Principles of

Instrumental Analysis

Youngsoo Kim
Molecular Luminescence Spectrometry

 Theory of Fluorescence and Phosphorescence

 Instruments for measuring Fluorescence and Phosphorescence

 Applications of Photoluminescence Methods

 Chemiluminescence
Molecular Luminescence Spectrometry

광/발광(photoluminescence)
형광 : 전자 스핀 유지, 짧은 수명
인광 : 전자 스핀 변화, 긴 수명
들뜸 복사선보다 긴 파장

화학/발광(chemiluminescence)
화학 반응 중에 형성된 들뜬 화학종에 의한 복사선의 방출에 기반

발광 방법의 특징
무기 및 유기 화학종을 정량적으로 측정
고유한 감도 : 흡수 분광법에서 발생하는 것보다 낮은 검출 한계
흡수법에서보다 훨씬 큰 선형 농도 범위
 Theory of Fluorescence and
Phosphorescence
Resonance fluorescence
: the absorbed radiation is reemitted without a change in
frequency

For Na,
: excitation 3s → 3p: absorption at 589.6 nm and 589.0 nm
: relaxation 3p → 3s: emission at 589.6 nm and 589.0 nm

Stoke shift
: molecular fluorescence bands center at wavelength
longer than the resonance line
→ shift toward longer wavelength
Excited states producing fluorescence and
phosphorescence
Electron spin

Pauli Exclusion Principle

- No two electrons in an atom can have the same set of four quantum number
- No more than two electrons occupy an orbitals and furthermore the two have opposed
spin state
- spin paring: diamagnetic
- free radicals, which contain unpaired electrons: paramagnetic
Excited states producing fluorescence and
phosphorescence
Singlet and triplet excited states

Singlet state
: A molecular electronic state in which all electron spins are pared
: No splitting of electronic energy levels occurs when the molecule is exposed to the magnetic field

Excited singlet state

: the spin of the promoted electrons is still paired with the ground-state electrons
: Diamagnetic

Excited triplet state

: the spins of the two electrons have become unpaired, thus parallel (paramagnetic)
: the excited triplet state is less energetic than the corresponding excited singlet state
Excited states producing fluorescence and
phosphorescence
Excited singlet vs. Excited triplet

Energy: excited singlet > excited triplet

Excitation probability: singlet ↔ singlet > singlet ↔ triplet

Absorption: singlet ↔ singlet > singlet ↔ triplet

Average lifetime: excited triplet (10-4s ~ several s) > excited singlet (10-8)

Phosphorescence emission: excited singlet → excited triplet → ground state

 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
Jablonski diagram
 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
Rates of absorption and emission
Rate of photon absorption: 10-14 ~ 10-15 s

Rate of emission
Fluorescence emission: 10-5 ~ 10-10 s, (singlet-singlet transition)
Phosphorescence emission : 10-4 ~ 10 s, (triplet-singlet transition)
 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
Deactivation processes
An excited molecule can return to its ground state by a combination of several
mechanistic steps (AKA, Relaxation or recombination process)

: Radiative emission process: fluorescence and phosphorescence

: non-radiative emission process: involves vibration relaxation, internal conversion,
external conversion

- most favored route to the ground state is the one that minimizes the lifetime of the
excited state
 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
1) Vibrational relaxation

- Collisions between molecules of the excited species and those of the solvent
→ rapid energy transfer
→ minuscule increase in temperature of solvent

- Lifetime of vibrationally excited molecules (10-12) < average lifetime of electronically

excited state (10-5 ~ 10-10 s)
→ fluorescence always involves a transition from the lowest vibrational level of an
excited electronic state
→ stoke shift
 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
2) Internal conversion
- 복사선의 방출 없이 분자를 낮은 에너지 전자 상태로 만드는 분자 간 과정

- 같은 다중도의 두 상태 사이의 교차(단일 - 단일, 삼중 - 삼중)

- 전자 에너지 준위가 비슷하여 진동 에너지 준위가 서로 겹치게 될 때 효율적

들뜸
λ1 : S0 → S1
λ2 : S0 → S2

방출 : λ3
S2 → S1 : λ3
S1 → S0 : λ3
형광 파장 : 들뜸 파장과 무관
 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
Quinine
들뜸 파장 : 250 nm, 350 nm
최대 방출 파장 : 450 nm
 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
2-1) Predissociation
Occurs when an electron moves from a higher electronic
state to an upper vibrational level of a lower electronic
state in which the vibrational energy is enough to cause
rupture of a bond

vs.

