). Assim como os basídios
7-13 x 3-5 µm (vs 10-13 x 4-5 µm) comparados com os descritos por Eriksson et
al. (1988).

Trechispora mollusca (Pers.) Liberta, Canadian Journal of Botany 51 (10): 1878

(1974) (Figura 1- A).
Descrição: Eriksson et al. (1988).
Distribuição no Brasil: Norte (Acre) e Sul (Paraná, Rio Grande do Sul)
(Specieslink2023).
Material examinado: Brasil, Amazonas, Manaus: Instituto Nacional de Pesquisa
da Amazônia (INPA) Campus I, Bastos, V., 20 de julho de 2012 (CFL 7457);
Estação Experimental de Silvicultura Tropical ZF, Bastos, V., 24 de julho de 2012
(CFL 12974); Área urbana, Jesus, M.A., 13 de abril de 2014 (CFL 10390).
Basidiocarpo: ressupinado, efuso, macio e frágil, facilmente destacável do
substrato. Himênio: branco para mais ou menos ocráceo, cordão
geralmente largo, aracnoide e frequentemente fibriloso. Sistema hifal:
monomítico, no subhimenio e no nervo reto,parede fina a parede espessa (2-5
µm) de largura, incrustada, hifa ricamente ramificada, de célula muito curta,
septo no cordão frequentemente ampuliforme. Basídio: cilíndrico e curto, em
geral levemente acinturado (15-10 x 5-6 µm), as vezes com aparência pleural ao
finalizar uma hifa em crescimento vertical, com 4 esterigmase um grampo basal.
Basidiósporo: elipsoide, verrugoso, (5-4 x 4-3 µm) (Figura 2- Ae B).
Comentário: O espécime analisado apresenta as descrições semelhantes as
feitas para a espécie de Eriksson et al. (1988).

627
Figura 1. Basidiomass dos fungos corticióides - A.Trechispora mollusca; B.
Gloeocystidiellum ochraceum; C. Phlebia lilascens; D. Peniophora violaceovida; E.
Phlebiopsis gigantea; F. Phanerochaete. calotricha; G. Phlebiopsis roumeguerii; H.
Trechispora farinacea; I. Peniophora cinerea; J. Trechispora cohaerens; K. Phanerochaete
sordida; L. Gloeocystidiellum convolvens; M. Aleurodiscus fennicus; N. Trechispora invisitata.
Barra de escala: A- N= 10 mm.

628
Figura 2. Microestruturas reprodutuvas e ornamentais dos fungos corticióides
A. Basídio e B. Basidiósporo de Trechispora mollusca; C. Gloeocistidio, D. Basidiósporo e E.
Basídio deGloeocystidiellum ochraceum; F. Basídio e G. Basidiósporo de Phlebia lilascens;
H. Basídio, I. Cistídio e J. Basidiósporo de Peniophora violaceovida; K. Basidiósporo, L.
Cistídio e M. Basidío Phlebiopsis gigantea; N. Cistídio, O. Basidiósporo e P. Basídio de
Phanerochaete calotricha; Q. Cistídio, R. Basidiósporo e S. Basídio de Phlebiopsis
roumeguerii; T. Basídio e U. Basidiósporo de Trechispora farinacea; V. Basídio, W.
Basidiósporo e X. Cistídio de Peniophora cinerea; Y. Basídio e Z. Basidiósporode Trechispora
cohaerens; A'. Basidiósporo, B'. Cistídio e C'. Basídio de Phanerochaete sordida; D'.
Gloeocistídio, E'. Basídio e F'. Basidiósporo de Gloeocystidiellum convolvens; G'. Basídio,
H'. Basidiósporo e I'. Gloeocistídio de Aleurodiscus fennicus; J'. Basidiósporo, K' e L'.
Basídio deTrechispora invisitata; Barra de escala:= 10 µm, V= 15 µm; Basidiósporo: (B, D,
G, J, K, O, R, U, W,Z, A', F', H', J') = 5 µm; Cistídio: (I, L, N, Q, X, B') = 10 µm; Gloeocistídio:
(C, I) = 10 µm, D'= 15 µm.

Conclusão
O estudo contribuiu para o conhecimento da ocorrência de 14 espécies
de macrofungos corticioides no Brasil. Destas, destacam se Aleurodiscus
fennicus, Peniophora violaceolivida, Phanerochaete calotricha, Phlebia lilascens,
e Trechispora invisitata, como primeiro registro para o Brasil. Assim como
Gloeocystidiellum convolvens, G. ochraceum, Peniophora cinerea,
Phanerochaete sordida, Phlebiopsis gigantea, P. roumeguerii, T. cohaerens, T.
farinacea e T. mollusca com novos registros no Brasil.

629
 Agradecimentos
Á Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM,
pelo apoio financeiro por meio do projeto de Coleção de Microrganismos de
Interesse Agrossivilcutiral e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico pela bolsa de apoio do Programa de Iniciação Científica
concedida a William Wallace da Silva Pereira.

Referências
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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Penicillium citrinum isolado da região amazônica: uma nova

fonte de enzima fibrinolítica

Souza, Thayana Cruz2; Schwarz, Marcos Gustavo Araujo3; Silva, Daniela

Marinho1; Maia, Carolina Rabelo1; Oliveira, Luiz Antonio4; Degrave, Wim Maurits
Sylvain3; Mendonça-Lima, Leila3; Fernandes, Ormezinda Celeste Cristo1

1InstitutoLeônidas e Maria Deane (ILMD), Fiocruz-Amazonas, 2Faculdade Estacio do

Amazonas, 3Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, 4Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia.
Email: [email protected]

Resumo
A produção de novos fármacos a partir de fontes naturais tem sido o principal
incentivo para o desenvolvimento de diversos setores da bioindústria. O Brasil,
com uma das maiores biodiversidades do mundo, apresenta grande potencial na
busca por essas novas moléculas que possam se transformar em produtos úteis
e de alto valor, sendo o grupo das enzimas proteolíticas um dos mais
importantes. Proteases fibrinolíticas microbianas têm sido investigadas como
alternativas no tratamento de doenças cardiovasculares, pois apresentam a
capacidade de degradar o coágulo sanguíneo composto por fibrina. O objetivo
desse trabalho foi demonstrar uma nova fonte para produção de enzima
fibrinolítica por P. citrinum CFAM 521. O fungo foi submetido a fermentação
submersa para obtenção do filtrado de cultura e, posterior, realização dos testes
enzimáticos. A enzima proteolítica produzida pelo fungo tem ação fibrinolítica e
fibrinogenolítica. A enzima apresentou massa molecular aparente de
aproximadamente 34 kDa. Os dados revelam P. citrinum CFAM 521 como um
novo produtor de enzima fibrinolítica, sendo esta uma alternativa potencial para
o desenvolvimento de agentes trombolíticos.

Palavras-Chave: atividade trombolítica; enzima fibrinolítica; Penicillium

Introdução
A produção de novos fármacos a partir de fontes naturais tem sido o
principal incentivo para o desenvolvimento de diversos setores da bioindústria.
O Brasil, com uma das maiores biodiversidades do mundo, apresenta grande
potencial na busca por essas novas moléculas que possam se transformar em
produtos úteis e de alto valor, sendo o grupo das enzimas proteolíticas um dos
mais importantes (Morais et al. 2014; Specian et al. 2014).

632
 Entre as proteases, as enzimas fibrinolíticas podem degradar o coágulo
de fibrina e, por isso, desempenham um papel importante na indústria
farmacêutica como agentes quimioterápicos no tratamento de trombose,
considerada uma das principais causas de doenças cardiovasculares (DCVs) na
vida moderna (Katrolia et al. 2020; Silva et al. 2013). Segundo dados da
Organização Mundial da Saúde (OMS), estima- se que 17,9 milhões de pessoas
morreram de DCV em 2019, representando 32% de todas as mortes globais,
portanto as doenças cardiovasculares são a principal causa de morte
globalmente (WHO 2021).
Existem atualmente alguns ativadores de plasminogênio para o
tratamento de doenças trombolíticas. Dentre elas, estão algumas, como a
uroquinase, ativador do plasminogênio tecidual, estreptoquinase e
estafiloquinase, que são amplamente sugeridas para remoção de coágulos
(Krishnamurthy e Belur 2018). No entanto, existem vários problemas envolvendo
essas substâncias, que vão desde o alto custo de produção até efeitos colaterais,
como hemorragias internas (Thelwell 2010). Portanto, novas pesquisas estão
sendo feitas para descobrir alternativas a essas drogas.
Sabe-se que as proteases podem ser obtidas de animais, plantas e
microrganismos, mas este último grupo tem sido extensivamente estudado nas
últimas décadas como potenciais produtores de biomoléculas trombolíticas,
como Bacillus natto (nattokinase) e B. amyloliquefaciens (subtilisin DJ-4).
Enzimas fibrinolíticas também foram encontradas em alguns fungos, como
Penicillium chrysogenum H9 (El-Aassar et al. 2009), Aspergillus ochraceus 513
(Batomunkueva e Egorov 2001), Fusarium sp. PCCC 480097 (Wu et al. 2009),
Rhizopus chinensis (Xiao-Lan et al. 2005) e Mucor subtillissimus UCP 1262
(Nascimento et al. 2015). Fungos filamentosos são uma boa escolha para
produzir enzimas fibrinolíticas devido aos altos níveis de produção e fácil
recuperação de enzimas, uma vez que a maioria delas são exsudatos celulares
(Sandhya et al. 2005).
Dado o grande potencial e crescente aplicabilidade de enzimas
microbianas na produção de fármacos, o presente estudo relata e caracteriza
uma enzima fibrinolítica produzida por uma linhagem de Penicillium citrinum
(CFAM 521) isolada da região amazônica.

633
 Material e Métodos
Microrganismo
A cepa de Penicillium citrinum utilizada está depositada na Coleção de
Fungos da Amazônia (CFAM/FIOCRUZ-Brasil, número 521). Para obtenção do
inóculo, o cultivo foi reativado em Malt Extract Agar (MEA) em placas de Petri (Ø
= 90 mmx15mm) e mantido a 28 °C por 7 dias. Este fungo foi previamente
identificado em nível de gênero na coleção. Para identificação genética da cepa,
a cultura estoque foi utilizada para extração de DNA. Este projeto está registrado
no SisGen sob o número de registro AD34ED.

Identificação molecular
A extração de DNA total foi realizada a partir do micélio de P. citrinum
CFAM 521 usando o kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), de acordo com as
instruções do fabricante. A região do espeçador interno transcrito (ITS), assim
como os genes β- tubulina (BenA) e calmodulina (CaM) foram amplificados por
PCR em uma mistura de reação de 25µL preparada contendo 2,5µL de tampão
PCR 10X, 0,5µL dNTP Mix (10mM) (Invitrogen), 0,75µL de MgCl2 (50mM), 0,5
µL de cada primer (10µM), 0,3mL Platinum Taq DNA polimerase (5U/µL)
(Invitrogen) e 2,0µL DNA template. Para todas as regiões a serem amplificadas,
os ciclos de PCR foram: (1) 94°C por 5 minutos; (2) 35 ciclos de 30 segundos a
94°C, 1 minuto a 55°C e 2 minutos a 72°C; e (3) uma incubação de 2 minutos a
72°C. A região ITS foi amplificada utilizando os primers ITS1 (5'
TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGA TATGC
3') (White et al. 1990). BenA foi amplificado usando primers Bt2a (5'
GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 3') e Bt2b
(5'ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC 3') [16] e CaM usando primers
CF1 (5' GCCGACTCTTTGACYGARGAR 3') e CF4 (5'
TTTYTGCATCATRAGYTGGAC 3') (Peterson et al. 2005).
A amplificação foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 1,5%
(p/v), corado com GelRed (Biotium). Os fragmentos amplificados foram tratados
com PEG a 20% antes do sequenciamento. O sequenciamento foi realizado na
direção direta e reversa usando os primers descritos anteriormente. Foi utilizado
o kit Big Dye Terminator Cycle Premix, seguindo o protocolo do fabricante, e os
produtos foram analisados no sequenciador automático de DNA ABI 3130xl

634
(Thermo Fisher Scientific). Eletroferogramas direto e reverso foram usados para
construir sequências de consenso no software Geneious versão 6.0.6
(Drummond et al. 2011). O final ruidoso de cada sequência foi aparado para
diminuir os resultados enganosos durante a análise genética. As sequências
geradas foram verificadas por meio de busca de similaridade no BLASTn (Basic
Local Alignment Search Tool) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) restringindo a busca
ao banco de dados de sequências tipo.

Fermentação submersa.
A fermentação submersa foi realizada pela transferência de 1 mL da
suspensão de esporos (5x106 conídios.mL-1) dos isolados para frascos
Erlenmeyer contendo 50 mL de solução de Manachini et al. (1987),
suplementada com 0,5% (p/v) de gelatina. A fermentação submersa foi
conduzida em agitador orbital por 96 h/150 rpm/28 ºC. O sobrenadante foi
recuperado por filtração a vácuo usando papel de filtro Whatman #1 e, em
seguida, membrana de filtro (0,45 μm). A atividade proteolítica foi determinada no
sobrenadante. Os experimentos foram realizados em triplicata.

Investigação da atividade fibrinolítica

O sobrenadante foi submetido ao ensaio de atividade fibrinolítica em placa
de Petri, segundo método descrito por Astrup e Mullertz (1952) com pequenas
modificações. A placa de fibrina, gel de fibrina de 3 mm de espessura e 9 cm de
diâmetro, foi preparada misturando 10 mL de fibrinogênio a 0,5% com 0,1 mL de
trombina (100 unidades NIH/mL). A placa de fibrina solidificada foi preparada
despejando a mistura em uma placa de Petri e deixando-a em repouso por 30
minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante contendo a enzima
fibrinolítica (20 µL) foi aplicado diretamente na placa de fibrina e incubado a 37°C
por 18 horas. No método da placa de fibrina, observa-se uma região clara e
transparente na qual a fibrina é hidrolisada, e seu diâmetro é diretamente
proporcional à atividade fibrinolítica.

Determinação da atividade fibrinolítica

A atividade fibrinolítica foi determinada de acordo com o método descrito
por Wang et al. (2009). Primeiro, 0,4 mL de fibrinogênio a 0,72% foi colocado em

635
um tubo de ensaio com 0,1 mL de tampão fosfato 245 mM (pH 7) e incubado a
37°C por 5 min. Em seguida, adicionou-se 0,1 mL de solução de trombina 20
U/mL. A solução foi incubada a 37 °C por 10 min, adicionou-se 0,1 mL de solução
enzimática diluída e a incubação continuou a 37°C. Esta solução foi novamente
misturada após 20 e 40 min. Aos 60 min, 0,7 mL de 0,2 M TCA foi adicionado
e misturado. A mistura de reação foi centrifugada a 15.000 x g por 10 min. Em
seguida, 1 mL do sobrenadante foi coletado e a absorbância a 275 nm foi medida.
Neste ensaio, uma unidade (unidade de degradação da fibrina por L) de atividade
enzimática é definida como um aumento na absorbância de 0,01 por minuto a 275
nm da solução reacional. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

SDS-PAGE
A eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-
PAGE) foi realizada usando um gel contínuo de poliacrilamida a 12% de acordo
com o método de Laemmli (1970). Bandas de proteína foram detectadas após
coloração com azul brilhante de Coomassie R-250.

Ensaio fibrinogenolítico
A atividade fibrinogenolítica foi determinada da seguinte forma: 150 µl de
solução de fibrinogênio humano a 1,0% foi incubado com 50 µl da enzima
purificada a 37°C por diferentes tempos (Lakshmi, Bhargavi, Prakasha 2013). A
reação foi interrompida pela adição de tampão desnaturante. Os produtos
digeridos foram analisados por SDS-PAGE 12% de acordo com o método de
Laemmli (1970).

Precipitação de sulfato de amônio

A precipitação com sulfato de amônio foi feita para análise em SDS-PAGE
foi feita a partir de 100 mL do sobrenadante da cultura obtido do crescimento
bacteriano, conforme descrito acima, foi submetido ao fracionamento com sulfato
de amônio em diferentes faixas de saturação (20, 40, 60 e 80%) e os precipitados
foram coletados por centrifugação a 15.000 xg por 10 min a 4°C. A fração de
saturação que continha a maior atividade fibrinolítica, foi ressuspensa em
tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7,0. A enzima foi avaliada por SDS-PAGE
e a atividade específica por um ensaio fibrinolítico, conforme descrito acima.

636
 Resultados e Discussão
Identificação molecular
O fungo deste estudo foi coletado do solo da região amazônica e está
depositado na Coleção de Fungos da Amazônia (CFAM). Após sequenciamento
e busca de similaridade em BLAStn, as sequências dos três marcadores (ITS,
BenA e CaM) apresentaram 100% de identidade com a espécie tipo Penicillium
citrinum, depositada no banco de dados do National Center for Biotechnology
Information (NCBI) com os respectivos códigos de acesso: NR_121224.1,
GU944545.1 e GU944638.1.

Atividade fibrinolítica
O sobrenadante da cultura de P. citrinum CFAM 521 apresentou atividade
fibrinolítica de 310,20 ± 4,24 U/ml. Esse fungo também apresentou capacidade
de degradação do coágulo na placa de fibrina, com halo de 19 mm de diâmetro
nas três amostras analisadas. Esses resultados são superiores aos relatados por
Nascimento et al. (2015). Os autores produziram proteases fibrinolíticas usando
Mucor subtillissimus UCP 1262 e Rhizopus arrhizus var. arrhizus UCP1295 em
diferentes substratos agroindustriais, obtendo como resultados atividades
proteolíticas de 78 U/ml e 58 U/ml, respectivamente.
O potencial do Penicillium para produzir proteases já é conhecido (Souza
et al. 2015; Alhelli et al. 2016), mas sua capacidade fibrinolítica tem sido pouco
explorada, como no trabalho de El Aassar et al. (2009). Eles analisaram a
variação da produção de proteases fibrinolíticas em diferentes fontes de
nitrogênio e carbono usando a cepa P. chrysogenum H9. Vale ressaltar que
nosso trabalho é o primeiro relato sobre produção de protease com capacidade
fibrinolítica obtida de P. citrinum.
Outros estudos utilizando fungos como fonte de proteases demonstraram
que esses microrganismos são promissores produtores de enzimas fibrinolíticas
que podem ser alternativas para aplicação biofarmacêutica. Shirasaka et al.
(2012) encontraram uma protease fibrinolítica produzida por Aspergillus oryzae
KSK-3, que foi indicada para terapia fibrinolítica oral e aplicações nutracêuticas.
Da mesma forma, Kim et al. (2011) demonstraram que Paecilomyces tenuipes
produz uma enzima fibrinolítica que pode ter aplicações potenciais no tratamento
de trombose.

637
 A enzima fibrinolítica de P. citrinum CFAM 521 foi analisada por SDS-
PAGE, após a remoção do excesso de sulfato de amônio usando unidades de
filtro Amicon, seguindo as instruções do fabricante. A massa molecular estimada
é de aproximadamente 34 kDa (Figura 1). Outros pesquisadores relataram outras
enzimas fibrinolíticas produzidas por fungos como Rhizopus chinensis 12 (18
kDa) (Xiao-Lan et al. 2005), A. oryzae KSK-3 (30 kDa) (Shirasaka et al. 2012),
Aspergillus ochraceus 513 (36 kDa) (Batomunkueva e Egorov 2001), Fusarium
sp. CPCC 480097 (28 kDa) (Wu et al. 2009) e M. subtilissimus UCP 1262 (97
kDa) (Nascimento et al. 2016). Esses dados mostram a diversidade estrutural
das proteases fibrinolíticas produzidas por fungos e indicam que a pesquisa deve
ser sempre continuada para descobrir novas atividades com diferentes
especificidades.

Figura 1 - Peso molecular da enzima fibrinolítica. SDS-PAGE corado com CBB-R250 contendo
20 µl de amostra (1). M: marcador de proteína (kDa)

638
Atividade fibrinogenolítica
Para elucidar a atividade sobre o fibrinogênio, a enzima foi incubada com
fibrinogênio humano e o modo de reação foi analisado por SDS-PAGE. O ensaio
fibrinogenolítico da enzima de P. citrinum CFAM 521 mostrou que as bandas Aα,
Bβ e γ desapareceram após 1 min (Figura 2). Portanto, todas as cadeias do
fibrinogênio (Aα, Bβ e γ) foram susceptíveis à clivagem da enzima fibrinolítica,
por isso tem atividade fibrinogenenolítica. Este padrão hidrolítico foi semelhante
a outras proteases fibrinolíticas purificadas de Fusarium sp. CPCC 480097 (Wu
et al. 2009), Codium fragile (Choi et al. 201) e S. marcescens RSPB11 (Alhelli
et al. 2016), mas foi diferente das enzimas de B. subtilis HQS-33 (Huang et al.
2013) e B. circulans (Yogesh e Halami 2015) em que a cadeia γ resistiu
degradação. A degradação proteolítica das cadeias Aα implica em menor
estabilidade do coágulo, enquanto a degradação proteolítica das cadeias γ se
traduz em menor interação do fibrinogênio com as plaquetas (Sousa e Duarte
1996). Uma redução no nível de fibrinogênio diminui a incidência de trombose.
Portanto, esta protease pode ser uma candidata para uso na terapia trombolítica
e na prevenção da formação de coágulos sanguíneos.

Figura 2 - Atividade fibrinogenolítica da enzima analisada por SDS-PAGE após os intervalos de

tempo indicados acima das pistas. Linha C: controle (fibrinogênio), 1 a 120: tempo de incubação
(min), M: marcador de proteína (kDa).

639
 Conclusões
Os dados indicam que P. citrinum CFAM 521 apresenta capacidade de
produzir enzima com ação fibrinolítica e fibrinogenolítica. A enzima produzida
pelo fungo apresenta aproximadamente 34 kDa.

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Prospecção de Bacillus spp. para produção de enzimas

quitinases para o controle de Aedes aegypti

Souza, Izane Maria Matos1; Rocha, Elerson Matos2; Oliveira, Juan Campos1;
Muniz, Veranilce Alves1; Souza, Douglas Vitor Barbosa1; Roque, Rosemary
Aparecida3; Katak, Ricardo de Melo3

1Universidade Federal do Amazonas,2Faculdade de Ciências Agronômicas, 3Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia.
Email: [email protected]

Resumo
O mosquito Aedes aegypti é considerado vetor primário de arbovírus causadores
de doenças como a Dengue, Chikungunya e Zika. As principais estratégias de
controle para reduzir os impactos na Saúde Pública incluem medidas como o
controle vetorial. O gênero Bacillus se destaca por serem considerados agentes
de controle de diversas ordens de insetos e pragas agrícolas. As bactérias desse
gênero produzem uma diversidade de moléculas inseticidas, dentre elas as
enzimas hidrolíticas quitinases. Estudos mostraram que essas enzimas
apresentam patogenicidade para diversos insetos e, muitas delas atuam em
sinergismo com outras moléculas inseticidas. Considerando o potencial
metabólico do gênero Bacillus, o presente estudo objetivouavaliar o potencial
antagônico de Bacillus spp. e seu potencial para produção de enzimas
quitinases. Neste experimento, utilizou-se duas linhagens de bacilos (GD02.13
e SBC13), ambas identificadas como Bacillus sp. para avaliar o potencial
antagônico e atividade enzimática de enzimas quitinoliticas. A fração do pellet
das linhagens mostrou 100% de mortalidade no intervalo de 24 horas. O mesmo
perfil detoxicidade foi observado para a linhagem padrão BtiBR101. Em relação
à atividade quitinolítica, a linhagem GD02.13 produziu 218 U/ml de enzimas,
sendo considerada a maior atividade das linhagens isoladas, seguida pelas
linhagens SBC13 e BtiBR101, apresentando 211 e 201 U/ml, respectivamente.
Não foi observado o mesmo perfil deatividade quitinolítica em relação ao controle
positivo (Pichia pastori), pois produziu uma maior quantidade. Neste contexto, os
Bacillus sp. avaliados neste trabalho podem ser usados em pesquisas como
agentes de biocontrole, principalmente na prospecção de enzimas quitinases
para o controle de A. aegypti.

Palavras-Chave: Controle biológico; Aedes aegypti; enzimas quitinolíticas

Introdução
O mosquito Aedes aegypti pode transmitir diversos arbovírus causadores
de doenças, que afetam a saúde de seres humanos como, Dengue, Zika,
Chikungunya e Febre amarela urbana (Souza-Neto et al. 2019). A adaptação em

643
área urbana, vemocasionando mudanças no seu comportamento antropofílico,
aumentando surtos das infecções virais mencionadas acima, tornando um
grande problema à Saúde Pública (Kilpatrick e Randolph 2012; Paixão et al.
2018; Nóbrega et al. 2018).
Atualmente, não há vacinas disponíveis para essas doenças como
medidas profiláticas, o controle vetorial é considerado um dos métodos de
estratégias para reduzir os impactos na Saúde Pública no Brasil e outras partes
do mundo (Hamid et al. 2018; Sasmita et al. 2021). Vários métodos são utilizados
para o controle vetorial,entre eles o mecânico pela eliminação dos criadouros e
o químico pelos inseticidas sintéticos (Zara et al. 2016). Os inseticidas químicos
são tóxicos ao meio ambiente, eo uso prologando pode promover a resistência
desses mosquitos. Com o aumento dessas populações de mosquitos
resistentes, outras estratégias são aplicadas, comoo controle biológico, no qual
utilizam microrganismos entomopatogênicos (vírus, bactérias e fungos) como
uma alternativa para amenizar os impactos provocados pelos inseticidas
químicos (Lazarte et al. 2018; Moyes et al. 2017, Hamid et al. 2018; Wuliandar et
al. 2020).
Bactérias do gênero Bacillus são potenciais agentes de controle biológico,
poisproduzem uma diversidade de moléculas com ação inseticidas. A exemplo da
bactéria B. thuringiensis, estas espécies produzem diversas proteínas com
propriedadesinseticidas, como por exemplo, proteínas Cry, Cyt, Vip, Sip (Bravo
et al. 2007; Crikmore et al. 2021). Além disso, B. thuringiensis produzem enzimas
hidroliticas como as quitinases que, quando usadas em combinação com outros
componentes, incluindo proteínas Cry, ocasionam danos nas larvas de
mosquitos (Thamthiankul et al. 2004). As quitinases apresentam funções de
romper a membrana peritrófica e permite que microrganismos e patógenos
invadam a hemocele dos insetos (Shapiro et al. 1987). As bactérias produzem
quitinases para o uso de quitina como fontes de nitrogênio e carbono (Woo et al.
1996). Estudos mostraram que essas macromoléculas apresentam potencial
sinérgico na patogenicidade do A. aegypti, pois a enzima quitinase hidrolisa a
membrana peritrófica no intestino facilitando a ligação das proteínas Cry aos
receptores celulares no intestino médio (Galzer, Azevedo-Filho 2016). Argôla-
Filho e Loquercio (2014), evidenciaram que bactérias que apresentam gene

644
da quitinase são promissoras para o controle de insetos, além disso, apresentam
maior eficácia, pois, pode aumentar o efeito mosquitocida.
A diversidade microbiana da Amazônia tem um grande bioma que precisa
ser explorado, principalmente as fontes de recursos genéticos e metabólicos da
sua biodiversidade. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial antagônico
de linhagens de Bacillus spp. e a produção de enzimas quitinases para o controle
delarvas de A. aegypti.

Material e Métodos
Reativação das linhagens bacterianas e condições de cultivo
Neste experimento foram utilizadas duas linhagens SBC13 Bacillus sp.
MT052634 e GD02.13 Bacillus sp. MT163315 isoladas de solo e da água de
ambientes amazônicos. Além dessas linhagens, a linhagem padrão BtiBR101
cedidapelo Laboratório de Genética e Taxonomia bacteriana da Universidade
Estadual de Londrina UEL/PR foi utilizada como controle positivo.

Pré-inóculo e condições de cultivo dos bacilos

Para a reativação das linhagens foram adicionados 20 µl de cada linhagem
emtubos de ensaio contendo 2 ml do meio Nutriente broth (5 g de tecido animal,
5 g decloreto de sódio, 1.5 g extrato de carne, 1.5 g de extrato de levedura). Após
o acréscimo, os tubos de ensaio foram incubados na estufa a 30°C sob agitação
de 180 rpm por 24h. Em seguida, 100 µl do cultivo bacteriano foi transferido para
Erlenmeyer de 250 ml, contendo 100 ml do respectivo meio. Após isso foram
incubados na estufaa 30ºC sob agitação de 180 rpm durante 120 horas. Estes
procedimentos foram realizados em triplicata, com base na metodologia de
Marche et al. (2017), com adaptações. As amostras de cada linhagem foram
distribuídas em quantidade de 40 ml nos tubos falcons com capacidade de 50 ml
e centrifugadas a 4°C a 2.800 x g por 40 min. O pellet foi congelado a -20°C e
deixados em overnight. Em seguida submetidos à liofilização no liofilizador
(Enterprise I, TERRONI) durante 48 horas. Para a diluição dos pellets utilizou-
se 50 mg das amostras e diluiu em 10 ml de águadestilada, e em seguida foram
homogeneizados em vortéx (OMS 2005).

645
Obtenção de larvas de Aedes aegypti
As larvas A. aegypti foram obtidas do insetário do Laboratório de Controle
Biológico e Biotecnologia da Malária e Dengue (LCBMD) do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia-INPA. Inicialmente, os ovos foram colocados em bacias
de plásticos e adicionado 200 ml de água. Após a eclosão das larvas, foi
adicionada a alimentação que consistiu na mistura da ração (Teklab global) e da
ração Whiskas®.Ao atingirem o terceiro instar, uma quantidade específica de
larvas foi separada e coletada para a realização dos ensaios biológicos (Lima et
al. 2009).

Infecção das larvas com o pellet de Bacillus spp.

Neste procedimento, utilizaram-se três copos de plástico de 50 ml, no qual
foi adicionado 10 ml de água destilada, 10 larvas de A. aegypti (L3) em cada
copo e a concentração de 0.008 mg/L da fração do pellet (PEL). A mortalidade
das larvas foi avaliada no intervalo de 24 h. O controle negativo consistiu em um
copo contendo 50ml de água destilada, larvas e ausência de fração bacteriana.
Para o controle positivo, foi utilizada a linhagem padrão BtiBR101 a fim de
comparar a atividade larvicida.

Análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Três larvas das amostras do controle positivo e do pellet (PEL) foram
levados ao microscópio eletrônico ZEISS Stemi 2000 50X, após o período de 24
horas de exposição. Através do auxílio de alfinetes entomológicos, as partes
relacionadas à cabeça e do sifão respiratório foram cortadas a fim de facilitar a
permeação dos produtos químicos. Posteriormente, as larvas foram colocadas
em solução de Glutaraldeído de 2,5% tamponada com Cacodilato de Sódio (0,1
M, pH 7,2) por 24 horas e mantidos a -20ºC em overnight. Seguidamente, foi
fixado em tetróxido de ósmio (1%) por 1 h, em seguida adicionado por 10 minutos
no tampão Cacodilato desódio (0,1 M, pH 7,2). Após isso, foi feita a desidratação
em uma série crescente de etanol a 50, 70,80, 90, 95 e 100% por 10 minutos
cada. Posteriormente, as larvas foram montadas individualmente em suportes
metálicos, revestidos com ouro (Au) e observados sob um Microscópio
eletrônico de varredura Tescan (Vega 3, TESCAN, tcheco República) no

646
Laboratório Temático de Microscopia Óptica e Eletrônica (LTMOE) do Instituto
Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA).

Ensaios enzimáticos para produção de enzimas quitinases

A produção de quitinase foi realizada pelo cultivo dos Bacillus spp. em 200
ml de meio M9 (Na2HPO4, KH2O4, NaCl, NH4Cl, MgSO4, CaCl2, Glicose, Caseína
hidrolisada), suplementado com pó de casca de camarão como uma única fonte
de carbono. O meio inoculado por 5% de uma pré-cultura, foi incubado a 35ºC
em uma incubadora agitadora (120 rpm). Após a incubação, o meio de cultura
foi centrifugadoa 800 g durante 20 min e filtrado. A atividade de quitinase foi
testada empregando ensaio espectrofotométrico utilizando o substrato 4-
Methylumberilliferyl-β-D-N,N',N''- tricetylchitotrioside (4-MUFtriNAG). Na presença
de quitinase o substrato é hidrolisado liberando umbeliferona, um produto
fluorescente facilmente mensurado. A reação foi realizada em placa de 96 poços
com 20 µl substrato em tampão citrato fosfato ph 7,0 em 50mM e 80 µl do
sobrenadante de cultura. A reação foi incubada durante 20 minutos a 37 ºC e
finalizada pela adição de uma solução stop (00 mM de carbonato de sódio). A
fluorescência foi mensurada no comprimento de onda de excitação de 340 nm e
emissão 450 mm (Thimoteo et al. 2017) com modificações. Uma unidade de
atividade de quitinase foi definida como a liberação de 1 mmol de 4-MUF por
minutonas condições do ensaio.

Resultados e Discussão
Ensaios biológicos das frações Pellet (PEL)
Considerando as linhagens expostas a fração do pellet (PEL), observou-
se 100% de mortalidade das larvas nas primeiras 24h para as linhagens
GD02.13 e SBC13, ambos Bacillus sp. O mesmo perfil de toxicidade foi
observado na linhagempadrão BtiBR101-B. thuringiensis var. isralensis (Figura
1). Os esporos presentes na biomassa bacteriana quando ingeridos pelos
insetos, são germinados devido a carência de nutrientes nesses microambientes
desfavoráveis. Além disso, as células vegetativas proliferam, contribuindo para
o dano tecidual e a morte do hospedeiro (Salamitou et al. 2000; Milutinovic et al.
2013). Os efeitos das cepas de B. thuringiensis em larvas de A. aegypti foram

647
relatados por Viana et al. (2020), no qual observaram que a toxicidade de 24
horas nas larvas provocam efeitos histopatológicos e deformações nas células
epiteliais das larvas

Figura 1: Atividade larvicida das frações do PEL em 24 horas.

CN: controle Negativo

Análise da infecção da fração do pellet nas larvas de A. aegypti

Os resultados obtidos demonstram o potencial de infecção da fração do
pellet (PEL) das linhagens BtiBR101 e SBC13 contra as larvas de A. aegypti na
concentração de 0.01 mg/L. As análises observadas no microscópio eletrônico
de varredura (MEV) mostraram que estas linhagens utilizadas neste estudo
apresentaram colonização na superfície das larvas, principalmente na parte da
cabeçae do tronco. Em relação à análise de microscopia da linhagem GD02.13-
Bacillus sp. mostrou colonização de esporos na cabeça (escovas laterais) e no
tórax (Figura 2A). Considerando o resultado observado da análise de
microscopia, a linhagem SBC13- Bacillus spp. mostrou a colonização na parte
da cabeça e do tórax. A quantidade de esporos bacterianos é observada na parte
da cabeça e do tórax (Figura 2B). A linhagem padrão BtiBR101 apresentou uma
grande quantidade de esporos aderidos na parte da cabeça, palpos maxilares e
tórax das larvas (Figura 2C). As colonizações visíveis nas imagens de
microscopia mostraram a total competência dos esporos bacterianos das
linhagens em causar a infecção em 24 horas de exposição.

648
Figura 2: A) Análise de microscopia eletrônica de varredura com larvas de A. aegypti expostas a
fraçãodo pellet (PEL) da linhagem GD02.13NA-Bacillus sp. B) Análise de microscopia eletrônica
de varreduracom larvas de A. aegypti expostas a fração do pellet (PEL) da linhagem SBC13NA-
B. thuringiensis. C) Análise de microscopia eletrônica de varredura com larvas de A. aegypti
expostas à fração do pellet (PEL) da cepa Bti BR 101.

O contato direto de bactérias com insetos depende de diversos fatores

que ainda não estão bem elucidados e são escassos na literatura, como por
exemplo, o microparatismo. Embora, estudos sobre a interação de fungos
patogênicos contra insetos levaram a considerar que a produção de proteínas
proteolíticas, lipolíticas, enzimas quitinolíticas são os principais responsáveis
pela virulência destes microrganismos (Khachatourians e Qazi 2008). O
micoparasitismo em insetos é bemestabelecido, principalmente se tratando das
enzimas hidrolíticas que são secretadas pelos fungos. Contudo, ainda são
escassas essas abordagens sobre o mecanismo demicroparasitismo de Bacillus
em larvas de A. aegypti.
As micrografias das figuras 2A- 2C do processo de infecção larvas de A.
aegypti expostas aos Bacillus mostraram as estratégias de como esses
microrganismos podem ocasionar a patogenicidade por contato direto com as
larvas de A. aegypti. A estratégia de controle biológico resulta de múltiplas
interações que ocorrem em diferentes condições experimentais (Bar-Shimon et
al. 2004). Dessa forma, este estudo tem como estratégia tentar elucidar alguns
fatores de patogenicidade de Bacillus contra larvas de A. aegypti.

Atividade quitinolítica dos Bacillus spp.

Em relação à atividade quitinolítica dos Bacillus spp., foi observado que
as linhagens apresentaram potencial para produção de enzimas quitinolíticas.
A linhagem GD02.13 apresentou maior atividade quinolítica entre os Bacillus

649
spp. testados (218 U/mL). Em relação ao controle positivo, a levedura
recombinante Pichiapastoris que expressa enzimas quitinases apresentou 262
U/ml. A linhagem padrão BtiBR101 foi a que menos expressou atividade
enzimática (201 U/ml). Os dados referentes ao desvio padrão mostraram que as
médias estão de acordo com os valores esperados. O controle positivo (Pichia
pastori) e as linhagens de Bacillus spp. testados mostraram diferenças
estatísticas em relação ao controle negativo (Figura 3).

Figura 3: Atividade quitinolítica de Bacillus spp., tóxicos para larvas de A. aegypti. Os valores são
referentes à média da triplicata do experimento e estão expressos em Unidades (U), em que uma
Unidade representa 1µmol de açúcar redutor liberado por hora na reação quitinas e quitina
coloidal.

As quitinases apresentam funções de romper a membrana peritrófica e

permite que microrganismos e patógenos invadam a hemocele dos insetos
(Shapiro et al. 1987). As bactérias produzem quitinases para o uso de quitina
como fontes de nitrogênio e carbono (Woo et al. 1996).
B. thuringiensis também produz várias quitinases com diferentes massas
moleculares: 66, 60, 47 e 32 kDA (Thamthiankul et al. 2004). Este tipo de enzima
quitinolítica é usado como um antagonista e, além disso, usada como
mecanismo dedefesa contra insetos contendo quitina (Sahai e Manocha 1993).
Em relação à padronização e a otimização para a produção de enzimas
quitinolíticas, outrasabordagens deverão ser realizadas para fins características
gerais dessas enzimas. Dessa forma, a continuidade desse estudo possibilitará
obter enzimas e testar seus efeitos in vitro nas larvas de A. aegypti.

650
 Conclusões
As linhagens de Bacillus sp. apresentam ação antagônica para larvas de
A. aegypti. As linhagens GD02.13 e SBC13 apresentam potencial para produção
de enzimas quitinases. Estudos sobre o isolamento dessas moléculas e
investigação dos mecanismos de patogenicidade para larvas de A. aegypti
deverão ser realizados posteriormente.

