Affymetrix HTA 2.0 has high coverage of probes that can measure coding and noncoding transcripts, containing >6.0 million probes covering > 200,000 coding transcripts and > 40,000 non-coding transcripts. This array has ten probes per exon and four probes per exon-exon splice junction, thus having an average of 100 probes cover one transcript. The raw microarray data was normalized using the Transcriptome Analysis Console (version 4.0.1) with exon-level SST-RMA. After normalization, 893,193 of 913,035 probes remained based on the transcript accession numbers. Then, we used the “ComBat” algorithm in SVA package in R language to remove batch effects (1). Here, we only included 558,258 probes representing coding probes for the subsequent analysis. We then used empirical Bayes (eBayes) statistics in the ‘limma package’ to determine which probes were significantly differentially expressed between patients with response and non-response to induction chemotherapy (IC) (2), and a total of 23,024 probes (eBayes P<0.05) were identified for further analysis.

<think>嗯，用户想了解Affymetrix HTA 2.0的探针覆盖情况，还有用R语言中的SVA包和limma包进行数据处理，包括批次效应去除和差异表达分析。首先，我需要先确认Affymetrix HTA 2.0芯片的基本信息，特别是探针覆盖的范围和设计特点。然后，关于数据处理流程，用户可能想知道整个分析步骤，从原始数据预处理到批次校正，再到差异表达分析的具体流程。 首先，关于HTA 2.0芯片，我记得它是高通量转录组分析芯片，覆盖全转录组和外显子区域。探针设计方面，Affymetrix的芯片通常每个基因会有多个探针，可能位于不同的外显子或剪接位点，这样可以检测不同的转录本变体。需要确认HTA 2.0的具体探针覆盖情况，比如是否包含注释信息，如RefSeq或Ensembl，以及是否覆盖非编码RNA区域。这部分可能需要查阅官方文档或者相关论文，比如引用中的GEO数据库处理可能有提到相关批次效应的问题。 接下来是R语言中的数据处理流程。用户提到了SVA包和limma包，还有ComBat用于批次效应去除。首先，SVA包中的ComBat函数常用于校正批次效应，这在引用[2]里提到的GEO数据库处理中有应用。需要解释ComBat的原理，它是基于经验贝叶斯方法调整批次间的均值差异，同时保持生物变异。而SVA包中的sva函数可能用于检测和校正潜在的混杂因素，比如在差异分析前使用。 然后是limma包的流程，包括读取数据、标准化、构建设计矩阵、线性模型拟合、eBayes平滑方差，最后得到差异表达基因。需要详细说明每一步骤，比如使用rma预处理，可能包括背景校正、归一化和汇总。之后用ComBat处理批次效应，然后使用limma的lmFit和eBayes进行统计分析。用户可能还需要知道如何设置设计矩阵，如何处理多因素实验设计，比如同时考虑处理因素和批次因素。 可能用户的问题还包括如何评估批次效应去除的效果，比如PCA分析前后对比，或者检查已知生物因素是否主导变异。此外，关于差异分析的阈值设定，比如p-value和logFC的截断值，以及多重检验校正方法（如BH法）。 需要确保回答中提到的R包函数用法正确，比如sva::ComBat和limma的处理流程。同时，注意用户提到的探针覆盖情况可能影响后续分析，比如不同探针对应不同转录本，可能需要注释文件进行转换，比如使用affy包或Bioconductor的注释数据库。 还要注意用户可能混淆了SVA包和ComBat的使用，因为ComBat现在可能包含在sva包中，而sva包还有其他功能，如surrogate variable analysis。需要明确说明步骤顺序：先预处理数据，然后去批次效应，再进行差异分析。 最后，用户可能的应用场景是处理来自不同批次的芯片数据，或者整合多个数据集的微阵列数据，这时候批次效应去除尤为重要，如引用[2]所述的不同平台或处理时间的影响。需要确保整个流程的连贯性和正确性，同时指出可能的注意事项，比如批次变量与生物因素的混杂，以及如何避免过度校正。</think>### Affymetrix HTA 2.0探针覆盖情况及数据处理流程解析 #### 1. **Affymetrix HTA 2.0探针覆盖情况** Affymetrix Human Transcriptome Array 2.0（HTA 2.0）芯片设计覆盖全转录组及外显子区域，具有以下特点： - **探针数量**：约6.0 million探针，覆盖编码和非编码RNA区域[^3]。 - **外显子覆盖**：每个基因平均包含约40个外显子探针，支持转录本异构体分析。 - **注释信息**：探针设计基于RefSeq、Ensembl等数据库，支持基因、外显子及剪接位点的精准检测[^1]。 #### 2. **数据处理流程（R语言）** **流程框架**： ``` 原始数据（CEL文件） → 预处理 → 批次校正（ComBat） → 差异表达分析（limma） ``` **详细步骤**： 1. **数据读取与预处理** - 使用`affy`或`oligo`包读取CEL文件，进行背景校正和归一化（如RMA算法）： ```r library(oligo) celFiles <- list.celfiles() rawData <- read.celfiles(celFiles) normalizedData <- rma(rawData) ``` 2. **批次效应去除（SVA::ComBat）** - 使用`ComBat`校正技术批次（如芯片批次、实验时间等）： ```r library(sva) batch <- c(rep(1,5), rep(2,5)) # 定义批次变量 combatData <- ComBat(exprs(normalizedData), batch = batch) ``` 3. **差异表达分析（limma）** - 构建设计矩阵并拟合线性模型： ```r library(limma) design <- model.matrix(~ group) # group为实验分组 fit <- lmFit(combatData, design) fit <- eBayes(fit) degResults <- topTable(fit, coef=2, number=Inf, adjust.method="BH") ``` **关键方法说明**： - **ComBat原理**：基于经验贝叶斯模型调整批次间的均值差异，保留生物信号[^2]。 - **limma的eBayes**：通过方差收缩（shrinkage）提高小样本数据分析的稳定性[^1]。 #### 3. **注意事项** - **批次变量定义**：需确保批次变量与生物因素无强关联，避免过度校正。 - **探针注释更新**：使用`Bioconductor`的注释包（如`hta20transcriptcluster.db`）确保探针对基因的映射准确性。 ---