UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

MANUAL DE AULAS PRÁTICAS

EM BIOQUÍMICA

Recife
2025
Baseada no manual “Práticas em Bioquímica” Rehn, K. G.; Simões, D. A. Recife, 1998.

Atualização realizada por:

Profa. Dra. Elba Verônica Matoso Maciel de Carvalho - Docente do Departamento de Bioquímica
Profa. Dra. Leydianne Leite de Siqueira Patriota - Docente do Departamento de Bioquímica

Colaboradores:

Amanda de Oliveira Marinho - Doutoranda em Ciências Biológicas

Beatriz de Albuquerque Vilar - Graduanda em Biomedicina
Jediel Oliveira dos Santos - Graduando em Biomedicina
José Rhaldney Lima de Queiroz - Graduando em Biomedicina
Maira Freitas Matos Costa- Graduanda em Biomedicina
Pedro Lucas Oliveira Costa - Graduando em Enfermagem
Rayssa Nilma da Silva Alves - Graduanda em Biomedicina
Ryan Cristian da Silva - Graduando em Biomedicina
 ÍNDICE

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO E SOLUÇÕES……………………………………………... 4

AMINOÁCIDOS…………………………………………………………………………………….. 15
PROTEÍNAS………………………………………………………………………………………… 21
ENZIMAS……………………………………………………………………………………………. 28
IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS……………………………………………………. 34
CARBOIDRATOS…………………………………………………………………………………… 39
HIDRÓLISE DO AMIDO…………………………………………………………………………… 48
LIPÍDEOS……………………………………………………………………………………………. 52
 4

AULA
INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO E SOLUÇÕES

INSTRUÇÕES

1. Compareça às aulas práticas nos dias e nos laboratórios designados para sua turma;
2. Por questões de segurança, é obrigatório o uso de jaleco ao entrar no laboratório;
3. Lembre-se que o laboratório é um ambiente dedicado a atividades científicas, toda
conduta deve refletir seriedade e responsabilidade;
4. Antes de cada prática, leia o manual e revise os procedimentos para garantir o máximo
de aproveitamento das aulas;
5. Os experimentos devem seguir estritamente as orientações fornecidas em sala de aula.
Não é permitido realizar experimentos não autorizados;
6. Não troque os reagentes de uma mesa para outra;
7. Quebra ou danos nos materiais ou aparelhos devem ser imediatamente comunicadas
aos professores ou monitores;
8. Não é permitido consumir alimentos no laboratório;
9. Em caso de dúvidas, o professor e os monitores estarão disponíveis para os
esclarecimentos necessários.
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ROTULAGEM PADRÃO DE PRODUTOS QUÍMICOS

UNIDADE DE VOLUME

A unidade fundamental de volume na medida de líquidos é o litro (l) e o mililitro (ml)

é o seu submúltiplo, correspondente à milésima parte do litro.

MATERIAIS FUNDAMENTAIS DE LABORATÓRIO

VIDRARIA: De modo geral, em um laboratório de Bioquímica, encontramos 2 tipos de

materiais de vidro: Volumétricos e Não volumétricos.

VOLUMÉTRICOS: balões volumétricos, provetas, pipetas.

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NÃO VOLUMÉTRICOS: tubo de ensaio, béquer, erlenmeyer e funil.

PIPETAS: São utilizadas para transferir volumes específicos de líquido. Existem dois tipos
principais: pipetas graduadas e volumétricas. Nas práticas abordadas aqui, apenas pipetas
graduadas são utilizadas. Elas estão disponíveis em volumes de 1, 2, 5 e 10 ml e permitem
escoar volumes variáveis de líquido, conforme a graduação, que pode ser dividida em décimos
ou centésimos de ml.

PROVETAS: São de medida volumétrica não muito rigorosa, graduadas para diversos
volumes de líquido: 25, 50, 100, 250 ml, etc.
 7

BALÕES VOLUMÉTRICOS: São recipientes calibrados para conter um volume específico

indicado por um traço de referência (50, 100, 250, 500 ml, etc.). São utilizados no preparo de
soluções que exigem alta precisão na concentração. Para garantir essa exatidão, todas as
operações de preparo de soluções devem ser realizadas à temperatura de calibração do material
volumétrico, geralmente 20°C.

OUTROS MATERIAIS: São também frequentemente usados estantes e pinças para tubos de
ensaio.

PRINCÍPIOS DE TÉCNICA

● Pipetas graduadas NÃO devem ser sopradas em nenhuma ocasião. Utilize os

pipetadores/puxadores para dispensar todos os volumes líquidos;
● Uma pipeta deve ser exclusivamente utilizada para medir apenas uma única
solução a não ser que seja lavada;
● Nunca aquecer material volumétrico;
● Antes de retirar qualquer solução de um frasco, certifique-se de ler o rótulo atentamente;
● Nunca devolva uma solução para o frasco estoque.