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Screening de Bacillus spp. da Amazônia para o controle de

Aedes albopictus e Anopheles spp.

Katak, Ricardo de Melo1; Muniz, Veranilce Alves2; Oliveira, Juan Campos2; Tavares,
Claudia Patrícia da Silva3; Silva, William Ribeiro1; Nascimento Neto, Joaquim
Ferreira1; Rocha, Elerson Matos4; Roque, Rosemary Aparecida1

1InstitutoNacional de Pesquisas da Amazônia, 2Universidade Federal do Amazonas,

3Universidade do Estado do Amazonas, 4Faculdade de Ciências Agronômicas
Email: [email protected]

Resumo
Os mosquitos vetores de doenças são um grande problema para saúde pública.
O Aedes albopictus é o vetor secundário dos arbovírus dengue, Zika,
chikungunya e entre outros. O Anopheles sp. são considerados os vetores dos
Plasmodium spp. causadores da malária. Devido à inexistência de vacinas
disponíveis para as medidas profiláticas, o controle vetorial é uma das
alternativas para amenizar os impactos na Saúde Pública. Bactérias do gênero
Bacillus têm mostrado como agentescontroladores de populações de mosquitos
vetores de doenças. Neste estudo, utilizou sete linhagens de Bacillus sp.
provenientes de ambientes amazônicos para o controle de populações de A.
albopictus e Anopheles spp. As larvas de A. albopictus foram expostas aos
cultivos dos bacilos, assim como suas frações (pellets e sobrenadante) em
réplicas de cinco copos, com três repetições. Os dados de mortalidade foram
avaliados nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. Para os bioensaios com larvas de
Anopheles spp. foi utilizado apenas a fração do pellet dos bacilos, em réplicas de
três, com três repetições e a avaliação da mortalidade foi feita no intervalo de
24 h. Os resultados da atividade larvicida para populações de A. albopictus
revelaram que a linhagem GD02.13 apresentou 100% de mortalidade no intervalo
de 24 h em todas ascondições testadas. A exposição das larvas de Anopheles
spp. a fração do pellet dos Bacillus sp. mostrou que a linhagem GD02.13
apresentou 100% de eficácia em 24 horas. A linhagem padrão Vectobac® WG
revelou o mesmo perfil de mortalidade para as larvas. Neste contexto, a
descoberta de novas linhagens de Bacillus sp. entomopatogênicas pode ser uma
nova oportunidade para encontrar novas formulações bioinseticidas para o
controle de insetos no Brasil. Dessa forma, mais estudos sobre a caracterização
de seus princípios ativos, mecanismos de ação e concentrações letais deverão
ser realizados posteriormente.

Palavras-Chave: bactérias entomopatogênicas; controle biológico; e microbiota

amazônica.

654
 Introdução
As doenças ocasionadas por vetores impactam significativamente a
Saúde Pública, afetando aproximadamente 30% da população mundial (WHO
2017). Arbovírus como dengue, Zika, chikungunya e dentre outros são
transmitidos por mosquitos do gênero Aedes (Souza-Neto et al. 2019). Entre
eles, o mosquito Aedes albopictus é considerado o vetor secundário competente
para esses arbovírus, além disso, é ecologicamente mais flexível, com uma
distribuição geográfica mais abrangente do que o Ae. aegypti (Bonizzoni et al.
2013).
A malária continua sendo um dos mais importantes problemas de Saúde
Pública em todo o mundo. Os parasitas do gênero Plasmodium são os principais
agentes etiológicos da malária e são transmitidos aos humanos pelos mosquitos
fêmeas. Aproximadamente 40 espécies de Anopheles são considerados vetores
da malária, no qual foram responsáveis por cerca de 241 milhões de casos e
mais de 627.000 mortes em 2020 (WHO 2021).
O controle de vetores tornou se uma abordagem de esforço global para
deter apropagação de arboviroses e infecções parasitárias no mundo (Wilson et
al. 2020). Neste contexto, os inseticidas químicos são usados para suprimir
populações de mosquitos vetores de doenças, mas impactam negativamente no
meio ambiente e são tóxicos para organismos não-alvos (Moyes et al. 2017;
Dahmana et al. 2020). Dessa forma, o controle biológico para o desenvolvimento
de bioinseticidas microbianos tem mostrado um método bastante promissor para
sua utilização (Evans et al. 2018).
O gênero Bacillus representa um grupo de microrganismos de grande
importância para o controle biológico de insetos vetores de doenças, por conta
da produção de uma diversidade de moléculas com potencial inseticida e outros
fatores de virulência (Malovichko et al. 2019; Falqueto et al. 2021). Além disso,
este gênero alberga diversas espécies de bactérias, como por exemplo, a
bactéria Bacillus thuringiensis var. israelenses (Bti), no qual é usada como um
agente de biocontrole de larvas de Ae. aegypti, vetor da Dengue (Boyce et al.
2013; WHO 2020).
A floresta tropical amazônica contém uma de diversidade de
microrganismos com potencial genético e metabólico que precisam ser
explorados. Portanto, o objetivodeste estudo foi avaliar o potencial de linhagens

655
de Bacillus spp., isolados da Amazônia para o controle de populações de larvas
de Ae. albopictus e Anopheles spp. vetores da dengue e da malária,
respectivamente. As pesquisas envolvendo o isolamento de novas espécies de
Bacillus são de fundamental importância para a prospecção de novas linhagens
entomopatogênicas, que podem ser implementadas no controle biológico de
insetos vetores de doenças no Brasil.
O objetivo desta pesquisa foi avaliar o potencial de linhagens de Bacillus
spp., isolados da Amazônia para o controle de populações de larvas de Ae.
albopictus e Anopheles spp. vetores da dengue e da malária, respectivamente.

Material e Métodos
Local de estudo
As atividades foram realizadas no laboratório de Controle Biológico e
Biotecnologia da Amazônia - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
(INPA).

Reativação e preparo dos cultivos bacterianos

As linhagens dos Bacillus spp. utilizadas neste experimento foram isoladas
por Katak et al. (2021), nos quais foram caracterizados pelo gênero Bacillus
(SISBIO 21263-1). A linhagem padrão Bacillus thuringiensis var. isralensis (Bti)
foi obtida da reativação do produto comercial Vectobac® WG. Primeiramente, as
linhagens incluindo o Bti foram cultivadas em meio sólido Nutriente Ágar - NA
(extrato de carne 1.0 g, extrato de levedura 2.0 g; peptona 5.0, pH 6.8 g/l). Uma
alça de cada colônia das bactérias foi colocada em 2 ml de Nutriente broth (Caldo
nutritivo) e crescido por 24 horas em 30ºC sob agitação de 180 rpm.
Posteriormente, uma alíquota de 100 µl foi retirada e adicionada em frascos de
250 ml contendo 100 ml dos respectivos meios.Os cultivos em escala preparativa
foram feitos em triplicata, incluindo a amostra controle. Os cultivos foram
mantidos em 30ºC sob agitação de 180 rpm durante 120 horas até atingirem a
densidade óptica de 8 unidades na escala de McFarland (~24 ×108 células/ml)
(Katak et al. 2021).

656
Bioensaios seletivos para larvas de Aedes albopictus
As larvas de Ae. albopictus utilizada neste estudo foram obtidas da colônia
do Insetário do Laboratório de Controle Biológico da Malária e Dengue-INPA
(SISBIO/79907/2021-2022). Larvas de primeira geração (F1) foram utilizadas nos
ensaios biológicos para avaliar a patogenicidade dos Bacillus sp. Os bioensaios
foram realizados utilizando em três repetições por dias alternados, consistindo
em cinco réplicas de copos contendo 100 ml de água destilada, 10 larvas de
terceiro instar, 1 mg de alimento e 1 ml (24x108 cells/ml) dos cultivos dos bacilos.
Um controle negativo (sem bactérias) foi usado para este experimento, e o
controle positivo utilizou-se a linhagem padrão Bti. Larvas mortas foram contadas
após 24, 48 e 72 horas de exposição em condições de laboratório. Os bioensaios
foram realizados de acordo com o protocolo de WHO (2005) e Katak et al. (2021).

Bioensaios com as frações dos cultivos dos bacilos

Linhagens que apresentaram pelo menos 50% de mortalidade larval em
ensaios anteriores foram analisadas quanto seu potencial tóxico em seus
componentes celulares (pellets) e seus secretados (sobrenadante). Neste
experimento, as linhagens foram inoculadas em 2 ml do meio liquido Nutriente
Broth e mantidas em incubadora agitadora a 30ºC e 180 rpm por 24 h. Após isso,
100 µl dopré-inóculo foi transferido para 100 ml do respectivo meio e incubado a
30°C e 180 rpm por 120 horas. Após 120 h de incubação, cada cultivo foi
centrifugado a 4°C em 2800 x g por 40 min. O sobrenadante (SUP) obtido foi
filtrado em membrana Millipore de 0.22 μM. O pellet (PEL) foi congelado e
liofilizado por 72 h em 150 mmHg (Dahmana et al. 2020; Katak et al. 2021). A
atividade larvicida do sobrenadante e do pellet foi avaliada separadamente.
Inicialmente, os produtos liofilizados foram preparados da seguinte forma; (I)
PEL= 50 mg de pellet + 10 mL de água. Todas as amostras foram
homogeneizadas com vórtex por 40 min. O ensaio com a fração do pellet (PEL)
foi conduzido em cinco réplicas, cada uma contendo 100 ml de água, 10larvas
de terceiro instar e as concentrações de 0.04, 0.03, 0.02, 0.01 e 0.008 mg/L.
Para o ensaio com a fração do sobrenadante foi utilizado as mesmas condições
supracitadas, porém utilizou-se cinco alíquotas (1000, 500, 250, 125 e 62.5 µL)
obtidas do sobrenadante. A mortalidade larval de Ae. albopictus foi avaliada
apenas no intervalo de 24 horas.

657
Ensaios biológicos com larvas de Anopheles spp.
Os anofelinos foram coletados no Município de Iranduba-AM, no Ramal
do 13, Região Metropolitana de Manaus (S 03°10'09.6 e W 06°09´50.3). Com
conchas entomológicas foram coletadas larvas de Anopheles spp. As larvas
foram levadas para o Laboratório de Malária e Dengue do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA). Os insetos adultos foram identificados a partir
de caracteres morfológicos externos, com auxílio de microscópio estereoscópico
ZEISS Stemi 200050X e chaves de identificação: Forattini (2002) e Wrbu (2022).
Os testes de patogenicidade foram conduzidos em três repetições por dias
alternados, utilizando cinco réplicas de cada copo. Em cada copo, continha 10
ml de água, 10 larvas de terceiro instar, 1 mg de ração e cinco concentrações de
0,04, 0,03, 0,02, 0,01 e 0,008 mg/l da fração do pellet (WHO 2005). As larvas
mortas foram contadas após à exposição de 24 h. Como controle positivo
utilizou-se a linhagem padrão Vectobac® WG-B. thuringiensis var. israelensis
nas mesmas concentrações da fração do isolado e, para o controle negativo
utilizou-se água destilada sem fração bacteriana.

Resultados e Discussão
Atividade larvicida de Bacillus spp. ativos para larvas de Aedes albopictus
A exposição de larvas de Ae. albopictus aos cultivos bacterianos de sete
linhagens de Bacillus spp. na concentração de 24x108 cells/mL revelaram o
potencialde Bacillus sp. isolado de diferentes ambientes. A linhagem GD02.13-
Bacillus sp. matou 100% as larvas no intervalo de 24 horas. O mesmo perfil de
mortalidade foi observado para a linhagem padrão Vectobac® WG (Tabela 1).
As demais linhagens (SPa22, SX15, SBC13, SBC1, Spa09 e SP06)
apresentaram baixa mortalidade para as larvas até no intervalo de 72 horas.
Estudo realizado por Katak et al. (2021) mostraram que os cultivos da linhagem
GD02.13 também apresentou mortalidade de100% na concentração de 24x108
cells/ml em larvas de Ae. aegypti.
O controle dos mosquitos Ae. albopictus vetor secundário de arbovírus
como dengue, Zika, chikungunya é uma forma eficaz de conter a transmissão de
patógenos para humanos (Dahmana et al. 2020). Espécies de B. thuringiensis
produzem durantea esporulação proteínas (Cry e Cyt) com atividade inseticida

658
contra diversas ordens de insetos. Além disso, as células vegetativas de B.
thuringiensis secretam proteínas Vips e Sips. No entanto, outros fatores de
virulência de B. thuringiensis foramdescobertos, incluindo metabólitos primários
e secundários com propriedades inseticidas (Chaabouni et al. 2012; Malovichko
et al. 2019).
Diversos fatores de virulência podem ser responsáveis pela mortalidade
das larvas, uma vez que este gênero de bactérias é um reservatório de uma
variedade de biomoléculas com diferentes mecanismos de ação.

Tabela 1- Atividade larvicida avaliada em 24, 48 e 72 h após a exposição aos cultivos bacterianos.
Osvalores são a média de cinco réplicas biológicas, cada uma contendo 10 larvas de terceiro
instar de A.albopictus em 99 ml de água destilada e 1 ml (~24 x108 cells/ml) de
cultivo bacteriana

Atividade larvicida com a frações dos cultivos dos Bacillus spp. para
larvas de Aedes albopictus
A linhagem ativa no bioensaio seletivo foi testada para avaliar a atividade
larvicida em seus componentes celulares e seus secretados separados. A
atividade larvicida da fração do pellet (componentes celulares) revelou a
mortalidade de 100% em todas as concentrações testadas para a linhagem
GD02.13-Bacillus sp. A linhagem padrão Vectobac® WG não demonstrou o
mesmo perfil de mortalidade que a linhagem isolada, sendo que nas
concentrações 0.01 e 0.008 mg/l foram menos tóxicas, apresentando 90 e 80%
de mortalidade no intervalo de 24 h, respectivamente (Figura 1A). Esses
resultados são semelhantes com o estudo de Katak et al. (2021), no qual
utilizaram as frações do pellet da linhagem GD02.13 na concentração de 5 mg/L
e observaram também 100% de mortalidade para as larvas de Ae. aegypti.
659
Figura 1: Atividade larvicida das frações do pellet e do sobrenadante obtidos dos cultivos das
bactérias.
A mortalidade das larvas de A. albopictus foi avaliada em 24 horas. (A) Fraçãodo pellet; (B)
Fração do sobrenadante. CN- Controle negativo com água no lugar das frações da cultura
microbiana.

Atividade larvicida da fração do pellet dos Bacillus spp. para larvas

de Anopheles sp.
Considerando os resultados da atividade larvicida da fração do pellet para
larvas de Anopheles sp. foi observado a mortalidade de 100% no intervalo de 24
horaspara a linhagem GD02.13-Bacillus sp. em todas as concentrações testadas
(Figura 2). Por outro lado, não foi observado o mesmo perfil de toxicidade para a
linhagem padrãoVectobac® WG quando testadas em todas as concentrações.
As concentrações 0.01e 0.008 mg/l do formulado foram menos eficientes que a
linhagem isolada. Os resultados mostraram que mesmos em baixas
concentrações, a linhagem GD02.13- Bacillus sp. tem mais eficácia para as
larvas de Anopheles spp.

Figura 2: Atividade larvicida das frações do pellet dos cultivos das bactérias. A mortalidade das
larvasde Anopheles foi avaliada em 24 horas. CN- Controle negativo.

660
 As intervenções de controle de larvas de mosquitos têm registros
comprovados de redução da transmissão e até mesmo da erradicação dos
mosquitos da malária (Killeen et al. 2002). Produtos à base de B. thuringiensis
var. israelenses (Bti) são usados como agente de controle biológico para a
malária e seu controle vetorial (Koeraadt et al. 2021).
Derua et al. (2019) enfatizam a importância de avaliar os produtos à base
de B. thuringiensis e comparar seus efeitos em diferentes localidades
geográficas, principalmente visando novas estratégias. O formulado
Vectobac® WG é um dos formulados disponíveis pela OMS para ser usado no
controle de vetores da malária (WHO 2020). Neste contexto, a linhagem GD02.13
-Bacillus sp. isolada da Amazônia mostrou tanto promissora quanto a linhagem
padrão, podendo ser uma nova estratégia de controle nessa região.
Esses achados mostraram as primeiras evidências dessa linhagem como
potencial biocontrole de populações de Anopheles spp. em condições de
laboratório. Mais estudos sobre as concentrações letais e a elucidação de seus
princípios ativos serão necessários para validar esse microrganismo com
potencial entomopatogênico, contra vetores da dengue e da malária.

Conclusões
Uma linhagem de Bacillus sp. apresentou potencial para o controle de
populações de A. albopictus e Anopheles spp. As frações dos componentes
celulares e os secretados do cultivo dos Bacillus sp. contém princípios ativos
larvas de A. albopictus. Estudos sobre a caracterização de seus princípios ativos
e seus mecanismos de patogenicidade serão necessários posteriormente.

Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM.

Referências
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663
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Viabilidade dos métodos de sílica-gel e óleo mineral na

preservação de Penicillium spp. depositados na Coleção
Microbiológica-INPA

Sousa, Sabrina Sinara Portela de1; Melo, Roger Fagner Ribeiro1; Barbosa,
Renan do Nascimento 1; Jesus, Maria Aparecida de2

1
Universidade Federal de Pernambuco; 2Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia
Email: [email protected]

Resumo
Fungos do gênero Penicillium além de sua importância ecológica, se destacam
com sua ampla aplicabilidade biotecnológica. Algumas espécies são
decompositoras e produtoras de micotoxinas, outras são fontes de biocompostos,
de interesse industrial, farmacológico, agrícola, e outras são utilizadas na
indústria de alimentos. Devido à sua grande aplicabilidade, a preservação "ex-
situ" é essencial, assim como a manutenção da viabilidade dessas linhagens. O
objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade das linhagens de Penicillium,
mantidas nos métodos de preservação Sílica gel e óleo mineral na Coleção
Microbiológica-INPA a fim de analisar a eficiênciade cada técnica, e garantir a
qualidade e manutenção cultural do acervo. Foi realizado a reativação das
linhagens de Penicillium que estavam depositadas na Coleção Microbiológica -
INPA nos métodos de preservação óleo mineral e em sílica gel, para tal foi
colocado um inóculo da cepa com papel de filtro (diâmetro de 5 mm) embebido
com caldo glicosado em eppendorf e incubados a 26°C por 7 dias. Após a
reativação das culturas e crescimento das colônias, foram observadas as
características culturais de cada linhagem, assim como a ausência de
contaminação. A viabilidade das cepas mantidas nos métodos analisados foi
estimada a partir da fórmula expressa em porcentagem, avaliou se a eficiência
de cada método para a preservação das culturas de Penicillium. Das linhagens
de Penicillium que foram reativadas, apenas 44% e 15% foram obtidadas a partir
dos métodos de sílica-gel e óleo mineral, respectivamente, indicando assim que
provavelmente as condições em que o fungo foi preservado não favoreceu a
preservação cultural das linhagens, principalmente devido à contaminação.

Palavras-Chave: Amazônia; Fungo anamorfo; Biodiversidade.

Introdução
O gênero Penicillium Link. é largamente conhecido em especial pelas
indústrias alimentícias devido que o fungo é causador de podridões destrutivas
nos alimentos. Ademais, o gênero em sua circunscrição taxonômica válida, inclui
espécies cosmopolitas de amplo espectro ecológico, que desempenham papéis

664
importantes, tanto nos ecossistemas quanto em processos biotecnológicos.
Dentre as quais muitas espécies são decompositoras e produzem uma ampla
variedade de micotoxinas (Visagie et al. 2014; Barbosa et al. 2020). Outras são
empregadas na indústria de alimentos que utilizam linhagens de Penicillium para
a produção de queijos como Camembert e Roquefort (Giraud et al. 2010). Além
disso, várias espécies são estudadas no processo de produção de biocompostos
de interesse industrial, agrícola efarmacológico (Pallu 2010), e algumas espécies
são utilizadas como controle alternativo de outros fungos (Sousa et al. 2021).
Desse modo se torna essencial a preservação "ex situ" das linhagens desse
gênero, permitindo assim o acesso sempre que houver demanda, seja para
pesquisa ou ensino.
No acervo de fungos lignocelulíticos da Coleção Microbiológica - Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia /INPA estão depositados diversos gêneros
de fungos anamorfos, dos quais, Penicillium se destaca pela grande ocorrência
na regiãoNorte do país e por serem de ampla aplicabilidade biotecnológica. Em
vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar a viabilidade das linhagens de
Penicillium, mantidas nos métodos de preservação sílica gel e óleo mineral na
Coleção Microbiológica-INPA a fim de analisar a eficácia de cada método e
garantia da qualidade cultural do acervo.

Material e Métodos
Foi realizada a reativação das culturas de Penicillium depositadas na
Coleção Microbiológica-INPA, seguindo a metodologia de Sousa et al. (2021).
Os testes de viabilidade foram realizados conforme Aparecido et al. (2018), com
alterações. As amostras de cada cultura foram semeadas em meio Batata-Ágar-
Dextrose (BDA) e incubadas à temperatura de 26 ºC, durante 7 dias. Aquelas
culturas que se desenvolveram foram avaliadas macro e microscopicamente
para verificar se as características morfológicas descritas para Penicillium
estavam preservadas. Após essas avaliações e aparentemente sem
contaminação, inóculos foram repicados em três pontos em placas de Petri (45
x 10 mm) com meio BDA, incubadas a 26 °C, em média por 7 dias, até o
crescimento total do fungo sobre o meio na placa de Petri.

665
 A eficácia do método de preservação das culturas de Penicillium spp. foi
estimada com base nos dados obtidos na viabilidade cultural (porcentagem)
expressa abaixo:

Fonte: Sousa et al. (2021).

Para o macrocultivo de Penicillium, três inóculos foram distribuídos

equidistantes em uma placa de Petri (90 x 15 mm) com meio Ágar Czapek-Dox
+ Extrato de Levedura 0,5% (p/v) (CYA) e em outra placa de Petri com Ágar
Extrato de Malte (MEA) visando diferenciar a colônia formada em cada meio de
cultivo, com basenas características macroscópicas, como cor, textura e diâmetro
da colônia, presença e cor de exsudados e liberação de pigmentação no meio
de cultura. As placas foram mantidas à temperatura de 26ºC, durante 7 dias até
que as três colônias atingissem o tamanho equidistante entre elas. Todos os
macrocultivos foram fotografados, visando o registro das características coloniais
de cada fungo.
Posteriormente, para a preservação das linhagens em diferentes
métodos, um total de 25 inóculos miceliais padronizados de 6 mm de diâmetro
foi retirado do macrocultivo com o auxílio de uma ponteira invertida (Figura 1),
os quais foram transferidos para placa de Petri estéril que foi mantida a 26 °C,
até o crescimento completo do fungo, visando inóculo sem qualquer
contaminação.

Figura 1. Inóculos padronizados.

666
 A técnica de microcultivo proposta por Riddell (1950) modificada (Figura
2), foi empregada para visualizar e mensurar as estruturas microscópicas de
Penicillium spp. tais como, tipo de ramificação, comprimento, largura e textura
dos conidióforos, comprimento e textura das métulas, fiálides, bem como
diâmetro, forma e textura dos conídios.

Figura 2. Esquema da Câmara úmida com microcultivo de fungo anamorfo.

Todos os dados e as imagens das características morfológicas de cada

linhagem foram inseridos em planilha, a serem disponibilizados em banco de
dados e sistema de informatização institucional. Para fins de padronização e
identificação, todas as linhagens de Penicillium estão mantidas em triplicada em
todos os métodos de preservação e depositadas na Coleção de Microrganismos
de Interesse Agrossilvicultural-INPA.

Resultados e Discussão
Dentre as linhagens de Penicillium que estavam depositadas na coleção,
130 linhagens estavam no método Sílica-gel e 141 em óleo mineral, com as quais
foram realizadas as tentativas de reativação e análises de viabilidade cultural
(Figura 3).
Dos 141 isolados mantidos em óleo mineral, 21 linhagens foram
reativadas. O número baixo de linhagens recuperadas deve estar associado a
dificuldade de manuseio dos tubos, bem como a penetração lenta de oxigênio
através do óleo, o que pode causar crescimento posterior do fungo e
variabilidade genética, desvantagens essas já observadas e descritas por
Mariano e Silveira (2005). Ademais, das 130 linhagens preservadas no método
Sílica-gel, se obteve 57 culturas puras, enquanto as demais 73 não cresceram
nas duas tentativas de reativação micelial.

667
 %

Figura 3. Número e viabilidade de linhagens de Penicillium spp. reativadas de cada método

depreservação.

A preservação em óleo mineral é um dos métodos mais antigo, comum,

simples, de baixo custo (Cavalcanti 1991; Silva et al. 1994) e de grande
viabilidade confirmada em trabalhos recentes como o de Barros Correia et al.
(2020), o qual demostrou alta viabilidade para um gênero que também
pertencente à família Thricomaceae. No entanto, não se observou a mesma
viabilidade cultural neste estudo.
Em suma, os resultados obtidos implicam que provavelmente, as
condições em que o fungo foi preservado tanto no óleo mineral como no método
Sílica-gel não favoreceu a preservação cultural das linhagens do gênero
Penicillium no acervo, principalmente devido à contaminação.
Desse modo, a análise de viabilidade, macro e microscópica possibilitou
a confirmação taxonômica á nível de gênero das linhagens de Penicillium (Figura
4), as quais foram mantidas novamente nos três métodos de preservação (sílica-
gel, óleo mineral e baixa temperatura) e depositadas no acervo com todas as
informações culturais obtidas durante o estudo.

668
Figura 4. Características morfológicas de Penicillium spp. em MEA. A (CMINPA 896). B
(CMINPA1309). C (CMINPA 1382). D (CMINPA 292). E (CMINPA 1117). F (CMINPA 1122).
G (CMINPA 783). H (CMINPA 665). I (CMINPA 1219).

Conclusões
Neste estudo foi observada baixa viabilidade dos métodos de preservação
sílica-gel e óleo mineral para o gênero Penicillium, tendo em vista que a perda
de culturas foi muito superior ao número de reativações obtidas. Tal resultado
pode servir como base para outras coleções, na escolha e/ou aperfeiçoamento
dos métodos de preservação para o organismo estudado. Além disso, estudos
de viabilidade cultural são essenciais para a manutenção de culturas de
Penicillium na Região Amazônica, bem como para o acesso das culturas visando
futuros estudos tanto taxonômico quanto biotecnológico.

Agradecimentos
Agradecemos ao INPA pelo apoio nas atividades realizadas, ao CNPq
pela conseção de bolsa e apoio financeiro, e à UFPE pelo apoio técnico-
científico.

669
 Referências
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670
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

671
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Atividade enzimática de fungos filamentosos isolados de

ambientes aquáticos da região de Santarém, Pará, Brasil

Aguiar, Aline Lima1; Ferreira, Rayane Bonfim1; Silva, Ana Luiza Figueira1;
Santana, Marcos Diones Ferreira1; Canto, Eveleise Samira Martins1

1Universidade Federal do Oeste do Pará

Email: [email protected]

Resumo
Os fungos filamentosos são organismos heterotróficos capazes de desenvolver
estruturas denominadas de hifas, que em conjunto constituem o micélio,
permitindo colonização de diversos habitats. Estes microrganismos representam
a principal fonte de enzimas proteolíticas de interesse industrial e biotecnológico.
O objetivo deste trabalho foi avaliar qualitativamente a potencial produção da
enzima protease em meio sólido produzidas por fungos filamentosos de
ambientes aquáticos isolados de amostras de água de Santarém - Pará. Foram
utilizadas cinco cepas fúngicas do gênero Curvularia sp., Aspergillus sp.,
Penicillium sp., Dichotomopilus sp. e Talaromyces sp. que estavam
armazenadas na coleção didática do Laboratório de Micologia e Bioensaios da
Universidade Federal do Oeste do Pará. As cepas foram reativadas em batata-
dextrose-ágar e incubadas em 30±2°por 5 dias e passaram por identificação
molecular. Após a confirmação do gênero a partir do valor de cobertura e
identidade, as cepas foram utilizadas nos testes enzimáticos em meio de cultura
sólido ágar-leite e incubados a 28±2°C por 5 dias. Para a determinação do Índice
de Atividade Enzimática (IAE) os halos enzimáticos e as colônias foram medidos
e aplicados na equação 1: IAE= diâmetro do halo (mm)/diâmetro da colônia (mm)
que considera o microrganismo como um bom produtor de enzimas em meio
sólido quando o valor é maior ou igual a 2,0. As cinco colônias testadas foram
identificadas através da morfologia e identificação molecular e revelaram cinco
gêneros com potencial biotecnológico, para as quais os resultados obtidos
demonstraram a atividade enzimática qualitativamente das cepas fúngicas do
gênero Curvularia sp., Penicillium sp., Dichotomopilus sp. e Talaromyces sp. Nas
condições analisadas as cepas não apresentaram índices enzimáticos
considerados ideais, porém esse estudo demonstra a necessidade de aplicação
de metodologia mais específicas para potencializar a atividade enzimática
apresentadas pelas culturas.

Palavras-Chave: Fungos filamentosos; Atividade enzimática; Protease

Introdução
Os fungos filamentosos são organismos heterotróficos capazes de
desenvolver estruturas denominadas de hifas, que em conjunto constituem o
micélio, permitindo colonização de diversos habitats e garantindo distribuição de

672
forma abrangente nos diferentes ambientes (Yike 2011). No processo de
nutrição, estes microrganismos são importantes na ciclagem de nutrientes, pois
atuam como saprófitos, decompondo a matéria orgânica morta e tornando os
nutrientes disponíveis para os demais organismos da cadeia trófica (Oliveira et
al. 2021).
Os microrganismos representam a principal fonte de enzimas. Neste
quesito, os fungos filamentosos se destacam devido a facilidade de cultivo de
culturas miceliais e por sua capacidade de crescimento em substratos de baixo
custo, o que possibilita replicabilidade e sucesso na busca por propriedades
desejáveis (Thapa et al. 2019). No setor industrial, os fungos filamentosos são
responsáveis pela produção de mais de 50% das enzimas industriais, sendo
essas enzimas capazes de catalisar reações biológicas e atuar em diversos
processos bioquímico celulares, dentre eles agregando valor a produtos têxteis,
alimentícios, medicamentos, cosméticos e produtos de uso científico e
biotecnológico (Singh et al. 2019).
Uma das enzimas importantes relacionadas aos fungos filamentosos são
as proteases, também conhecidas como peptídeo hidrolases. Essas enzimas
possuem ação catalisadora nas reações de hidrólise das ligações peptídicas
existentes nas moléculas das proteínas, dando origem a peptídeos menores e
aminoácidos livres (Queiroz e Sousa 2020). Possuem grande aplicação no setor
industrial, sendo responsáveis por aproximadamente 60% do mercado mundial
de enzimas industriais (Santos et al. 2016; Filho et al. 2022).
O objetivo desta pesquisa foi avaliar qualitativamente a potencial
produção da enzima protease em meio sólido produzidas por fungos
filamentosos de ambientes aquáticos isolados de amostras de água de Santarém
- Pará.

Material e Métodos
Neste presente estudo, foram utilizadas cinco cepas fúngicas dos gêneros
Curvularia Boedijn., Aspergillus P. Micheli., Penicillium Link., Dichotomopilus X.
Wei Wang, Samson & Crous. e Talaromyces CR Benj. Esses microrganismos
provenientes de ambientes aquáticos de Santarém, Pará estavam armazenados
na coleção didática do Laboratório de Micologia e Bioensaios da Universidade
Federal do Oeste do Pará e foram utilizadas para a identificação molecular.

673
Identificação molecular
Para a identificação molecular, as cinco cepas fúngicas foram reativadas
utilizando o meio de cultura Batata Dextrose Ágar (BDA), acrescido de antibiótico
cloranfenicol, incubadas a 30±2°C por cinco dias. Após crescimento satisfatório,
as culturas foram encaminhadas para o processo de identificação molecular.
Durante esse processo o DNA genômico das cepas foi extraído utilizando o Kit
de Wizard® Genomic DNA Purification (PROMEGA). Ocorreu a Reação de
Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificação da região ITS1-5.85-ITS2 do
rDNA, que foi realizada em volume total de 50 L, contendo 1x de tampão 10x, 1,5
mM de MgCl2, 0,2 µM de cada primer ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG
-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), 0,2 mM de dNTP, 0,2 U de Taq
DNA polimerase (Sinapse) e 25 ng de DNA.
Para a amplificação, o processo foi realizado em termociclador
(TermoFicher) utilizando a seguinte ciclagem: desnaturação inicial de 94°C por
3 minutos, 35 ciclos de desnaturação de 95°C por 30 segundos, anelamento a
55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e extensão final a 72°C
por 10 minutos. Os produtos obtidos passaram por visualização em gel de
agarose 1% corado com SYBrSafe (Invitrogen). Os produtos da amplificação
foram purificados utilizando Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System,
Promega, e foram submetidos ao sequenciamento pelo método Sanger na
empresa ACTGene Análises Moleculares. Posteriormente os eletroferogramas
resultantes foram analisados no software Bioedit, para obtenção da sequência
consenso, que foi comparada com sequências já depositadas no GenBank,
utilizando a ferramenta BLASTn. A confirmação do gênero foi considerada a
partir do valor de cobertura e identidade dos alinhamentos.

Determinação da atividade proteolítica qualitativa

Para a indução da enzima protease, foram utilizados o meio sólido ágar-
leite, utilizando 5,0 g de leite desnatado, 1,0 g de ágar nutriente em 100 ml de
água destilada de acordo com Chen et al. (2003). O meio de cultura foi vertido
em placas de Petri de 90 mm de diâmetro, onde foram inoculados dois discos de
micélio de aproximadamente 5 mm na superfície do meio de cultura. As placas
foram então incubadas em estufa de Demanda Biológica de Oxigênio (BOD) a
28±2°C por cinco dias, sendo que a cada 24 horas foi observada a formação do

674
halo enzimático translucido. Não foi necessário o uso de substâncias reveladoras
para a revelação dos halos enzimáticos.
Após a formação dos halos enzimáticos, os mesmos foram medidos em
seu diâmetro, assim como o diâmetro da colônia, com o auxílio de uma régua
milimetrada. Para a determinação do Índice de Atividade Enzimática (IAE),
utilizou-se a equação 1 conforme descrita em Teixeira et al. (2011). Assim, o
microrganismo é considerado como um bom produtor de enzimas em meio sólido
quando o valor do IAE é maior ou igual a 2,0 (Teixeira et al. 2011). Equação 1:
IAE = diâmetro do halo (mm)/diâmetro da colônia (mm).

Resultados e Discussão
As cinco colônias testadas foram identificadas através da morfologia e
identificação molecular, obtendo-se as seguintes espécies: Curvularia sp.,
Dichotomopilus sp., Penicillium sp., Talaromyces sp. e Aspergillus sp.

Figura 1 - Aspecto visual de culturas miceliais de fungos filamentosos isolados de ambiente

aquático da região de Santarém, Pará, Brasil, em meio de cultivo Batata Dextrose Ágar (BDA).
(A) Curvularia sp.; (B) Penicillium sp.; (C) Dichotomopilus sp.; (D) Aspergillus sp.; (E)
Talaromyces sp.

Os isolados fúngicos identificados demonstraram-se potenciais

produtores de enzimas proteolíticas no meio de cultura ágar-leite, como pode ser
observado na Figura 2, pois apresentaram halo de hidrólise translucido e índice
enzimático maior que 0 (Tabela 1) de acordo com a equação descrita por Teixeira
et al. (2011). Contudo, ainda segundo o índice enzimático, as culturas dessas
espécies não atingiram o índice enzimático maior ou igual a 2,0 mm que indica
uma boa produção da enzima.

675
Figura 2 - Aspecto visual do halo de degradação positivo em meio de cultura ágar-leite produzido
por culturas miceliais de fungos filamentosos isolados de ambientes aquáticos da região de
Santarém, Pará, Brasil. (A) Curvularia sp.; (B) Dichotomopilus sp.; (C) Talaromyces sp.; (D)
Penicillium sp.; (E) Aspergillus sp.; visualização de teste negativo (E).

Dentre os fungos utilizados o isolado Penicillium sp. formou um halo de

degradação de 27 mm e índice enzimático de 1,35 mm, formando dentre as
demais cepas fúngicas, o maior halo de degradação, destacando a positividade
para protease. Este resultado corrobora com o estudo de Queiroz e Sousa
(2020), onde destacaram a capacidade desse gênero de fungo em produzir
enzimas extracelulares proteolíticas em meio ágar-leite. Estes resultados
também coincidem com os de Paz Junior et al. (2020), que demonstraram
positividade de protease para uma espécie de Penicillium, com grande potencial
para os setores industriais e biotecnológicos.
O isolado Talaromyces sp. formou um halo de degradação de 14 mm e
seu índice enzimático foi de 1,16 mm, demonstrando atividade positiva para a
enzima protease, assim como Pardo et al. (2022).

Tabela 1: Atividade enzimática de protease de fungos filamentosos presentes em ambientes

aquáticos de Santarém, Pará, Brasil.
Diâmetro do halo de degradação (mm) Diâmetro da colônia Índice enzimático
(mm) (mm)
Curvularia 40 34 1,17
Dichotomopilus 15 10 1,5
Penicillium 27 20 1,35
Talaromyces 14 12 1,16
Aspergillus 0 5 0

676
 Foi observado que as culturas miceliais de Curvularia sp. obtiveram
crescimento radial rápido do micélio em meio de cultura ágar-leite e
aparecimento do halo translúcido, comparado ao isolado Dichotomopilus sp.,
para o qual o crescimento foi relativamente lento. Na literatura não há relatos
sobre o gênero Dichotomopilus sp. como produtor de protease. Culturas miceliais
de Aspergillus sp. não demonstraram atividade para a enzima protease e seu
índice enzimático foi igual a 0. A literatura demonstra trabalhos que relatam
grande positividade para este gênero, sendo ele responsável por produção de
níveis de atividade enzimática elevados e, portanto, considerados como bons
produtores da enzima protease (Carvalho et al. 2012; Queiroz e Sousa 2020).

Conclusões
As cinco colônias testadas foram identificadas através da morfologia e
identificação molecular e revelaram cinco espécies com potencial biotecnológico,
para as quais os resultados obtidos demonstraram a atividade enzimática
qualitativamente das cepas fúngicas do gênero Curvularia sp., Dichotomopilus
sp., Talaromyces sp. e Penicillium sp., sendo este último o gênero que
apresentou maior índice enzimático. Nas condições analisadas as cepas não
apresentaram índices enzimáticos considerados ideais, porém esse estudo
demonstra a necessidade de aplicação de metodologia mais específicas para
potencializar a atividade enzimática apresentadas pelas culturas.

