Prof. Valmir F.

Juliano

QUI624
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
 Classificação dos métodos
analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS
Chamados de métodos Baseados em propriedades
de via úmida físicas (químicas em alguns casos )

Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Cromatográfico

Espectrométrico

Propriedades Propriedades Propriedades

elétricas ópticas mistas*
*Separação: interações físico-químicas.
Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou
 Cromatografia
Histórico
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett
(1903), botânico russo: Separação de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes
éter de sólidos e solventes variados.
petróleo
mistura de
pigmentos

CaCO pigmentos
3 separados

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever]

(grego)
 Cromatografia
Definição - Princípio Básico

Cromatografia é um método físico-químico de

separação de misturas, identificação e
quantificação de seus componentes.
• A separação depende da interação dos
componentes da mistura com a fase móvel e com
a fase estacionária.
• A interação dos componentes da mistura com estas duas
fases é influenciada por diferentes forças
intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e
específicos efeitos de afinidade e solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da
interação de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação
com padrões de concentrações conhecidas,
 Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

• De acordo com o sistema cromatográfico

• Em Coluna
• Cromatografia Líquida
• Cromatografia Gasosa
• Cromatografia Supercrítica

• Planar
• Centrífuga (Chromatotron®)
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
• Cromatografia em Papel (CP)
 Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

• De acordo com a fase móvel

• Utilização de Gás
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)

• Utilização de Líquido
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

• Utilização de Gás Pressurizado

• Cromatografia Supercrítica (CSC)
 Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

• De acordo com a Fase Estacionária

• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas

• De acordo com o modo de separação

• Por Adsorção
• Por Partição
• Por Troca Iônica
• Por Afinidade
 Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas

Técnica Planar Coluna

FM Líquido Gás Líquido

FE Líq Sól Líq Sól Líq Sól Troca Afinidade Fase Exclusão
Iônica Ligada

Tipo de
cromato- CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
grafia
 Cromatografia
Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um
grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa
região.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre
as moscas e abelhas.

Fase estacionária Analitos

 Cromatografia
Analogia

Para uma mesma mistura, a simples troca da fase

estacionária pode ser suficiente para alterar
completamente a ordem de eluição de componentes da
mistura.

Fase estacionária Analitos

 Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
 Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na
celulose.

Separação
Fase móvel

A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois

líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de
filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de
cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura
azul e amarela.
 Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é

bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra.
Aplica-se na separação e identificação de compostos
 Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a
ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com
fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca
iônica.
 Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Termos e parâmetros técnicos
ΔS mancha
Rf 
ΔS solvente

a
Rf a 
s s
c
b
Rfb 
s
b
c
a Rfc 
s
 Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

FASES ESTACIONÁRIAS

Sílica (SiO2)
Ativação de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC
Alumina (Al2O3)

Celulose Ativação de 10 min

a 105 oC

Poliamida
 Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

ANÁLISE QUALITATIVA

- Comparação com valores de Rf tabelados

- Comparação com padrão eluído em conjunto

- Extração e aplicação de métodos instrumentais

 Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Conclusões:

Amostra não contém a espécie B

Amostra pode conter a espécie A

Para se certificar da presença,

eluir em outros solventes

A B Após
Amostra Eluição
 Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografi
a Bi-
dimensional

Solvente 1 Solvente 2
 Cromatografia
Cromatografia planar

Chromatotron é uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas
colunas e HPLC.
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

PROCESSOS DE SEPARAÇÃO

Exclusão Partição

Adsorção Troca Iônica

Afinidade
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO

- Fase Móvel Líq. ou Gás

- Fase Estacionária Sólida

Processos de
Adsorção/Dessorção

Ligações de hidrogênio;
Forças de Van der Waals
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

Diferença entre Absorção e

 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO

Fase Estacionária Sólida:

