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Predictive Toxicology in Drug Safety 1st Edition

Jinghai J. Xu

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safety-1st-edition-jinghai-j-xu/

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Analytical Methods for Therapeutic Drug Monitoring and

Toxicology 1st Edition Q. Alan Xu

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Predictive ADMET Integrated Approaches in Drug Discovery

and Development 1st Edition Urban

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L. Iverson

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Pharmacokinetics Alan G E Wilson (Ed.)

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Drug safety evaluation 1st Edition Shayne C. Gad

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Drug Safety Evaluation Second Edition Shayne Cox Gad

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shayne-cox-gad/

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Drug Safety Evaluation Methods and Protocols 1st Edition

Alberto Lodola (Auth.)

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protocols-1st-edition-alberto-lodola-auth/

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Advances in Microbial Food Safety 1st Edition J Sofos

(Ed.)

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edition-j-sofos-ed/

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This page intentionally left blank
Predictive Toxicology in Drug Safety

According to the Institute of Medicine and the U.S. Food and Drug
Administration, “developing new scientific approaches to detecting,
understanding, predicting, and preventing adverse events” was a
critical path to the future of drug safety. This book brings together a
collection of state-of-the-art chapters, written by experts in the drug
safety field. It provides information on the present knowledge of drug
side effects and their mitigation strategy during drug discovery, gives
guidance for risk assessment, and promotes evidence-based toxicol-
ogy. Each specific area of toxicology relevant for drug discovery is dis-
cussed in detail, including theory, experimental approaches, and data
interpretation supported by comprehensive up-to-date references.
Many chapters provide fascinating case studies, which are of general
interest for those who have basic science training and are interested in
how chemicals interact with the human body.

Dr. Jinghai J. Xu is currently Director of Knowledge Discovery and

Knowledge Management at Merck & Company, Inc. Dr. Xu has won
numerous awards, including the Central Research Achievement Award
and Pfizer Global Research & Development Award. His most recently
published book is Drug Efficacy, Safety, and Biologics ­Discovery: Emerging
Technologies and Tools (2009).

Dr. Laszlo Urban is currently Executive Director and Global Head

of Preclinical Safety Profiling at Novartis Institutes for Biomedical
Research. Dr. Urban has been actively involved in organizations such
as the European Neuropeptide Club, the Society for Biomolecular
Sciences, and the International Association for the Study of Pain. His
most recently published work is Hit and Lead Profiling: Identification and
Optimization of Drug-Like Molecules (2009).
Predictive Toxicology in
Drug Safety
Edited by
Jinghai J. Xu
Merck & Company, Inc.

Laszlo Urban
Novartis Institutes for Biomedical Research
CAMBRIDGE UNIVERSITY PRESS
Cambridge, New York, Melbourne, Madrid, Cape Town, Singapore,
São Paulo, Delhi, Dubai, Tokyo

Cambridge University Press

The Edinburgh Building, Cambridge CB2 8RU, UK

Published in the United States of America by Cambridge University Press, New York

www.cambridge.org
Information on this title: www.cambridge.org/9780521763646
© Cambridge University Press 2011

This publication is in copyright. Subject to statutory exception and to the

provision of relevant collective licensing agreements, no reproduction of any part
may take place without the written permission of Cambridge University Press.
First published in print format 2010

ISBN-13 978-0-511-90999-3 eBook (NetLibrary)

ISBN-13 978-0-521-76364-6 Hardback

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of urls for external or third-party internet websites referred to in this publication,
and does not guarantee that any content on such websites is, or will remain,
accurate or appropriate.
Contents

Contributors page vii

Prologue – Predictive toxicology: a new chapter in drug safety evaluation xi
Jinghai J. Xu and Laszlo Urban

I: Specific areas of predictive toxicology

1 The human predictive value of combined animal toxicity
testing: current state and emerging approaches 1
Harry M. Olson and Thomas S. Davies
2 Screening approaches for genetic toxicity 18
Jiri Aubrecht and Jinghai J. Xu
3 Cardiac safety 34
Martin Traebert and Berengere Dumotier
4 Predicting drug-induced liver injury: safer patients
or safer drugs? 54
Jinghai J. Xu
5 In vitro evaluation of metabolic drug–drug interactions 76
Albert P. Li
6 Reliability of reactive metabolite and covalent binding
assessments in prediction of idiosyncratic drug toxicity 102
Amit S. Kalgutkar
7 Immunotoxicity: technologies for predicting immune
stimulation, a focus on nucleic acids and haptens 124
Jörg Vollmer
8 Predictive models for neurotoxicity assessment 135
Lucio G. Costa, Gennaro Giordano, and Marina Guizzetti
9 De-risking developmental toxicity-mediated drug attrition
in the pharmaceutical industry 153
Terence R. S. Ozolinš

II: Integrated Approaches of Predictive Toxicology

10 Integrated approaches to lead optimization: improving
the therapeutic index 183
Laszlo Urban, Jianling Wang, Dejan Bojanic, and Susan Ward

v
vi Contents

11 Predictive toxicology approaches for small

molecule oncology drugs 204
Timothy J. Maziasz, Vivek J. Kadambi, and Carl L. Alden
12 Mechanism-based toxicity studies for drug development 230
Monicah A. Otieno and Lois D. Lehman-McKeeman
13 Fish embryos as alternative models for drug safety evaluation 244
Stefan Scholz, Anita Büttner, Nils Klüver, and Joaquin Guinea
14 The role of genetically modified mouse models
in predictive toxicology 269
Glenn H. Cantor
15 Toxicogenomic and pathway analysis 284
Bin Lu, Ying Jiang, and Chester Ni
16 Drug safety biomarkers 302
David Gerhold and Frank D. Sistare
17 Application of tk/pd modeling in predicting dose-limiting toxicity 314
Li J. Yu, Lee Silverman, Carl L. Alden, Guohui Liu,
Shimoga Prakash, and Frank Lee
18 Prediction of therapeutic index of antibody-based therapeutics:
mathematical modeling approaches 330
Kapil Mayawala and Bruce Gomes
19 Vaccine toxicology: nonclinical predictive strategies 344
Sarah Gould and Raymond Oomen
Epilogue 371
Index 375
Color plates follow page 370.
Contributors

Carl L. Alden D.V.M. Berengere Dumotier Ph.D.

Millennium Pharmaceuticals Preclinical Safety
The Takeda Oncology Company Novartis Pharma AG
Cambridge, MA Basel, Switzerland

Jiri Aubrecht Pharm.D., Ph.D. David Gerhold Ph.D.

Drug Safety Research and Department of Laboratory Sciences
Development and Investigative Toxicology
Pfizer Global Research & Merck Research Laboratory
Development West Point, PA
Groton, CT
Gennaro Giordano Ph.D.
Dejan Bojanic Ph.D. Department of Environmental and
Lead Finding Platform Occupational Health Sciences
Novartis Institutes for Biomedical University of Washington
Sciences Seattle, WA
Cambridge, MA
Bruce Gomes Ph.D.
Anita Büttner Ph.D. Biotherapeutics Research and
University of Leipzig Development
Institute of Organic Chemistry Pfizer Inc.
Leipzig, Germany Cambridge, MA

Glenn H. Cantor D.V.M., Ph.D. Sarah Gould Ph.D.

Discovery Toxicology Non-Clinical Safety
Bristol-Myers Squibb Sanofi Pasteur
Princeton, NJ Marcy l’Etoile, France

Lucio G. Costa Ph.D. Joaquin Guinea Ph.D.

Department of Environmental and ZF Biolabs
Occupational Health Sciences Madrid, Spain
University of Washington
Marina Guizzetti Ph.D.
Seattle, WA
Department of Environmental and
Thomas S. Davies Ph.D. Occupational Health Sciences
STA Preclinical Services LLC University of Washington
Essex and Lyme, CT Seattle, WA
vii
viii Contributors

Ying Jiang Ph.D. Kapil Mayawala Ph.D.

Department of Laboratory Sciences Biotherapeutics Research and
and Investigative Toxicology Development
Merck Research Laboratory Pfizer Inc.
West Point, PA Cambridge, MA

Vivek J. Kadambi Ph.D. Timothy J. Maziasz Ph.D.

Millennium Pharmaceuticals Millennium Pharmaceuticals
The Takeda Oncology Company The Takeda Oncology Company
Cambridge, MA Cambridge, MA
Amit S. Kalgutkar Ph.D.
Chester Ni Ph.D.
Pharmacokinetics Dynamics and
Computational Biology
Metabolism Department
University of Washington
Pfizer Global Research &
Seattle, WA
Development
Groton, CT Harry M. Olson D.V.M., Ph.D.
Nils Klüver Ph.D. STA Preclinical Services LLC
Helmholtz Centre for Environmental Essex and Lyme, CT
Research Raymond Oomen Ph.D.
Department of Bioanalytical Discovery Bioinformatics
Ecotoxicology Sanofi Pasteur
Leipzig, Germany Cambridge, MA
Frank Lee Ph.D.
Monicah A. Otieno Ph.D.
Millennium Pharmaceuticals
Discovery Toxicology
The Takeda Oncology Company
Bristol-Myers Squibb Company
Cambridge, MA
Princeton, NJ
Lois D. Lehman-McKeeman Ph.D.
Discovery Toxicology Terence R. S. Ozolinš Ph.D.
Bristol-Myers Squibb Company Department of Pharmacology and
Princeton, NJ Toxicology
Queen’s University
Albert P. Li Ph.D. Kingston, Canada
In Vitro ADMET Laboratories Inc.
Columbia, MD Shimoga Prakash Ph.D.
Millennium Pharmaceuticals
Guohui Liu Ph.D.
The Takeda Oncology Company
Millennium Pharmaceuticals
Cambridge, MA
The Takeda Oncology Company
Cambridge, MA Stefan Scholz Ph.D.
Helmholtz Centre for Environmental
Bin Lu Ph.D.
Research
Drug Safety Research and
Department of Bioanalytical
Development
Ecotoxicology
Pfizer Global Research & Development
Leipzig, Germany
Groton, CT
Contributors ix

Lee Silverman D.V.M., Ph.D. Jianling Wang Ph.D.

Millennium Pharmaceuticals Metabolism and Pharmacokinetics
The Takeda Oncology Company Novartis Institutes for Biomedical
Cambridge, MA Research
Cambridge, MA
Frank D. Sistare Ph.D.
Department of Laboratory Sciences Susan Ward Ph.D.
and Investigative Toxicology Life Sciences Industries
Merck Research Laboratory Cambridge, MA
West Point, PA
Jinghai J. Xu Ph.D.
Martin Traebert Ph.D. Knowledge Discovery and Knowledge
Preclinical Safety Management
Novartis Pharma AG Merck & Co., Inc.
Basel, Switzerland Rahway, NJ

Laszlo Urban M.D., Ph.D. Li J. Yu Ph.D.

Lead Finding Platform Drug Metabolism and
Novartis Institutes for Biomedical Pharmacokinetics
Research Hoffmann–La Roche, Inc.
Cambridge, MA Nutley, NJ

Jörg Vollmer Ph.D.

Pfizer Oligonucleotides Therapeutics
Unit
Coley Pharmaceutical GmbH
Düsseldorf, Germany
Prologue
Predictive toxicology: a new chapter in
drug safety evaluation

In 2007, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) issued a report titled “The
Future of Drug Safety – Promoting and Protecting the Health of the Public.” In it,
strengthening the science that supports drug safety evaluation was recognized
as a critical path to improve drug safety assessment. In particular, “developing
and qualifying techniques for predictive toxicology” was identified as one of the
major unmet needs in advancing scientific approaches to detect, understand,
predict, and prevent adverse events (http://www.fda.gov/).
With the cost of developing an FDA-approved medicine approaching $1 bil-
lion and time to develop a drug taking 10 to 15 years, late-stage failures or
attritions pose a significant burden on the sustainability of the current phar-
maceutical research and development (R&D) model. Because 90% of drug can-
didates that enter clinical development fail to reach the market, the root cause
of rising R&D costs is a continuous investment in failure. By last account, clin-
ical safety represents 20% and preclinical toxicology embodies 13% of failed
development efforts. Together, drug safety reasons account for one-third of
overall failure. Most of the current tools and models used for toxicology and
human safety testing are decades old, including many that are recommended
by the FDA. Better models, methodologies, and testing paradigms with dem-
onstrated improvement in drug safety prediction than existing practices are
clearly needed. Predictive toxicology, aimed at addressing this challenge using
a combined knowledge and insight from all fields of science, is the central topic
of this book.
This book is organized into two sections. The first section starts with a “current
state” chapter on the predictivity of animal toxicology evaluation for human
drug safety. This is followed by individual topics of toxicology, including genetic,
cardiac, hepatic, drug–drug interactions, reactive metabolite, immune, neuro-
logic, and developmental toxicology. The second section of the book empha-
sizes integrated approaches (integrated lead optimization, oncology drugs,
­mechanism-based toxicity), novel in vivo experimental models (zebrafish, genet-
ically engineered models), emerging technologies (toxicogenomic pathway min-
ing, safety biomarkers), and mathematical modeling approaches (PKPD modeling,
biologics modeling). The book ends with a chapter on the safety evaluation of
vaccines. Each chapter is authored by subject matter experts in that area. We are

xi
xii Prologue

extremely grateful to all the contributing authors for sharing their knowledge
and insight. It is our honor to experience their enthusiasm, professionalism, and
collaboration from the beginning of this book project.
Even though there is a heavy emphasis on drug discovery and development,
the predictive toxicology strategies and approaches described in this book
should also be highly relevant and applicable to the fields of chemical, environ-
mental, and other areas of toxicology where rational prediction of human safety
risk becomes a fundamental duty for toxicologists. We hope that toxicologists
in both practice and training will find this book thought-provoking and highly
pertinent to the direction of toxicology in the twenty-first century.

Jinghai J. Xu, Ph.D.

Laszlo Urban, M.D., Ph.D.
Predictive Toxicology in Drug Safety
I Specific Areas of Predictive Toxicology

1 The human predictive value of combined

animal toxicity testing
Current state and emerging approaches

Harry M. Olson and Thomas S. Davies

1.1 Introduction

Pharmaceutical development in the late twentieth and early twenty-first cen-

turies has been a challenging enterprise. It is an expensive undertaking with a
high degree of risk associated mainly with a high failure rate. A new chemical
entity (NCE) that successfully completes the entire process of drug discovery and
development reaching approval as a new therapeutic may accrue total develop-
ment costs in excess of one billion dollars (U.S.).1 Also, for the drugs that are suc-
cessful, it typically takes 10 to 12 years from the initiation of research efforts to
reach final marketing approval.1 Experience in the past decade with the overall
success/failure rate process – which now encompasses many new and emerging
tools including early screening assays and in silico technologies, and the histor-
ical experience of “what works and doesn’t work” – has so far not yielded the
expected productivity improvements. Enigmatically, recent experience suggests
that it is getting more difficult to identify successful lead molecules that lead to
safe and effective therapeutics.
A high-level schematic overview of the current drug development process
is shown in Figure 1.1. Candidate molecules entering preclinical develop-
ment from the discovery process proceed through the stages of clinical de-
velopment (Clinical Phases I, II, and III). During clinical development, safety
(first) and efficacy are evaluated in consecutively larger groups of normal
volunteers and patients. First-in-human (or FIH) studies number in the 10s of
normal subjects or patients, and then the NCE is assessed in patients (100s in
Phase 2, and 1,000s in Phase 3) with the disease of therapeutic interest. This
overall “classical” approach is oriented mainly to small synthetic molecules,
but it is applicable (with modifications) to other drug categories (e.g., biologi-
cals and botanical products) as well.
The drug discovery phase preceding clinical drug development is when eval-
uation of many potential NCE molecules occurs and the numbers of promising
structures is reduced and refined to a select handful of very promising can-
didates. The goal in discovery is to apply both pharmacology and toxicology
screening processes relevant to the intended therapeutic indication and route of
administration to identify candidate molecules with the most favorable efficacy

1
2 Olson and Davies

Clinical Clinical Clinical

Discovery Preclinical* Registration
Phase I ** Phase II Phase III

Discovery Regulatory
Toxicology Toxicology

Clinical Phase Objective Subjects No. Studied

Phase I Safety, PK Normal volunteers 10's
Phase II Safety, Efficacy Patients 100's
Phase III Safety, Efficacy Patients 1000's

Figure 1-1: Toxicology in drug development. Reprinted from Regulatory Toxicology and Pharma-
cology, vol. 32/1, Olson et al., “Concordance of the Toxicity of Pharmaceuticals in Humans and in
Animals” 12, 2000, with permission from Elsevier.

