URI - CAMPUS ERECHIM

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS

ESTUDO DA ATIVIDADE DA ENZIMA GLUTATIONA PEROXIDASE

EM CARNE DE FRANGO

RENATA BEZERRA ROTTA

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de

Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-Campus
de Erechim, como requisito parcial à obtenção do Grau
de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de
Concentração: Engenharia de Alimentos, da
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das
Missões – URI, Campus de Erechim.

ERECHIM, RS - BRASIL

MAIO DE 2007
 ESTUDO DA ATIVIDADE DA ENZIMA GLUTATIONA PEROXIDASE
EM CARNE DE FRANGO

Renata Bezerra Rotta

Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de

Mestrado em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários à
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de Concentração:
Engenharia de Alimentos.

Comissão Julgadora:

____________________________________
Prof. Alexandre José Cichoski, D.Sc.
Orientador

____________________________________
Gerson Scheuermann, Ph.D.

____________________________________
Prof. Marco Di Luccio, D.Sc.

____________________________________
Prof. Tatiana Emanuelli, D.Sc.

Erechim, 28 de maio de 2007

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 AGRADECIMENTOS

Ao Professor Alexandre José Cichoski, pela valorosa orientação, pelo apoio e

disponibilidade, mas principalmente pela confiança, amizade, dedicação e exemplo
de caráter e profissionalismo.

A todos os professores do Departamento de Engenharia de Alimentos, em

especial à Prof. Helen Treichel, Prof. Alice Valduga, Prof. Marco Di Luccio, Prof.
Fernanda Corazza e Prof. Marcos Corazza, pelo apoio e ensinamentos durante o
curso e pela amizade e companheirismo demonstrados.

À Professora Tatiana Emanuelli, e à aluna de iniciação científica Lídia Einsfeld,

do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de
Santa Maria, pela ótima recepção e pelos valorosos ensinamentos.

Aos alunos de graduação Renata Ril, Roberto Verlindo, Alencar Grolli, Carla
Francischetto, Rafael Barriquelo e Larissa Vanzo, meu agradecimento por todas as
horas de dedicação que possibilitaram o sucesso dos experimentos.

Aos pesquisadores Gerson Scheuermann, Anildo Cunha, Paulo Rosa e demais

pessoas envolvidas na criação das aves na Embrapa Unidade Aves e Suínos de
Concórdia-SC, que possibilitaram a realização dos experimentos. Agradeço pela
excelente recepção e disponibilidade na parceria.

Aos meus colegas do Mestrado, principalmente os da “turma especial”,

Marilúcia, Gabriela, Luiz Paulo, Joncimar, Iloir, Elisandra e Jarbas, obrigada pela
amizade e auxílio. Sentirei saudades de todas as conversas jogadas fora, das
descobertas e dos planos que fizemos, dos tantos risos e momentos que
compartilhamos. Saudades até dos momentos de lágrimas, de angústia, enfim, do
companheirismo vivido.

A todos os funcionários do Departamento de Engenharia de Alimentos, em

especial à Central de Materiais, por estarem sempre dispostos a ajudar. Igualmente
ao Departamento de Farmácia, pelos constantes empréstimos.

À direção do Hospital São Sebastião de Espumoso-RS, que possibilitou a

concretização deste objetivo, aceitando com paciência a negociação de meus
horários, folgas e plantões durante estes 27 meses de curso.
 E finalmente, agradeço a Deus, por ter-me dado forças para enfrentar os
obstáculos dia após dia, e por ter iluminado a minha mente e enchido meu coração
de esperança nas horas mais difíceis.
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Engenharia de
Alimentos como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de
Mestre em Engenharia de Alimentos.

ESTUDO DA ATIVIDADE DA ENZIMA GLUTATIONA PEROXIDASE EM

CARNE DE FRANGO

Renata Bezerra Rotta

Maio/2007

Orientador: Alexandre José Cichoski

A selenoenzima glutationa peroxidase (GSH-Px) faz parte do sistema antioxidante

celular, exercendo um papel essencial na proteção dos tecidos através da
eliminação de hidroperóxidos e outras espécies reativas formadas normalmente
durante o metabolismo. Na carne, a oxidação lipídica é responsável pela diminuição
de sua qualidade, desta forma, a inclusão de antioxidantes na dieta de animais
representa um método efetivo para aumentar a estabilidade oxidativa do músculo.
Este estudo teve como objetivo avaliar a influência da suplementação de diferentes
fontes e níveis de selênio na alimentação de frangos de corte sobre a atividade da
enzima glutationa peroxidase na carne de sobrecoxa fresca, submetida ao
processamento térmico e ao congelamento, e sobre o nível de oxidação lipídica
destas amostras, através da determinação dos valores de TBARS. As aves foram
divididas em cinco tratamentos, conforme o tipo de suplementação dietética: sem
suplementação de selênio (T1), selênio inorgânico a 0,15 mg/kg (T2), selênio
inorgânico a 0,35 mg/kg (T3), selênio orgânico a 0,15 mg/kg (T4) e selênio orgânico
a 0,35 mg/kg (T5). Entre as amostras de carne crua de sobrecoxa de frango, foi
possível concluir que as atividades obtidas não foram significativamente diferentes
entre os cinco diferentes tratamentos. Com o congelamento destas amostras,
verificou-se que as atividades de todos os tratamentos diminuíram chegando a
valores estatisticamente iguais entre si. O cozimento da carne de sobrecoxa de
frango proporcionou uma diminuição significativa na atividade da enzima glutationa
nos tratamentos T2, T4 E T5. Com o efeito do congelamento sobre a carne cozida,
somente o tratamento T1 teve sua atividade significativamente reduzida. Quanto aos
níveis de oxidação lipídica das amostras, pode-se verificar na carne crua que o
maior valor de TBARS foi encontrado no tratamento T5, seguido dos tratamentos T1,
T3 e T4 (que não diferiram entre si) e por último, o tratamento T2, que apresentou o
menor valor. Com o cozimento, obtiveram-se valores de TBARS significativamente
maiores para todos os tratamentos; o mesmo foi observado após o congelamento da
carne cozida. Também foram testadas novas condições de análise com o objetivo de
otimizar as determinações de GSH-Px; pode-se concluir que concentrações de
peróxido de hidrogênio superiores a 0,72 mM ocasionaram inibição da enzima
glutationa peroxidase; a temperatura de reação que proporcionou maiores valores
de atividade foi a de 22ºC; a utilização do substrato terc-butil hidroperóxido em lugar
do peróxido de hidrogênio ocasionou uma diminuição das taxas de reação e o uso
do mercaptoetanol na etapa de extração enzimática não ocasionou a obtenção de
melhores resultados.

Palavras-chave: glutationa peroxidase, carne de frango, influência da temperatura,

estabilidade oxidativa
Abstract of Dissertation presented to Food Engineering Program as a partial
fulfillment of the requirements for the Degree of Master in Food Engineering

STUDY OF GLUTATHIONE PEROXIDASE ACTIVITY IN CHICKEN

MEAT

Renata Bezerra Rotta

May/2007

Advisor: Alexandre José Cichoski

Glutathione peroxidase (GSH-Px) is a selenium-dependent enzyme that plays an

essential role in the cellular protection against the action of hydroperoxides and other
reactive species formed normally during the metabolism. In meat, the lipid oxidation
is responsible for the reduction of the quality, thus the inclusion of antioxidants in the
animal’s diet represents an effective method to increase the oxidative stability of the
muscle. The purpose of the present study was to evaluate the influence of different
sources and levels of selenium added on chicken’s diet on the glutathione
peroxidase activity in the fresh, cooked and storaged meat; also on the levels of lipid
peroxidation of these samples. The chickens were divides in five treatments, as the
type of diet: without supplementation of selenium (T1), inorganic selenium 0,15
mg/kg (T2), inorganic selenium 0,35 mg/kg (T3), organic selenium 0,15 mg/kg (T4)
and organic selenium 0,35 mg/kg (T5). Between the fresh samples, the activities of
GSH-Px weren’t significantly different in the five treatments. After freezing, all the
treatments presented reduction of activity, with values equal between itself. The
cooking of chicken meat caused a reduction in the GSH-Px’s activity in treatments
T2, T4 and T5. With the freezing of the cooked meat, only T1 had your activity
significantly reduced. In relation of the levels of lipid oxidation, the higher value of
TBARS in the fresh meat it was found in T5. With the cooking, all the treatments
presented increase in TBARS values; the same was observed after freezing of
cooked meat. Also it was tested new reaction conditions with the purpose of optimize
the enzyme determinations. It follows that hydrogen peroxide in concentrations above
0,72 mM produced inhibition of glutathione peroxidase; the reaction temperature of
22ºC provided higher values of activity; the substrate tert-butyl hydroperoxide
provided a reduction of the reaction rates and the use of mercaptoethanol in the
buffer didn’t promote the best extraction of enzyme.

Key-words: glutathione peroxidase, chicken meat, influence of temperature, oxidative

stability
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................1

2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................4
2.1 PROCESSOS OXIDATIVOS NA CARNE...............................................................................4

2.1.1. Oxidação de Proteínas...........................................................................................................5

2.1.2. Oxidação de Lipídios..............................................................................................................6

2.1.2.1. Etapas da Peroxidação Lipídica...............................................................................7

2.1.2.1.1. Iniciação ou Indução ..............................................................................................8

2.1.2.1.2. Propagação ............................................................................................................9

2.1.2.1.3. Terminação ..........................................................................................................10

2.1.2.2. Fatores que afetam a Oxidação Lipídica......................................................................10

2.1.2.2.1. Espécie Animal.....................................................................................................10

2.1.2.2.2. Tipo de Músculo ...................................................................................................10

2.1.2.2.3. Manipulação e Cozimento....................................................................................10

2.1.2.3. Controle da Oxidação Lipídica através da Suplementação de Antioxidantes .............11

2.1.2.4. Influência da Oxidação Lipídica sobre a Qualidade da Carne .....................................11

2.1.2.4.1. Flavor....................................................................................................................12

2.1.2.4.2. Textura .................................................................................................................13

2.1.2.4.3. Cor........................................................................................................................14

2.2 CONGELAMENTO DA CARNE ............................................................................................14

2.3 USO DO MINERAL SELÊNIO NA DIETA ANIMAL ..............................................................16

2.4 ENZIMA GLUTATIONA PEROXIDASE ................................................................................18

2.4.1. Denominação, Correlação com Selênio e Localização .......................................................18

2.4.2. Presença no Tecido Muscular..............................................................................................21

2.4.3. Princípio de Análise da Atividade.........................................................................................21

2.4.4. Interações entre Enzima e Substratos .................................................................................22

2.4.5. Inibidores da Reação ...........................................................................................................24

 2.4.6. Extração Enzimática.............................................................................................................25

2.4.7. Efeito do pH sobre a Atividade Enzimática ..........................................................................26

2.4.8. Efeito da Temperatura sobre a Atividade Enzimática..........................................................26

2.4.9. Efeito dos Eletrólitos sobre a Enzima ..................................................................................27

3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................28
3.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................................................................28

3.1.1. Criação das Aves .................................................................................................................28

3.1.2. Composição das Dietas .......................................................................................................30

3.1.3. Abate das Aves ....................................................................................................................32

3.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA GLUTATIONA PEROXIDASE..................33

3.2.1. Amostras e Condições de Análise .......................................................................................34

3.2.2. Obtenção do Extrato Enzimático..........................................................................................34

3.2.3. Método de Determinação da Atividade ................................................................................35

3.2.4. Expressão dos Resultados...................................................................................................36

3.3 DETERMINAÇÃO DO GRAU DE OXIDAÇÃO LIPÍDICA .....................................................37

3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................................38

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................................................39

4.1 PRIMEIRA ETAPA ................................................................................................................39

4.1.1. Influência das Fontes e Níveis de Selênio sobre a Atividade da Enzima Glutationa
Peroxidase......................................................................................................................................39

4.1.2. Estabilidade da Enzima Glutationa Peroxidase frente ao Armazenamento a Baixa

Temperatura ...................................................................................................................................43

4.1.3. Estabilidade da Enzima Glutationa Peroxidase frente ao Cozimento .................................45

4.1.4. Nível de Oxidação Lipídica em função do Cozimento e Armazenamento a Baixa

Temperatura ...................................................................................................................................48

4.2 SEGUNDA ETAPA................................................................................................................53

4.2.1. Efeito da Concentração de Peróxido de Hidrogênio sobre a Atividade da Enzima

Glutationa Peroxidase ....................................................................................................................53
 4.2.2. Efeito da Temperatura e do Tempo de Incubação do Meio de Reação sobre a Atividade da
Enzima Glutationa Peroxidase .......................................................................................................55

4.2.3. Variação de Substratos: Peróxido de Hidrogênio X Terc-butil Hidroperóxido .....................57

4.2.4. Efeito do Tampão empregado na Extração Enzimática.......................................................58

5 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES.............................................................60
5.1 CONCLUSÕES ......................................................................................................................60

5.2 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.....................................................................61

6 REFERÊNCIAS ..................................................................................................62

APÊNDICE A – DADOS SOBRE O DESEMPENHO DOS FRANGOS DE CORTE

ALIMENTADOS COM DIFERENTES FONTES E NÍVEIS DE SELÊNIO .................77
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Molécula da mioglobina................................................................................6

Figura 2. Estrutura do aminoácido cisteína ...............................................................25

Figura 3. Visão geral do Aviário Experimental...........................................................29

Figura 4. Box número 19 no Aviário Experimental ....................................................29

Figura 5. Lavagem das carcaças das aves e separação das partes no Abatedouro
Experimental .............................................................................................................33

Figura 6. Interconversão de glutationa nas suas formas reduzida e oxidada pela

ação das enzimas glutationa peroxidase (GSH-Px) e glutationa redutase (GR) .......33

Figura 7. Reação entre TBA e MDA com a formação do produto pigmentado que
absorve a 531 nm. Fonte: Fernández et al. (1997) ...................................................38

Figura 8. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o
abate e na carne armazenada durante 90 dias a −18ºC nos cinco tratamentos
empregados na criação das aves..............................................................................43

Figura 9. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o
abate, logo após o cozimento a 66ºC e na carne cozida armazenada durante 90 dias
a −18ºC nos cinco tratamentos empregados na criação das aves ............................46
Figura 10. Valores de TBARS (mg de malonaldeído/ kg de tecido) encontrados na
carne crua três horas após o abate, recém cozida a 66ºC e armazenada durante 90
dias a −18ºC nos cinco tratamentos empregados na criação das aves ....................50

Figura 11. Variação da taxa de reação (Abs.min-1) da enzima glutationa peroxidase

observada com as diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio..................54

Figura 12. Valores de absorbância do NADPH em 340 nm no decorrer do tempo de

reação verificados nos diferentes modos de pré-incubação do meio de reação .......56

Figura 13. Valores de absorbância do NADPH em 340 nm no decorrer do tempo de

reação verificados com os substratos: terc-butil hidroperóxido 15 mM e peróxido de
hidrogênio 0,72 mM...................................................................................................58

Figura 14. Valores de absorbância do NADPH em 340 nm no decorrer do tempo de

reação verificados com três tipos de tampão de extração: solução tampão 1 (fosfato
de potássio 50 mM pH 7,0 + EDTA 1 mM + mercaptoetanol 1 mM), solução tampão
2 (tris-HCl 50 mM pH 7,6 + EDTA 1 mM + mercaptoetanol 5 mM) e solução tampão 3
(tris HCl 50 mM pH 7,6).............................................................................................59
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Substratos e seus respectivos Km em relação à enzima glutationa

peroxidase. Fonte: Brenda (2007).............................................................................24

Tabela 2. Distribuição das aves no Aviário Experimental..........................................28

Tabela 3. Suplementação de selênio empregada nos tratamentos na criação das

aves...........................................................................................................................30

Tabela 4. Composição percentual das dietas nas três fases de desenvolvimento das
aves...........................................................................................................................31

Tabela 5. Percentagem de selênio inorgânico e orgânico utilizado nas dietas das

aves...........................................................................................................................32

Tabela 6. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o
abate e na carne armazenada durante 90 dias a −18ºC nos cinco tratamentos
empregados na criação das aves..............................................................................40

Tabela 7. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o
abate, logo após o cozimento a 66ºC e na carne cozida armazenada durante 90 dias
a −18ºC nos cinco tratamentos empregados na criação das aves ............................45

Tabela 8. Valores de TBARS (mg de malonaldeído/ kg de tecido) encontrados na

carne crua três horas após o abate, recém cozida a 66ºC e armazenada durante 90
dias a −18ºC nos cinco tratamentos empregados na criação das aves ....................48
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGPI ácidos graxos poliinsaturados

GR glutationa redutase

GSH glutationa, forma reduzida

GSH-Px glutationa peroxidase

GSSG glutationa, forma oxidada

MDA malonaldeído

NADP+ nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma oxidada

NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma reduzida

NRC National Research Council

TBA ácido 2-tiobarbitúrico

Tris-HCl trizma cloridrato

1 INTRODUÇÃO

O elemento químico selênio foi descoberto em 1817, pelo químico sueco

Jons Jakob Berzelius, sendo considerado inicialmente cancerígeno e altamente
tóxico para a saúde humana (Cozzolino, 2005). Somente em 1957, Schwarz e
Foltz observaram sua essencialidade metabólica em animais, sendo que até agora
cerca de 30 selenoproteínas foram identificadas em tecidos de mamíferos, embora
a função precisa da maioria delas ainda não seja conhecida (Arthur e Beckett,
1994). Como integrante destas selenoproteínas, o selênio participa de importantes
funções fisiológicas e processos bioquímicos, incluindo a defesa antioxidante, o
metabolismo dos hormônios tireoideanos e a integridade funcional dos
espermatozóides (Brown e Arthur, 2001).
A selenoenzima mais conhecida, glutationa peroxidase ou GSH-Px (Rotruck
et al., 1973), faz parte do sistema antioxidante presente em todas as células que
utilizam o metabolismo oxidativo, exercendo um papel essencial na proteção
destas através da eliminação de hidroperóxidos e outras espécies reativas
formadas normalmente durante o metabolismo (Behne e Kyriakopoulos, 2001).
Em aves, as principais conseqüências da ingesta insuficiente de selênio
incluem miodistrofia nutricional, diátese exudativa e desordens hepáticas e
pancreáticas, sendo também verificada diminuição da performance do animal,
atraso no desenvolvimento do sistema imune dos frangos jovens e diminuição na
produção de ovos (Leng et al., 2003).
Paralelamente, sabe-se que na carne, a oxidação dos ácidos graxos
insaturados dos fosfolipídios das membranas musculares é responsável pela
diminuição de sua qualidade, afetando negativamente atributos como cor, textura,
aroma e sabor. Assim, a inclusão de antioxidantes na dieta de animais destinados
à produção de carne é um método efetivo para aumentar a estabilidade oxidativa
do músculo. Alguns compostos administrados não são propriamente antioxidantes,
e sim nutrientes essenciais para o funcionamento de sistemas antioxidantes
endógenos, como é o caso do selênio (Carreras, 2004a).

