BioL

 477  
 

 
 
Immunology  Lab  
Biology  477  
Lab  Manual  
 
Spring  2016  
Dr.  Julie  Jameson  
 
   
 BioL  477  
 
SOLUTIONS  AND  UNITS  OF  MEASURE  IN  BIOLOGY  
 
I.    Units  of  Measure  
 
Length  
 
meter  =  m  =  39.37  inches  
    centimeter  =  cm  =    0.39  inches  or  0.01  m  
    millimeter  =  mm  =  0.04  inches  or  0.001  m  
    micrometer  =  µm  =  one-­‐millionth  of  a  meter  or  10-­‐6  m  
    nanometer  =  nm  =  one-­‐billionth  of  a  meter  or  10-­‐9  m  
    angstrom  =  Å  =  0.1  nm  or  10-­‐10    m  
 
    a  prokaryotic  cell  =  1-­‐10  µm  in  diameter  
    a  eukaryotic  cell  =  10-­‐100  µm  in  diameter  
    large  organelles  such  as  nuclei,  mitochondria,  chloroplasts  =  1-­‐5  µm  in  
diameter  
    small  organelles  =  0.2-­‐1.0  µm  in  diameter  
    ribosome  =  25  nm  in  diameter  
    membranes  =  7-­‐10  nm  thick  
    actin  microfilament  =  7  nm  in  diameter  
    DNA  helix  =  2  nm  in  diameter  
 
Since  the  resolution  of  the  light  microscope  is  about  0.25  µm,  only  whole  cells  and  
large  organelles  may  be  observed,  even  under  the  best  conditions.  
 
Mass  
 
    gram  =  g  =  0.002  pounds  
    milligram  =  mg  =  .001  g  
    microgram  =  μg  =  one-­‐millionth  of  a  gram  or  10-­‐6  g  
    nanogram  =  ng  =  one-­‐billionth  of  a  gram  or  10-­‐9  g  
    picogram  =  pg  =  one-­‐trillionth  of  a  gram  or  10-­‐12  g  
 
  C.    Volume  
     
    liter  =  l    =  0.908  quarts;  volume  of  one  kilogram  of  water  at  4°  C    
    milliliter  =  ml  =  0.001  l,    the  volume  contained  in  a  cube  with      
      sides  of  1  cm;  one  ml  of  water  weights  1  g  at  4°  C  
    microliter  (µl)  =  one-­‐millionth  of  a  liter  or  10-­‐6  liter;  one  microliter  of    
      water  weighs  one  μg  
 
   
 BioL  477  
 
January  29,  2016  
 
1.  Safety  Training    
 
2.  Introduction  to  Immunological  Techniques  
 
  Cell  culture  
 
 
 
 
  ELISA  
 
 
 
 
 
  Flow  cytometry  
 
 
 
 
  Histology  
 
 
 
 
  Magnetic  cell  sorting  
 
 
 
 
3.  Lab  Notebooks  
   
  5  points  per  week  for  a  total  of  65  points  
   
  Must  have  in  lab  notebook:  Purpose,  Materials/Methods  from  the  lab  we  are  
going  to  do  and  Results/Data,  Discussion  of  data  for  the  lab  we  previously  did.  
 
4.  Lab  Reports  
 
  There  will  be  three  lab  reports.  Each  is  due  after  a  key  methods  section.  
Reports  will  be  required  to  have  a  title,  and  either:  (lab  report  1)  Methods  and  
Materials  used  (detailed  with  WHY  each  step  is  taken),  (lab  report  2)  Results  
(Figures  and  figure  legends  will  be  explained),  (lab  report  3)  Discussion  (put  the  
data  into  context  of  the  field  of  immunology).    All  three  reports  will  need  a  
 BioL  477  
 
bibliography  with  at  least  5  primary  research  articles  referenced.  You  will  be  
required  to  use  your  own  words  in  all  written  sections,  plagiarism  will  not  be  
tolerated.  
 