Start IND
enabling
No. of candidate molecules

tox studies
100’s to 1,000’s

First-in-
human
clinical
1 to 3

Selection, aka, Attrition

Lead optimization

Discovery Development

Figure 1-2: Selection and attrition in drug development. Reprinted from Regulatory Toxicology
and Pharmacology, vol. 32/1, Olson et al., “Concordance of the Toxicity of Pharmaceuticals in
Humans and in Animals” 12, 2000, with permission from Elsevier.

and safety attributes so that they can be considered for further development.
This process is known as candidate selection (see Figure 1.2), or lead molecule
optimization. The technologies and resources applied during candidate selection
may include in silico methods (e.g., Quantitative Structure Activity Relationship
[QSAR]), in vitro efficacy and safety screens, and also possibly some in vivo animal
model assessment (e.g., pharmacokinetic and toxicology screening studies).2,3

1.1.1 Candidate selection and attrition – the inevitability of failure

As previously described, candidate selection is the approach in drug discovery

that is expected to yield a small and select number of promising molecules for
Value of combined animal toxicity testing 3

Complex disease targets Insufficient selectivity

Retention time in body too Side effects

short or too long

Adverse reactions Unstable compound

Competition (in
Poor or low bioavailability marketplace)

Lack of adequate clinical

Not practical to synthesize
effectiveness

Figure 1-3: Some common causes of attrition. Reprinted from Regulatory Toxicology and
Pharmacology, vol. 32/1, Olson et al., “Concordance of the Toxicity of Pharmaceuticals in ­Humans
and in Animals” 12, 2000, with permission from Elsevier.

the intended therapeutic indication (Figure 1.2). Many compounds or chemical

classes during selection are evaluated in virtual or actual test systems. For toxi-
cologists, this may include in silico assessment for structural alerts such as for
genotoxic potential, cellular damage, or other potential toxic effects.2,3 The next
step in drug development of the selected lead molecule is attrition. Attrition is
the loss of molecules or drug candidates that have entered the preclinical de-
velopment or subsequent clinical development phases (Figure 1.2). A substan-
tial number of development candidates fail because toxicity issues surfaced in
preclinical Investigative New Drug Application (IND)-supporting studies (these
compounds selected pre-FIH may never make it into Phase I clinical trials), in
subsequent toxicology studies conducted during development, or as a result of
significant clinical adverse events arising during development. Attrition can
occur even after product registration and marketing, possibly resulting in with-
drawal of the product from the market.
Some of the common reasons for attrition are shown in Figure 1.3; these in-
clude both toxicity-related findings and other deficiencies in drug candidates
that can occur at any time during drug development. Indeed, attrition is about
more than toxicity, which nonetheless does remain an important contributor to
drug loss.4 The other factors listed in Figure 1.3 should be kept in mind as key
factors in this loss of NCE molecules during development. Unlike during the
candidate selection phase, attrition is not a desirable outcome, but it is a normal
and expected outcome of drug development. Historically (e.g., in large pharma-
ceutical company portfolios), attrition can reach or exceed a 90 percent failure
rate of compounds identified as “promising” in the late discovery and early de-
velopment phases. Overall, this may be considered as a kind of Darwinian “nat-
ural selection” process, to identify drugability shortcomings early and to focus
available resources on the most promising candidates.
Optimally, drug developers want attrition to occur as early as possible, and
in particular in the interval between start of the FIH- (or IND)-supporting stud-
ies and the end of the Phase II clinical trials (Figure 1.1). Later stage attrition
(e.g., in Phase III clinical trials) can have a profound negative impact on drug
development programs, timing, and costs.1 The withdrawal of drugs from the
4 Olson and Davies

marketplace due to toxicity or other issues can be discouraging and frustrating

(or worse) to patients, drug manufacturers, and regulators.
The understanding of attrition occurring in drug development currently is
more grounded historically to small, synthetic molecule development programs
than to the more recent advent of biological therapeutics. While there is not yet
the long history of experience with biologicals, some manufactured protein/
polypeptides are typically “purpose designed” and configured as “humanized”
to modulate or replace endogenous molecules, such as insulin, blood clotting
factors, or other biomolecules. However, the early stage development of all eth-
ical therapeutics – whether small molecules or biological therapeutics – must
include preclinical toxicology evaluation in recognized and accepted (by regula-
tory authorities) in vivo test systems that are recognized as predictive of potential
human toxicities or adverse effects.

1.1.2 In silico, in vitro, and in vivo – what approaches to use, and when?

The approach used to identify lead therapeutic molecules must be adaptable

to – and take account of – the clinical program therapeutic goals, understand
the attributes of the candidate molecule (both unique to the NCE and to the
chemical class), and recognize the capabilities and limitations of any test sys-
tems used to characterize toxicity. As shown in Figure 1.4, the approach should
begin with consideration of in silico approaches that may precede in vitro and in
vivo studies.2,3 Included here are access to the published literature, FOI (freedom-
of-information) resources, and archival documentation including computer-
based and searchable compound databases, which are important to review what
is already known about potential target organ toxic effects for the chemical
class. QSAR searchable artificial intelligence systems – a few are Internet access-
ible – can screen chemical structures and identify possible or “suspect” struc-
tural alerts. This information can be useful if applied judiciously to the process
of optimizing lead molecule selection. Some in silico systems (MultiCASE) are
useful to gather information sourced from historical databases and literature ref-
erences. Many large pharmaceutical companies have systems that include data,
summaries, and reports from internal investigative studies.
In vitro screening assays (Figure 1.4) are similarly useful to identify specific
molecular characteristics such as receptor affinity, ex vivo cross-species compara-
tive metabolite profile, compound metabolic stability, mutagenic potential or
other specific attributes or liabilities.2,3 In preclinical development preceding
the Phase I clinical trial, there are specific regulatory requirements for in vitro
studies conducted under Good Laboratory Practice (GLP) guidances,3,4 including
mutagenic potential in bacteria, structural chromosomal damage in mamma-
lian cells, and also assessment of potassium channel inhibition in the human
Ether-à-go-go Related Gene (hERG) test system.2–4 Published data from investiga-
tive or regulatory in vitro systems may provide useful guidance of similar mol-
ecule characteristics. In silico and in vitro evaluations can contribute much to
Value of combined animal toxicity testing 5

In silico In vitro In vivo

• Chemical • Targetted • PK-TK
structures screening assays
(e.g., pharmacology, • Acute tolerance
• Literature (public genetic tox.)
domain) • Repeat dose
• Metabolism and toxicity & recovery
• SAR – alerts to stability )
avoid • IND-enabling
• K channel effects studies (GLP)
• Institutional (cardiac safety)
• Identify
memory (reports,
• Rank-order large biomarkers (clinical
data)
numbers of NCE’s pathology, novel)
(lead optimization)

Figure 1-4: Strategic approach to in vivo study. Reprinted from Regulatory Toxicology and
Pharmacology, vol. 32/1, Olson et al., “Concordance of the Toxicity of Pharmaceuticals in ­Humans
and in Animals” 12, 2000, with permission from Elsevier.

the understanding of the molecular toxicity profile, including a preliminary

estimate of the probability of success with the NCE development.2 However, the
results from in vitro systems have real limitations, and can’t be used to reliably
characterize the toxicity profile of a selected lead molecule as a therapeutic can-
didate. For this, the essential resource is in vivo toxicity testing.
The inclusion of laboratory animals in studies to assess the toxic po-
tential of lead molecules as a basis for further clinical development is inte-
gral to the process of data-based decision making for drug development
(Figure 1.4). As an outcome of the cause of death of seventy-six people from
diethylene glycol poisoning, as a constituent of a sulphanilamide formulation
(Elixir Sulfanilamide), came passage of the federal Food, Drug, and Cosmetic
(FD&C) Act of 1938. With this legislation came – for the first time – the re-
quirement of manufacturers of medicines to show that a drug was safe prior to
marketing. This and other subsequent legislation mandated the key principles
for testing and evaluating new drugs, including the mandate for in vivo animal
toxicity testing.5
Mammalian test systems (notably rat, dog, and primate) are biochemically
integrated, with metabolic capabilities for drug transformation and excretion,
complex endocrine pathways and feedback loops, and internal organ sys-
tems and many clinical pathology biomarkers of toxic effects (e.g., elevated
liver enzymes released from damaged hepatocytes or bone marrow toxicity
revealed in hemogram changes) that mimic those in humans.3,6 Therefore,
these animal models – most typically one rodent and one nonrodent animal
species – have been shown to provide an approximate integrated surrogate to
assess possible in-life and target organ toxicity of the NCE. These preclinical
studies are ­important to providing assurance of the safety profile prior to pro-
ceeding with studies in human volunteers or patients. Indeed, preclinical in
vivo models are prime examples of translation of toxic effects to human risk
6 Olson and Davies

assessment.6 However, the outcome of toxicology studies performed in these

test systems has not always predicted the identical outcomes in humans. But
we have acquired much experience about the usefulness of these models to
predict human toxicity, and also the limitations to identify certain types of
clinical adverse effects.
In order to achieve the end-game of developing a marketable therapeutic, the
requisite criteria are that the drug must be shown to be “pure, safe and effec-
tive” (Food, Drug and Cosmetic Act of 1938). Practice, experience, and updated
regulatory guidance have provided guideposts for meeting each of these three
­criteria over the course of drug development. The remainder of this chapter will
address the extent to which combined animal toxicity testing can help achieve
an understanding of potential human toxicity, or adverse effects and what are
the shortcomings that remain today.

1.2 Meaning and value of predicting human toxicity in

pharmaceutical development

Our attention in this chapter is to focus on contributions to reduce attrition

by the pragmatic use of preclinical in vivo toxicity testing throughout drug de-
velopment. This is provided by understanding the use, predictive value, and
limitations of preclinical in vivo toxicology studies as they pertain to identifying
possible human clinical toxicity, and how the safety data obtainable from these
preclinical studies is being refined and continues to be improved.
Implicit in the title of this chapter, “The Human Predictive Value of
Combined Animal Toxicity Testing,” is the expectation that there is predictive
value in preclinical animal toxicity testing. This is why these studies are done
in pharmaceutical research and development, why toxicologists and clinical
pharmacologists rely on the data and information from such studies, and,
of course, why there are preclinical testing requirements mandated by reg-
ulatory authorities. Results from in vivo toxicity studies – both the toxicity
and toxicokinetic data and their interpretation – are of direct use by clinical
investigators to assess risk and benefit of a NCE exposure for patients, partic-
ularly in early phases of controlled clinical studies. Support for the predic-
tive value of in vivo toxicity testing comes from long experience, historical
precedence, published research and regulatory guidance, and requirements
spanning many decades. The practice and requirements for animal toxic-
ity design and testing (e.g., using the fewest number of animals needed to
obtain a valid scientifically defensible outcome) have been incorporated into
current preclinical toxicology study designs. With the availability of current
methods to compare in vitro metabolism of compounds across species, and
to measure plasma levels of parent drug and key (major) metabolites in ani-
mal toxicity studies (to compare with therapeutic plasma levels in clinical
studies), it is possible to provide expected safety margin estimates for NCEs
during development. 2,3
Value of combined animal toxicity testing 7

1.3 In vivo testing strategies and models in-use for drug

development

The background leading to today’s preclinical regulatory study testing require-

ments has been described previously. Guidelines for testing of NCEs are pro-
vided in the M-3 Guidance4 and other preclinical regulatory documents issued
by review committees of the International Conferences on Harmonization
(ICH). ICH was first convened in 1992 as a cooperative body to reduce duplicate
testing of new medicines during the research and development phase. ICH guid-
ance documents and revisions now provide a unified, standardized approach for
toxicology testing, achieving greater harmonization of technical guidelines and
study designs for product registration.
The main purpose of in vivo toxicity testing is to define the preclinical safety
profile of the NCE. The safety profile doesn’t mean that the drug candidate is
absolutely safe in all respects or for all routes of dose administration, but instead
that the safety profile of the prospective drug is known. This profile includes
in-life effects and target organ toxicity endpoints in relationship to the schedule
and route of intended dosing. The systemic drug exposure is reported also in
animal toxicology studies. Therefore, “safe” means that the occurrence, inci-
dence, severity, and reversibility of toxic effects and exposure to the NCE in
the in vivo test system all contribute to determine how the NCE can be admin-
istered safely to human subjects. It is important to evaluate and understand the
NCE dose-response relationship in studies that include lower doses near to the
intended therapeutic exposure in patients, up to higher doses that test the toler-
ance (toxicology) limits. This dose-response concept was originated by Paracelsus
(sixteenth-century “father of toxicology”) who advised, “all substances may be
poisons, it is the dose that makes the poison” (paraphrased, italics the author’s).
Therefore, the safety profile of a NCE may include tolerance evaluation, clin-
ical effects, blood or urine biomarkers that signal damage to target organs, and
histopathology, which confirms the effect. Toxicokinetic measurements in
these studies provide plasma exposure data on the parent compound and/or
key metabolites that also occur in humans. During the past decade, the revers-
ibility of toxicity effects is also often evaluated in the study design, by inclusion
of a nondosing interval following the dosing phase. Based on this information
a safety margin can be determined comparing the intended clinical plasma ex-
posure with that in rodent and nonrodent studies to ensure the safety profile
is consistent with the intended therapeutic indication. The main objective for
drug registration (oncology therapeutics being an exception) is that the drug is
expected to be safe under the conditions of intended human investigation and
therapeutic use (by route and dose as prescribed).

1.3.1 Predictive value of animal testing

The rationale for laboratory animal testing is that the results from these studies
are predictive of possible adverse effects in humans, and therefore can be used to
8 Olson and Davies

manage the risk of subsequent human exposure. This is particularly true leading
up to initial human trials – also called first-in-human studies – where there is no
prior NCE clinical experience.
A very few investigations have been published to determine how predictive
animal toxicity testing is related to human toxicities associated with investigative
or marketed therapeutics.7–13 The main aim of these studies was to understand
how useful animal toxicity studies are to predict human clinical toxicity. Several
of these studies have focused on cytotoxic anticancer therapeutics,9–12 which have
inherently narrow safety margins for tolerable toxicity since higher exposures may
engender adverse effects in order to also achieve effective treatment of the dis-
ease. For anticancer therapeutics, the observed clinical toxicity in humans may be
predicted for at the higher doses in the preclinical toxicity studies because of the
very narrow safety margin. For the broader classes of pharmaceuticals (including
but not limited to anticancer agents), the predictive value of preclinical animal
toxicology studies is addressed by prediction of the clinical toxicity observed dur-
ing clinical drug development trials (Figure 1.1). Two multinational pharmaceut-
ical company surveys have been undertaken by the International Life Sciences
Institute – Human and Environmental Sciences Institute (ILSI-HESI) organization
to explore this aspect. The initial survey has been published,7 and the second
survey workshop was held in 2007 [HESI concordance of animal and human tox-
icity workshop, September 20–21, 2007, Washington, D.C.].
The multinational pharmaceutical company survey is the largest published
survey of this kind, including a total of 150 compounds with 221 human toxici-
ties (or adverse effects).7 Some included drug candidates caused multiple clin-
ical toxicities. In this survey, prediction of the human toxicity was the basis for
evaluating whether animals were – or were not – effective to identify the cor-
responding target organ(s) human toxicity. Schein et al. examined the reported
preclinical and human toxicities of twenty-five anticancer drugs in dog, primate,
and human studies.11 Owens reported toxicity findings of twenty-one anticancer
drugs in rodent, dog, primate, and human studies,9 and Freireich and colleagues
reported toxicity findings of eighteen anticancer drugs in mouse, rat, hamster,
dog, primate, and humans.12
The following summarizes the results and conclusions obtained from these
published studies for the following organ systems:
Central nervous system (CNS). In a Japanese study of eighty-four drugs
­evaluated in general pharmacology studies, the reported capacity to ­predict ad-
verse effects was mixed; however, it reported that changes in locomotor ­activity
in rodents correlated with dizziness in humans.13 In some studies, high doses
in ­animals produced CNS-related effects (ataxia, convulsions) not observed in
­clinical trials.7,14 The concordance in studies of general ­therapeutics7 and ­anticancer
therapeutics9,11 was reported as moderate (predictive from 20 to 60 ­percent) as
there was poor correlation with specific symptoms. Overall, nonrodent data were
more predictive than rodent data for identifying adverse ­neurological effects in
the clinic, and histopathologic evaluations were useful to detect serious neuro-
toxic effects.15
Value of combined animal toxicity testing 9