1
 Apesar das vantagens do uso de selênio como agente antioxidante in vivo, o
conhecimento de seu nível de eficiência em relação ao retardamento da oxidação
que ocorre na carne submetida a tratamento térmico é restrito. Sabe-se que a
aceleração da oxidação lipídica na carne provocada pela ação da temperatura
deve-se em parte pela inativação das enzimas antioxidantes, dentre elas,
glutationa peroxidase (Mei et al., 1994).
Em 1967, Paglia e Valentine desenvolveram um método de análise no qual a
atividade da enzima glutationa peroxidase era medida através de um
procedimento espectrofotométrico indireto, cujo princípio é utilizado até os dias
atuais. Assim, a atividade desta enzima tem sido determinada em diversos tipos
de amostra, tais como carnes bovina (Mei et al, 1994; Lee et al., 1996; O’Grady et
al., 2001), suína (Mei et al, 1994; Mahan e Parrett, 1996; Hernández et al., 2002) e
de frango (Arai et al., 1994; Moreira et al., 2001; Surai e Dvorska, 2002; Carreras
et al., 2004, Hoac et al., 2006); também em leite bovino (Chen et al., 2000;
Lindmark-Mansson et al., 2001) e plasma sanguíneo (Bügel et al., 2004).
Apesar dos diversos experimentos e publicações referentes à determinação
da atividade da enzima glutationa peroxidase, falta ainda uma elucidação maior
sobre a técnica e os mecanismos de reação propriamente ditos, pelo fato de este
ser um método de análise complexo e dependente de muitos fatores. Existem
também muitas divergências entre diferentes autores em relação à metodologia
utilizada nas análises e aos valores encontrados para o mesmo tipo de amostra.
Além disso, são vários os fatores que influenciam a atividade da enzima glutationa
peroxidase na carne, que vão desde o tipo de suplementação de selênio na dieta
animal até condições de processamento do tecido muscular após o abate, como
cozimento e armazenamento em baixas temperaturas.
Com base nestas informações, elaborou-se este trabalho de pesquisa cuja
finalidade principal foi avaliar a influência da suplementação de diferentes fontes e
níveis de selênio na alimentação de frangos de corte sobre a atividade da enzima
glutationa peroxidase na carne de sobrecoxa submetida ao processamento
térmico e ao congelamento, e também sobre o nível de oxidação lipídica destas
amostras. Em uma segunda etapa, foram variadas algumas condições de pré-

2
análise e da reação catalisada pela glutationa peroxidase, com o objetivo de
otimizar as determinações da atividade desta enzima.

3
2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Processos Oxidativos na Carne

Na estrutura dos átomos e das moléculas, os elétrons associam-se

normalmente em pares. Define-se radicais livres ou espécies reativas como
espécies independentes que contêm um ou mais elétrons não pareados. Essa
característica confere ao átomo ou molécula grande instabilidade e reatividade,
pela tendência em acoplar o elétron não pareado com um outro que esteja
presente em estruturas próximas à sua. O oxigênio é o principal fornecedor de
radicais livres (Leite e Sarni, 2003).
Os lipídios, proteínas e ácidos nucléicos constituem os principais substratos
para atuação das espécies reativas (Carreras, 2004a). A peroxidação lipídica é a
conseqüência mais estudada do estresse oxidativo, sendo que a formação do
radical peroxil danifica diretamente as membranas celulares, ocasionando
alterações em sua fluidez, permeabilidade e função metabólica (Leite e Sarni,
2003).
A carne é bastante susceptível às reações de oxidação lipídica,
especialmente quando exposta a condições como trituração, onde oxigênio é
incorporado ao músculo, e cozimento, onde ferro é liberado das heme-proteínas. A
combinação de catalisadores da oxidação lipídica, sistemas de membranas
altamente insaturadas e períodos de alta oxigenação propiciam as reações
oxidativas no músculo esquelético, que inicialmente ocorrem ao nível de
membrana (Chan e Decker, 1994).
Para prevenir ou retardar as reações oxidativas, o tecido muscular conta com
diversos sistemas antioxidantes endógenos, entre eles enzimas como glutationa
peroxidase (GSH-Px), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Estes
sistemas antioxidantes previnem a formação de radicais livres a partir de
peróxidos preexistentes, e como estão naturalmente presentes no músculo
esquelético, são capazes de inibir a oxidação lipídica tanto em tecidos vivos como
na carne pós-abate (Chan e Decker, 1994).

4
 A concentração e atividade de muitos destes antioxidantes endógenos pode
ser influenciada pela dieta, e desta forma pode-se aumentar a estabilidade
oxidativa da carne sem que a adição de antioxidantes sintéticos seja necessária
(Maraschiello et al., 1999).

2.1.1. Oxidação de Proteínas

O termo “oxidação protéica” refere-se à modificação de uma proteína

induzida de forma direta por espécies reativas ou indiretamente através da reação
com produtos secundários do estresse oxidativo. Embora as proteínas também
sejam substratos para a ação dos radicais livres, seu efeito sobre elas é menos
intenso do que se verifica nos lipídios, devido ao fato das reações serem mais
lentas. Alguns dos agentes responsáveis pela oxidação protéica são o peróxido de
hidrogênio, metais de transição como ferro e cobre, luz ultravioleta, ozônio e
produtos da oxidação lipídica (Shacter, 2000).
Devido ao dano oxidativo, as proteínas podem sofrer modificações em
aminoácidos específicos, mudanças conformacionais, fragmentação da cadeia
peptídica ou alteração da carga elétrica. Estas alterações podem provocar
diversas conseqüências funcionais, tais como aumento da susceptibilidade à
proteólise e inativação enzimática (Shacter, 2000).
As principais conseqüências da oxidação protéica sobre a qualidade da carne
e produtos cárneos verificam-se sobre a coloração, sendo que esta se deve
fundamentalmente ao estado da proteína muscular mioglobina (Figura 1), principal
responsável pela cor vermelha do músculo e tendo como função o
armazenamento do oxigênio necessário ao metabolismo aeróbico. A mioglobina é
uma proteína conjugada constituída por uma parte protéica (globina) e um grupo
prostético de natureza não-peptídica (grupo heme).

5
 Figura 1. Molécula da mioglobina.

A molécula de mioglobina dá à carne fresca uma coloração vermelho

púrpura. Em contato com o ar, esta molécula se oxigena dando lugar a
oximioglobina, de cor vermelho brilhante. Quando a mioglobina se oxida, forma-se
a forma férrica (Fe+3), denominada metamioglobina, responsável pela coloração
marrom da carne (Chan et al., 1997)
A oxidação da oximioglobina e a oxidação lipídica ocorrem de maneira
simultânea, e cada um destes processos parece ser capaz de agravar o outro. Já
foi demonstrado que produtos secundários da oxidação lipídica promovem a
oxidação da oximioglobina, assim como heme-pigmentos, especialmente
metamioglobina, são catalisadores da peroxidação lipídica na carne cozida (Chan
et al., 1997).

2.1.2. Oxidação de Lipídios

Uma das mais importantes causas da deterioração de produtos cárneos é a

oxidação lipídica, a qual afeta ácidos graxos, principalmente os poliinsaturados
(Fernández et al., 1997). Este processo de degradação auto-oxidativa gera
produtos que alteram a qualidade e as características organolépticas da carne,
diminuindo a aceitação do produto por parte do consumidor. Além disso, existe a
possibilidade de um efeito tóxico causado pela ingestão contínua e prolongada
dos produtos rancificados (Bobbio e Bobbio, 2001). O processo de oxidação se

6
inicia na ligação carbono-hidrogênio adjacente à dupla ligação da cadeia de
carbono, podendo ser catalisado por um grande número de fatores, especialmente
fatores ambientais (umidade, calor, luz, oxigênio), presença de certos metais,
enzimas e pigmentos (Racanicci, 2004).
A carne de frango se caracteriza por possuir uma concentração relativamente
elevada de ácidos graxos insaturados, que a torna mais susceptível à rancidez
oxidativa em comparação a outros tipos de carne, sendo superada somente pela
carne de peixe (Byrne et al., 2002), principalmente durante os processos de
armazenamento e cozimento (Carreras, 2004a). A rancidez oxidativa normalmente
não ocorre com ácidos graxos saturados, porque neste caso a formação de um
radical livre é energeticamente desfavorável; já a presença de duplas ligações na
cadeia carbônica do ácido graxo baixa a energia necessária para a ruptura
homolítica das ligações carbono-hidrogênio (Bobbio e Bobbio, 2001).
O grau de oxidação lipídica da carne e de produtos cárneos é determinado
habitualmente por métodos químicos, sendo o teste do ácido tiobarbitúrico (TBA) o
mais utilizado e considerado um bom indicador da rancidez. A formação do
malonaldeído (MDA) ocorre através da decomposição de hidroperóxidos, produtos
primários da oxidação lipídica. Alguns dos fatores que determinam a extensão na
formação deste aldeído através de ácidos graxos poliinsaturados são: o grau de
insaturação (Dahle et al., 1962), a presença de metais, o pH, a temperatura e a
duração e condições do aquecimento (Fernández et al., 1997). Existem, além do
MDA, outras substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico, sendo estas
chamadas genericamente de TBARS (Carreras, 2004a).

2.1.2.1. Etapas da Peroxidação Lipídica

A modificação dos ácidos graxos é principalmente realizada através de um
mecanismo de autocatálise envolvendo radicais livres, denominado auto-oxidação
(Fernández et al., 1997). Esta reação em cadeia ocorre em três etapas, com
características organolépticas distintas. Na primeira fase, formam-se os primeiros
radicais livres, e ainda não se percebe cheiro ou sabor de ranço; na segunda fase,
há um aumento na quantidade de peróxidos e seus produtos de decomposição, e

7
o cheiro e sabor que tendem a aumentar rapidamente; a última fase caracteriza-se
por cheiro e sabor fortes, alterações da cor e da viscosidade dos lipídios e também
por sua decomposição (Bobbio e Bobbio, 2001).

2.1.2.1.1. Iniciação ou Indução

Para a formação dos primeiros peróxidos é necessária a participação de um
radical suficientemente reativo, capaz de subtrair um átomo de hidrogênio de um
grupo metileno do ácido graxo (Morrissey et al., 1998). Dentre os radicais
iniciadores, podemos citar:

Oxigênio Singleto (1O2) - o oxigênio atmosférico (3O2), no estado tripleto,

necessita ser ativado para que possa reagir, no estado singleto, com moléculas
orgânicas, como os ácidos graxos insaturados (Bobbio e Bobbio, 2001).

Radical Superóxido (O2−) - a redução, por adição de um elétron, do oxigênio

molecular, gera o radical superóxido. No tecido muscular este radical pode ser
gerado pelos sistemas de transferência de elétrons de membrana, através da
auto-oxidação da oximioglobina a metamioglobina, pela ativação de leucócitos ou
ainda através da oxidação de compostos redutores, como o ácido ascórbico
(Carreras, 2004a). Este radical não tem um potencial redox suficiente para iniciar a
oxidação lipídica, mas pode ser transformado em outras espécies oxidantes mais
potentes, tais como peróxido de hidrogênio (H2O2), radical peridroxila (HOO−) e
peroxinitrito (Spiteller apud Carreras, 2004a).

Peróxido de Hidrogênio (H2O2) – a redução de um elétron do radical superóxido

gera o peróxido de hidrogênio, que apesar de não reagir diretamente com ácidos
graxos, possui a capacidade de atravessar membranas biológicas, além de
originar radicais livres muito reativos (Halliwell e Gutteridge, 1984).

8
Radical Hidroxila (HO•) – a maior parte é produzida pela cisão do peróxido de
hidrogênio catalisada por metais, denominada reação de Fenton. O radical
hidroxila também pode ser gerado a partir da reação entre o peróxido de
hidrogênio e o radical superóxido, conhecida como reação de Haber-Weiss ou
pela reação entre metais e peróxidos orgânicos, lipídicos ou protéicos. Este radical
é altamente reativo, capaz de iniciar a oxidação de lipídios e outras moléculas
biológicas (Carreras, 2004a). A Equação 1 mostra o primeiro passo da reação de
oxidação lipídica de um ácido graxo insaturado (RH), iniciada pelo radical
hidroxila, dando origem a um radical lipídico (R•).

RH + HO• → R• + H2O (1)

Heme-Proteínas – além de serem eficientes catalisadores da reação de Fenton e

da reação de Haber-Weiss, a mioglobina e a hemoglobina podem ser ativadas por
H2O2, gerando um radical oxoferril intermediário de vida curta, capaz de iniciar a
peroxidação (Chan et al., 1997).

2.1.2.1.2. Propagação
O radical lipídico (R•) formado durante a etapa de iniciação reage
rapidamente com o oxigênio molecular gerando um radical peroxila (ROO•), como
mostra a Equação 2.

R• + O2 → ROO• (2)

Este radical pode oxidar outros ácidos graxos, dando lugar a hidroperóxidos
(ROOH) (Equação 3) e propagando assim a reação em cadeia, que se processa
rapidamente, pois menos energia é requerida (Morrissey et al., 1998).

ROO• + RH → ROOH + R• (3)

9
2.1.2.1.3. Terminação
A terminação da reação em cadeia da peroxidação se dá normalmente pela
combinação de radicais peroxila, dando lugar a produtos não-radicalares
(Carreras, 2004a).

2.1.2.2. Fatores que afetam a Oxidação Lipídica

2.1.2.2.1. Espécie Animal - o potencial oxidativo lipídico de amostras de carne

crua é muito influenciado pelo conteúdo de pigmentos heme; assim, a carne crua
bovina tem maior tendência a sofrer oxidação do que a de frango, por exemplo.
Mas na carne cozida, esta situação se inverte, e a carne de frango passa a ocupar
o primeiro lugar quanto à susceptibilidade à oxidação. Isto se explica, em parte,
pelo maior conteúdo de ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) destas carnes.
Durante o cozimento é produzida a desnaturação das hemeproteínas que
participam como catalisadores da oxidação, e por sua vez ocorre a liberação dos
AGPI dos fosfolipídios de membrana, que são os principais substratos de oxidação
(Gray et al., 1996). Por outro lado, também tem sido descritas diferenças na
atividade do sistema endógeno de enzimas antioxidantes em função da espécie
animal (Mei et al., 1994; Lee et al., 1996b).