Dissociation
the absorbed radiation directly excites the electron of a chromophore to a sufficiently
high vibrational level to cause rupture of the chromophoric bond.
→ No internal conversion
 Energy-level diagrams for
photoluminescent molecules
3) External conversion
- 들뜬 분자와 용매 또는 다른 용질 사이의 상호작용 및 에너지 전달을 포함하는 과정

- 증거 : 대부분의 화학종의 형광 강도에 대한 현저한 용매 효과

낮은 온도, 높은 점성 조건에서는 용매와의 충돌이 줄어들게 되어 형광의
세기가 증가한다.
4) Intersystem crossing
- 다중성이 다른 전자 상태 사이에서의 교차
- S1 → T1
- 두 상태의 진동 준위가 겹칠 때 쉽게 발생
- 중원자 효과 : 아이오딘, 브로민 등 무거운 원자가 있는 분자에서 주로 발생

5) Phosphorescence
- 계간 교차 → 내부 전환, 외부 전환, 인광
- 삼중항 → 단일항 전이 : 낮은 가능성, 긴 수명
- 복사선 조사가 끝난 후에도 지속
 Variables affecting fluorescence and
phosphorescence
분자 구조와 화학적 환경
- 발광 여부
- 발광 세기

양자 수득률
- 양자 효율(quantum efficiency)
- 발광하는 분자의 수와 들뜬 분자의 총 수와의 비율, 𝜙𝜙

𝑘𝑘𝑓𝑓
𝜙𝜙 =
𝑘𝑘𝑓𝑓 + 𝑘𝑘𝑖𝑖 + 𝑘𝑘𝑒𝑒𝑒𝑒 + 𝑘𝑘𝑖𝑖𝑖𝑖 + 𝑘𝑘𝑝𝑝𝑝𝑝 + 𝑘𝑘𝑑𝑑

k : 비활성화 과정의 속도상수

f : 형광, i : 계간 교차, ec : 외부 전환, ic : 내부
전환, pd : 선해리, d : 해리
 Variables affecting fluorescence and
phosphorescence
Transition types in fluorescence
250 nm 이하의 UV 흡수
- 높은 에너지(200 nm = 140 kcal/mol)
→ 선해리나 해리에 의해서 들뜬 상태의 비활성화

- σ*→ σ 전이에 의한 형광은 드물게 관찰

- 형광은 가장 일반적으로 첫 번째 들뜬 전자 상태의 최저 진동 준위로부터 전자

바닥 상태의 진동 준위 중 하나로 전이됨에 따라 발생

- 𝜋𝜋∗→ n 혹은 𝜋𝜋∗ → 𝜋𝜋 전이 중에서 에너지가 덜한 것에 의해 복사선이 생성

 Variables affecting fluorescence and
phosphorescence
Quantum efficiency and transition type

양자 효율 : π*→ π > π*→ n

몰흡광 계수 : π → π* > n → π*

평균 수명 : π* → π (10-7~10-9 s) < π*→ n (10-5~10-7 s)

들뜬 상태는 짧은 평균 수명을 나타내며 형광과 경쟁하는 비활성화 과정이 덜

일어나기 때문에 형광은 더 일반적으로 π, π* 상태와 연관
 Variables affecting fluorescence and
phosphorescence
Fluorescence and structure
Strong and useful fluorescence