Polar

Aumento da Atividade

-CO2H > -OH > -NH2 >

-SH > -CHO > -C=O >

-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

 Cromatografia
Cromatografia em Coluna
A função das fases móveis na cromatografia por
adsorção tem sentido amplo:
a) Função solvente
• Solubilizar os componentes
• Ter baixo ponto de ebulição
b) Função eluente
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)

SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente

Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < Ácido Acético
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

ADSORÇÃO
Usos:
a) Laboratórios de química orgânica  separar e
purificar reagentes e materiais obtidos em síntese.
b) Laboratórios de produtos naturais  escala
preparativa e analítica.
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de
esteróides de urina ou de sangue, etc.
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa

Fase Estacionária Líquid

Processos de
Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua volatilidade.
volatilidade
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Líquid

Processos de
Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua solubilidade.
solubilidade
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca
iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio
químico de extraordinário valor em processos analíticos.

Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Sólida

Processos de Troca
Iônica
Adsorção reversível e
diferencial dos íons da
fase móvel pelo grupo
trocador da matriz
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas
e Aniônicas
Fluxo da FM

FE altamente carregada

Maior Interação

• Íons de alta carga

• Íons de menor
tamanho
A diferença de afinidade
entre os íons da FM pode ser
controlada por pH e força
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

juste do pH proporciona a separação das duas proteín

 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária em Gel

Enquanto as partículas menores penetram

nas cavidades, as maiores vão sendo
eluídas contornando as estruturas
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de
exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros
tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel
não carregado constituído de macromoléculas que têm
ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas
que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas
- Determinação de Massa Molar
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
Características
desejáveis para os
Géis
-Inércia Química:
Não pode haver uma interação
química entre a matriz e o
soluto.
-Estabilidade:
O gel deve suportar uso
contínuo quanto mantido em
condições brandas de
temperatura e pH.
-Baixo teor de íons:
Grupos carregados interferem
no processo de separação.
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

EXCLUSÃO
Fluxo da FM

Tipos de Géis

Dextrano (Sephadex)

Poliacrilamida

Ágar e Agarose
 Cromatografia
Cromatografia em Coluna

AFINIDADE

Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Sólida

Propriedades

Biológicas e

Funcionais
 Cromatografia
Teoria Básica
Sem
importância
SOLUTO na CG, mas
com grande
importância
na CLAE
⇌
⇌
FASE
MÓVEL
⇌ FASE
ESTACIONÁRIA
 Cromatografia
Teoria Básica
Coluna cromatográfica:
cromatográfica série de estágios independentes onde
acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase
estacionária e na fase móvel:

Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito

sorvido na FE e dissolvido na FM.

KC 
A FE Afinidade pela
FE
[A]FE
A FM MENOR
RETENÇÃO !!!
KC = Constante de Distribuição
Volatilida [A]FM
[A]FE = concentração do analito na de
FE
 Cromatografia
Quantificação da eficiência
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios
separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:

Cada “estágio” de equilíbrio

é chamado de PRATO
O número de pratos teóricos
TEÓRICO
de uma coluna (N) pode ser
calculado por:

tR Coluna mais
N eficiente
wb
 Cromatografia
Quantificação da eficiência
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
Valores típicos de H e
“Tamanho” de cada estágio de dC df N:H N

equilíbrio 0,10 0,25 0,081 370370

0,25 0,25 0,156 192308
(L = comprimento da 0,32 0,32 0,200 150000
coluna) 0,32 0,50 0,228 131579
Capilares, L = 30 m 0,32 1,00 0,294 102041
0,32 5,00 0,435 68966
dc = diâmetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionária em 0,53 1,00 0,426 70423
m 0,53 5,00 0,683 43924
2,16 10% 0,549 3643
Empacotadas, L = 2
2,16 5% 0,500 4000
m
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são
próximos, mas como L para capilares é MUITO maior
tipicamente elas são mais eficientes
 Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa

Fase estacionária

Detecçã
Fase móvel o
Separação
 Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa

Injetor:
submetido à
temperatura
controlada Detector:
submetido à
Fase temperatura
móvel: gás controlada
inerte
Coluna: contendo a
fase estacionária
está submetida à
temperaturas
controladas
 Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade

Quais misturas podem

ser separadas por CG ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um
fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos
parcialmente, nesse gás.