5.  Plagiarism  Policy:  
 
Students  are  responsible  for  honest  completion  and  representation  of  their  
work.  Plagiarism  will  not  be  tolerated  in  any  of  the  projects.  Any  evidence  of  
cheating  (including  plagiarism,  i.e.  presenting  the  words  or  ideas  of  others  as  your  
own,  cutting  and  pasting  phrases  from  the  internet,  copying  or  modifying  someone  
else’s  work)  will  result  in  a  failing  grade  for  that  assignment  and  possibly  a  failing  
grade  for  the  semester  for  the  course.  There  will  be  zero  tolerance  for  infractions.  
The  instructor  reserves  the  right  to  discipline  any  student  for  academic  dishonesty  
and  plagiarism,  in  accordance  with  the  general  rules  and  regulations  of  the  
university.    
Please  see  me  if  you  have  any  questions  about  what  exactly  constitutes  
plagiarism.  The  writing  center  is  available  to  help  any  students  struggling  with  the  
art  of  scientific  writing.  In  addition,  I  am  holding  a  scientific  writing  group  on  Wed  at  
noon  in  the  library  to  give  one-­‐on-­‐one  advice.  
 
6.  Methods  Presentations  
   
  Worth  85  points  (first  15  minutes  of  class)  includes:    
  1.    What  we  will  be  doing  for  this  assay  (describe  the  methods  with  an  
emphasis  on  why).  
  2.    Scientific  principles  of  the  assay  (how  does  it  work  scientifically?)  
  3.    Uses  of  the  assay  in  immunology  (past  and  present).  
  4.    An  example  of  current  published  research  that  has  used  this  method  
(show  a  figure  from  the  paper  and  explain  what  the  results  mean).    
 
Any  video  content  should  be  less  than  30  seconds  or  created  by  the  group.  
 
7.  Pipet  aid  training  
 
  Using  a  pipet  aid  can  be  frustrating  at  first  since  it  is  easy  to  accidentally  suck  
media  up  in  to  the  filter  at  the  top  of  the  pipet.  This  can  destroy  the  pipet  aid  and  
thus  we  will  practice  performing  the  measurement  of  liquid  with  pipet  aids.  
 
  1.  Hold  the  pipet  at  the  end  (never  touch  the  tip  that  goes  into  the  liquid),  pop  
the  end  out  of  the  paper  (if  this  is  a  sterile,  paper-­‐covered  pipet).  
 
  2.  Place  the  end  of  the  pipet  into  the  pipet  aid  securely.  Push  hard  enough  
that  it  fits  tight,  but  do  not  overly  shove  it  in.  
 
  3.  Place  the  tip  of  the  pipet  into  the  liquid  and  gently  push  on  the  top  button  
with  your  index  finger.  Start  very  gently  and  then  slowly  increase  pressure  until  you  
 BioL  477  
 
reach  the  desired  volume.  If  you  get  too  much  liquid,  gently  push  the  bottom  button  
with  your  middle  finger  to  push  liquid  out  of  the  pipet.    
 
  4.  Move  the  pipet  tip  to  the  desired  vessel  to  move  the  liquid  (i.e.  another  
empty  tube).  Gently  push  the  bottom  button  to  release  the  liquid  from  the  pipet.  
 
  5.  Practice  measuring  liquids  with  a  variety  of  pipets.    
 
For  your  purposes  in  this  class:    
Use  the  5  ml  pipet  for  liquid  volumes  of  4  ml  or  less.    
The  10  ml  pipet  for  liquid  volumes  from  9  ml  to  4  ml.    
The  25  ml  pipet  for  liquids  from  24  ml  to  9  ml.    
 
 
1.  Pipet  3  ml,  6  ml,  9  ml,  12  ml,  15  ml  and  18  ml  of  liquid.  Move  the  water  
from  a  50  ml  tube  to  a  fresh  15  or  50  ml  tube  and  verify  the  volume  you  moved.  Let  
the  professor  know  immediately  if  the  filter  at  the  top  of  the  pipet  becomes  wet  due  
to  overpipeting.  
2.  Practice  until  you  are  confident  in  your  ability  to  pipet  the  liquid.  
 