TÉCNICA DE LEITURA DE MATERIAL VOLUMÉTRICO

A leitura do volume é feita observando a coincidência entre a curvatura que se forma

na superfície livre do líquido (menisco) e a graduação no material volumétrico. A parte inferior
do menisco deve coincidir com o traço de graduação correspondente ao volume desejado. Para
evitar erros, seus olhos, o menisco e o traço de graduação devem estar no mesmo plano
horizontal.
 8

VELOCIDADE DE ESCOAMENTO

Se o escoamento for muito rápido, a quantidade de líquido que permanece aderida às

paredes da pipeta será maior do que o esperado. Para pipetas de 1 ml e 5 ml contendo água, o
tempo mínimo recomendado para o escoamento total é de 15 segundos.

EXPERIÊNCIA

TREINAMENTO COM PIPETAS - Procure identificar as pipetas de diferentes capacidades

e graduações (1, 2, 5 e 10 ml) que estão em sua bancada. Faça então os exercícios seguintes,
começando com uma pipeta de 10 ml:

Acople o pipetador na extremidade superior da pipeta graduada. Insira a ponta da pipeta na

água destilada, contida em um béquer, e gire a válvula para sucção até que o líquido atinja o
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menisco. Em seguida, aproxime a pipeta do recipiente de destino e pressione a válvula de

escoamento para transferir o líquido.

REPITA O EXERCÍCIO:

Com uma pipeta de 5 ml, escoando: 5 ml - 4 ml - 3 ml - 2 ml.

Com uma pipeta de 2 ml, escoando: 2 ml - 1,7 ml - 1,5 ml - 1 ml.

LEMBRE-SE:

● Volumes compreendidos entre 10 e 5 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 10

ml;
● Volumes entre 5 ml e 2 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 5 ml;
● Volumes entre 2 e 1 ml com uma pipeta de 2 ml e volumes entre 1 e 0,1 ml com uma
pipeta de 1 ml.

SOLUÇÕES

As principais maneiras de definir a concentração de uma solução são através da percentagem,

da molaridade ou da normalidade.

Uma solução percentual contém uma quantidade medida do soluto numa determinada
quantidade do solvente. Os três principais tipos de soluções percentuais resultam da definição
destas quantidades por peso ou por volume:

1 - Solução percentual peso por volume - % p/v:

Ex.: solução de cloreto de sódio 2% (2 g do sal em 100 ml da solução)

2 - Solução percentual peso por peso - % p/p:

Ex.: solução de ácido clorídrico 37% (37 g do ácido em 100 g da solução)

3 - Solução percentual volume por volume - % v/v:

 10

Ex.: solução de ácido acético 5% (5 ml do ácido em 100 ml da solução)

Uma solução molar é aquela que contém o peso molecular do soluto em gramas por litro de
solução. É representada por 1M ou M. Pode haver múltiplos ou submúltiplos do peso molecular
(2M - 4M - 0,1M - 0,2M, etc).

Por exemplo: uma solução 1M de Cloreto de Sódio contém 58,5 g (p.m.) do sal, em um litro.

Uma solução 2 M conterá 2 x 58,5g = 117 g

Uma solução 0,1 M conterá 5,85 g

Soluções normais são aquelas que contém um equivalente-grama do soluto por litro de solução.
Podemos ter múltiplos e submúltiplos do equivalente-grama (1N, 2N, 0,1N..).

O cálculo do equivalente-grama depende da natureza química do soluto. Se um ácido, calcula-

se dividindo o peso molecular pelo número de átomos de H ionizáveis.

Ex.: sol. HCl 1N (36,5 g/l); sol. HCl 0,1N (3,65 g/l); sol. H2SO4 1N (98/2 = 49 g/l).

EXPERIÊNCIA

PESAGEM E PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO

Preparar 25 ml de uma solução de cloreto de sódio (NaCl) 20% p/v.

1) Sobre a balança coloque um béquer e aperte no botão de “tarar” ou “zerar”;

2) Adicione a quantidade de NaCl necessária para se preparar 25 ml da solução a 20 % p/v.

Anote a quantidade de NaCl que pesou: ___________

3) Temos assim pesada a quantidade de sal necessária para se preparar os 25 ml da solução a

20% e deve-se prosseguir para a preparação da solução.
 11

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO

1) Ao NaCl contido no béquer junte cerca de 10 ml de água destilada;

2) Misture com um bastão de vidro até dissolver. Transfira a solução do sal para uma
proveta de 25 ou 50 ml, tomando cuidado para não perder líquido;
3) Ao béquer adicione 5 ml de água destilada e transfira para a proveta. Complete o
volume até a marca de 25 ml com água destilada não deixando ultrapassar a marca.

OBSERVAÇÕES

As quantidades definidas por volume são sujeitas a alterações significativas pela

temperatura. Em ambientes onde a temperatura não pode ser controlada rigorosamente, é
recomendável definir todas as quantidades pelas massas.

SOLUÇÕES-TAMPÃO

Tampões são soluções que resistem a variações de pH. São constituídos de ácidos fracos
e seus sais ou de bases fracas e seus sais.

Ex.: tampão acetato (ácido acético + acetato de sódio).

Vamos tomar como exemplo o tampão acetato:

Se a este tampão adicionar-se um ácido forte como o HCl, haverá formação de um sal neutro e
de um ácido fracamente ionizado, e o pH da solução permanecerá quase o mesmo.
 12

CH3COONa + HCl → NaCl + CH3COOH

(sal neutro) (ácido fraco)

Se ao mesmo tampão adicionarmos uma base forte como o hidróxido de sódio, haverá formação
de acetato de sódio (menos alcalino que o NaOH) e água. Também neste caso o pH quase não
se modificou.