Misturas cujos constituintes sejam

VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas
cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até
300oC e que sejam termicamente estáveis.
 Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)

INERTE: Não deve reagir com a amostra,

nem com a fase estacionária ou
superfícies do instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas
em gases e seus
efeitos: H O, O oxida / hidrolisa algumas
2 2
FE
incompatíveis com DCE
hidrocarbone ruído no sinal de DIC
tos
 Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)

CUSTO: Gases de A = 99,995 % (4.5)

CUST
altíssima pureza C B = 99,999 % (5.0)
podem ser muito B

O
A C = 99,9999 %
caros. PUREZ
(6.0)
A

COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector

demanda um gás de arraste específico para melhor
funcionamento.
DCT He , H2
Seleção de Gases
de Arraste em DIC N2 , H2
Função do N2 (SS), Ar + 5% CH4
DCE
Detector:
 Cromatografia Gasosa
Injetor

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou

VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução
INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

t=0

Injeção
instantânea: t=x

t=0

Injeção lenta:
t=x
 Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”
1
2
1 - Septo (silicone)

3 2 - Alimentação de gás
de arraste)
4
3 - Bloco metálico
aquecido

4 - Ponta da coluna
cromatográfica
 Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”

1 - Ponta da
1 2 3 agulha da
microsseringa é
introduzida no
início da coluna.
2 - Amostra
injetada e
vaporizada
instantaneamente
no início da
coluna.
3 - “Plug” de
vapor de amostra
 Cromatografia Gasosa
Parâmetros de injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente,
mas sem decomposição.
Regra Geral:
Geral Tinj = 50oC acima da temperatura de
ebulição do componente menos volátil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do
estado físico da amostra.
Amostras Amostras
COLUNA Líquidas Gasosas
Sólidos:
Sólidos
convencionalment empacotada
e se dissolve em  = 3,2 mm 0,2 L ... 20 0,1 mL ... 50 mL
L
um solvente (1/4”)
adequado e capilar
 = 0,25 mm 0,01 L ... 3 1 L ... 100 L
injeta-se a L
 Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeção
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10
L
êmbol agulha (inox
o 316)
Microsseringa
de 10  L:
corpo
(pirex)
corpo agulha

Microsseringa de 1
 L (seção
ampliada): guia
êmbolo (fio de
aço soldado ao
Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido
pulverizado (FE sólida ou FE
líquida depositada sobre as
partículas do recheio)

CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas
com um filme fino (fração de
m) de FE líquida ou sólida
 Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito
demora para percorrer a coluna depende de sua
PRESSÃO DE VAPOR (p0).
Estrutura química do
p =f
0
analito
Temperatura da
coluna

Temperatura Pressão Velocidade

da de de
coluna vapor migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE

(MENOR RETENÇÃO)
RETENÇÃO
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna

TEMPERATURA DA
AUMENTO DA
CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
 Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades
muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA: TCOL ALTA:

- Componentes mais voláteis - Componentes mais

são separados voláteis não são separados
- Componentes menos - Componentes menos
voláteis demoram a eluir, voláteis eluem mais
saindo como picos mal rapidamente
definidos
 Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a
separação:

TEMPERATUR
TFIM

R
TINI

A
tINI tFIM
TEMP
O
TINI - Temperatura Inicial
Consegue-se boa
separação dos TFIM - Temperatura Final

componentes da tINI - Tempo Isotérmico Inicial

amostra em menor tFIM - Tempo Final do Programa
tempo R - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia Gasosa

Programação linear de
temperatura

a) Isotérmico a 45 ºC;
b) isotérmico a 145 °C;
c) programado de 30 ºC a 180
ºC
 Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Possíveis problemas associados à
PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO
DO GÁS DE ARRASTE: A
viscosidad vazã
viscosidade de um gás
e o
aumenta com a
temperatura.