Cardiovascular. The overwhelming majority of concordance cases in these

studies were reported in nonrodent species, specifically the dog and to a lesser
extent the primate.7,15 For general therapeutics the concordance rate was 80
percent,7 and this was principally in pharmacology studies. The basis for evalu-
ation includes safety pharmacology electrocardiographic effects and histopatho-
logic toxicities. In these surveys, rodents were determined to have lesser utility
because of the unsuitability of this model to evaluate cardiovascular function.
Electrocardiographic (ECG) assessment in dogs – combined with in vitro assess-
ment in hERG and Purkinje standardized test systems – is currently the regula-
tory standard to identify compounds presenting higher risk for human cardiac
arrhythmias.2,4
Hematologic. There was a high concordance (91 percent) in both rodent
and nonrodent species with human hematotoxic findings.7,11,12 These cases are
highly correlated with anticancer and antiinfective therapies. Current methods
for identifying and evaluating bone marrow toxicity and coagulation effects in
both preclinical toxicology and clinical studies are similar, providing the basis
for consistent assessment and reliable cross-species and human comparison.
Gastrointestinal (GI). There was a high concordance (85 percent) of human
GI toxicities with the animal findings most notably in nonrodent species.7
This high concordance was particularly the case for anticancer, antiinfective,
and antiinflammatory drug classes mediated by pharmacologic mechanisms.
Similarly, safety pharmacology studies in a Japanese review of eighty-eight non-
cancer drugs showed a good correlation for rodent intestinal transport stud-
ies and clinical adverse effects (anorexia, constipation).13 Other studies showed
similar positive correlation outcomes across therapeutic classes, including anti-
cancer drugs.9,11,12,14 In particular the physiologic similarities of the dog and
human gastrointestinal tracts may be useful and conducive in support of this
high concordance.16
Hepatic. Hepatotoxicity remains a significant contributor to attrition in
drug development portfolios of many pharmaceutical and biotech companies.7
Recent surveys indicated that drug-induced liver damage accounts for over 50
percent of incidences of acute liver failure in the United States.17 In the clinical
and preclinical settings, measurement of liver enzymes in blood during NCE
dose administration is the most reliable in-life method of detecting potential
hepatotoxicity; liver histopathology is also important to confirm severity of
effects in animal studies. One study reported a concordance of 80 percent in
identifying hepatotoxicity from toxicity studies with known human hepato-
toxicity.18 Other studies assessing anticancer drugs reported good predictivity
of hepatotoxic injury in humans with drugs, as evaluated by enzyme changes
and liver histopathology.9,11 In the large multinational industry survey, concord-
ance was shown to be about 50 percent,7 which was among the lower predictive
markers. Possibly this is related to the occurrence of either: (a) subtle preclinical
changes (i.e., minimal liver histopathologic changes or low-level increases in
liver enzymes in only a few study animals) that fail to be recognized as hepato-
toxic signals, or (b) occurrence of idiosyncratic hepatotoxicity with < 1:10,000
10 Olson and Davies

incidence in the population. In fact, idiosyncratic reactions are not uncommon

and continue to have an impact on late-stage attrition of drugs in development
or withdrawals from the marketplace.15 For large pharmaceutical companies, the
occurrence of liver enzyme changes in early drug development in rats is recog-
nized as a common occurrence, generally related to propensity of this species
to respond to metabolic inducers. NCEs that show evidence for liver effects and
damage are usually presumed to be risky and are dropped in the early screening
stages of drug development.
Renal. Renal toxicity – similar to hepatotoxicity – is assessed in preclinical toxi-
cology studies by blood parameters (blood urea nitrogen [BUN], creatinine, elec-
trolytes), urinalysis constituents, and histopathologic examination. Predictive
results in studies with anticancer drugs were variable, with a tendency toward
overprediction.9,11 Concordance in the large multinational industry survey was
about 70 percent.7
Pulmonary. The assessment of drug candidates on respiration is performed
prior to FIH registration in either specific safety pharmacology respiratory stud-
ies – typically in rodents – or clinical evaluation of rodents and nonrodents
in the postdose phase of conventional toxicology studies, and by histopatho-
logic evaluation of lungs. Igarashi et al. reported that respiratory disturbances
that occur clinically were not predicted by the safety pharmacology studies.13
Both Schein and Fletcher reported a high degree of overprediction of respiratory
effects in animal toxicity and safety pharmacology studies, compared to actual
clinical adverse events.11,14
Endocrine. Endocrine changes may be identified by inclusion of specific
hormone analyses (based on availability of bioanalytical methods for the spe-
cies) in toxicology studies, or more typically by histopathologic evaluation of
endocrine organs. Results from the multinational industry survey showed only
moderate concordance (60 percent) from preclinical studies.7 Fletcher reported
that the findings from preclinical toxicology studies overpredicted effects in
humans.14
Dermal. There are very few reported cases of skin reaction responses in the
multinational industry survey,7 and animal models in other surveys do not pro-
vide reliable predictive utility for these effects.9,11,14 However, when they occur,
dermal hypersensitivity-type reactions are a significant contributor to termin-
ation of drugs in various stages of development (Clinical Phases 2 and 3 in
particular).7,19
Immunologic. The literature is replete with examples of xenobiotic (including
therapeutics) immune effects in animal species, but except for hypersensitization
few of these effects have been seen in human studies. In many cases immuno-
logic endpoints in animal studies have not been evaluated for predictivity in
humans. However, some specific individual species effects that are usefully com-
pared to human immunologic effects (e.g., immune complex effects in rabbits, or
immediate/delayed-type hypersensitivity in guinea pigs) have been reported.20
A workshop on Preclinical Evaluation of Peptides and Recombinant Proteins
provided an integrated interpretation of preclinical toxicology data for
Value of combined animal toxicity testing 11

several recombinant protein therapeutic molecules from studies in animals and

humans.21 A key conclusion of this analysis is that clinically relevant adverse
effects can be obtained from well-designed preclinical toxicity studies. Examples
of concordant effects with recombinant Hu interleukins include vascular leak
syndrome (occurs in mouse, rat, primate) and hypotension (rabbit, primate). In
the workshop discussion, it was noted that there may be quantitative differences
in species sensitivity to clinical toxic effects. However, testing of the human
protein in preclinical species – including species with and without the protein
molecule receptor – may have value in identifying human-relevant toxicity. The
importance of appropriate study design was emphasized, including species sen-
sitivity, dose selection, and possible nonlinear dose response effects with bio-
logicals, induction of an antibody response, and other factors.21

1.3.2 Predictive assessment of developmental and reproductive

toxicology studies

Developmental and reproductive toxicology (DART) studies – usually conducted

in the rat and rabbit – are performed during clinical development of synthetic
and biological therapeutics.4 The results of these studies may be included in the
approved drug package insert with a category score to communicate risk. There
is currently no published analysis of the predictive outcome of DART studies,
nor are there any consistent reports of clinical teratogenic effects associated with
exposure to drugs. However, a discussion of the significance and human risk
assessment of preclinical teratogenic findings – at doses where maternal toxicity
is or is not observed – is provided by Hood and Miller.22

1.4 Limitations of in vivo testing in drug development –

example of carcinogenicity studies

This section will focus on the current status and future trends of carcinogenicity
testing in support of drug development. Even though the predictive value of the
rodent bioassay remains controversial, the results of the rodent bioassay are cur-
rently required for approval of chronic use drugs in the United States and other
countries. The safety and approval of drugs is based on a regulatory assessment
of data from preclinical toxicology studies and clinical trials. The FDA Office
of Pharmaceutical Science Web site states that toxicology studies are used to
assess three broad categories of chemical toxicities that cannot be appropriately
assessed in humans – genetic toxicity, reproductive and developmental toxicity,
and carcinogenicity.23 The default assumption is that positive effects in a rodent
carcinogenicity study indicate that a drug candidate may have carcinogenic po-
tential in humans. Thus, if no adequate human data are present, positive effects
in a rodent carcinogenicity study become a basis for assessing the carcinogenic
risk to humans. Results of carcinogenicity studies (and two other categories) are
communicated by means of the drug label.
12 Olson and Davies

Historically, the regulatory requirements for the assessment of the carcino-

genic potential of pharmaceuticals recommended the conduct of long-term car-
cinogenicity studies in two rodent species, usually the rat and the mouse. In the
1990s, the use of transgenic mice was introduced in an attempt to improve the
process of hazard identification.24 Deficiencies of the conventional bioassay are
well known and include the following:25,26

• Approximately 50 percent of drugs tested yield positive results in bioassay.

• Bioassay often produces contradictory results – simultaneous tumor increases
and decreases.
• Demonstrated lack of concordance of tumor sites in rodents and humans.
• Tumor type and/or incidence varies by species and strain/stock.
• Diet (calories) is a potential variable in carcinogenicity studies.
• Use of maximum tolerated dose (often not indicative of human exposure) is
required.
• Bioassay is costly, time consuming, and resource intensive.

Interpretation and risk assessment of tumor findings in rodent bioassay would

typically include evaluation of

• Adequacy of the study (dose selection, adequate survival)

• Type (rare vs. common), lethality, and time of onset of tumor
• Comparison of concurrent and historical control incidences of tumor type
• Dose response of tumor incidence data
• Presence/absence of preneoplastic lesions
• Occurrence of class effects for particular drug class
• Long-term tissue retention of drug
• The presence of a threshold (no-effect-level)
• Safety margin based on exposure multiples (mg/m2 and/or AUC) at the
no-effect-level
• Presence/absence of structural alerts and/or DNA reactivity
• Species/gender differences in tumor incidence, toxicokinetics (AUC), protein
binding, and metabolism
• Molecular fingerprint of the tumor
• Need for mechanistic data, additional genotoxicity data, or transgenic mouse
data

Drug candidate selected for full development are typically negative for geno-
toxic potential because of the recognized relationship between genotoxicity
and tumor development. As a consequence of screening for lack of genotoxic
potential, the majority of tumors identified in rodent bioassays conducted in
support of pharmaceutical development occur by nongenotoxic (epigenetic)
mechanisms, often at doses much higher than anticipated human exposure.
There is a general agreement concerning the need to improve risk assessment
of bioassay data through the incorporation of more information on mechanism
of action of tumor induction. Investigative studies to identify the mechanisms
of action of rodent epigenetic carcinogens may clarify the relationship between
Value of combined animal toxicity testing 13

Table 1-1. Examples of tumor target organs and epigenetic mechanisms in rodents with
little relevance for humans

Rodent target organ Epigenetic mechanisms in rodents

Liver Liver enzyme inducers that increase liver weight

Inhibitors of TSH synthesis
Thyroid Inhibitors of T3-monodeiodinase (converts T4 to T3)
Liver enzyme inducers (increase disposition of
thyroid hormones)
Mesovarium β-Adrenergic agonists
Mammary gland Dopamine antagonists (increase prolactin)
Uterus Dopamine agonists (decrease prolactin)
Stomach Gastric acid antisecretory agents
Testis 5α-Reductase inhibitors
Pituitary, testis LHRH-analogs
Pituitary, mammary gland Estrogens
Uterus
Blood Immunosuppressants
Adrenal Drugs that affect calcium absorption and
homeostasis
Drugs that affect catecholamine release from the
adrenal medulla
Testis, ovary Drugs that affect FSH or LH secretion

Urinary bladder Carbonic anhydrase inhibitors

Drugs that affect urinary pH

Source: Adapted from Monro.27

findings in rodents and likely effects in humans. Mechanistic data often lead
to development of useful biomarkers. Numerous compounds induce tumors
in rodents at doses and through mechanisms clearly not relevant to humans.
Table 1.1 lists examples of epigenetic tumor formation in rodents with little
relevance for human cancer risk.
A number of activities that hold promise for improvements in carcinogenic
risk assessment of pharmaceuticals are underway. The Critical Path Institute,
a nonprofit organization dedicated to implementing the FDA’s Critical Path
Initiative through collaborations between the FDA and industry, has recently
established a Predictive Safety Testing Consortium (PSTC) of pharmaceutical
companies.28 One of several PSTC working groups, the Carcinogenicity Working
Group, is evaluating the results of chronic rat studies as a predictor for 2-year rat
carcinogenicity outcomes. The working group database contains approximately
240 chronic rat studies and matching carcinogenicity studies.29 Preliminary
analyses showed a strong sensitivity (87 percent) and negative predictivity (89
percent) of chronic study results for bioassay outcomes. Ultimately efforts like
this may lead to improved predictivity, increased knowledge regarding human
14 Olson and Davies

relevance of rodent tumors, revision of testing guidelines, reduced animal use,

and reductions in time to market for new pharmaceuticals. Additional areas of
research with potential promise for improvement in the current carcinogenicity
risk assessment paradigm include predictive toxicogenomics and computational
toxicology.30,31

1.5 Remaining gaps and additional perspectives on

predicting human toxicity

The pragmatic application of toxicology data and interpretation from in vivo

studies is of value to inform drug development stakeholders – including physi-
cians, regulators, and the drug development sponsors – of potential human
toxicity risks with an NCE and to facilitate safety risk management decision
making (i.e., speed of dose escalation, identification of dose-limiting toxicity,
making “go/no-go” project decisions). As shown previously, toxicity effects –
including biomarkers identified with hematology, coagulation and clinical
chemistry data or other novel urinary or blood biomarkers, and target tissue
effects from macroscopic and histopathologic evaluation – are evaluated in the
preclinical species.2,3 This approach has continued to be effective over many
decades in helping drug developers to manage and reduce the safety risks of
repeated and long-term drug exposure in patients. The evidence of this is that
controlled clinical trials have shown a long history and an overall excellent re-
cord of safety.
The predictive analysis of preclinical toxicology data has been shown previ-
ously in a quadrant model that takes account of the toxicity outcomes from pre-
clinical studies and occurrence or nonoccurrence of adverse effects recorded in
clinical trials (see Figure 1.5).7 As shown in Figure 1.5, the “true positive” (upper
left) and “true negative” (lower right) quadrants represent agreement (“concord-
ance”) between the clinical studies and the preclinical studies outcomes. That is,
a clinical toxic effect in a target tissue was also identified – or predicted – in the
preclinical model. This experience is important from the standpoint of placing
reliance on whether toxicity signals observed in the test systems have shown
reliable proficiency in identifying potential clinical toxicity. Conversely, does
the absence of a toxic effect (perhaps characteristic of a chemical class) correctly
predict that the clinical toxicity does not occur? Experience has shown that
some unusual or rare (idiosyncratic) toxicities (e.g., liver) may not occur until
after several years of marketing.
However we also know that the test systems are not infallible; they are subject
to false positive outcomes (i.e., a false alert) or false negative outcomes (missing
a human toxicity raises concern for all stakeholders). False positive outcomes may
be the result of several factors, including occurrence of toxicity only at exagger-
ated dose levels (identifiable by determining safety margins based on compara-
tive plasma exposure, or including biomarkers if available), or species-specific
effects or toxic metabolites (as shown to not occur in humans). The consequence
 Value of combined animal toxicity testing 15

Animal toxicity observed

Yes No

True Positive False Negative

Failure to identify
Yes

Accurately identify
Human toxicity observed

human adverse effects human adverse

effects;
SERIOUS ISSUE

False Positive True Negative

No

Misinterpretation; Accurately identify

possible loss of useful absence of human
therapeutic NCE’s adverse effects

Figure 1-5: Quadrant analysis of clinical predictivity. Reprinted from Regulatory Toxicology
and Pharmacology, vol. 32/1, Olson et al., “Concordance of the Toxicity of Pharmaceuticals in
Humans and in Animals” 12, 2000, with permission from Elsevier.

of unrecognized false positive signals may be the attrition of a valuable human

therapeutic as a consequence of misinterpretation of a nonrelevant preclinical
effect. A false negative outcome as described earlier, carries the potential of a high
safety risk impact on drug development. This depends directly on the incidence
and severity of the human toxicity with the NCE and the clinical indication
being treated. Ultimately, this becomes a risk–benefit decision by regulators and/
or the sponsor. As shown previously, animal models do have limits in their ability
to predict for some types of human toxicities including, for example, poor pre-
dictivity for dermal (rashes) and allergic or pseudoallergic adverse events.7 These
false negative outcomes and other examples of poor predictivity constitute a
gap with current in vivo testing that will hopefully be addressed by emerging
transgenic animal models, humanized in vitro test systems, ex vivo biomarkers, or
some other novel approaches that are described in subsequent chapters.
Ongoing progress in identifying new blood, urine, or other biofluid markers
of toxicity – potentially assessable in current animal models – also provides
optimism that such refinements will expand the translational usefulness of
these preclinical studies.6,7 Recent examples of emerging or novel biomarkers
that may become mainstream toxicity markers (as in research hospital clinical
pathology assessments) are troponin markers for cardiac and skeletal muscle
toxicity,32 and kidney biomarkers to delineate specific regional toxic effects
in the renal tubule/parenchyma.33 Further development of these and similar
assessable markers of toxicity will be pursued and usefully applied both pre-
clinically and clinically.
In summary, combined animal toxicity testing, including toxic effects and
signals recognized from safety pharmacology, clinical and histopathology, and
toxicokinetics endpoints, provides a predictive and useful basis for human safety
16 Olson and Davies

risk assessment in all phases of clinical development of new therapeutics. These

test systems are essential to sustain the long track record of safety in clinical
trials. The development of novel and robust biomarkers translatable from the
preclinical to the clinical environments will help to provide toxicologists, clini-
cians, and regulators with reliable and appropriate risk management measures
needed to address many potential safety concerns.

Acknowledgments

The authors acknowledge the helpful input, comments, and perspective of the
following contributors to the concepts included, and reviewers of this manu-
script: William J. Dougherty, Ph.D., Thomas Monticello, DVM, Ph.D., and David
Jacobsen-Kram, Ph.D.