 
8.    Rules  in  the  Tissue  Culture  Room  
 
9.    Design  Experiments  for  Part  1  
  Key  aspects  of  design  (Cell  number,  Cell  type,  Read-­‐out,  Methods  Used)  
  Lab  math  
  In  vivo  versus  In  vitro  studies  
  Clinical  research    
 BioL  477  
 
February  5,  2016  
1.  Introduction  to  Cell  Culture  Techniques  (Watch  Video  from  link  below)  
 
The  ability  to  culture  cells  outside  the  natural  environment  (i.e.  from  an  animal  or  
plant)  has  been  named  one  of  “medicine’s  ten  great  discoveries”.  One  of  the  first  
biology  courses  in  the  US  was  taught  at  Yale’s  Sheffield  Scientific  School  in  1870.  
Ross  Harrison  was  recruited  to  start  a  new  zoology  department  there  in  1907.  Dr.  
Harrison  had  been  studying  how  to  culture  amphibian  embryo  neural  tube  
fragments  using  tissue  culture  techniques  and  his  data  were  published  over  the  next  
three  years  elucidating  the  principles  of  short-­‐term  cell  culture  (Harrison,  1910).  
His  initial  breakthrough  occurred  when  he  added  the  cells  to  fresh  frog  lymph  and  
used  a  hanging  drop  technique  for  culture  (see  below).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Primary  Cell  Cultures:  Cells  cultured  directly  from  an  animal  or  plant.  Many  cell  
types  only  survive  a  set  number  of  divisions  before  undergoing  senescence  or  losing  
the  ability  to  proliferate.  
 
Cell  Lines:  When  primary  cells  are  subcultured,  or  transferred  in  small  numbers  to  a  
new  vessel  to  continue  proliferation,  they  are  called  a  cell  line.  Some  cell  lines  
undergo  senescence,  while  others  undergo  transformation,  either  spontaneously  or  
induced,  and  become  immortal  (i.e.  HeLa,  A20  B  cell  lymphoma).  
 
When  subcultured  cells  are  further  selected  and  propagated  they  are  called  a  cell  
strain,  which  may  have  undergone  a  variety  of  genetic  changes  distinguishing  it  
from  the  primary  cell  culture.  
 
Growth  Characteristics:  
Suspension  Cells:  grow  without  attaching  to  the  flask  or  culture  vessel.  
 
Adherent  Cells:  attach  to  the  surface  of  the  flask  creating  a  monolayer.    
 
General  Cell  Culture  Conditions:  
Each  cell  type  has  unique  requirements  for  culture  in  vitro,  however  several  
variables  are  generally  consistent.  
1. Media  (solid  or  liquid)-­‐  includes  amino  acids,  vitamins,  minerals,  
carbohydrates  for  survival  
2. Growth  Factors  
3. Hormones  
 BioL  477  
 
4. Gases  
5. A  stable  environment  with  constant  physiological  temperature,  pH,  and  
osmotic  pressure  
6. Antibiotics  
 
Sterile  Technique  
Dirt,  dust,  spores,  bacteria  live  on  surfaces  and  in  the  air.  To  keep  cell  cultures  from  
becoming  contaminated  it  is  important  to  follow  rules  of  sterility.  
1. Keep  the  working  space  clear.  Only  have  necessary  bottles,  pipets  and  
containers  in  the  biosafety  hood  when  working  with  cells.  
2. Keep  surfaces  clean.  Wipe  everything  down  with  70%  EtOH:  bottles  
(prior  to  entering  biosafety  hood),  surfaces  in  the  hood,  your  gloves,  and  
pipets.  
3. Only  use  “sterile”  media  and  reagents.  A  solution  is  only  considered  
sterile  if  it  has  never  been  opened  outside  the  hood.  Pipets  and  pipet-­‐tip  
boxes  must  only  be  opened  in  the  biosafety  cabinet.  
4. Minimize  hand  motion,  especially  over  any  open  tubes,  bottles,  flasks  or  
plates.  Place  everything  in  an  easy  to  reach  and  maneuver  spot.  
5. Prepare  well  prior  to  beginning  in  order  to  have  everything  needed  for  
your  cell  culture  work.  
6. If  you  need  to  put  a  sterile  cap  down,  put  it  down  face  up.  
7. Wear  gloves  to  protect  your  cells  from  you  and  you  from  your  cells!  
 