DERIVA (“DRIFT”) NA
LINHA DE BASE: Devido
ao aumento de
volatilização de FE líquida
 Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar,
aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente
com os componentes da amostra.

FE Seletiva:
separação adequada dos
constituintes da amostra

FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna
de boa eficiência
 Cromatografia Gasosa
Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela
interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na
interface entre o gás de
arraste e a FE sólida

• Sólidos com grandes áreas

superficiais (partículas finas, poros)

ADSORÇÃ • Solutos polares

O
• Sólidos com grande número de
sítios ativos (hidroxilas, pares de
elétrons...)
 Cromatografia Gasosa
Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela
interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO

A absorção ocorre no
interior do filme de FE
líquida (fenômeno
INTRAfacial)

• Filmes espessos de FE líquida

• Grande superfície líquida exposta

ABSORÇÃ ao gás de arraste
O
• Interação forte entre a FE líquida e
o analito (grande solubilidade)
 Cromatografia Gasosa
Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros
óticos são MUITO SIMILARES  FE convencionais
não interagem diferencialmente com os isômeros
óticos.
óticos

PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de

origem sintética e natural (natural = normalmente
substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são
misturas racêmicas).
FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos
isômeros óticos têm atividade farmacológica.
 Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído,
gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás
de arraste.
Características ideais:
ideais
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por
várias ordens de grandeza.
4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo
menos 400 ºC.
5.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7.Similaridade de resposta para todos os solutos.
8.Não destrutivo.
 Cromatografia Gasosa
Detectores

REGISTRO
DE
SINAL

ANALÓGICO
Registradores
XY
DIGITAL
Integradore
s
Computador
es
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no
cromatograma.
 Cromatografia Gasosa
Detectores
DCT DC DNP
E

UNIVERSAIS: SELETIVOS: ESPECÍFICOS:

Geram sinal para Detectam Detectam
qualquer apenas substâncias que
substância eluída. substâncias possuam
com determinado
determinada elemento
propriedade ou grupo
físico-química. funcional em
suas
 Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT
OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de
arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU
FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em
uma chama de H2 + ar.

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU

ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de
elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD):

Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H2
+ ar passam por uma superfície de silicato de rubídio
onde se formam íons de moléculas com N e P.
 Cromatografia Gasosa
Detectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT
OU TCD): Universal.
Universal Observa-se para qualquer substância
eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas
de  g (10
DETECTOR
4
). POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU
FID): Quase-universal.
Quase-universal Detecta qualquer substância que
contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2,
N2, CX4, SiX4 (X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2,
NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 –
DETECTOR
108
). POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU
ECD): Seletivo.
Seletivo Responde muito bem a halogenetos
orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e
organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade
DETECTOR
até ng. (104) TERMOIÔNICO (DNP OU NPD):
Específico.
Específico Responde a compostos orgânicos com N e P.
Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade
 Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
Específico Um
dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa
é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer
substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no
espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando
monitora-se um fragmento de determinada razão m/z.
Detecção

TIC
Universal
Similar a DCT
SIM
Seletivo
Maior
 Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
Específico

Cromatograma de íons

CONTAGEN
totais: TIM ou TIC

S
Em cada posição do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.
MASSA / CARGA
CONTAGEN
S

TEMP
O
 Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
Específico

Cromatograma de

CONTAGEN
íons selecionados:
SIM

S
Em cada posição do
cromatograma tem-
se o sinal somente MASSA / CARGA
da m/z selecionada.
Oferece a
CONTAGEN

vantagem de
S

registrar somente
o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
“cego” para os TEMP
O
 Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
CG-EM
Câmara
Colun de
C E a Ionização
G M Capila
r