CH3COOH + NaOH → CH3COONa + H2O

(acetato de sódio)

TAMPÕES FISIOLÓGICOS

Um dos mecanismos de controle da neutralidade dos líquidos celulares é a ação dos

tampões. Os principais tampões que estabilizam o pH do sangue na faixa de 7,35 a 7,45 são
bicarbonato/ácido carbônico, fosfato e hemoglobina. A manutenção desse pH é crucial, pois
valores acima de 7,7 ou abaixo de 6,8 são incompatíveis com a vida.

EXPERIÊNCIAS COM TAMPÕES

Distribua em quatro béqueres marcados:

Béquer 1 e 2: 25 ml de água destilada

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Béquer 3 e 4: 25 ml de sol. tampão acetato 0,1 N pH 4,8.

Faça a medição do pH aproximado dos líquidos dos 4 béqueres com papel indicador. Anote o
resultado no quadro a seguir:

Béquer pH inicial pH após HCl pH após NaOH

● Aos béqueres 1 e 3 adicione em cada, uma gota de HCl 2N.

 14

● Aos béqueres 2 e 4 adicione em cada, uma gota de sol. NaOH 2N.

Misture por leve agitação.

● Faça a medição, com papel indicador, do pH dos líquidos em cada béquer e anote.

Baseado nos resultados da tabela, o que concluiu?

 15

AULA
AMINOÁCIDOS

1. REAÇÃO XANTOPROTÉICA

Identificação da presença de aminoácidos de cadeia lateral aromática

(Tirosina e Triptofano)

1. A reação consiste na nitração do anel aromático, formando o nitrocomposto amarelo.

2. Em seguida a adição de base transforma os nitrocompostos formados em sais de

coloração alaranjada.

Tais radicais são encontrados na tirosina e no triptofano presentes nas proteínas.

TÉCNICA

Marque 3 tubos de ensaio e coloque em cada um as seguintes substâncias:

Tubo 1: 1 ml de ovoalbumina.

Tubo 2: 1 ml de amido.

Tubo 3: 1 ml de água destilada.

 16

Para cada tubo, adicione 10 gotas de ácido nítrico concentrado (corrosivo). Em seguida, agite
levemente e coloque-os em banho-maria por 5 minutos.

Após esse tempo, resfrie os tubos em água corrente e adicione 4 ml de NaOH 2N. Registre
os resultados em uma tabela, indicando os testes positivos com um sinal de mais (+) e os
negativos com um sinal de menos (-).
 17

O aparecimento de coloração alaranjada indica a positividade do teste, confirmando a presença

dos aminoácidos tirosina e triptofano.

TUBO RESULTADOS

2. REAÇÃO DE SAKAGUCHI

É um teste colorimétrico que detecta a presença do aminoácido arginina em amostras

peptídicas. O grupamento guanidina presente na arginina reage em meio alcalino com o alfa-
naftol, na presença de um agente oxidante, como hipoclorito de sódio, resultando em um
produto de coloração vermelha.
 18

TÉCNICA

Marque 2 tubos de ensaio e coloque em cada um as seguintes substâncias:

Tubo 1: 1 ml de ovoalbumina.

Tubo 2: 1 ml de água destilada.

Adicione a cada tubo os reagentes abaixo na seguinte ordem:

1 mL de NaOH 2N, 1 gota de alfa-naftol 5% e depois 1 mL da solução de hipoclorito de sódio

0,5%. Observe a cor que forma e anote o resultado.

Em seguida, registre os resultados em uma tabela:

 19

TUBO RESULTADO

3. REAÇÃO DO BIURETO

Reação geral para proteínas

A reação é conhecida como "reação do biureto" porque o composto mais simples que
resulta em positivo neste teste é o biureto. O biureto é uma substância artificial formada pelo
aquecimento intenso da ureia e possui a seguinte fórmula:

Este composto pode reagir em meio alcalino com íons de cobre divalente, formando um
complexo de cor violeta. Outros compostos com duas ligações amida dispostas de maneira
similar ao biureto também reagem de maneira análoga. Por isso, a reação do biureto é
observada principalmente com proteínas, que possuem múltiplas ligações peptídicas.

Os complexos coloridos formados com íons de cobre divalente em meio alcalino têm
estruturas semelhantes.
 20

TÉCNICA

Rotule 3 tubos de ensaio e adicione em casa um as seguintes substâncias:

Tubo 1: 1 ml de ovoalbumina.

Tubo 2: 1 ml de amido.

Tubo 3: 1 ml de água destilada.

Em seguida, adicione 1 ml do reativo do biureto (sulfato cúprico complexado com tartarato em

meio alcalino) em cada um .

Misture suavemente os conteúdos dos tubos por agitação leve e aguarde 10 minutos. Em
seguida, registre os resultados em uma tabela.

