Centro de Ciências Agrárias
Disciplina: Biotecnologias da reprodução
Professor: Diego Luiz dos Santos Ribeiro
CRIOPRESERVAÇÃO
DE SÊMEN NAS DIVERSAS ESPÉCIES
Janeiro, 2025
01 ALÍCIA OLIVEIRA
06 HELLIAN COLLINS
02 ANDRESSA RAYANNA 07 LUIZ EDUARDO
03 CAMILLY PESSOA
08 MARCOS ANDRÉ
INTEGRANTES
04 CINTHYA RAQUEL
09 MARCOS AURÉLIO
05 GABRIEL DIAS 10 MARCELO HILLK
11 MIKAELLE SOUZA
CRIOPRESERVAÇÃO
Início do processo
Objetivo - Conservação de células e material genético;
Congelamento - velocidade e temperatura adequada;
Conservar Estruturas intracelulares e extracelulares;
Não comprometer composição
Técnica - Melhoramento genético;
Esperma - Animal alto potencial genético;
Armazenar material com variabilidade genética;
Risco de extinção - ambiente não propicio.
Recuperação do Habitat
DESAFIOS
Método - Não conserva 100% do material genético
Congelamento e Descongelamento
Células Passam por alterações físicas e metabólicas
Afetam Membrana plasmática e atividades bioquímicas
Congelamento (+) solutos - desequilíbrio osmótico
Meio extracelular (+) hipertônico - Desidratação
Água - meio intracelular / meio extracelular
Células - Alterações na estrutura de membrana e
Desnaturação de proteínas
Danos aos espermatozóides
PONTOS DE ATENÇÃO
Perda da motilidade
Movimentos anormais
Danos ao acrossomo e membrana plasmática
Redução do metabolismo (sucesso fecundação)
Perda de componentes intracelulares
Qualidade dos espermatozoides
Diminuição na taxa de fertilidade.
USO DE
CRIOPROTETORES
Preservar estruturas - Diminuir danos
Proteger material genético e as células
Processo de Congelamento e Descongelamento
Congelamento - formação de cristais de gelos
Descongelamento - rompimento das células
Permeáveis - Meio extracelular e intracelular
Impermeáveis - Meio extracelular
Promovendo a desidratação no Congelamento
Impedindo a formação de cristais
Eficácia varia de animal para animal e espécie
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM EQUINOS
melhoramento genético
eficiência produtiva e
reprodutiva
IA + criopreservação do sêmen
* animais sazonais
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM EQUINOS
Exame andrológico
Coleta e análise de sêmen
Criopreservação
Redução do custo na compra de animais
Armazenamento do sêmen por longos
períodos mantendo a viabilidade espermática
Utilização do sêmen mesmo após a morte
do animal
Redução da contaminação de patógenos
pela monta natural
Equino em manequim artificial (A) e natural (B) para a coleta de sêmen
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM EQUINOS
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM SUINOS
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM SUÍNOS
Melhoramento genético
Conservação de linhagens
Transporte de material genético entre diferentes regiões ou países
A sensibildade das células espermáticas
à baixa temperatura, afeta negativamente
a integridade dos espermatozoides,
assim como, a baixa concentração
espermática no ejaculado, as taxas de
http://www.reproducaomt.com.br/servico/item/6/congelamento-de-s%C3%AAmen-a-campo fertilidade de sêmem ejaculados são
inferiores ao fresco.
SÊMEM DO SUÍNO Temperaturas muito baixas
podem causar choque térmico,
afetando negativamente o vigor
O sêmen de suíno é termolábil e
espermático. O sêmen suíno
sensível a variações de temperatura, também não deve ser mantido
não devendo ser mantido em em temperaturas muito
temperaturas abaixo de 15°C. elevadas, acima de 20°C.
A temperatura ideal para a sua
conservação é entre 15 e 18°C. O sêmen suíno pode ser
utilizado em até 48-72 horas
após a coleta. Para descongelar
o sêmen, a temperatura ideal é
entre 35-37°C por no mínimo 30
segundos.
Congelamento do sêmem Conservação do sêmem
Para que o sêmen possa ser conservado, é
necessário:
As palhetas podem ser locadas, na posição
horizontal, sobre uma raque a 4 cm acima do Diluí-lo para aumentar a sua durabilidade e
nitrogênio líquido e mantidas em vapor de transporte em extensores.
nitrogênio (–120 ºC) por 15 minutos e,
Utilizar crioprotetores (Glicerol).
finalmente, submersas em nitrogênio líquido (–
Armazená-lo em palhetas plásticas ou em
196 ºC).