Vácu
o
Separador Molecular Interface Capilar
O gás de arraste leve Direta
(He) difunde mais Com colunas capilares
rapidamente que o a vazão baixa de gás
analito e tende a ser de arraste pode ser
drenado para o vácuo. drenada pelo sistema
de vácuo.
 Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito
éo
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
tR = Tempo de Retenção
tR (tempo decorrido entre a
injeção e o ápice do pico
tR’ = tR - cromatográfico)
tM tM = Tempo de Retenção do
SINAL

Composto Não-Retido (tempo

mínimo para um composto
t que não interaja com a FE
M
atravesse a coluna)
tR’ = Tempo de Retenção
TEMPO
Ajustado (tempo médio que
as moléculas do analito
 Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25
m
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC
Volume injetado: 1 L Como se explica esta
Mistura de benzeno, n-
propanona, n-propanol, n-
ordem de eluição?
butanol, isobutanol e n-
1. A n-propanona elui primeiro
pentanol.
devido à sua maior
volatilidade.
2. O benzeno em segundo
devido sua natureza apolar
(menor ).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenças de
polaridade não são elevadas,
a volatilidade se torna o
principal parâmetro que
 Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:

• Altura da banda cromatográfica: não

recomendado, pois a banda necessita ser
perfeitamente simétrica.
• Área da banda cromatográfica.
SINAL

Área Altura

TEMPO
 Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa

Área
amostra

Concentração

tempo
 Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa

A partir de
ÁREA

certo ponto o
sinal não
aumenta mais
linearmente

MASSA
1,05 S

O fim da zona de linearidade ÁREA / MASSA

pode ser detectado quando a
razão (Área / Massa) diverge
em mais de 5 % da inclinação 0,95 S
da reta na região linear:
MASSA
 Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa

concentração

Área
na amostra
amostra

Concentração Adicionada

tempo
Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida
 Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade

Quais misturas podem

ser separadas por
CLAE ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um
líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa

molar de 32 até 4000000.
DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas
cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de
volatilidade ou de estabilidade térmica.
 Cromatografia Líquida
Aumento de polaridade

Insolúvel em água Solúvel em água

Apolar Iônico
Polar não iônico

Tipos e Partição
102
Aplicações da Partiçã Partiçã
Adsorção o em Troca
o em
Cromatografia 103 fase fase
iônic
reversa normal a
Líquida
molecular
Massa

104

Permeaç Filtraçã
ão em Exclusão o em
105 gel gel

106
Cromatografia Líquida
Componentes típicos - CLAE
 Cromatografia Líquida
Esquema de um equipamento para CLAE
 Cromatografia Líquida
Requisitos dos sistemas de
bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10
mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo
de 0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão

Bomba recíproca (também são

chamadas de bombas de pistão ou de
 Cromatografia Líquida
Sistemas de injeção de amostras

Suportam pressões de até 7.000

psi
Volumes típicos: 5 a 500 L
 Cromatografia Líquida
Fase móvel para
CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separação.
• Eluição isocrática:
• Quando a separação é feita utilizando um único
solvente de composição constante.

• Eluição com gradiente:

gradiente
• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que
diferem bastante entre si em polaridade.
• Depois que a eluição começa, a razão entre os
solventes é variada de modo programado, de forma
contínua ou em passos.
A eluição com gradiente produz efeitos similares
aos produzidos pela programação de temperatura
 Cromatografia Líquida
Eluição com Coluna C18, 5 m, fase
gradiente reversa
Detector fluorescência:
excit. 334 nm – emis. 425
nm
 Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox,
embora tubos de vidro com
paredes resistentes sejam
encontrados ocasionalmente.
No entanto, estes últimos são
restritos a pressões mais baixas
do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na
fase estacionária. Preços variam de 200 a 500
dólares.
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
•Remoção de material particulado
•Contaminantes do solvente
Pré-coluna
•Contaminantes da amostra
•Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida útil da coluna