TUBO RESULTADOS

3
 21

AULA
PROTEÍNAS

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO

As proteínas podem ser precipitadas de suas soluções por ácidos fortes, soluções
concentradas de sais (como sulfato de amônio), solventes orgânicos (como álcool) e sais de
metais pesados, sob determinadas condições.
Embora as reações de precipitação possam parecer semelhantes, os mecanismos
envolvidos são muito diferentes. A precipitação de proteínas geralmente é acompanhada por
desnaturação, embora essa mudança de conformação às vezes seja reversível. Por outro lado,
existem formas de desnaturação irreversível (como com bases fortes ou detergentes) que não
resultam na precipitação das proteínas.

1. PRECIPITAÇÃO PELO ÁCIDO TRICLOROACÉTICO

Os ácidos fornecem íons negativos e precipitam as proteínas na forma de sais. No

entanto, esse mecanismo está associado à destruição das partes da conformação nativa das
proteínas que dependem de pontes de hidrogênio e ligações iônicas. A eficácia de ácidos
particularmente eficientes para precipitar proteínas, como os ácidos tricloroacético, túngstico
e pícrico, é explicada pelo fato de esses reagentes também atacarem os centros hidrofóbicos
das proteínas.
 22

TÉCNICA

Marque 3 tubos de ensaio e coloque em cada um 2 ml de ovoalbumina. Posteriormente,

adicione em cada um as seguintes soluções (cuidado):

Tubo 1: 1 ml sol. ácido acético 20 %

Tubo 2: 1 ml sol. ácido clorídrico 2N

Tubo 3: 1 ml sol. ácido tricloroacético 20 %.

Agite e misture completamente. Em seguida, observe e registre os resultados em uma tabela

conforme indicado abaixo, utilizando sinais de "+" para indicar a quantidade de precipitado
formado.

TUBO RESULTADO

O que concluiu sobre a eficiência dos diferentes ácidos para precipitar a proteína ?
 23

Existe relação entre a molaridade do ácido e o seu efeito sobre a ovoalbumina?

2. PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS

As bases, mesmo as fortes, não precipitam as proteínas, embora também possam

quebrar as pontes de hidrogênio e ligações iônicas. No entanto, o meio alcalino aumenta
significativamente o número de cargas negativas nas proteínas. Nessas condições, reagentes
como íons de metais pesados (como mercúrio e chumbo) precipitam as proteínas devido à
formação de sais insolúveis (proteinatos) dos metais. Vale ressaltar que, mesmo na ausência de
proteínas, esses metais, em condições alcalinas, formam hidróxidos também insolúveis. O
precipitado final, portanto, consiste em dois componentes.

Proteína + OH- → Proteína-

Proteína- + metal+ → Proteinato de metal (insolúvel)

Metal+ + OH- → metal-OH (insolúvel)

TÉCNICA

Marque 3 tubos de ensaio e coloque em cada um 2 gotas de NaOH (corrosivo).

Tubo 1: 1 ml de ovoalbumina.

Tubo 2: 1 ml de ovoalbumina e 5 gotas de solução de acetato de chumbo 10%.

Tubo 3: 1 ml de água destilada e 5 gotas de solução de acetato de chumbo 10 % (tubo controle).

Misture por leve agitação dos tubos, espere 10 minutos e anote os resultados em forma de tabela
como segue, marcando com um sinal - o teste negativo e com um ou vários sinais + , a
quantidade de precipitado que apareceu nos testes positivos.
 24

TUBO RESULTADO

O que concluiu sobre a natureza do precipitado no tubo n° 2?

3. PRECIPITAÇÃO POR SATURAÇÃO SALINA E COM SOLVENTE ORGÂNICO

Muitas proteínas são solúveis em água devido a uma extensa camada de água
estruturada que interage com cargas elétricas e resíduos polares na superfície da molécula
proteica.
 25

Quando são adicionados sais, como sulfato de amônio, ou solventes hidrossolúveis,

como álcool e acetona, essas moléculas ou íons são solvatados, competindo com a proteína
pela água, o que resulta na sua insolubilidade devido à remoção da camada superficial de água
estruturada. No entanto, grande parte dessa precipitação é reversível com a adição de mais
água, ao contrário das experiências anteriores.

TÉCNICA

Marque 2 tubos de ensaio e coloque em cada um 1 ml de ovoalbumina. A seguir, adicione

neles:

Tubo 1: 3 ml de sol. saturada de sulfato de amônio.

Tubo 2: 3 ml de álcool.

Misture bem e deixe em repouso antes de anotar os resultados.

 26

Após 5 minutos, adicione 5 mL de água destilada a cada tubo e misture novamente.

Na tabela abaixo, use um ou mais sinais "+" para indicar a quantidade de precipitado que
apareceu antes e depois da adição de água:

TUBO 1° RESULTADO 2° RESULTADO

(após adição de água)

O que concluiu sobre a reversibilidade das precipitações nos tubos 1 e 2 ?

4. PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA

O ponto isoelétrico de uma proteína é o valor de pH no qual a molécula possui carga

total nula. Nesse ponto, as proteínas apresentam solubilidade mínima, resultando em máxima
precipitação. Esse efeito pode ser demonstrado mais rapidamente em condições que removem
parcialmente a proteção fornecida pela camada superficial de água, o que pode ser obtido pela
adição de álcool.