“FlatPacks”
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM CANINOS
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM CANINOS
1.Métodos de coleta de sêmen: Manipulação peniana, eletroejaculação e
indução farmacológica da ejaculação.
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM CANINOS
Diluentes:
Deve conter nutrientes, servir como tampão ajustando as alterações do pH, promover uma pressão
osmótica e concentração de eletrólitos dentro dos padrões fisiológicos, proteger as células contra o choque
térmico durante o processo de resfriamento e possuir crioprotetores que reduzam os danos às células
espermáticas durante a congelação e posterior descongelação (Concannon e Battista, 1989).
Principais diluentes utilizados no sêmen canino:
Diluidores à base de glicina-gema
Leite desnatado
Tampão Tris
Água de coco ACP-106®
Diluidores comerciais (Triladyl, Laiciphos 478 e Biociphos W482 e CLONE).
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM CANINOS
Crioprotetores/protetores de resfriamento:
Melhora a sobrevivência celular após os processos de congelação e descongelação e impede a formação de
grandes cristais de gelo intracelulares (Watson, 2000).
Principais crioprotetores utilizados no sêmen canino:
Glicerol
Propilenoglicol
Propanodiol
Dimetilsulfóxido
*Etilenoglicol
*Dimetilformamida.
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM CANINOS
Diluição
Concentração espermática pré-fixada na ordem de 100, 200, 400 e 800 x 10^6 de espermatozóides/mL.
Proporção de um volume fixo, entre uma parte de sêmen e: uma parte de diluente, até quatro partes
de diluente.
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM CANINOS Existem vários
protocolos elaborados,
variando quanto ao
meio de diluição, aos
Método de criopreservação de sêmen canino mais usual: agentes crioprotetores
e ao protocolo de
congelamento (EILTS,
1. Diluição do sêmen a 37ºC em Tris acrescido de gema de ovo e glicerol;
2005).
2. Procedido um período de equilíbrio de três horas;
3. Seguido do envase em palhetas plásticas;
4. Exposição aos vapores de nitrogênio para congelação.
Metódo CLONE
1. Diluição à temperatura ambiente em um diluente denominado Clone A;
2. Período de equilíbrio de uma hora;
3. Adição do diluente Clone B;
4. Envase;
5. Exposição aos vapores de nitrogênio.
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM CANINOS
Descongelação
Descongelação do sêmen a 37 oC por 45s é o método mais seguro.
Metódo CLONE
1. Diluição à temperatura ambiente em um diluente denominado Clone A;
2. Período de equilíbrio de uma hora;
3. Adição do diluente Clone B;
4. Envase;
5. Exposição aos vapores de nitrogênio.
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM FELINOS
ELETROEJACULAÇÃO
COLETA
A colheita utilizando o eletroejaculador
VAGINA ARTIFICIAL é o método de eleição para os felinos
selvagens e para a maioria dos gatos
domésticos, uma vez que o animal deve
CATETERIZAÇÃO URETRAL ser anestesiado e não há necessidade de
treinamento prévio do animal.
O protocolo de estímulos elétricos mais
LAVAGEM DA VAGINA PÓS-COITO
utilizado em gatos é o de três séries de
estímulos de 2 a 6 volts, com descanso de 5
RECUPERAÇÃO minutos entre cada série.
ESPERMÁTICA DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO
Adição de tampões ao meio diluente para a
manutenção do balanço iônico e do pH é
DILUIÇÃO PRÉ-RESFRIAMENTO imprescindível. Substâncias como:
O citrato de sódio;
Substâncias que mantêm a osmolaridade e TRIS (trishidroximetilaminometano);
tamponam o meio, garantindo a TES (ácido N-trishidroximetil-metil-2-
sobrevivência do espermatozóide durante a aminometano-sulfônico)
criopreservação
Os principais diluidores são o Botu-crio® e o A adição dos agentes crioprotetores ao meio
Tryladyl para o congelamento de diluente é essencial para a sobrevivência das
células espermáticas.
espermatozoides felinos e demonstraram ser
O glicerol é o mais utilizado
opções práticas e viáveis.
Estudos têm sido desenvolvidos em
diferentes concentrações: 4%, 5% e 7%
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM FELINOS
As primeiras tentativas para prolongar a
viabilidade espermática de felinos,
datam da década de 70.