2.1.2.2.2. Tipo de Músculo - dentro de uma mesma espécie animal, o conteúdo

lipídico, a atividade das enzimas antioxidantes os níveis de antioxidantes
endógenos não enzimáticos como a vitamina E, variam em função do tipo de
músculo (Devore et al., 1983; Lee et al., 1996a).

2.1.2.2.3. Manipulação e Cozimento - a manipulação física da carne produz

rupturas em sua estrutura muscular e expõe os lipídios a um ambiente pró-
oxidante, promovendo o contato entre os substratos da oxidação, favorecendo a
reação (Gray et al., 1996).
Já o cozimento provoca uma ruptura na estrutura do tecido muscular,
causando a desnaturação de proteínas com conseqüente perda na atividade
enzimática de algumas delas, além de liberar ferro que atua como catalisador da

10
oxidação. O tratamento térmico afeta a atividade das enzimas antioxidantes (Mei
et al., 1994; Lee et al., 1996b), oxigênio é liberado da oximioglobina, gerando
peróxido de hidrogênio e assim ocorre a ruptura de hidroperóxidos gerando
radicais livres que propagam a peroxidação (Kanner, 1994).

2.1.2.3. Controle da Oxidação Lipídica através da Suplementação de

Antioxidantes
O tecido muscular postmortem difere do tecido vivo porque não pode se auto-
reparar e por isso a estabilidade oxidativa do músculo esquelético dependerá da
composição, concentração e reatividade dos substratos de oxidação, de seus
catalisadores e dos antioxidantes (Carreras et al., 2004a).
O músculo vivo possui valores de pH na faixa de 6,9 a 7,3 (Enfalt et al. apud
Anadón, 2002), mas devido à glicólise postmortem e o conseqüente acúmulo de
ácido láctico, o pH diminui, afetando várias propriedades da carne, incluindo a cor,
capacidade de retenção de água e a solubilidade de proteínas (Anadón, 2002).
As enzimas glutationa peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) e superóxido
dismutase (SOD) são classificadas como antioxidantes preventivos, e constituem
um importante sistema de defesa enzimático contra o ataque de radicais livres a
membranas celulares e intracelulares (Rover et al., 2001).
A inclusão de antioxidantes na dieta de animais destinados à produção de
carne é um método efetivo para aumentar a estabilidade oxidativa do músculo.
Alguns compostos administrados não são propriamente antioxidantes, e sim
nutrientes essenciais para o funcionamento de sistemas antioxidantes endógenos.
Um exemplo são os minerais cobre, manganês, zinco e selênio, cofatores de
sistemas enzimáticos antioxidantes (Papas, 1999).

2.1.2.4. Influência da Oxidação Lipídica sobre a Qualidade da Carne

O processo de rancidez oxidativa inicia-se logo após o abate do animal,
intensificando-se até o ponto em que a carne torna-se inaceitável para consumo.
Durante o processo de conversão de músculo em carne ocorrem várias mudanças
bioquímicas que fazem parte do metabolismo postmortem, sendo assim

11
promovidas condições para que o processo oxidativo se instale (Gray et al., 1996;
Morrissey et al., 1998). Imediatamente após o abate ainda existe uma certa
atividade metabólica, mas devido à falta de circulação sanguínea, os produtos da
quebra do glicogênio se acumulam nos tecidos na forma de ácido lático, ocorrendo
uma diminuição gradual do pH a níveis levemente ácidos. Além disso, o sistema
de defesa antioxidante torna-se enfraquecido devido à deficiência de vitaminas, e
é pouco provável que este sistema normalmente disponível no animal vivo ainda
funcione (Racanicci, 2004).
O termo “qualidade da carne” diz respeito a um amplo conjunto de
características apresentadas por esta, incluindo desde suas propriedades físicas,
químicas, morfológicas, bioquímicas e microbiológicas até aspectos sensoriais
(flavor, textura e cor desejáveis), tecnológicos (processamento e armazenagem) e
nutricionais (composição lipídica e protéica adequada, ausência de compostos
alergênicos ou tóxicos) (Anádon, 2002; Carreras, 2004a). O aspecto, a textura, a
suculência, a maciez, o odor e o flavor são algumas das características
perceptíveis que mais influenciam a opinião dos consumidores a respeito da
qualidade da carne, influenciando na decisão de compra (Gray et al., 1996).

2.1.2.4.1. Flavor
O flavor é um dos atributos sensoriais mais destacados na carne, podendo
ser definido pelo conjunto complexo de propriedades olfativas e gustativas que se
percebem durante a degustação. O desenvolvimento do flavor na carne é
influenciado por fatores antemorten (espécie, sexo, idade, composição da dieta
animal) e por fatores postmorten (processamento, cozimento, armazenamento),
sendo estes últimos os mais destacados na maioria dos casos (Carreras, 2004a).
Apesar de que o principal fator limitante na vida de prateleira da carne fresca
seja a carga microbiana, a oxidação lipídica dos ácidos graxos insaturados dos
fosfolipídios das membranas musculares é uma das principais causas da
deterioração da qualidade da carne e no desenvolvimento de off-flavors, termo
utilizado para descrever sensações olfato-gustativas não características,
geralmente associadas à deterioração da carne (Gray et al., 1996).

12
 É durante o cozimento da carne que são gerados os compostos responsáveis
pelo seu flavor característico. São produzidos dessa forma compostos não voláteis
(peptídeos, aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares e nucleotídeos) e compostos
voláteis (alcanos, aldeídos, cetonas, álcoois, ésteres e ácidos), derivados
principalmente da reação de Maillard e da peroxidação lipídica, sendo que estes
últimos, gerados pela decomposição de hidroperóxidos, são os grandes
responsáveis pelo desenvolvimento de odor e flavor indesejáveis (Mottram, 1998).
O termo warmed over flavor (WOF) foi introduzido por Tims e Watts no ano
de 1958 para descrever o desenvolvimento de um flavor oxidado nas carnes
reaquecidas após cozimento e refrigeração, que se verifica mesmo em períodos
curtos. O desenvolvimento de WOF é atribuído principalmente à auto-oxidação
dos ácidos graxos poliinsaturados na carne. Vários estudos têm investigado sobre
o desenvolvimento de WOF, e estes levam em conta o método, a temperatura e o
tempo de cozimento (Byrne et al., 2002). O cozimento de carnes em temperaturas
de 70 a 80ºC leva a um rompimento das membranas musculares, facilitando a
interação dos catalisadores da oxidação lipídica com os ácidos graxos, resultando
na geração de radicais livres e na geração de WOF (Pearson apud Byrne et al.,
2002). Já em temperaturas iguais ou superiores a 100ºC, o desenvolvimento de
WOF parece ser inibido, provavelmente devido às propriedades antioxidantes de
substâncias produzidas pela reação de Maillard nestas temperaturas (Byrne et al.,
2002).

2.1.2.4.2. Textura
A textura é um fator importante na apreciação sensorial de um alimento,
sendo que a textura da carne é influenciada pela raça do animal, sexo, idade e
fatores de criação. As mudanças produzidas durante a conversão do músculo em
carne afetam também de forma importante esta característica (Anadón, 2002). Da
mesma forma, como resultado da reação entre lipídios oxidados e proteínas,
podem ser provocados intercruzamentos entre essas moléculas, causando uma
diminuição da solubilidade de proteínas ou também sua desnaturação, o que
afetaria negativamente a textura da carne (Kanner, 1994).

13
2.1.2.4.3. Cor
A coloração da carne fresca depende diretamente da concentração e estado
químico dos pigmentos heme, sendo que os principais encontrados na carne de
frango são a mioglobina, a hemoglobina e o citocromo C. A concentração de
mioglobina, pigmento que mais contribui para a definição da cor, é
significativamente mais baixa neste tipo de carne do que a encontrada em
músculos de outras espécies (Anadón, 2002).
A cor da carne é afetada por fatores como idade, sexo, raça, dieta, gordura
intramuscular, conteúdo de umidade e nível de estresse no momento do abate. As
diferenças básicas de cor entre músculos de um mesmo animal são resultado da
proporção relativa de fibras musculares brancas e vermelhas. Em relação às aves,
o peito é composto principalmente por fibras brancas com baixo conteúdo em
mioglobina, possuindo assim uma cor clara; já a sobrecoxa é composta
principalmente por fibras vermelhas e apresenta uma cor mais escura (Daun e
Akesson, 2004).
Espécies radicalares produzidas durante a oxidação lipídica podem promover
a oxidação dos pigmentos heme; diversos estudos mostram a eficácia de
diferentes antioxidantes na manutenção da estabilidade da cor da carne (Gray et
al., 1996).

2.2 Congelamento da Carne

O congelamento é considerado uma das melhores alternativas de
conservação a longo prazo para a maioria dos alimentos, retardando a
deterioração causada por microrganismos e mantendo características como
aparência, cor e aroma (Ben, 1999). Assim, o congelamento representa um
método de prolongamento da vida útil de carnes, pois à medida que a temperatura
é reduzida, as reações físicas, químicas e bioquímicas, responsáveis pelas
alterações sensoriais, passam a ocorrer em velocidades mais lentas (Paine e
Paine apud Vieira, 2007). Contudo, sabe-se que a deterioração do sabor devido à
oxidação das gorduras representa um fator limitante da qualidade da carne e de
produtos cárneos congelados (Pino, 2005).

14
 Os benefícios da técnica de congelamento devem-se à baixa temperatura
utilizada, e não à formação de gelo em si. Durante o congelamento de tecidos, a
água em solução é transferida a cristais de gelo de um grau de pureza bastante
alto, e assim quase todos os constituintes não aquosos são concentrados em uma
quantidade mínima de água não congelada. Este efeito é similar ao da
desidratação convencional, apesar de que no congelamento a temperatura é
inferior e a água separada é depositada localmente na forma de gelo. Devido ao
efeito de concentração por congelamento, a fase não congelada muda
significativamente suas propriedades, tais como pH, força iônica e viscosidade.
Estas mudanças freqüentemente favorecem o aumento das velocidades de
reação, por forçar as moléculas a unir-se e interagir umas com as outras. Em
conseqüência, o congelamento produz dois efeitos opostos: a diminuição da
temperatura, por si, reduz as velocidades de reação, enquanto que a
concentração por congelamento, muitas vezes propicia seu aumento (Fennema,
1993).
Enquanto que muitas enzimas sofrem desnaturação durante os processos de
congelamento e descongelamento, outras não são afetadas ou conservam
parcialmente sua atividade. Este comportamento depende principalmente do tipo
de enzima, do sistema em que ela se encontra e das condições de congelamento,
principalmente no que diz respeito à velocidade e oscilações de temperatura
(Fennema, 1993).
A formação dos cristais de gelo é a principal causa da degradação da
estrutura dos tecidos animais, devido ao rompimento das membranas e organelas
celulares através de perfurações, ocasionando alterações na estrutura e
localização das enzimas nestes tecidos (Mortensen et al., 2006). Quanto menor for
o tempo de duração da etapa de transição líquido – sólido, menores são os cristais
formados dentro do alimento que está sendo congelado, e assim, ao retornar a
temperatura ambiente, o tecido muscular se encontra próximo ao seu estado
original. No congelamento rápido, esta etapa de transição leva até 25 minutos; já
no congelamento lento, há remoção de água das células e grandes cristais de gelo
são formados, podendo ocorrer danos físicos aos tecidos celulares (Pino, 2005).

15
Dessa forma, o congelamento e descongelamento lentos determinam, por regra
geral, maiores perdas de atividade enzimática do que os processos rápidos.
Flutuações da temperatura de estocagem também favorecem o crescimento dos
cristais de gelo (Neves Filho apud Vieira, 2007).
A susceptibilidade de carnes congeladas à oxidação lipídica pode ser em
função da atividade de água (Aa), termo criado para denominar a água disponível
para crescimento microbiano e reações que possam deteriorar os alimentos
(Bobbio e Bobbio, 2001). Em baixos valores de atividade de água (em torno de
0,4), a água presente no alimento liga-se aos hidroperóxidos, interferindo em sua
decomposição e retardando o processo de oxidação. Nesta faixa ocorre também
hidratação dos íons metálicos, que são catalisadores desta reação, reduzindo sua
eficiência. À medida que são alcançados valores acima de 0,4, há um aumento
progressivo na velocidade de oxidação lipídica. Este comportamento pode ser
devido ao aumento da quantidade de oxigênio dissolvido, que catalisa a reação;
também há expansão das moléculas e exposição de seus sítios catalíticos.
Finalmente, em valores de atividade de água maiores (acima de 0,8), há um
retardamento na velocidade de oxidação, provavelmente devido à diluição dos
catalisadores da reação (Fennema, 1993).
Durante o congelamento a −18ºC, a atividade de água que correspondia a
aproximadamente 0,9 na carne fresca, é reduzida até 0,6, entrando na faixa de
valores que favorecem o aumento das reações de oxidação lipídica (Pino, 2005).

2.3 Uso do Mineral Selênio na Dieta Animal

Os minerais são necessários para a manutenção da vida, pois estão
envolvidos em uma série de processos metabólicos e fisiológicos fundamentais à
manutenção da saúde em humanos e animais. Os microminerais ou elementos-
traço, particularmente o selênio, têm impacto significativo na performance e
imunidade animal, induzindo mudanças fisiológicas no tecido muscular, o que
pode afetar positivamente a qualidade da carne de gado e frango (Hess et al.,
2003).

16
 O micronutriente selênio ocorre naturalmente em duas formas químicas,
inorgânica e orgânica. O selênio inorgânico pode ser encontrado, dependendo de
seu estado de oxidação, na forma de selenito, selenato ou seleneto; já a forma
orgânica é encontrada incorporada aos aminoácidos metionina e cisteína. Apesar
da forma inorgânica representar uma fonte economicamente mais acessível deste
nutriente, ela pode ser tóxica em médias a altas concentrações, além de interagir
e quelar outros minerais (Gowdy, 2004).
Em agosto de 2000, a forma de selênio orgânico selenometionina,
incorporada a leveduras (Sel-Plex®, Alltech Biotechnology Center, Nicholasville,
KY), foi aprovada pelo United States Food and Drug Administration como fonte de
suplementação de selênio para frangos de corte (Upton Jr., 2003) e desde então
esta forma tem sido uma boa alternativa de suplementação na dieta animal. Sel-
Plex® é uma fonte orgânica de selênio resultante do crescimento de células de
leveduras em um meio deficiente em enxofre. Desta forma, as células são
forçadas a incorporar o selênio em seus aminoácidos, tornando-se enriquecidas
com selenometionina, que é a mesma forma de selênio encontrada em grãos
(Kelly e Powers apud Gowdy, 2004).
Embora as duas formas de selênio, inorgânica e orgânica, possam ser
utilizadas como suplemento dietético, elas diferem bastante em suas propriedades
químicas, sendo absorvidas e metabolizadas de forma diferente. Durante a
absorção, a selenometionina é ativamente transportada através das membranas
intestinais e acumulada no fígado e músculo. Já o selênio inorgânico, sendo
absorvido como um mineral, é muito pouco retido nos tecidos, sendo a maior parte
excretada (Upton Jr., 2003).
A concentração de selênio utilizada na dieta de animais de criação influencia
diretamente o depósito deste elemento nos tecidos destes animais, bem como nos
produtos derivados, como leite e ovos. Os órgãos geralmente acumulam maiores
quantidades de selênio; o fígado da maioria das espécies contêm em média
quatro vezes mais selênio do que o músculo esquelético (Combs Jr., 2001). Em
frangos foi observado que a concentração de selênio decresce na seguinte ordem:
penas > fígado > rim > músculo > plasma (Upton Jr., 2003).