TÉCNICA

Marque 3 tubos de ensaio e coloque em cada um 2 ml dos seguintes tampões:

 27

Tubo 1: solução tampão pH 6,0.

Tubo 2: solução tampão pH 4,7.

Tubo 3: solução tampão pH 3,0.

Adicione 1 mL de ovoalbumina e 4 mL de álcool a cada tubo. Misture bem agitando

eficientemente. Observe e registre os resultados em forma de tabela conforme indicado,
marcando com um sinal "+" os testes positivos e com um sinal "-" os negativos:

TUBO RESULTADO

Que concluiu sobre o ponto isoelétrico da ovoalbumina ? Quais aminoácidos ionizados são
mais abundantes nesta proteína ?
 28

AULA
ENZIMAS

UREASE (ureia amidohidrolase E.C.3.5.1.5).

É uma enzima encontrada nas sementes das leguminosas, especialmente no feijão de porco
(Canavalia ensiformis), mas também nas sementes da melancia (Citrullus vulgaris). Atua
especificamente sobre a ureia, transformando-a em CO2 e Amônia.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

A atividade da enzima pode ser demonstrada reagindo-a com uma solução de ureia a
pH 7, tamponada fracamente. A solução contém o indicador vermelho de fenol, que muda de
amarelo para rosa no intervalo de pH de 6,8 a 8,4. Se a enzima estiver ativa, a liberação de NH3
será suficiente para superar a ação do tampão, tornando o meio da reação alcalino. Como
consequência da elevação do pH, a solução, originalmente amarela, passará para rosa.

1. TESTE DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Marque 2 tubos e adicione:

Tubo 1: 3 ml de Ureia tamponada.

Tubo 2: 3 ml de Ureia tamponada.

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Após isso, adicione APENAS ao tubo 1 três gotas de urease e ao tubo 2 três gotas de água.
Agite os tubos e registre na tabela com um sinal "+" ou "-" com base na mudança de cor
observada.

TUBO RESULTADO

2. ESPECIFICIDADE

A urease é altamente específica para a ureia. Isso pode ser demonstrado fazendo ela
reagir com um composto com estrutura semelhante à ureia, a Tioureia.
 30

Marque 2 tubos e adicione:

Tubo 1: 2 ml de Ureia tamponada.

Tubo 2: 2 ml de Tioureia tamponada.

Após isso, adicione três gotas de urease a ambos os tubos. Agite-os e registre na tabela com
um sinal "+" ou "-" com base na mudança de cor observada.

TUBO RESULTADO

3. DESNATURAÇÃO PELO CALOR

 31

Devido à sua natureza proteica, as enzimas são sensíveis à ação de temperaturas

elevadas que podem destruir a função catalítica do seu centro ativo.

Marque 2 tubos e adicione:

Tubo 1: 3 ml de Água destilada e 3 gotas de Urease.

Após isso, agite e coloque em banho-maria fervente por 3 minutos. Ao fim, esfrie em água
corrente.

Tubo 2: 2 ml de Ureia tamponada + 1 ml da Urease fervida (Tubo 1). Agite e verifique se

houve modificação de cor da solução durante 5 minutos.
 32

Explique porque a urease foi diluída antes de esquentar e porque a elevação de temperatura
desnatura as proteínas.

TUBO RESULTADO

4. INIBIÇÃO

Grupos sulfidrila (SH) próximos ao centro ativo da urease são essenciais para a
manutenção de sua conformação ativa. Compostos como sais de metais pesados (Hg, Pb e Ag)
se combinam com os grupos SH, causando modificações permanentes na conformação da
enzima e resultando em diminuição ou perda de sua atividade.

Marque 2 tubos e adicione:

Tubo 1: 3 gotas de Urease + 1 ml de Água Destilada + 8 gotas de HgCl2.

Tubo 2: 3 gotas de Urease + 1 ml de Água Destilada.

 33

Após isso, agite e adicione 3 ml de Ureia tamponada. Agite novamente e após 5 minutos
assinale na tabela + ou - com base na mudança de cor observada.

TUBO RESULTADO

2
 34

AULA
IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Os ácidos nucleicos presentes em um tecido, especialmente o DNA, podem estar

firmemente ligados a cátions ou proteínas catiônicas, como histonas e protaminas. Assim, essas
proteínas estarão presentes junto com os ácidos nucleicos quando forem precipitados a partir
de um homogenato de fígado de rato, por exemplo. Os polinucleotídeos podem ser precipitados
pela ação de soluções salinas ou por álcool na presença de sais.

Nesta prática, será utilizado um método antigo que emprega ácido tricloroacético para
precipitar complexos nucleoproteicos. O precipitado nucleoproteico é posteriormente
dissociado pelo aumento da temperatura, liberando os ácidos nucleicos na forma de
oligonucleotídeos solúveis, enquanto as proteínas permanecem insolúveis. Em seguida, no
extrato solúvel dos oligonucleotídeos, será testada a presença dos açúcares característicos do
RNA e DNA.

A reação do Orcinol (reativo de Bial) permite identificar o RNA através da ribose presente.