We  will  be  using  a  Class  II  Biosafety  Cabinet,  which  creates  a  barrier  between  the  
sterile  environment  and  the  outside  air  by  using  HEPA  filtered  air.  Movement  of  
arms  in  and  out  of  the  cabinet  breaks  the  air  curtain  disturbing  the  flow.  Therefore,  
do  not  block  the  airflow  and  work  at  least  6  inches  inside  of  the  hood.    
 
Signs  of  Contamination:  Watch  the  media  for  dramatic  changes  in  color.  The  pH  
indicator  will  turn  yellow  when  acidic  or  purple  for  alkaline.  If  media  becomes  
yellow,  the  culture  is  overgrown  or  contaminated.  Purple  indicates  dead  cells  or  no  
growth.  Similarly  cloudy  media  suggests  contamination  or  overgrowth.  If  adherent  
cells  come  off  from  the  flask  or  if  suspension  cells  clump  up,  contamination  is  also  
possible.  Observe  cells  at  a  higher  magnification,  bacteria  will  appear  in  the  
cytoplasm  or  media  as  small  moving  columnar  objects.  
 
Videos:  
http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/Cell-­‐
Culture/videos/CellCultureBasics.html?CID=ccbvid1  
 
References:  
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/gibco-­‐cell-­‐culture-­‐
basics/introduction-­‐to-­‐cell-­‐culture.html      
 
Harrison,  R.  (1910)  The  outgrowth  of  the  nerve  fiber  as  a  mode  of  protoplasmic  
movement.  J.  Exp.  Zool.  9:787-­‐846.    
 BioL  477  
 
2.  MAKE  MEDIA  
We  will  prepare  two  kinds  of  media  for  the  cells  we  are  growing  this  semester.    
10%  FCS  in  DMEM  and  
10%  FCS  in  RPMI  
 
1.  First  squirt  all  materials  with  70%  ethanol  prior  to  putting  them  in  the  
hood.  Lightly  loosen  any  caps  within  the  hood  of  liquids  that  you  will  be  moving.    
 
  2.  Using  the  50  ml  conical  tube  to  hold  your  media  add  each  of  the  following  
to  both  your  40  ml  of  DMEM  and  your  40  ml  of  RPMI:  
    4  ml  of  FCS  
    .5  ml  Pen/Strep/Glu  
    .5  ml  nonessential  amino  acids  
    .5  ml  sodium  pyruvate  
    1.25  ml  Hepes  
    40ul  of  β-­‐2me  (this  is  a  stinky,  and  nasty  chemical,  add  quickly  and  
shut  the  tube,  wash  the  pipet  tip  in  the  media  you  add  it  to)  
 
3.  Label  your  tubes  well!!  
How  do  we  label  tubes?    
With  group  name,  date,  and  what  has  been  added  to  the  tube.  
 
3.  THAW  CELLS  FOR  GROWING  (this  will  be  done  prior  to  class)  
 
To  thaw  cells  you  have  to  act  quickly.  The  cells  have  been  frozen  in  DMSO  which  is  
toxic  to  them  once  they  thaw  out  in  the  media.  The  cells  will  be  thawed  using  a  37C  
water  bath.  Once  the  tube  has  only  one  small  piece  of  ice  left  immediately  squirt  
with  ethanol  and  place  it  in  the  biosafety  hood.    
 
1. Remove  the  liquid  from  the  vial  and  place  it  in  10  ml  of  10%  DMEM  in  a  15  
ml  conical  tube  (it  is  best  to  already  have  the  10  ml  of  10%  DMEM  in  the  tube  
you  are  transferring  to).    
 
2. Spin  the  cells  down  into  a  pellet  using  a  table  top  centrifuge  at  1250  RPM  for  
5  minutes  (this  is  a  typical  “wash”  for  cells).  
 
3. The  cell  pellet  will  be  at  the  bottom  of  the  tube  while  the  supernatant  is  the  
liquid  above  that.  
 
4. Inside  the  biosafety  hood  remove  and  dispose  of  the  supernatant  by  putting  
the  supernatant  in  the  liquid  waste.    
 