- 낮은 에너지의 π → π* 전이를 하는 방향족 작용기를 가지고 있는 화합물

- 대부분의 방향족 탄화수소는 형광 방출

- 양자 효율은 고리 수와 축합의 정도에 따라 증가

몰흡광 계수 증가, 들뜬 상태의 수명 감소

→ 형광 발생
 Variables affecting fluorescence and
phosphorescence
벤젠 고리 + 치환체
- 흡수 λmax의 이동 → 형광 파장 이동
- 할로젠 치환 : 형광의 세기 감소(중원자 효과)
 Effect of structural rigidity in
fluorescence
단단한 구조를 가진 분자에서 높은 형광을 나타냄
- fluorene vs. biphenyl : CH2에 의해 구조의 경직성이 증가

양자
효율

>
8-
HQ
Lack of rigidity in a molecules ↓
→ enhanced internal conversion rate (kic)
→ consequent increase in the probability for non-radiative deactivation
 Temperature and solvent effect

The quantum efficiency of fluorescence in most molecules:

- decreases with increasing temperature
→ increased frequency of collision at elevated temperatures improves the probability
for deactivation by external conversion

- decreases in solvent viscosity

→ increases probability of external conversion, resulting in decreasing in quantum
efficiency

The fluorescence of a molecules

- decreased by solvents containing heavy atoms or other solute with heavy
atoms in their structure (ex, carbon tetrabromide, ethyliodide, etc)
 Effect of pH on fluorescence

The fluorescence of a aromatic compound with acidic or basic ring substituents

is usually pH dependent
- the emission intensity are likely to be different for the protonated and unprotonated
forms of the compound
→ differing number of resonance species that are associated with the acidic and basic
forms of the molecules

→ Additional resonance forms leads to a more stable first excited state, resulting in
consequence of fluorescence in the UV region
 Effect of pH on fluorescence

The fluorescence of a aromatic compound with acidic or basic ring substituents

is usually pH dependent
- the fluorescence of certain compounds as a function of pH have been used for the
detection of end-point in acid-base titration
ex) the fluorescence of 1-naphtol-4-sulfonic acid is found in the UV region
→ phenolate by the addition of base, emission band shift to the visible wavelength

In the presence of dissolved oxygen reduces the intensity of fluorescence in

solution
- photochemically induced oxidation of the fluorescing species
 Effect of concentration on fluorescence
intensity
The power of fluorescence emission F
𝐹𝐹 = 𝜙𝜙𝑓𝑓 𝐾𝐾 ′′ 𝑃𝑃0 − 𝑃𝑃 = 𝐾𝐾 ′ 𝑃𝑃0 − 𝑃𝑃
P0: power of incident beam, P is the power after traversing a length b,
ϕf is quantum efficiency, K'' is constant

F to the concentration of c of fluorescing species, rewrite Beer’s law in the form

𝑃𝑃
= 10−𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏
𝑃𝑃0
𝐹𝐹 = 𝐾𝐾 ′ 𝑃𝑃0 1 − 10−𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏
2 3
2.303𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏 2.303𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏
𝐹𝐹 = 𝐾𝐾 ′ 𝑃𝑃0 2.303𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏 − + +⋯
2! 3!

Under lower concentrated conditions, 2.303εbc = A < 0.05

𝐹𝐹 = 2.303𝐾𝐾 ′ 𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏𝑃𝑃0
𝐹𝐹 = 𝐾𝐾𝐾𝐾 = 2.303𝐾𝐾 ′ 𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏𝑃𝑃0 = 2.303𝜙𝜙𝑓𝑓 𝐾𝐾 ′′ 𝜀𝜀𝑏𝑏𝑏𝑏𝑃𝑃0 (at constant 𝑃𝑃0 )

Thus, the F vs. c should be linear at low concentrations

 Quenching of Fluorescence

Quenching: usually refers to nonradiative energy transfer from excited species to other
molecules

Dynamic quenching (collision quenching)