Agradecimentos
Agradecimentos à Universidade Federal do Oeste do Pará e ao
Laboratório de Micologia e Bioensaios.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Atividades enzimáticas de fungos ascomicetos associados ao

basidioma de Hymenochaetaceae (Basidiomycota)

Couceiro, Douglas de Moraes1; Almeida, Maria de Fátima Oliveira1; Rodrigues,

Rafael de Souza1; Souza, Afonso Duarte Leão1; Astolfi Filho, Spartaco1; Souza,
Antonia Queiroz Lima1

1Universidade Federal do Amazonas

Email: [email protected]

Resumo
Os macrofungos, Ascomycota e Basidiomycota, são produtores de enzimas de
aplicação comercial (e.g. amilase, celulase e protease) cujo interesse se dá
principalmente pela facilidade de obtenção dessas enzimas. Neste estudo,
observamos a produção de enzimas por fungos ascomicetos isolados de
basidiomasde Hymenochaetaceae coletados nos Estados do Acre e Amazonas.
Isolados de ascomicetos foram obtidos em meio de cultura generalista (Batata
Dextrose + Extratode levedura líquida) a partir de fragmentos higienizados de
basidioma de Hymenochaetaceae (Fomitiporia bambusarum, F. neotropica,
Fuscoporia gilvus, Hymenochaete damicornis, Phylloporia spathulata). A
produção das enzimas foiconfirmada por meio da mensuração (média) dos halos
de fundição em meio de cultura específico. Foram obtidas dez cepas de
ascomicetos, as quais foram positivaspara produção de proteases (halo de 7,94
mm), amilase (halo de 12,32 mm) e celulase(halo de 13,69 mm) com resultados
promissores a partir de 72 horas. Os fungos ascomicetos associados às espécies
de Hymenochaetaceae apresentam grande potencial para produção de enzimas
de interesse biotecnológico, porém são necessários novos estudos para
entender a relação entre esses táxons e ampliar as possibilidades de
biosprospecção enzimática desses fungos amazônicos.

Palavras-Chave: Agaricomycetes; Amazônia; Enzimas.

Introdução
Os macrofungos, Ascomycota e Basidiomycota, podem atuar como
promissoras fontes de alimentos, sendo algumas espécies amplamente
conhecidas comercialmente como Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach
(champignon) e Lentinula edodes (Berk.) Pegler (shitake), espécies como
Penicillium chrysogenum Thom e Sarocladium strictum (W. Gams) Summerb.,
são produtoras de compostos bioativos e enzimáticos, como a penicilina e a
cefalosporinas respectivamente (García-Estrada et al. 2020; Serpa et al. 2022).
Outras substâncias igualmente importantes de prospectar, como as enzimas
proteases, celulases e lacases, tambémpode ser de origem fúngica, podendo ser

679
produzidas por fungos ascomicetos associados a basidiomicetos (De Silva et al.
2013; Krupodorova et al. 2021).
As enzimas são proteínas ou RNA catalisadas de reações químicas que
se tornam essenciais para o sistema metabólico de todos os organismos vivos.
O potencial catalítico específico dos fungos, está associado à sua conformação
nativa que pode ser afetada pela temperatura, pH e força iônica (Orlandelli et al.
2012). Entreas enzimas, encontram-se as amilases, usadas na indústria para
degradar amido, principalmente quando utilizado em alimentos, detergentes,
tecido, bebidas,alimentação, produção de papel e fermentação (Adrio e Demain
2014; Chapman et al. 2018).
O grupo das ligninocelulases são enzimas utilizadas na produção de
vinho, cerveja e suco de frutas, consideradas as mais importantes para a
bioconversão de biomassa lignocelulósica em biocombustível de segunda
geração (Okal et al. 2020). As proteases são enzimas que contribuem para várias
reações químicas e bioquímicas em indústrias de alimentos, bebidas,
farmacêutica e cosmética, hidrolisando ligações peptídicas em proteínas e
polipeptídeos (Uyar e Baysal 2004). Essas enzimas podem variar conforme a
sua disponibilidade e seu uso em escala industrial ainda é limitado por seus altos
custos de produção e obtenção, além de que sua atividade é frequentemente
limitada a uma gama restrita de característicasbioquímicas (Akhtar et al. 2013).
O objetivo desta pesquisa foi detectar a produção de enzimas por fungos
ascomicetos isoladosde basidiomas de espécies de Hymenochaetaceae.

Material e Métodos
Os espécimes utilizados de Hymenochaetaceae são provenientes da
Fazenda Experimental do Catuaba - UFAC (10°03'25.8"S, 67°36'00.9"W),
Reserva Florestal doHumaitá (9°45'49.36"S, 67°38'25.54"O), ambas localizadas
no Estado do Acre, e na Fazenda Experimental da UFAM (2°39'1.12"S,
60°3'12.30"O), localizado no Estado do Amazonas. Os espécimes foram
coletados e herborizados conforme o método de Fidalgo e Bononi (1999).
Fragmentos dos basidiomas de Hymenochaetaceae coletados foram
submetidos a assepsia para isolamento dos ascomicetos a partir do método
adaptado de Souza et al. (2004), para os quais foram necessárias várias
repicagens para obtenção da cultura puras. Essas culturas foram submetidas a

680
microcultivos para indicação taxonômica ao menor nível possível. Foi realizada
a extração de DNA comsequenciamento das regiões ITS 1 e ITS2 do rDNA para
as culturas puras dos fungos ascomicetos. Para os Hymenochaetaceae
coletados foram realizadas complementação de análises macromorfológicas e
micromorfológicas para identificação (Ryvarden 2004).
Para o ensaio enzimático, foram inoculados fragmentos dos fungos
ascomicetos em frascos de Erlenmeyer de 50 mL de capacidade contendo 20
mL demeio de cultura líquido Batata Dextrose, acrescido de extrato de levedura
(BD+L) e incubados a 26,5 ºC, durante oito dias a 120 rpm, em duplicata.
No oitavo dia, com auxílio de bomba a vácuo e kitassato, o meio foi filtrado
comfunil de buchner e filtros de papel para separar completamente o micélio do
meio de cultura e obtenção do extrato enzimático, os quais foram mantidos em
tubo Falcon de15 mL em duplicata a -20 oC até o ensaio qualitativo. Para isso
foram preparados 200mL dos seguintes meios de cultura específicos: (i) ágar-
gelatina-leite (3,6 g de ágar +20 g de solução de gelatina 10% incolor + 20 g de
solução de leite desnatado 10% + 0,1 M tampão citrato fosfato [0,0373 g de ácido
cítrico + 0,0733 g de fosfato de sódiodibásico], pH 5,0 ); (ii) ágar-CMC (3,6 g de
ágar + 2 g CMC + 1,6406 g de 0,1 M tampãode acetato de sódio, pH 5,0); (iii) ágar-
amido (3,6 g de ágar + 2 g de amido + 0,1 M tampão citrato-fosfato [0,0373 g de
ácido cítrico + 0,0733 g de fosfato de sódio dibásico], pH 5,0). Estes meios de
culturas, após esterilizados em autoclave por 15 minutos a 121°C, foram vertidos
em placas de Petri (200 mm de diâmetro) até 6 mm de altura. Após solidificados,
30 poços de 6 mm de diâmetro foram perfurados em cada placa de Petri,contendo
os diferentes meios de cultura, nos quais foram inoculados 100 µL de cada
extrato enzimático em triplicata e mantidos a 28 ºC. O controle desse
experimento consistiu em meio líquido na ausência dos fungos ascomicetos, além
de poço de igualtamanho e profundidade sem meio (branco). As observações
iniciaram após 24 horase duraram até o extrato enzimático se fundir ao meio de
cultura.
Para a revelação enzimática, as placas de Petri com os poços foram
coradas com 10 mL de solução de ácido acético 2% para revelar a presença de
protease, 10 mL de vermelho de Congo 1% ideal para celulase e 10 mL de
solução de lugol para revelar a presença da enzima amilase. Essas ficaram em
repouso por 30 minutos e logo após, foram mensurados o diâmetro dos halos

681
(mm) com auxílio de uma régua milimetrada pelo verso da placa de Petri, sendo
confirmado usando o software Image J1.53 e 64x.
Para análise de dados foi inicialmente testado o pressuposto de
normalidade (shapiro-wilk) e as médias dos halos foram comparados utilizando
uma Análise de Variância (ANOVA) de uma direção, sendo o Teste de Tukey
realizado a posteriori nosoftware R 3.5.2 (R Core Team 2012) usando o pacote
Vegan (Oksanen et al. 2015).

Resultados e Discussão
Os fungos Hymenochaetaceae coletados foram identificados como
Fomitiporia bambusarum (Rick) Camp.-Sant. & Decock, F. neotropica Camp.-
Sant., Amalfi, R.M. Silveira, Robledo & Decock, Fuscoporia gilvus (Schwein.) T.
Wagner & M. Fisch., Hymenochaete damicornis (Link) Lév., Phylloporia
spathulata (Hook.) Ryvarden. Desses espécimes foram obtidas dez cepas de
ascomicetos, das quais foram observadas por meio da técnica de cup plate a
presença das enzimas amilase (12,32 mm), protease (7,94 mm) e celulase
(13,69 mm) (Tabela 1).

Tabela 1. Relação das cepas dos fungos ascomicetos obtidas a partir de isolamentos dos
basidiomasde Hymenochaetaceae com suas respectivas atividades enzimáticas.
Média do halo (mm)
Organismo de isolamento Organismo obtido Amostras
Amido Celulase Protease
ab
Fuscoporia gilvus Chaetomium globosum A2 12,67 13,67ª 10,00ab
b
Hymenochaete damicornis Xylariales sp. A3 12,67 11,67ª 10,67ab
Fuscoporia gilvus Chaetomium globosum A5 12,33ª 15,33ª 12,67ª
Hymenochaete damicornis Xylaria sp. A7 12,00ab 13,67ª 10,33ab
Hymenochaete damicornis Xylaria sp. A8 12,00a 15,67ª 7,67b
Hymenochaete damicornis Xylaria sp. A10 13,00ab 13,00a 8,33b
ab
Phylloporia spathulata Xylaria sp. A12 13,33 13,33ª 8,33b
ab
Fomitiporia bambusarum Xylaria sp. A14 12,67 12,67ª 10,67ab
ab
Hymenochaete damicornis Chaetomium globosum A15 12,00 13,67ª 7,33b
ab a
Fomitiporia neotropica Colletotrichum sp. A19 13,33 13,00 9,33ab
Controle CO 11,00ab 14,33ª 0,00c
Desvio padrão ±0,66 ±1,10 ±12,67
Médias com letras iguais nas colunas não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%.

O aspecto visual dos meios de culturas após a revelação com os corantes

específicos indicam a presença das enzimas. Assim, halos de degradação com
zonas escuras indicam a presença de celulase e amilase, e, zona mais clara
apontam a presença de protease (Figura 2). Comparando as médias, estas

682
foram significativas para celulase (ANOVA F= 3,11, p< 0,01) e protease (ANOVA
F= 22,09, p< 0,001), mas não foram diferentes para amilase. Entre as cepas dos
ascomicetos, o Teste deTukey é significativo para o contraste das amostras A2-
A10 (p< 0,009), A3-A10 (p< 0,020) e A5-A10 (p< 0,095) para celulase, e na
protease nas amostras A15-A10, A19-A10, A2-A10, A3-A10, A5-A10, A7-A10,
A8-A10, Controle-A10, A14-A12, A15-A12, A19-A12 (p< 0,000), e A2-A12, A3-
A12 e A5-A12 (p< 0,001).

Figura 1 - Detecção de atividades de amilase, celulase e protease (halos) por fungos

ascomicetosassociados aos basidiomas de Hymenochaetaceae.

Discussão
Neste estudo, foi observado que a atividade das enzimas amilase,
celulase e protease, obtidas das cepas de ascomicetos isoladas dos basidiomas
dos fungos Hymenochaetaceae, foram evidenciadas utilizando o meio de cultura
simples a base de Batata Dextrose, acrescido de extrato de levedura, e, portanto,
sem indução específica considerando as técnicas tradicionais. Isso torna os
resultados elucidativose desertam para novas formas de bioprospectar os fungos
da Amazônia, região com pouco investimento em pesquisa de base. Embora
deva-se considerar que a formaçãodos halos nos diferentes meios de culturas
surgiu entre 48 e 72 horas, indicando quea ação enzimática sem indutor leva
mais tempo para incorporar ao meio específico.

683
 Os ensaios qualitativos enzimáticos demostraram êxito na primeira parte,
posteriormente o início da produção de metabolitos secundários será avaliado
com o intuito de validar a abordagem e suas vantagens. Em geral, os
macrofungos lignocelulolíticos produzem um grande número de celulases e
amilases, usadas na natureza para degradação de polissacarídeos da parede
celular vegetal (Marian et al. 2022). Na região Amazônica, a popularização
técnica de bioprospecção é de grande importância, pois os macrofungos
constituem um dos maiores produtores de enzimas com importância
biotecnológica e potencial industrial (Baldrian 2008), como mostradopor nossos
resultados positivos qualitativos.
Em comparação ao estudo de Souza et al. (2008), que avaliaram a
produção de amilase e protease de cepas de basidiomicetos em meio líquido,
usando indutor, os resultados do presente estudo são semelhantes, com a
formação de halos menores. Com a técnica de cup plate para protease,
obtivemos resultados positivo, embora com menor formação de halo, similar ao
observado por Souza et al. (2008) para quatro espécies de basidiomicetos. No
entanto, as métricas obtidas nesse tipo de análise podem variar de acordo com
as espécies fúngicas, principalmente em táxons associados a outros grupos
(Bezerra et al. 2021), como os fungos ascomicetos alvos dessa investigação.
Além de ser influenciada também pelos componentes presentes no meio de
cultura, principalmente fontes de carbono e nitrogênio, pH e temperatura, tempo
de incubação e até mesmo o tamanho do inóculo (Haddar et al. 2010).

Conclusões
Os ascomicetos associados aos basidiomas de Hymenochaetaceae
foram capazes de produzir atividades enzimática. No entanto, pela técnica
aplicada, as enzimas mais evidentes e produzidas em maior quantidadeforam as
amilases e celulases. Para as celulases, o meio de cultura CMC contribuiu com
os maiores halos, enquanto para as proteases, o meio de cultura agar- gelatina-
leite não beneficiou a formação de halos expressivos. A técnica aplicada nesse
estudo é de baixo custo e atende as necessidades da pesquisa de base
considerando a necessidade de intensificar estudos em bioprospecção de fungos
na Amazônia e aumentar a produção de enzimas de interesse para a
biotecnologia.

684
 Agradecimentos
Os autores agradecem os recursos concedidos da RESOLUÇÃO N.
008/2021 - POSGRAD 2021/FAPEAM pelo Programa de Pós-Graduação em
Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal (PPGBionorte) para coletas
de Hymenochaetaceaeno estado do Acre e A Fundação de Amparo a Pesquisa
do Estado do Amazonas (FAPEAM) pelas bolsas de doutorado e pós-doutorado
para realização desses estudos na região Amazônica.

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Avaliação de fungos endofíticos do gênero Aspergillus spp.

isolados de Myrcia guianensis como produtores de
biossurfactantes

Soares, Angélica Ribeiro1; Rodrigues, Juliana Gisele Corrêa1; Albuquerque,

Patrícia Melchionna1

1Universidade do Estado do Amazonas

Email: [email protected]

Resumo
O número de pesquisas voltadas para a produção de biossurfactantes cresceram
de modo significativo nas últimas décadas. Estas moléculas anfifílicas oriundas
demicrorganismos apresentam uma miríade de aplicações industriais. Apesar do
potencial auspicioso, fungos endofíticos são pouco utilizados como produtores
de biossurfactantes. Diante disto, este estudo teve por objetivo avaliar a
produção de biossurfactantes oriundos de quatro linhagens de fungos
endofíticos isolados da espécie amazônica Myrcia guianensis. Os fungos foram
reativados e cultivados em meio líquido contendo óleo de soja (0,5 g/L). A
presença de moléculas tensoativas foi avaliada por meio de ensaios de
emulsificação e das medidas de tensão superficial do meio de cultivo fúngico. As
linhagens testadas demonstraram baixa atividade emulsificante. Contudo, todas
apresentaram redução da tensão superficial, com destaque para o fungo
Aspergillus sp. F8 com redução de 20,4%. Os resultados evidenciam o potencial
para a produção de biossurfactantes que pode ser aprimorada por meio de
mudanças metodológicas.

Palavras-Chave: Bioprocessos; Tensoativos; Fungos Amazônicos

Introdução
Biossurfactantes são moléculas anfifílicas de origem microbiológica
(fungos, bactérias e leveduras) que possuem aplicações em indústrias variadas,
como a de fármacos, cosméticos e alimentos (Santos et al. 2016; Nitschke e Silva
2018; Moldes et al. 2020). Por conta da composição química, são substitutos
viáveis para seus pares sintéticos, os surfactantes, que provocam danos
ambientais, devido à toxicidade e baixa biodegradabilidade (Palmer, Hatley
2018).
Em comparação com as bactérias, biossurfactantes de origem fúngica são
menos explorados em pesquisas científicas (Sena et al. 2018). Este número
torna-seainda mais escasso em relação aos fungos endofíticos; microrganismos

687
encontrados no interior de espécies vegetais, que despertam interesse por conta
da produção significativa de compostos bioativos importantes, como
antimicrobianos, antioxidantes, enzimas, entre outros (Rana et al. 2019, Gurgel
et al. 2020, Batista et al. 2022) [PA1]. Por conta dos benefícios ecológicos e
industriais, somados à escassez de informações acerca da produção de
biossurfactantes por fungos isoladosde espécies amazônicas, este trabalho teve
como objetivo avaliar a produção de moléculas tensoativas em metabólitos
obtidos a partir do cultivo submerso de fungosdo gênero Aspergillus sp. isolados
da espécie amazônica Myrcia guianensis (Myrtaceae).

Material e Métodos
Os fungos filamentosos do gênero Aspergillus utilizados neste estudo
estão depositados na Central de Coleções Microbiológicas da Universidade do
Estado do Amazonas (CCM/UEA). Foram utilizadas linhagens isoladas de galhos
e folhas de Myrcia guianensis (Myrtaceae) que se encontravam armazenados
segundo a técnica de Castellani (1939).
O cultivo em meio líquido foi realizado segundo Silva (Silva 2019), sendo
composto por MgSO4 (0,5 g/L), Na2HPO4 (3,0 g/L), KH2PO4 (1,0 g/L) e extrato de
levedura (1,3 g/L), acrescido de 0,5 g/L de óleo de soja filtrado em membrana de
0,22µm (adicionada ao meio após autoclavagem). O meio de cultura sem inóculo
fúngico foi utilizado como controle. Com o meio homogeneizado, foi feita a
inoculação por meio de fragmentos do micélio, sendo incubados em shaker
durante 7 dias a 28°C e 170 rpm. O cultivo foi realizado em triplicata.
Para o índice de emulsificação (E24), foi feita uma mistura de 6 ml de
querosenee 4 ml do meio líquido filtrado. Após agitação em vórtex durante 2
minutos, a misturapermaneceu em repouso. Passadas 24 h, o E24 foi calculado
por meio da divisão entrea altura da camada de emulsão pela altura total do líquido
(Cooper e Goldenberg 1987; Silva 2015).
A tensão superficial foi medida pelo método de anel de Du Nouy (1925),
utilizando um tensiômetro Krss-K20 à temperatura ambiente (22°C a 25°C). Água
ultrapura foi utilizada para a calibração do equipamento (Walter et al. 2010;
Pereira et al. 2017).

688
 Resultados e Discussão
Os resultados demonstraram que a capacidade de reduzir a tensão
superficiale de formar emulsão não são correlatas. O meio de cultivo apresentou
uma tensão superficial de 55,7 mN.m-1. Este valor foi reduzido em todos os meios
após o cultivo fúngico. A linhagem F8 se destacou por promover uma redução
de 20,4% na tensão superficial. Consoante Twigg et al. (2021), um
biossurfactante com atividade superficial e interfacial ótima é capaz de reduzir a
tensão superficial para valores próximos ou abaixo de 35 mN.m-1 (Twigg et al.
2021).

Tabela 1. Índice de emulsificação (E24) e Tensão Superficial (TS) dos meios de cultivo das
linhagensfúngicas avaliadas, após sete dias de cultivo.
Linhagem fúngica E24 (%) TS (mN.m-1)
Controle - 55,7 ± 0,02
Aspergillus sp. F1 - 42,65 ± 0,43
Aspergillus sp. F8 - 35,3 ± 0,11
Aspergillus sp. F9 - 52,8 ± 0,29
Aspergillus sp. F20 - 45,8 ± 0,54

A ausência de emulsões estáveis e a redução da tensão superficial indicam

queo biossurfactante produzido pertence ao grupo de biossurfactantes de baixo
peso molecular, como glicolipídios, lipopeptídeos e fosfolipídeos (Drakontis e
Amin 2020). Este grupo está associado à maior redução da tensão superficial
presente tanto em líquidos imiscíveis, quanto na superfície ar/água. Enquanto os
de alto peso molecularsão mais utilizados para estabilizar emulsões óleo/água,
sendo chamados de bioemulsificantes (Uzoigwe et al. 2015).

Conclusões
Fungos endofíticos amazônicos do gênero Aspergillus sp. demonstraram
aptidão para produzir moléculas tensoativas. Todas as linhagens apresentaram
redução na tensão superficial, sendo a F8 a mais promissora. Em nenhuma das
linhagens ocorreu a formação de emulsão. A otimização do cultivo fúngico
poderá produzir resultados mais satisfatórios.

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Efeito dos parâmetros nutricionais na produção de corante por

Penicillium gravinicasei P3SO332

Oliveira, Luciana Aires1; Segundo, Walter Oliva Pinto Filho1; Cortez, Ana Cláudia
Alves2; Souza, Érica Simplício1; Souza, João Vicente Braga2

1Universidade do Estado do Amazonas, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

Email: [email protected]

Resumo
Corantes sintéticos têm sido criticados por serem causadores da poluição
ambiental,efeitos adversos em humanos e tem sofrido severas restrições pela
legislação quanto as suas aplicações. Os corantes produzidos por fungos
filamentosos possuem diversas características que despertam interesse no uso
biotecnológico. O presente estudo investigou a influência dos parâmetros
nutricionais na produção de corante por Penicillium gravinicasei P3SO332 (um
isolado do solo Amazônico). A espécie foi identificada pelo sequenciamento da
região espaço interno transcrito (ITS) do DNAr. Foram realizados bioprocessos
submersos com cinco fontes de carbono (sacarose, glicose, amido de milho,
maltose e carboximetilcelulose - CMC) e quatro fontes de nitrogênio (nitrato de
sódio, sulfato de amônio, peptona e extrato de levedura).Penicillium gravinicasei
P3SO332 exibiu a produção de um corante de tonalidade amarelo e uma maior
produção foi observada quando o amido de milho foi usado comofonte de carbono
e peptona como fonte de nitrogênio no bioprocesso submerso. A partir dos
resultados encontrados neste estudo, concluiu-se que fungos isolados do solo
Amazônico são potenciais produtores de corantes.

Palavras-Chave: Amazônia; meio de cultivo; nutrientes

Introdução
Os corantes disponíveis no mercado, em sua grande maioria, são de
fontes sintéticas e têm sido criticados por serem causadores da poluição
ambiental e pelos inúmeros efeitos adversos em humanos pelo seu uso em longo
prazo. E portanto, tem sofrido severas restrições pela legislação quanto as suas
aplicações (Mapari et al. 2010). Os corantes produzidos por fungos filamentosos
possuem diversas características que despertam interesse no uso
biotecnológico desses compostos como aditivos e intensificadores de cor na
indústria alimentar, tingimento de tecidos, formulação de cosméticos e fármacos,
entre outros. Além, da produção de diversos metabólitos com diferentes
atividades biológicas (Malik et al. 2012; Gessler et al. 2013; Lopes et al. 2013).

692
 A produção de corantes por fermentação microbiana permite pequenos
espaços, larga escala, crescimento em substratos simples, independência das
condições climáticas, otimização das condições de cultivo e a extração e
obtenção do produto final pode ser realizada de modo simples, econômico e
eficiente (Lebeau et al. 2017; Sigurdson et al. 2017; Venkatachalam et al. 2020).
Uma espécie fúngica promissora produtora destes compostos deve ser capaz
de assimilar uma variedade de fontes de carbono e nitrogênio, converter o
substrato em produto de forma eficiente com altos rendimentos. Porém, a
composição do meio de cultura e outros fatores como pH, aeração e temperatura
podem influenciar a produção de corantes por fungos (Pereira 2008; Sutthiwong
et al. 2014). Mediante o exposto, o presente estudo investigou a influência dos
parâmetros nutricionais na produção de corante por Penicillium gravinicasei
P3SO332 (um isolado do solo Amazônico).

Material e Métodos
Obtenção e identificação do isolado Penicillium gravinicasei P3SO332
O isolado fúngico foi obtido de amostra de solo Amazônico coletada na
zona florestal localizada na Reserva Biológica de Campina (2°35'19,19"S, 60°
1'59,91"O) Manaus, Brasil. Para o isolamento, foi utilizado o método de diluição
seriada (1×10-1 - 1×10-3) empregando a técnica de espalhamento em placas
contendo Ágar Sabouraudestéril e incubação a 28ºC±2 por 5-7 dias.
A espécie foi identificada pelo sequenciamento da região espaço interno
transcrito (ITS) do DNAr. O DNA fúngico foi extraído do micélio pelo método
fenol:clorofórmio:álcool-isoamílico (Ferrer et al. 2001). Reações de PCR (22,5 µL
de tampão (1X), 5 µL de MgCl2 (2,5 mM), 2 µL de DNTPs (200 µM), 5 µL de ITS1
(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3')
(White et al. 1990) e água ultrapura para um volume final de 30 μL) foi realizado
no termociclador SuperCyclerTM SC-200 (Kyratec) usando as seguintes
condições de amplificação: 94ºC/5 min, 30 ciclos de 94ºC/30 s, 53ºC/30 s, 72ºC/1
min e 72ºC/10 min. Os produtos de PCR (8 µL) foram visualizados em luz UV
após eletroforese (3 μL de SYBR® Safe (Invitrogen), 2 μl de Orange 6X
(Fermentas), 10 µL de DNA Ladder de 100 pb, 40 min/100 V/100 A) em um gel de
agarose a 1,5% em tampão TBE 1X. Os produtos de PCR foram purificados por
precipitação com polietilenoglicol (20% p/vPEG, 2,5 M NaCl).

693
 A reação de sequenciamento foi realizada utilizando o kit BigDye®
(Applied Biosystem). O sequenciamento foi realizado no Applied Biosystems
3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). As sequências obtidas foram
analisadas pelo BioEdit Sequence Alignment Editor e comparadas com as do
banco de dados GenBank. Uma árvore filogenética foi construída utilizando o
programa MEGA X v10.2.4 para verificar a relação genética e evolutiva entre
essas sequências.

Efeito dos parâmetros nutricionais na produção do corante

Foram realizados bioprocessos submersos com cinco fontes de carbono
em uma concentração de 30g/L (sacarose, glicose, amido de milho, maltose e
carboximetilcelulose - CMC) e quatro fontes de nitrogênio contendo 3g/L (nitrato
de sódio, sulfato de amônio, peptona e extrato de levedura) tendo como meio
base caldo Czapeck (50 mL) em frascos Erlenmeyer (125 mL) onde foi inoculado
uma suspensãode esporos de 104 células/mL. Uma varredura entre 400 nm a 700
nm foi realizada emespectrofotômetro UV/VIS a partir do extrato de acetato de
etila para estimar a produção do corante (Celestino et al. 2014).

Resultados e Discussão
O isolado Penicillium sp. P3SO332 foi identificado como Penicillium
gravinicasei P3SO332 (99% Acesso: MG600581.1) e suas sequências de
nucleotídeos foram submetidas ao GenBank com o número de acesso
OP563023. Fungos do gênero Penicillium são relatados como potenciais
produtores de substâncias de interesse biotecnológico, como corantes
(Takahashi e Carvalho 2010; Dufossé et al. 2014; Narendrababu e Shishupala
2017). Neste estudo, Penicillium gravinicasei P3SO332 exibiu a produção de um
corante de tonalidade amarelo, o que corrobora com os achados da literatura
(Anelli et al. 2018). A absorbância máxima foi observada em 400 nm com uma
maior produção quando o amido de milho (2,8 ±0,1 UA) foi usado como fonte de
carbono e peptona (0,9 ±0,1 UA) como fonte de nitrogênio no bioprocesso
submerso (Figura 1 A, B).

694
Figura 1: Efeito dos parâmetros nutricionais na produção de corante amarelo por Penicillium
gravinicasei P3SO332. Letras diferentes representam diferenças significativas de acordo com o
teste t-Sudent (p<0,05).

As necessidades nutricionais variam para cada micro-organismo e as

fontes de carbono e nitrogênio a serem utilizadas na fermentação devem ser
escolhidas com cuidado, pois as mesmas podem interferir na expressão e
regulação de genes responsáveis pela produção de corantes e
consequentemente no rendimento final, pois, cerca de 50% de carbono e 10% de
nitrogênio compõem a massa de células dos microorganismos (Chatterjee et al.
2009).
Penicillium sclerotiorum 2AV2 produziu em maior eficiência o pigmento
amarelo-alaranjado ao ser adicionada peptona como fonte de nitrogênio em
fermentações líquidas (Celestino et al. 2014). A produção de melanina foi
otimizada utilizando-se peptona em bioprocesso com a espécie endofítica
Spissiomyces endophytica SDBR-CMU319 (Suwannarach et al. 2019).
Os melhores resultados foram observados em meio de cultivo contendo
peptona para produção do pigmento vermelho de Talaromyces australis e para
o pigmento amarelo de Penicillium murcianum (Hernández et al. 2019).

Conclusões
Considerando os resultados encontrados neste estudo, concluiu-se que a
espécie Penicillium gravinicasei P3SO332 é potencial produtora de corantes.
Portanto, novos estudos podem ser realizados avaliando a estabilidade e
possíveis aplicabilidades deste composto.

695
 Agradecimentos
Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas (FAPEAM) pelo financiamento da pesquisa no âmbito da Chamada
Universal FAPEAM-006/2019.

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697
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Produção coagulante por uma espécie de Penicillium em

resíduo da fruticultura amazônica

Brito, Ana Kezia Pimentel1; Pimenta, Laynah1; Barbosa, Elliza Emily Perrone1;
Batista, Samara Cláudia Picanço1; Martim, Salomão Rocha2; Teixeira, Maria
Francisca Simas1

1Universidade Federal do Amazonas, 2Universidade Nilton Lins

Email: [email protected]

Resumo
As proteases são exploradas por diversos setores industriais, destacando -se no
setor alimentício pela vasta aplicação, sendo muito utilizada na indústria de
laticínios na fabricação de queijos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
produção de enzimas de coagulação do leite de uma espécie de Penicillium em
resíduo agroindustrial e determinar parcialmente seu perfil enzimático para
aplicação na produção de queijo. Nesta pesquisa foi avaliada uma espécie de
Penicillium da Coleção de Fungos da Amazônia-CFAM/FIOCRUZ - AM: P.
fellutanum CFAM 60 cultivada em ágar Czapeck Extratdo de Levedura em placa
de Petri, mantendo os cultivos a 25oC, durante sete dias. Foram cultivados 10
disco miceliais em EL+FA (Exocarpo de Laranja [Citrus sinensis]+ Farelo de
Arroz), EM+FA (Exocarpo de Maracujá [Passiflora edulis] + Farelo de Arroz),
ST+FA (Semente de Tucumã [Astrocaryum tucuma] + Farelo de Arroz), ET+FA
(Exocarpo de Tucumã [Astrocaryum tucuma] + Farelo de Arroz). suplementado
com farelo de arroz e incubados a 28 ºC durante oito dias. Após oito dias o extrato
foi filtrado a vácuo. Para a determinação da atividade das proteases utilizou-se
150µL do extrato e 250µL de azocaseina em tampão Tris-HCl, pH 7,2, realizando
a leitura a 440nm. A determinação da atividade coagulante foi a 40 ºC em um
período de 40 minutos. Temperatura (35 a 45 ºC e pH (5-10) ótimos foram
determinados conforme a metodologia de determinação de atividade coagulante.
Nos resultados obtidos a produção significativa de proteases coagulantes foi
determinada em EL+FA (7,50 U) e EM+FA (1,66 U). Os demais substratos
(ST+FA e ET+FA) demonstraram biossíntese inferior de enzimas. As proteases
coagulantes de P. fellutanum demonstram o potencial destes biocatalisadores na
indústria de alimentos, em especial na elaboração de queijos.

Palavras-Chave: Enzimas; Penicillium fellutanum; Resíduo agroindustrial

Introdução
As proteases são enzimas que pertencem ao grupo de hidrolases que tem
a capacidade de clivar proteínas em peptídeos e aminoácidos. São exploradas

698
por diversos setores industriais como farmacêutico, alimentício, de detergentes
e de couro. No último ano, movimentaram cerca de US$ 781,73 milhões com
estimativa de crescimento de 6,41%, atingindo em 2028 US$ 1135,15 milhões
(Martim et al. 2017; Marketwatch 2023).
Com a crescente demanda comercial, a busca por novas fontes naturais
e renováveis de proteases cresce constantemente. Dentre as principais fontes
de enzimas proteolíticas as de origem fúngicas tem se destacado pela excreção
natural, alta capacidade de produção, fácil manipulação genética e características
bioquímicas favoráveis para uso em diversas aplicações comerciais (Batista et
al. 2021; Prado et al. 2021).
No setor alimentício, na fabricação de laticínios devido ao aumento da
produção de queijo gerou aumento do custo e escassez do coalho animal,
condição está impulsionando a procura de novas fontes de proteases
coagulantes (Beux et al. 2017).
Neste contexto, espécies de Penicillium vêm se destacando como
produtores de proteases coagulanttes. P. citrinum (Mabrouk et al. 1976), P.
expansum (Abdel- Fattah et al. 1987) e P. oxalicum (Hashem 1999) são espécies
que cientificamente são citados como produtores de coagulantes e usados na
fabricação de queijo, dados que possibilitam a efetivação de investigação acerca
de outras espécies.
Os objetivos desta pesquisa foram avaliar a produção de enzimas de
coagulação do leite de uma espécie de Penicillium em resíduo agroindustrial e
determinar parcialmente seu perfil enzimático para aplicação na produção de
queijo.

Material e Métodos
Reativação e manutenção das culturas
Nesta pesquisa foi avaliada uma espécie de Penicillium da Coleção de
Fungos da Amazônia-CFAM/FIOCRUZ - AM: P. fellutanum CFAM 60. Das
culturas preservadas em água destilada foram retirados fragmentos de micélio e
transferidos para tubo de ensaio contendo meio de cultura Ágar Czapek Extrato
de Levedura (CYA) e os cultivos foram mantidos a 25 °C por sete dias.

699
Fermentação em estado sólido para produção de proteases
Resíduos Lignocelulósicos
A espécie P. fellutanum foi submetida à fermentação em estado sólido.
Foram utilizados os resíduos lignocelulósicos da fruticultura amazônica,
provenientes de feiras da cidade de Manaus, EL+FA (Exocarpo de Laranja [Citrus
sinensis ]+ Farelo de Arroz), EM+FA (Exocarpo de Maracujá [Passiflora edulis] +
Farelo de Arroz), ST+FA (Semente de Tucumã [Astrocaryum tucuma] + Farelo
de Arroz), ET+FA (Exocarpo de Tucumã [Astrocaryum tucuma] + Farelo de
Arroz). Cada resíduo foi suplementado com farelo de arroz - FA.

Tratamento dos Resíduos Lignocelulósicos

Os resíduos foram lavados em água corrente para retirada do excesso de
sujeira, em seguida, higienizados com solução desinfetante para hortifrutícolas
contendo cloro ativo 0,85% (p/p). Após 15 minutos foram submetidos à lavagem
sucessiva, seguindo a drenagem do excesso de líquido. Cada resíduo foi
misturado com RB e a umidade e o pH aferidos para 60% e 6,0, respectivamente.
Os substratos foram acondicionados em frascos Erlenmeyer. Os frascos
contendo as misturas de resíduos foram esterilizados a 121 ºC, durante 60
minutos, por três dias consecutivos, procedendo ao resfriamento por 24 horas.
Após, foram inoculados 10 discos miceliais e incubados a 28 ºC durante 8 dias
(Brito et al. 2021).

Extração das proteases sintetizadas por P. fellutanum cultivados em

resíduos lignocelulósicos
As proteases foram extraídas em água destilada esterilizada na razão 5:1
(água: resíduo lignocelulósico, v/p) sob agitação (180 rpm), a 25 °C. Após 30
minutos, o extrato bruto foi recuperado por filtração em tecido de musseline,
posteriormente filtrado a vácuo, seguido de centrifugação (8.000 x g/5 minutos).
Em seguida, o extrato foi filtrado usando a membrana polietersulfônica 0,22μ.
Após obtenção do extrato foram realizados os estudos de determinação de
atividade proteásica e caracterização enzimática (Fonseca et al. 2014).

700
Determinação da atividade proteolítica
A atividade proteolítica foi determinada segundo Leighton et al. (1973),
utilizando-se azocaseína a 1% como substrato enzimático. Uma unidade de
atividade de protease foi definida como a quantidade de enzima necessária
para produzir variação de absorbância igual a 0,01 em 60 minutos.

Determinação da Atividade Coagulante

A atividade coagulante do leite foi determinada de acordo com Arima et
al. (1970). Como substrato foi utilizado leite desnatado 10% (p/v) (Itambé, Belo
Horizonte, Minas Gerais, Brasil), diluído em CaCl2 0,05M, pH 5,8 (Martim et al.
2017). Dessa solução foi transferido 5 ml para cada tubo reação, seguindo a
incubados a 40º C, em banho-maria com agitação interna (Marconi MA 179).
Após 15 minutos foi adicionado 0,5 ml do extrato enzimático bruto, seguindo a
homogeneização da mistura e incubação durante 40 minutos. A atividade
coagulante foi determinada como positiva após formação de coágulos na parede
do tubo. O resultado foi expresso com base na formação de coágulo e a forma
de separação do soro do leite visualizado nos tubos de ensaio em: coagulação
forte (coágulo distinto e soro abundante) ou coagulação fraca (coagulação sem
separação visual de soro) (Alecrim et al. 2017). Uma unidade de atividade
coagulante foi definida como a quantidade de enzima necessária para coagular
1 mL de substrato em 40 minutos a 40 °C. Todos os experimentos foram
realizados em triplicata. A atividade coagulante foi calculada de acordo com a
equação 2. Equação 2. U= onde 2400 = tempo total do ensaio de atividade
coagulante em segundos; =volume de leite (mL); E =volume do extrato bruto
utilizado (mL); e =tempo de formação do coágulo, em segundos.

Caracterização Parcial da Atividade Coagulante de P. fellutanum

Determinação do efeito da temperatura e pH na atividade das
proteases coagulantes do leite
Para determinação do pH de atividade ótima da enzima coagulante foi
elaborada solução de leite desnatado 10% (p/v) nos seguintes tampões (0,1 M):
Citrato (pH 4), Acetato (pH 5 e 6), Tris-HCl (pH 7 e 8) e Glicina-NaOH (pH 9 e
10). A temperatura ótima de atividade foi avaliada em diferentes faixas (30º C a

701
55º C), utilizando a solução de leite 10% (p/v) diluída em tampão de pH ótimo,
como substrato. Todos os sistemas de reação e o branco foram incubados
conforme citado anteriormente (determinação da atividade coagulante).