COLUNAS TÍPICAS
•Material:
Material aço inox
•Comprimento:
Comprimento 10 a 30 cm
•Diâmetro:
Diâmetro 4 a 10 mm
•FE:
FE Partículas de 5 a 10 m
•Eficiência:
Eficiência 40 mil a 60 mil
pratos/metro
 Cromatografia Líquida
Separação isocrática de alta velocidade
Coluna de - 4 cm de
comprimento
alta - 0,4 cm d.i. 100.000 pratos/metro
velocidade e - FE: spherisorb 3 m
alta
FM: 4,1% EtAc em n-
eficiência
Hexano
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de
benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
 Cromatografia Líquida
Fase estacionária para CLAE
Basicamente são dois tipos de FE:
• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40
m, recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• Partícula porosa:
porosa
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros
de 3 a 10 m. As partículas são constituídas dos
mesmos materiais do recobrimento pelicular.
pelicular
 Cromatografia Líquida
Detectores
As características desejáveis para os
detectores para CLAE não são diferentes
daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• Propriedades universais (índice de refração, densidade
ou constante dielétrica).
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).

Características ideais:
ideais
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens
de grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.Não destrutivo.
 Cromatografia Líquida
Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV

• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103

• Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104
 Cromatografia Líquida
Detectores
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis
atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os
detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens
como alta sensibilidade, simplicidade e ampla
aplicabilidade.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
 Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de
massa potencializa a técnica de separação e quantificação
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes
relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de
vácuo na EM.
Interface CL-EM
 Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa

TIC
CONTAGEN
SIM
S

CONTAGENS
CONTAGENS

MASSA / CARGA

CONTAGENS MASSA / CARGA

TEMPO

TEMPO
 Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE

Ao contrário da CG, onde a FM se comporta

como um gás ideal e não contribui para o
processo de separação, a FM líquida da CLAE
interage tanto quanto a FE com os
componentes da amostra.

Isto torna o desenvolvimento dos métodos

em CLAE um tanto mais complexo que na CG.
 Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• PARTIÇÃO:
PARTIÇÃO líquido-líquido e fase ligada. A diferença
entre elas consiste em como a FE é mantida nas
partículas do suporte do empacotamento  Adsorção e
ligação química.
química Dois tipos podem ser distinguidos:
Fase normal e Fase reversa.
reversa
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)
FM apolar (ex. hexano ou éter
isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro
por ser o mais solúvel na fase móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex.
hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou
acetonitrila)
 Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na
fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-
octadecil)
 Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
Campo Misturas típicas
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos,
lipídios
Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB
(bifenilas policloradas)
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no
sangue, narcóticos
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas,
extratos de urina, estrógenos
 Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• ADSORÇÃO:
ADSORÇÃO líquido-sólido. FE sílica ou alumina.
alumina É a
forma clássica da CL introduzida no início do século 20.
Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos
métodos de HPLC.
• TROCA IÔNICA:
IÔNICA líquido-sólido. FE resina com
capacidade de troca iônica.
iônica
• EXCLUSÃO:
EXCLUSÃO líquido-gel. FE gel.
gel Um material
polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas
ligações cruzadas, são capazes de promover a
separação de acordo com os tamanhos das moléculas 
EXCLUSÃO DE TAMANHO.
TAMANHO Se o material reticulado for
uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de
EXCLUSÃO DE ÍONS.
ÍONS
 Cromatografia

Para refletir e responder:

Duas substâncias diferentes com a mesma concentração
apresentarão a mesma área sob suas bandas
cromatográficas?
Para um mesmo analito, a área ou altura
aumentam com o aumento da concentração. A
área sob a banda cromatográfica de duas
substâncias diferentes dependerá da resposta
do detector para aquele tipo de substância,
independentemente do tipo de detector
 Cromatografia

Para refletir e responder:

A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo
de analito?

A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são

os casos em que isto ocorre?
FIM