5. Add  10  ml  of  fresh  10%  DMEM  to  the  cell  pellet,  put  on  the  cap  and  disrupt  
the  pellet  using  a  vortex.  
 
 BioL  477  
 
6. After  vortexing  remove  1  ml  of  the  well  mixed  cell  suspension  and  put  it  in  a  
15  ml  conical  tube  (this  will  be  taken  to  the  lab  for  counting  at  your  lab  
bench).  
 
7. Wash  the  cells  in  10ml  of  10%  DMEM  using  centrifugation  again  (as  in  step  
2).  
 
8. Remove  supernatant  and  place  the  cells  in  10  ml  of  fresh  10%  DMEM.  
Resuspend  the  cells  using  the  vortex  and  move  the  cells  and  media  into  a  T25  
flask  with  filter.  
 
9. Label  the  flask  well.  
 
4.  COUNTING  AND  SEEDING  CELLS  
 
Prepared  back  at  your  bench  and  viewed  in  microscope.  Once  the  cells  are  in  trypan  
blue  you  must  count  quickly  since  they  will  eventually  all  die  and  take  up  the  trypan  
blue.  
 
1. Dilute  10ul  of  your  cell  sample  into  40  ul  trypan  blue  working  solution.  This  
is  a  __:__  dilution.  
 
2. Clean  the  coverslip  and  hemocytometer  with  ethanol.  Let  it  dry.  Place  the  
coverslip  on  the  hemocytometer.  
 
 
3. Take  all  50  ul  of  the  cell  sample  +  trypan  blue  solution  into  the  pipetman  and  
allow  about  20  ul  to  be  taken  under  the  slide  on  each  side  using  capillary  
action.  
 
4. Immediately  place  the  hemocytometer  on  the  stage  of  the  microscope  and  
locate  the  grids  at  low  power.  
 
 
5. Count  cells  within  one  large  grid  (“A”  with  16  very  small  squares).  It  is  
easiest  to  move  to  one  of  the  corner  grids  (i.e.  A,  B,  C  or  D)  and  increase  the  
magnification  of  the  microscope  so  the  grid  takes  up  the  entire  space.  
 BioL  477  
 

 
6. Count  the  viable  (not  blue)  cells  in  the  upper  left  1-­‐mm  square  grid  (“A”  with  
16  very  small  squares).  Repeat  with  each  corner  grid  “B”,  “C”,  and  “D”  so  that  
you  have  four  numbers.  Average  the  numbers.    
 
7. Do  the  same  but  only  count  dead  (blue)  cells.  
 
8. Calculate  the  number  of  viable  cells  per  ml  using  the  formula:      
  Average  #  of  cells  in  one  grid  x  10,000  x  dilution  factor  =  #  of  cells/ml  
 
9. Calculate  the  percentage  of  viable  cells  by  dividing  the  viable  cells  in  one  grid  
by  the  viable  +  dead  cells  in  one  grid  (total  cells)  and  multiply  by  100.  
 
10. 80%  viability  or  less  suggests  cells  are  not  healthy.  
 
11.  How  many  cells  do  you  have  per  ml?  
 
 
12.  How  many  ml  are  left  in  your  cell  culture?  
 
 
13. Thus,  how  many  cells  are  now  in  your  flask?  
   
 BioL  477  
 
 
February  12,  2016  
Harvest  Cells,  Count  Cells,  Activate  Cells,  and  Harvest  Supernatant  
 
Harvest  Cells  in  Biosafety  Cabinet  
1.  Cells  will  be  removed  from  the  T25  flask  by  scraping  with  a  cell  scraper.  
2.  Place  cells  and  media  in  a  15  ml  conical  tube.  Vortex  well.  
3.  Count  cells.  
4.  Place  1x105  cells/well  in  6  wells  of  a  96-­‐well  flat  bottom  plate  in  200ul  of  10%  
RPMI.  
5.  Add  LPS  (1ug/ml)  to  the  experimental  wells  (3  wells)  and  No  LPS  to  the  control  
wells  (3  wells).  
6.  Incubate  at  37C  for  48-­‐72  hours.  
7.  Identify  students  who  would  like  to  come  and  harvest  the  supernatant  and  freeze  
in  the  -­‐80C.  
8.  To  harvest  supernatant,  use  a  p200  pipet  to  remove  the  top  100ul  of  supernatant  
only  (leaving  the  cells).  Place  into  a  96  well  plate  (well  labeled).  Seal  plate  with  
parafilm  and  freeze  the  plate  in  the  -­‐80C.    
 