A reação da difenilamina com a desoxirribose permite identificar e quantificar o DNA. Em

meio ácido, o DNA é hidrolisado, liberando desoxirribose, que reage com a difenilamina
através do grupo CHO livre, formando um complexo de coloração azulada.
 35

TÉCNICA

● Extração de ácidos nucleicos do homogenato;

● Identificação do DNA no extrato pela reação da difenilamina;
● Identificação do RNA no extrato pela reação do Orcinol (teste de Bial).

PROCEDIMENTO

1. EXTRAÇÃO DO EXTRATO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1.1. Adicionar 1 ml de solução de ácido tricloacético 20% ao tubo de centrífuga contendo 2

mL de homogenato de fígado de boi. Agite e deixe em repouso por 10 minutos.

1.2. Centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos e despreze o sobrenadante;

1.3. Ao sedimento (ácidos nucleicos e proteínas) adicione 5 ml de sol. de ácido tricloroacético

5% e misture cuidadosamente com bastão de vidro. Após isso, transfira a suspensão para um
tubo de ensaio (o tubo de centrífuga não pode ser aquecido);
 36

1.4. Leve o tubo de ensaio para o banho-maria fervente por 20 minutos. Esfrie e transfira
novamente a suspensão para o tubo de centrífuga;

1.5. Centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos e transfira o sobrenadante para um tubo de ensaio
limpo (o sobrenadante conterá quase todo RNA e DNA existente nos 2 ml de homogenato
inicial).

2. IDENTIFICAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS NO EXTRATO ÁCIDO

2.1. IDENTIFICAÇÃO DO DNA

Marque 2 tubos de ensaio e adicione:

Tubo 1: 2 ml do sobrenadante da etapa 1.5.

Tubo 2: 2 ml de água destilada.

 37

Após isso, adicione aos dois tubos 2 ml do reativo da Difenilamina, agite e leve ao banho-maria
fervente por 10 minutos.

TUBO RESULTADO

2.2. IDENTIFICAÇÃO DO RNA

Marque 2 tubos de ensaio e adicione:

Tubo 1: 0,2 ml do sobrenadante (extrato ácido de ácidos nucleicos) da etapa 1.5.

Tubo 2: 0,2 ml de água destilada.

Após isso, adicione aos dois tubos 0,8 ml de água destilada e 2 ml do reativo de Orcinol, agite
e leve ao banho-maria fervente por 10 minutos.
 38

TUBO RESULTADO

2
 39

AULA
CARBOIDRATOS

1. TESTE DE MOLISCH

Este é um teste geral para identificação de carboidratos. A base do teste reside na ação
desidratante de ácidos concentrados sobre os monossacarídeos, que resulta na formação de
furfural quando o açúcar é uma aldopentose e de hidroximetilfurfural quando é uma
hexose. Esses produtos podem se condensar com fenóis e aminas, formando compostos
coloridos conhecidos como derivados de trifenilmetano.
 40

A identificação não se limita a monossacarídeos livres, mas também abrange compostos

que contêm carboidratos ligados, como polissacarídeos, glicoproteínas e glicolipídeos, devido
à ação hidrolisante do ácido sulfúrico concentrado.

Marque 3 tubos e adicione:

Tubo 1: 2 ml de sol. glicose 1%.

Tubo 2: 2 ml de sol. amido 1%.

Tubo 3: 2 ml de água destilada.

Após isso, adicione 5 gotas de alfa naftol aos tubos e misture-os delicadamente por leve
agitação. Em seguida, adicione lentamente 2 mL de ácido sulfúrico aos tubos, despejando-o
pela parede lateral do tubo sem agitar, para que o ácido se concentre na parte inferior.
 41

A reação será positiva se um anel violeta surgir.

TUBO RESULTADO

3
 42

2. TESTE DE BIAL

Essa é a reação usada para identificação de pentoses. O teste de Bial, também conhecido
como reação do Orcinol, segue um mecanismo semelhante ao teste de Molisch. Isso significa
que um composto furfural é formado pela ação de um ácido concentrado e, em seguida,
identificado pela reação com um componente fenólico. No entanto, no teste de Bial, o ácido
utilizado é o clorídrico e o fenol é o Orcinol.

Rotule 3 tubos e pipete 1 mL do reagente de Bial em cada um deles. Em seguida, adicione

Tubo 1: 1 ml de solução de pentose (Arabinose).

Tubo 2: 1 ml de solução de glicose.

Tubo 3: 1 ml de água destilada.

Após isso, leve os tubos ao banho-maria fervente por 15 minutos. A reação é positiva com o
surgimento de uma coloração esverdeada.
 43

TUBO RESULTADO

3. TESTE DE SELIWANOFF

Essa é a reação usada para distinguir entre aldoses e cetoses. Nas condições deste teste,
as cetohexoses se convertem em derivados de furfural mais rapidamente do que as aldohexoses.
Portanto, a coloração causada pelo resorcinol só será visível nas cetohexoses. No entanto, se o
tempo de incubação for prolongado, as aldoses também mostrarão essa coloração.

Rotule 4 tubos e adicione 3 mL do reagente de Seliwanoff em cada um deles. Em seguida,

adicione:

Tubo 1: 1 ml de solução de frutose.