Análises estatísticas
Os resultados experimentais foram expressos como média ± erro padrão
da média e submetidos à análise de variância (ANOVA), seguida de teste de
Tukey que determinou a significância das diferenças observadas nas amostras,
ao nível de significância de 5%, usando o programa Minitab, versão 19.0.

Resultados e Discussão
P. fellutanum CFAM 60 sintetizou e excretou proteases em todas as
misturas de substratos (Figura 1). Na atividade de proteases o cultivo de P.
fellutanum que apresentou atividade significativa foi EL+FA (600,27 U/mL). Em
EM+FA, ST+FA e ET+FA as atividades foram 17%, 14,16% e 12,21% inferiores
quando comparadas aos cultivos em EL+FA (Tabela 1). Sousa et al. (2016), ao
avaliar P. implicatum em fermentação submersa observou atividade proteolítica
de 504,90 U/mL, dado inferior ao encontrado em P. fellutanum em substrato a
base de Laranja.

702
Figura 1 - Fermentação em estado sólido de P. fellutanum CFAM 60 em diferentes substratos.
A. EL+FA, B. EM+FA, C. ST+FA, D. ET+FA.

A atividade coagulante e a força de coagulação estão descritas na tabela

1. A produção significativa de proteases coagulantes foi determinada em EL+FA
(7,50 U) e EM+FA (1,66 U). Os demais substratos (ST+FA e ET+FA)
demonstraram biossíntese inferior de enzimas. De acordo com Schuster et al.
(2019), as enzimas coagulantes fúngicas são frequentemente produzidas em
condições de cultivo submerso. Entretanto, também há sucesso na fermentação
em estado sólido para a produção e excreção de enzimas proteolíticas
coagulantes, corroborando com os dados obtidos.
Diversos autores reportaram que espécies de Penicillium são fontes de
proteases coagulantes. (Mabrouk et al. 1975; Ahmed et al. 1987; Hashem 1999;
Hashem 2000).

Tabela 1. Atividade coagulante e força de coagulação de P. fellutanum CFAM 60.

Substrato Atividade proteolítica (U/ml) Atividade coagulante (U) Força de coagulação
EL+FA 600,27 ± 0,01 ª 7,50 ± 0,01a Fraca
EM+FA 102,00 ± 0,04? 1,66 ± 0,004b Fraca
ST+FA 85,00 ± 0,02? 1,34 ± 0,06bc Fraca
ET+FA 73, 87± 0,02 ? 1,02 ± 0,03c Forte
EL+FA (Exocarpo de Laranja + Farelo de Arroz), EM+FA (Exocarpo de Maracujá +Farelo de
Arroz), ST+FA (Semente de Tucumã + Farelo de Arroz), ET +FA (Exocarpo de Tucumã + Farelo

703
de Arroz). Médias que não compartilham a mesma letra são significativamente diferentes Teste
de Tukey (p<0,05).

Quanto à força da coagulação das proteases coagulantes foi observado

que P. fellutanum fermentado em substrato a base de exocarpo de tucumã
sintetizou enzimas com forte coagulação (presença de coágulo). Contudo, os
extratos brutos de EM+FA, EL+FA e ST+FA apresentaram coagulação fraca,
sem formação de coágulo e ausência de soro abundante (Figura 2).
Segundo Prado et al. (2021), a seleção de uma nova fonte de proteases
coagulantes é complexa pois alguns fatores como pH, conteúdo de metais,
temperatura e especificidade enzimática influenciam na coagulação e devem ser
levados em consideração. O que influencia na investigação do perfil enzimático
da enzima obtida na fermentação em estado sólido.

Figura 2 - Classificação da força de coagulação das proteases de P. fellutanum CFAM 60. A.

ET+FA coagulação forte, B. EM+FA coagulação fraca e C. EL+FA coagulação fraca sem formação
de coágulo.

As enzimas coagulantes do leite sintetizadas por P. fellutanum

apresentaram atividade ótima em pH levemente ácido (pH 5,0). Nos pHs 6,0, 7,0,
8,0, 9,0 e 10 não foi observada atividade coagulante. A atividade ótima de
temperatura foi determinada em 35 º C (Figura 3).

704
Figura 3 - Efeito da temperatura na atividade das enzimas coagulantes de Penicillium fellutanum
CFAM 60.

Penicillium roqueforti, submetido a fermentação em resíduo de casca de

cacau, apresentou atividade ótima em pH 11 a 50ºC (Nogueira et al. 2022).
Segundo Qasim et al. (2022), Mucor racemosus expressou proteases
coagulantes com características ótimas de atividade em pH 4,8 a 45 ºC. Dado
similar ao encontrado neste trabalho.

Conclusões
Penicillium fellutanum em substrato agroindustrial a base de tucumã
sintetizou e excretou proteases com forte coagulação do leite bovino . As
proteases coagulantes expressaram atividade catalítica significativa em pH 5,0 a
35 °C. As características bioquímicas das proteases da espécie P. fellutanum
demonstram o potencial destes biocatalisadores na indústria de alimentos, em
especial na elaboração de queijos.

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Sistema de Duas Fases Aquosas. XII Seminário Brasileiro de Tecnologia
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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Produção de proteases por Aspergillus oryzae var effusus para

usoem processo industrial

Pimenta, Laynah1; Batista, Samara Claudia Picanço1; Barbosa, Elliza Emily

Perrone1; Brito, Ana Kezia Pimentel1; Castro, Syandra Baiatones2; Azevedo,
Evila Silva Mortagua2; Martim, Salomão Rocha2; Teixeira, Maria Francisca Simas1

1Universidade Federal do Amazonas, 2Universidade Nilton Lins

Email: [email protected]

Resumo
O potencial uso enzimas proteolíticas de origem microbiana se destaca por ser
muitoutilizado no setor industrial devido as condições desejáveis para uso em
processos biotecnológicos por serem considerados biocatalisadores de fácil
acesso, baixo custo e não tóxicos. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a
produção e caracterizar as proteases sintetizadas por Aspergillus oryzae var
effesus DPUA 930. A cultura matrizfoi preparada em ágar Sabouraud e mantida
por sete dias a 25 ºC e a autenticação daespécie foi realizada em culturas obtidas
em Czapek (CZ) e ágar Czapek Levedura Autolisado (CYA). Para produção das
proteases, a espécie foi cultivada em meio líquido [GYP (glicose, extrato de
levedura e peptona)]. E a fermentação foi conduzidaem agitador orbital 150 rpm,
25 ºC. Após oito dias a massa micelial foi separada por filtração a vácuo em
papel Whatman nº 1. O extrato bruto recuperado foi novamente filtrado em
membrana polietersulfônica de 0,45μL. Na determinação da atividade das
proteases foi utilizado como substrato azocaseína 1% (p/v), em tampão Tris-
HCl pH 7.2. Os resultados mostraram a eficiência da produção de A. oryzae
proteases em todos nos meios testados, porém com atividade significativa no
meio GYP (77,30 U/mL), com atividade ótima em pH 5,0 e temperatura 50 ºC.
Esses resultados sugeremque essas enzimas podem ser utilizadas em diversos
segmentos industriais, como alimentícia em produções de queijos e outros
laticínios.

Palavras-Chave: Proteases; Fermentação submersa; Biotecnologia

Introdução
As proteases são grupos de enzimas que atuam na decomposição de
proteínasem aminoácidos e, são biocatalisadores que têm grande importância
econômica devido a sua aplicabilidade em diversos setores industriais (Razzaq
et al. 2019). Ovalor das proteases, no mercado global de proteases, em 2023,
está estimado em US$ 2,1 bilhões, com previsão de atingir US$ 4,6 bilhões até
2033 (Future MarketInsights 2023).

708
 Enzimas proteolíticas podem ser obtidas de animais, vegetais e
microrganismos. Entretanto, os fungos vêm se destacando como fontes
vantajosas de proteases devido à diversidade bioquímica, susceptibilidade à
manipulação genética e alta capacidade de produção de enzimas extracelulares
que são facilmente recuperadas por filtração (Araújo et al. 2020).
Entre os fungos filamentosos, Aspergillus oryzae é considerado um
excelente produtor de proteases que podem ser aplicadas as áreas da medicina
veterinária, farmacêutica, cosmética, entre outras (Zhao et al. 2019). As
enzimas proteolíticas A. oryzae também destaque no setor alimentício, sendo
essenciais na fabricação de produtos fermentados, como miso (pasta de soja),
shoyu (molho de soja), tane-koji (malte de arroz), ducha (soja preta fermentada
e salgada), tempero de tofu e vinagre (Daba et al. 2021).
A fermentação submersa é a tecnologia mais utilizada pela indústria para
produção de proteases em larga escala, por apresentar condições padronizadas
de pH, temperatura, aeração e nutrientes do meio de cultivo. Porém, para uso
em larga escala as características bioquímicas dessas enzimas devem ser
conhecidas (Rigo et al. 2021).
Considerando a necessidade crescente de novas fontes de proteases com
características catalíticas apropriadas para atender à demanda industrial, este
estudo teve como objetivo avaliar a produção de proteases por Aspergillus oryzae
var effesus DPUA 930 por fermentação submersa e proceder a caracterização
bioquímica dessesbiocatalisadores.

Material e Métodos
Microrganismo
Neste estudo foi utilizado Aspergillus oryzae var effesus DPUA 930,
cedido do acervo da Coleção de Culturas DPUA, da Universidade Federal do
Amazonas-UFAM.Para obtenção da cultura viável, a espécie foi cultivada em
placas de Petri contendo ágar Sabouraud e mantida a 25 °C por oito dias para
posterior utilização nos experimentos (Prado et al. 2021).

Autenticação da espécie com base nas características morfológicas

Para autenticação da linhagem, A. oryzae var effesus DPUA 930 foi
cultivado em ágar Czapek (CZ) e ágar Czapek Levedura Autolisado (CYA). As

709
placas foram incubadas a 25 °C por oito dias e após o período de incubação, as
características macroscópicas das colônias, como: diâmetro, coloração, textura,
topografia, difusão de pigmento e presença de exsudato foram coletadas (Raper
e Fennel 1977; Prado et al. 2021).

Fermentação submersa
No cultivo em meio líquido, discos miceliais do cultivo em ágar Sabouraud
foramtransferidos para frascos de Erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL de
meio líquido, GYP (glicose, extrato de levedura e peptona). Os frascos foram
mantidos em agitadororbital, a 150 rpm, 30 °C por sete dias. Após o período de
incubação, a biomassa foi separada por filtração à vácuo em papel de filtro. Para
determinação da atividade enzimática os extratos foram submetidos a filtração
em filtros de membrana polietersulfônica de 0,45 μm (Prado et al. 2021).

Determinação da atividade proteolítica

Avaliação qualitativa da atividade proteolítica
Para determinação da atividade de proteases foi utilizado o extrato bruto
e discos miceliais. No procedimento para determinação da atividade de
proteases utilizando discos miceliais, foram retirados da cultura teste três discos
miceliais de 8mm, e inoculados na superfície do ágar leite. Para o procedimento
de determinaçãoda atividade das proteases utilizando extrato bruto, retirou-se
100µl do extrato enzimático e foram feitos "cup plates" de 8 mm de diâmetro do
ágar para inoculação.Os cultivos foram mantidos a 25 ºC por 7 dias. A produção
das enzimas foi observada pela formação dos halos enzimáticos, os quais foram
medidos em seu diâmetro e os resultados expressos em mm. Para a
determinação do Índice de Atividade Enzimática(IAE), foi utilizada a equação 1,
conforme descrita em Teixeira et al. (2011): diâmetrodo hallo (mm)/ diâmetro do
poço (mm). O microrganismo é considerado como um bomprodutor de enzimas
em meio sólido quando o valor do IAE é maior ou igual a 2,0 (Teixeira et al. 2011).

Determinação quantitativa da atividade proteolítica

O método utilizado para quantificação das enzimas proteolíticas no extrato
bruto foi executado conforme descrito por Prado et al. (2021). Na mistura
reacional foi utilizado 250 μL do substrato (Azocaseína 1,0% p/v em Solução

710
Tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6) e 150µL do extrato bruto recuperado da
fermentação submersa. Essa mistura foi incubada durante 60 minutos a 25 °C,
em ausência de luz, incluindo o branco. A reação foi interrompida pela adição de
1,2 mL de ácido tricloroacético 10 %p/v, seguida de centrifugação por 10 minutos
a 8000 x g, a 4ºC. Em seguida, 800 μl do extrato recuperado foram transferidos
para tubos de ensaio contendo 1,4 mL de hidróxido de sódio 1 M e a leitura
realizada a 440 nm. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Uma
unidade de protease foi definida como a quantidade necessária para promover
variação de absorbância igual a 0,1 por minuto durante 60minutos e expressa
em U/mL.

Determinação do efeito do pH e temperatura ótima na atividade proteolítica

Para determinação do efeito do pH na atividade proteolítica, foi utilizada
solução de azocaseína 1,0 % (p/v) diluída em tampão Acetato de Sódio (pH 5,0 e
6,0), Tris-HCl (pH 7,0 e 8,0) e Glicina-NaOH (pH 9,0 e 10). O efeito da
temperatura foi realizado nas temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70 °C. A
determinação do efeito do pHe temperatura foram processadas conforme o item
2.5 (Pimenta et al. 2021).

Análise Estatística
Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva média, desvio
padrão, gráficos e os cálculos de atividade enzimática (R2 ≥ 95%) por análise de
variância (Anova) e teste Tukey (ρ < 0,05) para comparação de médias,
utilizando o software Minitab ® versão 17.0.

Resultados e Discussão
Nos testes de autenticação foi confirmada a viabilidade A. oryzae var
effesus com base nas características morfológicas nos cultivos oriundos de
culturas preservadas em óleo mineral e água destilada (Prado et al. 2021).
Nas condições de cultivo, A. oryzae var effesus DPUA 930 produziu
proteases de valor significativo quando avaliado pelos métodos do Bloco de
Gelose e Perfuraçãopor poço, demonstrando valores de halo, em média, 18 mm
e 20 mm, respectivamente, com atividade proteolítica significativa pelo método
de perfuração por poço. O IAE (índice de atividade enzimática) resultou em 2,0

711
mm, dados que comprovam que essa espécie tem potencial como fonte de
proteases. A formação dehalos translúcido e o IAE também foram verificados por
Benchaya et al. (2022), nas análises com Aspergillus niger. O método da
perfuração por poço é uma dos mais aplicadas na avaliação qualitativa
enzimática, pois subsidia a verificar desde os menores níveis enzimáticos
produzidos por microrganismos (Filho et al. 2022).
Na avaliação quantitativa de proteases foi verificada atividade de 77,30
U/mL. Em estudos com outras espécies de Aspergillus sp. foi observado valores
similares (Prado et al. 2021; Benchaya et al. 2022) Muitos fatores são capazes
de influenciar a produção de enzimas, como a fisiologia do fungo, composição
físico- químico dos meios, condições padronizadas (Filho et al. 2022).
O efeito do pH na atividade de proteases de A. oryzae var effesus DPUA
930 está demonstrado na figura 1, houve excreção de proteases em todos os pH
testados.A atividade significativa foi determinada, em média, pH 5, apresentando
89% com ação catalítica maior que quando comparada ao pH 10. Resultados
similares foram obtidos por Filho et al. (2022) que em estudos com Aspergillus
flavus encontraram o pH 5 com atividade significativa. Porém, em outros estudos,
de Benchaya et al. (2022) verificaram o pH 7 em condições ótimas para
Aspergillus niger. As divergências nos resultados podem ser justificadas pelo tipo
de solução, concentração do meio de cultura, presença de agentes redutores
(Pimenta et al. 2021).

Figura 1 - Efeito do pH na atividade de proteases de A. oryzae var. effesus DPUA 930, nos
cultivosrealizados em meio líquido.

Valores de pH de 5 a 8, sugerem uma ampla aplicabilidade industrial, o

pH 5 infere que essas proteases são aplicáveis na indústria de alimentos para

712
melhoria dovalor nutricional dos alimentos e podem ser utilizadas na produção
de bebidas e laticínios (Denti et al. 2022).
A atividade significativa das proteases foi verificada em 50 ºC, ocorrendo
redução da atividade catalítica em temperaturas superiores (Figura 2). Dados
similares são encontrados em estudos de Araújo et al. (2020) a mesma faixa de
temperatura quando cultivaram Aspergillus oryzae em fermentação em estado
sólido.A temperatura influencia diretamente na capacidade catalítica da enzima
e através desse processo é possível sugerir em qual ramo industrial a enzima
pode ser aplicada (Pimenta et al. 2021).

Figura 2 - Efeito da temperatura na atividade de proteases produzidas por A. oryzae var. effusus
DPUA930 utilizando cultivo em meio líquido.

Conclusões
Os resultados obtidos revelam que A. oryzae var effesus DPUA 930
sintetiza eexcreta enzimas proteolíticas com potencial catalítico para aplicação
em vários processos industriais, principalmente na indústria de alimentos.
Estudos posteriores são necessários a fim de expandir o conhecimento e
aplicação biotecnológica das proteases produzidos por essa espécie oriunda do
bioma amazônico.

Agradecimentos
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), ao Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado do Amazonas
(FAPEAM) e à Universidade Federal do Amazonas (UFAM), pelo apoio técnico,
científico e financeiro.

713
 Referências
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e temperatura para máxima atividade de proteases de Aspergillus oryzae NRRL
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714
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Tecnologia verde: recuperação da prata de filme de Raio-X

processado com proteases de fungo

Batista, Samara Claudia Picanço1; Perrone, Elliza Emily1; Brito, Ana Kézia
Pimentel1; Pimenta, Laynah1; Martim, Salomão Rocha2; Nóbrega, Jordane
Pimentel3; Souza, Leidyane de Souza1; Teixeira, Maria Francisca Simas1

1UniversidadeFederal do Amazonas, 2Universidade Nilton Lins, 4Universidade Federal

de Pernambuco
Email: [email protected]

Resumo
A prata é um metal amplamente utilizada industrialmente devido às notáveis
propriedades físico-químicas, sua recuperação de subprodutos beneficia o meio
ambiente e, contribui para a preservação de reservas naturais existentes em todo
o mundo. Existem poucos estudos que demonstram o uso de proteases de
microrganismos para recuperação de prata em filmes de raios-X. Por este motivo,
este trabalho teve como objetivo remover a prata de filmes de raios-X utilizando
proteasesproduzidas por Aspergillus flavus DPUA 516 cultivado em meio líquido.
As proteases foram produzidas por cultivo em meio líquido, em condições
padronizadas. Desse processo fermentativo realizado em 72 horas, o extrato
bruto foi recuperado por filtração a vácuo em papel de filtro, em seguida em
membrana filtrante polietersulfônica 0,22μ. Em seguida foi determinada a
atividade quantitativa e verificado a influência do pH e temperatura para uso no
uso na extração da prata do filme de Raio-X. Na extração da prata foram
utilizados fragmentos de filme de raios- X, em frascos de Erlenmeyer de 50 ml
contendo 5 ml de extrato enzimático. A soluçãocontendo os filmes foi mantida em
agitador orbital a 50 °C, 180 rpm. No extrato enzimático recuperado da
fermentação foi avaliado a atividade proteolítica e efeito do pH e temperatura
dessas enzimas. A atividade proteolítica foi de 18,02 ± 0,17 U/ml e, pH e
temperatura ótima 6,0 - 50 ºC, respectivamente. Estas enzimas quando utilizadas
na remoção da camada proporcionaram a degradação da camada de gelatina
impregnada nos filmes de Raio-X proporcionando recuperação de 0,199 g de
prata, uma perda de peso de 43,73%, dado obtido com base na diferença de peso
dos filmesde Raio-X, antes e após o processo de extração da prata. A prata de
filmes de raios-X foi removida com sucesso e recuperada com bom rendimento
utilizando proteases produzidas por A. flavus.

Palavras-Chave: Aspergillus flavus; Protease; Recuperação de metais

Introdução
A prata comumente está sendo utilizada em grandes quantidades para
diversosfins, principalmente na indústria fotográfica. Os filmes de raio X são uma
rica fonte deprata, que é distribuída na camada de gelatina, revestido em ambos
os lados por material radioativo, com sensibilidade à luz (Al-Abdalall et al. 2016).

715
 Dentre os métodos de recuperação de prata, os mais utilizados é a
oxidaçãode prata metálica seguido por eletrólise, e queima dos filmes, além da
remoção dacamada de prata-gelatina usando enzimas proteolíticas microbianas.
Na recuperaçãode prata por queima dos filmes ocasiona poluição ambiental e
riscos à saúde, além de gerar odor fétido indesejável. Este método é oneroso,
considerando o custo demanutenção do forno e o tratamento da fuligem, efluente
e fumaça (Choudhary 2013).
Os processos aplicados para recuperar prata de raio X devem ser
rentáveis e deve ter mínimo impacto no meio ambiente. Um método alternativo
viável, constitui nouso de proteases que degrada a camada de gelatina presente
na camada de emulsão do filme de raio X. Ao término desse bioprocesso há
liberação e recuperação da prata,sem causar contaminação ambiental (Lakshmi
et al. 2016).
Normalmente os processos enzimáticos tem um alto grau de
especificidade e removem a camada de gelatina do filme de raios X em poucos
minutos sem danificara base do filme de poliéster (Lakshmi et al. 2016).
A ação enzimática nas camadas de gelatina no filme de raios X permite
não sóa recuperação da prata, mas também da base de poliéster, que pode ser
reciclada (Lakshmi et al. 2016). As enzimas de fonte microbiana são livres de
poluição e rentável (Choudhary 2013). Desta forma, existe há a necessidade de
desenvolver estudos de recuperação de prata com utilização de enzimas por
Aspegillus, pois a adoção desses métodos é ecologicamente correta, renováveis
e viáveis.
O objetivo desta pesquisa foi verificar o potencial de recuperação de prata
com utilização de enzimas produzidas por Aspegillus.

Material e Métodos
Microrganismo
A espécie selecionada para investigação foi Aspergillus flavus DPUA
516,cedido pela Coleção de Culturas do Departamento de Parasitologia
(DPUA) da Universidade Federal do Amazonas-UFAM. Como inóculo foi
preparada suspensão celular no cultivo em Czapek+Extrato de Levedura 0,5%
[(p/v) CYA], inclinado, em tubos de ensaio. Após 7 dias de cultivo foi adicionado

716
10 ml de água destilada esterilizada. A massa micelial foi desprendida utilizando
uma alça de níquel cromo e,em seguida o tubo foi agitado no agitador de tuco.

Produção das proteases cultivo em meio líquido (Fermentação submersa)

A fermentação foi realizada em frascos de Erlenmeyer de 125 ml contendo
meiolíquido [Extrato de Malte e Peptona de carne 0,5% (p/v)]. Para cada frasco
de Erlenmeyer foi transferido 1000 μL da suspensão celular preparada na cultura
de Aspergillus flavus DPUA 516, em ágar CYA. Os cultivos foram mantidos em
agitador orbital a 150 rpm, a 30 °C, por 72 horas. Ao final do processo
fermentativo, o extrato bruto foi recuperado por filtração a vácuo utilizando papel
de filtro. As amostras de extrato bruto, para determinação da atividade das
proteases foram submetidas a filtro para seringa membrana em seguida em
membrana filtrante polietersulfônica 0,22 µm.

Avaliação da atividade proteolítica quantitativa

A atividade proteolítica foi determinada quantitativamente segundo
metodologiadescrita por Kirsch et al. (2013). No tubo reação foram adicionados
250 μL do substrato azocaseína 1,0% (p/v), em tampão 0,1 M Tris-HCl, pH 7,2 a
150 μL de cadaextrato bruto. A mistura da reação foi incubada a 25 ºC por uma
hora em câmara escura, seguindo-se a adição de 1,2 ml de ácido tricloroacético
10% (p/v) e centrifugado a 4 ºC, 10.000 xg por 5 minutos. Do sobrenadante foram
retirados 800 µL para adição em 1,4 ml de NaOH 1 M. Uma unidade de
atividade proteolítica foi definida como a quantidade de enzima capaz de produzir
um aumento na absorvânciade 0,01 em uma hora, a 440 nm, expressa em U/mL.

Determinação do pH e da temperatura ótima das proteases

Na determinação do pH ótimo foram utilizados tubos de ensaio
adicionados de150 µL do extrato bruto e 250 µL de azocaseína (1%, p/v) diluída
nos tampões: acetatode sódio (pH 5,0 e 6,0), Tris-HCl (pH 7,0 e 8,0) e glicina-
NaOH (pH 9,0 e 10,0). Em seguida, a atividade proteolítica foi determinada
conforme descrito no item anterior. Na determinação da temperatura ótima, a
mistura reacional (azocaseína diluída em tampão de pH ótimo + extrato
enzimático) foram incubados em câmara escura, por uma hora nas temperaturas
de 30, 40, 50, 60, 70 e 80 °C (Kirsch et al. 2013).

717
Recuperação da prata de filmes de raios-X
O processo de extração da prata do filme de raio-X (Fluxograma 2) foi feita
de acordo com Kumaran et al. (2013). Os filmes foram lavados com água
destilada e higienizado com papel de filtro impregnado com etanol.
Posteriormente os filmes foram secos em estufa a 40 ºC por 30 min e cortados
em fragmentos de 4x4 cm2. Emseguida, nos fragmentos do filme de Raio-X foi
adicionado 100 mL do extratoenzimático. O pH desse extrato foi ajustado para
6,0. A mistura, contendo os filmes de Raio-X foram mantidos a 50 ºC, em banho-
maria com agitação contínua. Como controle foi utilizado fragmento de Raio-X,
substituindo o extrato enzimático por solução tampão de pH 6,0.

Resultados e Discussão

Atividade Quantitativa das Proteases e efeito do pH e temperatura

utilizadas na extração da prata
Proteases têm destaque em processo industrial, são usadas como aditivo
em detergentes, na fabricação de produtos alimentício, farmacêutico e, em
especial, narecuperação de resíduos e da prata dos filmes de raio-X (Fonseca et
al. 2014; Martim et al. 2017). Nesta pesquisa na investigação das enzimas
proteolíticas de Aspergillus flavus, os resultados mostraram atividade de
proteases igual a 18,02 ± 0,17 U/ml, noextrato recuperado do cultivo em meio
líquido, utilizando azocaseína como substrato.Nas análises de determinação do
efeito do pH na atividade dessas proteases, na faixa de 5,0 a 10,0, as enzimas
foram ativas em todos os pHs, com máxima atividade em pH 6,0. Porém, a
partir do pH 7,0 a 10 foi registrada redução da atividade enzimática, atingindo
50,31% em pH 10,0 comparado aos valores em pH 6,0 (Figura 1). Enzimas com
maior atividade na faixa de pH 5,0-8,0 são classificadas como neutras e têm
valiosa aplicação na indústria de alimentos (Teixeira et al. 2011; Souza et al.
2015; Razzaq et al. 2019). Resultados similares foram observados por Benchaya
et al. (2022), na determinação da influência do pH na atividade de proteases
Aspergillus clavato flavus. Nessa investigação também foi verificada a redução
da atividade em pH de valores superiores. Prado et al. (2022) ao analisar A.
oryzae em condições semelhantes, as enzimas proteolíticas apresentaram
atividade significativaem pH 5,0.

718
Figura 1. Efeito do pH na atividade proteolítica de Aspergillus flavus DPUA 516 cultivado em meio
líquido.

A figura 2 mostra o efeito da temperatura na atividade das proteases de

Aspergillus flavus. Os resultados dessas análises mostraram que a máxima
atividade catalítica foi determinada a 50 °C. Em temperaturas inferiores ou
superiores a essa atividade proteolítica foi observada a redução a 30 °C e 80 °C
de 52,29% e 31,58%, respectivamente. (Figura 2).

719
Figura 2. Efeito da temperatura na atividade proteolítica de Aspergillus flavus DPUA 516
cultivado em meio líquido.

Benchaya et al. (2022) em seu estudo para avaliar o efeito da temperatura

na atividade de proteases, foi observado atividade dessas enzimas em todas as
faixas de temperaturas (30°C -70°C), contudo, o valor significativo foi registrado
a 50°C. Em outra investigação realizada com proteases de A. oryzae, os dados
revelaram atividade significativa a 50 °C, ocorrendo redução de atividade nas
temperaturas superiores (Prado et al. 2022).

Extração da Prata de Filme de Raio-X utilizando proteases de Aspergillus

flavus
A prata tem aplicação em diversos processos para diversos
fins, particularmente na indústria fotográfica e filme de Raio X. Cerca de 60%
de toda a prata produzida é utilizada na indústria fotográfica, e uma quantidade
consideráveldesse metal é recuperado do filme fotográfico gasto e das soluções
de processamento (Cameron 2009). Dessa forma, os métodos usados na
recuperar prata de resíduossão importantes na redução de custos e tempo, e
têm um efeito positivo na poluiçãoambiental. Neste estudo, nos experimentos
realizados para extração da prata dos filmes de Raio-X teste, foi utilizado
proteases recuperadas do cultivo de A. flavus emmeio líquido. A extração da
prata foi realizada por imersão dos filmes de Raio-X no extrato enzimático
proteolítico (Figura 3).

720
Figura 3. Filme de Raio-X sem ação das proteases (A) e, ao término do processo da extração da
prata(B).

A expressão do quantitativo de prata extraída foi realizada com base no

peso inicial dos filmes de Raio-X teste (Kumaran et al. 2013). Ao término do
bioprocesso da extração da prata, os resultados demonstraram rendimento de
0,199 g de prata. Ea perda de peso foi de 43,73% com base no peso inicial dos
fragmentos do filme de Raio-X (Kumaran et al. 2013). Observou-se que durante
a reação, em 60 minutos, a 50 ºC, sob agitação, a camada de gelatina foi
completamente degradada. (Choudhary, 2013; Kumaran et al. 2013).
Choudhary et al. (2013) em estudos utilizando Aspergillus versicolor para
recuperação de prata com proteases, obteve 0,135 g de prata, rendimento
equivalentea 0,335%. Nessa extração, a decomposição total da gelatina foi de 20
minutos, a 50ºC.Nos estudos de Cavello et al. (2013), na extração de prata com
proteases de Purpureocillium lilacinum, a degradação parcial da camada de
gelatina foi 41,0%, após15 minutos. Nessas análises, degradação completa da
gelatina foi observada após 33 minutos.

Conclusões
Aspergillus flavus DPUA 516 sintetiza proteases extracelular com
atividade ótima em pH neutro e temperatura 50 ºC. Essas proteases se mostram
eficazes na hidrólise da matriz de gelatina impregnada com prata, da camada
de revestimentos dos filmes de Raio-X, facilitando a extração da prata dos
721
respetivos filmes. Ao términoda extração da prata, a base plástica transparente
dos filmes foi o resíduo restante ao término do processo de extração da prata.

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723
MICROBIOLOGIA MÉDICA

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Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Atividade larvicida de fungos Trichoderma isolados da região

Amazônica contra o vetor Aedes aegypti

Nonato, Mesaqueuri Mota1,2; Araújo, Francys Sayara Andrade1; Ríos-Velásquez,

Cláudia María1; Moya, Kemily Nunes da Silva1; *Aquino, Priscila Ferreira1

1Instituto Leônidas & Maria Deane/Fiocruz Amazônia, 2Universidade Federal do

Amazonas
E-mail: [email protected]

Resumo
A dengue é considerada problema de saúde pública em regiões de climas
tropicais. Porém, o controle dessa doença está sujeito a eliminação do vetor.
Para isso, o controle é realizado, principalmente, com inseticidas químicos e este
tem levado populações de mosquito à resistência. Desse modo, a utilização de
fungos entomopatogênicos têm sido vistos como alternativa promissora de
bioinseticidas, pois atuam via contato, ingestão e são menos agressivos aos
humanos e meio ambiente. Logo, essa pesquisa teve como objetivo avaliar a
atividade larvicida de diferentes fungos Trichoderma isolados da região
Amazônica contra o vetor Ae. aegypti. Para isso, cepas fúngicas foram
selecionadas e reativadas da coleção de fungos (CFAM) do Instituto Leônidas &
Maria Deane (ILMD). Para cada espécie, foi formulado uma suspensão de
conídios em cinco diferentes concentrações e verificados quanto a taxa de
germinação. Após isso, vinte larvas de 3° instar foram expostas às
concentrações durante 7 dias, com a mortalidade larval verificada a cada 24
horas. Os ensaios foram conduzidos com cinco réplicas. Uma análise estatística
foi realizada utilizando o software Minitab. Com isso, foram selecionadas cinco
diferentes espécies do gênero Trichoderma (T. harzianum CFAM1308, T. virens
CFAM252, T. atroviride CFAM1375, T. gamsii CFAM44 e T. asperellum
CFAM256). Nos bioensaios, as espécies T. harzianum, T. gamsii e T. asperellum
apresentaram as maiores taxas de mortalidade larval, variando entre 80%-100%
para as maiores concentrações. Esse efeito foi visível a partir da concentração
1x107 conídios/mL e se intensificou com a concentração 1x108 conídios/mL.
Aliás, entre as cepas, destaca-se o T. asperellum que ocasionou em média, a
mortalidade de 84% dos indivíduos após 24 horas e de 100% em 72 horas,
sugerindo que esta cepa possui um alto potencial. Portanto, esses dados podem
ser considerados pertinentes na investigação de novas cepas com atividade
entomopatogênica contra a fase larval do Ae. aegypti.

Palavras-chave: Amazônia, Controle biológico, Fase imatura, Fungos

entomopatogênicos.

725
 Introdução
O Aedes aegypti ocupa um lugar central entre os vetores de doenças
tropicais, sendo capaz de hospedar e transmitir uma ampla variedade de vírus,
como os causadores da dengue, Zika e chikungunya (WHO, 2017). Esse
mosquito é essencialmente urbano, antropofílico e encontrado em maior
abundância nas cidades (Valle et al. 2021). Esse vetor possui ciclo holometábolo,
compreendendo as quatro fases: ovo, larva (L1-L4), pupa e adulto. Em particular,
a fase imatura do Ae. aegypti é o período de alimentação e crescimento, com o
estágio larval durando cerca de 4 a 7 dias (Forattini 2002). Essa fase, em
especial, tem o potencial de ser o alvo mais adequado para a intervenção do
ciclo biológico devido a dispersão do vetor adulto (Bardach et al. 2019).
O combate desse vetor tem sido realizado com medidas de saneamento
nos domicílios e áreas adjacentes através de ações de conscientização da
população, armadilhas de oviposição e produtos químicos (Bardach et al. 2019).
Porém, o uso constante de inseticidas sintéticos tem gerado linhagens de Ae.
aegypti resistentes (Guedes et al. 2020). Nesse contexto, uma das alternativas
ao controle químico é o uso de bioinseticidas à base de fungos
entomopatogênicos, pois além de atuarem via ingestão e contato externo,
apresentam alta especificidade e segurança para o homem e o meio ambiente
(Samson et al. 2013).
Conceitualmente, os fungos entomopatogênicos são microrganismos que
parasitam o inseto, matando-os ou incapacitando-os (Samson et al. 2013). Estes
podem infectar diferentes estágios de desenvolvimento dos hospedeiros, sendo
essa, uma característica bastante desejável e específica desse grupo
(Sundaravadivelan e Padmanabhan, 2014; Ghosh et al. 2021). O processo de
interação entre o fungo e o inseto ocorre em quatro etapas: adesão, germinação,
penetração e a colonização da carcaça (Butt et al. 2016).
Além disso, a floresta Amazônica abriga inúmeras espécies com potencial
biotecnológico. As condições únicas e particulares existentes na Amazônia
podem vir a favorecer a seleção de cepas com virulência para seus hospedeiros
(Zanotto et al. 2012). Dentre esses, destacam-se os fungos do gênero
Trichoderma, um entomopatógeno de diversos artrópodes e que está presente
em solos Amazônicos (De Oliveira et al. 2021). Entretanto, ainda são escassos
os trabalhos desse gênero no controle dos diferentes estágios de vida do Ae.

726
aegypti. Deste modo, a seleção de espécies desse gênero que possam ser
virulentas às diferentes fases do vetor, pode contribuir com melhorias no controle
biológico do mosquito Aedes aegypti. Logo, essa pesquisa teve como objetivo
avaliar a atividade larvicida de cinco diferentes espécies de Trichoderma
isoladas da região Amazônica contra o vetor Aedes aegypti.

Material e Métodos
Este projeto se encontra cadastrado no Sistema Nacional de Gestão do
Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) sob o
número A021E78. Os ovos de Ae. aegypti foram cedidos pelo Insetário do
Laboratório de Ecologia de Doenças Transmissíveis na Amazônia (EDTA) do
ILMD/Fiocruz Amazônia. Para eclosão das larvas, os papeis filtros contendo os
ovos foram colocados em bandejas contendo água destilada e alimento para
peixe TetraMin (Tetra®) triturada. Após três dias, as larvas nascidas foram
separadas e alimentadas em dias alternados até o 3° estágio larval (L3).
Para a escolha das espécies, foi realizado um levantamento bibliográfico
a fim de identificar espécies fúngicas pertencentes ao gênero Trichoderma que
possuíam relatos na literatura de ação entomopatógena contra mosquitos e/ou
praga da agricultura. Após isso, as espécies foram selecionadas de acordo com
a disponibilidade na Coleção de Fungos da Amazônia (CFAM) do Instituto
Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz Amazônia).
Fragmentos do fungo foram transferidos para placas de petri contendo o
meio de cultura MEA (Extrato de Malte Ágar) para posterior preparo dos inóculos.
Esses foram incubados à 28°C por 15 dias. Após esse período, 10mL de água
destilada estéril com Tween 80 a 0,05% foram adicionados e o conteúdo foi
filtrado em gaze estéril; resultando assim, na suspensão estoque. Para a
determinação da concentração da suspensão estoque, utilizou-se a câmara de
Neubauer espelhada.
Para a contagem de esporos, preparou-se em paralelo, uma diluição de
1:20 e dessa, retirou-se 20 µL e aplicou em cada campo da câmara de Neubauer.
A contagem de conídios foi realizada em microscópio óptico utilizando o aumento
de 400 vezes (40x). A concentração foi obtida empregando os dados no software
CALIBRA®. Posteriormente, a solução estoque foi ajustada com água estéril

727
contendo Tween 80 a 0,05% para as concentrações 1x104, 1x105, 1x106, 1x107
e 1x108 conídios/mL. Para cada suspensão, a taxa de germinação foi calculada
através do teste de viabilidade (Francisco et al. 2006) e só foram utilizadas nos
bioensaios quando a germinação dos conídios era superior a 85%.
Os bioensaios larvicida foram realizados seguindo a metodologia de
Oliveira et al. (2021) com modificações. Estes foram realizados em copos
plásticos contendo 50mL de água destilada, vinte larvas de 3° ínstar, alimento
para peixe TetraMin (Tetra®) triturada e propágulo fúngico nas diferentes
concentrações: 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 e 1x108 conídios/mL. Estes
recipientes foram incubados à ± 25°C, fotofase de 14 horas e escotofase de 10
horas, durante 7 dias, com a verificação da mortalidade a cada 24 horas, sendo
as larvas mortas e/ou pupas retiradas durante a contagem. Para o branco, foi
aplicado água com Tween 80 a 0,05% sem conídios no mesmo volume utilizado
da concentração de 1x108 conídios/mL e no controle não foi realizado nenhum
tipo de tratamento.
Os ensaios foram realizados em cinco réplicas e uma repetição, de modo
que para cada cepa fúngica foram utilizadas 100 larvas de 3° ínstar (20 larvas
por réplica) para cada concentração, um branco e um controle, totalizando 540
larvas por fungo. A partir dos dados obtidos, foi calculado como indicador
entomológico a taxa de mortalidade larval, que corresponde à razão entre o
número de larvas mortas pelo número de larvas vivas iniciais no tratamento.
Uma vez verificada a normalidade dos dados, foram realizadas as
análises de variância (ANOVA) e o pós-teste de Tukey considerando um nível
de significância de 5%, a fim de verificar a diferença mínima significativa entre
os bioensaios com seus respectivos controles. Logo após, as análises de
frequência foram visualizadas mediante diagrama de caixa (Boxplot). Para as
análises descritivas e inferenciais, foi utilizado o programa estatístico Minitab®
19.1.