 
 
 
 
 
 
 
 BioL  477  
 
February  19,  2016  
Perform  ELISA  on  Supernatants  from  Last  Week  
 
TNF-­‐a  ELISA  
1.  (TNF  ELISA  READY  SET  GO,  eBiosciences)  Coat  ELISA  plate  with  100  μL/well  of  
capture  antibody  in  Coating  Buffer  (dilute  as  noted  on  C  of  A,  which  is  included  with  
the  reagent  set).    Seal  the  plate  and  incubate  overnight  at  4°C.    
 
2.  Aspirate  wells  and  wash  3  times  with  >250  μL/well  Wash  Buffer*.  Allowing  
time  for  soaking  (~  1  minute)  during  each  wash  step  increases  the  effectiveness  of  
the  washes.  Blot  plate  on  absorbent  paper  to  remove  any  residual  buffer.    
 
3.  Dilute  1  part  5X  concentrated  Assay  Diluent  with  4  parts  DI  water.*  Block  wells  
with  200  μL/well  of  1X  Assay  Diluent.  Incubate  at  room  temperature  for  1  hour.    
 
4.  Optional:  Aspirate  and  wash  at  least  once  with  Wash  Buffer.  
 
5.  Using  1X  Assay  Diluent*,  dilute  standards  as  noted  on  the  C  of  A  to  prepare  the  top  
concentration  of  the  standard.  Add  100  μL/well  of  top  standard  concentration  to  the  
appropriate  wells.  Perform  2-­‐fold  serial  dilutions  of  the  top  standards  to  make  the  
standard  curveor  a  total  of  8  points.  Add  100  μL/well  of  your  samples  to  the  
appropriate  wells.  Seal  the  plate  and  incubate  at  room  temperature  for  2  hours  (or  
overnight  at  4°C  for  maximal  sensitivity).    
 
6.  Aspirate/wash  as  in  step  2.  Repeat  for  a  total  of  3-­‐5  washes  **.    
 
7.  Add  100  μL/well  of  detection  antibody  diluted  in  1X  Assay  Diluent*  (dilute  as  
noted  on  C  of  A).  Seal  the  plate  and  incubate  at  room  temperature  for  1  hour.    
 
8.  Aspirate/wash  as  in  step  2.  Repeat  for  a  total  of  3-­‐5  washes  **.  
 
9.  Add  100  μL/well  of  Avidin-­‐HRP*  diluted  in  1X  Assay  Diluent  (dilute  as  noted  on  C  
of  A).  Seal  the  plate  and  incubate  at  room  temperature  for  30  minutes.  
 
10.  Aspirate  and  wash  as  in  step  2.  In  this  wash  step,  soak  wells  in  Wash  Buffer*  for  
1  to  2  minutes  prior  to  aspiration.  Repeat  for  a  total  of  5-­‐7  washes  **.  
 
11.  Add  100  μL/well  of  Substrate  Solution  to  each  well.  Incubate  plate  at  room  
temperature  for  15  minutes.    
 
12.  Add  50  μL  of  Stop  Solution  to  each  well.    
 
13.  Read  plate  at  450  nm.  If  wavelength  subtraction  is  available,  subtract  the  values  
of  570  nm  from  those  of  450  nm  and  analyze  data.  
 