: requires contact between the excited species and the quenching agent (Q)
: occurs as rapidly as the collision partner can diffuse together
: the rate depends strongly on temperature and viscosity
: the quencher concentration must be high enough that there is a high probability of a
collision between the excited species and the quencher during the lifetime of the
excited state
𝑘𝑘𝑒𝑒𝑒𝑒 = 𝑘𝑘𝑞𝑞 𝑄𝑄
𝑘𝑘𝑓𝑓 𝑘𝑘𝑓𝑓
𝜙𝜙𝑓𝑓0 = (1) 𝜙𝜙𝑓𝑓0 = (2)
𝑘𝑘𝑓𝑓 + 𝑘𝑘𝑖𝑖 + 𝑘𝑘𝑖𝑖𝑖𝑖 𝑘𝑘𝑓𝑓 + 𝑘𝑘𝑖𝑖 + 𝑘𝑘𝑖𝑖𝑖𝑖 + 𝑘𝑘𝑞𝑞 𝑄𝑄

𝜙𝜙𝑓𝑓0 𝐹𝐹0
= 1 + 𝐾𝐾𝑞𝑞 [𝑄𝑄] = 1 + 𝐾𝐾𝑞𝑞 [𝑄𝑄] Stern-Volmer equation
𝜙𝜙𝑓𝑓 𝐹𝐹
𝐾𝐾𝑞𝑞 = 𝑘𝑘𝑞𝑞 ⁄ 𝑘𝑘𝑓𝑓 + 𝑘𝑘𝑖𝑖 + 𝑘𝑘𝑖𝑖𝑖𝑖

Dynamic quenching reduces both the fluorescence quantum yield and fluorescence lifetime
 Quenching of Fluorescence

Static quenching
: the quencher and the ground state fluorophore form a complex (dark complex)
: the decrease in fluorescence intensity can also be described by the Stern-Volmer eq.
Kq is now the formation of constant of dark complex
: the lifetime of fluorescence is not affected by the static quenching

Förster quenching
: energy transfer occurs without collision between molecules
: dipole-dipole coupling (interaction) between the excited fluorophore and quencher
account for the transfer
: dependence of the degree of quenching on the quencher concentration is complicated
not follow the Stern-Volmer behavior
 Emission and Excitation spectra

들뜸 스펙트럼
- 들뜸 파장이 변화되는 동안 고정 파장에서 발광 세기 측정
→ 세기 vs. 파장
- 흡수 스펙트럼과 동일

전체 발광 스펙트럼 (방출 스펙트럼)

- 들뜸 파장 고정 → 각 파장에서 방출 세기 측정
- 파장 : 들뜸 < 형광 < 인광
- 형광 파장과 인광 파장의 차이 = 삼중항과 단일항의 에너지 차이와 유사
Emission and Excitation spectra

Tryptophan
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
기기의 구성 요소

광발광 측정 기기의 구성 요소
- 자외선-가시선 광도계 또는 분광 광도계와 유사
- 겹살 광학을 사용

들뜸 파장 선택기
- 들뜸 파장만 통과
- 형광 방출 파장은 제거

광원-시료-검출기
- 직각, 산란과 광원의 영향 최소화

방출 파장 선택기 : 형광 파장을 선택
 Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
형광계와 분광계의 구성
[광원]
- 감도는 광원의 복사선 세기 P0에 정비례한다 F ∝ Po
- 흡수 측정보다 세기가 더 큰 광원 사용

램프 청색 발광 다이오드(LED)
- 저압 수은 증기 램프 - 450~475 nm 파장 방출
- 형광을 들뜨게 하는 유용한 선들을 생성 - 특정 형광체의 들뜸에 사용
- 흡수 또는 간섭 필터를 사용해서 파장
선택

고압 제논 아크 램프 레이저
- 300 ∼1300 nm의 연속 복사선 광원 - 질소 기체 또는 Nd:YAG 레이저
- 크로마토그래피, 전기이동의
검출기에 사용
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
[필터와 단색화 장치]
• 형광계 : 필터
• 분광형광계 : 회절발 단색화 장치

[변환기]
• 광전 증배관
• 전하-이동 장치

[시료 용기와 용기칸]

• 유리 또는 실리카로 만든 원통형 및 직사각형 시료 용기
• 저용량 마이크로 시료 용기
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
기기 설계