Resultados e Discussão
Cinco diferentes espécies pertencentes ao gênero Trichoderma foram
selecionadas (Tabela 1) com base em um extenso levantamento bibliográfico
realizado sobre ação entomopatogênica. Após isto, as espécies foram
selecionadas de acordo com a disponibilidade na Coleção de Fungos da
728
Amazônia (CFAM) do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz
Amazônia).

Tabela 1. Lista das espécies fúngicas selecionadas e reativadas para o estudo.

Gênero Espécie Acervo biológico N° de acesso
Trichoderma harzianum CFAM 1308
Trichoderma virens CFAM 0252
Trichoderma atroviride CFAM 1375
Trichoderma gamsii CFAM 0044
Trichoderma asperellum CFAM 0256

Quanto ao bioensaio, pode-se observar que a taxa de mortalidade das

larvas de 3° ínstar nos diferentes ensaios fúngicos, quando comparados com o
controle (MED=0% [0%-5%]) e o branco (MED=0% [0%-15%]) foram superiores.
Em específico, ressalta-se as espécies T. harzianum (MED=17% [4%-91%]), T.
gamsii (MED= 5% [2%-84%]) e T. asperellum (MED=6% [3%-98%]) que
apresentaram os maiores impactos sobre a mortalidade larval. Em contrapartida,
a espécie T. virens (MED=3% [2%-7%]) causou baixa mortalidade das larvas
(Figura 1).

Figura 1. Diagrama de caixa (boxplot) da taxa de mortalidade (%) das larvas de 3° instar de
Ae. aegypti exposto a diferentes espécies de Trichoderma.
A linha horizontal dentro da caixa representa a mediana e as letras iguais indicam que as
médias não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).

Quanto ao efeito das diferentes concentrações das espécies Trichoderma,

a dosagem 1x108 (MED=88% [7%-98%]; p<0,05) conídios/mL causou a maior
taxa de mortalidade sobre as larvas de 3° ínstar de Ae. aegypti, sendo

729
significativamente diferentes das demais concentrações, branco (MED=2% [0%-
4%]) e o controle (MED=0% [0%-10%]) (Figura 2).

Figura 2. Diagrama de caixa (boxplot) da taxa de mortalidade (%) das larvas de 3° ínstar de Ae.
aegypti por cada concentração aplicada, independente das espécies Trichoderma.
A linha horizontal dentro de cada caixa corresponde à mediana e as letras diferentes indicam
que as médias se diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).

De forma mais detalhada, com base em que 50% dos dados pertencentes
às diferentes espécies de Trichoderma apresentaram taxas de mortalidade
superior a 80% na concentração 1x108 conídios/mL, elaborou-se um gráfico para
demonstrar o comportamento de cada espécie nessa concentração (Figura 3).
De acordo com a figura 3, pode-se observar que o fungo T. virens
(MED=5% [0%-15%]) apresentou a menor taxa de mortalidade. Em
contrapartida, as espécies T. gamsii (MED=85% [65%-95%]; p<0,05),
T. atroviride (MED=95% [75%-95%]; p<0,05) e T. harzianum (MED=90% [80%-
100%]; p<0,05) apresentaram as maiores atividades entomopatógenas contra as
larvas de 3° ínstar de Ae. aegypti frente ao branco (MED=0% [0%-15%]) e o
controle (MED=0% [0%-5%]). Em adição, entre todas as espécies estudadas, se
destaca o fungo T. asperellum que apresentou mediana de 100%, com as
réplicas variando entre 95% e 100% de taxa de mortalidade.

730
Figura 3. Diagrama de caixa (boxplot) da taxa de mortalidade (%) das larvas de 3° ínstar de
Ae. aegypti expostas às espécies de Trichoderma na concentração de 1x108 conídios/mL.
A linha horizontal dentro de cada caixa corresponde à mediana e as letras diferentes indicam
que as médias se diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).

Devido às características dos resultados do fungo T. asperellum, optou-

se por analisá-lo individualmente, a fim de verificar o comportamento desta cepa
na concentração de 1x108 conídios/mL durante o período de 168 horas de
exposição das larvas.
Através da figura 4, nota-se que a sobrevivência das larvas foi diminuindo
ao decorrer do tempo e após 72 horas de exposição, não havia mais larvas vivas
entre os tratamentos (réplicas). Essa atividade foi observada com maior
intensidade em 24 horas de exposição, onde o número de larvas vivas era
inferior a cinco e após 48 horas a sobrevivência larval variava entre 1 e 0,
indicando que a cepa de T. asperellum na concentração de 1x108 conídios/mL
pode matar mais de 90% dos indivíduos após 48 horas de exposição (Figura 4).

731
Figura 4. Gráfico de valores individuais ilustrando o número de larvas de 3° instar vivas em função
do tempo durante a exposição ao fungo Trichoderma asperellum pelo período de 168 horas.
O círculo na cor preta representa a média dos dados, os losangos de cor verde são os valores
individuais (réplicas) e a linha de cor cinza representa a linha de conexão entre as médias.

Trabalhos envolvendo as espécies Trichoderma contra o mosquito Ae.

aegypti ainda são escassos. Além disso, as pesquisas são realizadas
principalmente contra a fase larval e na fase pupal, empregando as espécies
fúngicas T. harzianum (Sundaravadivelan e Padmanabhan, 2014), T. atroviride
(Singh e Prakash, 2015) e o T. asperellum (Aguiar 2020), formulados em
Nanopartículas de prata (AgNPs) e extratos orgânicos.
Achados anteriores das espécies Trichoderma corroboram com os dados
desse trabalho, tais como o de Aguiar (2020), no qual o secretoma enzimático
de T. asperellum, suplementado com o extrato de larvas de Ae. aegypti, causou
a mortalidade de 100% no período de 48 horas; reforçando assim, que essa
espécie pode ser um potencial entomopatógeno para o biocontrole de larvas de
Ae. aegypti. Adicionalmente, Sundaravadivelan e Padmanabhan (2014) também
observaram a susceptibilidade de larvas e pupas de Ae. aegypti ao T. harzianum;
onde notou-se que a maior mortalidade também foi registrada nas larvas no 3°
instar com 100%, sendo estes resultados semelhantes aos encontrados em
nosso estudo, onde a mortalidade das larvas variou entre 80-100% para T.
harzianum.
No presente estudo, a cepa T. asperellum CFAM0256 se destacou frente
aos demais, por causar rápida mortalidade das larvas de Ae. aegypti. Essa

732
espécie tem sido apontada como promissora no controle de larvas de diferentes
mosquitos e teve seu mecanismo de ação entomopatogênico recentemente
relatado em larvas anofelinas (Podder e Ghosh 2019; Ghosh et al. 2021). A
atuação dessa espécie em larvas ocorre através do contato externo, onde os
esporos se fixam à superfície através da secreção de mucilagem e invadem a
cutícula utilizando proteínas como Pr1, quitinases e proteases (Ghosh et al.
2021). Logo após, dentro do corpo larval, ocorre a secreção de toxinas que
diminui a fenol oxidase e degenera as células, causando a morte das larvas
(Podder e Ghosh 2019).
Logo, no contexto de aumento da resistência dos mosquitos aos
inseticidas sintéticos e aumento da poluição ambiental, o presente estudo pode
fornecer uma abordagem ecológica que eventualmente no futuro pode
desempenhar um papel importante em programas de controle de mosquitos.

Conclusões
As espécies T. harzianum CFAM1308, T. gamsii CFAM0044 e T.
asperellum CFAM0256 apresentaram as maiores taxas de mortalidade larval.
As atividades larvicidas foram observadas utilizando a concentração de
1x107 e 1x108 conídios/mL. Porém, na concentração 1x107 conídios/mL ocorreu
de forma menos agressiva.
Nesse estudo o T. asperellum CFAM0256 se destacou aos demais, pois
apresentou taxa mediana de 100% de mortalidade em 72 horas de exposição.
No período de 24 horas, o fungo T. asperellum CFAM0256 causou a
mortalidade média de 84% das larvas de 3° instar.
Portanto, esses resultados podem ser considerados pertinentes na
investigação por novas cepas com atividade entomopatógena contra as larvas
de Ae. aegypti e um passo importante na prospecção de bioprodutos de origem
Amazônica com efeito contra a fase imatura do vetor Ae. aegypti.

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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Avaliação do potencial antimicrobiano do extrato etanólico da

Petúnia mexicana (Ruellia simplex C. Wright)

Albuquerque, Isabela Ribeiro1; Freitas, Adriana Dantas Gonzaga1; Nobre,

Janaina da Costa Nogueira1; Souza, Maria Lucidalva Ribeiro1; Luciano, Jackeline
da Silva1; Souza, Francy Mary Galúcio1; Farias, Mariana Nepomuceno1

1Universidade Federal do Amazonas

Email: [email protected]

Resumo
A Ruellia simplex C. Wright, conhecida como petúnia mexicana, é comumente
utilizada como planta ornamental, no entanto, estudos recentes têm relatado seu
potencial medicinal. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial
antimicrobiano do extrato etanólico da Ruellia simplex C. Wright utilizando dois
métodos de extração para obtenção dos compostos orgânicos, o estático e o
ultrassom em seguida testá-los frente às cepas de Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus. Foram
analisadas quatro concentrações dos extratos (10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL,
50 mg/mL). Sendo utilizado para a avaliação da atividade antimicrobiana o
método de disco difusão, no qual discos de papel filtro foram embebidos nas
respectivas concentrações, com quatro repetições para cada tratamento, as
placas desse experimento foram incubadas a 37 °C em estufa B.O.D., onde
foram observadas por 72h, e posteriormente os halos de inibição formados foram
medidos e as médias obtidas foram utilizadas na análise estatística (Anova). A
análise fitoquímica foi realizada por Cromatografia de Camada Delgada (CCD)
em placas de sílica gel utilizando reveladores químicos e físicos. A atividade
antioxidante foi realizada utilizando o método de DPPH. O extrato estático da flor
e o ultrassom da folha foram capazes de inibir o crescimento das bactérias S.
aureus e E. coli, porém o extrato do ultrassom foi o mais eficaz, observando-se
halos de 8 mm para S. aureus. Para a E. coli, os dois tipos de extratos obtiveram
um resultado aproximado com médias de 4,75 mm e 4 mm, respectivamente. O
extrato estático da flor apresentou potencial antimicrobiano sobre S. aureus e
para E. coli. A análise fitoquímica mostrou-se positiva para a possível presença
taninos, terpenoides, antocianinas, ácidos graxos, compostos fenólicos e
saponinas. Portanto, neste trabalho, foi observado que os extratos etanólicos da
Ruellia simplex apresentaram atividade antimicrobiana e antioxidante sob as
condições avaliadas.

Palavras-Chave: Cromatografia de Camada Delgada; Resistência microbiana;

Ruellia sp.

736
 Introdução
A Ruellia simplex C. Wright, também chamada de petúnia mexicana, é
uma espécie que pertence à família Acanthacae, conhecida por ser
frequentemente utilizada como planta ornamental, porém estudos mais recentes
revelam que o gênero Ruellia sp. possui propriedades medicinais como
antioxidandes e antimicrobianos. O primeiro registro dessa espécie foi feito em
1870 em Cuba, mas esta pode ser encontrada nos Estados Unidos, México,
Paraguai, Bolívia e Brasil. Possui diversos sinônimos, os mais conhecidos são:
Ruellia tweediana, Ruellia coeruelea e Ruellia brittoniana, mas Ruellia simplex
tem prioridade taxonômica (Ezcurra e Daniel 2007).
É uma espécie que apresenta habilidade de crescer em diversos tipos de
condições, desde ambientes alagados até xéricos. A Ruellia simplex pode atingir
até 1 metro de altura, possui flores na cor roxa ais quais atraem diversos
polinizadores (Freyre et al. 2012). Algumas espécies da família Acanthacae são
utilizadas pela medicina popular para tratamento de diversas doenças, servindo
como diurético, purgativo, antídoto de mordida de cobra e usada externamente
para tratamento de reumatismo (Samy et al. 2015).
O gênero Ruellia sp. tem importância medicinal pois algumas espécies
são geralmente utilizadas para tratamento de infecções renais, gonorreia e sífilis.
De acordo com Samy et al. (2015), a Ruellia tuberosa tem diversas propriedades,
dentre elas, anti-inflamatória, antioxidante, antibacteriana e citotóxica. Quanto a
Ruellia simplex, Tejaputri et al. (2019) dizem que o extrato feito com acetato de
etila apresentou o melhor resultado para ação antioxidante mostrando que essa
espécie também tem propriedades medicinais.
Desde a antiguidade, as plantas têm sido utilizadas para tratamento de
diversas doenças. Através das propriedades físico-químicas presentes nesses
seres vivos, fármacos naturais são produzidos e comercializados ao redor do
mundo, mas apesar do conhecimento acerca das propriedades medicinais de
algumas espécies, uma grande porcentagem e plantas ainda não tiveram seu
potencial medicinal descoberto. Atualmente, a busca por fármacos com ação
antimicrobiana vem crescendo devido à resistência de alguns microrganismos
patogênicos, e isso se dá pelo uso inadequado de antibióticos (Rozzato 2012).
O Brasil possui ecossistemas com grande diversidade de espécies
de plantas, a flora é uma das ricas do mundo, pois tem uma grande variedade

737
de matéria-prima para a produção de fitofármacos (Pinto et al. 2013). Segundo
estimativas, o número de espécies superiores pode chegar a 500.000, porém
apenas 15 a 17% foram estudadas com objetivo de analisar seu potencial
medicinal (Barros 2008).
O desenvolvimento de fármacos antimicrobianos tem crescido, e junto
deste, o aumento da resistência de patógenos. Essa resistência se deve a
diversos fatores, dentre eles o crescente uso inadequado de medicamentos,
grande quantidade de hospedeiros, além de procedimentos invasivos, o que
pode ocasionar o aumento de microrganismos multirresistentes. Em decorrência
disso, a procura de novos antimicrobianos tornou-se necessária e indispensável
(Catão et al. 2005).
Sendo comumente encontrada em ambientes ensolarados a petúnia é
uma planta de fácil adaptação, pois é possível observar seu crescimento em
diferentes biomas. Essa espécie é utilizada principalmente como planta
ornamental, mas recentemente estudos vêm sendo desenvolvidos relatando
sobre seu potencial medicinal. Deste modo, comprova-se que as folhas e flores
de várias espécies de plantas são grandes fontes de compostos secundários em
potencial, com vasta atividade biológica que possibilita auxiliar no processo
antimicrobiano de doenças acometidas nos seres humanos. Sendo assim, os
objetivos deste trabalho foram avaliar o potencial antibacteriano do extrato
etanólico da Ruellia simplex C. Wright sobre patógenos humanos, frente à
inoculação das cepas bacterianas de Escherichia coli (ATCC 25922);
Staphylococcus aureus (ATCC 25923); Klebsiella pneumoniae (ATCC 13899) e
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), identificar grupos de compostos
presentes nos extratos através da Cromatografia de Camada Delgada, e avaliar
a atividade antioxidante pelo método de DPPH.

Material e Métodos
Coleta de material vegetal
As amostras de petúnia mexicana (Ruellia simplex C. Wright), folhas
e flores foram coletadas no setor sul da Universidade Federal do Amazonas
(UFAM), localizado em Manaus (3°06'03.0"S 59°58'29.3"W). Foi
realizada confirmação da espécie no Laboratório de Taxonomia Vegetal do
Instituto de Ciências Biológicas (ICB) - UFAM.

738
Processamento de amostras e extração por solvente
O material coletado foi levado ao Laboratório de Pesquisa em
Microbiologia localizado no ICB 01, UFAM. Após a coleta, folhas e flores foram
lavadas com água corrente, secas e pesadas. Em seguida, o material foi
transportado ao Laboratório de Botânica da Universidade Federal do Amazonas,
onde foi depositado em estufa com circulação de ar forçada, a temperatura
constante de 55 °C, por 3 dias, para a secagem completa. O material vegetal
seco foi triturado em moinho tipo faca até ser reduzido a pó a fim de conseguir
150 g do material. Para a obtenção do extrato estático, 50 g do material
resultante da maceração das folhas e flores foram depositados em um Becker e
adicionado 500 mL de solvente (etanol P.A), o Becker foi vedado com papel
alumínio e deixado em condições estáticas na bancada por um período de 15
dias. Após esse período, a solução foi filtrada e levada ao evaporador rotatório
na temperatura de 34 °C para a evaporação do solvente. A extração por
ultrassom foi realizada no Laboratório de Abertura de Amostras e Ensaios
Químicos (LAEQ), utilizando-se 50 gramas do material (folha), onde foram
adicionados 500 mL de etanol P.A processo de extração durou 20 minutos,
posteriormente o solvente foi evaporado através do evaporador rotatório a 34°C.

Bioensaios com os microrganismos

Para os testes, foram utilizadas as seguintes cepas bacterianas:
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922),
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Klebsiella pneumoniae (ATCC 49619).

Teste de sensibilidade (Difusão em disco)

Os inóculos foram preparados em caldo Mueller-Hinton e a suspensão
ajustada para aproximadamente 105 unidades formadoras de colônias (UFC) por
mililitro, comparando a turvação dos inóculos com o padrão 0,5 da escala de
MacFarland (1,5 x 105 UFC/mL). Um swab de algodão estéril foi imerso na
suspensão do respectivo microrganismo e friccionado por toda a superfície de
uma placa contendo meio de cultura Ágar Mueller-Hinton (processo de estrias
bacterianas).
Cada extrato foi pesado e o teste realizado em quatro concentrações
distintas (C1= 10 mg, C1= 15 mg, C3= 20 mg, C4= 50 mg) com auxílio de uma

739
balança analítica e adicionado 1000µL de DMSO em tubos Eppendorf. Após
esse procedimento, as concentrações foram homogeneizadas com auxílio do
Vórtex.
Depois, utilizou-se 4 discos autoclavados para cada placa de Petri, cada
disco foi embebido na sua respectiva concentração (C1= 10 mg/mL, C2=
15 mg/mL, C3= 20 mg/mL, C4= 50 mg/mL), e colocados com auxílio de uma
pinça estéril na placa de Petri do respectivo microrganismo, mantendo-se uma
distância razoável. Em uma placa separada, foi colocado um disco embebido em
50 µL de Dimetilsulfóxido (DMSO) para o controle negativo, e para o controle
positivo, um disco embebido em 50 µL do antibiótico Tetraciclina na
concentração de 500µg.
As placas foram incubadas a 37 °C e observadas por 72 horas, e após
esse período, o diâmetro dos halos de inibição foram medidos em milímetros. Os
resultados obtidos foram dados pela média das medidas dos halos. Os testes de
sensibilidade antimicrobiana foram realizados em quatro repetições.

Prospecção fitoquímica por Cromatografia de Camada Delgada (CCD)

Para a análise fitoquímica dos extratos da flor e folha pelo método Estático
e o extrato da folha pelo método de Ultrassom, foi utilizado para a fase móvel um
sistema 8:2, que consistia em 8mL de Hexano e 2mL de Acetato de Etila. A fase
estacionária consistiu em placas de alumínio com sílica no qual aplicamos todos
os extratos. Foram utilizados os seguintes reveladores químicos: 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH),
Vanilina Sulfúrica, Ácido Fosfomolibidínico e Vapor de Iodo. Para o teste
antioxidante com DPPH, foi utilizado como controle positivo a Quercetina, um
composto padrão para comparação em testes de antioxidantes, e como controle
negativo o solvente Hexano. Os reveladores físicos utilizados foram os
comprimentos de onda UV 254nm, 365nm e luz branca.

Análise Estatística
Para a comparação dos resultados expressos, como média dos halos
obtidos em cada concentração, foi realizada Análise de Variância (ANOVA), e
em seguida o teste Tukey ao nível de 95% de significância. As análises

740
estatísticas foram realizadas no software Sisvar, versão 5.6, segundo Ferreira
(2014).

Resultados e Discussão
O extrato etanólico da flor obtido pelo método estático mostrou-se
eficiente contra as bactérias S. aureus e E. coli, o mesmo foi observado para o
extrato da folha realizado por ultrassom. P. aeruginosa e K. pneumoniae não
apresentaram halo de inibição (Tabelas 1 e 2). O extrato estático da folha não
apresentou eficiência contra os microrganismos teste. No terceiro dia de
avaliação da atividade antimicrobiana, algumas placas apresentaram o
crescimento de colônias bacterianas, ou seja, o extrato botânico começou a
perder as suas propriedades antibacterianas.
Como era esperado, a avaliação dos controles utilizados nesse
experimento observou-se que a concentração utilizada de tetraciclina (500 µg)
inibiu a cepa E. coli onde foi observado a formação de halo de inibição de 7 mm,
já para as bactérias P. aeruginosa e S. aureus obtiveram 8 mm e K. pneumoniae
obteve 10 mm, no controle negativo, no qual foi utilizado o DMSO, não houve
halo de inibição.
A análise fitoquímica por Cromatografia em Camada Delgada mostrou a
presença de compostos secundários produzidos pela Ruellia simplex através de
bandas coloridas visualizadas por reveladores químicos e físicos (Figura 1). A
placa A, para o extrato da folha por Ultrassom, evidenciou a presença de
clorofila, para manchas verdes, terpenos e compostos aromáticos para manchas
roxas, no qual utilizou-se Vanilina Sulfúrica, com Fator de Retenção, Rf"s 0,3 e
0,18. Para a placa B, revelada com Ácido Fosfomolibidínico, apresentou
manchas roxas, evidenciando terpenos e ácidos graxos, com Rf"s presentes em
toda a placa, inclusive na origem, para todos os extratos. Na placa C foi utilizado
vapor de iodo, no qual evidenciou substâncias insaturadas como terpenoides,
compostos fenólicos e saponinas através das bandas amarronzadas e
amareladas, sendo os Rf"s de destaque 0,82; 0,74; 0,45; 0,35 e o de origem,
para todos os extratos. As placas D e E foram reveladas em luz UV 254nm e
365nm respectivamente, estas mostraram a presença diversas substâncias.
O extrato da flor mostrou grande quantidade de flavonoides, como a
antocianina, pela presença da cor roxa azulada, esse pigmento é responsável

741
por parte das propriedades antioxidantes dos vegetais. Na placa F utilizou-se
DPPH, um revelador de capacidade antioxidante, aplicou-se os três extratos em
duas repetições, como controle negativo utilizou-se o solvente Hexano, e como
controle positivo, aplicou-se Quercetina. Os halos claros ao redor das amostras
mostram o potencial antioxidante do respectivo extrato. Foi observado potencial
antioxidante para os três extratos, no entanto o extrato da folha obtido pelo
método Estático obteve maior capacidade antioxidante.
Estatisticamente, a análise da variância mostrou diferença significativa
entre todas as médias dos halos para S. aureus no extrato ultrassom da folha.
Para a E. coli, as médias obtidas pelas concentrações C1 e C2 tanto no extrato
estático da flor quanto no extrato ultrassom da folha, mostraram semelhantes.
Em relação às diferenças entre os extratos que apresentaram atividade
antimicrobiana, o extrato da folha obtido pelo método ultrassom mostrou-se mais
eficiente em comparação ao extrato estático da flor para S. aureus, observando-
se halos de 8 mm. Em relação a E. coli, os dois extratos resultaram em halos
com medidas parecidas.

Tabela 1. Média dos halos de inibição de crescimento obtidos pelo extrato da flor através do
método estático.
Concentração
Amostra S. aureus E. coli P. aeruginosa K. pneumoniae
(mg/mL)
C1 10 2,75b 1,00a - -
C2 15 2,25a 1,00a - -
C3 20 2,00a 1,75b - -
C4 50 6,25c 4,75c - -

Os dados deste trabalho corroboram com os dados de Arirudran et al.

(2011) no qual mostrou que o clorofórmio, acetato de etila, álcool e o extrato
aquoso da Ruellia tuberosa L. foram efetivos contra as bactérias Escherichia coli
e Pseudomonas aeruginosa.

Tabela 2. Média dos halos de inibição de crescimento obtidos pelo extrato da folha através
do método Ultrassom.
Concentração
Amostra S. aureus E. coli P. aeruginosa K. pneumoniae
(mg/mL)
C1 10 3,75a 1,00a - -
C2 15 5,75b 1,00a - -
C3 20 6,00c 1,25b - -
C4 50 8,50d 4,00c - -
(-) não apresentaram halo de inibição frente ao extrato. As médias seguidas pela mesma letra
na verticalnão diferem pelo teste Tukey (p=0,05).

742
 Para Lakshmi et al. (2017), o extrato etanólico da Ruellia patula foi ativo
contra as bactérias Gram-negativas utilizadas no estudo, dentre elas a E. coli, o
que não ocorreu com as bactérias Gram-positivas, como a S. aureus. O autor
sugere que a baixa eficiência contra as bactérias Gram negativas de alguns
extratos se deve à presença da camada externa que protege a célula de
perturbações, o que pode ter ocorrido com as bactérias P. aeruginosa e K.
pneumoniae, em que não houve halo de inibição. Para as Gram-positivas, os
extratos podem ter sido eficientes devido à presença de metabólitos presentes
no mesmo, no qual tem a capacidade de interferir nas estruturas das membranas
celulares, o que pode ter ocorrido para Vasconcelos (2014) no qual utilizou os
óleos essenciais de Ruellia aspérula (Mart.ex ness) Lindau e Ruellia paniculata
L., e obteve os melhores resultados sobre as linhas de bactérias Gram-positivas.
A resistência bacteriana tem se tornado um problema de saúde pública,
dentre as cepas mais resistentes está a K. pneumoniae, microrganismo
conhecido por causar principalmente enterites e doenças pulmonares, podendo
levar a óbito. Sousa et al. (2019) observou que isolados dessa espécie são
resistentes a antimicrobianos β lactâmicos, como a ampicilina e amoxicilina.
Essas substâncias advindas dessa espécie são capazes de produzir enzimas
hidrolíticas que inativam a ação dessa classe de antibióticos, dessa forma, atuam
como um mecanismo de resistência.
Dentre os possíveis fatores de resistência de P. aeruginosa a antibióticos
está relacionado à limitação da entrada de pequenas moléculas hidrofílicas. A
membrana externa dessa bactéria possui canais constituídos de porinas, no qual
permitem uma entrada lenta de solutos, dessa forma, esse mecanismo resulta
na resistência pois limita a penetração de certos antibióticos (Roca 2014).
Baseando-se na análise fitoquímica realizada por Tejaputri et al. (2019),
o extrato etanólico da flor possui taninos, glicosídeos, triterpenos, alcaloides e
flavonoides. Os taninos são moléculas que tem propriedades antimicrobianas
capazes de inibir o crescimento de bactérias e fungos. Os triterpenos são
metabólitos naturalmente encontrados nas plantas. Em alguns países asiáticos
são utilizados como antimicrobianos e antivirais.
De acordo com Santos (2022), os radicais livres são produzidos
naturalmente pelo organismo, porém o excesso provoca doenças
cardiovasculares, respiratórias, renais, diabetes e diversos tipos de câncer. As

743
substâncias antioxidantes são frequentemente encontradas em vegetais, dessa
forma, o suprimento com fontes desses compostos é de suma importância para
a saúde. Tendo em vista a grande quantidade de radicais livres presentes na flor
da Ruellia simplex, esta tem um grande potencial para uso farmacológico.
Em relação ao método de extração, uma das principais vantagens do
método ultrassom se deve a não aplicação de calor na amostra, por isso, obtêm-
se melhor rendimento e seletividade (Franzen et al. 2017). Dessa forma, o
extrato feito por ultrassom pode ter sido mais eficaz devido a esse tipo extração.
Portanto, as diferenças de resultado entre os trabalhos podem ser
causadas por diversos fatores, dentre eles ambientais, as diferentes formas de
se obter os extratos, a espécie utilizada no estudo, à metodologia empregada,
entre outros (Haida et al. 2007).

Figura 1. Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e atividade antioxidante dos extratos

etanólicos da folha e flor da Ruellia simplex C. Wright. (A) Revelador-Vanilina Sulfúrica-luz
branca: Clorofila, terpenos e compostos aromáticos. (B) Revelador-Ácido Fosfomolibidínico-
luz branca: Terpenos e ácidos graxos. (C) Revelador-Vapor de Iodo-luz branca: Terpenóides,
compostos fenólicos e saponinas. (D e F) Luz UV 254 e 365nm respectivamente. (F)
Atividade antioxidante dos extratos. E1: Extrato da flor Estático. E2: Extrato da folha Estático.
E3: Extrato da folha por Ultrassom. RF: Fator de Retenção. DE: Distância Percorrida Pelo
Extrato. Controle negativo (-): Solvente Hexano. Controle Positivo (+): Quercetina.

744
 Conclusões
A Ruellia simplex C. Wright apresentou atividade antimicrobiana contra as
bactérias S. aureus e E. coli quando obtido o extrato estático da flor e o extrato
ultrassônico da folha. Todos os extratos possuem compostos secundários de
importância médica e comercial, além da alta capacidade antioxidante. Ainda se
conhece pouco sobre as propriedades medicinais de Ruellia simplex, e ainda
menos sobre o poder antimicrobiano dessa planta. Porém, alguns estudos como
os supracitados relatam sobre o potencial bacteriano e antifúngico de outras
espécies do gênero que apresentam eficácia contra microrganismos
patogênicos. Portanto, faz-se necessário mais estudos sobre o potencial
farmacológico dessa espécie, a fim de se produzir novos medicamentos contra
microrganismos que afetam negativamente os seres vivos.

Agradecimentos
À Fapeam e à UFAM.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Bioprospecção de moléculas antibióticas em linhagem

amazônica de Streptomyces murinus MAD 24

Caldas, Luis Felype Garcia de Sousa1; Queiroz, Claudia Afras de 3; *Silva, Gilvan
Ferreira3

1Universidade Federal do Amazonas, 2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,

3
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
E-mails: [email protected]

Resumo
A espécie tipo de Streptomyces murinus foi isolada de solo no Japão na década
de 60 e desde então tem sido estudada do ponto de vista químico e genético.
Atualmente, novas abordagens como a mineração genômica combinada com
plataformas como o ARTS (Antibiotic Resistant Target Seeker) estão sendo
utilizadas na busca por novas moléculas com ação antibiótica, visando o
combate de linhagens multirresistentes. Por esse motivo, neste estudo buscou-
se avaliar o potencial biotecnológico para produção de antimicrobianos com base
na identificação de BGCs (Biosynthetic Gene Clusters) de S. murinus linhagem
MAD 24 isolada de sedimentos do rio Madeira. Foram identificados pelo menos
15 clusters associados à produção de antimicrobianos, com similaridade entre
2% e 92% com vias de biossíntese já caracterizadas e cujas moléculas podem
ser preditas com base na composição de genes do BGC. A busca por genes de
resistência que são utilizados como forma de escape contra antibióticos
produzidos pela própria linhagem, identificou 31 genes de resistência dentro ou
próximo de clusters gênicos biossintéticos. Foram identificados também 51
genes duplicados e 228 genes obtidos por transferência horizontal entre
espécies.

Palavras-chave: Actinobactéria, Metabólitos Secundários, Mineração de

genomas, Resistência antimicrobiana.

Introdução
As actinobactérias do gênero Streptomyces, são os microrganismos que
mais se destacam quando falamos da obtenção de produtos naturais. Esse
gênero apresenta a capacidade de produção da mais variada gama de
substâncias bioativas, como exemplo, antifúngicos, antiparasitários, antibióticos
compostos com ação citotóxica e imunossupressora, além de enzimas de
interesse industrial (Deepthi et al. 2012).

748
 A química de produtos naturais a partir de microrganismos é uma das
principais estratégias na obtenção e desenvolvimento de novas moléculas com
potencial antimicrobiano, são inúmeros os trabalhos que abordam o alto
potencial dos microrganismos especialmente das Streptomyces na obtenção de
compostos de interesse farmacológico (Thirumurugan 2018; Lee et al. 2020;
Newman e Cragg 2020; Zhou et al. 2020).
O Brasil é considerado como um dos países com maior biodiversidade do
planeta, abrigando 20% de espécies da fauna e flora conhecidas pela
humanidade. Possui uma enorme diversidade de biomas principalmente o
Amazônico, os quais os quais podem ser alvos de pesquisas com foco em
bioprospecção.
No caso dos microrganismos pouco se conhece sobre a biodiversidade
no bioma amazônico, mas devido à grande diversidade de organismos e
ecótonos que pode abrigar a microbiota amazônica e sua complexidade ainda
pouco compreendida espera-se que a diversidade microbiana seja muito maior
que a dos demais organismos. Tal situação eleva as chances de se encontrar
novos fármacos, como os antimicrobianos (Oliveira 2018).
O avanço das tecnologias de sequenciamento combinadas com
ferramentas de bioinformática como o antiSMASH tem propiciado a prospecção
de moléculas por meio da mineração de genomas, permitindo a identificação de
vias de biossíntese e por análise comparativa da composição de genes é
possível determinar se um microrganismo é capaz de realizar a síntese de uma
molécula desde que ele tenha todos os genes necessários. Em microrganismos
os genes para a biossíntese de metabólitos secundários estão normalmente
agrupados fisicamente, o que a literatura nomeia como BGCs do inglês
Biosynthetic gene cluster (Chaval e Rhee 2018; Blin et al. 2019).
A mineração genômica por meio da identificação de BGCs combinada
com o emprego de métodos analíticos como cromatografia associada à
espectrometria de massas de alta resolução, permite elucidar quantitativamente
e qualitativamente os produtos naturais obtidos destes clusters, essas
abordagens combinadas com testes de bioatividade pode auxiliar a descoberta
de novos antimicrobianos (Lee et al. 2020).

749
 Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo realizar mineração
genômica da linhagem amazônica de S. murinus MAD 24 com foco na
prospecção de antimicrobianos.

Material e Métodos
A linhagem S. murinus MAD 24, foi oriunda de sedimentos do rio Madeira
e faz parte da coleção de microrganismos da Embrapa Amazônia Ocidental. A
autorização de acesso ao patrimônio genético se deu de acordo com a
solicitação do SISGEN com cadastro de Acesso N° AB6B14FA.
A identificação filogenômica foi realizada com o auxílio da plataforma
TYGS (Type Strain Genome Server). Os cálculos das distâncias entre genomas,
foram apresentados por meio dos valores de hibridização digital DNA-DNA
(Meier-Kolthoff, 2019). Para identificação de MAD 24 foi utilizado o valor de
dDDH na fórmula D4, esta fórmula é considerada a mais adequada para
rascunhos de genoma e genomas incompletos, sendo utilizado como critério
para pertencer à mesma espécie valores de dDDH acima de 70%, e genomas
com valores abaixo deste ponto são considerados novas espécies (Meier-
Kolthoff et al. 2019).
A análise dos metabólitos secundários com ação antimicrobiana foi
efetuada por meio do programa antiSMASH versão 6.1.0 (Blin et al. 2019)
utilizando o modo relaxado (relaxed mode).
A priorização de BGC’s relacionados à biossíntese de antibióticos foi
realizada por meio da ferramenta ARTS. Onde foram identificados BGCs
próximos a genes de resistência, duplicados, transferência horizontal entre
espécies, e os clusters próximos a BGC’s (Alanjary et al. 2017; Mulgan et al.
2020).

Resultados e Discussão
A identificação da linhagem MAD 24 com base no genoma completo
apresentou igual valor de dDDH (73.7% na fórmula D4) tanto para Streptomyces
phaeogriseichromatogenes DSM 40710, quando para Streptomyces
griseofuscus NRRL B-5429. As linhagens S. phaeogriseichromatogenes DSM
40710 e S. costaricanus DSM 41827 são sinônimo heterotípico de S. murinus.

750
Figura 1 - Árvore filogenética obtidas pelo TYGS (Type Strain Genome Server) baseado no
genoma completo do isolado MAD 24.

A mineração da S. murinus linhagem MAD 24 revelou a apresentação de

55 BGC’s envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários. Destes, 8 foram
associados para NRPS (5 BGC’s para NRPS, 2 NRPS-Like, 1 NRPS-
independent-siderophore), ainda se encontrou outros 20 inseridos em clusters
candidatos do tipo misto. 16 clusters para PKS (PKS tipo I com 13 clusters, tipo
II com 1, tipo III com 1 clusters e PKS tipo I - hgIE-KS com 1 clusters). Também,
foram identificados 4 clusters associados a síntese de terpenos, (2) para
sideróforos, (2) ectoína, (1) melanina, (2) butirolactona, (1) lassopeptídeo. O
programa identificou dezessete clusters candidatos do tipo misto. Os dois
clusters restantes foram classificados como outros tipos de clusters: (2) RiPP-
like (Ribosomally synthesised and post-translationally modified peptide), RRE-
containing, LAP (Linear azol(in)e-containing peptides).
Do conjunto total de BGCs identificados 15 apresentaram apresentam
similaridade variando de 2 a 92% com BGCs de vias de biossíntese associada a

751
moléculas já caracterizadas com bioatividade relacionada a ação antimicrobiana
(Tabela 1).

Tabela 1 - Clusters gênicos biossintéticos identificados no isolado MAD 24 que apresentam

similaridade com clusters relacionados à biossíntese de compostos antimicrobianos.

Região do Contig Cluster biossintético Bioativo Similaridade (%)

3.1 NRPS Diisonitrile antibiotic SF2768 66

15.1 NRP- Acyldepsipeptide 1 15

metallophore,NRPS,NRPS-
like

17.1 Terpene Julichrome Q3-3/julichrome Q3- 25

5

22.1 NRPS/Other Actinomycin D 89

23.1 NRPS, NAPAA Dstenothrici 13

23.2 Ectoine Showdomycin 23

41.1 PKS T1 Filipin 92

45.1 PKS T1 Cyphomycin 2

65.1 other, PKS T1, PKS-like Tambjamine BE-18591 21

69.1 PKS T1 Pentamycin 53

75.1 Lanthipeptide class I A-201A 6

76.1 NRPS,NRP-metallophore Mirubactin 78

141.1 NRPS Cyclofaulknamycin 8

226.1 PKS T1 Kinamycin 11

283.1 PKS T1 Quinolidomicin 22

Total: 15

Obs.: NRPS: Sintetase de peptídeos não ribossomais, PKS: sintetase de policetídeos tipo 1
(T1PKS), NAPAA: Não alfa Poliaminoácidos tipo e-Polilisina, PKS-like: Fragmento do tipo
PKS, NRPS-like: Fragmento do tipo NRPS.