17
 Segundo Ali et al. (1997), a exigência de selênio para frangos de corte,
listada no NRC (1994), é de 0,15 mg/kg de ração, o que seria suficiente para
otimizar a atividade da enzima glutationa peroxidase até os 21 dias de idade;
porém, o efeito da suplementação de selênio em dietas de aves pode variar de
acordo com a fonte utilizada (Moreira et al., 2001). Assim, a utilização de selênio
na dieta de animais de criação, visando garantir níveis adequados deste elemento
tanto para o animal quanto para o consumidor, deve considerar além de sua
concentração, sua forma química.
Embora selenito ou selenato (formas inorgânicas) possam ser efetivos como
suplementos alimentares para prevenir a deficiência de selênio em bovinos, estas
formas têm pouco impacto no conteúdo de selênio na carne, leite e ovos. Níveis
maiores de selênio nos tecidos podem ser alcançados usando uma fonte de
selenometionina como suplemento alimentar (Combs Jr., 2001). Isto se dá devido
a diferenças no metabolismo do selênio nos animais. Selenito, selenato e mesmo
selenocisteína são utilizados na biossíntese de selenoproteínas biologicamente
ativas, como a enzima glutationa peroxidase; já a selenometionina é incorporada
às proteínas teciduais no lugar do aminoácido metionina, garantindo o estoque
muscular de selênio (Finley, 1999; Combs Jr, 2001; Whanger, 2003). Desta forma,
pode-se dizer que a atividade da enzima glutationa peroxidase é regulada
predominantemente pelos níveis de selenocisteína e/ou espécies inorgânicas de
selênio oriundas da dieta (Borawska et al., 2004).
De acordo com Van Saun (1990), as concentrações teciduais da enzima
glutationa peroxidase servem como um bom indicador dos níveis de selênio na
dieta de animais de criação. As dosagens de GSH-Px têm sido sugeridas para a
avaliação de selênio em bovinos, porém como esta enzima apresenta-se em
pequenas quantidades e com baixa estabilidade, o uso desta técnica é limitado.

2.4 Enzima Glutationa Peroxidase

2.4.1. Denominação, Correlação com Selênio e Localização

18
 De acordo com o Nomenclature Committee of the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), as peroxidases recebem
genericamente a nomenclatura EC 1.11.1. Estas fazem parte do grupo de enzimas
denominado oxi-redutases, as quais estão envolvidas em reações do tipo redox
onde átomos de hidrogênio, oxigênio ou elétrons são transferidos entre moléculas,
sendo que no caso das peroxidases essa transferência ocorre na presença de
peróxidos (London South Bank University, 2007). Esta reação pode ser descrita
pela Equação 4, sendo que X corresponde à molécula que sofre peroxidação:

Xreduzida + H2O2 → Xoxidada + H2O (4)

A enzima glutationa peroxidase ou GSH-Px foi descoberta por Mills em 1957,

em eritrócitos de mamíferos. Não se observa sua presença em plantas ou
bactérias, embora possa ser encontrada em algumas algas e fungos (Halliwell e
Gutteridge, 1985). É através da redução de hidroperóxidos que esta enzima
desempenha um importante papel na prevenção de danos oxidativos em tecidos
(Arai et al., 1994); duas classes distintas desta enzima são conhecidas, a GSH-Px
selênio-dependente (EC 1.11.1.9) e a GSH-Px selênio-independente (EC
2.5.1.18), cada uma possuindo maior especificidade por um determinado substrato
(Daun e Akesson, 2004).
A glutationa peroxidase selênio-dependente é capaz de reduzir peróxido de
hidrogênio (H2O2) e uma variedade de hidroperóxidos orgânicos. Essa forma
possui massa molecular de 81.000, é uma proteína tetramérica e possui um átomo
de selênio em cada subunidade, na forma de selenocisteína. O segundo tipo, a
enzima GSH-Px selênio-independente, tem massa molecular de 35.000, é
dimérica e está apta a reduzir qualquer hidroperóxido orgânico, exceto o H2O2
(Punchard et al., 1996), e em substituição à selenocisteína, possui um resíduo de
tirosina no sítio catalítico. Esta classe de enzimas selênio-independentes
correspondem às glutationa S-transferases (Arthur, 2000; Stagsted, 2006).
A atividade da GSH-Px selênio-dependente parece ter correlação positiva
com a ingestão dietética deste mineral (DeVore et al., 1983). Conseqüentemente,

19
níveis inadequados de selênio no organismo podem levar a uma redução na
atividade desta enzima, ocorrendo um decréscimo na habilidade de degradar
peróxido de hidrogênio. Altos níveis desta substância estão relacionados com a
auto-oxidação de membranas celulares, danos ao DNA e prejuízos à função
imune; pesquisas recentes demonstram uma elevação de 32% na peroxidação
lipídica nos eritrócitos de frangos deficientes de selênio (Holovská Jr. et al., 2003).
Foram identificadas quatro formas distintas da enzima GSH-Px selênio-
dependente, que atuam em diferentes compartimentos subcelulares: citosólica,
fosfolipídeo hidroperóxido, plasmática e gastrintestinal (Arthur e Beckett, 1994).
Nos mamíferos e aves, a maior parte da enzima GSH-Px é encontrada na forma
de glutationa peroxidase citosólica (cGSH-Px), a qual utiliza como substratos
peróxido de hidrogênio, peróxido de cumeno, terc-butil hidroperóxido e
hidroperóxidos de ácidos graxos. Já a glutationa peroxidase fosfolipídeo
hidroperóxido (phGSH-Px), intimamente associada às membranas celulares, exibe
atividade unicamente frente a hidroperóxidos de fosfolipídeos e colesterol (Ursini
et al. apud Arthur e Beckett, 1994). A glutationa peroxidase plasmática ou
extracelular (pGSH-Px), sintetizada e secretada pelas células hepáticas,
metaboliza facilmente peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos de ácidos graxos, e
com menos eficiência, hidroperóxidos de fosfolipídeos e colesterol. Por último, a
glutationa peroxidase gastrintestinal (giGSH-Px) age nos mesmos substratos da
cGSH-Px e pGSH-Px (Punchard et al., 1996).
Apesar das diferentes localizações e especificidade em relação aos
substratos, as formas de GSH-Px citosólica, fosfolipídio hidroperóxido e
gastrintestinal são comumente agrupadas e denominadas genericamente de
glutationa peroxidase celular, devido ao fato de apresentarem características
cinéticas semelhantes (Maddipati e Marnett, 1987; Lindmark-Mansson e Akesson,
2001b). Estudos recentes relatam que eritrócitos e tecidos animais contém a GSH-
Px celular, enquanto que leite e plasma sanguíneo contém a forma extracelular
(Chen et al., 2000; Stagsted, 2006), o que explica em parte a necessidade de
ajustes na técnica de determinação para os diferentes tipos de amostra.

20
2.4.2. Presença no Tecido Muscular

As fibras musculares podem ser classificadas em dois tipos metabólicos

diferentes: oxidativas (vermelhas) e glicolíticas (brancas), sendo essa classificação
baseada em sua composição química e atividade enzimática. Os músculos
oxidativos possuem maior número de mitocôndrias e um maior conteúdo de
mioglobina do que os glicolíticos, e usam principalmente ácidos graxos como
substratos, enquanto que os glicolíticos utilizam principalmente glicogênio como
fonte de energia (Daun e Akesson, 2004).
Estudos anteriores realizados com frango e peru (DeVore et al., 1983; Lee et
al., 1996) demonstraram uma maior atividade de GSH-Px no músculo oxidativo
(coxa) do que no glicolítico (peito). Como esta enzima está localizada nas
mitocôndrias e no citosol das células musculares, sua maior atividade nas fibras
vermelhas pode ser correlacionada com a função de impedir a oxidação nestas
células, as quais encontram-se principalmente sob metabolismo aeróbico (Chan e
Decker, 1994).

2.4.3. Princípio de Análise da Atividade

A enzima glutationa peroxidase (GSH-Px) catalisa in vitro, com alta

especificidade, a reação que ocorre in vivo, ou seja, a detoxificação do peróxido
de hidrogênio (H2O2) através da oxidação paralela do tripeptídeo reduzido
glutationa (GSH), formado pelos resíduos dos aminoácidos glicina, glutamato e
cisteína (Lehninger et al., 1995). A Equação 5 representa esta reação global.

2 GSH + H2O2 GSH-Px GSSG + 2 H2O (5)

A molécula de glutationa oxidada (GSSG), formada nesta reação, é

regenerada à sua forma reduzida (GSH) através da reação paralela com a
molécula de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH),
catalisada por uma segunda enzima, a glutationa redutase (Equação 6). Apesar
desta enzima não atuar diretamente na remoção de espécies radicalares, ela age

21
conjuntamente com a glutationa peroxidase, impedindo a paralisação do ciclo
metabólico da glutationa (Rover Jr., 2001).

GSSG + NADPH + H GS RED 2 GSH + NADP+ (6)

O método analítico descrito por Paglia e Valentine em 1967 para a

determinação da atividade da enzima glutationa peroxidase em eritrócitos baseia-
se neste ciclo redox. Através da medida do decaimento da absorbância do
NADPH a 340 nm em presença de H2O2, é possível determinar a atividade
enzimática, já que esta é proporcional ao consumo do NADPH. Desde então, este
método vem servindo de referência para a aplicação e adequação aos mais
diferentes tipos de amostras, por ter-se mostrado mais conveniente e confiável
(Chen et al., 2000).

2.4.4. Interações entre Enzima e Substratos

Enzimas são biocatalisadores, ou seja, são moléculas que aumentam a taxa

da reação química sem sofrer transformação permanente, apesar de haver uma
perda gradativa de sua atividade. Apresentam geralmente alta especificidade
como conseqüência de sua conformação tridimensional, que provoca a formação
de sítios ativos. Considerando a natureza complexa das enzimas é razoável que
muitos fatores influenciem a eficiência dessa atividade catalítica (London South
Bank University, 2007).
Para que a reação catalisada pela glutationa peroxidase ocorra, é necessária
a participação do substrato glutationa (GSH) em sua forma reduzida, e uma
atenção especial deve ser dada à estabilidade deste tripeptídeo, visto que ele
pode sofrer oxidação em função de impurezas presentes (como metais) e do valor
do pH da solução tampão. Estes fatores podem levar a erros durante a análise,
prejudicando a interpretação dos resultados (Rover Jr., 2001).
É necessária também a presença de alguma espécie de hidroperóxido, e
este pode ser inorgânico, como etil-hidroperóxido, terc-butil hidroperóxido e

22
peróxido de hidrogênio, que são reduzidos à água; os hidroperóxidos de origem
orgânica, como os derivados do colesterol, ácidos graxos e cumeno, são
reduzidos ao seu álcool correspondente (Chaudiere et al., 1984; Brenda, 2007).
Em concentrações de substrato muito baixas, a velocidade inicial de reação
(V0) é proporcional à concentração do substrato. Entretanto, à medida que a
concentração do substrato aumenta, a taxa inicial passa a crescer menos,
deixando de ser proporcional a essa concentração. Com o posterior aumento na
concentração do substrato, a taxa de reação torna-se essencialmente
independente de sua concentração, aproximando-se de uma taxa constante.
Nessa faixa pode-se dizer que a enzima está saturada com o substrato.
Todas as enzimas apresentam o efeito da saturação, porém variam em
relação à concentração requerida para produzi-lo. Esse efeito de saturação levou
alguns pesquisadores a estabelecerem a hipótese de que enzima e substrato
reagem reversivelmente para formar um complexo, passo essencial na catálise de
uma reação (Lehninger et al., 1995).
As reações catalisadas pela GSH-Px extracelular (encontrada no leite e
plasma sanguíneo) são cerca de dez vezes mais lentas do que aquelas
catalisadas pelo tipo celular (encontrada em eritrócitos e tecido muscular); além
disso, quando trata-se do tipo extracelular, a saturação pelos substratos ocorre
facilmente, por este motivo este sistema necessita de concentrações mais baixas
de glutationa reduzida (GSH) e peróxido (Chen et al., 2000). Já a GSH-Px celular
parece não ser saturada com GSH, porém altas concentrações desse substrato
também acabam bloqueando a reação enzimática, só que por outro caminho,
inibindo a enzima glutationa redutase (que atua em conjunto no ciclo redox),
diminuindo desta forma a taxa de reação (Chen et al., 2000).
Em 1913, L. Michaelis e L. Menten desenvolveram a teoria da ação e cinética
enzimática, e a partir disso, criou-se uma Equação (7) que permite demonstrar
como a velocidade de uma reação varia em função da concentração do substrato
(Lehninger et al., 1995):

23
 V0 = V max[S ] (7)
Km + [ S ]

Esta equação relaciona a velocidade inicial de reação (V0), a velocidade

máxima (Vmax) e a concentração inicial de substrato [S] com a constante de
Michaelis-Menten (Km). O Km de um substrato é a concentração do substrato na
qual a velocidade inicial de reação equivale à metade da velocidade máxima;
quanto menor seu valor, maior a afinidade da enzima pelo substrato. Para reações
que envolvem um substrato é expressa em moles por litro e é independente da
concentração da enzima. Na Tabela 1 encontram-se alguns substratos e seus
respectivos Km em relação à enzima glutationa peroxidase. Deve-se salientar que
os valores de Km não são fixos e podem variar com a estrutura do substrato, com
o pH e com a temperatura; para enzimas que atuam em mais de um substrato,
cada substrato possui um Km característico (Brenda, 2007).

Tabela 1. Substratos e seus respectivos Km em relação à enzima glutationa peroxidase. Fonte:

Brenda (2007)
Substrato Km (mM) Observações
Colesterol 7 beta- hidroperóxido 0,003
Peróxido de hidrogênio 0,003

Terc-butil hidroperóxido 0,059

Hidroperóxido de cumeno 0,144

GSH 2,1 pH 7,5, 25°C, reação com H2O2

GSH 2,6 pH 7,5, 25°C, reação com hidroperóxido de
cumeno
GSH 5,5 pH 7,5, 25°C, reação com terc-butil
hidroperóxido

2.4.5. Inibidores da Reação

Já foi constatado que ácidos mercapto-carboxílicos são inibidores potentes e

específicos da GSH-Px, formando com esta complexos reversíveis. Alguns

24
compostos análogos à GSH atuam como substratos fracamente redutores na
ausência desta molécula, e assim como muitos mercaptanos, competem com a
GSH no ciclo enzimático da GSH-Px (Chaudiere et al., 1984).
Dentre outros inibidores da reação catalisada pela enzima GSH-Px, pode-se
citar ânions polivalentes (fosfato, sulfato, maleato) e o próprio NADPH, que age
provavelmente devido à inibição da glutationa redutase durante a reação paralela
(Brenda, 2007).

2.4.6. Extração Enzimática

Diferentemente do que ocorre com a determinação da atividade da enzima

glutationa peroxidase no plasma, a determinação em tecidos animais requer uma
extração prévia, pois a enzima encontra-se nas mitocôndrias e no citosol das
células musculares (Chan e Decker, 1994). Além disso, outros fatores devem ser
levados em consideração nesta fase pré-análise, com o objetivo de preservar a
atividade enzimática, e entre eles pode-se citar o pH, a temperatura, a
concentração de eletrólitos e a diluição empregada (Fennema, 1993).
O centro ativo da enzima glutationa peroxidase contém o aminoácido
selenocisteína, um derivado da cisteína (Figura 2) por substituição do átomo de
enxofre por selênio. Este grupamento funcional, além de ser responsável pela
polaridade da molécula, facilita sua oxidação, através da formação de uma ligação
covalente entre dois átomos de selênio. Ligações deste tipo ocorrem facilmente,
ocasionando maior estabilidade na estrutura das proteínas, e conseqüentemente
ocasionando inibição no centro ativo da enzima, o que dificulta sua extração e
reatividade com os substratos (Lehninger et al., 1995).

Figura 2. Estrutura do aminoácido cisteína.

25
 “The Comprehensive Enzyme Information System” cita que o 2-
mercaptoetanol seria um agente estabilizador da enzima glutationa peroxidase
(Brenda, 2007). Esta capacidade de formação de complexos reversíveis com
compostos derivados do mercaptano torna-se bastante útil na etapa de pré-
ativação da GSH-Px (Chaudiere et al., 1984). O 2-mercaptoetanol corresponde a
um agente redutor de ação branda cuja utilização já foi descrita em outros
trabalhos (Arai et al., 1994) com a finalidade de prevenir a oxidação espontânea
durante a extração de uma proteína (Farfán, 1994).

2.4.7. Efeito do pH sobre a Atividade Enzimática

A maior parte das enzimas apresenta sua atividade máxima na faixa de pH

entre 4,5 e 8,0. Existe para cada enzima uma faixa em que a inativação é
reversível, provavelmente devido à ionização dos grupos funcionais do centro
ativo ou ainda de áreas que controlam a conformação da enzima. Mas em valores
extremos de pH, esta atividade pode decair irreversivelmente, devido à
desnaturação protéica (Fennema, 1993).
Para a glutationa peroxidase, o pH ótimo de ação é próximo de 8,0 (Paglia e
Valentine, 1967), mas esta enzima continua ativa com valores de até 9,0 (Brenda,
2007); sua atividade é mínima em pH abaixo de 6,0 (Mills, 1959). Assim, a maioria
dos procedimentos de análise da GSH-Px é conduzida na faixa de pH de 7,0 a 7,6
(Punchard et al., 1996).