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 2 Screening approaches for genetic toxicity

Jiri Aubrecht and Jinghai J. Xu

2.1 Introduction

Assessing human cancer risk associated with exposure to chemicals is an essential

component of the safety assessment paradigm for drugs, cosmetics, and indus-
trial chemicals. The current testing paradigm mainly relies on in vitro genotoxic-
ity testing followed by 2-year carcinogenicity bioassays in mice and rats. Because
of the technical complexity, high costs, and animal usage associated with 2-year
bioassays, the genetic toxicology battery has been designed to be highly sensitive
in predicting chemical carcinogenicity.1,2 In fact, the genotoxicity testing is used
as a surrogate for carcinogenicity testing and is required for initiation of clinical
trials3 and for most industrial chemicals. Since the beginning of genotoxicity
testing in the early 1970s, many different test systems have been developed and
used. Since no single test is capable of detecting all genotoxic agents, present
routine genotoxicity evaluation of pharmaceutical compounds incorporates a
standard battery of in vitro and in vivo assays.4 These tests include (a) bacterial
reverse-mutation tests, (b) in vitro tests for chromosomal damage (cytogenetic
assays and in vitro mouse lymphoma thymidine kinase assay), and (c) an in vivo
test for chromosomal damage (micronucleus test). To further enhance human
genotoxic risk assessment, the international ICH working group together with
other scientific groups have also suggested additional tests such as the measure-
ment of DNA adducts, DNA strand breaks, DNA repair, and recombination to
complement the standard battery in certain cases.5
Recent progress in molecular biology, genomics, and bioinformatics has
revolutionized drug discovery research. The current discovery process utilizes
high-throughput pharmacologically based screens for the identification of lead
compounds. Since standard genetic toxicology assays originated in the 1970s
and are still being employed, it is expected that their throughput will not satisfy
future needs. To facilitate testing, the standard assays must be re-­engineered or
replaced to both accommodate the increased numbers of compounds submit-
ted to testing and to provide more mechanistically based outcomes to enhance
human genotoxic risk assessment.
The goal of genetic toxicity screening assays is to predict the outcome of the
assays required by regulatory agencies (Figure 2.1.). Considering cost and uncertain

18
Screening approaches for genetic toxicity 19

Discovery and preclinical Phases of clinical development

Early lead Candidate I II III

Regulatory genetic
Genetic
Genetictoxicity
toxicityscreening
screening toxicology testing battery Carcinogenicity testing

• In vitro/In silico • In vitro/in vivo • In vivo (rat and mouse)

• Hazard identification • Hazard identification • Risk
• Will cmpd test positive in • Does cmpd cause DNA • Does cmpd cause cancer in
GLP assays? damage? animals?
• CAN quality guidelines • Required for IND • Required for NDA
• Cost • Cost • Cost
• <$100 • $60K/cmpd • $3M/cmpd
• Time • Time • Time
• 2 weeks, high throughput • 1–3 month • 3 years

Figure 2-1: Integration of genetic toxicity screening into safety assessment paradigm. Genetic
toxicity screening is used as a surrogate for carcinogenicity assessment and is required for in-
vestigational new drug (IND) submissions. The goal of genetic toxicity screening assays is to pre-
dict the outcome of the assays required by regulatory agencies. Considering cost and uncertain
drug development options associated with positive results in a regulatory genetic toxicology
testing battery, the application of genetic toxicity screening at early stages of drug development
for selecting clean chemical series and compounds is essential.

drug development options associated with positive results in the regulatory genetic
toxicology testing battery, the application of genetic toxicity screening at early
stages of drug development for selecting clean chemical series and compounds is
essential. There are three major themes providing foundation for the development
of screening assays. The compound’s potential to produce point mutations (muta-
genicity) is assessed mostly via miniaturized Salmonella assay platforms. Typically,
these assays utilize the same endpoint as the regulatory assay and provide reliable
data. Because of mainly practical reasons, the screening assays for chromosome
damage (clastogenicity) utilize alternative, more automation friendly endpoints
such as micronuclei and Comets (DNA breakage) instead of microscopic evalua-
tion of chromosome aberrations, which regulatory agencies typically require for
evaluation of chromosome damage. Since compounds producing chromosome
damage are not uncommon in drug development pipelines and regulatory assays
are laborious and time consuming, those screening assays are quite valuable for
evaluation of chemical series and selection of drug candidates. The third theme
applied to developing mainly high-throughput assays is genotoxic stress response
(also called SOS response) in bacteria. Genotoxic stress triggers a variety of bio-
logical responses including the transcriptional activation of genes regulating cell
survival. This idea led to the development of promoter–reporter construct-based
platforms (biosensors) for detecting genotoxicity in bacteria, yeast, and mamma-
lian cells (reviewed in Reference 6). Since genotoxic stress response provides a
fingerprint corresponding to the mechanisms of action of tested chemical, arrays
of tester strains have been developed where each tester strain or cell line carries a
promoter–reporter construct (biosensor) capable of detecting induction of a single
stress response pathway. An array of such biosensors covering multiple genotoxic
20 Aubrecht and Xu

stress-associated pathways provides even more complex insight into genotoxic

mechanisms (reviewed in Reference 6).

2.2 Screening approaches for mutagenicity

The analysis of mutations in specific bacterial marker genes serves as indicators of

mutagenicity. The Salmonella (Ames) assay has been developed to measure rever-
sions of specific auxotrophic bacterial mutations in Salmonella typhimurium.7 The
Salmonella test has been validated in studies using several hundred chemicals
and remains the required mutagenicity test by regulatory agencies.8 However,
the standard Salmonella test protocol is laborious, time consuming, and requires a
large amount of test article. Because of the high concordance of positive Salmonella
test results with rodent carcinogenicity, the positive findings in this assay typic-
ally lead to discontinuation of development. Therefore, the application of screen-
ing assay platforms capable of detecting bacterial mutagens in the regulatory
Salmonella assay is important. To increase the throughput of the Salmonella assay,
several modifications and alternative approaches have been developed.
Spiral modification of Salmonella assay9 was developed to eliminate the need
for serial dilutions and multiple plates. The sample delivery by a spiral plater allows
fixed as well as variable dilution depositions onto the agar plate. As a result, this
system permits testing over a wide range of concentrations on a single agar plate
using about 35–50 mg of test article. Although the introduction of the Spiral assay
has significantly enhanced compound screening, the requirement for agar plates
and limited potential for full automation restricts its future application.
Gradient plate assay (GPA) also utilizes the concentration gradient of tested
compounds in the agar plates.10 The concentration gradient is established by a
plating technique without the need for special instrumentation. In addition,
each gradient plate allows simultaneous testing of multiple Salmonella tester
strains. The GPA platform also eliminates the need for serial dilutions and mul-
tiple plates. However, the assay produces rather qualitative mutagenicity assess-
ment, and its potential for full automation is limited.
To increase the throughput a Miniscreen assay platform has been developed.
In principle, the Miniscreen is a scaled down version of the standard AMES
assay.11 Since the assay is performed in multiwell plates, only 20 mg of test art-
icle is needed. However, Miniscreen does not eliminate the serial dilution steps
and is not suitable for automation. In addition, it is also rather difficult to obtain
quantitative data for mutagenicity assessment.
On the other hand, a Mutascreen assay platform is a fully automated instru-
ment for mutagenicity assessment12. It is suitable for experiments involving all
bacterial tester strains. Its major advantages are streamlined protocol and elim-
ination of agar plates. The assay exploits the turbidity measurements of liquid
bacterial cultures for the detection of bacterial growth. Small volumes of cul-
tures are treated in multiwell plates, and the turbidity in each well is moni-
tored intermittently over a 24-h period by using a vertical pathway photometer.
Screening approaches for genetic toxicity 21

The analysis of growth kinetics allows calculations of mutation frequencies and

assessment of overall toxicity of tested compounds. Although this assay provides
streamlined protocol and can be fully automated, the turbidimetric measure-
ments of cell density are not highly sensitive or accurate.
In contrast to Mutascreen, the AmesII assay utilizes fluctuation analysis for
calculation of reversion frequency. Besides the standard Salmonella tester strain
TA98, the AmesII assay also includes new strains each designed to revert by only
one specific base pair substitution mutation.13 Thus, when mixed, all six base
pair substitutions can be represented in one culture.
The concept of a biosensor yielded the establishment of bacterial mutagenic-
ity assays that employ bioluminescent or biofluorescent gene products. The lux
genes permit cells to emit light due to bioluminescence that can be easily detected
using a luminometer. The bioluminescence test14 and its commercialized ver-
sion (Mutatox assay) uses dark mutants of luminous bacteria Vibrio fischeri and
determines the ability of various genotoxic agents to restore the luminescence
by inducing mutations.15 The increase of light emission in treated liquid culture
over the control is indicative of mutagenicity. This assay has potential for full
automation.
A special TA98 Salmonella tester strain carrying luxAB genes under the control
of constitutive promoter is used in a bioluminescence Salmonella assay platform.16
The authors have shown that the light emission corresponds to the number of
living cells in culture (biomass). The mutagenicity is evaluated as an increase of
revertant biomass using a microluminometer. Since only viable cells are capable
of light emission, this technique also permits easy evaluation of overall toxicity
of tested chemical. This elegant approach eliminates the need for multiple agar
plates and reduces laborious pipetting steps. In addition it can be easily auto-
mated and miniaturized.
Biofluorescence is utilized in a green fluorescent protein (GFP)-based E. coli
mutation assay.17 In this system, the E. coli tester strains carrying the GFP form of
Aequorea victoria jellyfish serve as mutation biosensors. In the reversion system,
the treatment of bacteria carrying a specific frameshift mutation in the GFP
gene with genotoxic agents yields fluorescent colonies indicating that reversion
to the wild type has occurred. In the forward system, the wild type GFP is under
the control of arabinose PBAD promoter. Mutations in the control region that de-
repress the promoter result in the expression of GFP and biofluorescence.
Recently, we have reported the development of the bioluminescent reverse
mutation assay in Salmonella as a fully automated higher-throughput platform
applicable for the screening of large sets of test compounds18 (Figure 2.2). The
bioluminescent Salmonella assay utilizes genetically engineered standard Ames
Salmonella tester strains TA98 and TA100 expressing the lux (CDABE) operon
from Xenorhabdus luminescens. The assay employs bioluminescence as a sensor
of changes in bacterial metabolism associated with starvation, hence effectively
identifying colonies of histidine-independent revertant cells. In this assay, the
cells are treated in agar medium on a multiwell plate. The cells that acquired the
reverse mutation and thus can function in the absence of histidine form small
22 Aubrecht and Xu

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 44

Day

Inoculate cells Wash cells, Prepare Incubation Scoring &

overlay +S9, (~48 h) evaluation
Compound dilutions
Dosing
Medium – tryptophan (E. coli)
– histidine (Salmonella)

Medium + tryptophan (E. coli)

+ histidine (Salmonella)

Figure 2-2: Bioluminescent Salmonella assay workflow. The luminescent histidine-dependent

cells are exposed to tested compounds in agar overlay containing only traces of histidine in
multiwell-plate format. The reverse-mutation events restore endogenous histidine synthesis re-
sulting in luminescent colonies of histidine-independent cells that can be visualized via CCD
camera. The fully automated instrument in conjunction with automated image analysis of plates
enables the analysis of 100 plates in one run.

luminescent colonies. These colonies can be easily detected and counted via a
sensitive charge-coupled device (CCD) camera, which captures the luminescent
image of an entire multiwell plate at once. The digitized image is then analyzed
using an automated image analysis algorithm. Since the image analysis algorithm
actually counts the number of revertant colonies, it avoids the common mistakes
associated with gross luminescent measurements that cannot distinguish the dif-
ference between lots of small colonies and fewer but larger colonies. The biolumi-
nescent Salmonella assay coupled with the automated image analysis algorithm
provides an economical, higher-throughput tool for assessment of mutagenicity
with high concordance to outcomes in the current Ames standard plate incorpo-
ration method18 and provides reliable data across multiple laboratories.19

2.3 Screening approaches for clastogenicity

The incidence of chromosome damage findings among lead compounds in

drug discovery is quite common (approximately 30 percent of drug candi-
dates testing positive). Although the impact of the positive findings is not as
severe as in case of positive mutagenicity findings, the application of screen-
ing tools capable of providing data in sufficient throughput in early drug dis-
covery is essential to avoid delays in drug development or potential attrition
of the drug candidate.
In vitro micronucleus (IVMN, or MN) assay detects extra-nuclear chroma-
tin present in the cell’s cytoplasm arisen after cell division as a consequence
of chromosome (DNA) breakage (clastogenicity) or lagging chromosome (aneu-
genicity). The lagging chromosome is caused by the compound’s interference
Screening approaches for genetic toxicity 23

(A)

Arrows indicate binucleate

cells with microiuclei

(B)

96-well plates

Quality control

Figure 2-3: Comparison of manual (microscopic) and automated image analysis-based in vitro
micronucleus assay platforms. (A) The cells are treated on chambered microscopic slides. Visual
microscopic analysis of micronuclei is performed after fixation and staining with DNA-specific
dye via fluorescent microscope. Since the microscopic analysis is laborious and time consum-
ing, the throughput is limited to four to six compounds per week. (B) The automated image
analysis–based platforms typically utilize 96-well plates for the treatment of cells. After fixation,
the cells are stained with DNA-specific dye, and images of nuclei and micronuclei are acquired
using high-throughput scanner technology. Application of sophisticated image analysis algo-
rithms enables fast detection of micronuclei. The assay operator then typically performs only
quality control of the data. The automated platform provides opportunity for testing typically
100–200 compounds per week.

with the spindle apparatus or cellular signaling pathways. The mode of micro-
nucleus formation can be investigated via use of kinetochore antibody stain-
ing to identify micronuclei containing centromeric DNA indicating the whole
chromosome20. The MN assay can be conducted in most proliferating cell lines
but is typically performed in Chinese hamster ovary (CHO), Chinese hamster
lung (CHL), human lymphocytes or mouse lymphoma cells L5178Y. The cells are
exposed to the test compound in the presence and absence of liver S9 homoge-
nate, and the incidence of micronuclei of the compound-treated sample is com-
pared with the vehicle-treated controls. The positive response is characterized as
a dose-dependent increase of incidence of micronuclei.
The advantage of the MN assay is its relative simplicity and low compound
requirement. It is possible to provide data with 20–30 mg of test compound.
The presence and incidence of micronuclei is typically examined and enumer-
ated microscopically. However, the laborious and time-consuming microscopic
analysis severely limits assay throughput and its application as a screening tool
in drug discovery. Thus, alternative methods for detection of micronuclei have
been developed21–23 (Figure 2.3). One approach exploits image analysis algo-
rithms. The advantage of image analysis is the ability to use the 96-well format
and high-throughput microscopic scanning instrument such as the ArrayScan
(by Cellomics, now Thermo Fisher). A variety of algorithms have been developed
for the enumeration of micronuclei.24–26 In our laboratory, we have developed
24 Aubrecht and Xu

(B) Cell
(A) Raw
outline with
image
main nuclei

(C) Cell
(D) Cell-by-
outline with
cell data
micronuclei

Figure 2-4: Automated image analysis of the in vitro micronucleus assay. See color plates.