Foram identificados clusters de NRPS para relacionados à biossíntese de

antimicrobianos como diisonitrile antibiotic, apresentando similaridade de 66%,
que apresenta ação antibiótica por meio do controle de oxigênio reativo e
controle, inibindo o crescimento bacteriano (Zhu et al. 2020). Cluster mistos
contendo NRPS em relação às suas via biossintéticas apresentaram similaridade
com as moléculas: actinomycin D, Acyldepsipeptide, Dstenothrici, Mirubactin e
Cyclofaulknamycin com 15%, 89%, 13%, 78% e 8%, respectivamente,
antimicrobianos com ação contra Acinetobacter baumannii, Staphylococcus
752
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis,
Mycobacterium smegmatis, Citrobacter freundii, Mucor hiemalis, Candida
albicans, Cryptococcus neoformans e Pichia anomala (Tang 2019; Cociancich e
Leclère 2022).
Entre os policetídeos foram identificados BGCs relacionados a produção
de: filipin, cyphomycin, pentamycin, tambjamine BE-18591 e kinamycin, todos
estes com ação antibacteriana (Oliveira 2018; Silva 2020; Little e Hertweck
2021). As moléculas cyphomycin e mediomycin possuem propriedades
bactericidas e antifúngicas; já pentamicyn possui propriedade antibiótica,
antiparasitária com ação contra protozoários e antifúngica. Em relação ao
kinamycin e tambjamine BE-18591, estes apresentam propriedade funcional
antimicrobiana e antitumoral (Trombini 2020; Godzieba e Ciesielski 2020; Little e
Hertweck 2021). As moléculas julichrome Q3-3/julichrome Q3-5 e A-201, tem
relacionados em suas vias de biossíntese terpeno e lantipeptídeo de classe I,
respectivamente, moléculas de ação antibiótica.
O cluster 23.2 relacionado a showdomycin é uma molécula com ação
antibiótica, principalmente contra Escherichia coli, sendo pertencente a classe
das ectoínas, possuindo ação citotóxica e imunossupressora. Algumas linhagens
de E. coli apresentam resistência a showdomycin (Palmu et al. 2017).
Neste trabalho também foi utilizada a abordagem de mineração genômica
com base na plataforma ARTS. Esta permite a mineração de genomas
bacterianos específica e direcionada a prospecção de antibióticos, tanto a partir
de alvos escolhidos (exemple resistência a determinado antibiótico de interesse)
quanto na busca de novos alvos (como novos mecanismos de ação antibiótica),
por meio da correlação entre os genes de manutenção (housekeeping gene) e
de genes de resistência conhecidos, que estejam próximos ou dentro do BGC,
estes mecanismos de auto-resistência podem ser incorporados ao genoma por
meio de eventos de duplicação e transferência horizontal de genes (HGT) e
quando estes genes estão fisicamente próximos a uma via de biossíntese, indica
que estes genes conferem uma forma de escape contra o antibiótico produzido
pela própria linhagem (Alanjary et al. 2017; Mulgan et al. 2020).
Neste sentido foram identificados 43 genes de resistência no genoma de
MAD 24, apresentados na tabela 2, destes 31 estão próximos ou dentro de
BGCs. Foram identificados também 51 genes duplicados e 228 genes obtidos

753
 por transferência horizontal entre espécies (Alanjary et al. 2017; Mulgan et al.
2020).
Tabela 2 - Clusters gênicos biossintéticos identificados no isolado MAD 24 que apresentam
genes duplicados próximos ou dentro de Cluster Gênicos Biossintéticos.
BGC Tipo Função D B P
3.1 NRPS,T1PKS,NRPS-like Metabolismo energético Sim Sim Sim
65.1 other,T1PKS,PKS-like Síntese de proteína Sim Sim Sim

23.1 NRPS Destino da proteína Sim Sim Sim

Biossíntese de
23.2 Ecoína cofatores, grupos prostéticos e Sim Sim Sim
transportadores
Destino da
10.1 NRPS Sim Sim Sim
proteína
Biossíntese de
14.1 Thiopeptide, LAP, terpeno cofatores, grupos prostéticos e Sim Sim Sim
transportadores

17.1 Terpeno
Destino da proteína Sim Sim Sim
79.1 T3PKS
Biossíntese de
Thiopeptide, LAP,
14.1 cofatores, grupos prostéticos e Sim Sim Sim
Terpeno
transportadores
Síntese de
17.1 Terpeno Sim Sim Sim
proteína
Biossíntese de
6.1 NRPS, Siderophoro cofatores, grupos prostéticos e Sim Sim Sim
transportadores

17.1 Terpeno
Purinas, pirimidinas, nucleosídeos e
Sim Sim Sim
nucleotídeos
61.1 transAT-PKS-like,NRPS

Biossíntese de
240 NRPS cofatores, grupos prostéticos e Sim Sim Sim
transportadores
61.1 transAT-PKS-like,NRPS Metabolismo energético Sim Sim Sim
41.1 T1PKS Não Classificado Sim Sim Não
Total: 16
Obs.: D: Duplicações, P: transferência horizontal de genes, B: próximos a BGC.

Conclusões
A prospecção in silico produtos naturais com base no genoma de S.
murinus MAD 24 isolada do rio Madeira revelou que a linhagem apresenta pelo
menos 55 cluster relacionada à biossíntese de moléculas de diferentes classes.

754
Pelo menos 15 BGCs estão relacionados à produção de compostos relatados na
literatura com ação antibiótica.

Agradecimentos
Os autores agradecem às agências de fomento: FAPEAM (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas) CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Este trabalho contou com o
suporte financeiro da FAPEAM Editais: (PROSPAM 08/2021, CT&I ÁREAS
PRIORITÁRIAS 010/2021, PRODUTIVIDADE-CT&I-013/2022, Biodiversa Nº
007/2021 e pela concessão de bolsa de estudo ao primeiro autor), CAPES editais
(Procad AmazonMicro e Amazônia Legal).

Referências
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757
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Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Criptococose felina: primeiro relato de caso no município de

Parintins Amazonas, Brasil

Barroso, Layssa do Carmo1; Segundo, Walter Oliva Pinto Filho2; Oliveira,

3
Luciana Aires de

1
Laboratório Central de Saúde Pública do Amazonas, 2Fundação de Vigilância em
Sáude Drª Rosemary Costa Pinto, 3Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
E-mails:[email protected]; [email protected]

Resumo
A criptococose, conhecida como "doença do pombo", é uma zoonose causada
pelo gênero Cryptococcus, afetando animais e humanos. Esta infecção fúngica,
frequentemente associada a excrementos de aves, apresenta sintomas severos
em felinos, como tosse, espirros, anorexia, letargia, dificuldade de locomoção e
lesões ulcerativas faciais. Indivíduos com imunidade comprometida são
particularmente susceptíveis. Em gatos, apesar de apresentar baixa incidência,
os acometidos podem desencadear sintomas como: tosse, espirros, falta de
apetite, fraqueza, dificuldade para se mover e lesões ulceradas, principalmente
na região da face. O manejo da doença inclui antifúngicos e prevenção,
enfatizando a importância de evitar áreas contaminadas e manter a saúde
imunológica do animal. Este estudo foca em um caso de criptococose em um
felino de Parintins-AM, diagnosticado com Cryptococcus neoformans. As
amostras foram cultivadas em Ágar Sabouraud Dextrose com cloranfenicol e
Ágar Mycosel, incubadas a 25ºC e 37ºC por até 10 dias. A análise das colônias
permitiu a identificação do patógeno, confirmada pelo Vitek MS MALDI-TOF.
Este caso reforça a relevância do diagnóstico laboratorial na identificação precisa
de patógenos fúngicos, crucial para o tratamento efetivo e medidas preventivas,
contribuindo para o bem-estar felino.

Palavras-chave: Criptococose; Cryptococcus neoformans; Amazonas, Infecção

fúngica.

Introdução
A criptococose é uma doença fúngica sistêmica de grande relevância
na saúde pública e veterinária, causada principalmente por duas espécies do
gênero Cryptococcus: C. neoformans e C. gattii. Essa micose oportunista é
conhecida por sua capacidade de afetar o sistema nervoso central, pulmões
e pele, apresentando um espectro clínico variado entre os hospedeiros
(Kwon-Chung et al. 2014). A transmissão ocorre principalmente pela inalação

758
de esporos fúngicos dispersos no ambiente, o que coloca em risco tanto
seres humanos quanto animais, especialmente em áreas com alta carga de
esporos no ar. C. neoformans é frequentemente associado a pacientes
imunocomprometidos, como aqueles com HIV/AIDS, enquanto C. gattii tem
sido relatado como causador de doença em indivíduos imunocompetentes,
destacando a diversidade patogênica dentro deste gênero (Chen et al. 2014;
Rajasingham et al. 2017). Essa diferenciação tem implicações importantes
para a epidemiologia e o manejo da criptococose, sublinhando a
necessidade de vigilância contínua para entender melhor a distribuição
global desses patógenos. Os sinais clínicos da criptococose podem variar
amplamente, dificultando o diagnóstico precoce. Em felinos, manifestações
podem incluir dificuldades respiratórias, lesões cutâneas e sinais
neurológicos, refletindo a tropismo do fungo por esses tecidos (Sykes et al.
2010). Os animais imunocomprometidos estão particularmente em risco,
realçando a importância de entender as interações hospedeiro-patógeno e
os fatores de risco associados (Trivedi et al. 2011). Em humanos, a meningite
criptocócica é a forma mais grave e comum da doença, exigindo atenção
médica imediata para evitar desfechos fatais.
O diagnóstico da criptococose baseia-se na combinação de sinais
clínicos, achados laboratoriais, e técnicas específicas, como a cultura
fúngica, a citologia e a sorologia. Técnicas moleculares, como a PCR, têm
emergido como ferramentas valiosas para a identificação rápida e precisa
das espécies de Cryptococcus (Firacative et al. 2016). Essas abordagens
permitem um diagnóstico mais rápido e uma gestão clínica mais eficaz da
doença. O tratamento da criptococose envolve o uso prolongado de
antifúngicos, como a anfotericina B e o fluconazol, dependendo da
severidade da infecção e do estado imunológico do paciente (Perfect et al.
2010). No entanto, a resistência a medicamentos e a recorrência da doença
após o tratamento são desafios significativos, destacando a necessidade de
novas estratégias terapêuticas. A epidemiologia da criptococose tem
evoluído, com mudanças nas áreas endêmicas e na distribuição dos
genótipos de Cryptococcus. Estudos recentes têm enfocado na análise
genética dos isolados para compreender melhor a ecologia, a virulência e os
padrões de resistência desses fungos (Firacative et al. 2018). Tal pesquisa

759
é fundamental para o desenvolvimento de políticas de saúde pública e
estratégias de prevenção.
A importância da criptococose como uma zoonose também tem sido
cada vez mais reconhecida. A transmissão de Cryptococcus de animais para
humanos, embora rara, representa um risco potencial, especialmente para
indivíduos imunocomprometidos, e reforça a necessidade de uma
abordagem One Health para o controle da doença (Bartlett et al. 2013). Este
trabalho tem como objetivo relatar um caso de criptococose felina
diagnosticado no interior do Amazonas ressaltando a importância da doença
devido ao seu potencial zoonótico e aos riscos à saúde pública. Através
deste estudo, busca-se contribuir para o entendimento da criptococose,
enfatizando a importância da vigilância epidemiológica e da pesquisa em
micologia.

Materiais e métodos
Para a identificação de fungos, foi adotado procedimento padrão de
cultura conforme rotina laboratorial de diagnóstico micológico. Inicialmente,
as amostras foram semeadas em placas de Ágar Sabouraud Dextrose
(KASVI®, Madrid, Spain) enriquecidas com cloranfenicol, e em Ágar Mycosel
(KASVI®, Madrid, Spain). Para cada tipo de amostra, foram preparadas
culturas em duplicata. Estas foram incubadas a temperaturas de 25 ºC e
37 ºC, por um período de até 10 dias. Durante este intervalo, as culturas foram
inspecionadas diariamente para monitoramento do crescimento fúngico. Após
o período de incubação, foram avaliadas as características macroscópicas e
micro morfológicas das colônias formadas. As colônias representativas de
leveduras foram transferidas para placas de Ágar Niger, para a confirmação
da presença do gênero Cryptococcus, dada a sua capacidade de assimilar
compostos específicos presentes no meio, resultando em alteração de cor.
Para a identificação microscópica, as colônias suspeitas foram submetidas a
uma coloração com tinta Nanquim para visualização da cápsula
polissacarídea característica do gênero Cryptococcus. Para a identificação
precisa, foi empregada a identificação automatizada utilizando o sistema Vitek
MS MALD-TOF (BioMérieux®, França), através da análise do perfil proteico
específico do organismo.

760
 Resultados e discussão
Um felino doméstico, sem raça definida, de um ano de idade e sexo
feminino, castrado, proveniente do município de Parintins – AM (Latitude: -
2.62835, Longitude: -56.7365 2° 37' 42" Sul, 56° 44' 11" Oeste, 595.238) (Figura
1), apresentou-se com lesões ulcerativas exsudativas na região nasal, testa
e arco zigomático esquerdo, exibindo drenagem de secreção sanguinolenta
(Figura 2A). Diante da suspeita clínica de cryptococose, amostras da lesão
nasal foram encaminhadas ao Laboratório Central de Saúde Pública –
(LACEN/FVS-RCP/AM) para análise micológica. A avaliação macroscópica
revelou três lesões ulceradas na face. Devido à limitação de material, não foi
possível realizar exame direto. Culturas em Ágar Sabouraud Dextrose, com
cloranfenicol, à temperatura de 25 ºC, evidenciaram crescimento de
leveduras, (Figura 2B) sem desenvolvimento em Ágar Mycosel. A análise
microscópica, após coloração com tinta nanquim, identificou estruturas
esféricas de 3,5 a 20 micrômetros, circundadas por uma cápsula, compatíveis
com Cryptococcus spp. (Figura 2C). A cultura em Ágar Niger confirmou a
identificação, com posterior confirmação de C. neoformans via Vitek MS
MALDI-TOF, com 99% de probabilidade.
Os sinais clínicos observados neste caso estão em concordância com
a literatura, que relata infecções do trato respiratório superior em 50 a 60%
dos casos de criptococose felina, e manifestações oculares em cerca de 15%
(Sykes et al. 2010). A infecção por Cryptococcus spp. em gatos
frequentemente ocorre por inalação de esporos presentes em ambientes
contaminados por excretas de pombos ou material orgânico em
decomposição, representando um risco significativo para animais com livre
acesso ao exterior e condição corporal debilitada (Trivedi et al. 2011; Mallick
et al. 2020).
Estudos recentes têm ampliado o entendimento sobre a epidemiologia
e o manejo da criptococose em felinos. Uma revisão por Duncan et al. (2019)
destacou a variabilidade genética de C. neoformans e C. gattii, influenciando
o espectro clínico da doença e suas implicações terapêuticas. Além disso, a
pesquisa por Oliveira et al. (2021) ressaltou a importância de medidas
preventivas e de controle ambiental para reduzir a exposição a Cryptococcus
em áreas endêmicas. Casos de similares de felinos infectados por

761
 Cryptococcus também foram observados por Rodrigues et al. (2020). O
contato com locais comumente implicados como reservatórios da levedura
como excreta de pombos e materiais em decomposição, pode ser um
potencial fator de risco, principalmente para animais de companhia com
condição corpórea insatisfatória e que tem livre acesso a rua (Dias et al.
2014). A identificação precisa do agente etiológico, como realizado neste
caso, é essencial para um tratamento direcionado e eficaz, reforçando a
relevância de técnicas avançadas de diagnóstico, como a espectrometria de
massa MALDI-TOF, na prática clínica veterinária (Fernandes et al. 2022).

Figura 1. Mapa do Brasil, com enfoque no estado do Amazonas, destacando a localização

geográfica do município de Parintins. Fonte: https://www.spatialnode.net/projects/mapa-de-
localizacao-de-parintins-no-para-73e99c.

762
Figura 2. A) Lesões provocadas pelo agente C. neoformans; B) Culturas semeadas e
tubos contento Ágar Niger e Ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol; C) Análise
microscópica pela coloração da tinta Nanquim.

Conclusão
Este estudo relata um caso de criptococose em um felino doméstico
proveniente de Parintins - AM, diagnosticado com lesões ulcerativas na região
nasal, testa e arco zigomático esquerdo. Através de métodos de cultura, análise
microscópica e identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF, foi
possível confirmar a infecção por Cryptococcus neoformans com alta
probabilidade. Os achados clínicos e laboratoriais deste caso estão em
consonância com a literatura, que destaca as infecções do trato respiratório
superior e manifestações oculares como apresentações comuns da doença em
felinos. A ocorrência de criptococose felina, uma zoonose potencialmente fatal,
destaca a importância de uma vigilância epidemiológica contínua, principalmente
em regiões endêmicas. Além disso, este caso reforça a relevância de medidas
preventivas e de controle ambiental para minimizar a exposição de animais
domésticos a áreas de risco, como aquelas contaminadas por excretas de
pombos ou material orgânico em decomposição. A identificação precisa do
agente etiológico através de técnicas avançadas de diagnóstico, como a
espectrometria de massa MALDI-TOF, é crucial para o manejo clínico eficaz da
doença. Este estudo contribui para o corpo de conhecimento sobre a
criptococose em felinos, evidenciando a necessidade de abordagens
diagnósticas e terapêuticas mais precisas, assim como a importância da
conscientização sobre os fatores de risco associados à doença. A criptococose

763
felina representa um desafio diagnóstico e terapêutico significativo, exigindo
atenção dos profissionais de saúde animal para o seu diagnóstico precoce e
tratamento adequado, além da implementação de estratégias efetivas de
prevenção e controle para proteger a saúde animal e pública.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Design in silico de epítopos da Mycobacterium tuberculosis

com base na proteína mpt64

Loureiro, Rebeca Trícia Oliveira1; Procópio, Rudi Emerson de Lima1

1Universidade do Estado do Amazonas

Email: [email protected]

Resumo
A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa crônica e transmissível de nível
global, causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mbt) que afeta
principalmente os órgãos do sistema respiratório, sendo uma das principais
causas dos problemas de saúde pública mundial. Logo, é necessário o
desenvolvimento de novos métodos de imunodiagnósticos para o controle e a
prevenção da doença. O uso de proteínas recombinantes, por meio da
bioinformática, tem se mostrado uma alternativa para a produção de testes
sorológicos com base no complexo antígeno-anticorpo. Portanto, a pesquisa tem
como objetivo o design e a construção in silico de epítopos recombinantes da M.
tuberculosis com base na proteína MPT64. Foi utilizada a sequência de
aminoácidos da M. tuberculosis H37Rv, MPT64 (NC_000962.3) baixada do gene
bank database, a qual segundo o IEDB e BepiPred2.0 apresentou 3 regiões
satisfatórias para a produção de epítopo de células B, 23 a 41, 137 a 153 e 169
a 187, sendo a primeira e a última selecionadas. Adiante, a proteína
recombinante foi construída, composta pelas duas sequências selecionadas
ligadas pelo ligante flexível (GPGP) e a poli-histidina na parte final da sequência.
Em seguida, foi feita a previsão de antigenicidade pelo ANTIGENpro, a qual
demonstrou que a proteína heteróloga possui potencial antigênico, com uma
pontuação de 0,671. Já em relação a conformação da estrutura proteica, foi
usado o I-TASSER, que apresentou a concentração de α-hélice no início e no
final da estrutura, além da presença da fita-β na parte intermediária da proteína.
Por fim, foi feito a construção do vetor pET28b (+) por meio do SnapGene Viewer.
Portanto, in silico a proteína demonstrou ter capacidade imunogênica,
entretanto, é necessário realizar sua expressão em um sistema bacteriano a fim
de averiguar sua ação imunológica.

Palavras-chave: Diagnóstico, Imunoinformática, Peptídeo recombinante,

Tuberculose.

Introdução
A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa crônica que afeta
principalmente o sistema respiratório e apresenta o bacilo Mycobacterium
tuberculosis (Mbt) como agente etiológico, sendo considerada uma das
principais causas de morbimortalidade do mundo (Fihiruddin et al. 2022; Gill et

766
al. 2022). Logo, a busca por novos métodos de diagnósticos rápidos e precisos
são uma prioridade para o controle e a prevenção da TB (Cheng et al. 2011; Xiao
et al. 2019).
Os testes sorológicos se destacam por sua rapidez, baixo custo,
simplicidade e versatilidade (Steingart et al. 2012). Estes, se baseiam na reação
entre antígenos e anticorpos específicos, apresentando o primeiro como
potencial candidato para testes de vacinas de DNA recombinante, e o segundo
para o desenvolvimento de biomarcadores (Yang et al. 2011; Sulman et al.
2021).
A proteína MPT64 é um antígeno secretado específico das espécies do
complexo Mbt e se destaca pela sua forte resposta celular, promovendo a
sobrevivência e consequentemente a virulência da micobactéria. Além disso,
também é uma das primeiras proteínas secretadas a ser reconhecida pelo
sistema imunológico do hospedeiro, gerando assim, a resposta imune inicial em
indivíduos infectados por Mbt (Sypabekova et al. 2019; Grønningen et al. 2021).
Portanto, essa proteína demonstra ser um antígeno promissor para testes de
sorodiagnósticos (Fihiruddin et al. 2022).
O rápido avanço da imunoinformática contribui para a seleção de epítopos
imunogênicos, facilitando o desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico.
Logo, o objetivo do trabalho é realizar o design e a construção in silico de
epítopos para geração de anticorpos contra tuberculose, com base na proteína
MPT64.

Material e Métodos
Seleção da proteína da M. tuberculosis H37Rv
Foi utilizada a sequência de aminoácidos da proteína secretora da M.
tuberculosis H37Rv (NC_000962.3), isto é, a proteína imunogênica MPT64
(NP_216496.1) retirada do GenBank DataBase
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome).

767
Figura 1. Sequência de aminoácidos da proteína MPT64 da M. tuberculosis H37Rv.
Predição de epítopos de célula B
A sequência da proteína MPT64 (NP_216496.1) foi submetida aos
servidores IEDB (http://tools.iedb.org/bcell/) e DTU Health Tech
(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?BepiPred-2.0), sendo que o
primeiro utilizou a ferramenta Antibody Epitope Prediction e o segundo a
BepiPred 2.0 visando a análise da predição de epítopos de célula B.

Previsão de antigenicidade
Para a previsão de antigenicidade da proteína com epítopos
selecionados, foi utilizada a ferramenta da web ANTIGENpro presente no
servidor SCRATCH Protein Predictor (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/).

Predição de estrutura da proteína

Para predição da estrutrura da proteína da sequência obtida, foi usado o
I-TASSER (https://zhanggroup.org/I-TASSER/).

Construção do plasmídeo de expressão

Foi feita a tradução reversa dos códons presentes na sequência de
peptídeo recombinante a fim de realizar a sua expressão. Nessa sequência
foram introduzidos os locais de restrição Nco I e Xho I no terminal N e C,
respectivamente, com a finalidade de clonar a sequência do gene sintetizado no
vetor pET28b (+). A construção do modelo da sequência foi feita no SnapGene
Viewer (https://www.snapgene.com/snapgene-viewer).

Resultados e Discussão
As análises obtidas de ambos os servidores, utilizando o método de
predição linear de epítopo BepiPred 2.0, demonstraram regiões similares que
podem ser usadas para a geração de epítopos de célula B, conforme a figura 2.

768
Figura 2. Predição de epítopos de célula B segundo o método BepiPred 2.0 do servidor IEDB.
As áreas amarelas presentes no gráfico indicam a presença de epítopos de células B da
proteína secretada MPT64.

Os resultados adquiridos do IEDB mostram que os aminoácidos de 23 a

41, 137 a 153 e 169 a 187 são as melhores regiões para produzir epítopos, uma
vez que apresentam um tamanho de 19, 17 e 19, respectivamente, sendo uma
característica da ligação de epítopos de célula B, conforme descrito em outros
trabalhos (Rubinstein et al. 2008; Van Regenmortel et al. 2009; Kringelum et al.
2013). Logo, as maiores sequências foram escolhidas para a próxima etapa.
Segundo a figura 3, na construção do peptídeo recombinante foi utilizada
a metionina, dando início à síntese, seguido do epítopo inicial (presente na região
23 a 41), ligante flexível (GPGP), epítopo final (localizado na região 169 a 187)
e da cauda de histidina (6x His-Tag) para posterior purificação do peptídeo.

Figura 3. Peptídeo recombinante contendo os dois epítopos preditos em verde, ligante

flexível em vermelho, metionina e 6x His-Tag em azul, respectivamente.

O ANTIGENpro é um software que apresenta bom desempenho na

classificação da antigenicidade de proteomas (Magnan et al. 2010). Baseado na
composição de aminoácidos, essa ferramenta apresentou uma pontuação de
0,671 para a sequência de peptídeo construída, demonstrando assim um
potencial antigênico.

769
 A análise da conformação da proteína recombinante, avaliada no I-
TASSER, é mostrada na figura 4.

Figura 4. Predição da estrutura 3D da proteína recombinante MPT64 sob diferentes ângulos

(A) e análise de enovelamento da proteína (B), ambos projetados pelo I-TASSER.

A predição da estrutura 3D da proteína, apresentou um modelo para cada

domínio e o completo enovelamento desta (Figura 4A). Também é possível
perceber a concentração de α-hélice no início e no final da estrutura proteica,
além da presença da fita-β na parte intermediária da proteína (Figura 4B).
A figura 5 mostra o resultado da construção da sequência do vetor, com
uma representação do gene da proteína MPT64 recombinante a ser inserido e
das enzimas de restrição Nco I e Xho I.

Figura 5. Plasmídeo pET28b contendo a sequência de DNA para a expressão da proteína

recombinante (entre RBS e 6xHis).

O plasmídeo pET28b contém em sua estrutura o promotor do bacteriófago

T7 sob controle do repressor Lac, marcador de resistência a canamicina, e uma

770
região de poli-hisitidina, sendo a última, a etiqueta mais utilizada em vetores para
purificação da proteína recombinante conforme relatado em outras pesquisas
(Shao et al. 2015; Huang et al. 2018; Zhang et al. 2021). Além disso, é um
plasmídeo de baixo número de cópias e excelente para expressão de proteínas
heterólogas, sendo um dos mais utilizados em pesquisas da área de engenharia
genética (Nicolini et al. 2013; Lin et al. 2015; Yang et al. 2017; Yang et al. 2020;
Thakur e Singh 2022).

Conclusões
A sequência de aminoácidos da MPT64 apresentou 3 regiões satisfatórias
para a produção de epítopo, no entanto, foram selecionadas apenas aquelas
contendo 19 aminoácidos (regiões 23 a 41 e 169 a 187). A construção do
peptídeo recombinante foi composta pela união das duas sequências de
epítopos através do ligante flexível (GPGP) e da poli-histidina no final da
sequência. Quanto a antigenicidade, o peptídeo heterólogo demonstrou ter
potencial antigênico, com uma pontuação de 0,671 segundo o ANTIGENpro. Já
em relação a estrutura 3D da proteína, esta apresentou a concentração de α-
hélice no início e no final, além da presença da fita-β na parte intermediária da
proteína. Por fim, foi realizada a construção do vetor pET28b (+) por meio do
SnapGene Viewer. Portanto, in silico a proteína demonstrou ter capacidade
imunogênica, entretanto, é necessário realizar sua expressão em um sistema
bacteriano a fim de averiguar sua ação imunológica.

Referências
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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Distribuição espacial e frequência de casos de Sporothrix sp.

em amostras laboratoriais de Manaus

Nascimento, Pármenas Costa Macedo do1; Plesu, Eldaiana Silva1; Junior,

Cláudio de Souza1; Guilherme Soares do Carmo1; Danin, Amanda Paula
Ferreira1,2

1Centro Universitário FAMETRO, 2Patoclinvet Laboratório Clínico Veterinário

E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
A esporotricose, causada pelo fungo Sporothrix sp., é uma micose prevalente
em regiões tropicais e temperadas, afetando tanto humanos quanto felinos. A
cidade de Manaus, nos anos de 2020 e 2021, enfrentou uma epidemia da
doença, com um aumento expressivo de casos. O objetivo deste estudo é
descrever o perfil epidemiológico dos casos positivos para Sporothrix sp. em
amostras recebidas por um laboratório em Manaus, analisando a
interdependência entre variáveis associadas à presença da doença e sua
distribuição espacial. Utilizando uma abordagem transversal, descritiva e
ecológica, foram coletadas 26 amostras de felinos de diferentes regiões de
Manaus para exames citológicos. Dos 26 casos analisados, 16 (61,53%) foram
diagnosticados como positivos para esporotricose, com uma média de 5,33
casos por mês. A análise do perfil epidemiológico revelou uma predominância
de casos em machos adultos (56,25%), especialmente na zona centro-oeste
(56,25%). A distribuição espacial indicou uma concentração em seis bairros,
destacando as zonas centro-oeste e centro-sul. A prevalência da esporotricose
em felinos, especialmente em machos adultos, corrobora com estudos
anteriores, ressaltando comportamentos típicos da espécie como fatores de
risco. A associação significativa entre a idade dos felinos e a presença da doença
reforça a importância de considerar diferentes faixas etárias na análise
epidemiológica. A concentração de casos em áreas específicas aponta para a
necessidade de estratégias preventivas direcionadas a essas regiões. A análise
das amostras de citologia revelou uma alta prevalência de esporotricose em
felinos, destacando uma predominância em machos adultos e uma concentração
na zona centro-oeste de Manaus. A persistência da enfermidade nessa região
sugere a necessidade urgente de estratégias preventivas e de controle
específicas, visando conter a propagação da esporotricose.

Palavras-chave: Citologia, Saúde pública, Zoonose.

Introdução
O Sporothrix sp., agente causador da esporotricose, é um fungo dimórfico
saprófito patogênico complexo (Antunes et al. 2009; Vásquez-del-Mercado et al.
2012), composto por pelo menos seis espécies: S. schenckii, S. brasiliensis, S.

774
globosa, S. mexicana, S. luriei e S. pallida (Rodrigues et al. 2013). Embora esses
fungos tenham distribuição global, são frequentemente encontrados em regiões
tropicais e temperadas (Greene 2015).
A esporotricose é uma micose subaguda ou crônica que afeta humanos
e, principalmente, felinos. Em felinos, ela se manifesta predominantemente na
forma cutânea, apresentando lesões ulceradas (Pires 2017), frequentemente
localizadas na região da face e nos membros torácicos (Crothers et al. 2009).
Essa doença representa um risco ocupacional para aqueles que lidam
com o solo devido à alta probabilidade de infecção por inoculação fúngica
através de ferimentos (Greene 2015). Além disso, a transmissão de animais para
humanos destaca seu papel como uma doença emergente com significativa
importância para a saúde pública, devido ao seu caráter zoonótico (Gonçalves
et al. 2019).
O exame citológico é o método preferencial para diagnosticar a
esporotricose em gatos, devido à elevada carga parasitária nas lesões e à sua
natureza rápida e econômica (Silva et al. 2012). A coloração facilita a
identificação das formas leveduriformes características do fungo (Larsson 2011).
O tratamento, que dura de 16 a 80 semanas (Rocha 2014), utiliza o
Itraconazol como fármaco principal devido ao seu amplo espectro de ação
(Nobre et al. 2002). Em casos de impossibilidade de tratamento devido a
limitações econômicas e ao longo período necessário (Barros et al. 2010;
Larsson 2011), a eutanásia é recomendada, pois a doença representa um risco
à saúde pública (SES-AM 2022).
Em Manaus, nos anos de 2020 e 2021, houve um crescente número de
casos confirmados, configurando uma epidemia na região (Machado et al. 2022).
Secretaria Municipal de Saúde de Manaus confirmou 300 casos de esporotricose
animal entre novembro de 2020 e julho de 2022 (MANAUS 2022). A Secretaria
de Estado de Saúde do Amazonas (SES-AM 2022) relatou que apenas no ano
de 2022, 167 casos em humanos foram confirmados na cidade.
Diante do aumento de casos e da impactante presença dessa zoonose no
contexto da saúde pública, este estudo tem como propósito descrever o perfil
epidemiológico dos casos positivos para Sporothrix sp. em amostras recebidas
por um laboratório da cidade, no período entre novembro de 2022 e janeiro de

775
2023, e analisar a interdependência entre as variáveis associadas à presença da
doença e sua distribuição espacial.

Material e Métodos
Este estudo, de natureza transversal, descritiva e ecológica, foi conduzido
na cidade de Manaus, Amazonas. A população alvo compreendeu felinos cujas
amostras cutâneas foram encaminhadas por 11 clínicas veterinárias localizadas
nas zonas norte, centro-oeste, centro-sul e sul para o Laboratório de Patologia
Clínica Veterinária. No período de 15 de novembro de 2022 a 15 de janeiro de
2023, 26 amostras foram recebidas, apresentadas em lâminas de citologia,
coletadas por meio das técnicas de imprint e/ou swab estéril. Fragmentos de
tecidos, secreções ou escamas provenientes de lesões foram examinados.
A escolha do método de coloração envolveu o uso do kit panótico rápido,
composto por três corantes: Rápido 1 (agente fixador - solução de triarilmetano
a 0,1%), Rápido 2 (solução corante de hemácias - solução de xantenos a 0,1%),
e Rápido 3 (solução corante de leucócitos e plaquetas - solução de tiazinas a
0,1%), com tempos de 30, 30 e 60 segundos nos respectivos corantes. A leitura
microscópica foi realizada utilizando a lente objetiva 100x com a inclusão de óleo
de imersão para aprimorar a visualização.
Na análise estatística, foram empregados testes de medida central e
medidas de frequência absoluta e relativa. As variáveis de interesse incluíram
sexo, idade (categorizada em jovens: <1 ano; adultos: 1-7 anos; idosos: >7 anos)
e a região de Manaus onde a amostra foi coletada. Os dados foram submetidos
a análise usando o software Tableau Desktop e Microsoft Excel. Para avaliar a
relação entre as variáveis e a presença da doença, foi conduzido o teste G de
independência, utilizando o software Bioestat 5.3, estabelecendo um intervalo de
confiança (IC) de 95%, p=0,05 como nível de significância, e um erro amostral
de 5%. Para a elaboração de mapas temáticos, foi utilizado o QGIS 3.26, com
base em um arquivo vetorial disponibilizado pelo Instituto Municipal de
Planejamento Urbano - IMPLURB.

776
 Resultados e Discussão
Nos resultados dos exames de citologia cutânea em felinos (Tabela 1),
observou-se que 16 em 26 casos (61,53%) foram diagnosticados como positivos
para esporotricose, com uma média de 5,33 casos por mês.

Tabela 1. Frequência de exames de citologia de pele em felino em três meses e seus

respectivos resultados, por zonas e bairros de Manaus, frequência absoluta e relativa.
Mês
Total
Resultado Zona Bairro Novembro Dezembro Janeiro
(n=26)
(n=7) (n=7) (n=12)
Centro- Da Paz 1/7 1/26
oeste - (14.28%) - (3.84%)
Chapada 2/7 2/7 2/12 6/26
(28.57%) (28.57%) (16.66%) (23.07%)
Negativo
Centro- Flores 1/7 1/7 2/26
sul (14.28%) (14.28%) - (7.69%)
Parque 10 de 1/12 1/26
Novembro - - (8.33%) (3.84%)
Alvorada 2/12 2/26
Centro- - - (16.66%) (7.69%)
oeste Da Paz 2/7 2/7 3/12 7/26
(28.57%) (28.57%) (25%) (26.92%)
Centro- Chapada 2/7 2/12 4/26
sul (28.57%) - (16.66%) (15.38%)
Positivo
Cidade Nova 1/7 1/26
Norte
- (14.28%) - (3.84%)
Compensa 1/12 1/26
Oeste
- - (8.33%) (3.84%)
Morro da 1/12 1/26
Sul
Liberdade - - (8.33%) (3.84%)
Fonte: LPVAD, 2023

A análise do perfil epidemiológico dos casos positivos (Tabela 2) revelou

que 9 dos 16 casos (56,25%) pertenciam ao sexo masculino, enquanto 7 dos 16
casos (43,75%) eram do sexo feminino. Quanto à faixa etária, 14 dos 16 casos
(81,25%) eram adultos, e 2 dos 16 casos (18,75%) eram idosos. No que diz
respeito à distribuição geográfica, as zonas identificadas com casos positivos
foram as seguintes: centro-oeste, com 9 dos 16 casos (56,25%); centro-sul, com
4 dos 16 casos (25%); sul, com 1 dos 16 casos (6,25%); e norte, com 1 dos 16
casos (6,25%).

777
Tabela 2. Ocorrência de casos de esporotricose em três meses, em frequência absoluta e
relativa.
Mês p-valor
TOTAL
Variável Novembro Dezembro Janeiro (Teste G)
(n=16)
(n*=4) (n=3) (n=9) (IC 95%)
Sexo
7/16
Fêmea 1/4 (25) 1/3 (33.33) 5/9 (55.55) (43.75)
2.3292
9/16
Macho 3/4 (75) 2/3 (66.66) 4/9 (44.44) (56.25)
Faixa etária
13/16
Adulto 3/4 (75) 2/3 (66.66) 8/9 (88.88) (81.25)
< 0.05
3/16
Idoso 1/4 (25) 1/3 (33.33) 1/9 (11.11) (18.75)
Região
Norte - 1/3 (33.33) - 1/16 (6.25)
Sul - - 1/9 (11.11) 1/16 (6.25)
Oeste - - 1/9 (11.11) 1/16 (6.25)
nsa**
Centro- 9/16
oeste 2/4 (50) 2/3 (66.66) 5/9 (55.55) (56.25)
Centro-sul 2/4 (50) - 2/9 (22.22) 4/16 (25)
Fonte: LPVAD, 2023.
*n=população
**Não se aplica: por serem inferiores a 1, esses valores se tornam incalculáveis utilizando o
BioEstat 5.3.

A distribuição espacial dos casos de esporotricose, conforme ilustrado na

Figura 1, apresentou uma concentração notável em seis bairros abrangendo
diferentes zonas de Manaus: Da Paz (7/16), Chapada (4/16), Alvorada (2/16),
Compensa (1/16), Morro da Liberdade (1/16) e Cidade Nova (1/16). Ao longo dos
meses, observou-se um aumento da incidência da esporotricose, especialmente
nas regiões Centro-oeste e Centro-sul.

778
Figura 1. Mapa de distribuição espacial de casos de esporotricose, por bairros e zonas
administrativas, entre novembro de 2022 e janeiro de 2023. Manaus, AM, 2021.