Platz (1978)
A técnica de refrigeração, com temperaturas
entre 4 - 50°C ou 15 e 20° C promove menor
danos às células espermáticas
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM FELINOS
Zambelli et al. (2002), após testarem
Os principais métodos de criopreservação de
cinco taxas para congelação,
sêmen são refrigeração entre 4- 5°C e
observaram que a menor taxa
congelamento a -196°C em nitrogênio líquido
utilizada (3,85ºC/min) proporcionou
por um minuto ou 30 segundos,
os melhores resultados de motilidade
e porcentagem de acrossomos
Taxas de refrigeração lentas não superiores a
normais,
-0,05°C/min, entre 19 e 8°C diminuem os danos
utilizando taxas rápidas morfológicos em espermatozóides.
de congelação
obtiveram resultados
semelhantes, motilidade
espermática média de
62%.
UTILIZAÇÃO DO SÊMEN FELINO
CRIOPRESERVADO
Características físicas do sêmen
aparência branco leitosa com aspecto homogêne
O volume é uma caracteristica que varia de acordo com a técnica utilizada
A coleta por vagina artificial possuem um A coleta por eletroejaculação gera um
volume menor, porém com uma maior maior volume de plasma seminal
concentração de espermatozóides por mL
MOTILIDADE MÉDIA DOS GATOS NORMOSPÉRMICOS VARIA ENTRE 50 A 95%
E O VIGOR VARIA ENTRE 3 A 5.
UTILIZAÇÃO DO SÊMEN FELINO
CRIOPRESERVADO
Características físicas do sêmen
As anormalidades espermáticas mais frequentes em amostras
A avaliação da morfologia espermática permite seminais de gatos domésticos são:
observar a quantidade de células com defeitos macrocefalia, microcefalia, formas duplas, cauda fortemente
maiores, menores e totais. enrolada ou dobrada, peça intermediária dobrada,
gota citoplasmática proximal ou distal e cabeça isolada
A membrana espermática de felinos teratospérmicos apresenta:
maior susceptibilidade aos danos induzidos pela refrigeração,
maior sensibilidade ao estresse osmótico,
menor estabilidade do DNA,
menor capacidade de fertilização após a injeção espermática intra-citoplasmática,
maior período para capacitação espermática e reação acrossomal in vitro
UTILIZAÇÃO DO SÊMEN FELINO
CRIOPRESERVADO
Coletado por método de eletroejaculacao
motilidade total superior a 55% e vigor 3
Taxas de viabilidade celular acima de 68% após congelação-descongelação
formação de blastocisto acima de 24% com sêmen congelado-descongelado após fertilização e
cultivo in vitro de oócitos maduros
Após inseminação artificial com sêmen obtido por eletroejaculação, foi alcançada uma taxa de
gestação acima de 30% utilizando sêmen a fresco e acima de 40% com sêmen congelado-
descongelado
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM BOVINOS
DILUIÇÃO PRÉ-RESFRIAMENTO
Substâncias que mantêm a osmolaridade e
tamponam o meio, garantindo a sobrevivência do
espermatozóide durante a criopreservação
Para o sêmen bovino, os principais diluidores são
formulados à base de gema de ovo ou leite*
*inativação da lactenina
SÊMEN BOVINO
O sêmen bovino possui uma porção do plasma seminal que pode interferir na ação
dos diluidores
SOLUÇÃO Centrifugação do sêmen
Comum na criopreservação
do sêmen de equinos
ENVASE E IDENTIFICAÇÃO
Palhetas de 0,5ml ou 0,25ml
Devem ser identificadas com:
Nome do animal
Registro
Data
Propriedade
Raça
Espécie
CURVA DE RESFRIAMENTO
O sêmen bovino é sensível ao choque frio (estresse
sofrido pelos espermatozóides durante o processo
de refrigeração)
Para ruminantes: quanto mais lenta a CR, melhor
Período ideal: 4 horas à 5°C
CURVA DE CONGELAÇÃO
O sêmen de ruminantes são bem tolerantes,
aceitando curvas que variam de -10 a -100°C/min
Transportado a um recipiente contendo nitrogênio
líquido, permanecendo por 10 a 20 minutos.
ARMAZENAMENTO
Botijão criogênico
Temperatura de -196°C
Armazenado por tempo indeterminado desde que
haja manutenção do botijão e constante
reabastecimento de nitrogênio líquido
DESCONGELAÇÃO
Deve atingir temperatura entre 35 a 38°C entre 30 a
50 segundos.