2.4.8. Efeito da Temperatura sobre a Atividade Enzimática

A maior parte das enzimas apresenta sua máxima atividade na faixa de 30 a

40ºC, e em temperaturas acima de 45ºC, começam a sofrer desnaturação,
diminuindo gradativamente sua atividade (Fennema, 1993). A aceleração da
oxidação lipídica causada pela temperatura, que é percebida nas carnes cozidas,
pode ser devida em parte à inativação das enzimas antioxidantes pelo calor (Mei
et al., 1994). Segundo Lee et al. (1996), temperaturas internas a partir de 70ºC na
carne já promovem a inativação da enzima glutationa peroxidase, sendo que a
90ºC nenhuma atividade foi detectada. Paralelamente, sabe-se que muitas

26
enzimas sofrem desnaturação durante os processos de congelamento e
descongelamento (Fennema, 1993).

2.4.9. Efeito dos eletrólitos sobre a enzima

Concentrações elevadas de eletrólitos afetam em geral a solubilidade das

proteínas (Fennema, 1993). De acordo com Chen et al. (2000), soluções tampão
em baixas concentrações favorecem a atividade da GSH-Px. A maioria dos
procedimentos de análise desta enzima são conduzidos em tampão tris-HCl ou
fosfato, nas concentrações de 50 a 100 mM (Punchard et al., 1996).

27
3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Obtenção das Amostras

3.1.1. Criação das Aves

Durante os meses de abril e maio de 2006 foi conduzida a criação de frangos
de corte nas instalações da Embrapa, Unidade Suínos e Aves, em Concórdia-SC.
Foi adquirido um total de 1140 pintos de um dia, machos da linhagem Ross, já
vacinados contra a doença de Marek. As aves foram alojadas em 30 boxes (1,60
m X 1,75 m) cujas laterais eram teladas e o piso forrado com cama de maravalha.
As aves foram distribuídas nos boxes (38 aves cada) de acordo com o peso inicial
(bloco) e os tratamentos (Tabela 2).

Tabela 2. Distribuição das aves no Aviário Experimental

Box Bloco Tratamento

28
 O manejo geral das aves seguiu recomendação do Manual da linhagem,
sendo fornecidas 24 horas diárias de luz nos primeiros 21 dias e 16 horas no
período posterior. Água e ração foram fornecidos à vontade durante todo o
experimento. A disposição dos boxes dentro de cada bloco foi planejada visando
minimizar as diferenças quanto à iluminação natural, temperatura e ventilação. A
Figura 3 mostra o corredor principal de acesso aos boxes no Aviário Experimental,
enquanto a estrutura de um box é apresentada na Figura 4.

Figura 3. Visão geral do Aviário Experimental.

Figura 4. Box número 19 no Aviário Experimental.

29
 3.1.2. Composição das Dietas
Os tratamentos experimentais consistiram de cinco dietas apresentando
diferentes níveis e fontes de selênio, conforme especificado na Tabela 3. As dietas
experimentais foram elaboradas a partir de fórmulas básicas seguindo a
recomendação de exigência nutricional de Rostagno et al. (2005), considerando-se
três fases de desenvolvimento das aves: inicial (1 a 21 dias), crescimento (21 a 35
dias) e final (35 a 42 dias) (Tabela 4). Para propiciar a elaboração de dietas
experimentais com diferentes níveis de selênio nos tratamentos T2 a T5, o
ingrediente inerte caolin das fórmulas básicas foi substituído pelas fontes de selênio
inorgânico (selenito de sódio) ou orgânico (Sel-Plex), conforme consta na
Tabela 5.

Tabela 3. Suplementação de selênio empregada nos tratamentos na criação das aves

Tratamento Descrição
T1 sem suplementação de selênio na dieta (controle negativo)
T2 com suplementação de selênio inorgânico 0,15 mg/kg de ração
T3 com suplementação de selênio inorgânico 0,35 mg/kg de ração
T4 com suplementação de selênio orgânico 0,15 mg/kg de ração
T5 com suplementação de selênio orgânico 0,35 mg/kg de ração

30
Tabela 4. Composição percentual das dietas nas três fases de desenvolvimento das aves

Fases de desenvolvimento das aves

Ingrediente Inicial Crescimento Final
Milho (%) 54,815 59,459 59,011
Farelo de Soja (%) 36,323 32,460 32,342
Óleo (%) 4,985 4,195 5,063
Fosfato Bicálcico (%) 2,033 1,927 1,760
Calcário (%) 0,806 1,003 0,971
DL-Metionina (%) 0,222 0,219 0,172
Sal (%) 0,364 0,365 0,366
Cloreto Colina (60%) 0,217 0,217 0,200
1
PX vit – 300 (%) 0,030 0,030 0,030
2
Px mineral (%) 0,100 0,050 0,050
3
Coban 200 (%) 0,060 0,030 0
4
Surmax-100 (%) 0,010 0,010 0
Caolin (%)5 0,035 0,035 0,035
Total 100,00 100,00 100,00
Composição calculada
EM (kcal/kg) 3150 3150 3200
PB (%) 21,5 20,1 20,0
Ca (%) 0,85 0,85 0,80
P disp. (%) 0,46 0,43 0,40
Metionina (%) 0,55 0,53 0,48
Metionina + Cistina (%) 0,90 0,86 0,81
Lisina (%) 1,21 1,10 1,10
1
Composição por kg do produto: Vit.A,33.333.000 UI; Vit.D3,10.000.000 UI; Vit.E,133.330mg;
vit.K,10.000mg; Tiamina, 6.670mg; Riboflavina, 20.000mg; Piridoxina, 13.330mg; Vit.B12,
50.000mcg; Niacina, 166.670mg; Ác.Pantotênico, 40.000mg; Ác. Fólico, 3.330mg; Biotina,
500mg.
2
Composição por kg do produto: Fe, 100.000mg; Cu, 20.000mg; Mn, 160.000mg; Zn, 100.000mg;
Co, 2.000mg; I, 2.000mg.
3
Monensina sódica - na fase Inicial foi utilizado COBAN 200 (200 g de atividade/kg de produto); na
fase de crescimento utilizou-se COBAN 400 (400 g de atividade/kg produto).
4
Avilamicina, equivalente a 100g de atividade por kg do produto.
5
Produto inerte utilizado para possibilitar inclusão variada de fontes de selênio que substituíram o
caolin.

31
Tabela 5. Percentagem de selênio inorgânico e orgânico utilizado nas dietas das aves

Tratamentos
Ingredientes T1 T2 T3 T4 T5
1
Caolin (%) 0,035 0,020 0,000 0,020 0,000
2
PX-Se (%) 0 0,015 0,035 0 0
Sel-Plex® (%) 3 0 0 0 0,015 0,035

1
Ingrediente inerte.
2
Premix selênio, à base de selenito de sódio, contendo 1000 mg Se/kg.
3
Produto comercial (Alltech®), contendo 1000 mg Se/kg.

3.1.3. Abate das Aves

Aos 42 dias de idade foram amostradas 90 aves para serem abatidas,
visando pesagem dos cortes e coleta de amostras para análises laboratoriais.
Antes do abate e ainda no aviário, procedeu-se a pesagem de todas as aves, e foi
calculado o peso médio por box. Em cada box foram amostradas três aves, cujo
peso vivo mais se aproximava do valor médio do box de origem. As aves foram
identificadas e transportadas até o Abatedouro Experimental, onde foram
sacrificadas, depenadas e evisceradas. Após um período de aproximadamente 15
minutos (para o escoamento de líquidos), as carcaças evisceradas foram lavadas
e separadas em partes (Figura 5), sendo as sobrecoxas embaladas em sacos
plásticos devidamente identificados. O material foi conservado em caixas de
isopor com gelo durante o abate e transportado nestas condições para a URI -
Campus de Erechim para a realização das análises posteriores.

32
 Figura 5. Lavagem das carcaças das aves e separação das partes no Abatedouro Experimental.

3.2 Determinação da Atividade da Enzima Glutationa Peroxidase

A atividade da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px) foi determinada de

acordo com um procedimento modificado do método de Paglia e Valentine (1967),
no qual a molécula oxidada de glutationa (GSSG), produzida na reação primária
com a GSH-Px, é reduzida por intermédio de uma segunda enzima, a glutationa
redutase, com o auxílio do cofator NADPH, como mostra a Figura 6. Esta análise
foi realizada com base no decaimento da absorbância no comprimento de onda de
340 nm, devido à oxidação do NADPH provocada pela presença da enzima
glutationa peroxidase. Utilizando o coeficiente de extinção molar do NADPH ( =
6,22 mM-1.cm-1), é possível calcular a atividade enzimática da GSH-Px.

GSH-Px
H2O2 2 H2O

2 GSH GSSG

GR

NADP+ NADPH + H+

Figura 6. Interconversão de glutationa nas suas formas reduzida e oxidada pela ação das
enzimas glutationa peroxidase (GSH-Px) e glutationa redutase (GR).

33
 3.2.1. Amostras e Condições de Análise
As determinações da atividade enzimática da GSH-Px foram realizadas em
duas etapas distintas. Na primeira etapa, utilizou-se a carne de sobrecoxa de frango
crua cerca de três horas após o abate (crua zero dia) e também cozida em água
durante 40 minutos até atingir a temperatura interna de 66ºC (cozida zero dia),
sendo que as condições de cozimento escolhidas correspondem àquelas utilizadas
pela maioria dos consumidores. Estas mesmas amostras, crua e cozida,
permaneceram congeladas durante 90 dias a uma temperatura de –18ºC (±1), e
foram descongeladas lentamente a uma temperatura de 4ºC a fim de que se
procedessem as análises, dando origem às amostras denominadas “crua 90º dia” e
“cozida 90º dia”. Igualmente, o tempo e a temperatura de congelamento simulam as
práticas comuns de estocagem doméstica da carne. As análises foram realizadas
em duplicata em duas amostras de cada tratamento (T1, T2, T3, T4 e T5).
As determinações da segunda etapa foram realizadas em amostras cruas
congeladas durante 120 dias, escolhidas aleatoriamente entre os tratamentos T2 a
T5, ou seja, entre aqueles em que as aves receberam suplementação de selênio.
Nesta etapa, foram testadas diferentes condições de análise, com o objetivo de
otimizar as determinações. Foram variadas a concentração de peróxido de
hidrogênio e a temperatura e o tempo de incubação do meio de reação; foi testada
a variação de substratos, com a utilização de terc-butil hidroperóxido em lugar do
peróxido de hidrogênio, e também a variação da solução tampão empregada na
extração enzimática.

3.2.2. Obtenção do Extrato Enzimático

O extrato enzimático foi obtido de acordo com a metodologia de Devore et al.,
(1983), com algumas modificações. Amostras de 5 g de sobrecoxa livre de pele e
gordura aparente foram homogeneizadas em 25 mL de tampão a 5ºC durante 60
segundos no homogeneizador Omni-Mixer 17105 na velocidade 3, em banho de
gelo. Na extração, foram usados três tipos de tampão: na primeira etapa, tampão
trizma-cloridrato (Tris-HCl) 50 mM pH 7,6 (Carreras, 2004), e na segunda etapa,
tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,6 + EDTA 1 mM + 2-mercaptoetanol 5 mM (Arai et al.,

34
1994) e tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 + EDTA 1 mM + 2-
mercaptoetanol 1 mM (ZeptoMetrix Corporation, 2006). Tanto o EDTA como o 2-
mercaptoetanol foram utilizados na solução tampão extrativa com o objetivo de
proteger o sítio ativo da enzima.
O homogeneizado foi transferido para tubos plásticos de centrífuga com 1,5
mL de capacidade e estes foram centrifugados a 27.500 g a 4ºC durante 30
minutos. O sobrenadante obtido foi filtrado através de funil de vidro e papel filtro e
novamente centrifugado nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante límpido
foi retirado cuidadosamente através de pipetador automático e armazenado a 4ºC
em tubos identificados até o momento da análise, ou seja, durante
aproximadamente 60 minutos.
O pH das soluções tampão utilizadas foi mantido na faixa ideal para atividade
da glutationa peroxidase, que varia de 7,0 a 7,6 (Punchard et al., 1996); a
temperatura também foi mantida em uma faixa que afastasse o risco de inativação
térmica da enzima, com o uso de solução tampão em baixa temperatura,
homogeneização realizada em banho de gelo para evitar o aquecimento produzido
pela rotação das lâminas do homogeneizador e centrifugação realizada à
temperatura de 4ºC. As concentrações das soluções tampão utilizadas também
foram mantidas na faixa que favorece a atividade da enzima GSH-Px (Chen et al.,
2000).

3.2.3. Método de Determinação da Atividade

Para a determinação da atividade enzimática da enzima glutationa
peroxidase o meio de reação era composto por 350 µL de tampão fosfato de
potássio 171 mM + azida sódica 4,28 mM + EDTA 2,14 mM, 250 µL de glutationa
reduzida 6 mM, 250 µL de NADPH 0,9 mM, 250 µL de glutationa redutase 2 U/mL e
150 µL de extrato enzimático. A azida sódica foi adicionada ao meio com o objetivo
de inibir a atividade da enzima antioxidante catalase (Punchard et al., 1996), que
converte o peróxido de hidrogênio em água.
Os reativos foram pipetados em tubo de ensaio, em seqüência, à temperatura
de 22ºC (±1). Após rápida homogeneização, foram adicionados 250 µL de peróxido

35
de hidrogênio, efetuando-se a transferência do meio de reação para a cubeta de
quartzo e determinando-se no espectrofotômetro a variação de absorbância a 340
nm durante 300 segundos, com leituras registradas a cada 15 segundos e zerando
o aparelho com água Milli-Q. As medidas de absorbância foram realizadas no
aparelho Agilent 8453 UV-Visible. Devido ao fato de possuírem baixa estabilidade,
as soluções de glutationa redutase e peróxido de hidrogênio foram preparadas
minutos antes de cada análise, não sendo estocadas.
Foram testadas três concentrações de peróxido de hidrogênio, 0,72 mM, 7,2
mM e 72 mM, e em substituição a esse substrato, terc-butil hidroperóxido na
concentração de 15 mM. Paralelamente, foi feita a leitura dos controles, que
consistiam no mesmo meio de reação exceto o extrato enzimático, que foi
substituído por água Milli-Q na mesma proporção. A medida de absorbância do
controle é necessária para descontar a oxidação não enzimática que ocorre com o
NADPH.

3.2.4. Expressão dos Resultados

A atividade da enzima GSH-Px é calculada com base no coeficiente de
extinção molar do NADPH, que a 340 nm é igual a 6,22 mM/cm. A taxa de
decaimento na absorbância (∆A/min) observada para cada amostra (calculada
através da subtração da taxa observada para o controle) pode ser convertida em
consumo de NADPH com o uso da seguinte relação: 1 unidade de glutationa
peroxidase causa a formação de 1 µmol de NADP+ a partir do NADPH por minuto
em pH 7,0 e a 25ºC (Zeptometrix Corporation, 2006). Dependendo da amostra
utilizada, a atividade da enzima glutationa peroxidase pode ser expressa em
unidades/mL ou L, unidades/g de tecido, unidades/mg de proteína ou ainda em
unidades/mg de hemoglobina (Punchard et al., 1996).
Neste experimento os valores de atividade foram expressos em U/g de
tecido, de acordo com a Equação 8 (Zeptometrix Corporation, 2006):

U/g = ∆A/min X F (8)

36
 Na Equação 8, F representa um fator teórico usado para converter a taxa de
decaimento na absorbância (∆A/min) às correspondentes unidades de atividade
enzimática, e é calculado de acordo com a Equação 9:

(VR / VA) × 5
F=
6,22
(9)

onde VR corresponde ao volume de reação (em mL) e VA ao volume de amostra

(em mL); o número 5 corresponde à diluição empregada na extração (isto é, 5 mL
de extrato enzimático é o volume que contém 1 g de tecido) e 6,22 corresponde ao
coeficiente de extinção molar do NADPH (em mM/cm).

3.3 Determinação do grau de oxidação lipídica

As análises de TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) foram

determinadas em duplicata em três amostras de cada tratamento. Foi utilizada a
carne de sobrecoxa de frango crua cerca de três horas após o abate (crua zero
dia) e cozida em água durante 40 minutos até atingir a temperatura interna de
66ºC (cozida zero dia); estas mesmas amostras cozidas permaneceram
congeladas por 90 dias a uma temperatura de –18ºC (±1) (cozida 90º dia), e foram
descongeladas lentamente a uma temperatura de 4ºC a fim de que se
procedessem as análises, segundo o método de extração ácido-aquosa, descrita
por Raharjo et al. (1992) e modificada por Facco (2002).
Os produtos primários da oxidação lipídica constituem-se principalmente de
hidroperóxidos, que são rapidamente decompostos em várias substâncias reativas
ao ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), sendo o malonaldeído (MDA) o elemento mais
importante. O produto da reação destes compostos secundários com o TBA é
colorido e absorve fortemente a 531 nm (Figura 7) (Facco, 2002; Racanicci, 2004).