779
 Ao contrastar a situação atual da capital do Amazonas com outras capitais
brasileiras, a região do Rio de Janeiro é reconhecida como um local endêmico
para a esporotricose (Silva et al. 2012). No ano de 2022, na cidade do Rio de
Janeiro, de acordo com o Instituto Municipal de Vigilância Sanitária, Vigilância
de Zoonoses e de Inspeção Agropecuária (IVISA-Rio 2022), foram registrados
519 casos confirmados da micose. Em paralelo, na capital amazonense, esse
número é próximo, totalizando 521 casos em animais, conforme identificado pelo
Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) e divulgado pela SEMSA (MANAUS
2023), sendo que 340 destes estão concentrados na zona Oeste. Os casos
positivos destacados nesta pesquisa concentram-se principalmente na zona
Centro-oeste, vizinha à zona Oeste, com apenas 1 caso, levantando duas
possíveis hipóteses: uma disseminação para outros bairros antes não
endêmicos, especialmente em janeiro de 2023, representando 56,25% dos
casos identificados aqui, podendo indicar a propagação da doença por meio da
interação de animais contaminados ou pela mesma fonte ambiental (Bazzi et al.
2016); ou a falta de atendimento laboratorial por parte do LPV.
Quanto ao sexo dos felinos, embora não tenham sido estatisticamente
significativos, os machos representam a maioria dos casos da doença (56,25%).
Essa predominância sexual foi também observada por Bazzi et al. (2016) e
Almeida et al. (2018), atribuindo essa alta porcentagem de machos afetados aos
comportamentos típicos da espécie, principalmente brigas, disputas territoriais e
busca de fêmeas para acasalamento (Greene 2015).
A idade dos animais emergiu como um fator relevante na presença da
doença, conforme indicado pelo teste G, apresentando um valor estatisticamente
significativo (<0,05). Neste estudo, verificou-se que os felinos adultos (81,25%)
foram os mais afetados pelo Sporothrix sp. A fase sexual ativa desses animais
pode ter influenciado na suscetibilidade à contaminação. Bazzi et al. (2016)
também destaca a idade mais comum dos felinos com esporotricose, geralmente
em torno de 5 anos.

Conclusões
A análise das amostras de citologia revelou que mais da metade
apresentou resultados positivos para esporotricose, indicando uma prevalência
da doença. Os felinos mais afetados foram machos adultos, ressaltando um

780
padrão de vulnerabilidade específico nessa categoria. A zona centro-oeste
emergiu como a área com maior incidência, mantendo casos constantes ao
longo dos três meses de avaliação, o que sugere uma preocupante persistência
da enfermidade nessa região. A proximidade com outros bairros afetados aponta
para a possibilidade de uma disseminação mais ampla, destacando a
necessidade de estratégias preventivas e de controle direcionadas, visando
conter a propagação da esporotricose.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Frequência de fungos identificados em laboratório de patologia

clínica veterinária em Manaus – AM

Nascimento, Pármenas Costa Macedo do1; Plesu, Eldaiana Silva1; Junior,

Cláudio de Souza1; Guilherme Soares do Carmo1; Danin, Amanda Paula
Ferreira1,2

1Centro Universitário FAMETRO, 2Patoclinvet Laboratório Clínico Veterinário

E-mails: [email protected], [email protected]

Resumo
A dermatofitose é uma infeção fúngica que afeta cães, gatos e humanos, sendo
originada, principalmente, pelos agentes patogénicos Microsporum sp.,
Trichophyton sp. e Epidermophyton sp. Além destes, outros fungos, como
Aspergillus sp. e Penicillium sp., também podem ser responsáveis por
dermatopatias. Este estudo teve como objetivo identificar fungos dermatófitos e
não dermatófitos em amostras de um laboratório de patologia clínica veterinária
em Manaus, entre setembro de 2022 e janeiro de 2023, analisando seu perfil
epidemiológico e possíveis associações entre espécies de fungos. O estudo, de
natureza descritiva e retrospectiva, avaliou os resultados de culturas fúngicas em
amostras de caninos e felinos, utilizando meio de cultura DTM e Agar Sabouraud.
A tabulação e análise estatística dos dados foram conduzidas meticulosamente.
Metade das amostras positivas estava associada a fungo não dermatófito, sendo
as associações mais frequentes aquelas entre Microsporum sp. e Aspergillus sp.
A predominância de fungos não dermatófitos foi evidente, especialmente em
animais do sexo masculino da espécie canina, com idades compreendidas entre
1 e 7 anos. Esses resultados ressaltam a intricada natureza das infeções
fúngicas em animais domésticos em Manaus, indicando também a possível
influência das variações climáticas sazonais.

Palavras-chave: Cultura fúngica, Dermatopatias, Veterinária.

Introdução
A dermatofitose, uma infecção fúngica que afeta tanto humanos quanto
cães e gatos, incide nos tecidos queratinizados, onde os agentes patogênicos
degradam a queratina presente nos pelos, unhas e pele por meio de
queratinases (Azulay et al. 2017). Essa condição é uma antropozoonose comum
na rotina clínica de pequenos animais, desencadeando alterações
dermatológicas marcadas por alopecia multifocal, descamação e diversas lesões
(Andrade e Rossi 2019; Cafarchia et al. 2004).

784
 Os principais fungos dermatófitos, Microsporum sp., Trichophyton sp., e
Epidermophyton sp., são prevalentes em animais de companhia, sendo o
Microsporum sp. e Trichophyton sp. os mais comuns (Mercer e Stewart 2019).
Esses fungos se alimentam da queratina, considerada nutriente essencial para
sua sobrevivência (Cafarchia et al. 2004). Além dos dermatófitos, outros fungos,
como os saprófitos dos gêneros Aspergillus sp. e Penicillium sp., podem causar
micoses cutâneas (Frias e Kozusny-Andreani 2008).
A transmissão da dermatofitose ocorre por contato direto ou indireto,
sendo direto quando há contato com o animal afetado pelo fungo e indireto
através do ambiente e fômites, como cobertores e recipientes (Silva et al. 2011).
No caso do ser humano, o Microsporum canis é o agente mais frequentemente
associado à dermatofitose, sendo reconhecido mundialmente como causador
tanto em animais quanto em humanos O Microsporum canis é o agente mais
frequentemente associado à dermatofitose em humanos, reconhecido
mundialmente como causador tanto em animais quanto em pessoas (Amorim
2020). Embora a enfermidade não seja específica em relação à idade e sexo, é
mais observada em animais jovens, portadores de enfermidades prévias ou
idosos (Moriello 2004; Souza et al. 2022).
Os sinais clínicos geralmente se manifestam aproximadamente três
semanas após a exposição ao agente patogênico (Souza et al. 2022). Os
sintomas comuns incluem alopecia, lesões circulares, eritema, escamas, crostas
e prurido, podendo resultar em lesões traumáticas na pele do animal devido ao
prurido (Neves et al. 2011; Moriello et al. 2017; Soares e Sérvio 2022). Alguns
animais, mesmo infectados, podem ser portadores assintomáticos, contribuindo
assim como reservatórios (Souza et al. 2022).
O diagnóstico da dermatofitose envolve o histórico clínico do animal,
exame físico e microscopia, sendo a cultura fúngica o método mais empregado
e confiável (Crivellenti e Borin-Crivellenti 2021). O meio de cultura para
dermatófitos (DTM) contém ágar Sabourand, antimicrobianos para inibir o
crescimento de bactérias e fungos saprófitos, e vermelho fenol como indicador
de pH (Birchard e Sherding 2008). O exame microscópico direto verifica a
presença de hifas e artroconídeos, embora amostras insuficientes ou mal
escolhidas possam resultar em falsos negativos (Mattei et al. 2014).

785
 O tratamento é realizado de forma sistêmica e tópica (Soares e Sérvio
2022). O tratamento sistêmico inclui antifúngicos orais, como itraconazol,
cetoconazol, fluconazol ou griseofulvina, sendo estes os fármacos mais
comumente utilizados para o combate à micose (Amorim 2020). Associado ao
tratamento sistêmico, o tratamento tópico é essencial para a melhoria clínica do
paciente, podendo ser aplicado na forma de cremes, loções e shampoos com
princípios ativos como miconazol, clotrimazol ou enilconazol (Soares e Sérvio
2022). A limpeza do ambiente é também fundamental para a erradicação do
fungo, contribuindo para a eficácia e rapidez do tratamento clínico (Avante et al.
2009; Souza et al. 2022).
A elevada prevalência da dermatofitose resulta das condições ambientais
locais, como alta temperatura e umidade, características predominantes na
cidade de Manaus. Diante desse contexto, este trabalho objetiva descrever os
resultados obtidos de culturas fúngicas para fungos dermatófitos e não
dermatófitos de amostras recebidas em um laboratório veterinário no período
entre setembro de 2022 e janeiro de 2023, além de identificar seu perfil
epidemiológico.

Material e Métodos
O presente estudo, de natureza descritiva e retrospectiva, concentra-se
na análise dos resultados de exames de cultura fúngica realizadas em amostras
de caninos e felinos por um laboratório de patologia clínica veterinária em
Manaus, Amazonas. O período abrangido pela pesquisa compreende setembro
de 2022 a janeiro de 2023. A coleta de dados foi realizada a partir do arquivo
laboratorial e do sistema Vetcloud.
Nesta investigação, foram consideradas tanto as espécies de fungos
dermatófitos (FD) quanto não dermatófitos (FND) presentes nas culturas
fúngicas, com o intuito de identificar possíveis associações, além de analisar os
resultados positivos e negativos. As amostras foram coletadas em clínicas
veterinárias de diversas regiões de Manaus, sendo devidamente identificadas e
acondicionadas em frascos estéreis antes de serem enviadas ao laboratório,
acompanhadas de suas respectivas requisições.
O exame de cultura fúngica utilizou a técnica de laminocultivo,
empregando o meio Agar D.T.M. na face larga da lâmina e os meios Agar

786
Sabouraud Glicose Seletivo e Agar BiGGY na face dividida da lâmina. Durante a
análise, foram observadas as características da colônia fúngica, tais como
coloração e aspecto, bem como o pigmento frente e verso da cultura fúngica, ao
longo de um período de 20 dias. A análise microscópica foi realizada da seguinte
maneira: um fragmento de fita adesiva foi utilizado para realizar o imprint em
ambas as faces dos meios de cultura. Posteriormente, uma gota de corante azul
de algodão foi aplicada sobre a lâmina de microscopia, e a fita foi sobreposta na
lâmina de microscopia. Este procedimento foi repetido para todas as faces dos
meios de cultura. Em seguida, visualizou-se as estruturas utilizando as lentes de
microscopia 10x, 40x e 100x, respectivamente.
A tabulação dos dados foi conduzida por meio das ferramentas Microsoft
Excel 2016 e Tableau Desktop 2022.2. A análise estatística foi realizada
utilizando o software BioEstat 5.0 para auxiliar na distribuição e frequência
relativa e absoluta das variáveis a serem estudadas, tais como espécie de fungo,
sexo, idade e espécie animal.

Resultados e Discussão
Durante o período de investigação, foram coletadas 56 amostras
destinadas à análise de culturas fúngicas. Dentre essas amostras, 40
manifestaram crescimento, representando uma taxa de 40% de positividade para
dermatófitos, conforme registrado na Tabela 1. Dessas amostras positivas,
constatou-se que a metade estava concomitantemente associada a um fungo
não dermatófito. Foram identificadas 14 amostras com infecções fúngicas
duplas, sendo 8 apresentando coexistência de fungos dermatófitos e fungos não
dermatófitos, e 6 com duas variedades de fungos não dermatófitos.

Tabela 1. Perfil epidemiológico de distribuição de fungos dermatófitos (FD) e fungos não

dermatófitos (FND) em amostras de culturas fúngicas de animais domésticos
Fungos dermatófitos Fungos não dermatófitos
FD e FND
Característica (FD) (FND)
n=16 % n=24 % n=8 %
Sexo
Fêmea 6 37.5 14 58.3 3 37.5
Macho 10 62.5 10 41.7 5 62.5
Espécie
Canina 14 87.5 21 87.5 7 87.5
Felina 2 12.5 3 12.5 1 12.5

787
Faixa etária,
anos
<1 1 6.3 3 12.5 1 12.5
1a7 12 75.0 17 70.8 6 75
>7 3 18.8 4 16.7 1 12.5
A análise da frequência das espécies de fungos identificados nas
amostras (Figura 1) indica uma prevalência de fungos não dermatófitos, com
destaque para Aspergillus sp.

Figura 1. Distribuição das espécies de fungos dermatófitos e não dermatófitos em amostras

de culturas fúngicas de animais domésticos.

As principais associações observadas foram Microsporum sp. em

conjunto com Aspergillus sp. (28.6%) e Trichophyton sp. associado a Aspergillus
sp. (21.4%). Além disso, no grupo de não dermatófitos, Aspergillus sp. associado
a Malassezia sp. foi a associação mais frequente (35.7%) (Tabela 2).

Tabela 2. Distribuição de tipos de fungos e associações correspondentes, em frequência

absoluta e relativa.
Tipo de fungo Associação N %
Dermatófitos Microsporum sp. + Aspergillus sp. 4 28.6
Dermatófitos Trichophyton sp. + Aspergillus sp. 3 21.4
Dermatófitos Trichophyton sp. + Penicillium sp. 1 7.1
Não dermatófitos Aspergillus sp. + Malassezia sp. 5 35.7
Não dermatófitos Malassezia sp. + Penicillium sp. 1 7.1

788
 Ao comparar nossos resultados com o estudo de Smaniotto e Botelho
(2019), observamos semelhanças na faixa etária dos animais com fungos
dermatófitos e não dermatófitos. Além disso, a associação encontrada por Fialho
et al. (2023) indicando que gatos têm 4,556 vezes mais chances de apresentar
dermatofitose do que cães e filhotes têm 1,625 vezes mais chances do que
animais adultos ou idosos, contrasta com nossos achados. Em nossa amostra,
observamos uma maior frequência de cães afetados e uma predominância de
animais com idades entre 1 a 7 anos.
Fialho et al. (2023), assim como Smaniotto e Botelho (2019) e Neves et
al. (2011) também destacaram as fêmeas como o principal sexo afetado. Essa
concordância entre estudos sugere uma tendência consistente na maior
predisposição das fêmeas à dermatofitose em animais de companhia.
Quanto às espécies específicas de fungos, apesar de Microsporum sp. e
Trichophyton sp. terem a mesma frequência em nosso estudo, Microsporum sp.
foi a espécie mais prevalente em estudos anteriores, como os de Neves et al.
(2011), Balda et al. (2004) e Fialho et al. (2023).
No que diz respeito à interação entre fungos dermatófitos e não
dermatófitos, o estudo de Lemes (2020) explica que a inexistência da associação
entre leveduras como Malassezia sp. e dermatófitos filamentosos como
Microsporum sp. e Trichophyton sp. pode ser atribuída à ação antagônica das
leveduras, inibindo o crescimento dos filamentosos.
A sazonalidade observada nos eventos intensos de chuvas,
especialmente entre novembro e maio (Aleixo e de Paula 2023), coincide com o
período de estudo. Ao contextualizar esses achados em relação à
vulnerabilidade da cidade de Manaus a eventos extremos de chuvas, conforme
evidenciado por Fernandes (2017), destaca-se interação complexa entre fatores
biológicos, sazonais e ambientais para uma abordagem holística na
compreensão das dermatopatias por fungos dermatófitos e não dermatófitos em
Manaus.

Conclusões
Neste estudo, observou-se que a maioria das amostras analisadas
revelou a presença de fungos não dermatófitos, apontando para uma
predominância dessas infecções fúngicas cutâneas. Os animais mais

789
suscetíveis a essas condições foram predominantemente do sexo masculino, da
espécie canina e apresentavam idades compreendidas entre 1 a 7 anos. A
análise das associações entre diferentes espécies de fungos enfatizou a
prevalência de Aspergillus sp., especialmente quando associado a Microsporum
sp. e Trichophyton sp. Esses resultados sublinham a complexidade das
infecções fúngicas em animais domésticos em Manaus, destacando a influência
potencial das variações climáticas sazonais nesse cenário.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Fungos endofíticos isolados da espécie Eleutherine plicata,

Herb. (Iridaceae), com atividade antibacteriana

Ferreira, Rayane Bonfim1; Aguiar, Aline Lima1; Silva, Ana Luiza Figueira1; Sousa
Junior, José Jeosafá Vieira1; Silva, Silvia Katrine Rabelo1; Santos, Aysla Mclane
Lobato1; Canto, Eveleise Samira Martins1

1Universidade Federal do Oeste do Pará

E-mails: [email protected]; [email protected]

Resumo
Os fungos endofíticos são microrganismos que habitam os tecidos internos das
plantas, sem causar danos aparentes ao seu hospedeiro. Além disso, são
responsáveis pela produção de metabólitos secundários com potencial bioativo.
Alguns produzem substâncias químicas caracterizadas originalmente pela planta
hospedeira. Desse modo, o presente trabalho tem como objetivo identificar
fungos endofíticos presentes de Eleutherine plicata com atividade antibacteriana.
O isolamento dos fungos endofíticos foram realizados a partir de folhas, bulbos
e raízes de E. plicata, obtidos de três pontos localizadas no município de
Santarém, Pará. O vegetal foi submerso em soluções desinfetantes, em seguida
as partes do vegetal foram fragmentadas em 5mm e inoculadas em meio de
cultivo BDA. Com os fungos já isolados, foram feitas a caracterização macro e
microscópica, assim como o cultivo em meio líquido CDB para a fermentação e
obtenção do caldo metabólito bruto dos isolados. Foram identificados quatro
gêneros de fungos endofíticos, por meio da identificação molecular como:
Muyocopron, Xylaria, Penicillium e Acrocalymma. Os gêneros Penicillium e
Muyocopron foram submetidos a ensaios antibacterianos. O isolado fúngico do
gênero Penicillium foi capaz de inibir as cepas clínicas Enterococcus faecium
ATCC 6560 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. O isolado do gênero
Muyocopron também apresentou halos de inibição frente a cepa Enterococcus
faecium ATCC 6560. Contudo, a inibição do crescimento das cepas ATCC
testadas, reforça a necessidade de mais estudos relacionados a capacidade dos
mesmos produzirem metabólitos para a produção de novos antibacterianos para
o tratamento de doenças.

Palavras-chave: Atividade biológica; Isolamento fúngico; Cepas clínicas.

Introdução
O Brasil possui uma rica diversidade biológica pouco explorada ao que se

792
refere a investigação de fungos endofíticos associados a plantas da flora
brasileira. A espécie Eleutherine plicata Herb., pertence à família Iridaceae,
comumente encontrada na região Amazônica brasileira, onde é chamada
popularmente de “Marupazinho” (Pinto 2018). Na medicina popular é indicado
para usos terapêuticos, tendo como principal componente a naftoquinona, onde
a partir de evidências clínicas, seu princípio ativo possui propriedades
antimicrobianas, antiparasitárias, anti-inflamatórias e analgésicas (Couto et al.
2016). Além disso, E. plicata está entre as 71 espécies que fazem parte da
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS),
construída em 2009, com a finalidade de orientar pesquisas e estudos (Brasil
2012).
Os fungos endofíticos são microrganismos que vivem nos tecidos internos
dos vegetais, sem causar-lhes danos aparentes (Bogas et al. 2020). Utilizando
assim, como principal porta de entrada as raízes. A população endofítica
presente na planta varia entre um ou mais microrganismos, dependendo do
estado de saúde da hospedeira (Vaz 2012). Além disso, possuem uma grande
diversidade e apresentam papéis importantes no desenvolvimento,
sobrevivência e a variação de temperatura que as plantas sofrem (Gupta et al.
2020).
Fazendo com que os estudos voltados a esses microrganismos tenham
se tornado crescentes, já que possuem produção de metabólitos secundários
com propriedades antimicrobianas, antiparasitárias e antioxidantes (Tchamgoue
et al. 2020). Os metabólitos secundários são compostos extracelulares
secretados no meio de cultura durante o crescimento e diferenciação de um
organismo vivo, isolados e caracterizados para fins industriais (Nicoletti et al.
2015). No entanto, não se pode estimar ainda a variedade de metabólitos
secundários produzidos por um fungo endofítico.
Dentre os compostos bioativos produzidos por esses endófitos está a
atividade anticancerígena, além de possuírem metabólitos capazes de produzir
atividade antimicrobiana, a fim de inibir ou matar agentes causadores de
doenças como vírus, protozoários, bactérias, fungos e outros (Dantas 2017). Um
exemplo disso, é a produção de taxol, um medicamento bastante utilizado no
tratamento de câncer, obtido primeiramente da espécie vegetal Taxus baccata,

793
e posteriormente de metabólitos secundários obtidos do isolado da espécie
fúngica endofítica Taxomyces andreanae (Li et al. 2022).
Devido as propriedades medicinais apresentadas por E. plicata e a
ausência de pesquisas sobre fungos endofíticos desta planta, além do grande
desafio relacionado a resistência de patógenos aos antimicrobianos, o presente
trabalho tem como objetivo identificar fungos endofíticos presentes de E. plicata
com atividade antibacteriana.

Material e Métodos
Coleta do material vegetal
As amostras utilizadas neste estudo foram obtidas a partir de 3 pontos de
coletas realizadas na cidade de Santarém, Pará. O primeiro ponto foi em um
cultivo em ambiente urbano (2° 26’49.2”S 54°44’26.9”W), o segundo foi realizado
no Parque Municipal da Cidade (2°43’40.5”S 54° 71’76.9”W) e o terceiro
localizado em ambiente nativo, as proximidades da Comunidade Santa Maria do
Rio Curuá-Una (2° 48’07.5’’S 54°16’55.4’’W), localizada a margem esquerda da
Rodovia PA 370, às proximidades da Usina Hidrelétrica (UHE) Silvio Braga, no
km 75 da PA 370. Foram analisados 2 espécimes aparentemente sadios de cada
ponto. As coletas foram realizadas nos meses de março e abril de 2022.
O material coletado (folhas, bulbos e raízes), foi colocado em sacos
plásticos e acondicionadas em caixa isotérmica e levados para o Laboratório de
Ensino Multidisciplinar em Biologia Aplicada – LABIO da Universidade Federal
do Oeste do Pará – UFOPA, onde foram realizados os procedimentos de
higienização das superfícies e isolamento do material vegetal. A identificação da
espécie botânica foi realizada por um especialista do Herbário de Santarém
HSTM, localizado também na UFOPA, onde foi realizado o depósito de exsicata
com o código de registro HSTM016892.

Preparo das amostras vegetais e isolamento dos fungos

Para o isolamento dos fungos, primeiramente realizou-se a higienização
do material vegetal com água corrente e sabão líquido. Em um ambiente
asséptico, as folhas, bulbos e raízes foram submetidos ao processo de
desinfecção superficial, no qual as amostras foram imersas em: etanol 70% por
1 minuto; hipoclorito de sódio (NaCl) de 2 a 2,5% de cloro ativo por 2 minutos;

794
novamente em etanol 70% por 30 segundos e lavagem em água destilada. Após
a assepsia, foram retirados fragmentos de 5mm aproximadamente de cada parte
do vegetal e transferidos para placas de Petri contendo meio de cultivo Ágar
Batata Dextrose (BDA: batata 250g/L, ágar 25g/L, dextrose 10g/L, acrescido de
extrato de levedura 1,5g/L) acrescido com o antibiótico cloranfenicol (0,05g/L),
para impedir o crescimento de bactérias.
As placas foram incubadas a 28°C de 5 a 14 dias em estufa de Demanda
Bioquímica de Oxigênio (B.O.D) e acompanhadas periodicamente para
avaliação do crescimento de fungos a partir dos fragmentos vegetais. À medida
que havia crescimentos fúngicos, os mesmos foram repicados em novas placas
de Petri com o meio BDA para purificá-los.

Preservação dos isolados fúngicos

Para a preservação dos isolados fúngicos, foram retirados discos de 5mm
de diâmetros de meio de cultura de todos os isolados, onde foram submersos
em microtubos com 1mL de água destilada, armazenados em temperatura
ambiente, seguindo o método Castellani e depositados na Coleção de Cultura
Didática Micológica do Laboratório de Micologia e Bioensaios – LAMIB da
UFOPA, Santarém, PA.

Identificação Macroscópica e Microscópica dos fungos

Foram selecionados 4 isolados fúngicos para a realização da presente
pesquisa. A caracterização macroscópica foi realizada por meio da verificação
de caracteres macroscópicos como: coloração do micélio no verso e no reverso
do meio, a forma da borda e topografia da cultura. A caracterização microscópica
foi realizada por meio da técnica de microcultivo, que possibilitaram a
comparação entre as características morfológicas com a literatura micológica
disponível, realizou-se a identificação dos fungos ao menor nível taxonômico
possível.

Identificação Molecular
Foram selecionados 4 isolados fúngicos de acordo com suas
características macroscópicas e submetidos a identificação molecular. Para isso,
o DNA genômico dos isolados foi extraído utilizando Kit de Wizard® Genomic

795
DNA Purification (PROMEGA). A Reação em Cadeia Polimerase (PCR) para
amplificação da região intergênica transcrita (ITS) realizada em volume final da
PCR foi de 50 µL, preparado com 5 µL de tampão Taq polimerase 10X, 0,4 µL
da enzima Taq polimerase (2 U/ µL), 3 µL de dNTP (0,3 nM), 3 µL do Primer
foward 20mM, 3 µL do Primer reverse 20mM, 1 µL de DNA e 34,6 µL de água
ultrapura. As amostras foram colocadas em termociclador, sob programa de
amplificação com desnaturação inicial de 10 min a 95 °C, 1 min a 95 °C para a
desnaturação, 30 segundos a 52 °C para anelamento e 1 min a 72 °C para
extensão. Para a extensão final do DNA, a temperatura foi mantida a 72 °C por
5 min.
A visualização dos produtos de amplificação foi realizada em gel agarose
1% corado com o corante Blue Green. Os produtos de amplificação foram
purificados (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega) e
submetidos para sequenciamento na empresa ACTGene Análises Moleculares.
Os eletroferogramas resultantes foram analisados e comparados com
sequências depositadas no GenBank, utilizando a ferramenta BLASTn. Para
confirmação da espécie foi considerado o valor de cobertura e identidade dos
alinhamentos.

Fermentação das culturas fúngicas para obtenção do caldo bruto

Para a avaliação do potencial antibacteriano foi realizada a obtenção de
caldo metabólito bruto dos isolados fúngicos, através de cultivo submerso em
meio líquido Caldo Batata Dextrose (CDB: 120 g/L de batata, 10 g/L de dextrose).
Para isso, as culturas foram repicadas em placa de Petri contendo BDA e
incubadas por 7 dias. Após esse período, foram retirados discos de 5mm da
cultura do isolado e inoculados em 50mL de caldo batata dextrose em
erlenmeyers de 125mL em triplicata. Estes foram incubados em condições
estáticas por 15 dias em temperatura ambiente e ausência de luz.
Posteriormente, o caldo foi submetido a filtração a vácuo para a separação do
micélio.

Cepas testes
Foram utilizadas linhagens padrão American Type Culture Collection –
ATCC de bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus ATCC 33591 e

796
Enterococcus faecium ATCC 6560), gram-negativas (Escherichia coli ATCC
25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Os microrganismos testes
foram obtidos a partir da coleção de cultura de microrganismos do Laboratório
de Microbiologia da UFOPA, adquiridas do Programa Nacional de Controle de
Qualidade (PNCQ). As cepas testes foram previamente incubadas a 37°C por
24h em Ágar Müeller Hinton.

Difusão em poços
Para determinação da atividade antibacteriana, os caldos metabólitos
brutos foram submetidos à técnica de perfuração em ágar, de acordo com o
Clinical & Laboratory Standards Institute - CLSI (2012), (EUA: norma M02-A11 -
Padrões de Desempenho Antimicrobiano para Testes de Sensibilidade em disco)
com modificações. O inóculo contendo as cepas testes foram preparados com
turvação de 0,5 da escala MacFarland, medidas em espectrofotômetro e
posteriormente semeadas nas placas de petri contendo Ágar Müeller Hinton com
o auxílio de swab estéril em diferentes direções. Foram removidas pequenas
porções do meio de cultura sólido Ágar Müeller Hinton, que formaram poços
regulares de aproximadamente 6mm de diâmetro. Os poços foram preenchidos
com 100µL dos caldos metabólitos brutos em triplicata. Como controle positivo
de crescimento bacteriano foram adicionados 10µL de Ciprofloxacino (10µg), e
como controle negativo foram adicionadas 100µL de solução salina (0,85%).
Posteriormente as placas inoculadas foram levadas a estufa a 35°C por 24 horas.
Passado esse período, foi realizada a medição dos halos de inibição, em
milímetros, com o auxílio de um paquímetro.

Resultados e Discussão
Foram identificados quatro gêneros de fungos endofíticos de E. plicata.
Na Figura 1, podem ser vistos os detalhes da caracterização macro e
microscópica de dois grupos taxonômicos.
Foram identificados os gêneros Muyocopron e Xylaria isolados das folhas,
Penicillium e Acrocalymma isolados das raízes. Foram selecionados os gêneros
Penicillium e Muyocopron para a submissão aos ensaios antibacterianos.

797
Figura 1: Caracterização macroscópica e microscópica dos gêneros isolados Muyocopron
(A, B e C) e do gênero Penicillium (D, E e F).

De acordo com Elias (2015), é frequente a presença de fungos endofíticos

do gênero Penicillium na literatura, por apresentarem atividade biológica e
comprovação através de estudos a produção de metabólitos secundários desde
a descoberta da penicilina. Foi submetido ao teste com caldo metabólito bruto o
isolado do gênero Penicillium. O endofítico foi capaz de inibir duas cepas clínicas
testadas: Enterococcus faecium ATCC 6560 (bactéria gram-positiva) e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (bactéria gram-negativa), com halos de
inibição variando de 5mm a 8mm e 4,5mm a 6mm respectivamente, conforme a
Figura 2.

Figura 2: Teste antibacteriano (metodologia dos poços) de um isolado do gênero Penicillium

apresentando halos de inibição frente as cepas Enterococcus faecium ATCC 6560 (A) e P.
aeruginosa ATCC 27853 (B).

798
 O gênero Penicillum é amplamente distribuído pelo mundo, apresentando
atividade antibacteriana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas,
isoladas de plantas medicinais como Uncaria tomentosa (Rodrigues et al. 2018)
e de Croton lechleri, uma espécie nativa amazônica (Vargas et al. 2018).
O caldo metabólito bruto do isolado fúngico do gênero Muyocopron
também submetido ao teste de atividade antibacteriana, apresentou resultado
positivo inibindo a cepa clínica gram-positiva Enterococcus faecium ATCC 6560,
com halos de inibição variando de 5mm a 7,5mm, Figura 3.

Figura 3 - Teste antibacteriano de um isolado do gênero Muyocopron apresentando halos de

inibição contra a cepa gram-positiva E. faecium ATCC 6560.

Segundo Nakashima et al. (2020), o gênero Muyocopron comumente

encontrados nas folhas de diferentes espécies vegetais, apresentou atividade
antimicrobiana isoladas de Canavalia lineata a partir de azafilonas que são
pigmentos naturais produzidos por fungos desse gênero.

Conclusões
A presente pesquisa apresentou fungos endofíticos cultiváveis presentes
em E.plicata, Herb., possibilitando a identificação de gêneros cultiváveis como
Xylaria, Acrocalymma, Penicillium e Muyocopron.
Foi possível realizar testes para a avaliar a produção de atividade
antibacteriana frente as cepas de interesse médico.

799
 O caldo metabólito bruto de Penicillium se mostrou o mais promissor,
sendo capaz de inibir cepas bacterianas gram-positiva e gram-negativa.
Acredita-se que novos estudos precisam ser realizados, para investigar
substâncias produzidas por fungos endofíticos presentes em plantas
consideradas medicinais, afim de conhecer novos compostos com diferentes
aplicações voltadas à saúde pública.

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28 de março de 2012. Estabelece o elenco de medicamentos e insumos da
Relação Nacional de Medicamentos Essenciais (RENAME) no âmbito do
Sistema Único de Saúde (SUS).
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(https://repositorio.ufmg.br/handle/1843/BUOS-99JFRP).

801
Oliveira, L.A., Oliveira, J.G.S., Gasparotto, L., Bentes J.L.S.,
Rocha, L.C, Jesus, M.A., Andrade, S.L., Cruz, K.S., Souza, A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 4, 2024. Editora INPA

Identificação de Candida spp. em cavidade oral de pacientes

com carcinoma de células escamosas

Silva, Denyson Reinaldo Xisto1; Santos, Rosangela Brito1; Feitosa, Felipe

Aragão1; Silva, Jacqueline Botelho2; Ono, Lia Mizobe2; Andrade, Suanni Lemos1

1Universidade do Estado do Amazonas, 2Fundação Centro de Controle de Oncologia

do Estado do Amazonas.
E-mails: [email protected]; [email protected]

Resumo
O gênero Candida é o principal envolvido em infecções orais oportunistas em
pacientes com câncer de cabeça e pescoço, em decorrência da terapia
antineoplásica que influencia na microbiota e favorece alterações no
microambiente oral. Assim, essa pesquisa teve como objetivo investigar a
presença de Candida spp. em cavidade bucal de pacientes com câncer de
cabeça e pescoço atendidos na FCECON-AM. Sendo assim, foram coletadas
mostras da cavidade bucal de pacientes atendidos no setor de radioterapia
previamente ao início do tratamento, as amostras foram processadas em placas
de Petri contendo CHROMagar Candida a qual foi incubada por 48h a 72h a
37°C. Após o crescimento foi realizado a identificação e purificação das colônias
em placas contendo Sabouraud Dextrose Agar, acrescido de antibiótico
(clorafenicol), destas amostras foram selecionas leveduras para identificação no
sistema automatizado VITEK 2 (bioMérieux). Foram avaliados 23 pacientes,
todos apresentaram diagnóstico para Carcinoma de Células Escamosas, foi
observado predileção pelo sexo masculino, com média de 62,39. Houve
crescimento positivo para leveduras em 39,13% (9/23) das amostras coletadas,
quatro apresentando múltiplas espécies. Das 9 amostras positivas 16 leveduras
foram isoladas, sendo a espécie mais prevalente a C. albicans em 37,5% (6),
outras espécies também identificadas foram, C. glabrata (2), C. parapsilosis (2),
C. Krusei (2), C. famata (1) outras espécies não identificadas Candida sp. (3).
Houve predomínio do sexo masculino na pesquisa. A espécie C. albicans foi a
mais prevalente no estudo. Espécies de Candida não-albicans estão presentes
antes do tratamento radioterápico. Este trabalho demostra a necessidade de
estudo sobre a relação de colonização e infecção por leveduras em pacientes
com câncer da cabeça e pescoço antes, durante e após a terapia antineoplásica.

Palavras-Chave: Candida; Neoplasia; Infecção Oportunista; Candidíase Bucal

Introdução
A candidíase é uma infecção fúngica oportunista, representada por uma
gama de espécies de Candida, sendo C. albicans a mais comum (Bandeira e
Sabadin 2016). Essa levedura é comum na microbiota do trato gastrointestinal e

802
genital, capaz de tornar-se patogênica a depender do status imunológico do
hospedeiro. Tais infecções comumente resultam em danos à saúde e
disseminação hematogênica, comprometendo a sobrevida do paciente
(Ramirez-Garcia et al. 2016).
A presença de Candida spp. na cavidade oral como colonizadora, quando
associados a cofatores locais e sistêmicos como: redução do fluxo salivar,
deficiência de vitaminas, erosões na mucosa oral e a supressão imunológica
generalizada desempenham papéis importantes na instalação e
desenvolvimento de patologias em graus variados, assim, muitas vezes, essas
infecções oportunistas são indicativas de alterações imunológicas e variações
do microambiente (Hu et al. 2019).
A candidíase sistêmica pode se apresentar como infecção da corrente
sanguínea levando a um estado séptico grave. Para tanto, o estado geral de
saúde, motivos ambientais (hospitalar), internações prologadas (UTI), uso de
antibióticos de amplo espectro, radioterapia e a quimioterapia são fatores
importantes associados ao quadro (Di Cosola et al. 2021).
A quimioterapia (QT) e radioterapia (RT) causam redução do fluxo salivar
e fragilidade das mucosas, resultando em mucosite, consequentemente
acarretando infecção por Candida (Patel 2022). O Carcinoma de Células
Escamosas é o tipo de câncer mais comum na região de cabeça e pescoço,
aproximadamente 70% dos pacientes submetidos ao tratamento antineoplásico
apresentam complicações orais ocasionadas pela estomatotoxicidade direta ou
indireta (Chattopadhyay et al. 2019). E está bem estabelecido que diferentes
espécies de Candida são comensais em indivíduos doentes, em especial,
indivíduos irradiados, as alterações induzidas pela radiação no ambiente
intraoral, levam ao aumento de diferentes espécies, algumas dessas como a
Nakaseomyces glabrata (C. glabrata) e Pichia kudriavzevii (C. krusei) espécies
C. não-albicans, podem invadir os tecidos e promover infecções, quando o
número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) for baixo (de Freitas et al.
2013).
Sabe-se que a condição oral comprometida pode influenciar
negativamente no quadro sistêmico dos pacientes, em especial aqueles
indivíduos que tiverem imunocomprometidos com os pacientes oncológicos.
Sendo assim, uma equipe multidisciplinar deve fornecer assistência, atuando

803
para garantir o bem-estar dos pacientes, estando atenta para prevenir e tratar as
infecções oportunistas fúngicas que acometem a cavidade bucal (Silva et al.
2017). Portanto este trabalho objetivou-se investigar a presença de Candida spp.
em cavidade bucal de pacientes com câncer de cabeça e pescoço atendidos na
Fundação Centro de Controle de Oncologia do Estado do Amazonas - FCECON-
AM.

Material e Métodos
Tratou-se de um estudo observacional descritivo transversal utilizando
amostras obtidas da cavidade bucal de pacientes com câncer de cabeça e
pescoço atendidos e tratados na FCECON-AM. Os critérios de inclusão do
estudo foram indivíduos maiores de idade, de ambos os gêneros, com
diagnóstico de Carcinoma Células Escamosas (CEC) e que ainda não tivessem
iniciado a radioterapia. Após a assinatura do termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE), foram submetidos à coleta de material da cavidade oral,
utilizando-se Swab estéril, a amostra foi armazenada em tubos contendo meio
de transporte.
Cada amostra foi processada em placas de Petri, contendo CHROMagar
Candida®, a qual foi incubada por 48h a 72h a 37°C, as colônias suspeitas de
leveduras foram contadas, e seu número expresso em Unidades Formadoras de
Colônias (UFC), a identificação das espécies foi feita conforme orientação do
fabricante. Posteriormente cada espécie identificada foi purificada em placas de
Petri, contendo Sabouraud Dextrose Agar (SDA), acrescido de antibiótico
(cloranfenicol), após a purificação a colônia mais isolada foi armazenada em tubo
de ensaio contendo o referido meio de cultura. Foram selecionados apenas
amostras que demostraram quantidade elevada de UFC condizente com
infecção para realização da identificação pelo sistema automatizado VITEK2
(bioMérieux®).
Foi realizado o estudo morfológico detalhado através do microcultivo pela
técnica de Rivail (Lacaz 2002), para realizar este método foi semeada levedura
em ágar-fubá sob uma lâmina contida em suporte em uma placa de Petri e papel
filtro umedecido. E após 24 horas, 48 horas e 72 horas as lâminas foram
examinadas em microscópio ótico. A pesquisa é parte de um projeto do
programa de apoio a iniciação cientifica da FCECON-AM, tendo aprovação pelo

804
Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade do Estado do Amazonas sob
registro CAAE 48762921.3.0000.5016, estando em conformidade com os
preceitos da Resolução 466/12.