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM
BUBALINOS
INTRODUÇÃO
O primeiro congelamento bem-sucedido de sêmen
de búfalo;
Roy (1957)
Relato da prenhez de bubalino com sêmen
descongelado; Basirov (1964)
Principio básico para congelamento de sêmen em
bubalinos é semelhante às demais espécies
domésticas;
Portanto:
O ejaculado seja diluido com meios diluidores ou
extensores, e seja submetido a uma curva de
resfriamento e tempo de equilibrio e depois curva
de congelamento.
CARACTERÍSTICAS BIOQUIMICAS
DO SÊMEN BUBALINO
Particularidades dos espermatozoides dessa espécie:
Maior susceptibilidade do espermatozoide bubalino aos danos causados
pelos processos de resfriamento e congelamento, quando comparados ao
bovino;
O espermatozoide bubalino apresenta uma razão de lipídeos e fosfolipídeos
na membrana plasmática, menor que aquela encontrada em bovinos
As diferenças apontadas podem ser um fator responsável por uma menor
resistência ao choque frio, pois alteram a fluidez da membrana.
CARACTERÍSTICAS BIOQUIMICAS
DO SÊMEN BUBALINO
Particularidades do plasma seminal dessa espécie:
O total de lipídeos é maior que no plasma seminal de bovinos;
A quantidade de colesterol nos búfalos é menor que em Bos taurus, considerando
o plasma como uma fonte de colesterol para a membrana do espermatozoide
para manter sua integridade estrutural, pode também afetar negativamente o
processo de congelamento
UTILIZAÇÃO DO SÊMEN BUBALINO
CRIOPRESERVADO
Preparo dos animais para a coleta
Treinamento se inicia a partir dos 14-15 meses
Animais mantidos em quarentena, isolados dos demais recebendo banhos
diários nas horas mais quentes do dia e alimentação controada
Para coleta de sêmen recomenda-se a utilização de vagina artificial - mesmo
modelo utilizado em bovinos;
O macho bubalino é considerado de mais baixa ipido que os touros da espécie
bovina - menor circulação de andrógenos;
Método de eletroejaculação deve ser utilizado apenas para a colheita do sêmen
de bubalinos entre 2 a 4 anos, desde que tenha uma boa contenção.
UTILIZAÇÃO DO SÊMEN BUBALINO
CRIOPRESERVADO
Características físicas do sêmen
Colaração depende da concentracao da amostra:
Aquosos a leitosos e cremosos
O volume é uma caracteristica variável;
Touros jovens - 1 a 3 ml Touros adultos - 4 a 8 ml
Turbilhamento acima de 3, em uma escala de 0 a 5
Ph variando entre 6,5 a 7,2. O pH deve ser determinado imediatamente após a
coleta pois o sêmen bubalino tem maior tendência a se acidificar.
UTILIZAÇÃO DO SÊMEN BUBALINO
CRIOPRESERVADO
Fatores que afetam o congelamento do
sêmen de búfalos
Ejaculado seja diluido com Submetido a uma curva de
meios diluidores ou extensores resfriamento e tempo de equilibrio
curva de aprox. 2 horas de 30° a 5°c,
combinados a tempo de equibrio de 2h
Curva de congelamento Armazenamento
congelamento inicial lento (4° a -10°C usar -3°C/min)
Rapida taxa de congelamento (-10° a -80°C usar -30°C/min
UTILIZAÇÃO DO SÊMEN BUBALINO
CRIOPRESERVADO
Assim como as taxas de resfriamento e congelamento, a taxa de descongelamento
pode ser um fator determinante para a resposta pós-descongelamento.
Elevar a temperatura de descongelamento de 37°C por 30seg
Diluidores adaptados dos bovinos, variações em relação ao tampão, crioprotetor
penetrante e aditivos
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM ANIMAIS
SILVESTRES
Objetivos e Vantagens
Armazenamento a longo prazo
Conservação de espécies
Manter a variabilidade genética
Diminui a necessidade de transporte
internacional
Diminui o risco de introdução de doenças
exóticas
Felis catus x felinos silvestres = anatomia semelhante
Desafios:
Volume pequeno do ejaculado
Baixa concentração espermática
Métodos:
Eletroejaculação;
Vagina Artificial;
Coleta Farmacológica com Cateterização Uretral.