37
 TBA Malonaldeído Produto pigmentado

Figura 7. Reação entre TBA e MDA com a formação do produto pigmentado que absorve a 531
nm. Fonte: Fernández et al. (1997).

Para execução da análise, as amostras de sobrecoxa de frango, livres de

pele e gordura aparente, foram picadas manualmente e a 5 g delas foram
adicionados 0,5 mL de BHT 0,15% e 20 mL de ácido tricloroacético (TCA) 5%,
sendo aguardado um tempo de contato de 15 a 20 minutos para que ocorresse a
extração do MDA. O BHT foi utilizado para prevenir a oxidação durante o preparo.
Foi processada a homogeneização no homogeneizador Omni-Mixer 17105, na
velocidade 3 durante 60 segundos. Em seguida o homogeneizado foi filtrado
através de funil de vidro e papel filtro para balões volumétricos de 25 mL, e seu
volume foi completado com TCA 5%. Desta solução foram retirados 2 mL que
reagiram com 2 mL ácido tiobarbitúrico 0,08 M, sendo os tubos vedados,
colocados em banho-maria fervente e deixados por 5 minutos após a temperatura
da água ter atingido 95ºC. O líquido resfriado foi centrifugado a 3.000 rpm durante
cinco minutos e foi efetuada a leitura a 531 nm contra um branco contendo todos
os reagentes exceto a amostra, que foi substituída por água na mesma proporção.
O espectrofotômetro utilizado foi da marca Lambda, modelo EZ 150.

3.4 Análise Estatística

As determinações foram realizadas com três repetições e os resultados

obtidos foram analisados estatisticamente através de cálculos de média, desvio
padrão, análise de variância e teste de Tukey, em um nível de confiança de 95%,
utilizando o Software Statistica 5.0 (StatSoft Inc®).

38
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste capítulo serão discutidos os resultados referentes às medidas de

atividade da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px) e TBARS na carne de
sobrecoxa de frango. Os experimentos foram conduzidos em duas etapas; na
primeira foi verificada a influência da suplementação de selênio e das condições
de processamento e armazenamento sobre a atividade enzimática e os níveis de
oxidação lipídica nas amostras. Na segunda etapa, foram testadas novas
condições de análise com o objetivo de otimizar as determinações de GSH-Px.

4.1 Primeira Etapa

Os objetivos desta primeira etapa foram verificar a influência de diferentes
fontes e níveis de selênio adicionados à alimentação dos frangos sobre a atividade
da enzima glutationa peroxidase na carne e também avaliar a estabilidade desta
enzima e a estabilidade oxidativa nas amostras frente ao cozimento e ao
armazenamento a baixas temperaturas.
As determinações da GSH-Px foram realizadas na carne de sobrecoxa de
frango crua após três horas do abate (crua zero dia) e congelada a –18ºC durante
90 dias (crua 90° dia); avaliou-se também o comportamento da enzima na carne
cozida em água durante 40 minutos até atingir a temperatura interna de 66ºC
(cozida zero dia) e depois de congelada a –18ºC durante 90 dias (cozida 90° dia).
As determinações de TBARS foram realizadas na carne de sobrecoxa de frango
crua após três horas do abate (crua zero dia), na carne cozida em água durante
40 minutos até atingir a temperatura interna de 66ºC (cozida zero dia) e depois de
congelada a –18ºC durante 90 dias (cozida 90° dia).

4.1.1. Influência das Fontes e Níveis de Selênio sobre a Atividade da Enzima

Glutationa Peroxidase
Na Tabela 6 são mostrados os valores de atividade da enzima GSH-Px em
análise estatística individual, onde se pode verificar o efeito das fontes e níveis de
selênio empregados na dieta das aves sobre a atividade enzimática da carne de

39
sobrecoxa crua três horas após o abate e armazenada durante 90 dias a −18ºC.
Estes mesmos resultados também podem ser visualizados na Figura 10.

Tabela 6. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o abate e na
carne armazenada durante 90 dias a –18°C nos cinco tratamentos empregados na
criação das aves

Tratamento Amostra crua dia zero Amostra crua 90º dia

T1 (s/ Se) 0,051 A 0,007 C

(± 0,031) (± 0,002)
A
T2 (Se inorgânico 0,15 mg/kg) 0,083 0,023 B
(± 0,014) (± 0,001)
A
T3 (Se inorgânico 0,35 mg/kg) 0,045 0,003 C
(± 0,003) (± 0,002)
A
T4 (Se orgânico 0,15 mg/kg) 0,077 0,020 B
(± 0,015) (± 0,002)
A
T5 (Se orgânico 0,35 mg/kg) 0,085 0,036 A
(± 0,019) (± 0,010)
A, B, C
NOTA: letras diferentes em uma mesma coluna apresentam diferença significativa pelo teste
de Tukey (p < 0,05).

Analisando-se os valores iniciais de atividade da GSH-Px na carne fresca

(amostra crua dia zero), verificou-se que os resultados encontrados para as
amostras nos cinco tratamentos não foram significativamente diferentes entre si (p
> 0,05), inclusive para aquele grupo que não recebeu selênio na dieta (T1). Assim,
neste trabalho, nenhum efeito produzido pela fonte ou nível de selênio usado na
alimentação das aves foi verificado sobre a atividade da GSH-Px.
Holovská Jr. et al. (2003), ao determinarem a atividade desta enzima em
fígado de frangos alimentados com diferentes formas e quantidades de selênio,
encontraram resultados semelhantes aos deste experimento. Ao utilizar quatro
tipos de dieta (basal, selênio inorgânico 0,2 mg/kg, selênio orgânico 0,2 mg/kg e
selênio orgânico 0,2 mg/kg), os valores de atividade da GSH-Px medidos por
estes autores não diferiram estatisticamente entre si. Moreira et al. (2001), em seu
experimento com fígado de frango liofilizado, verificaram que a atividade
enzimática da GSH-Px não foi influenciada pelas fontes de selênio utilizadas na
alimentação das aves. Também em acordo, estão os resultados encontrados por
Daun e Akesson (2004a), que verificaram que a variação na atividade da GSH-Px

40
em carne de coxa de frangos submetidos a vários tratamentos não foi devida aos
diferentes conteúdos de selênio da dieta das aves.
Os resultados encontrados neste experimento, porém, contrariam os estudos
realizados por diversos outros autores (Finley, 1999; Combs Jr., 2001; Whanger,
2003; Borawska et al., 2004), que demonstraram que o selênio na forma
inorgânica se mostra mais disponível metabolicamente para a biossíntese da
GSH-Px do que na forma orgânica, pois esta última forma garantiria maior aporte
do mineral no músculo, sob a forma de selênio tecidual e não sob a forma de
selenoproteínas biologicamente ativas.
Uma provável explicação para o fato das diferentes concentrações de selênio
não terem influenciado a atividade enzimática baseia-se na teoria de que o selênio
ingerido a partir da alimentação é usado pelo organismo para a síntese de
diferentes selenoproteínas (Daun e Akesson, 2004), não somente glutationa
peroxidase, e esta distribuição é regulada pela necessidade metabólica do animal.
Podemos citar, por exemplo, que em frangos submetidos a estresse por frio ou
calor, há um aumento na síntese da selenoproteína iodotironina deiodinase tipo I,
que possui, dentre outras funções, a de regular a temperatura corpórea (Arthur,
1993). Levando em consideração que já foi relatada a existência de pelo menos
outras trinta selenoproteínas com papéis biológicos diversos no organismo, torna-
se bem possível que o selênio ingerido na dieta seja utilizado de outras formas
que não sejam na biossíntese da GSH-Px.
O conteúdo de selênio na dieta basal (representada neste estudo pelo
tratamento T1) representa papel importante quando se tem o objetivo de examinar
o efeito da suplementação com este mineral. Os cereais presentes na composição
da dieta oferecida às aves variam bastante seu conteúdo de selênio, em função
das características geoquímicas e físico-químicas dos solos onde são cultivados
(Bügel et al., 2004). Neste experimento, uma segunda provável explicação pela
qual a atividade da glutationa peroxidase não tenha respondido à suplementação
de selênio é que a dieta basal já esteja fornecendo às aves níveis relativamente
altos deste mineral. Assim, a quantidade de selênio não representou um fator
limitante para a síntese desta enzima (Podoll et al., 1992) e, sendo a fonte nativa

41
deste mineral suficiente para a demanda bioquímica, quantidades superiores não
mais influenciariam sua atividade.
Ao analisar estatisticamente e individualmente o grupo de resultados obtidos
para as amostras congeladas (Tabela 6, amostra crua 90º dia), constata-se que
sobre estas amostras houve influência do tipo de suplementação utilizada na
dieta. O tratamento T5 foi o que apresentou maior atividade enzimática (0,036
U/g), seguido dos tratamentos T2 (0,023 U/g) e T4 (0,020 U/g), que não diferiram
estatisticamente entre si; com os menores valores, aparecem os tratamentos T1
(0,007 U/g) e T3 (0,003 U/g), que também não diferiram entre si (p > 0,05). Estes
resultados apontam para a possibilidade de que, embora não haja diferença
significativa entre os valores dos tratamentos na carne crua, na carne congelada a
fonte e a concentração de selênio influenciaram na manutenção da atividade. Nos
dois grupos de amostras, crua dia zero e crua 90º dia, os valores decrescem na
mesma ordem em função do tratamento.
Nas análises com a carne congelada, apesar de ter havido diferenças
significativas entre os tratamentos, estas diferenças não podem ser associadas
nem à fonte, nem ao nível de selênio suplementado, pois os maiores valores de
atividade da GSH-Px foram os obtidos com o selênio orgânico a 0,35 mg/kg,
seguido das formas inorgânica e orgânica a 0,15 mg/kg (iguais entre si) e por
último, o tratamento não-suplementado e aquele com selênio inorgânico a 0,35
mg/kg, que também apresentaram valores estatisticamente iguais (p > 0,05).
Apesar da atividade da enzima glutationa peroxidase ter sido demonstrada
em animais após o abate, a dimensão de sua participação na defesa contra a
oxidação lipídica e, conseqüentemente, na manutenção da qualidade da carne,
depende da resistência desta enzima à desnaturação durante os processos de
congelamento e cozimento (Hoac et al., 2006). A influência destas condições será
discutida nos itens 4.1.2 e 4.1.3 deste estudo.

42
4.1.2. Estabilidade da Enzima Glutationa Peroxidase frente ao
Armazenamento a Baixa Temperatura
A Figura 8 mostra os valores de atividade da GSH-Px para a carne crua
recém abatida e crua congelada. Os resultados apresentados nesta figura foram
analisados sob estatística global, para que se pudesse compreender o efeito geral
produzido pela condição de congelamento sobre a atividade enzimática, não
sendo levado em consideração apenas o efeito isolado exercido pelo tipo de
tratamento, como já foi discutido anteriormente no item 4.1.1.

0,090 A A
AB
0,080
Atividade GSH-Px (U/g)

am os tra crua dia zero

0,070
am os tra crua 90º dia
0,060
ABC BC
0,050
T1 s/ Se
CD
0,040
T2 Se inorgânico 0,15 mg/kg
0,030 CD
CD T3 Se inorgânico 0,35 mg/kg
0,020
D D T4 Se orgânico 0,15 mg/kg
0,010
T5 Se orgânico 0,35 mg/kg
0,000
T1 T2 T3 T4 T5

Tratamento

Figura 8. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o abate e na
carne armazenada durante 90 dias a –18°C nos cinco tratamentos empregados na
criação das aves (letras diferentes apresentam diferença significativa pelo teste de
Tukey (p < 0,05).

Em relação à carne crua no dia zero, a análise estatística global mostra que
as maiores atividades enzimáticas, encontradas nas amostras dos tratamentos T2
e T5, diferiram significativamente (p < 0,05) somente daquela encontrada no
tratamento T3, que corresponde ao menor valor medido entre as amostras cruas
(Figura 8). Porém, entre as amostras cruas congeladas durante 90 dias, o
comportamento foi diferente, uma vez que o maior valor de atividade da GSH-Px,
encontrado novamente no tratamento T5, não diferiu de nenhum dos outros quatro
tratamentos na mesma condição, mesmo estes tendo apresentado menores

43
valores numéricos. Assim, pode-se verificar que devido ao armazenamento a –
18ºC durante 90 dias, as amostras cruas de todos os tratamentos apresentaram
diminuição na atividade da enzima GSH-Px, com percentuais de 86% no T1, 72%
no T2, 93% no T3, 74% no T4 e 57% no T5, o que demonstra que a enzima GSH-
Px é sensível à temperatura de congelamento.
Lee et al. (1997), ao determinarem a atividade da GSH-Px em carne suína
armazenada a −15ºC durante 10 semanas oriunda de porcos submetidos à dieta
sem suplementação especial de selênio, verificaram uma redução de 32% entre
os valores de atividade encontrados no dia zero e aqueles da décima semana.
Surai e Dvorska (2002), durante a determinação da atividade da GSH-Px em
carne de peito de frango submetida ao congelamento a −20ºC durante 24 meses,
observaram que nas amostras obtidas das aves que receberam apenas a dieta
basal ocorreu diminuição na atividade enzimática, enquanto que naquelas que
receberam selênio na forma orgânica, a atividade se manteve constante.
Diferentemente, neste experimento, todas as amostras de carne de sobrecoxa de
aves apresentaram redução na atividade enzimática, independente da fonte ou do
nível de selênio utilizado (Figura 8 e Tabela 6).
Em função dos resultados observados, pode-se concluir que a enzima
glutationa peroxidase faz parte de um grupo de enzimas que sofre desnaturação
durante o processo de congelamento e descongelamento. De acordo com
Fennema (1993), esta diminuição na atividade enzimática, decorrente da
desnaturação, pode ser devida a mudanças conformacionais que ocorrem no
centro ativo da enzima em decorrência da passagem da água do estado líquido
para o sólido. A atividade de algumas enzimas pode ser afetada também pela
velocidade de congelamento, que influencia diretamente o tamanho dos cristais de
gelo formados. O congelamento e descongelamento lentos, por regra geral,
determinam maiores perdas da atividade enzimática do que os processos que
ocorrem rapidamente, devido principalmente à formação de grandes cristais que
degradam fisicamente a estrutura do tecido muscular. Estes seriam os fatores que
influenciaram na perda da atividade enzimática da GSH-Px nos cinco tratamentos

44
deste experimento, levando em consideração que os sistemas de congelamento e
descongelamento empregados na conservação destas amostras foi lento.

4.1.3. Estabilidade da Enzima Glutationa Peroxidase frente ao Cozimento

A Tabela 7 e a Figura 9 mostram as atividades da enzima GSH-Px obtidas
em cada um dos cinco tratamentos na carne recém cozida à temperatura interna
de 66ºC e na carne cozida armazenada a –18ºC durante 90 dias, tendo como
referência os valores de atividade enzimática obtidos na carne crua três horas
após o abate.

Tabela 7. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o abate, logo
após o cozimento a 66ºC e na carne cozida armazenada durante 90 dias a –18°C
nos cinco tratamentos empregados na criação das aves

Tratamento Amostra crua Amostra cozida Amostra cozida

dia zero dia zero 90º dia
T1 (s/ Se) 0,051 0,048 0,015
(± 0,031) (± 0,002) (± 0,004)
T2 (Se inorgânico 0,15 mg/kg) 0,083 0,030 0,029
(± 0,014) (± 0,004) (± 0,009)
T3 (Se inorgânico 0,35 mg/kg) 0,045 0,024 0,017
(± 0,003) (± 0,004) (± 0,003)
T4 (Se orgânico 0,15 mg/kg) 0,077 0,027 0,020
(± 0,015) (± 0,001) (± 0,003)
T5 (Se orgânico 0,35 mg/kg) 0,085 0,022 0,012
(± 0,019) (± 0,001) (± 0,002)

45
 A
0,090

AB
Atividade GSH-Px (U/g) 0,080
am ostra crua dia zero
0,070
am ostra cozida dia zero
0,060

BC

CDE
am ostra cozida 90º dia

BD
0,050

CDEF
CDEF

CDEF
0,040 T1 s/ Se

CDEF

CDEF
0,030 T2 Se inorgânico 0,15 mg/kg

DEF
EF
0,020
F
T3 Se inorgânico 0,35 mg/kg

F
0,010 T4 Se orgânico 0,15 mg/kg

0,000 T5 Se orgânico 0,35 mg/kg

T1 T2 T3 T4 T5

Tratamento

Figura 9. Atividades da GSH-Px (U/g) verificadas na carne crua três horas após o abate, logo
após o cozimento a 66ºC e na carne cozida armazenada durante 90 dias a –18°C
nos cinco tratamentos empregados na criação das aves (letras diferentes apresentam
diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05).