a fully automated approach relying on an image analysis algorithm. The cells

are treated in 96-well plates using standard laboratory automation methods and
stained with the DNA-specific dye Hoechst 33342. This dye stains main nuclei
and micronuclei with sufficiently high signal-to-background ratio to allow auto-
mated identification of these target objects. The cells are counterstained with
acridine orange, a dye that stains RNA and proteins in cytoplasm. Then the plates
are scanned using ArrayScan with a setting of 20× magnification and an XF93
filter. The 20× magnification allows image capture from a larger field of view
compared to the traditionally used 40× or 60×, while maintaining sufficient reso-
lution to detect micronuclei. The ArrayScan captures the nuclei/micronuclei and
cytoplasm images in separate wavelength or channels, and saves all the images
and their associated meta-data. These images are then analyzed using an image
analysis algorithm. In the first step, raw image of the acridine orange channel
is used to “identify” cell outlines (e.g., as in Figure 2.4a). This step converts the
acridine orange image into a binary map, where the extracellular space becomes
“0” and intracellular space becomes “1.” Next, the acridine orange image under-
goes a series of image “dialation” and “erosion” steps in order to automatically
segment adjacent and contacting cells into individual cells. The segmented “cell
outline” is then combined with the raw nuclei image from the Hoechst chan-
nel (e.g., as in Figure 2.4b). The algorithm automatically “identifies” main nuclei
within a cell, according to predefined ranges of size and shape (e.g., Figure 2.4b).
Following that, the algorithm further “searches” for micronuclei according to
the following criteria: (1) having a size that is less than a third the size of the
main nucleus, (2) being located within the cell outline, (3) not touching the main
nucleus, (4) having no more than two micronuclei within the same cell, and (5)
having a round or close-to-round shape. If a cell possesses more than two micro-
nuclei, the ­algorithm reports them as such (which can be an indication of nuclear
Screening approaches for genetic toxicity 25

fragmentation, e.g., due to apoptosis). After the micronuclei are found (e.g., as
in Figure 2.4c), the algorithm automatically compiles cell-by-cell data (e.g., as in
Figure 2.4d), as well as well-level statistics including micronuclei incidence. The
whole system including plate handling, automated image acquisition, and data
calculation is capable of providing data for 100–150 compounds per week.
An alternative approach for automating MN assay relies on flow cytometry.27,28
In principle, the flow cytometer is used for detecting nuclei and small micro-
nuclei after they were released from cells by cell lysis. The limiting factor for
application of flow cytometry for detection of micronuclei is its difficulty to dif-
ferentiate micronuclei from apoptotic and genotoxic events. Therefore, a fluores-
cent dye is covalently linked by photoactivation to chromatin of apoptotic and
dying cells prior to lysing the cell membranes. This results in true micronuclei
being labeled with a DNA dye and apoptotic or chromatin fragments from dying
cells being stained with both the DNA and covalently linked dye. The flow cyto-
metric analysis provides an elegant method enabling simultaneous detection of
micronuclei and cell cycle analysis.
In vitro comet assay provides a sensitive tool for detection of DNA breakage in
individual cells. In addition, the comet assay can detect DNA lesions that can be
converted to DNA strand breaks. Typically, the comet assay is conducted in CHO,
CHL, human lymphocytes, or mouse lymphoma cells LY-1457. Briefly, the cells are
treated with tested compounds in presence or absence of exogenous S9 rat liver
homogenate and then resuspended into single-cell suspension in agarose gel on
microscope slides. After the slides are prepared, the cell membrane is lysed, and
the nuclei are exposed to alkaline electroporesis.29,30 During this procedure, long
strands of chromosomal DNA denaturate, and low molecular weight DNA frag-
ments that arose as a consequence of DNA damage migrate toward positive elec-
trode when an electrical field is applied, forming a comet-like pattern. Thus, the
nucleus of undamaged DNA appears to be round, whereas the nucleus with dam-
aged DNA forms a trailing comet tail. The advantage of this assay is a relatively
small compound requirement (10 mg) and the potential for full automation of
the comet analysis. The disadvantage of this assay platform is the unknown role
of cytotoxicity in comet formation that might contribute to false positive results
in comparison with the clastogenicity assay accepted by regulatory agencies.
The DEL (deletion) recombination assay detects the incidence of intrach-
romosomal recombination events between two truncated alleles of HIS3 gene
arranged as a head to tail repeat in Saccharomyces cerevisiae. 31,32 The recom-
bination events produce deletions of the intervening sequence resulting in
restoration of the functional HIS3 allele. Briefly, the yeast cells are treated
with tested compound in presence and absence of S9 rat liver homogenate.
The HIS3-proficient cells can be easily detected as yeast colonies arisen in
histidine-free medium. The positive signal in this assay is considered as a
dose-dependent increase of HIS3-proficient colonies when compared to
vehicle-treated controls. Earlier mechanistic studies have shown that dou-
ble-strand breaks in DNA cause increased DEL recombination frequency. 33,34
Since the DNA deletions detected by the DEL assay represent one kind of
26 Aubrecht and Xu

chromosome aberration, the DEL assay data correlate with other chromo-
some aberration assays. 35,36 The deletion recombination is also sensitive to
other DNA lesions including DNA adduction, oxidative stress, and so on. In
fact, the DEL assay is capable of differentiating direct (DNA reactive) from
indirect (DNA nonreactive) mechanisms of genotoxicity based on the shape
of the dose response curve. Direct-acting compounds display a linear dose
response, whereas indirect-acting compounds display a threshold response,
only at cytotoxic concentrations. 37 Since the DEL assay detects clastogenic as
well as mutagenic compounds, 38 this test has a potential to reduce the screen-
ing battery into a single test replacing the separately run mutagenicity and
clastogenicity assays 39. In addition, the assay has potential to provide insights
into mechanisms of genotoxicity (i.e., DNA reactive vs. DNA nonreactive).
Tumor cells frequently contain genome rearrangements such as deletions, trans-
versions, and translocations. In fact, an elevated frequency of recombination and
genome rearrangements is found in cells from human patients suffering from can-
cer-prone diseases such as ataxia telangiectasia, Li-Fraumeni syndrome, Blooms
syndrome and Werners syndrome, Cockayne’s syndrome, Fanconi’s anaemia,
Lynch syndromes I and II, Wiscott-Aldrich syndrome, and xeroderma pigment-
osum (extensively reviewed in Reference 40). These data indicate that a high fre-
quency of genetic rearrangements may be a causative factor in tumor development
and thus provide mechanistic relevance for the DEL assay as a tool for detection
of carcinogens. In fact, the DEL assay is inducible by carcinogens with varying
mechanisms of genotoxicity.41 Application of the DEL assay in drug development
as a screening tool is limited by the permeability of the yeast cell wall for lar-
ger lipophilic compounds. Thus, a clear direction for future assay improvement,
namely development of a permeable yeast tester strain, has been identified.36 The
application of improved tester strain is expected to increase the sensitivity of the
assay, and it is crucial for future large-scale validation of the DEL assay as a clasto-
genicity screen. Nevertheless, the high degree of concordance with the IVMN and
other assays for clastogenicity, the consistency of results, amenability to automa-
tion, and economical nature of the DEL assay makes it an excellent candidate for
use as a genotoxicity assay for screening of new compounds.

2.4 Stress (SOS) response-based screening assays

Early studies in mammalian cells using ionizing radiation and prototypical

DNA-damaging compounds have identified genes that are induced by DNA
damage.42–44 These genes have been shown to play major roles in basic cellular
processes such as cell cycle and growth arrest, cellular signaling and apopto-
sis (see review in Reference 45). The discovery of these genes has lead to the
idea that genotoxicity can be identified by monitoring the expression of stress
responsive genes. In bacteria, the transcriptional activation of the SOS response,
measured using promoter–reporter constructs (biosensors) was exploited for
detecting genotoxicity of chemicals (Table 2.1, Figure 2.5).46 –51 Similarly in the
 Table 2-1. Selected bacterial biosensor-based assays used for detecting genotoxicity

Assay Promoter Reporter gene(s) Stressors detected Host Reference #

SOS chromotest sfiA lacZ, alkaline Benzofurans, naphtafurans, fungal toxins, MMC, NCS, MMS, EMS, DMS, E. coli 50
phosphatase DES, b-propiolactone, propane sultone, DMN, DEN, MNNG, B[a]P, 4NQO,
DMSO, NaCl, Caffeine, Aspirin
Umu-test umu lacZ DNA-damaging agents (radiation or chemical) S. typhimurium 48
Rec-lac test recA lacZ DNA-damaging agents (radiation or chemical), 4NQO, MMC, MNNG, E. coli 47
nalidixic acid, DMS, H2O2, formaldehyde, UV radiation, tert-butyl
hydroperoxide, cumene hydroperoxide, and streptonigrin
SOS-lux test cda, recA luxCDABFE DNA-damaging agents (radiation or chemical), MMC, MNNG, nalidixic E. coli 49
acid, DMS, H2O2, formaldehyde, UV and gamma irradiation
VITOTOX recN luxCDABE PAHs Bacterial (E. coli, 60
S. typhimurium)
GreenScreen rad54 gfp DNA-damaging agents S. cerevisiae 52
GreenScreenHC GADD45 gfp DNA-damaging agents Human TK6 65

Notes: 4NQO: 4-nitroquinoline-N-oxide; AP: Alkaline phosphatase; B[a]P: Benzo[a]pyrene; cda: Cytidine deaminase; DEN: Diethylnitrosamine; DES: Diethyl sulfate; DMN: Dimethylnitrosamine;
DMS: Dimethyl sulfate; DMSO: Dimethyl sulfoxide; EMS: Ethyl methanesulfonate; GFP: Green fluorescent protein; H202: Hydrogen peroxide; lacZ: β-galactosidase; lux: Luciferase; MMC: Mitomycin
C; MMS: Methylmethanesulfonate; MNNG: N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine; NaCl: Sodium chloride; NCS: Neocarsinostatin; PAHs: Polyaromatic hydrocarbons; rad 54: Radiation sensitive (or
related); rec: Recombination protein; sfiA: Cell division inhibitor; umu: Mutagenesis by UV and mutagens. Reprinted with permission from Pharmacogenomics 2005;6(4):419–428.

27
28 Aubrecht and Xu

(A)
Stress gene promoter Reporter gene

(B)
Stress gene promoter Reporter gene

Figure 2-5: Principle of biosensor-based assay platforms. (A) A promoter-reporter construct

consisting of stress gene promoter and appropriate reporter such as green fluorescent protein or
luciferase (biosensor) is integrated into the genome of cells used for detection of genotoxicity.
In case of bacterial assays the promoter–reporter construct may reside on an episomal plasmid.
(B) The treatment of biosensor-carrying cells with genotoxic agents activates the otherwise si-
lent stress promoter and initiate reporter gene transcription and production of reporter protein.
The resulting fluorescence or luminescence is detected via high-throughput detectors. Since
these assay platforms can be performed in high-density plates, the throughput can reach 1,000
compounds per week.

yeast, RAD54 promoter activity52,53 has been utilized to detect genotoxic stress.
Recently, the development of GreenScreen GC and GreenScreen HC has been
reported.52,65 Those assays utilize GFP as reporter for RAD54 in Saccharomyces
and GADD45 in human TK6 cells. However, monitoring transcriptional activity
of a single gene provides only limited characterization of the cellular stresses.
Accordingly, arrays of biosensors consisting of bacterial strains with promot-
er–reporter constructs sensitive to various stresses were developed and used to
study the mechanisms of action of unknown toxicants (Table 2.2). The major
advantage of this approach relies on relatively easy adaptation of biosensor assay
platforms to high-throughput screening that is suitable for testing hundreds of
compounds.
Since the activation of stress genes expression is a mechanistically different
endpoint than structural or numerical chromosome damage or point mutations,
the concordance of data from biosensor-based assays with traditional assay plat-
forms detecting chromosome damage or mutagenicity is not perfect. For instance,
monitoring mRNA levels of GADD45 in HepG2 cells was utilized as a screen
for genotoxicity to test chemicals from combinatorial libraries in drug discov-
ery.54 Although, a correlation between chemical structure and up-regulation of
GADD45 mRNA levels was apparent, the change in GADD45 transcript did not
correlate with the ability of test compounds to produce mutations in a standard
Salmonella reverse-mutation test.54 Furthermore, monitoring p53 protein levels
after treatment with chemicals was also proposed as a tool for identifying poten-
tial genotoxic carcinogens.55,56 However, although the p53 pathway or the induc-
tion of GADD45 can be activated by a wide spectrum of DNA-damaging agents,
other stresses such as hypoxia, nutrient, starvation, alteration of the ubiquitin
pathway, or ribonucleotide depletion have also been shown to affect the p53
pathway and/or the GADD45 gene levels.44,57–59 Despite these stresses, applying a
 Table 2-2. Examples of arrays of biosensors utilized to evaluate toxic mechanisms

Assay Promoter Reporter genes Stressors detected Host Reference #

micF, lon, fabA, lac, katG, luxCDABE sodium azide, 4-nitrophenol, phenol, 3,5-DCP, proflavine Bacterial (E. coli) 46
uspA, micF hemi sulfate, NiSO4, CTAB, fluoranthene, PbCl2, HgCl2, CdCl2,
H2O2, KH2AsO4, ZnCl2, 2,4-DNP, PCP, 2,4,5-T, 2,4,6-TCP,
2,4-D, benzidine, methyl viologen, parathion, malthion, SDS,
propiconazole
Pro-tox (C) katG, micF, osmY, uspA, recA, lacZ (DNA damage) trivalent chromium Bacterial (E. coli) 61
zwf, umuDC, merR, ada, dinD,
soi28, nfo
Cat-tox (L) cyp1A1, gstYa, hmtIIA, Fos, CAT DNA-damaging agents (vanadocene complexes, cisplatin, Mammalian (human 62, 63
xhf, hsp70, gadd153, gadd45, 3-MC, PMA, RA, MMS, heavy metals, arsenic) liver cells)
grp78, xre, NF-κBRE, gre,
p53RE, RARE
Cat-tox (D) DNA polβ, p53, gadd153, CAT DNA-damaging agents (UV irradiation, MMS, EMS, MNNG, Mammalian (human 64
gadd45, cfos, tPARE, tPA DMN, MMC, actinomycin D, Hydroxyurea) colon cells)

Notes: 2,4,5-T: 2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid; 2,4,6-TCP: 2,4,6-trichlorophenol; 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid; 2,4-DNP: 2,4-dinitro phenol; 3-MC: 3-methylcholanthrene; 3,5-
DCP: 3,5-dichlorophenol; ada: Transcriptional adaptor; CAT: Chloramphenicol acetyltransferase; CdCl2: Cadmiumchloride; PCP: Pentachloro phenol; CTAB: Cetyl trimethyl ammonium bromide;
CYP: Cytochrome P450; dinD: DNA-damage-inducible protein; DMN: Dimethylnitrosamine; DNA polb: DNA polymerase b; EMS: Ethyl methanesulfonate; fabA: β-hydroxydecanoyl thioester dehydrase;
Fos: Protooncogeneprotein; GADD: Growth arrest and DNA-damage-inducible; gre: glutocorticoid response element; grp78: Glucose-regulated proteinprecursor; gstYa: Glutathione S-transferase
Ya chain; H202: Hydrogen peroxide; HgCl2: Mercury chloride; hmtllA: Heavy metal tolerance protein; hsp70: Heat shock protein 70; katG: catalase-peroxidase protein G; KH2AsO4: Potassium
arsenate; lacZ: β-galactosidase; lux: luciferase; merR: Bacterial regulatory protein; micF: small RNA/regulatory antisense RNA; MMC: Mitomycin C; MMS: Methylmethanesulfonate; MNNG: N-methyl-
Nnitro-N-nitroso guanidine; NF-kBRE: Nuclear factor κB response element; nfo: Endonuclease IV; NiSO4: Nickel sulfate; osmY: Osmotically inducibleprotein Y; p53RE: Tumor suppressor p53
regulatory element; PbCl2: Lead chloride; PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetate; RA: Retinoic acid; RARE: Retinoic acid response element; rec: Recombination protein; SDS: Sodium dodecyl
sulfate; soi28: Superoxide inducible gene; tPA: Tissueplasminogen activator; tPARE: Tissue plasminogen activator response element; uspA: Universal stress protein A; xhf: Collagenase; xre: Phage-
related transcriptional regulator; ZnCl2: Zinc chloride; zwf: Glucose-6-phosphate dehydrogenase. Reprinted with permission from Pharmacogenomics 2005;6(4):419–428.