   
 BioL  477  
 
February  26,  2016  
Analyze  Data  from  Last  Week  
See:  http://www.abcam.com/protocols/calculating-­‐and-­‐evaluating-­‐elisa-­‐data  
 
AND  for  help  on  using  Excel:  
http://encorbio.com/protocols/ELISA-­‐Excel.htm  
 
 
   
 BioL  477  
 
 
March  4,  2016  
Making  a  Single  Cell  Suspension  from  Spleen  and  Thymus  
1.  Each  team  will  either  place  a  spleen  or  a  thymus  in  5  ml  10%  DMEM.  
2.  Mash  the  organ  with  the  rough  end  of  the  sterile  slides  (use  a  fresh  set  of  slides  
for  each  organ).  Remove  the  remaining  organ  pieces  and  throw  them  away  in  the  
biohazard  trash.  
3.  Move  cells  to  a  15  ml  conical  tube  (one  for  each  organ).  
4.  Underlay  the  spleen  cells  with  5  ml  of  Lympholyte  M.  Keep  the  thymocytes  on  ice.  
5.  Centrifuge  the  splenocytes  for  10  minutes  at  1450  RPM  in  table  top  centrifuge  
with  rotor  for  15  ml  tubes.    
6.  Remove  the  splenocytes  from  the  interface  between  the  media  and  the  
lympholyte  M  (it  should  look  cloudy).  Place  them  in  a  fresh  15  ml  tube  with  5  mls  of  
10%  DMEM.  
7.  Spin  down  thymocytes  and  splenocytes  in  centrifuge  at  1250  RPM  for  5  minutes.  
8.  Discard  supernatant.    
9.  Vortex  cells.  Add  10  ml  of  FACS  wash  buffer.  
10.  Count  cells.    
11.  Add  1x106  cells  per  small  5ml  conical  tube  (FACS  tube)  
12.  Each  group  will  need  to  prepare  the  following  FACS  tubes:  
  A.  Unstained  splenocytes/thymocytes  
  B.  Splenocytes/thymocytes  +  anti  CD3  Fitc  
  C.  Splenocytes/thymocytes  +  anti  CD4  APC  
  D.  Splenocytes/thymocytes  +  anti  CD8  PerCP  
  E.  Splenocytes/thymocytes  +  anti  B220  PE  
  F.  Splenocytes/thymocytes  +  all  four  antibodies  
13.  After  labeling  the  tubes,  add  the  correct  amount  of  cells  to  the  correct  tubes.  
14.  Spin  down  cells  in  centrifuge  at  1250  RPM  using  table  top  centrifuge  with  5  ml  
tube  insert.  
15.  Discard  supernatant.  
16.  Each  tube  will  have  100ul  of  facs  wash    
17.  Add  1ul  of  antibodies  to  appropriate  tubes.  Vortex.  
18.  Incubate  on  ice,  covered  for  30  minutes.  Vortex  at  least  once.  
19.  Add  4  ml  facs  wash  to  each  tube.  
20  Spin  down  cells  in  centrifuge  at  1250  RPM  using  table  top  centrifuge  with  5  ml  
tube  insert.  
21.  Discard  supernatant.  
22.  Vortex  cells.  Add  300ul  of  FACS  Fixative.  Vortex,  cap  tightly,  put  in  tube  rack  and  
cover  with  foil.  
 
   
 BioL  477  
 
March  11,  2016  
Run  stained  cells  on  flow  cytometer  from  last  week  
Read  flow  cytometry  guide  on  CC  before  class.  
 
During  class  review  how  to  do  a  “Results”  section  of  a  lab  report.  
 
 
 
 
   
 BioL  477  
 
March  18,  2016  
 
Analyze  Flow  Cytometry  Data  
 
Use  the  Accuri  flow  cytometry  program  to  analyze  and  interpret  your  data.  Save  
plots  for  your  lab  report  and  make  tables  that  summarize  your  data.  
 
   
 BioL  477  
 
April  1,  2016  
 
Stain  Spleen  and  Thymus  Sections  for  T  cell  and  B  cell  zones-­‐  
Immunofluorescent  Microscopy  
 
1.  Each  group  will  receive  1  slide  with  spleen  sections  and  one  slide  with  thymus  
sections  5um  thick.  
2.  Use  pap  pen  to  draw  around  the  sections  on  the  slide  
3.  Add  4%  Formaldehyde  using  a  p1000  to  cover  all  sections  (about  300ul).  
Incubate  1-­‐2  minutes.  Make  sure  the  sections  do  not  dry  out  at  any  point  in  the  
procedure.  
4.  Add  PBS  to  sections,  fully  covering  them.  
5.  Block  sections  with  blocking  buffer.  Incubate  for  30  minutes.  
6.  Add  primary  antibodies  with  2%FCS  in  PBS.  The  antibodies  should  be  diluted  
1:150  in  the  2%FCS  in  PBS.  Antibodies  to  be  used  are:  CD3  Fitc,  B220  PE  
7.  Incubate  for  1  hour  at  37C.  
8.  Dump  antibody.  
9.  Add  2%FCS  in  PBS  for  3-­‐5  minutes  to  wash  the  sections.  Keep  covered.  
10.  Add  mounting  media  with  DAPI  and  coverslips.  
 