Tubo 2: 1 ml de solução de glicose.

Tubo 3: 1 ml de solução de sacarose.

Tubo 4: 1 ml de água destilada.

 44

O reagente de Seliwanoff consiste em uma mistura de resorcinol e ácido clorídrico

concentrado.

A reação ocorre como segue:

● A hidrólise ácida de cetoses em polissacarídeos e em oligossacarídeos produz açúcares

mais simples seguidos de furfural;
● A cetose desidratada reage, então, com dois equivalentes de resorcinol em uma série de
reações de condensação para produzir uma molécula com uma cor vermelha-cereja
profunda;
● Aldoses podem reagir ligeiramente resultando em uma cor levemente rósea.

Em seguida, coloque-os simultaneamente em um banho-maria fervente, cronometre o tempo e

registre na tabela com "-", "+", "++" ou "+++" para avaliar a intensidade da coloração
avermelhada.
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1 min 2 min 4 min 6 min

Frutose

Glicose

Sacarose

Água

Qual é o melhor tempo para diferenciação entre frutose e glicose? Qual dos dois
monossacarídeos é a cetose? Porque a sacarose reage?

4. TESTE DE BENEDICT

Esta é a reação usada para identificar carboidratos redutores. Os monossacarídeos e

alguns dissacarídeos possuem grupos aldeídos ou cetona em suas estruturas, que podem estar
livres ou hidratados e têm a capacidade de reduzir certos íons metálicos encontrados em
reagentes.
 46

A maioria desses reagentes contém sais de cobre e são utilizados para detectar açúcares
redutores. Um desses reagentes é o reagente de Benedict, que contém sulfato cúprico, carbonato
de sódio e citrato de sódio. Este último composto forma um complexo azul com cobre
divalente, evitando a formação de hidróxido de cobre insolúvel em meio alcalino.

Quando um agente redutor está presente, o cobre divalente é reduzido a cobre

monovalente, que não pode formar um complexo solúvel com o citrato. Como resultado, o
cobre precipita na forma de hidróxido cuproso de cor amarela. Com o aquecimento, o hidróxido
cuproso se converte em óxido cuproso de cor vermelha.

Rotule 4 tubos e adicione 3 mL do reagente de Benedict em cada um deles. Em seguida,

adicione:

Tubo 1: 1 ml de solução de glicose.

Tubo 2: 1 ml de solução de frutose.

Tubo 3: 1 ml de solução de sacarose.

Tubo 4: 1 ml de água destilada.

Após isso coloque eles em banho-maria fervente por 3 minutos.

 47

TUBO RESULTADO

4
 48

AULA
HIDRÓLISE DO AMIDO

O amido quando tratado por um ácido a quente sofre um hidrólise sucessiva, dando
várias dextrinas e como produtos finais, maltose e glicose.

As dextrinas variam em tamanho, mas geralmente mantêm a estrutura em hélice do

amido. Como resultado, as dextrinas absorvem o iodo e reagem com o reagente de Lugol (uma
solução de poli-iodetos), produzindo soluções coloridas. As variações nas cores observadas
permitem classificar as diferentes dextrinas.

Tanto a maltose quanto a glicose possuem propriedades redutoras que podem ser
identificadas pela reação de Benedict. O reagente de Benedict contém sulfato cúprico,
carbonato de sódio e citrato de sódio. O citrato de sódio forma um complexo azul com o cobre
divalente, prevenindo a formação de hidróxido de cobre insolúvel em meio alcalino. Quando
um agente redutor (como maltose ou glicose) está presente, o cobre divalente é reduzido a
cobre monovalente, o qual não pode formar um complexo solúvel com o citrato de sódio. Como
 49

resultado, o cobre precipita na forma de hidróxido cuproso de cor amarela. Com o aquecimento,
o hidróxido cuproso se converte em óxido cuproso de cor vermelha.

TÉCNICA

1) Preparar o banho-maria e enumerar 7 tubos de ensaio;

2) Em um Erlenmeyer, colocar 30 ml da solução de amido 1% e 7 ml de HCl 2N;
3) Após isso, transferir 3 ml dessa solução para cada um dos 7 tubos de ensaio
enumerados;

4) Apenas no tubo 1, adicione 1 gota do reativo de lugol e observe o surgimento da

coloração azulada. O restante dos tubos deve ser colocado no banho-maria fervente;
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5) Retire cada um cada um deles ao fim do período de tempo indicado na tabela abaixo,
resfrie em água corrente e adicione uma gota de Lugol, exceto no tubo 7;
6) Ao tubo 7 adicione 3 ml do reativo de Benedict e retorne ele ao banho-maria fervente;
7) O aparecimento de um precipitado vermelho-alaranjado indica a presença de substância
redutora (maltose ou glicose).

TABELA:

TUBO MINUTOS DE REAÇÃO COR COM IODO PRODUTOS

1 0 minuto
2 2 minutos
3 5 minutos
4 10 minutos
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5 15 minutos
6 20 minutos
7 25 minutos Reação de Benedict

TESTE DE IODO

Identificação de polissacarídeos

Alguns polissacarídeos reagem com o iodo formando produtos coloridos. Com o amido, a cor
é azul, com o glicogênio é castanho-avermelhado. Os monossacarídeos não reagem. No amido,
é a fração não ramificada (amilose) que é responsável pela formação do complexo na cor azul;
a amilopectina reage de forma semelhante ao glicogênio.