[형광계]
• 수은 램프 + 필터 + 광전증배관
 Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
[분광형광계]
• 회절발 단색화 장치 + 광전증배관
 Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
[배열 검출기 기반 분광형광계]
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
[광섬유 형광센서]
• 광섬유 탐침
- 광원 및 검출기에서 멀리 떨어져 있는 위치에서 형광 측정
- 레이저 광원의 복사선이 광섬유를 통과하여 시료 용액에서 형광
- 형광 방출은 동일한 광섬유를 통해 다시 측정을 위해 검출기로 이동
- 형광 지시약 물질을 광섬유의 끝부분에 고정하여 비형광 분석 물질 측정
- 형광의 소광을 기반

Spectrometer
Power
cable
Laser

Optical fiber

Power supply

Sample holder
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
[인광계]
• 시료를 번갈아 조사하고 적절한 시간 지연 후에 인광 강도를 측정하는 장치
• 경질 매질 내에서 액체 질소 온도에서 수행
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
보정 및 보상 기법

광원의 보상
- 기준 광전증배관을 통해 광원의 세기를 모니터
- 시료의 발광 신호 대 기준 검출기로부터의 신호의 비율
- 광원 세기의 변동 및 들뜸을 보상

보정된 들뜸 스펙트럼
- 양자 계수기 사용
- 전산화된 분광광도계

보정된 방출스펙트럼
- 교정된 광원을 사용
- 방출 단색화장치 및 변환기에 대한 교정
계수 결정
- 적절한 보정 계수를 곱해서 스펙트럼 보정
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
기기의 표준화

- 안정한 형광체 표준 용액으로 수행

- 일반적인 시약은 약 10-5 M 농도의 quinine sulfate 표준 용액
- 350 nm에서 복사선에 의해 들뜨며 450 nm의 복사선을 방출
Instruments for measuring Fluorescence
and Phosphorescence
Applications of Photoluminescence
Methods
형광법과 인광법
- 가장 감도가 좋은 분석 기술 중 하나
- 향상된 감도는 광원의 세기에 직접 비례하는 농도와 관련
- 광발광 세기는 P0에 독립적으로 측정
- 흡광도 측정은 P0와 P 모두를 평가
- 흡수 방법보다 더 넓은 선형 동적 범위
- 분광광도법보다 낮은 정밀도와 정확도
Applications of Photoluminescence
Methods
무기물의 형광법 정량

직접법
- 형광성 킬레이트의 형성 후 방출을 측정

간접법
- 측정되는 물질의 소광 (quenching) 작용으로 인한 형광 방출의 감소를 측정
- 음이온 검출에 사용
Applications of Photoluminescence
Methods
형광 킬레이트를 형성하는 양이온
형광 킬레이트를 형성하는 전이 금속 이온의 수를 제한하
는 요인 (형광 X)
- 이온의 대부분은 삼중항 상태로의 계간 교차 속도를
증가시키는 상자기성
- 밀집된 에너지 준위 : 내부 전환에 의한 비활성화 증가

전이금속이 아닌 양이온 (형광 O)

- 내부 전환에 의한 비활성/인광 가능성 낮음
- 무색의 형광 킬레이트 생성

[형광용 시약]
- 금속 이온과 킬레이트 형성이 가능한 2개
이상의 주개 기능기가 있는 방향족 구조
Applications of Photoluminescence
Methods
Applications of Photoluminescence
Methods
유기 및 생화학 화학종에 대한 방법
식품, 의약품, 임상 시료 및 천연물의 분석
- adrenaline, morphine, penicillin, phenobarbital, procaine, reserpine, lysergic acid
diethylamide (LSD) 등