Os resultados apresentados na Figura 9 nas três condições (amostra crua dia

zero, cozida dia zero e cozida 90º dia) foram analisados sob estatística global,
para que se pudesse compreender o efeito geral produzido pelas condições de
cozimento e congelamento sobre a atividade enzimática.
Comparando as atividades medidas após o cozimento com aquelas
encontradas na carne crua, pode-se dizer que os tratamentos T1 e T3 não
apresentaram diferença estatística nos valores encontrados nas duas condições.
Os demais tratamentos (T2, T4 e T5) apresentaram redução significativa (p < 0,05)
no valor da atividade enzimática em função do cozimento (Figura 9).
Analisando o efeito do congelamento sobre a carne previamente cozida,
nota-se um comportamento interessante entre as amostras, onde somente o
tratamento T1 teve sua atividade significativamente reduzida, enquanto que os
demais mantiveram os valores estatisticamente iguais (p > 0,05) mesmo após o
congelamento (Figura 9).
Em função do cozimento, as perdas percentuais de atividade ocorreram na
seguinte ordem: 74% no tratamento T5, 65% no tratamento T4, 64% no tratamento
T2, 47% no tratamento T3 e 6% no tratamento T1.

46
 Mei et al. (1994) estudaram a atividade enzimática da enzima GSH-Px em
carne suína crua e cozida de animais que não receberam suplementação especial
de selênio. Assim, mediram na carne crua atividade enzimática de 0,228 U/g, na
carne cozida a 60ºC (temperatura interna) atividade de 0,192 U/g, a 70ºC de 0,094
U/g, a 80ºC de 0,007 U/g. Já a 90º, nenhuma atividade foi detectada nas amostras
analisadas. Observaram, respectivamente, uma redução de atividade de 15%,
60%, 97% e 100%. Na carne de peito de frango, Hoac et al. (2006) constataram
que o aquecimento a 60ºC diminuiu em mais de 60% a atividade inicial da enzima
glutationa peroxidase. Neste experimento, a enzima GSH-Px na carne de frango
apresentou comportamento semelhante, uma vez que as perdas de atividade
ficaram na faixa de 64 a 74% para três dos cinco tratamentos testados. A
diminuição na atividade enzimática só não foi significativa nos tratamentos T1 e
T3.
De acordo com a literatura, sabe-se que a fonte e o nível de selênio na dieta
animal possui correlação com a atividade enzimática de GSH-Px inicial verificada
na carne crua, porém não existem trabalhos que correlacionem diretamente a
suplementação deste mineral com a estabilidade da enzima frente às altas
temperaturas; pois não se tem conhecimento se a forma de selênio suplementada
influencia ou não a estabilidade térmica da enzima sintetizada. Mesmo assim,
pode-se concluir que nas amostras dos tratamentos T1 e T3, a enzima GSH-Px
mostrou-se mais estável, pois os resultados obtidos para as amostras crua e
cozida são estatisticamente iguais entre si (p > 0,05), conforme mostrado na
Figura 9.
As amostras de carne de ave pertencente aos cinco tratamentos, cozidas e
submetidas ao armazenamento a –18ºC durante 90 dias, mostraram uma pequena
diminuição em sua atividade, porém esta diminuição só foi significativa no
tratamento T1, que apresentou uma perda percentual de 69% em relação ao valor
encontrado na carne recém cozida. Este comportamento apresentado pelo grupo
que não recebeu selênio talvez possa ser explicado pelo maior índice de
desidratação ocorrido nestas amostras durante o congelamento, fazendo com que
o tecido muscular não conseguisse reter a enzima.

47
 Da mesma forma como foi observado por Hoac et al. (2006), neste
experimento a atividade da enzima glutationa peroxidase foi afetada em maior
grau pelo aquecimento do que pelo congelamento.

4.1.4. Nível de Oxidação Lipídica em função do Cozimento e Armazenamento

a Baixa Temperatura
Estudos feitos em carne de diferentes espécies indicam que as enzimas
antioxidantes endógenas, principalmente catalase e glutationa peroxidase, podem
retardar potencialmente o processo de rancidez oxidativa, sendo que altas
atividades destas enzimas estão associadas a aumentos significativos na
resistência contra a oxidação lipídica na carne armazenada (Hernández et al.,
2002).
O nível de oxidação lipídica medido através da reação com o ácido
tiobarbitúrico constitui um bom parâmetro para a avaliação da qualidade da carne
durante os processamentos aqui descritos (cozimento e congelamento). Na
Tabela 8 são mostrados os valores de TBARS encontrados na carne crua três
horas após o abate, recém cozida e cozida e armazenada sob congelamento.
Nesta tabela é apresentada a análise estatística individual, para que se possa
verificar as diferenças entre os tratamentos na mesma condição. Estes mesmos
resultados podem ser visualizados na Figura 10.

Tabela 8. Valores de TBARS (mg de malonaldeído/ kg de tecido) encontrados na carne crua três
horas após o abate, recém cozida a 66ºC e armazenada durante 90 dias a –18°C nos
cinco tratamentos empregados na criação das aves

Tratamento Amostra crua Amostra cozida Amostra cozida

dia zero dia zero 90º dia
T1 (s/ Se) 0,850 B 2,241 A 5,840 A
(± 0,056) (± 0,561) (± 0,592)
C B
T2 (Se inorgânico 0,15 mg/kg) 0,464 1,426 5,888 A
(± 0,033) (± 0,282) (± 0,348)
B B
T3 (Se inorgânico 0,35 mg/kg) 0,824 1,700 5,608 A
(± 0,049) (± 0,182) (± 0,949)
B A
T4 (Se orgânico 0,15 mg/kg) 0,776 2,223 5,347 A
(± 0,038) (± 0,067) (± 0,065)
A A
T5 (Se orgânico 0,35 mg/kg) 1,035 2,256 5,671 A
(± 0,035) (± 0,179) (± 0,173)
A, B, C
NOTA: letras diferentes em uma mesma coluna apresentam diferença significativa pelo teste
de Tukey (p < 0,05).

48
 Na carne crua, os valores encontrados mostram que as amostras do
tratamento T5 foram as que apresentaram maior nível de oxidação lipídica,
seguidas daquelas dos tratamentos T1, T3 e T4, que não diferiram entre si (p >
0,05) e por último do tratamento T2, que apresentou o menor valor de TBARS.
Estes resultados sugerem que, apesar das fontes e níveis de selênio
suplementado nos cinco tratamentos não ter influenciado a atividade da enzima
GSH-Px na carne de frango crua (conforme Tabela 6), o nível de oxidação lipídica
foi diferente nas amostras. O maior valor de TBARS foi encontrado no grupo
suplementado com selênio orgânico a 0,35 mg/kg e o menor valor, no grupo que
recebeu selênio inorgânico a 0,15 mg/kg. Como o tratamento T1 (sem
suplementação de selênio) não diferiu estatisticamente das fontes inorgânica a
0,35 mg/kg e orgânica a 0,15 mg/kg, pode-se concluir que neste experimento que
a inclusão deste mineral não ocasionou aumento da estabilidade oxidativa na
carne crua.
Os resultados encontrados para a carne crua neste experimento, que
variaram de 0,464 a 1,035 mg malonaldeído (MDA)/ kg, estão em uma faixa bem
acima dos encontrados por Pino (2005), que verificou valores entre 0,210 e 0,230
mg de malonaldeído/ kg de tecido para sobrecoxas de frangos alimentados com
diferentes fontes lipídicas, porém se assemelham aos valores relatados por
Maraschiello et al. (1998), que encontraram na carne de coxa de frango a média
de 1,070 mg MDA/kg para o grupo que não recebeu suplementação de
antioxidantes, ao passo que nas amostras de carne das aves que receberam α-
tocoferol na dieta, esses valores caíram para 0,300 mg MDA/kg, em média.
Diferentemente do que estes autores relataram, a inclusão de selênio na
alimentação das aves neste experimento não ocasionou menor nível de oxidação
lipídica das amostras quando em comparação à dieta basal oferecida.
A análise estatística individual das amostras recém cozidas (Tabela 8,
amostra cozida dia zero) revela que os maiores níveis de oxidação ocorreram nos
tratamentos T1, T4 e T5 (cujos valores não diferiram entre si), seguido dos
tratamentos T2 e T3, que estatisticamente também são iguais entre si (p > 0,05).
Apesar das fontes e níveis de selênio não terem influenciado a atividade da

49
enzima GSH-Px na carne crua (Tabela 6, amostra crua dia zero), os menores
valores de TBARS na carne cozida foram os encontrados para os tratamentos que
receberam selênio na forma inorgânica, T2 a 0,15 mg/kg e T3 a 0,35 mg/kg. Como
já foi discutido anteriormente, esta é a forma química mais biodisponível para a
enzima (Borawska et al., 2004).
Pode-se observar que com o congelamento das amostras cozidas (Tabela 8,
amostra cozida 90º dia), os valores de TBARS não diferiram significativamente (p
> 0,05) entre todos os tratamentos.
A peroxidação lipídica é uma das principais causas da diminuição da
qualidade em produtos cárneos crus e cozidos durante o armazenamento sob
refrigeração ou congelamento (Gomes et al., 2003). As alterações oxidativas na
carne de sobrecoxa, decorrentes do cozimento e congelamento, podem ser
observadas na Figura 10, onde os resultados verificados nas três condições
(amostra crua dia zero, cozida dia zero e cozida 90º dia) estão apresentados sob
análise estatística global, para que se possa compreender o efeito geral produzido
pelas condições de cozimento e congelamento sobre os valores de TBARS nas
amostras.

7,000
TBARs (mg de malonaldeído/kg tecido)

A A A A A
6,000
am os tra crua dia zero
5,000 am os tra cozida dia zero
4,000 am os tra cozida 90º dia

3,000
B B B T1 s/ Se
2,000 BC
CD T2 Se inorgânico 0,15 mg/kg
DE E E CDE
1,000 E
T3 Se inorgânico 0,35 mg/kg

T4 Se orgânico 0,15 mg/kg

0,000
T1 T2 T3 T4 T5 T5 Se orgânico 0,35 mg/kg

Tratamento

Figura 10. Valores de TBARS (mg de malonaldeído/ kg de tecido) encontrados na carne crua três
horas após o abate, recém cozida a 66ºC e armazenada durante 90 dias a –18°C nos
cinco tratamentos empregados na criação das aves (letras diferentes apresentam
diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05).

50
 Comparado aos valores iniciais obtidos na carne crua, pode-se perceber que
o cozimento provocou um aumento significativo (p < 0,05) nos valores de TBARS
nas amostras dos tratamentos T1, T2, T3, T4 e T5. O congelamento destas
mesmas amostras cozidas ocasionou uma elevação significativa e ainda maior
nos níveis de oxidação lipídica, também verificada em todos os tratamentos
(Figura 10).
De acordo com Lee et al. (1996), estes resultados sugerem que o nível de
oxidação das amostras aumentou devido à diminuição da eficácia do sistema de
defesa antioxidante endógeno, que pode ser constatado neste experimento
através da diminuição dos valores de atividade da enzima GSH-Px (Figura 9 e
Tabela 7); altos níveis de atividade enzimática geralmente estão associados a
baixos valores de TBARS (Sárraga et al., 2002).
Maraschiello et al. (1999) observou, com o cozimento de amostras de
sobrecoxa de frango, um aumento de até dez vezes nos valores de TBARS. O
aumento da oxidação lipídica associado ao cozimento da carne deve-se a uma
série de fatores, tais como a inativação das enzimas antioxidantes, a liberação de
ferro cataliticamente ativo e a ruptura das membranas celulares com exposição
dos AGPI aos pró-oxidantes.
O aumento do nível oxidativo da carne de frango, observado neste
experimento durante o armazenamento sob congelamento, pode ser explicado
devido a uma possível desidratação provocada pela baixa temperatura, que
provavelmente resultou em uma diminuição nos valores de atividade de água (Aa).
Conforme Fennema (1993), sabe-se que na faixa de Aa entre 0,4 e 0,8, as reações
de oxidação lipídica são favorecidas.
De acordo com Bou et al. (2001), existe uma relação entre os valores médios
de TBARS e as avaliações sensoriais da carne. Produtos cárneos com índice de
TBARS menores que 1,0 mg/kg geralmente não apresentam sabores e odores
residuais de ranço característicos de oxidação lipídica (Racanicci, 2004). Os
resultados de TBARS deste estudo indicam que os níveis de atividade enzimática
de GSH-Px encontrados nas amostras não foram suficientes para proteger o

51
tecido muscular da peroxidação lipídica, gerando alterações sensoriais
indesejáveis na carne cozida e armazenada sob congelamento.

Finalizada a primeira etapa de experimentos, pode-se verificar que as

atividades enzimáticas mais altas foram as determinadas na carne de sobrecoxa
de frango crua três horas após o abate, pois nestas amostras a enzima não sofreu
nenhum grau de inativação em decorrência do cozimento e/ou congelamento.
Porém, apesar de terem sido observados todos os cuidados requeridos no
processo de análise, estes valores iniciais encontram-se bem abaixo dos
resultados expressos em U/g de tecido mencionados na literatura. Para a carne
suína in natura, que de acordo com a literatura possui valores de atividade de
GSH-Px próximas às de frango, foram encontrados os valores de 0,228 U/g (Mei
et al., 1994), 0,250 U/g (Lee et al., 1997) e 0,170 U/g (Hernández et al., 2002).
Comparada a estes resultados, a média das atividades encontradas neste
experimento é cerca de três vezes menor. Para a carne de peito de frango in
natura, Daun et al. (2004) e Hoac et al. (2006) mediram a atividade de 0,7 U/g, ou
seja, um valor cerca de dez vezes maior do que a média encontrada neste
experimento.
Segundo Punchard et al. (1996), a faixa de decaimento nos valores de
absorbância considerada ideal para a enzima glutationa peroxidase situa-se entre
0,01 e 0,05 unidades/minuto e, nesta primeira etapa, as taxas medidas foram em
sua grande maioria inferiores a estes números. Como decorrência, percebeu-se a
importância ímpar de um estudo mais detalhado desta enzima, decidindo-se
continuar os experimentos com o intuito de aprimorar o método de análise e
também obter maiores informações a respeito das características cinéticas da
enzima glutationa peroxidase. O mesmo ocorreu com Stagsted (2006), que ao
tentar reproduzir o método de análise da GSH-Px já existente para leite bovino e
não obtendo resultados condizentes com publicações anteriores, decidiu
aprofundar o estudo, variando as condições de análise.

52
 4.2 Segunda Etapa

Esta etapa foi realizada com o objetivo de otimizar as determinações da

atividade da GSH-Px através da variação das condições de reação, não sendo
levados em consideração os tratamentos distintos. Foram utilizadas para os
experimentos amostras aleatórias de carne de sobrecoxa de frango crua
congeladas durante 120 dias, escolhidas entre os tratamentos que receberam
selênio na dieta (T2 a T5).

4.2.1. Efeito da Concentração de Peróxido de Hidrogênio sobre a Atividade

da Enzima Glutationa Peroxidase
A enzima glutationa peroxidase reduz numerosas espécies reativas de
oxigênio (ERO’s), entre elas o peróxido de hidrogênio. Esta reação de redução
tem como primeiro passo a oxidação direta do ânion selenolato (E-Se−) ou selenol
(E-SeH), que são as duas formas cataliticamente ativas do resíduo de
selenocisteína presente na GSH-Px (Prabhakar et al., 2005), como mostra a
Equação 10.

E-SeH + H2O2 E-SeOH + H2O (10)

Após a oxidação do centro ativo da glutationa peroxidase às custas do

peróxido de hidrogênio, esta enzima reage com uma primeira molécula de
glutationa reduzida (GSH), dando origem a um complexo enzima-glutationa
(Equação 11). Na terceira e última reação deste ciclo, este complexo irá reagir
com a segunda molécula de GSH, regenerando a enzima glutationa peroxidase na
sua forma reduzida e liberando uma molécula de glutationa oxidada (Equação 12),
a qual será novamente reduzida às custas da enzima glutationa redutase e com a
participação do NADPH (Prabhakar et al., 2005).