Resultados e Discussão
Foram avaliados 23 pacientes, todos oriundos da FCECON no setor de
radioterapia, dentre estes quatorze (60,86%) eram homens e nove (39,13%)
mulheres. A faixa etária em nosso estudo variou de 37 a 87 anos, com média
62,39 anos. Os resultados assemelham-se aos achados de Siqueira (2021), que
apontam o acometimento da doença preferencialmente em homens, em seu
estudo, 61,1% eram homens e 38,9% mulheres, com média de idade variando
de 55,5.
Todos os pacientes em nosso estudo possuíam diagnóstico de Carcinoma
de Células Escamosas com lesões na região oral e adjacências, sendo os locais
mais acometidos a laringe com 34,78% (8) e língua com 26,08% (6), seguidos
de assoalho da boca 8,6% (2), palato 8,6 (2), seios da face 8,6% (2), orofaringe
8,6 (2) e nasofaringe com 4,3% (1). A literatura diverge em relação aos sítios
mais acometidos pelo CEC, alguns estudos indicam a língua, assoalho da boca
e palato mole como os mais prevalentes, o presente estudo comprova essa
diversidade de locais acometidos pela doença (Teixeira et al. 2009; Makinen et
al. 2018).
Com relação à presença de Candida spp., entre as 23 amostras coletadas,
nove apresentaram crescimento positivo para leveduras, correspondendo a
39,13% das amostras estudadas. Em quatro amostras foram visualizados
crescimento de múltiplas espécies conforme a Tabela 1. Assim, foi possível isolar
16 leveduras sendo identificadas em 37,5% C. albicans (6) (Figura 1A), e 62,5%
espécies não-albicans sendo identificadas em: 12,5% C. parapsilosis (2), 12,5%
C. glabrata (2) (Figura 1B), 12,5% C. krusei (2) e 6,25% C. famata (1), 18,75%
(3) não foram identificadas sendo caracterizadas como Candida sp.

805
Tabela 1. Espécies de leveduras isoladas e a quantidade de Unidades Formadoras de
Colônia (UFC).
Amostra Sítios UFC Espécies
anatômicos
Pac16 Lingua 751 C. albicans
Pac10 Palato 457 C. albicans; C. parapsilosis*
Pac12 Assoalho de 150 C. albicans
boca
Pac14 Orofaringe 77 C. albicans
Pac23 Nasofaringe 72 C. albicans; C. glabrata; Candida sp.
Pac01 Língua 18 C. glabrata; C. parapsilosis*; C. krusei; C. famata*

Pac05 Laringe 2 C. krusei; Candida sp.

Pac20 Laringe 2 Candida sp.

Pac15 Seios da 1 C. albicans

Face
*Espécies identificadas pelo VITEK 2 (bioMérieux®)

Figura 1. Espécies de Candida spp. em CHROMagar ®, A) Colônias de C. albicans (verde),

C. glabrata (lilás) e Candida sp. (branca-creme) e no CHROMagarTMCandida®. B) espécies
C. glabrata (lilás), C. parapsilosis (branca-creme), C. krusei (rosa-rugosa) e C. famata (verde-
azulado). Fonte: Banco de dados do projeto.

Dentre os isolados positivos, dois pacientes apresentaram expressivo

número de UFC (751 e 457) e, simultaneamente, lesões orais de candidíase,
sendo assim, ficam confirmados com infecção tanto pela clínica, quanto pelo
quantitativo no isolamento. Por outro lado, três pacientes não configuraram
lesões clínicas, porém valores de UFC variam de 72 a 150. E por fim, outros
quatro pacientes apresentam baixo índice de UFC (18) com significantes
achados entre as espécies (Tabela 1).

806
 A não recomendação da pesquisa de colonização oral na rotina médica,
não se configura para pacientes com doenças imunossupressoras crônicas, pois
conhecer as espécies prevalentes minimiza danos graves (Goulart et al. 2018).
Mostrando-se importante a identificação de assintomáticos por Candida spp.
como vista na presente pesquisa. Visto que, alterações no mecanismo local de
defesa e doenças imunossupressoras associadas, facilmente evolui de
colonização para infecção (Colombo et al. 2013).
Para o estudo da micromorfologia na técnica de microcultivo em lâmina,
a espécie Candida albicans apresentou blastoconídios ovoides e pseudo-hifas
(Figura 2A) tais achados são semelhantes aos encontrados na obra de Lacaz et
al. (2002). Os estados morfológicos distintos da C. albicans correspondem a
diferentes fases da infecção, onde a forma leveduriforme está associada a
colonização e crescimento, enquanto a fase de hifas, à invasão dos tecidos do
hospedeiro (Vila et al. 2020). Em contraste, C. glabrata não é polimórfica, como
observado no presente estudo (Figura 2C) (Silva et al. 2012).

Figura 2. Microcultivo para espécies de Candida spp.; A) C. albicans - presença de pseudo-

hifas (seta) e blastoconídios ovoides; B) C. parapsilosis - presença de pseudo-hifas (seta)
com ramificações regulares e presença de blastoconídios esféricos C) C. glabrata - presença
de blastoconídeos ovoides (seta), não há formação de pseudo-hifas. Fonte: Banco de dados
do projeto.

Corroborando o estudo de Queiroz (2021), que avaliou a presença de

espécies de Candida spp. antes e durante a radioterapia em um grupo caso e
um controle, a espécie C. albicans foi a mais prevalente na 1ª coleta (antes da
RT) correspondendo a 44,83%, seguido por C. tropicalis (13,79%) e C.
parapsilosis (10,34%) as espécies C. glabrata e C. krusei apresentaram índices

807
distantes do presente estudo com (3,45%) e (3,45%) respectivamente. Nossos
achados concordam com a literatura onde a C. albicans é a espécie mais
prevalente tanto em pacientes oncológicos quanto saudáveis.
Espécies não-albicans são notáveis agentes patogênicos de candidíase
orofaríngea, entre elas C. tropicalis e C. glabrata são conhecidas com as
leveduras que podem ultrapassar a C. albicans como o maior agente etiológico
dessa infecção.
É conhecido que entre os pacientes com câncer a infecção é causada
comumente por C. albicans, seguido de C. tropicalis e C. glabrata em termo de
importância respectivamente (Silva et al. 2012; Jahanshiri et al. 2018). Em nosso
estudo as espécies C. não-albicans foram as mais identificadas no geral
correspondendo a 62,5% dos isolados, onde C. parapsilosis, C. glabrata e C.
krusei apresentaram os mesmos percentuais de isolamento, porém identificamos
que os pacientes que apresentaram indicies UFC elevados estavam infectados
por Candida albicans associadas ou não a outras espécies.
O estudo de espécies não-albicans como a C. glabrata reside no fato de
ser considerada patógeno emergente com particularidade de apresentar um
número considerável de cepas resistentes a antifúngicos triazólicos ou
necessitam doses maiores para sucesso terapêutico e Candida krusei
conhecidas como resistentes a fluconazol (Colombo et al. 2003; Cardoso 2020).
A C. glabrata exibe vários fatores de virulência como (aderência, formação de
biofilme e secreções de enzimas hidrolíticas), esses fatores contribuem à sua
extrema agressividade e resultam em baixa resposta terapêutica (Cardoso
2020). Essas duas espécies justificam a necessidade de identificar quando estão
associadas a doenças sistêmicas a fim de promover um diagnóstico preciso.
Em seu estudo, Sun et al. (2019), avaliando 323 pacientes com câncer
com episódios de candidemia, identificou a C. parapsilosis como a espécie mais
prevalente em hemoculturas (35,15% 120/323), seguido pela C. albicans
(34,37% 111/323). Os fatores associados a fungemia por C. parapsilosis foi a
nutrição parenteral, a neutropenia e o recebimento de quimioterapia. Esse
estudo demostrou a C. parapsilosis como a principal espécie de Candida spp.
isoladas em candidemias, ressaltando a necessidade de avaliação dos pacientes
expostos a esses riscos.

808
 Conclusões
Diante do exposto neste trabalho, podemos concluir que espécies de
Candida não-albicans estão presentes na cavidade oral de pacientes com CEC
anteriormente a radioterapia e que a espécie Candida albicans é a mais
prevalente nesses pacientes estando associada ao desenvolvimento de
infecções na cavidade oral. Este trabalho demostra a necessidade de estudo
sobre a relação de colonização e infecção por leveduras em pacientes com
câncer da cabeça e pescoço antes, durante e após a terapia antineoplásica.

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Perfil de sensibilidade a extratos vegetais por fungos

filamentosos e unicelulares

Baroni, Francisco de Assis1; Silva, Vinicius Ribeiro da1; Pereira, Juan Rojas1;
Alves da Silva, Vitória Vieira1; Oliveira, Aguida Aparecida1; Campos, Sergio
Gaspar1; Bonci, Mário Mendes1

1Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

E-mail: [email protected]

Resumo

A eficácia de muitos agentes antimicrobianos encontra-se deficitária decorrente

do desenvolvimento de resistência e por outros motivos como o uso
indiscriminado destes fármacos. Com isso, ocorrem pesquisas incessantes de
novos agentes antimicrobianos e neste contexto enquadram-se plantas que
podem apresentar efeitos promissores. O objetivo foi testar a sensibilidade de
fungos unicelulares e filamentosos a extratos aquosos brutos de quixaba, cravo,
copaíba e canela. Foram preparados meios de cultivo com a mesma base do
Sabouraud, substituindo-se parte da água destilada pelos extratos, obtendo-se
meio com concentrações de 2,1% e 4,2% (copaíba), 1,3%, 2,6% e 3,9%
(quixaba) e 1,7%, 3,4% e 5,1% (cravo e canela). O pH foi ajustado e os meios
distribuídos em placas de Petri. Para cada concentração de extrato, foram
inoculados Rhodotorula spp, Malassezia pachydermatis, Cryptococcus gattii, C.
neoformans, Candida albicans, Aspergillus clavatus, Scopulariopsis brevicaulis,
Lichtheimia corymbifera e Penicillium citrinum. Usamos nistatina e cetoconazol
como controles. Todas as concentrações de extrato de cravo foram eficazes
frente a todos os fungos. A maior eficácia dos extratos de quixaba ocorreu nas
concentrações de 2,6% e de 3,9% e para a copaíba a eficácia deu-se
principalmente a 4,2%. A canela foi eficaz em todas as concentrações para S.
brevicaulis, P. citrinum e M. pachydermatis e para C. albicans nas concentrações
de 3,4% e 5,1%. As diferentes sensibilidades aos extratos de copaíba e quixaba,
provavelmente resultam da diversificada natureza destes fungos, já que alguns
são da micobiota e outros são sapróbios. Acreditamos na necessidade de uso
de maiores concentrações de alguns extratos. Um fato a considerar é que dentro
de cada espécie, as sensibilidades fúngicas podem variar. Podemos inferir que
o efeito está relacionado à concentração e que todos os extratos apresentam
algum potencial para uso no controle fúngico.

Palavras-chave: Antifungigrama, Filamentosos, Inibição, Leveduras, Eficácia.

Introdução
Na atualidade a eficácia de muitos agentes antimicrobianos usados para

812
aumentar a vida útil de prateleira de produtos assim como a inibição de
microrganismos que promovem doenças no homem e nos animais, está
diminuída. Isto decorre do surgimento de resistência e por outras causas como
o seu uso indiscriminado. Tal fato leva à necessidade da busca de novos
antimicrobianos. Muitas plantas, inclusive de uso empírico e popular apresentam
efeitos promissores e algumas vêm sendo pesquisadas apresentando princípios
ativos contra vários microrganismos, inclusive fúngicos. Quixaba ou quixabeira,
também conhecida por sapotiaba, espinheiro e maçaranduba da praia pertence
à família Sapotaceae cujo nome científico é Sideroxylon obtusifolium. É presente
na caatinga, principalmente nos estados nordestinos do Brasil e em outros
países amazônicos. Tem indicações medicinais populares. Rangel et al. (2022)
estudaram a capacidade da nanoemulsão de extratos desta espécie no combate
à esquistossomose. Demachelier et al. (1999) apontaram que seus extratos
foram eficazes na redução da oxidação de DNA e Sampaio et al. (2017)
concluíram que frações de n-butanol e de diclorometano de seus extratos
apresentam atividade contra C.albicans e consideram que apresenta potencial
para bioprospecção de fitocompostos para o tratamento de periodontites
promovidas por C. albicans. Outros pesquisadores também trabalharam com a
fração N-butanol e chegaram à mesma conclusão verificando inclusive ação
sobre biofilmes produzidos por esta levedura (Pereira et al. 2016).
O cravo, conhecido como craveiro da Índia, girofle e cravo da India
aromático, tem nome científico Syzygium aromaticum, e está presente
originalmente nas Ilhas Molucas, Nova Guiné e Madagascar. Brochot et al.
(2017) e Liu et al. (2017) consideram positivo o uso do Cravo da Índia e citam
atividade contra fungos como Aspergillus flavus. O eugenol, substância presente
nos óleos essenciais do cravo é um hidroxifenil propeno de várias plantas da
família Myrtaceae (Marchese et al. 2017). Para estes autores o eugenol exerce
efeitos benéficos na saúde humana como antioxidante, antiinflamatório e
antimicrobiano.
A copaíba também conhecida como copaíva, bálsamo-da-Amazônia,
bálsamo-dos-jesuítas e copaúba é uma árvore presente principalmente na
Amazônia e na região do cerrado. São conhecidas várias espécies, mas a mais
pesquisada e utilizada é a Copaifera langsdorffii. Zimmerman et al. (2013)
estudaram a ação da oleoresina de copaíba contra fungos dermatófitos.

813
Verificaram uma ação moderada contra T. mentagrophytes e ação fraca contra
T. rubrum. Em relação a Microsporum canis e Nannizzia gypsea observaram
apenas danos físicos como compressão e agrupamentos de hifas. Carmo Silva
et al. (2020) estudando óleo de resina e uma forma de nanoemulsão de Copaíba
concluíram se tratar de promissor agente contra Paracoccidioides spp. Também
Alves et al. (2020) estudaram efeitos de diversas espécies de copaífera sobre
vários microrganismos.
Há vários relatos de efeitos antimicrobianos em relação ao gênero
Cinnamomum. Este gênero abriga grande número de espécies. Enquanto
Cinnamomum verum é o nome da canela verdadeira, tudo indica que a maioria
do que é comercializado é da espécie Cinnamomum cassia (Fao 2012). Na
odontologia ocorrem vários problemas ocasionados por bactérias e fungos e,
neste aspecto Yanakiev (2020) aponta para os extratos de canela, óleos e
demais derivados na atuação contra fungos e bactérias relacionados à cárie
lesões endodônticas, na cárie propriamente dita, além de ação contra a
candidíase. Liu et al. (2017) acreditam na canela no tratamento de várias
infecções fúngicas incluindo as promovidas por Aspergillus flavus. Tran et al.
(2020) verificaram que óleos essenciais de cravo promovem interferência
morfológica na membrana celular e na formação da filamentação característica
de Candida albicans e de C. auris. Outro efeito foi a inibição das atividades
hemolíticas destas duas espécies.
Este trabalho objetivou testar o efeito inibitório de extratos aquosos brutos,
obtidos por cocção e filtração de partes de vegetais como copaíba, quixaba,
cravo da Índia e canela frente a fungos filamentosos (Aspergillus clavatus,
Scopulariopsis brevicaulis, Lichtheimia corymbifera e Penicillium citrinum) e a
fungos unicelulares (Rhodorotula spp, Cryptococcus gattii, Cryptococcus
neoformans, Candida albicans e Malassezia pachydermatis). O ensaio visou
ainda empregar um método de macrodiluição modificado, por nós denominado
de “antifungigrama por macrodiluição em meio de cultivo sólido”.

Material e Métodos
Para esta pesquisa utilizamos um método inspirado na macrodiluição, que
denominamos de “antifungigrama por macrodiluição em meio de cultivo sólido”.
Neste caso, ao invés do uso de meio de cultura líquido com diferentes

814
concentrações de uma substância antifúngica, usamos diferentes concentrações
dos extratos brutos de vegetais como substitutos parciais da água destilada que
compõe o meio de cultura usado para o fungo. Cascas do tronco de copaíba e
de quixaba, ambos de origem certificada, flores de cravo e canela em pau, estas
obtidas no comércio, foram pesados e misturados com água destilada e
submetidos a cocção por 60 minutos. O produto foi filtrado e separado do
material vegetal e submetido a evaporação obtendo-se concentrações
respectivas de 21%, 13%,17% e 17% (relação entre peso da matéria vegetal e
volume pós evaporação). Foi utilizado meio de cultivo composto de 1% de
peptona, 2% de dextrose e 1,5 % de agar-agar (Meio Sabouraud Dextrose),
enriquecido com 1% de extrato de levedura. No momento da adição de H20
destilada, utilizamos alíquotas dos extratos líquidos dos vegetais em
concentrações diferentes. Deste modo, obtivemos meios com diferentes
concentrações dos extratos, sendo 2,1% e 4,2% para copaíba, 1,3%, 2,6% e
3,9% para quixaba, 1,7%, 3,4% e 5,1% para o cravo e para a canela. Pós
correção do pH e esterilização, o meio foi disposto em placas de Petri de 40 mm
X 14 mm, em número de 12 placas para cada concentração. Como controle
usamos nistatina e cetoconazol também acrescentados a meios de cultura. Os
fungos testados compreenderam leveduras (Rhodotorula spp, Malassezia
pachydermatis, Cryptococcus gattii, C. neoformans e Candida albicans) e fungos
filamentosos (Aspergillus clavatus, Scopulariopsis brevicaulis, Lichtheimia
corymbifera e Penicillium citrinum), todos obtidos junto à Micoteca do Laboratório
de Leveduras Patogênicas e Ambientais do Instituto de Veterinária da UFRRJ.
Todos foram previamente reativados por cultivo de 48 horas no caso das
leveduras, exceto Malassezia pachydermatis (5 dias) e de 6 dias para os fungos
filamentosos. Uma suspensão das leveduras igual ao grau 1 da escala de Mc
Farland para as leveduras e suspensão de conídios ou esporos fúngicos para
filamentosos com igual turbidez foram utilizados para semeadura na parte central
da superfície de cada meio de cultivo com extrato e concentração específica,
utilizando-se inóculo de 10 µL A leitura dos resultados considerou o crescimento
positivo ou ausência de crescimento, respectivamente como resistente àquela
concentração (R) ou sensível (S). Avaliou-se ainda sensibilidade intermediária
(I) nas situações em que ocorreu início de crescimento colonial seguida de

815
interrupção do crescimento colonial e no qual observou-se alterações
microscópicas.

Resultados e Discussão
Os resultados encontram-se expressos na tabela 1. Todas as
concentrações de extrato de cravo foram eficazes frente a todos os fungos por
não verificarmos crescimento dos fungos em nenhuma das concentrações
testadas. Tais resultados são concordantes com a maioria de pesquisadores. A
maior eficácia dos extratos de quixaba ocorreu nas concentrações de 2,6% e de
3,9%, mas a mesma não foi eficaz para Lichtheimia corymbifera e Penicillium
citrinum e também não houve boa eficácia para Aspergillus clavatus, haja vista
a ocorrência de “resultado intermediário” na maior concentração. Também com
relação a Cryptococcus neoformans, toda a sensibilidade verificada foi
“intermediária”. Para a copaíba a eficácia ocorreu principalmente a 4,2%, mas
igualmente ao caso anterior, a sensibilidade para C. neoformans mostrou-se
apenas como “intermediária” Estes efeitos da quixaba encontram respaldo em
Demachelier et al. (1999). A canela foi eficaz em todas as suas concentrações
para Scopulariopsis spp, P. citrinum e M. pachydermatis. Também foi eficaz para
C. albicans nas concentrações de 3,4% e 5,1%. Este fato corrobora com Brochot
et al. (2017) e de Yanakiev (2020). A espécie C. gatti mostrou sensibilidade
intermediária ao extrato de canela nas duas concentrações maiores, enquanto a
espécie C. neoformans mostrou-se resistente. Trabalhamos com uma amostra
de cada fungo citado e há a possibilidade de ocorrência de variações intra-
espécies. Os resultados com os ensaios “in vitro” não necessariamente refletirão
resultados “in vivo” embora muitos destes vegetais sejam conhecidos na
medicina popular. O emprego destas substâncias na medicina humana e
veterinária requer estudos criteriosos que incluam inclusive a toxicidade.

Tabela 1: Resultados da sensibilidade fúngica a extratos vegetais brutos

Fungos Cn Cct Copaíba Quixaba Cravo Canela
2,1 4,2 1,3 2,6 3,9 1,7 3,4 5,1 1,7 3,4 5,1
% % % % % % % % % % %
Rhodotorula spp S R R S R S S S S S R R S
C. gatti R R R S I S S S S S R I I
C. neoformans R R I I I I I S S S R R R
C. albicans S S R I ne ne ne S S S R S S
M. pachydermatis S S R I S S S S S S S S S

816
 A. clavatus R S S S R R I S S S R R S
S. brevicaulis R S R R R I S S S S S S S
L. corymbifera R R S S R R R S S S R R S
P. citrinum R S ne ne R R R S S S S S S
R= resistente, S= sensível, I=sensibilidade intermediária, ne = não efetuado, Cn = controle
nistatina, Cct = controle cetoconazol

Conclusões
O cravo da Índia apresenta potencial antifúngico para as amostras
testadas. Para os demais extratos, pelo menos uma amostra fúngica mostrou
sensibilidade.
Os efeitos restringem-se às amostras ou cepas trabalhadas, ao tipo de
extrato (bruto) e são dependentes das concentrações.
O método de “antifungigrama por macrodiluição em meio de cultivo sólido”
empregado para verificarmos a sensibilidade de fungos aos extratos vegetais
mostrou-se adequado podendo ser usado futuramente em outros ensaios,
inclusive para a realização de outros testes com fármacos comerciais.

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Potencial antagônico de Bacillus spp. frente a fungos de

importância médica, agronômica e veterinária

Muniz, Veranilce Alves¹; Oliveira, Juan Campos¹; Matos, Izane Maria de Souza¹;
Souza, Jakeline Andrade¹; Souza, Douglas Vitor Barbosa¹; Brito, Ana Claúdia da
Silva²; Roque, Rosemary Aparecida³; Katak, Ricardo de Melo³

¹Universidade Federal do Amazonas, ²Universidade do Estado do Amazonas, ³Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia
E-mails: [email protected], [email protected], [email protected]

Resumo
Fungos patogênicos para humanos, animais e plantas causam grandes prejuízos
para Saúde Pública e prejuízos econômicos. Apesar de haver medidas de
combate para tais doenças, a resistência fúngica a certos antibióticos é um dos
grandes desafios encontrados para o tratamento. As bactérias do
gênero Bacillus são promissoras para o biocontrole de leveduras de importância
clínica e fungos fitopatógenos. Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial
antagônico de Bacillus spp. frente a fungos de importância médica, veterinária e
agronômica em condições de laboratório. Um total de 21 linhagens
de Bacillus spp. foram testadas contra leveduras do gênero Candida,
fungos Sporothrix brasiliensis e Fusarium spp. No teste de antagonismo, foi
empregado o método de cultura pareada. A triagem para atividade antagônica
contra o Fusarium spp. foi realizada pela técnica de cultura dupla em placas. Os
resultados do ensaio de antagonismo mostraram que as linhagens SPa01,
59PHA e SX15 inibiram o crescimento do fungo Sporothrix brasiliensis, enquanto
a linhagem 59PHA teve atividade de antagonismo contra a levedura Candida
glabrata. Considerando o total de 21 linhagens de Bacillus spp. testadas no
ensaio de antagonismo contra o Fusarium spp., dez linhagens (47,6%) exibiram
atividade antagônica contra este fungo, dentre as quais a linhagem SX15
- Bacillus safensis apresentou atividade antifúngica mais eficiente, com o
percentual de 77, 87%. Sendo assim, diversos estudos demonstraram que o
gênero Bacillus spp. apresentam potencial antagônico contra patógenos
fúngicos. Essa atividade antagônica pode ser devido a sua capacidade de
produzir metabólitos bioativos, na qual inibem o crescimento fúngico. Portanto,
este trabalho mostrou que as linhagens de Bacillus spp. inibem o crescimento de
algumas espécies de leveduras, fungos Fusarium spp. e Sporothrix brasiliensis.

Palavras-chave: Antagonismo; Bactérias; Inibição de Crescimento.

Introdução
Microrganismos patogênicos podem ocasionar diversas patologias em
humanos, animais e plantas, resultando em diversos problemas de saúde pública

819
e econômicos. Os fungos têm impactos significativos na sociedade, porém
muitas espécies são causadoras de doenças em animais, plantas e nos seres
humanos (Brauer et al. 2019).
Os fungos fitopatógenos, como o Fusarium oxysporum afetam plantações
agronomicamente importantes causando grandes prejuízos econômicos. Estes
microrganismos são patógenos oportunistas em humanos, produzem
micotoxinas, causando doenças, tais como, murchas, ferrugem, podridões e
cancros de culturas agrícolas, tornando os produtos inviáveis para o consumo
humano (Ma et al. 2013; Kang et al. 2020).
Sporothrix brasiliensis é um fungo que pertence ao clado patogênico do
gênero Sporothrix, agente patogênico da esporotricose humana, uma micose
subcutânea transmitida por gatos infectados (Gremião et al. 2021). S.
brasiliensis é uma espécie emergente considerada a mais virulenta do
gênero Sporothrix (Gremião et al. 2017).
As leveduras com destaque para o gênero Candida sp. são consideradas
como fungos patogênicos oportunistas, causando diversas infecções humanas,
como por exemplo, a candidíase. Certamente, Candida albicans é a mais
comum, porém houve um aumento de infecções pelas leveduras, Candida
glabrata, Candida parapsilosis e Candida tropicalis (Kumar et al. 2022).
Apesar de haver tratamento para as doenças ocasionadas por esses
microrganismos, alguns medicamentos têm se tornando menos eficazes, devido
à resistência desses fungos a certos antibióticos, dificultando as estratégias de
tratamento (Scapaticci et al. 2018; Ahmad et al. 2020). Diante dessa
problemática, os desafios para o controle são diversos e necessitam de novas
estratégias a serem utilizadas.
O gênero Bacillus é um grupo de bactérias que são conhecidas como
agentes importantes no controle biológico de diversas ordens de insetos
agrícolas e pragas, assim como de microrganismos fitopatogênicos (vírus,
bactérias e fungos). Diversas espécies de Bacillus spp. têm demonstrado um
potencial antagônico contra fitopatógenos, como por exemplo, Botrytis
cinerea, Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysporum e Phytophtora
cinnamomi e leveduras de importância clínica (Xu et al. 2013; Cao et al. 2018).
Sendo assim, essas bactérias desenvolvem vários mecanismos de antagonismo
do crescimento de fitopatógenos, pois secretam uma diversidade de compostos

820
que resultam na produção de antibióticos que pode suprimir o crescimento de
patógenos (Perez-Garcia et al. 2011; Shoda 2019).
Este trabalho avaliou a atividade antagonista de 21 linhagens
de Bacillus spp. da região amazônica, contra seis espécies de leveduras de
importância clínica, gênero Candida, fungos Sporothrix brasiliensis e o
fitopatógeno Fusarium spp., usando o método de cultura dupla. Entretanto, mais
estudos são necessários para verificar os mecanismos de antagonismo e as
moléculas que estes microrganismos podem estar produzindo para inibir o
crescimento fúngico.

Material e Métodos
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Controle Biológico e
Biotecnologia da Amazônia do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia -
INPA.

Reativação das linhagens de Bacillus spp.

Nesse estudo foram utilizadas 21 linhagens bacterianas da Coleção de
Bactérias entomopatogênicas do Laboratório de Controle Biológico e
Biotecnologia da Amazônia (INPA). Em tubos de ensaio com capacidade de 20
ml, contendo 2 ml do meio Nutriente Broth (NB) (5 g peptona, 5 g cloreto de
sódio, 1.5 g extrato de carne, 1.5 g de extrato de levedura), foram adicionados
20 µl do cultivo bacteriano. Em seguida, foram incubados em estufa rotativa 30°C
e 180 rpm, por 24 h. Após isso, 20 µl deste cultivo foram transferidos para placas
de Petri, contendo o respectivo meio. Posteriormente, com uma alça de Drigalsky
foi feito o espalhamento. As placas foram incubadas em estufa a 28ºC, por 24
horas ou 48 horas para o crescimento das colônias. Posteriormente, com auxílio
de uma alça de platina, foi feita purificação das colônias pela técnica de
esgotamento por estrias cruzadas.

Reativação das leveduras e do fitopatógeno Fusarium spp.

Nesse estudo foram utilizadas 21 linhagens bacterianas da Coleção de
Bactérias entomopatogênicas do Laboratório de Controle Biológico e
Biotecnologia da Amazônia (INPA). Em tubos de ensaio com capacidade de 20
ml, contendo 2 ml do meio Nutriente Broth (NB) (5 g peptona, 5 g cloreto de

821
sódio, 1.5 g extrato de carne, 1.5 g de extrato de levedura), foram adicionados
20 µl do cultivo bacteriano. Em seguida, foram incubados em estufa rotativa 30
°C e 180 rpm, por 24 h. Após isso, 20 µl deste cultivo foram transferidos para
placas de Petri, contendo o respectivo meio. Posteriormente, com uma alça de
Drigalsky foi feito o espalhamento. As placas foram incubadas em estufa a 28
ºC, por 24 horas ou 48 horas para o crescimento das colônias. Posteriormente,
com auxílio de uma alça de platina, foi feita purificação das colônias pela técnica
de esgotamento por estrias cruzadas. As seis linhagens de leveduras, Candida
albicans LM6351, Candida glabrata LM6223, Candida tropicalis LM6230,
Candida krusei LM6229, Candida parapsilosis LM6228, e os fungos Sporothrix
brasiliensis LM6283 e Fusarium spp. LM6002 foram cedidos pelo laboratório de
Micologia, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia-INPA. As leveduras
foram reativadas em meio de cultivo BDA (200 g infusão de batata, 20 g dextrose,
2 g de extrato de levedura, 15 g ágar), purificadas pelo método de estrias
cruzadas e mantidos em meio inclinado contendo glicerol.
O fungo Fusarium spp. foi reativado em placas de Petri contendo meio de
cultivo BDA e colocado em estufa por 7 dias em temperatura de 30 ºC.

Teste de Antagonismo
No teste de antagonismo in vitro, foi empregado o método de cultura
pareada em placas de Petri contendo meio Nutriente Ágar (NA) (5 g peptona, 5
g cloreto de sódio, 1.5 g extrato de carne, 1.5 g de extrato de levedura, 15 g
ágar). Primeiramente, com a alça de platina foi feito um risco da bactéria na
superfície do meio NA na lateral da placa de Petri e em confronto foi feito o risco
das leveduras Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C.
glabrata e Sporothrix brasiliensis, representada na figura 1. O resultado do
ensaio antagonista foi observado após 72 horas de incubação.

822
Figura 1: Representação do teste de antagonismo entre Bacillus spp. e leveduras

Triagem in vitro para atividade antagonista do Fusarium spp.

A triagem in vitro para atividade antagônica foi realizada pela técnica de
cultura dupla em placas de BDA. Um disco de ágar de 5mm de diâmetro foi
retirado de uma cultura de fungo em crescimento ativo de 7 dias e colocados no
centro de uma placa de Petri contendo meio BDA. Cada linhagem bacteriana foi
riscada a 3 cm de distância do disco do patógeno em direção à borda da placa
de Petri. O fungo Fusarium sp. inoculado em meio BDA, sem o cultivo
bacteriano, foi utilizado como controle. As placas foram parafilmadas e
incubadas a 30 °C por 7 dias até que os micélios fúngicos atingissem a borda
nas placas de controle. A inibição do crescimento micelial na direção do isolado
bacteriano foi indicativa de atividade antagônica. Todos os testes foram
realizados em triplicata. A porcentagem da taxa de inibição do crescimento (GIR;
%) foi expressa conforme descrito por Li et al. (2016).

Resultados e Discussão
Os resultados do ensaio de antagonismo dos Bacillus spp. frente as
diferentes espécies de leveduras, mostraram que três linhagens SX15 - Bacillus
safensis, SPa01 - Bacillus sp. e 59PHA - Bacillus pumilus, inibiram o crescimento
do fungo Sporothrix brasiliensis. A linhagem 59PHA também apresentou
atividade de antagonismo contra a levedura Candida glabrata (Tabela 1 e Figura
2).

823
Tabela 1. Atividade de antagonismo de Bacillus spp. frente a espécies de Candida sp. e S.
brasiliensis.
Id. C. C. C. S.
Nº Linhagem C.tropicalis C.glabrata
Molecular Krusei albicans parapsilosis brasiliensis

Bacillus
1 SX15 safensis - - - - - +
Bacillus
2 SPa01 sp. - - - - - +

Bacillus
3 59PHA pumilus - - - _- + +

Figura 2: Teste de antagonismo de Bacillus sp. contra leveduras de importância médica e

veterinária. C. a: Candida albicans; C. p: Candida parapsilosis; C. t: Candida tropicalis; C. k:
Candida krusei; C. g: Candida glabrata e S. b: Sporothrix brasiliensis.

Youcef-ali et al. (2014), demonstraram em seus estudos a atividade

antifúngica de Bacillus subtilis e Bacillus mojavensis contra Candida albicans,
patógeno fúngico humanos de importância médica. As bactérias do
gênero Bacillus são capazes de produzir diversos metabólitos, surfactina, iturina,
fengicina, enzimas de degradação da parede celular fúngica, como celulase,
protease e quitinase, que podem inibir o crescimento dessas leveduras (Kang et
al. 2020).
A inibição do crescimento da levedura C. glabrata pela linhagem 59PHA
- Bacillius pumilus, pode ser devido a compostos antifúngico produzido por este
microrganismo. Estudos demonstraram que B. velezensis produz metabólitos
secundários que contribuem para o potencial antifúngico dessas bactérias
(Devi et al. 2019). Entretanto, mais estudos devem ser investigados para tentar
isolar os metabólitos produzidos por esses bacilos.
Esses resultados também revelaram que as linhagens SX15 - Bacillus
safensis, SPa01 - Bacillus sp. e 59PHA - Bacillius pumilus apresentaram
potencial de inibição para o crescimento de S. brasiliensis, uma vez que não há
824
relatos na literatura sobre o potencial antagônico de Bacillus sp. contra espécies
do gênero Sporothrix. Estes achados podem ser uma nova oportunidade para
investigação desses microrganismos como agentes de biocontrole para
S. brasiliensis.

Teste antagonista de Bacillus spp. contra Fusarium spp.

Um total de 21 linhagens de Bacillus spp. foram testadas para atividade
antifúngica. Dez linhagens (47,6%) exibiram atividade antagônica
contra Fusarium spp, dentre as quais a linhagem SX15 - Bacillus
safensis apresentou atividade antifúngica mais eficiente, com o percentual de 77,
87%, no sétimo dia do teste de antagonismo (figura 3 e 5). As demais
linhagens B. safensis - Spa22, Bacillus sp. Gd02.13, B. thuringiensis -
Bt06, Bacillus sp. - Spa08, Bacillus sp. - SBC1, B. thuringiensis -
BtAM49, Brevibacillus sp. - Spa07, Bacillus sp. - SMP1.2 e Bacillus sp. - Spa01
apresentaram taxa de inibição inferiores com 61,84%, 49,14%, 42,24%, 41,09%,
40,23%, 39,83%, 39,20%, 36,49% e 33,91%, respectivamente (Figura 3 e 4).

Figura 3: Percentual de inibição de crescimento fúngico. A linhagem SX15 apresentou

atividade antifúngica mais eficiente, com 77, 87%. As demais linhagens Spa22, Gd02.13,
Bt06 e Spa08, apresentaram taxa de inibição inferiores com 61,84%, 49,14%, 42,24%,
41,09%, respectivamente, no sétimo dia de crescimento. Os dias de teste são representados
pelas barras de diferentes cores.

825
Figura 4: Percentual de inibição de crescimento fúngico. As linhagens SBC1, BtAM49, Spa07,
SMP1 e Spa01 apresentaram taxa de inibição inferiores com 40,23%, 39,83%, 39,20%,
36,49% e 33,91%, respectivamente, no sétimo dia de crescimento fúngico. Os dias de teste
são representados pelas barras de diferentes cores.

Figura 5: a) Ação antagônica in vitro de Bacillus safensis SX15 contra o fungo Fusarium spp.
b) Controle – somente o fitopatógeno Fusarium spp.

Os resultados de inibição da linhagem SX15 são semelhantes aos

achados de Zhu et al. (2020), que utilizaram também a mesma técnica de cultura
dupla e demonstraram que Bacillus subtilis IBFCBF-4 pode inibir o crescimento
micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lini e Fusarium oxysporum f.
sp. cucumerinum com taxas de inibição de 66, 8% e 67,8%, respectivamente.
Alguns autores relatam que o efeito de inibição fúngica podem ser atribuídos a
enzimas hidrolíticas como quitinases, β-glucanase, proteases, produzidas
por Bacillus spp., que atuam com um antagonista inibindo o crescimento fúngico,

826
hidrolizando a parede celular contendo quitina de fungos fitopatogênicos
(Azizoglu et al. 2021).
Li et al. (2016), demonstraram que os lipopeptídeos bacilomicina L,
fengicina e surfactina produzidos por B. amyloliquefaciens mostraram atividade
antifúngica contra Fusarium oxysporum e desempenham um papel importante
no controle de doenças de plantas. Nesse estudo, foi demonstrado que linhagens
de Bacillus sp., isolados de ambientes amazônicos pode ser considerado como
uma provável bactéria com potencial a ser utilizada no biocontrole de doenças
causadas por fungos do gênero Fusarium. Bacillus sp. tem despertado bastante
interesse no controle biológico de pragas agrícolas, devido as suas
características de formar esporos resistentes e produzir diferentes antibióticos,
além da adaptabilidade a diferentes condições ambientais (Reiss e Jorgensen
2017). A maioria dos estudos envolvendo linhagens de Bacillus sp. mostraram
resultados promissores no biocontrole de fitopatógenos.

Conclusão
Em conclusão, B. safensis SX15 tem atividade antagônica contra o
fitopatógeno Fusarium sp. e inibiu o crescimento do fungo Sporothrix
brasiliensis. As linhagens SPa01 - Bacillus sp. e 59PHA - Bacillius
pumilus suprimiu o crescimento fúngico do S. brasiliensis. A linhagem 59PHA
também teve atividade de antagonismo contra a levedura Candida glabrata.
Assim, Bacillus spp. podem ser usados como agentes de biocontrole contra
patógenos que causam doenças de plantas ocasionadas por Fusarium sp. e/ou
fungos de importância médica.

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