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EM
CAPRINOS E OVINOS
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM
CAPRINOS
O sêmen deverá ser coletado preferencialmente por vagina artificial específica e em animais prévia e
devidamente treinados. Caso esse método não seja possível por algum motivo, poderá ser utilizado o
eletroejaculador (Embrapa, 2018)
Protocolos de criopreservação para caprinos
Diluentes
Crioprotetores
conservação: refrigeração x congelamento
descongelação
CRIOPRESERVACAO DE SÊMEN EM OVINOS
Os ovinos apresentam características específicas em relação a criopreservação de semem
Composição do semem
O sêmen de ovinos tem uma concentração espermática elevada e uma menor quantidade de plasma
seminal --- (mais vulnerável ao estresse)
Os espermatozoides ovinos são altamente sensíveis ao choque térmico
Os ovinos apresentam características específicas em relação a criopreservação de semem
Necessitam de diluidores enriquecidos com lipídios e crioprotetores como gema de ovo e glicerol para
proteger suas membranas celulares.
1. Coleta de sêmen
Métodos como vagina artificial ou eletroejaculação são utilizados,Após a coleta, o sêmen é avaliado
Motilidade progressiva,Concentração espermática,Morfologia espermática
2. Diluição inicial
Diluidor específico: diluidor que proteja a integridade das membranas espermáticas.
Gema de ovo: Fonte de lipoproteínas que estabilizam a membrana espermática.
leite ou água de coco
.
Estudos mostram que o uso de antioxidantes
(como glutationa e vitamina E) também
melhora significativamente a viabilidade pós-
descongelamento.
o semem é diluido em uma proporção de 1:2
ou ate de 1:4 (semem:diluidor)
4. Crioprotetores
glicerol é adicionado lentamente e em temperaturas controladas (cerca de 5 °C)
O glicerol estabiliza a membrana espermática e previne a formação de cristais de gelo intracelulares.
a concentração ideal de glicerol é de 4-6% para ovinos.
5. envasamento - em palhetas
6.Congelamento
Pré-congelamento:
As palhetas são expostas ao vapor de nitrogênio líquido, ficando a cerca de 4 cm acima da
superfície do nitrogênio por 7 a 10 minutos.
Congelamento final:
Após o pré-congelamento, as palhetas são mergulhadas no nitrogênio líquido (-196 °C) para
armazenamento.
7. Descongelamento ( etapa importante)
O método mais eficaz para sêmen ovino é o descongelamento rápido, geralmente realizado da seguinte
forma:
Banho-maria a 37 °C:(As palhetas são imersas por 30 a 60 segundos).
após descongeladas são homogeneizadas e avaliadas
Mesmo com técnicas adequadas de descongelamento, o sêmen ovino apresenta taxas de fertilização
pós-inseminação mais baixas do que espécies
CONCLUSÃO
ENCERRAR A APRESENTAÇÃO E MOTIVAR A EQUIPE
Na conclusão da apresentação de brainstorm para o time de marketing,
é importante agradecer a todos pela participação e pela colaboração
na geração de ideias. É importante destacar a importância do trabalho
em equipe para o sucesso das campanhas de marketing e motivar a equipe
para a implementação das campanhas definidas. Por fim, é preciso
encerrar a apresentação de forma clara e objetiva.
REFERÊNCIAS
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO. Medicina Veterinária. Andressa Linhares Nóbrega BIOTECNOLOGIA
APLICADA A REPRODUÇÃO ANIMAL - Criopreservação. São Paulo - 2024
BIANCHI, I. et al. Fator do plasma seminal associado à integridade de membrana de espermatozóides suínos
pós-descongelamento. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.60, n.2, Abr. 2008.
FERNANDES, Brenda Matos et al. Criopreservação de sêmen ovino utilizando gema de ovo proveniente de
galinhas alimentadas com e sem antioxidantes na ração. Revista Brasileira de Reprodução Animal, [S.l.], v. 46,
n. 4, p. 170-175, 2022. Disponível em: https://www.scielo.br/j/cab/a/rT7V9SqB6BRDGVJP36GLBVR/?
format=pdf&lang=pt. Acesso em: 5 jan. 2025.
CAVALCANTE, José Maurício Maciel et al. Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água
de coco em pó (ACP-102c). Ciência Animal Brasileira, v. 22, n. 4, p. 1-10, 2022. Disponível em:
https://www.scielo.br/j/cab/a/rT7V9SqB6BRDGVJP36GLBVR/?format=pdf&lang=pt. Acesso em: 5 jan. 2025.
REFERÊNCIAS
BRASIL. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa. Recomendações técnicas para execução da
inseminação artificial transcervical em caprinos no Brasil. Brasília, DF: Embrapa, 2018. Disponível em:
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1092720/1/CNPC2018CT46.pdf.
OBRIGADO