E-SeOH + GSH E-Se-SG + H2O (11)

53
 E-Se-SG + GSH E-SeH + GSSG (12)

Assim, por participar da primeira reação fundamental deste ciclo catalítico,

pode-se dizer que o peróxido de hidrogênio é um fator limitante da velocidade
global da reação, e sua falta ou excesso no meio pode comprometer a cinética
enzimática.
Para avaliar o efeito da concentração de peróxido de hidrogênio na taxa de
reação da glutationa peroxidase, foram preparadas três soluções de diferentes
concentrações, 0,72 mM, 7,2 mM e 72 mM. O restante das condições de reação
foram mantidas iguais. Os resultados obtidos estão apresentados na Figura 11.

0,0070
A
0,0060
0,0050
A bs/m in

0,0040 B
0,0030
0,0020 C
0,0010
0,0000
0,72 7,2 72

Concentração de peróxido de hidrogênio (mM)

-1
Figura 11. Variação da taxa de reação (Abs. min ) da enzima glutationa peroxidase observada
com as diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio.

Como pode ser observado na Figura 11, as taxas de reação encontradas

com o uso de concentrações de peróxido de hidrogênio de 0,72 mM, 7,2 mM e 72
mM foram significativamente diferentes entre si (p < 0,05), com valores respectivos
de 0,0060, 0,0034 e 0,0021.
De acordo com Lehninger et al. (1995), todas as enzimas apresentam o
efeito da saturação, porém variam em relação à concentração de substrato
requerida para produzi-lo. Neste experimento observou-se que com a mudança da
concentração do peróxido de hidrogênio para níveis superiores aos utilizados na
primeira etapa do experimento (0,72 mM), a taxa de reação diminui, indicando que

54
as concentrações de 7,2 mM e 72 mM não somente promoveram a saturação da
enzima glutationa peroxidase, como também a inibiram. Splittgerber e Tappel
(1979), ao variar as concentrações de três tipos de hidroperóxidos e mantendo
constantes as concentrações de GSH e GSH-Px parcialmente purificada extraída
de fígado de rato, verificaram que conforme a concentração dos hidroperóxidos
era aumentada, mais a taxa de reação diminuía. Lin e Hultin (1978) também
relataram que a enzima glutationa peroxidase é facilmente saturada com peróxido
de hidrogênio. A conclusão a que se pode chegar é que em concentrações
elevadas, este substrato, além de reduzir a taxa de reação, tornam o processo de
ativação inicial (Equação 10) mais lento.

4.2.2. Efeito da Temperatura e do Tempo de Incubação do Meio de Reação

sobre a Atividade da Enzima Glutationa Peroxidase
Para a medida da atividade da enzima glutationa peroxidase, existem
variações no que diz respeito à temperatura e ao tempo de incubação do meio de
reação. Carreras et al. (2004) adotaram o procedimento de pré-incubação da
mistura a 30ºC durante 5 minutos, com adição após este período do hidroperóxido
(iniciador da reação) e subseqüente leitura no espectrofotômetro, enquanto que
Moreira et al. (2001) e Penha-Silva et al. (2005) incubaram o meio de reação a
37ºC durante 10 minutos antes da adição do iniciador. Diversos autores citam a
reação imediata a 37ºC (Chen et al., 2000; Lindmark-Mansson et al., 2001;
Holovská et al., 2003; Hoac et al., 2006). Constam ainda na literatura os
experimentos conduzidos na faixa de temperatura de 20° a 25ºC (Paglia e
Valentine, 1968; Arai et al., 1994; Lee et al., 1997; Hernández et al., 2002). Na
primeira etapa deste experimento os ensaios foram realizados a 22ºC, sem pré-
incubação. Devido às diferentes condutas existentes na literatura, na segunda
etapa foi testada a influência destes dois fatores, tempo e temperatura, sobre a
medida da atividade da GSH-Px.
Como já foi visto na revisão bibliográfica, na reação catalisada pela enzima
glutationa peroxidase, a glutationa oxidada (GSSG) formada a partir da glutationa
(GSH) (Equação 13) é instantaneamente e continuamente reduzida, na presença

55
da enzima glutationa redutase (Equação 14), para a manutenção de um nível
constante de glutationa (GSH), o que evita a paralisação deste ciclo redox (Rover
Jr. et al, 2001; Penha-Silva et al., 2005).

2 GSH + H2O2 GSH-Px GSSG + 2 H2O (13)

GSSG + NADPH + H GS RED 2 GSH + NADP+ (14)

Neste ciclo redox, a molécula de NADPH comporta-se como um doador de

elétrons, oxidando-se paralelamente (Equação 14). Essa oxidação concomitante
que ocorre com o NADPH pode ser monitorada fotometricamente pelo decaimento
da absorção a 340 nm, sendo que este representa, aliás, o fundamento da análise
da atividade da enzima glutationa peroxidase. A Figura 12 mostra o gráfico destes
valores no decorrer dos cinco minutos de reação, verificados nos diferentes modos
de pré-incubação do meio de reação.

1,0400
Absorbância (340 nm)

1,0200
1,0000
0,9800
0,9600
0,9400
0,9200
0,9000
0,8800
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Tempo (segundos)

Figura 12. Valores de absorbância do NADPH em 340 nm no decorrer do tempo de reação

verificados nos diferentes modos de pré-incubação do meio de reação. Os símbolos
correspondem a: reação imediata a 22ºC ( ); banho-maria a 36ºC durante 30
minutos ( ) e banho-maria a 36º durante 10 minutos ( ).

56
 A taxa de reação (∆abs/min) corresponde a 0,0003 quando foi utilizado o
banho-maria a 36ºC durante 30 minutos, 0,0007 para o banho-maria a 36ºC
durante 10 minutos e 0,0058 para a reação imediata a 22ºC (Figura 12). Podemos
concluir que esta reação enzimática é bastante rápida, e provavelmente ocorreu
no período de incubação no banho-maria. Assim, no momento em que o
espectrofotômetro começou a registrar as absorbâncias, o NADPH já estaria
quase que totalmente oxidado, dando origem a taxas de reação próximas de zero,
fato ocorrido quando o tempo de incubação foi de 10 e 30 minutos.
Chen et al. (2000), ao testar a influência da temperatura sobre a
determinação da atividade da enzima glutationa peroxidase em leite, verificou que
ao conduzir os ensaios a 25ºC, a atividade da GSH-Px medida foi 30% mais baixa
do que a 37ºC. Isto ocorreu provavelmente devido a presença de diferentes
formas de GSH-Px em carne e leite, como já foi visto anteriormente. O tecido
muscular contém a forma celular (cGSH-Px), enquanto que no leite é encontrada a
forma extracelular (eGSH-Px) (Chen et al., 2000; Stagsted, 2006). Estas formas
são estruturalmente e funcionalmente diferentes uma da outra, sendo inclusive
que a eGSH-Px apresenta maior resistência às altas temperaturas do que a
cGSH-Px (Lindmark-Mansson et al., 2001a).

4.2.3. Variação de Substratos: Peróxido de Hidrogênio X Terc-butil

Hidroperóxido
Embora tanto peróxido de hidrogênio quanto terc-butil hidroperóxido sejam
substratos inorgânicos para a reação catalisada pela GSH-Px, os dois possuem
valores de Km diferentes em relação a esta enzima, com valores de 0,003 e 0,059
mM, respectivamente (Brenda, 2007), o que indica que a GSH-Px possui uma
maior afinidade pelo peróxido de hidrogênio. A Figura 13 mostra as curvas
cinéticas obtidas para cada um dos substratos testados.

57
 1,0000
0,9900

Absorbância (340 nm)

0,9800
0,9700
0,9600
0,9500
0,9400
0,9300
0,9200
0,9100
0,9000
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Tempo (segundos)

Figura 13. Valores de absorbância do NADPH em 340 nm no decorrer do tempo de reação

verificados com os substratos: terc-butil hidroperóxido 15 mM ( ) e peróxido de
hidrogênio 0,72 mM ( ).

A taxa de reação (abs/min) medida com a utilização do terc-butil

hidroperóxido corresponde a 0,0028 e com a utilização do peróxido de hidrogênio,
0,0077, o que confirma que a enzima GSH-Px possui maior afinidade por este
último substrato (Figura 13). Contrariando estes resultados, Avissar et al. (1991)
encontraram o mesmo valor de atividade enzimática no leite, usando tanto
peróxido de hidrogênio quanto terc-butil hidroperóxido como substratos.

4.2.4. Efeito do Tampão empregado na Extração Enzimática

De acordo com Farfán (1994), a substância mercaptoetanol, por comportar-
se como um agente fracamente redutor, formaria com a GSH-Px um complexo
reversível enzima-inibidor. Esta característica pode ser útil quando se deseja
prevenir a oxidação espontânea durante a extração da enzima glutationa
peroxidase. Arai et al. (1994) utilizaram esta substância durante o preparo do
extrato enzimático de carne de frango; a técnica de extração de tecidos citada pelo
manual Zeptometrix Corporation (2006) também preconiza o emprego do
mercaptoetanol.
Embora Chaudiere et al. (1984) tenham relatado a inibição da atividade da
GSH-Px devido à adição de mercaptoetanol no meio de reação, ocorrida
provavelmente devido à competição com o substrato glutationa, seria esperado

58
que a presença deste composto na solução tampão favorecesse a pré-etapa de
extração da enzima. Nas determinações da atividade enzimática da primeira
etapa, foi utilizado o tampão de extração tris-HCl 50 mM pH 7,6. Utilizando a
mesma amostra, porém variando a forma de extração, obteve-se as curvas
cinéticas que podem ser visualizadas na Figura 14.

1,1200
Absorbância (340 nm)

1,1000
1,0800
1,0600
1,0400
1,0200
1,0000
0,9800
0,9600
0,9400
0,9200
0,9000
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Te mpo (se gundos)

Figura 14. Valores de absorbância do NADPH em 340 nm no decorrer do tempo de reação

verificados com três tipos de tampão de extração: ( )solução tampão 1 (fosfato
de potássio 50 mM pH 7,0 + EDTA 1 mM + mercaptoetanol 1 mM), ( ) solução
tampão 2 (tris-HCl 50 mM pH 7,6 + EDTA 1 mM + mercaptoetanol 5 mM) e
( ) solução tampão 3 (tris-HCl 50 mM pH 7,6).

A taxa de reação (abs/min) para cada uma das condições testadas

corresponde a 0,0062 utilizando a solução tampão 1, 0,0072 quando foi utilizado a
solução tampão 2 e 0,0114 na utilização da solução tampão 3 (Figura 14). Estes
resultados mostram que a maior taxa foi obtida quando a solução tampão 3 foi
utilizada (tris-HCl 50 mM pH 7,6), comprovando que o mercaptoetanol não auxiliou
no processo de extração da enzima.

59
5 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

5.1 Conclusões
As diferentes fontes e os níveis de selênio utilizados na alimentação das aves
não influenciaram na atividade da enzima glutationa peroxidase na carne crua de
sobrecoxa, uma vez que não ocorreu diferença significativa entre os cinco
tratamentos.
O congelamento da carne crua proporcionou uma diminuição significativa na
atividade enzimática das amostras de todos os tratamentos, porém os valores
encontrados não diferiram entre si. Desta forma, a enzima GSH-Px mostrou-se
sensível à temperatura de −18ºC e nenhuma fonte ou nível de selênio testada foi
capaz de reduzir a perda na atividade.
O cozimento da carne de sobrecoxa de frango proporcionou uma diminuição
significativa na atividade da enzima glutationa peroxidase nos tratamentos T2, T4
e T5. Já os valores de atividade enzimática nas amostras cozidas de T1 e T3, não
foram estatisticamente diferentes daqueles encontrados na carne crua.
O congelamento associado ao cozimento promoveu diminuição significativa
na atividade da enzima glutationa peroxidase apenas no tratamento T1.
Na carne crua, o maior valor de TBARS foi encontrado no tratamento T5, que
diferiu significativamente de todos os outros tratamentos.
Com o cozimento, obteve-se valores de TBARS significativamente maiores
para todos os tratamentos.
O congelamento das amostras cozidas ocasionou uma elevação significativa
nos níveis de oxidação lipídica em todos os tratamentos.
Concentrações de peróxido de hidrogênio superiores a 0,72 mM ocasionaram
saturação, e mesmo inibição da enzima glutationa peroxidase, o que pode ser
verificado através da diminuição das taxas de reação.
Foram obtidos melhores resultados de atividade da enzima glutationa
peroxidase na reação imediata à temperatura de 22ºC.
O substrato terc-butil hidroperóxido promoveu diminuição das taxas de
reação quando em comparação ao peróxido de hidrogênio, demonstrando que a
enzima glutationa peroxidase possui maior afinidade por este último substrato.

60
 A solução tampão contendo mercaptoetanol não promoveu melhor extração
da enzima glutationa peroxidase.

5.2 Sugestões para Trabalhos Futuros

Analisar a atividade da enzima glutationa peroxidase plasmática das aves
durante a criação das mesmas;
Determinar as concentrações teciduais de selênio na carne após abate;
Quantificar os níveis de selênio na ração das aves;
Estudar paralelamente os parâmetros zootécnicos dos frangos alimentados
com diferentes fontes e níveis de selênio;
Utilizar uma faixa mais ampla de suplementação de selênio, com valores
acima de 0,35 mg /kg;
Verificar o efeito de temperaturas de cozimento inferiores a 66ºC sobre a
atividade da enzima glutationa peroxidase;
Verificar o efeito da temperatura de refrigeração (4ºC) em períodos inferiores
a 90 dias sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase;
Aprofundar o estudo cinético sobre o mecanismo de reação da enzima GSH-
Px em carne de frango.

61
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APÊNDICE A – DADOS SOBRE O DESEMPENHO DOS FRANGOS
DE CORTE ALIMENTADOS COM DIFERENTES FONTES E NÍVEIS
DE SELÊNIO

Tratamentos:
T1 – sem suplementação de selênio
T2 – selênio suplementar: 0,15 mg/kg, fonte inorgânica (selenito de sódio)
T3 – selênio suplementar: 0,35 mg/kg, fonte inorgânica (selenito de sódio)
T4 – selênio suplementar: 0,15 mg/kg, fonte orgânica (selenometionina)
T5 – selênio suplementar: 0,35 mg/kg, fonte orgânica (selenometionina)

Tabela 1. Peso vivo (g) de frangos de corte com 1, 21, 35 e 42 dias de idade alimentados com
dietas suplementadas com diferentes fontes e níveis de selênio

Tratamento 1º dia 21º dia 35º dia 42º dia

T1 43,90 426,3 695,8 1067,8

T2 44,11 801,0 1899,1 2546,7

T3 44,12 805,4 1883,2 2553,4

T4 44,01 791,0 1896,2 2528,6

T5 43,96 792,2 1875,0 2492,1

Tabela 2. Consumo de ração (g) de frangos de corte com 21, 35 e 42 dias de idade alimentados
com dietas suplementadas com diferentes fontes e níveis de selênio

Tratamento 21º dia 35º dia 42º dia

T1 830,0 2019,9 2793,4

T2 1034,6 3061,2 4481,8

T3 1086,9 3071,1 4478,1

T4 1083,9 3115,1 4524,8

T5 1069,7 3089,2 4511,0

77
Tabela 3. Conversão alimentar (g/g) de frangos de corte com 21, 35 e 42 dias de idade
alimentados com dietas suplementadas com diferentes fontes e níveis de selênio

Tratamento 21º dia 35º dia 42º dia

T1 2,033 2,965 2,660

T2 1,291 1,612 1,760

T3 1,351 1,632 1,754

T4 1,372 1,643 1,790

T5 1,351 1,648 1,810

Tabela 4. Peso vivo total (PABT), peso da coxa (CX), sobrecoxa (SCX), peito (PT) e fígado (FIG)
(g) dos frangos abatidos aos 42 dias de idade alimentados com dietas suplementadas
com diferentes fontes e níveis de selênio

Tratamento PABT CX SCX PT FIG

T1 1652,9 164,2 217,6 342,8 45,1

T2 2547,8 254,1 350,1 610,1 60,6

T3 2529,6 250,6 350,3 598,4 59,1

T4 2511,4 253,8 340,9 596,9 57,2

T5 2484,6 254,6 340,6 571,7 58,5

Tabela 5. Percentagem (%) de coxa (PCX), sobrecoxa (PSCX), peito (PPT) e fígado (PFIG) em
relação ao peso vivo dos frangos abatidos aos 42 dias de idade alimentados com dietas
suplementadas com diferentes fontes e níveis de selênio

Tratamento PCX PSCX PPT PFIG

T1 9,92 13,15 20,69 2,73

T2 9,97 13,74 23,97 2,38

T3 9,91 13,85 23,65 2,33

T4 10,11 13,59 23,73 2,28

T5 10,25 13,70 22,99 2,36

78
79