差异表达基因（DEGs）筛选前的步骤

### 差异表达基因(DEGs)筛选前的预处理步骤 #### 数据质量控制 在进行差异表达基因筛选之前，确保输入数据的质量至关重要。这通常涉及去除低质量细胞和特征(基因)，以减少噪声并提高后续分析的有效性[^2]。 对于单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据而言，具体操作可能包括但不限于： - **过滤细胞**：移除具有异常高比例线粒体读数、总UMI计数过少或过多以及检测到极少数基因表达水平的潜在死细胞或双倍体事件。 - **过滤基因**：排除那些在整个样本集中几乎不活跃或者表现出极高变异性的基因，因为这些可能是技术噪音而非生物学信号造成的偏差。 ```r # R代码示例用于Cell Ranger输出矩阵的质量控制(QC) library(Seurat) # 加载原始count matrix文件 sce <- Read10X(data.dir = "path/to/cellranger_output/") # 创建Seurat对象 seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts = sce, project = "SampleProject", min.cells=3,min.features=200) # 进行初步QC统计计算 seurat_obj[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seurat_obj, pattern = "^MT-", col.name = "percent.mt") VlnPlot(object = seurat_obj, features = c("nCount_RNA","nFeature_RNA","percent.mt"), ncol = 3) # 基于设定阈值来选择合格单元格 seurat_filtered <- subset(x = seurat_obj, subset = nFeature_RNA > 200 & nCount_RNA > 2000 & percent.mt < 15) ``` #### 归一化与批效应校正 为了使不同批次间的数据可比较，在完成上述基本清理之后还需要执行归一化处理，并考虑是否存在由实验条件变化引起的批量效应(batch effect)[^1]。可以采用诸如`sva`(Surrogate Variable Analysis)这样的工具来进行批效应回归调整，从而获得更加纯净且一致的表现型关联模式。 ```r # 使用sva包进行批效应估计与回归 library(sva) mod <- model.matrix(~condition, data = colData(seurat_filtered)) mod0 <- model.matrix(~1, data = colData(seurat_filtered)) # 计算代理变量(Surrogate Variables) svobj <- sva(as.matrix(GetAssayData(seurat_filtered)), mod, mod0)$sv # 将SV加入元数据框作为协变量重新拟合模型 colData(seurat_filtered)$sv_1 <- svobj[,1] colData(seurat_filtered)$sv_2 <- svobj[,2] # 更新设计矩阵包含新的混杂因素 new_mod <- model.matrix(~ condition + sv_1 + sv_2 ,data = colData(seurat_filtered)) ``` #### 可视化评估 最后一步是对经过预处理后的数据集进行全面可视化检查，确认各项指标均处于合理范围内后再继续下一步骤的工作流。例如绘制PCA图观察样品聚类情况；利用热图展示各组内相似度等方法辅助判断整体结构合理性[^3]。 ```r # PCA降维投影查看主要成分分布状况 DimPlot(seurat_filtered,reduction="pca",group.by="orig.ident") # 构建层次聚类树形图直观呈现个体间关系远近程度 HeatmapMatrix <- FetchData(seurat_filtered,"RNA_snn_res.0.8") %>% as.matrix() rownames(HeatmapMatrix) <- rownames([email protected]) heatmap(t(scale(t(HeatmapMatrix))), scale='none') ```