TÉCNICA

Marcar 3 tubos e distribuir neles:

Tubo 1 - 2 ml de amido 1%

Tubo 2 - 2 ml de glicose 1%

Tubo 3 - 2 ml de água destilada (tubo controle)

Aos tubos, adicionar 2 gotas de solução de lugol - o reativo de lugol é uma solução poli-iodetos,
produzidos por dissolução do iodo metálico numa solução de iodeto de potássio, e ele reage
como se fosse iodo elementar). Anotar os resultados na tabela.

TUBO RESULTADO

REVERSÃO DA REAÇÃO DO IODO PELO CALOR

Colocar o tubo 1 do ensaio anterior no banho-maria fervente por alguns minutos até o
desaparecimento da cor azul. Resfriar em água corrente. O que observou?

A cadeia da amilose (fração não ramificada do amido) tem a conformação de uma hélice que
absorve o iodo no interior do espiral. Este complexo forma-se por interações fracas que podem
ser desfeitas pelo calor.
 52

AULA
LIPÍDEOS
1. SAPONIFICAÇÃO

A reação de saponificação ocorre entre ésteres de ácidos graxos, presentes em óleos e

gorduras, e bases fortes, resultando na formação de sabão, que são sais de ácidos carboxílicos.
Esses sais são anfipáticos, ou seja, possuem afinidade tanto por moléculas polares quanto
apolares, devido ao seu caráter hidrofílico e hidrofóbico.

Sal de ácido
carboxílico (porção
polar; hidrofílica).

Cadeia de hidrocarbonetos (porção apolar; hidrofóbica).

Na prática isso permite que produtos de limpeza (sabões, detergentes, sabonetes,

shampoos, etc) auxiliem na eliminação de resíduos que não são solúveis em água ou facilmente
arrastados por ela.
 53

PROCEDIMENTO:

1) Adicione aproximadamente 1g de gordura animal a um tubo de ensaio grande (25 x 200

mm) e em seguida inclua 10 ml de solução alcoólica de KOH 0,5 N (extremamente
corrosiva);
2) Anexe um tubo condensador cheio de água da torneira ao tubo de ensaio para minimizar
a evaporação do álcool. Coloque o conjunto (tubo grande + tubo condensador) em um
banho-maria fervente por 5 minutos;
3) Após esse período, retire o tubo do banho e elimine qualquer resíduo sólido restante.
Prossiga apenas com o líquido contido no tubo grande;
 54

4) Adicione 10 ml de água destilada à mistura de saponificação e agite vigorosamente.

Observe a formação de espuma;
5) Preserve o conteúdo do tubo para experimentos subsequentes.
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2. PREPARAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES

1) Adicione à mistura de saponificação, já diluída com água destilada, 1 ml de ácido

clorídrico concentrado, gotejando-o lentamente e agitando o tubo posteriormente com
precaução (o ácido é corrosivo);
2) Retorne o tubo ao banho-maria até que ocorra uma separação adequada das camadas,
com a camada oleosa se posicionando acima da camada aquosa (os ácidos graxos livres
são pouco solúveis em água e menos densos do que ela);
3) Resfrie o tubo em um recipiente contendo gelo. A camada superior solidificará devido
à predominância de ácidos graxos saturados na gordura animal, os quais possuem um
alto ponto de fusão, comparado aos ácidos graxos insaturados predominantes na
gordura vegetal;
4) Separe o líquido do tubo e conserve apenas a parte sólida para os próximos
experimentos.

3. SOLUBILIDADE DOS ÁCIDOS GRAXOS LIVRES

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Ácidos graxos são pouco solúveis em água e podem ser solubilizados em solventes
orgânicos como éter.

1) Utilizando um bastão de vidro, retirar uma pequena quantidade dos ácidos graxos
isolados e transferi-los para um tubo de ensaio limpo e seco;
2) Acrescentar 2 ml de éter ao tubo e agitar.

4. FORMAÇÃO DE SABÕES SOLÚVEIS POR REDISSOLUÇÃO DOS ÁCIDOS

GRAXOS LIVRES

1) Adicione ao tubo da segunda experiência, que contém a maior parte dos ácidos graxos
isolados, 10 ml de água destilada e 5 ml de solução alcoólica de KOH 0,5 N (altamente
corrosiva);
2) Coloque o tubo em banho-maria por 3 minutos;
3) Agite e observe a formação de espuma. Conservar o conteúdo do tubo para a próxima
experiência.
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5. FORMAÇÃO DE SABÕES INSOLÚVEIS

1) Pegue dois tubos de ensaio e adicione 2 ml da solução de sabões solúveis obtida na

experiência anterior em cada um;
2) No primeiro tubo, adicione 10 gotas de solução de cloreto de cálcio 5%, e no segundo
tubo, adicione 10 gotas de solução de acetato de chumbo 10%;
3) Observe a formação de precipitados (sabões insolúveis de cálcio e chumbo, juntamente
com seus hidróxidos correspondentes).
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