Image  the  slides  at  Science  Hall  1,  microscope  room.  
 
   
 BioL  477  
 
April  8,  2016  
 
Analyze  Data  from  Microscopy  Experiment  
 
Use  photoshop  to  examine  images  and  make  into  figures  for  the  report.  
 
   
 BioL  477  
 
April  15,  2016  
 
Done  in  Biosafety  Cabinet:  Polarization  of  T  cells  into  TH1  cells  
1.  The  night  before  the  experiment:  Coat  a  24-­‐well  plate  with  anti-­‐CD3  at  1  ug/ml  
and  anti-­‐CD28  at  2  ug/ml.  Sterile!!!  
 
2.  Harvest  splenocytes  as  in  March  4,  2016  protocol  steps  2-­‐10.  Done  by  instructor.  
 
3.  Plate  1x106  cells/ml  in  2ml  per  well  in  two  wells  of  a  coated  24-­‐well  plate.  
 
4.  ADD  100U/ml  IL-­‐2,  10  ng/ml  IL-­‐12,  and  anti-­‐IL4  antibody  at  10ug/ml  (for  TH1  
polarization)  to  one  well  of  the  coated  plate.  Just  add  100U/ml  of  IL-­‐2  to  the  other  
well  of  the  coated  plate.  
 
5.  On  Day  3:  Pool  2  wells  of  TH1  cells  into  a  6  well  plate  containing  2  more  ml  of  
fresh  media  with  IL-­‐2  100U/ml.  Do  the  same  with  cells  from  the  IL-­‐2  alone  control  
coated  plate.  
 
 
 
 
   
 BioL  477  
 
April  22,  2016  
 
Intracellular  IFN-­‐γ  production  by  TH1  Cells  
1.  Stimulate  cells  with  PMA  (50  ng/ml)-­‐Ionomycin  (1uM)  for  5  hours  with  Bref  A  
(1ug/ml).  
 
2.  Harvest  cells  and  place  in  facs  tubes.  
 
3.    Each  group  will  need  to  prepare  the  following  FACS  tubes:  
  A.  Unstained  cells  
  B.  skewed  cells  +  anti  CD3  Fitc  
  C.  skewed  cells  +  anti  CD4  APC  
  D.  skewed  cells  +  anti  CD8  PerCP  
  E.  skewed  cells  +  anti  cytokine  (either  IL-­‐2  or  IFN-­‐g  or  TNF)  PE  
  F.  skewed  cells  +  all  four  antibodies  (B-­‐E)  
  G.  unskewed  cells  +  all  four  antibodies  (B-­‐E)  
 
 
3.  Wash  with  facs  buffer  and  follow  intracellular  cytokine  protocol  in  kit.  Details  at:  
http://www.bdbiosciences.com/ds/ab/others/559311%20Book_Website.pdf  
 
 
 
   
 BioL  477  
 
April  29,  2016  
 
Run  Stained  Cells  on  Flow  Cytometer  
 
Re-­‐read  flow  cytometry  guide  on  CC  before  class.  
 
During  class  review  how  to  do  a  “Discussion”  section  of  a  lab  report.  
 
   
 BioL  477  
 
May  6,  2016  
 
Analyze  Intracellular  IFN-­‐γ  production  by  TH1  Cells  
 
Use  the  Accuri  flow  cytometry  program  to  analyze  and  interpret  your  data.  Save  
plots  for  your  lab  notebook  and  summarize  your  data  and  what  it  means  to  the  field  
of  Immunology  for  interpretation  in  the  discussion  of  the  lab  report.