29
Exploring the Variety of Random
Documents with Different Content
weggruben, um so weniger hatte der Stein Boden unter sich, auf
dem er stehen konnte, und um so mehr kam sein Gleichgewicht ins
Wanken; und wie er dann ganz ins Wanken kam, da stemmten sie
sich noch alle Mann von der anderen Seite gegen den Stein, so,
wissen Sie, mit Hurra und auf russische Art: der Stein schaukelte
mal, und – plumps! fiel er in die Grube! Dann wurde fix
zugeschaufelt, mit einem Rammklotz festgestampft, mit Steinchen
festgepflastert – alles glatt, und der Stein war weg!“
„Denken Sie sich!“ sagte Werssiloff.
„Und was da an Menschen zusammenlief! Menschen, mehr als
man zählen kann! Die Engländer, die nämlich schon längst alles
erraten hatten, stehen da, sind wütend. Monferrand kommt
angefahren: ‚Das,‘ sagt er, ‚ist bäurisch gemacht, ist gar zu einfach.‘
– Aber das ist doch gerade der ganze Witz der Sache, daß es so
einfach zu machen war, ihr aber, ihr Schafsköpfe, seid nicht darauf
verfallen! Und ich kann Ihnen sagen, dieser Vorgesetzte, nämlich
dieser hohe Würdenträger und Staatsmann, – der umarmte ihn
einfach und küßte ihn: ‚Ja, woher kommst du, wer bist du?‘ fragt er
ihn. – ‚Wir sind aus dem Jaroslawschen, Euer Gnaden, sind unserem
Handwerk nach, mit Verlaub zu sagen, eigentlich Schneider, im
Sommer aber kommen wir nach der Hauptstadt, um mit Früchten
bißchen Handel zu treiben, Euer Gnaden.‘ Nun, die Obrigkeit erfuhr
davon, und ihm wurde eine Medaille umgehängt; und so ging er
denn seit der Zeit immer mit der Medaille am Halse; aber dann hat
er sich dem Trunk ergeben, sagt man. Wissen Sie, ein russischer
Mensch, der bändigt sich ja nicht! Deshalb nämlich werden wir auch
bis heute von den Ausländern ausgesogen, ja ... Ja ... sehen Sie
wohl!“
„Ja, allerdings, die russische Art ...“ begann Werssiloff, aber da
wurde mein Wirt von der kranken Frau gerufen, und er mußte zu ihr
eilen, – zu seinem Glück; denn ich hätte mich nicht mehr lange
bezwingen können. Werssiloff lachte.
„Mein Lieber, er hat mich ja schon eine ganze Stunde amüsiert,
noch bevor du kamst. Diese Anekdote vom Stein ... die ist doch für
ihn die einzige Möglichkeit, sein patriotisches Empfinden
auszudrücken, – wie darf man ihn da unterbrechen? Du hast es doch
selbst gesehen: er verging ja förmlich vor Wonne. Und außerdem
liegt dieser Stein, wenn ich mich nicht sehr irre, noch heute dort und
ist noch niemals versenkt worden ...“
„Ach, bei Gott!“ rief ich, „das ist allerdings wahr! Aber wie durfte
er dann ...“
„Was hast du? Du bist ja, wie’s scheint, ganz ernstlich
aufgebracht? Laß gut sein. Er hat da etwas verwechselt. Ich habe
eine ähnliche Geschichte von einem Stein schon in meiner Kindheit
gehört, nur lag jener Stein selbstverständlich irgendwo anders. Ich
bitte dich: ‚die Obrigkeit erfuhr davon‘! – seine ganze Seele sang ja
förmlich, als er das sagte. In diesem traurigen Milieu geht es ja nicht
ohne Anekdoten. Sie kennen eine Unmenge solcher Geschichten,
und sie gefallen ihnen ... Hauptsächlich wegen ihrer eigenen
Ungeistigkeit. Sie haben nichts gelernt, sie wissen nichts
Wissenswertes, nun, ein Mensch aber will doch manchmal auch von
etwas anderem reden, als nur vom Kartenspiel oder ewig
fachsimpeln, man will doch auch einmal von etwas allgemein
Menschlichem, Poetischem reden ... Was ist er, dieser Pjotr
Ippolitowitsch?“
„Ein armer Kerl, und sogar ein unglücklicher Mensch.“
„Nun, siehst du, vielleicht spielt er nicht einmal Karten? Ich sage
dir nochmals, mit der Erzählung solcher Anekdötchen kommt er dem
Bedürfnis seiner Nächstenliebe nach: er wollte doch auch uns
glücklich machen. Und auch seiner Vaterlandsliebe hat er ein
Genüge getan. Dann haben sie da noch eine Anekdote, – wie die
Engländer Sawjaloff eine Million gezahlt hätten, damit er seine
Fabrikate nicht mehr mit seiner Fabrikmarke versehe.“
„Ach Gott, ja, diese Anekdote habe ich auch gehört.“
„Wer hat sie nicht gehört? Und wenn er sie erzählt, weiß er ja
ganz genau, daß du sie schon gehört hast, aber er erzählt sie
trotzdem und macht sich selbst glauben, daß du sie noch nicht
gehört hast. Die Anekdote vom Traum des Schwedenkönigs scheint
bei ihnen jetzt schon veraltet zu sein; in meiner Jugend wurde sie
noch mit Wonne erzählt, und in geheimnisvollem Flüsterton, ganz
wie die andere Geschichte, daß zu Anfang des Jahrhunderts jemand
im Senat vor den Senatoren auf den Knien gelegen habe. Über den
Kommandanten Baschutzki gab es gleichfalls viele Anekdoten, zum
Beispiel, wie das Denkmal gestohlen wurde. Besonders beliebt sind
Anekdoten, die sich angeblich bei Hofe zugetragen haben. Zum
Beispiel von Tschernüschoff, dem ehemaligen Premierminister; etwa
wie er, der siebzigjährige Greis, sich äußerlich so herzurichten
verstanden hätte, daß er wie ein Dreißigjähriger aussah, und der
selige Kaiser sich bei den Empfängen jedesmal über ihn wunderte.“
„Auch diese Geschichte kenne ich.“
„Wer kennt sie nicht? Alle diese Anekdoten sind der Gipfel
geistiger Unsachlichkeit; aber du mußt wissen, daß dieser Typ des
unsachlichen Menschen viel tiefer sitzt und sogar viel verbreiteter ist,
als wir gemeinhin annehmen. Die Lust zu lügen, um seinen Nächsten
glücklich zu machen, wirst du sogar in unserer besten Gesellschaft
antreffen; denn wir leiden alle an dieser Unenthaltsamkeit unserer
Herzen. Nur sind unsere Geschichten von etwas anderer Art; was
aber bei uns zum Beispiel allein von Amerika alles erzählt wird, und
noch dazu von Staatsmännern, das ist fürchterlich. Ja, ich muß
bekennen, daß ich selbst zu diesem unenthaltsamen Typ gehöre und
mein ganzes Leben lang darunter gelitten habe ...“
„Die Anekdote von Tschernüschoff habe auch ich schon ein
paarmal erzählt.“
„Sogar schon selbst erzählt?“
„Hier ist außer mir noch ein Zimmermieter, ein Beamter, der
gleichfalls Pockennarben hat, ein schon alter Mann, aber er ist ein
furchtbarer Prosaiker, und sobald Pjotr Ippolitowitsch zu erzählen
beginnt, fängt er sofort an ihn zu unterbrechen und aus dem Text zu
bringen. Das hat er so weit gebracht, daß mein Wirt ihn wie ein
Sklave bedient und ihm alles zu Gefallen tut, damit er ihn nur
erzählen läßt.“
„Das ist bereits ein anderer Typ des Unsachlichen und vielleicht
sogar ein widerlicherer als der erste. Der erste – ist ganz
Begeisterung! ‚Laß mich nur etwas faseln, und du wirst sehen, wie
schön alles sich abspielt!‘ Der zweite Typ – ist ganz Mißgunst und
Prosa: ‚Ich laß dich nicht faseln, wo geschah das, wann, in welchem
Jahre?‘ – mit einem Wort, der zweite Typ ist ein Mensch ohne Herz.
Mein Freund, laß den Menschen immer ein wenig dichten – es ist
eine unschuldige Lust. Laß ihn sogar viel dichten. Erstens beweist du
damit Zartgefühl, und zweitens wird man dich dafür gleichfalls
dichten lassen – also zwei Vorteile zugleich. Que diable![38] Man
muß seinen Nächsten lieben. Aber für mich ist es Zeit. Du hast dich
sehr nett eingerichtet,“ bemerkte er, sich vom Stuhl erhebend. „Ich
werde Ssofja Andrejewna und deiner Schwester erzählen, daß ich
bei dir gewesen bin und dich bei guter Gesundheit angetroffen habe.
Auf Wiedersehen, mein Lieber.“
Wie, war das alles? Aber das war ja gar nicht das, was ich
brauchte! Ich hatte etwas ganz anderes erwartet, natürlich die
Hauptsache, aber ich begriff nun und sah ein, daß es anders ja gar
nicht möglich war. Ich nahm das Licht und begleitete ihn auf die
Treppe hinaus; auch mein Wirt eilte diensteifrig herbei und wollte ihn
gleichfalls begleiten, aber ich packte ihn hinter Werssiloffs Rücken
am Arm und stieß ihn wütend zurück. Er sah mich zwar verwundert
an, drückte sich aber sogleich.
„Diese Treppen ...“ sagte Werssiloff undeutlich und langsam,
augenscheinlich nur, um etwas zu sagen und somit zu verhüten, daß
ich etwas sagte, wovor er Angst zu haben schien, „... diese Treppen
– ich bin an so was nicht gewöhnt, und du wohnst im dritten Stock,
– übrigens, jetzt finde ich schon den Weg ... Bemühe dich nicht,
mein Lieber, du wirst dich noch erkälten.“
Aber ich ging nicht zurück. Wir waren schon auf der zweiten
Treppe.
„Ich habe diese ganzen drei Tage nur auf Sie gewartet,“ entrang
es sich mir plötzlich; wie von selbst; mein Atem stockte.
„Ich danke dir, mein Lieber.“
„Ich wußte, daß Sie bestimmt kommen würden.“
„Und ich wußte, daß du wußtest, daß ich bestimmt kommen
würde. Hab Dank, mein Lieber.“
Er verstummte. Wir waren fast schon an der Haustür angelangt,
und ich folgte ihm immer noch. Er wollte die Tür öffnen – ein kurzer
Windstoß löschte mein Licht. Da ergriff ich plötzlich seine Hand; es
war stockdunkel. Er zuckte zusammen, sagte aber nichts und
schwieg. Ich beugte mich plötzlich über seine Hand und küßte sie
gierig, küßte sie mehrmals, küßte sie immer wieder.
 „Mein lieber Junge, ja wofür liebst du mich denn so?“ sagte er,
aber schon mit einer ganz anderen Stimme.
Seine Stimme bebte, etwas ganz Neues klang in ihr, ganz als hätte
nicht er gesprochen.
Ich wollte irgend etwas erwidern, brachte aber nichts über die
Lippen und lief zurück nach oben. Er aber wartete immer noch und
stand auf demselben Platz; erst als ich schon im dritten Stock
angelangt war, hörte ich, wie unten die Haustür aufging und dann
laut zuschlug. An meinem Wirt, der mir, weiß Gott weshalb, wieder
in den Weg lief, schlüpfte ich schnell vorüber in mein Zimmer,
verriegelte die Tür von innen und warf mich, ohne Licht zu machen,
auf mein Bett, grub das Gesicht ins Kissen und – weinte, weinte.
Zum erstenmal weinte ich wieder seit der Zeit bei Touchard! Das
Schluchzen erschütterte mich mit solcher Gewalt, und ich war so
glücklich ... doch wozu das beschreiben.
Ich habe das jetzt niedergeschrieben, ohne mich zu schämen;
denn vielleicht war das alles nur gut, trotz der ganzen
Ungereimtheit.

III.

Aber er mußte mir dafür schon büßen! Ich wurde ein schrecklicher
Despot. Selbstverständlich ist diese Szene von uns nachher nie
erwähnt worden. Im Gegenteil, wir begegneten uns am dritten Tage,
als hätte sich nicht das geringste zwischen uns zugetragen, – mehr
noch: ich war an dem Abend nahezu grob, und er war auch von
einer gewissen wortkargen Trockenheit. Das trug sich wieder in
meiner Wohnung zu; ich war, ich weiß nicht weshalb, noch immer
nicht zu ihnen gegangen, trotz meines Verlangens, meine Mutter zu
sehen.
Gesprochen haben wir in dieser ganzen Zeit, das heißt, in diesen
ganzen zwei Monaten, nur von den abstraktesten Dingen. Und
darüber muß ich mich nun eigentlich wundern: wir taten wirklich
nichts anderes, als Gespräche über die abstraktesten Themata
führen, natürlich waren es allgemein menschliche und die für unsere
Zeit wichtigsten Themata, aber sie berührten nicht im entferntesten
die dringendsten Fragen unseres persönlichen Lebens in der
konkreten Wirklichkeit. Und dabei gab es in dieser Wirklichkeit so
vieles, was festgesetzt und aufgeklärt werden mußte, und das tat
sogar dringend not, aber gerade darüber schwiegen wir. Ich sprach
sogar mit keinem Wort von meiner Mutter oder Lisa und ... nun, und
schließlich auch nicht von mir und meiner ganzen Geschichte.
Geschah das nun aus Schamgefühl oder aus einer gewissen
jugendlichen Dummheit – das weiß ich nicht. Ich nehme an, daß es
Dummheit war; denn über das Schamgefühl hätte man sich
immerhin noch hinwegsetzen können. Ich spielte ihm gegenüber, wie
gesagt, den Despoten, und manchmal wurde ich sogar unverschämt,
wurde es aber eigentlich gegen meine Absicht: ich weiß nicht, das
geschah alles irgendwie ganz von selbst und unbezwingbar, ich
konnte mich nicht zurückhalten. In seinem Ton dagegen lag nach
wie vor ein feiner Spott, wenn er auch immer überaus freundlich
war, trotz aller meiner Ausfälle. Es wunderte mich auch nicht wenig,
daß er selbst lieber zu mir kam, so daß ich schließlich nur noch sehr
selten zu Mama ging, höchstens einmal in der Woche, nicht öfter,
besonders in der allerletzten Zeit, als ich schon ganz und gar vom
Wirbel erfaßt worden war und mich in ihm drehte. Er kam immer
abends, saß bei mir und unterhielt sich mit mir; auch mit meinem
Wirt unterhielt er sich gern, – das ärgerte mich bei einem Menschen
wie ihm. Mir kam auch der Gedanke: Hat er denn außer mir wirklich
keinen Menschen, zu dem er gehen könnte? Doch ich wußte ganz
genau, daß er noch andere Bekannte hatte und in der letzten Zeit
sogar frühere Beziehungen zu der höheren Gesellschaft, die von ihm
vor einem Jahr abgebrochen worden waren, wieder erneuert hatte;
aber ich glaube, der Verkehr mit ihnen lockte ihn nicht sonderlich;
viele Beziehungen hatte er nur offiziell erneuert, und wie mir schien,
kam er lieber zu mir. Es rührte mich manchmal sehr, daß er, wenn er
abends zu mir kam, fast jedesmal beim Öffnen der Tür gleichsam
zagte und in der ersten Minute mir immer mit einer sonderbaren
Unruhe in die Augen sah, als wollte er fragen: ‚Störe ich nicht? Sage
es nur, und ich gehe.‘ Ja, er sprach das manchmal sogar aus.
Einmal, zum Beispiel, es war in der letzten Zeit, kam er, als ich
gerade vom Schneider meinen Anzug erhalten und mich angekleidet
hatte, um zum „Fürsten Sserjosha“ zu fahren, mit dem ich mich
irgendwohin begeben wollte (wohin – werde ich später erklären). Er
aber hatte sich schon gesetzt und wahrscheinlich gar nicht bemerkt,
daß ich aufbrechen wollte; bisweilen kam eine sehr sonderbare
Zerstreutheit über ihn. Und zum Unglück begann er gerade von
meinem Wirt zu sprechen; ich brauste auf:
„Ach, zum Teufel mit ihm, mit diesem Wirt!“
„Ach so, mein Lieber,“ er stand sogleich auf. „Du scheinst
ausgehen zu wollen, und da habe ich dich aufgehalten ...
Entschuldige, bitte.“
Und er beeilte sich, mich zu verlassen. Eben diese Bescheidenheit
eines solchen Menschen, und noch mir gegenüber, eines so
unabhängigen Weltmannes, der soviel Persönliches hatte, erweckte
in meinem Herzen mit einem Schlage wieder meine ganze
Zärtlichkeit zu ihm und meinen ganzen Glauben an ihn. Aber wenn
er mich so liebte, warum hielt er mich dann in dieser Zeit meiner
Schmach nicht zurück? Er hätte doch damals nur ein Wort zu sagen
brauchen – und ich hätte mich vielleicht beherrscht. Übrigens ...
vielleicht auch nicht. Aber er sah doch meine Modetorheiten, meine
Großmannssucht, meinen Schlitten (ich wollte ihn sogar einmal in
meinem Schlitten mitnehmen, aber er lehnte es ab; und sogar mehr
als einmal habe ich ihn aufgefordert, einzusteigen, er hat aber
immer abgelehnt), er sah doch, daß ich mit dem Gelde nur so um
mich warf, – und kein Wort, kein Wort von ihm, nicht einmal eine
neugierige Frage! Das hat mich die ganze Zeit gewundert, auch
heute noch wundert es mich. Ich aber schämte mich damals
natürlich nicht im geringsten vor ihm und ließ ihn alles sehen, wenn
ich auch kein Wort zur Erklärung sagte. Er fragte nicht, und ich sagte
nichts. Das heißt, ein paarmal waren wir doch nahe daran, auf das
Thema der dringenden Angelegenheiten überzugehen. Einmal fragte
ich ihn (das war noch am Anfang, bald nach seinem Verzicht auf die
Erbschaft), wovon und wie er denn jetzt zu leben gedenke.
„Irgendwie, mein Freund,“ sagte er mit auffallender Ruhe.
Heute weiß ich, daß selbst Tatjana Pawlownas kleines Kapital von
ungefähr fünftausend Rubel in diesen zwei letzten Jahren zur Hälfte
für Werssiloff verausgabt worden ist.
Ein anderes Mal kamen wir, ich weiß nicht mehr, wie, auf meine
Mutter zu sprechen; auf einmal sagte er traurig: „Mein Freund, ich
habe es Ssofja Andrejewna oft gesagt, in der ersten Zeit unserer
Verbindung, übrigens nicht nur in der ersten Zeit, auch in der Mitte
und am Ende: ‚Liebste, ich quäle dich und quäle dich zu Tode, und
es tut mir nicht leid, solange du bei mir bist; aber ich weiß, wenn du
nicht mehr bist, werde ich mich mit Selbstanklagen zu Tode quälen.‘“
An diesem Abend war er, ich weiß noch, ganz besonders
offenherzig.
„Wenn ich noch ein charakterschwacher wertloser Mensch wäre
und unter diesem Bewußtsein litte! Aber das ist es ja nicht, ich weiß
doch, daß ich unendlich stark bin, und wodurch, was glaubst du? –
eben durch diese unmittelbare Kraft der Verträglichkeit mit allem,
was es auch sei, die allen klugen Russen unserer Generation in so
hohem Maße eigen ist. Mich kannst du durch nichts zerstören, durch
nichts vertilgen, durch nichts in Erstaunen setzen. Ich habe ein so
zähes Leben wie ein Hofhund. Ich kann auf die allerbequemste
Weise zwei entgegengesetzte Gefühle zu gleicher Zeit empfinden –
und das, versteht sich, doch nicht aus eigenem Willen. Aber
nichtsdestoweniger weiß ich, daß das ehrlos ist, vor allem deshalb,
weil es gar zu einsichtsvoll ist. Ich habe fast bis zum fünfzigsten Jahr
gelebt, und noch immer weiß ich weder, noch ahne ich, ob es nun
gut oder ob es schlecht ist, daß ich solange gelebt habe. Natürlich,
ich liebe das Leben, und das ergibt sich ja ganz von selbst aus der
Sache; aber für einen Menschen, wie ich, ist das Leben lieben –
unwürdig. In der letzten Zeit hat etwas Neues begonnen, und
Menschen wie Krafft leben sich nicht ein, sondern schießen sich tot.
Aber es ist doch klar, daß die vom Typus Krafft dumm sind; nun, wir
aber sind klug, – folglich läßt sich auch hier auf keine Weise eine
Parallele ziehen, und die Frage bleibt trotz alledem offen. Und sollte
denn die Erde wirklich nur für solche da sein wie wir?
Wahrscheinlich: ja; aber dieser Gedanke ist doch schon gar zu
trostlos. Und übrigens ... und übrigens bleibt die Frage doch offen.“
Er sagte das traurig, und dennoch wußte ich nicht, ob es aufrichtig
war oder nicht. Es blieb in ihm immer noch ein gewisses Geheimnis,
das er um keinen Preis aufdecken wollte.