인광법
- 인광과 형광은 상호 보완적
- 무거운 원자를 포함하는 화합물은 강한 인광
- 중원자가 없는 동일한 화합물은 인광보다 형광을
나타내는 경향
- 낮은 온도가 필요
- 일반적인 낮은 정밀도
Applications of Photoluminescence
Methods
수명측정
형광 수명 측정
- 충돌 비활성화 과정, 에너지 전달 속도 및 들뜬 상
태 반응에 대한 정보 제공
- 발광 화학종을 함유한 혼합물의 분석에서 추가적
인 선택성 제공
- 근래에는 형광 시간 척도(10-5 ∼10-9 초)에서 발광
붕괴 속도를 일상적으로 측정

시간 영역 측정
- 펄스 광원을 사용하고 형광의 시간 종속적인 붕괴
를 측정

주파수 영역 방법
- Sine 곡선 변조 광원을 사용하여 시료를 들뜨게 하
고 , 들뜸 파형에 대한 형광 방출의 위상 이동은 수명
에 대한 정보를 제공
Applications of Photoluminescence
Methods
형광영상법

형광 분광기와 광학 현미경의 결합
- 단일 세포 내 형광 물질 영상 생성
- 생체 분자의 고유 형광 이용
- 형광 지시계 이용

세포 내 Ca2+ 관찰
- 소뇌 중 Purkinje 뉴런 + Fura-2 지시약
- 형광의 예리한 변화 관찰
- 칼슘 의존성 전기적 사건이 일어나는
장소와 시간 결정 가능
 Chemiluminescence

화학 발광 현상
- 화학반응에 의해 전자적으로 들뜬 화학종이 바닥 상태로 되돌아가면서 빛을
방출할 때 생성

A + B → C* + D
C* → C + hv (C*는 화학종 C의 들뜬 상태)

생체 발광
- 생물학적 시스템에서 일어나는 화학 발광
- 반딧불, 바다 팬지, 특정 해파리, 박테리아, 원생 동물 및 갑각류 등
Chemiluminescence
 Chemiluminescence

복사선의 세기 ICL

- 초당 방출되는 광자 수
- 화학 반응의 속도(d[C]/dt)와 화학 발광 양자 수율 𝜙𝜙CL(반응한 분자당 광자 수)
에 의존

𝑑𝑑 𝐶𝐶 𝑑𝑑 𝐶𝐶
𝐼𝐼𝐶𝐶𝐶𝐶 = 𝜙𝜙𝐶𝐶𝐶𝐶 = 𝜙𝜙𝐸𝐸𝐸𝐸 𝜙𝜙𝐸𝐸𝐸𝐸
𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑑𝑑𝑑𝑑

- 일반적으로 𝜙𝜙𝐶𝐶𝐶𝐶 은 0.01 ~ 0.2

 Chemiluminescence

화학 발광의 측정
기기
- 반응 용기 + 광전증배관
- 광원 : 분석물질과 시약 간의 화학 반응
- 파장 선택기 불필요

정량 분석
- 일정 시간동안 신호를 적분 → 표준물의 신호와 비교
- 봉우리 높이의 비교
 Chemiluminescence

[기체 분석]
- 오존, 질소 산화물, 유황 화합물 분석
- NO 측정
NO + O3 → NO2* + O2
NO2* → NO2 + hv (λ : 600 ~ 2800 nm)
- 질소 산화물 측정 : 열분해 반응 이용
NO2 ⇌ NO + O

- 대기 오존 모니터링
: 분석 물질이 활성화된 실리카 젤 표면에 흡착된 염료인 Rhodamine B와 반응
할 때 생성되는 발광을 기반

- 대기 황 화합물의 측정
: 시료는 수소 불꽃으로 연소되어 황 이합체를 생성하며, 이 이합체는 분해되어
빛을 방출
4H2 + 2SO2 = S2* + 4H2O
S2* → S2 + hv (λ : 384, 394 nm)
 Chemiluminescence

[액상에서 무기 화학종의 분석]

- 루미놀 + 강염기
- O2, H2O2, 하이포아염소산 등의 산화제와 반응
- 촉매 필요

+ hv
 Chemiluminescence

[유기 화학종의 분석]

- 효소 반응의 생성물인 H2O2 분석

uricase
- Uric acid + O2 allantoin + H2O2