IV.

Ich überschüttete ihn damals mit Fragen, ich stürzte mich auf ihn
wie ein Hungriger auf Brot. Er antwortete mir immer bereitwillig und
offenherzig, aber im Grunde waren es nur ganz allgemein gehaltene
Aphorismen, so daß schließlich doch nichts aus ihm
herauszubekommen war. Dabei hatten mich alle diese Fragen schon
mein Leben lang beunruhigt, und ich sage offen, ich hatte die
Entscheidung dieser Fragen schon in Moskau bis auf weiteres
aufgeschoben, eben bis zu unserem Wiedersehen in Petersburg. Ich
habe ihm das einmal sogar gesagt, und er begann nicht über mich
zu lachen, im Gegenteil, ich weiß noch, er drückte mir die Hand.
Über die allgemeine Politik und die sozialen Fragen konnte ich auch
so gut wie nichts aus ihm herausbringen, und gerade diese Fragen
beunruhigten mich am meisten, natürlich im Hinblick auf meine
„Idee“. Über Menschen wie Dergatschoff entriß ich ihm einmal die
Bemerkung, sie ständen „unter jeder Kritik“, aber gleich darauf fügte
er sonderbar hinzu, daß er sich „das Recht vorbehielte, seiner
eigenen Meinung nicht die geringste Bedeutung beizulegen“.
Darüber, wie die heutigen Staaten und die heutige Welt enden und
wie die soziale Welt sich von neuem aufbauen werde, schwieg er
sich zunächst aus, aber einmal quälte ich doch so lange, bis er einige
Worte darüber äußerte.
„Ich kann mir denken, daß sich das alles höchst prosaisch
abspielen wird,“ sagte er. „Es werden ganz einfach alle Staaten
einmal, obgleich ihre Budgets balancieren und ‚keine Defizite‘
vorhanden sind, un beau matin[39] endgültig in der wirresten
Verwicklung sitzen, und da werden denn wohl alle ohne Ausnahme
nicht mehr bezahlen wollen, damit alle ohne Ausnahme sich im
allgemeinen Bankerott erneuen können. Dem wird sich das ganze
konservative Element der Welt widersetzen, denn eben dieses wird
der Aktionär und Gläubiger sein und den Bankerott nicht zulassen
wollen. Dann wird natürlich sozusagen die allgemeine Oxydation
beginnen; es werden viele Juden kommen, und dann beginnt die
jüdische Herrschaft; und darauf werden alle diejenigen, die niemals
Aktien besessen haben und überhaupt noch nichts besessen haben,
also alle Armen, natürlicherweise den Oxydationsprozeß nicht
mitmachen wollen ... So wird denn der Kampf beginnen, und nach
siebenundsiebzig Niederlagen werden die Armen die Aktionäre
vernichten, ihnen die Aktien wegnehmen und sich auf ihre Plätze
setzen, wiederum als Aktionäre, versteht sich. Vielleicht werden sie
auch was Neues sagen, vielleicht aber auch nicht. Wahrscheinlicher
ist, daß sie gleichfalls bankerottieren werden. Weiter, mein Freund,
vermag ich mir nichts mehr vorzustellen von den zukünftigen
Ereignissen, die das Antlitz dieser Welt verändern werden. Übrigens,
schlage in der Apokalypse nach ...“
„Ja, ist denn das wirklich alles so materialistisch? Wird denn die
jetzige Welt wirklich einzig an den Finanzen zugrunde gehen?“
„Oh, ich habe doch, versteht sich, nur ein Eckchen des
Gesamtbildes genommen, aber auch dieses Eckchen ist mit dem
Ganzen sozusagen durch unzerreißbare Bande verbunden.“
„Ja, aber, was soll man denn tun?“
„Ach, Gott, beeile dich doch nicht so: das wird ja alles nicht so
bald geschehen. Im allgemeinen aber ist nichts zu tun das
allerbeste, – wenigstens hat man dann sein ruhiges Gewissen und
kann sich sagen, daß man sich an nichts beteiligt hat.“
„Nein, genug, sprechen Sie zur Sache. Ich will wissen, was ich
tatsächlich tun soll, und wie ich leben soll?“
„Was du tun sollst, mein Lieber? Sei ehrlich, lüge nie, trachte nicht
nach deines Nächsten Haus, mit einem Wort: Lies die Zehn Gebote –
da ist alles das auf ewig niedergeschrieben.“
„Hören Sie auf, hören Sie auf, das ist ja alles so alt, und zudem
sind es bloß Worte, hier aber bedarf es einer Tat!“
„Nun, wenn dich die Langeweile schon gar zu sehr drückt, dann
bemühe dich, irgend jemand oder irgend etwas liebzugewinnen oder
einfach nur dein Herz an irgend etwas zu hängen.“
„Sie spotten ja nur! Und dann, was soll ich ganz allein mit Ihren
Zehn Geboten anfangen?“
 „Erfülle sie nur, trotz all deiner Fragen und Zweifel, und du wirst
ein großer Mensch sein.“
„Von dem niemand was weiß.“
„Es gibt nichts Geheimes, was nicht offenbar würde.“
„Sie spotten ja tatsächlich!“
„Nun, wenn du es dir schon so sehr zu Herzen nimmst, so ist es
das beste, du bemühst dich, möglichst schnell dich zu spezialisieren,
beschäftigst dich mit Häuserbau oder mit der Jurisprudenz, und
dann, wenn du deine wirkliche und ernste Arbeit hast, wirst du dich
beruhigen und das Unwichtige vergessen.“
Ich schwieg; was konnte man aus solchen Reden entnehmen? Und
doch regten mich diese Fragen nach jedem solchen Gespräch noch
mehr auf als früher. Außerdem sah ich doch deutlich, daß in ihm
immer gleichsam ein gewisses Geheimnis blieb, und gerade das war
es, was mich immer mehr und immer stärker zu ihm hin zog.
„Hören Sie,“ unterbrach ich ihn einmal, „ich habe immer den
Verdacht, daß Sie alles das nur so sagen, aus Erbitterung und Leid,
im geheimen aber, so für sich, sind gerade Sie ein Fanatiker
irgendeiner höheren Idee, nur verheimlichen Sie das, oder Sie
schämen sich, es einzugestehen.“
„Ich danke dir, mein Lieber.“
„Hören Sie, es gibt nichts Höheres, als nützlich zu sein. Sagen Sie
mir, wodurch kann ich im gegebenen Augenblick am allernützlichsten
sein? Ich weiß, daß es Ihnen nicht möglich ist, das zu entscheiden;
aber ich will nur Ihre Meinung wissen: Sagen Sie sie, und was Sie
sagen, das werde ich tun, das schwöre ich Ihnen! Also: Was wäre
zum Beispiel ein großer Gedanke?“
„Nun, Steine in Brot zu verwandeln, – da hast du einen großen
Gedanken.“
„Ist das der größte? Nein, wahrhaftig, Sie haben mir einen ganzen
Weg gezeigt! Sagen Sie: ist das wirklich der größte?“
„Ein sehr großer, mein Freund, ein sehr großer, aber nicht der
größte; ein großer, aber ein zweitrangiger, nur im gegebenen
Moment ist er groß: hat der Mensch sich sattgegessen, so denkt er
nicht mehr daran; im Gegenteil, er wird sofort sagen: ‚So, nun habe
ich mich sattgegessen, und was soll ich jetzt tun?‘ Die Frage bleibt
ewig offen.“
„Sie sprachen einmal von ‚Genfer Ideen‘; ich habe Sie damals nicht
verstanden; was sind das für ‚Genfer Ideen‘?“
„Die Genfer Ideen – das ist die Tugend ohne Christus, mein
Freund, also die heutigen Ideen, oder richtiger, die Idee der ganzen
heutigen Zivilisation. Mit einem Wort, das ist eine dieser langen
Geschichten, über die zu sprechen sehr langweilig ist, und es wird
viel besser sein, wenn wir beide von etwas anderem sprechen, oder
noch besser, wenn wir von anderem schweigen.“
„Natürlich, wenn Sie nur schweigen können, das ist für Sie immer
die Hauptsache!“
„Mein Freund, vergiß nicht, schweigen ist gut, ungefährlich und
schön.“
„Schön?“
„Versteht sich. Das Schweigen ist immer schön, und der
Schweigende ist immer schöner als der Redende.“
„Freilich ist so reden, wie Sie mit mir reden, ebensogut wie
schweigen. Zum Teufel mit solch einer Schönheit, und vor allem,
zum Teufel mit solch einem Vorteil!“
„Mein Lieber,“ sagte er da auf einmal zu mir, und er änderte ein
wenig seinen Ton, ja, er sprach sogar mit einem gewissen Gefühl
und mit besonderem Nachdruck: „Mein Lieber, ich will dich durchaus
nicht zu irgendeiner bourgeoisen Tugendhaftigkeit verführen und
von deinen Idealen fortlocken; ich predige dir nicht: ‚Glück ist besser
als Heldentum‘; im Gegenteil, Heldentum steht höher als jedes
Glück, und allein die Fähigkeit dazu ist an sich schon ein Glück. So
brauchen wir nun darüber keine Worte mehr zu verlieren. Eben
deshalb achte ich dich ja auch, weil du in unserer Oxydationszeit
fähig gewesen bist, in deiner Seele dir irgendeine ‚eigene Idee‘ zu
schaffen (rege dich nicht auf, ich habe mir das sogar sehr gemerkt).
Aber man muß doch auch ans rechte Maß denken; denn dich
verlangt jetzt nach einem auffallenden Leben: womöglich etwas
anzuzünden oder zu zerschmettern, über ganz Rußland dich zu
erheben, wie eine Gewitterwolke vorüberzuziehen und alle in Angst
und Entzücken zurückzulassen, selbst aber irgendwo in den
Vereinigten Staaten von Nordamerika zu verschwinden. Sicherlich ist
jetzt etwas Ähnliches in deiner Seele, und deshalb halte ich es auch
für notwendig, dich zu warnen, denn ich habe dich aufrichtig
liebgewonnen, mein Junge.“
Und was konnte ich selbst hieraus entnehmen? Hieraus sprach nur
Unruhe um mich, um mein materielles Schicksal; der Vater verriet
sich mit prosaischen, wenn auch guten Gefühlen; aber war es denn
das, was ich angesichts der Ideen brauchte, für die jeder ehrliche
Vater seinen Sohn selbst in den Tod schicken muß, wie der alte
Horatius seine Söhne für die Idee Roms?
Ich kam ihm auch oft mit Fragen wegen der Religion, aber hier
stieß ich auf den dichtesten Nebel. Auf meine Frage: „Was soll ich in
diesem Sinne tun?“ antwortete er mir auf die dümmste Weise, als
wäre ich ein kleines Kind: „Man muß an Gott glauben, mein Lieber.“
„Aber wenn ich an alles das nun einmal nicht glaube?“ rief ich
gereizt.
„Nun, das ist vortrefflich, mein Lieber.“
„Wieso vortrefflich?“
„Es ist das beste Zeichen, mein Freund; sogar das zuverlässigste,
denn unser russischer Atheist – wenn er nur auch wirklich Atheist ist
und ein wenig Verstand besitzt – ist der beste Mensch in der ganzen
Welt, und ist immer geneigt, Gott freundlich zu behandeln, eben weil
er unbedingt gut ist, und gut ist er, weil er maßlos zufrieden damit
ist, daß er – Atheist ist. Unsere Atheisten sind ehrenwerte Leute und
sind in höchstem Maße zuverlässig, sind, vielleicht, die Stützen des
Vaterlandes ...“
Das war natürlich etwas, aber ich wollte was anderes; nur einmal
sprach er sich deutlicher mir gegenüber aus, aber doch so
sonderbar, daß er mich durch diese Worte am meisten in Erstaunen
setzte, besonders, da ich von seinem angeblichen Katholizismus und
seinen Büßerketten gehört hatte.
„Mein Lieber,“ sagte er damals zu mir, es war nicht in meinem
Zimmer, sondern auf der Straße, und nach einem langen Gespräch;
ich begleitete ihn. „Mein Freund, die Menschen so zu lieben, wie sie
sind, ist unmöglich. Und doch soll man es nun einmal. Deshalb
verbeiße deine Gefühle, wenn du ihnen Gutes tun willst, halte dir die
Nase zu und schließe die Augen (letzteres ist unbedingt erforderlich).
Ertrage von ihnen Böses, nach Möglichkeit ohne dich über sie zu
ärgern, ‚eingedenk dessen, daß auch du ein Mensch bist‘. Versteht
sich, du bist verpflichtet, streng mit ihnen zu sein, wenn du auch nur
ein wenig klüger sein mußt als der Durchschnitt. Die Menschen sind
ihrer Natur nach niedrig und am ehesten bereit, aus Furcht zu
lieben; gehe du auf eine solche Liebe nicht ein und höre nicht auf, zu
verachten. Irgendwo im Koran gebietet Allah dem Propheten, auf die
‚Verstockten‘ wie auf Mäuse herabzusehen, ihnen Gutes zu tun und
an ihnen vorüberzugehen. – Ein wenig stolz, aber richtig. Verstehe
es, sie sogar dann zu verachten, wenn sie gut sind; denn gerade
dann sind sie am häufigsten schlecht. Oh, mein Lieber, wenn ich das
sage, urteile ich nach mir selbst! Wer auch nur ein wenig – nicht
dumm ist, kann nicht leben, ohne sich selbst zu verachten, ob er nun
ehrenhaft ist oder nicht, das ist ganz einerlei. Seinen Nächsten
lieben und ihn nicht verachten, – ist unmöglich. Meiner Ansicht nach
ist der Mensch mit der physischen Unmöglichkeit geschaffen, seinen
Nächsten zu lieben. Es muß da ein Irrtum in den Ausdrücken sein,
und zwar schon von Anfang an, und unter der ‚Liebe zur Menschheit‘
kann man nur Liebe zu derjenigen Menschheit verstehen, die du dir
selbst in deiner Seele erschaffst (mit anderen Worten: dich selbst
hast du erschaffen, und folglich ist es Liebe zu dir selbst), – und die
es deshalb niemals in der Wirklichkeit geben wird.“
„Niemals geben wird?“
„Mein Freund, ich gebe zu, daß das ein wenig dumm wäre, aber
das ist nicht meine Schuld; und da man bei der Erschaffung der Welt
mich nicht gefragt hat, so behalte ich mir das Recht vor, in der
Beziehung meine eigene Meinung zu haben.“
„Ja, aber – wie kann man Sie dann noch einen Christen nennen,“
rief ich aus, „einen Mönch mit Büßerketten, einen Propheten? Das
verstehe ich nicht!“
„Wer nennt mich denn so?“
Ich erzählte es ihm; er hörte mich sehr aufmerksam an, aber das
Gespräch brach er ab.
Leider kann ich mich nicht mehr erinnern, aus welchem Anlaß es
damals zu diesem mir noch so gut erinnerlichen Gespräch zwischen
uns kam; aber ich weiß noch, daß er beinahe in Zorn geriet, was bei
ihm sonst fast nie geschah. Er sprach leidenschaftlich und ohne
Spott, ganz, als spräche er nicht zu mir. Aber wiederum glaubte ich
ihm nicht: er konnte doch nicht mit einem Menschen, wie ich, von
diesen Dingen ernsthaft reden!
 Zweites Kapitel.

I.

A n diesem Morgen des fünfzehnten November traf ich ihn beim

„Fürsten Sserjosha“. Ich war es auch gewesen, der ihn und den
Fürsten wieder zusammengeführt hatte; aber ganz abgesehen
von mir, hatten sie ja genug Berührungspunkte (alle diese früheren
Geschichten im Auslande usw.). Außerdem hatte der Fürst ihm sein
Wort gegeben, von der Erbschaft wenigstens ein Drittel an ihn
abzutreten, was mindestens zwanzigtausend Rubel ausgemacht
hätte. Ich weiß noch, mich wunderte es damals sehr, daß er nur ein
Drittel und nicht die ganze Hälfte abtreten wollte; aber ich schwieg.
Dieses Versprechen hatte der Fürst ganz aus eigenem Antriebe
gegeben; Werssiloff hatte ihn mit keiner Silbe dazu veranlaßt, hatte
nie auch nur ein Wort darüber fallen lassen; der Fürst war selbst
damit hervorgetreten, Werssiloff aber hatte nur schweigend zugehört
und auch nachher kein einziges Mal etwas darüber geäußert oder
erwähnt, hatte auch mit keiner Miene gezeigt, daß er sich dieses
Versprechens überhaupt erinnerte. Ich will hier gleich bemerken, daß
der Fürst von Werssiloff in der ersten Zeit ganz bezaubert war,
besonders von seinen Reden, die ihn geradezu begeisterten, und in
dem Sinne hatte er sich auch mir gegenüber oftmals geäußert.
Wenn wir beide allein waren, hatte er manchmal ganz verzweifelt
über sich ausgerufen, er sei „so ungebildet, so unwissend, und auf
einem so falschen Wege ...!“ Oh, damals waren wir noch so
befreundet ...! Auch Werssiloff gegenüber bemühte ich mich immer,
nur die guten Seiten des Fürsten hervorzuheben, und ich verteidigte
oder leugnete sogar seine Fehler, obgleich ich sie selbst sah; aber
Werssiloff schwieg dazu oder lächelte.
 „Nun ja, mag er auch seine Fehler haben, aber jedenfalls hat er
ebenso viele Vorzüge, wie er Fehler hat!“ rief ich einmal, als ich mit
Werssiloff allein war.
„Gott, wie du ihm schmeichelst,“ lachte er.
„Wieso? Inwiefern schmeichle ich ihm?“ Ich verstand ihn zuerst
nicht.
„Ebenso viele Vorzüge! Herrgott, da müssen doch seine Gebeine
Reliquien werden, wenn er ebenso viele Vorzüge wie Fehler hat!“
Aber natürlich, das war kein Urteil. Und überhaupt schien er es
damals gewissermaßen vermeiden zu wollen, von dem Fürsten zu
sprechen, wie überhaupt von allem Gegenwärtigen und Dringenden;
aber vom Fürsten besonders. Ich hatte schon damals den Verdacht,
daß er beim Fürsten auch ohne mich vorsprach, und daß sie
besondere Beziehungen hatten, aber ich ließ das zu. Ich wurde auch
darüber nicht eifersüchtig, daß er mit ihm gleichsam ernster sprach
als mit mir, sagen wir, positiver, und weniger Spott beimischte: ich
war damals so glücklich, daß mir das sogar gefiel. Und ich
entschuldigte es noch damit, daß der Fürst ja ein wenig beschränkt
war und deshalb es nicht liebte, wenn man sich ungenau
ausdrückte, und manche Feinheiten verstand er sogar überhaupt
nicht. Aber siehe da, in der letzten Zeit hatte er angefangen, sich
gewissermaßen zu emanzipieren. Seine Gefühle Werssiloff
gegenüber begannen sich sogar zu verändern, was der feinfühlige
Werssiloff natürlich sofort merkte. Ich muß noch erwähnen, daß der
Fürst in derselben Zeit auch sein Verhalten zu mir änderte und sogar
recht merklich; es waren nur gewisse tote Formen von unserer
anfänglich fast glühenden Freundschaft übriggeblieben. Aber ich fuhr
doch fort, nach wie vor zu ihm zu gehen. Übrigens, wie hätte ich
nicht mehr zu ihm gehen sollen, nachdem ich nun einmal in alles das
mit hineingezogen worden war! Oh, wie unschlau ich damals war!
Und kann denn wirklich nur eine einzige Herzensdummheit einen
Menschen zu einer solchen Einfalt und Erniedrigung führen? Ich
nahm Geld von ihm und dachte, das hätte nichts auf sich, das müßte
so sein. Übrigens, nein: ich wußte auch damals schon, daß es so
nicht sein mußte, aber – ich dachte einfach nicht darüber nach.
Nicht des Geldes wegen ging ich zu ihm, obschon ich das Geld
furchtbar nötig hatte. Ich wußte, daß ich nicht des Geldes wegen
ging, aber ich begriff, daß ich jeden Tag bei ihm erschien und mir
Geld holte. Aber ich war im Strudel, und abgesehen von alledem,
war etwas, – sang etwas ganz anderes in meiner Seele!
Als ich an jenem Morgen eintrat, ungefähr um elf Uhr, fand ich
Werssiloff bei ihm und hörte noch, wie er gerade einen längeren
Satz zu Ende sprach; der Fürst hörte zu und schritt im Zimmer auf
und ab; Werssiloff saß. Der Fürst schien etwas erregt zu sein.
Werssiloff regte ihn fast immer auf. Der Fürst war ein überaus
empfänglicher Mensch, war es sogar bis zu einer Naivität, die mich
in manchen Fällen veranlaßte, auf ihn herabzusehen. Aber ich
wiederhole, in den letzten Tagen war in ihm ein gewisser boshafter
Hohn zum Ausdruck gekommen. Er blieb stehen, als er mich
erblickte, und in seinem Gesicht verzog sich etwas. Ich wußte im
geheimen, wie ich mir diesen Schatten an diesem Morgen zu
erklären hatte, aber ich hatte doch nicht erwartet, daß sein Gesicht
sich in solchem Maße verändern werde. Es war mir bekannt, daß er
eine Menge Unannehmlichkeiten hatte, aber das Abscheuliche war,
daß ich nur den zehnten Teil dieser Unannehmlichkeiten kannte, –
alles übrige war für mich damals ein Geheimnis, von dem ich nicht
das mindeste ahnte. Das war um so abscheulicher und um so
dümmer, als ich ihn oft großartig zu trösten versuchte, ihm
Ratschläge gab und sogar hochmütig lächelte über seine Schwäche,
„wegen solcher Lappalien“ außer sich zu geraten. Er aber schwieg
dazu, und es ist unmöglich, daß er mich in den Augenblicken nicht
furchtbar gehaßt hat; ich befand mich in einer gar zu falschen
Stellung ihm gegenüber, hatte aber selbst nicht einmal eine Ahnung
davon. Oh, ich rufe Gott zum Zeugen an, daß ich von der
Hauptsache wirklich keine Ahnung hatte!
Er streckte mir jedoch höflich die Hand entgegen. Werssiloff nickte
mir zu, ohne sich unterbrechen zu lassen. Ich warf mich auf den
Diwan. – Was war das überhaupt für ein Ton, den ich mir erlaubte,
was waren das für Manieren! Seine Bekannten behandelte ich, als
wären sie meine Bekannten ... Oh, wenn es doch eine Möglichkeit
gäbe, alles das jetzt von neuem zu machen, wie anders würde ich
mich jetzt zu benehmen verstehen!
 Noch zwei Worte, damit ich es später nicht zu erwähnen vergesse:
der Fürst wohnte damals immer noch in derselben Wohnung, die
jetzt fast ganz von ihm eingenommen wurde; die Stolbejeff, der die
Wohnung gehörte, hatte nur einen Monat in Petersburg verbracht
und war dann wieder irgendwohin gereist.

II.

Sie sprachen über den Adel. Ich muß vorausschicken, daß diese Idee
den Fürsten manchmal sehr aufregte, trotz seiner ganzen
anscheinend fortschrittlichen Gesinnung. Ja, ich vermute sogar, daß
vieles Schlechte in seinem Leben durch diese Idee veranlaßt oder
ausschließlich um ihretwillen von ihm begangen worden war: da er
so viel auf seine Fürstlichkeit gab, hatte er in seinem ganzen Leben
aus falschem Stolz mit dem Gelde um sich geworfen und sich auf
diese Weise, da er ja ganz arm war, in Schulden gestürzt. Werssiloff
hatte ihm schon mehrmals zu verstehen gegeben, daß der Adel nicht
darin liege, und hatte gleichzeitig versucht, ihm eine höhere
Auffassung vom Adel nahezulegen; doch der Fürst schien es
schließlich übelzunehmen, daß man ihn belehren wollte. Offenbar
hatte ihr Gespräch auch an diesem Morgen davon gehandelt, aber
den Anfang hatte ich nun versäumt. Werssiloffs Worte schienen mir
zunächst sehr reaktionär, später aber söhnte er mich wieder aus.
„Das Wort Ehre – bedeutet Pflicht,“ sagte er (ich gebe nur den
Sinn seiner Rede wieder, – seine Worte aber nur soweit ich mich
ihrer erinnere).
„Wenn in einem Staat ein bevorzugter Stand herrscht, so ist das
Land stark. Der bevorzugte Stand hat immer seinen bestimmten
Ehrbegriff und seine bestimmte Beobachtung der Ehrgesetze, die
meinetwegen auch unrichtig sein kann, aber sie dient doch fast
immer als Bindemittel und macht das Land stark; sittlich ist sie von
großem Nutzen, doch noch mehr ist sie es politisch ... Aber die
Sklaven leiden darunter, das heißt alle, die nicht zum bevorzugten
Stande gehören. Damit sie nicht leiden, versucht man die Rechte
auszugleichen. Das hat man bei uns auch getan, und das ist sehr
schön. Nur hat bisher, wie die Erfahrung lehrt, überall (das heißt,
natürlich nur in Europa) die Ausgleichung der Rechte ein gewisses
Sinken des Ehrgefühls zur Folge gehabt und folglich auch des
Pflichtgefühls. Der Egoismus ist an die Stelle der früheren
zusammenhaltenden Idee getreten, und alles ist zu persönlicher
Freiheit auseinandergefallen. Die Freigewordenen, die ohne
vereinenden, festigenden Gedanken blieben, haben nun jede
höhere, ideelle Verbindung mit der Zeit in solchem Maße eingebüßt,
daß sie zu guter Letzt sogar die von ihnen erlangte persönliche
Freiheit gemeinsam zu verteidigen aufgehört haben. Aber der
russische Adelstyp hat dem europäischen niemals geglichen. Unser
Adel könnte selbst jetzt, nach Verlust seiner Vorrechte, der höchste
Stand bleiben, als Hüter der Ehre, des Lichts, der Wissenschaft und
der höheren Idee, und, was die Hauptsache ist, ohne sich als
besondere Kaste abzuschließen, was der Tod der Idee wäre. Im
Gegenteil, die Tür zu diesem Stande steht bei uns schon lange offen,
jetzt aber dürfte es an der Zeit sein, sie endgültig und vollends
aufzumachen. Möge jede große Tat der Ehre, der Wissenschaft, des
Mutes bei uns einem jeden das Recht geben, sich den Menschen des
höheren Standes anzuschließen. Auf diese Weise würde sich der
höhere Stand ganz von selbst in eine Versammlung der Besten
verwandeln, und zwar im buchstäblichen und wahren Sinne, und
nicht im früheren Sinne einer privilegierten Kaste. In dieser neuen,
oder sagen wir richtiger erneuerten Gestalt könnte sich der Stand
erhalten.“
Der Fürst verzog den Mund zu einem halb höhnischen Lächeln,
das seine Zähne sehen ließ.
„Was wird denn das noch für ein Adel sein? Sie projektieren ja da
irgendeine Freimaurerloge, nicht aber einen Adel.“
Ich erwähne nochmals: der Fürst war furchtbar ungebildet. Ich
nahm vor Ärger über ihn auf meinem Diwan eine andere Stellung
ein, obschon ich Werssiloff nicht ganz beistimmte. Werssiloff begriff
nur zu gut, daß der Fürst sich getroffen fühlte und – ihm die Zähne
zeigte.
„Ich weiß nicht, in welchem Sinne Sie das von der Freimaurerei
gesagt haben,“ erwiderte er; „doch übrigens, wenn selbst ein
russischer Fürst sich von einer solchen Idee lossagt, so ist
selbstredend ihre Zeit noch nicht gekommen. Die Idee der Ehre und
der Aufklärung als Bekenntnis eines jeden, der in diesen Stand
eintreten will, der niemals abgeschlossen und beständig erneuert
wird – ist natürlich eine Utopie, aber weshalb denn eine
Unmöglichkeit? Wenn dieser Gedanke auch nur in wenigen Köpfen
lebt, so ist er doch noch nicht ausgelöscht, so brennt und leuchtet er
noch, und sei es auch nur wie ein feuriger Punkt in der Finsternis.“
„Sie gebrauchen immer Worte wie: ‚der große Gedanke‘, ‚die
zusammenhaltende Idee‘, und ähnliche. Ich würde gern wissen, was
Sie darunter verstehen, zum Beispiel unter dem ‚großen Gedanken‘?“
„Ich weiß wirklich nicht, was ich Ihnen darauf antworten soll, mein
lieber Fürst,“ erwiderte Werssiloff mit feinem Lächeln. „Das beste ist
wohl, ich gestehe Ihnen, daß ich selbst nichts darauf zu antworten
weiß. Der große Gedanke – das ist meistens ein Gefühl, das
manchmal gar zu lange unausgesprochen bleibt und noch immer
nicht seinen Ausdruck findet. Ich weiß nur, daß es immer dasjenige
gewesen ist, woraus das lebendige Leben zu strömen pflegt, ich
meine nicht das intellektuelle und nicht das erdichtete, sondern im
Gegenteil, das wirkliche, niemals langweilige und heitere Leben; so
ist denn die höhere Idee, der es entströmt, entschieden
unentbehrlich, – zum allgemeinen Ärger, versteht sich.“
„Warum zum Ärger?“
„Weil mit Ideen zu leben, langweilig ist, ohne Ideen dagegen
immer heiter.“
Der Fürst schluckte die Pille.
„Und was ist denn dieses lebendige Leben Ihrer Meinung nach?“
(Er ärgerte sich sichtlich.)
„Auch das weiß ich nicht, Fürst; ich weiß nur, daß es etwas
unglaublich Einfaches sein muß, das Alltäglichste und
Unverborgenste, etwas Tagtägliches und Allstündliches, etwas
dermaßen Gewöhnliches, daß wir einfach nicht glauben können,
dieses Einfache könnte es sein, und deshalb gehen wir schon so
viele Jahrtausende an ihm vorüber, ohne es zu bemerken und zu
erkennen.“
 „Ich wollte nur sagen, daß Ihre Idee vom Adel gleichzeitig eine
Verneinung des Adels ist,“ sagte der Fürst.
„Nun, wenn Sie es denn durchaus wollen, so – hat es einen Adel
bei uns vielleicht niemals gegeben.“
„Was Sie da sagen ist alles sehr dunkel und unklar. Ich denke,
wenn man schon spricht, muß man seinen Gedanken auch erklären
...“
Der Fürst runzelte die Stirn und blickte flüchtig nach der Kaminuhr.
Werssiloff erhob sich und nahm seinen Hut.
„Erklären!“ sagte er, „nein, lieber nicht; und überdies ist es meine
Leidenschaft – zu sprechen, ohne zu erklären. In der Tat, so ist es.
Und dann noch eine Eigenheit: Geschieht es einmal, daß ich einen
Gedanken, an den ich selbst glaube, zu erklären anfange, so ist es
bisher immer geschehen, daß ich zum Schluß der Erklärung an das
Erklärte selbst zu glauben aufhöre; dem fürchte ich mich auch heute
auszusetzen. Auf Wiedersehen, teurer Fürst; bei Ihnen rede ich
immer unverzeihlich viel.“
Er ging hinaus; der Fürst gab ihm höflich das Geleit, ich aber
fühlte mich gekränkt.
„Warum schauen Sie denn so finster drein?“ fuhr er mich plötzlich
geradezu an und ging, ohne mich anzusehen, zu seinem
Schreibtisch.
„Wenn ich finster dreinschaue,“ begann ich mit einem Zittern in
der Stimme, „so tue ich es deshalb, weil ich finde, daß Ihr Ton mir
und sogar Werssiloff gegenüber sich so sonderbar verändert hat,
weshalb ich ... Allerdings, Werssiloff begann vielleicht etwas zu
reaktionär, aber dann hat er das doch wieder gutgemacht und ... in
seinen Worten lag ein tiefer Sinn, aber Sie haben das vielleicht gar
nicht verstanden und ...“
„Ich will einfach nicht, daß man sich unterfängt, mich zu belehren,
und mich für einen Schuljungen hält!“ schnitt er mir fast wütend das
Wort ab.
„Fürst, solche Ausdrücke ...“
„Keine Theaterposen – wenn ich bitten darf. Ich weiß, daß das,
was ich tue, eine Gemeinheit ist, daß ich ein Verschwender bin, ein
Spieler, vielleicht ein Dieb ... ja, ein Dieb; denn ich verspiele das Geld
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