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Cold Hardiness in Plants Molecular Genetics Cell

Biology and Physiology Cabi Publishing First
Edition T. H. H. Chen (Editor)

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COLD HARDINESS IN PLANTS
Molecular Genetics, Cell Biology and Physiology
This page intentionally left blank
COLD HARDINESS
IN PLANTS
Molecular Genetics, Cell Biology
and Physiology

Edited by

Tony H.H. Chen

Oregon State University
Corvallis, Oregon, USA
M. Uemura
Cryobiosystem Research Centre
Iwate University
Morioka, Japan

and
S. Fujikawa
Department of Environmental Resources
Graduate School of Agriculture
Hokkaido University
Sapporo, Japan

CABI Publishing
 CABI Publishing is a division of CAB International

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Oxfordshire OX10 8DE Cambridge, MA 02139
UK USA

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© CAB International 2006. All rights reserved. No part of this publication may be
reproduced in any form or by any means, electronically, mechanically, by
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owners.

A catalogue record for this book is available from the British Library, London,
UK.

Library of Congress Cataloging-in-Publication Data

International Plant Cold Hardiness Seminar (7th : 2004 : Hokkaido University)

Cold hardiness in plants : molecular genetics, cell biology, and physiology / edited
by T.H.H. Chen, M. Uemura, S. Fujikawa.
p. cm.
Includes bibliographical references.
ISBN-13: 978-0-85199-059-0 (alk. paper)
ISBN-10: 0-85199-059-2 (alk. paper)
1. Plants--Frost resistance--Congresses. I. Chen, Tony H. H. II. Uemura, M.
(Matsuo) III. Fujikawa, S. (Seizo) IV. Title.
QK756.158 2004
581.4’2--dc22
2005011507

ISBN-13: 978 0 85199 059 0

ISBN-10: 0 85199 059 2

Typeset by SPI Publisher Services, Pondicherry, India.

Printed and bound in the UK by Biddles Ltd, King’s Lynn.
 Contents

Contributors vii

Preface xi

1 Global Analysis of Gene Networks to Solve Complex 1

Abiotic Stress Responses
K. Shinozaki and K. Yamaguchi-Shinozaki

2 The CBF Cold Response Pathways of Arabidopsis 11

and Tomato
J.T. Vogel, D. Cook, S.G. Fowler and M.F. Thomashow

3 Barley Contains a Large CBF Gene Family 30

Associated with Quantitative Cold-tolerance Traits
J.S. Skinner, J. von Zitzewitz, L. Marquez-Cedillo, T. Filichkin, P. Szu″cs,
K. Amundsen, E.J. Stockinger, M.F. Thomashow, T.H.H. Chen
and P.M. Hayes

4 Structural Organization of Barley CBF Genes Coincident 53

with a QTL for Cold Hardiness
E.J. Stockinger, H. Cheng and J.S. Skinner

5 The Genetic Basis of Vernalization Responses in Barley 64

L.L.D. Cooper, J. von Zitzewitz, J.S. Skinner, P. Szu″cs, I. Karsai,
E. Francia, A.M. Stanca, N. Pecchioni, D.A. Laurie, T.H.H. Chen
and P.M. Hayes

6 Vernalization Genes in Winter Cereals 76

N.A. Kane, J. Danyluk and F. Sarhan

v
vi Contents

7 A Bulk Segregant Approach to Identify Genetic 88

Polymorphisms Associated with Cold Tolerance
in Lucerne
Y. Castonguay, J. Cloutier, S. Laberge, A. Bertrand and R. Michaud

8 Ectopic Overexpression of AtCBF1 in Potato Enhances 103

Freezing Tolerance
M.-T. Pino, J.S. Skinner, Z. Jeknic′, E.J. Park, P.M. Hayes
and T.H.H. Chen

9 Overexpression of a Heat-inducible apx Gene Confers 124

Chilling Tolerance to Rice Plants
Y. Sato and H. Saruyama

10 Physiological and Morphological Alterations Associated 138

with Development of Freezing Tolerance in the Moss
Physcomitrella patens
A. Minami, M. Nagao, K. Arakawa, S. Fujikawa and D. Takezawa

11 Control of Growth and Cold Acclimation in Silver Birch 153

M.K. Aalto and E.T. Palva

12 The Role of the CBF-dependent Signalling Pathway 167

in Woody Perennials
C. Benedict, J.S. Skinner, R. Meng, Y. Chang, R. Bhalerao, C. Finn,
T.H.H. Chen and V. Hurry

13 Functional Role of Winter-accumulating Proteins 181

from Mulberry Tree in Adaptation to Winter-induced
Stresses
S. Fujikawa, N. Ukaji, M. Nagao, K. Yamane, D. Takezawa
and K. Arakawa

14 The Role of Compatible Solutes in Plant Freezing 203

Tolerance: a Case Study on Raffinose
D.K. Hincha, E. Zuther, M. Hundertmark and A.G. Heyer

15 Dehydration in Model Membranes and Protoplasts: 219

Contrasting Effects at Low, Intermediate and High
Hydrations
K.L. Koster and G. Bryant

16 Effect of Plasma Membrane-associated Proteins on 235

Acquisition of Freezing Tolerance in Arabidopsis
thaliana
Y. Tominaga, C. Nakagawara, Y. Kawamura and M. Uemura

Index 251
 Contributors

M.K. Aalto, Viikki Biocentre, Department of Biological and Environmental Sciences, Division
of Genetics, POB 56, FI-00014, Helsinki, Finland.
K. Amundsen, Department of Crop and Soil Sciences, Michigan State University, East
Lansing, MI 48824, USA.
K. Arakawa, Department of Environmental Resources, Graduate School of Agriculture,
Hokkaido University, Sapporo 060-8589, Japan.
C. Benedict, Umeå Plant Science Centre, Department of Plant Physiology, Umeå University,
S-901 87 Umeå, Sweden.
A. Bertrand, Soils and Crops Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food
Canada, 2560 Hochelaga Blvd, Sainte-Foy, QC, Canada G1V 2J3.
R. Bhalerao, Umeå Plant Science Centre, Department of Forest Genetics, Swedish University
of Agricultural Sciences, S-901 83 Umeå, Sweden.
G. Bryant, Department of Applied Physics, RMIT University, Melbourne 3001, Australia.
Y. Castonguay, Soils and Crops Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food
Canada, 2560 Hochelaga Blvd, Sainte-Foy, QC, Canada G1V 2J3.
Y. Chang, Department of Horticulture, Oregon State University, Corvallis, OR 97331-7304,
USA.
T.H.H. Chen, Department of Horticulture, College of Agriculture, Oregon State University,
Corvallis, OR 97331, USA.
H. Cheng, Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing
100081, China.
J. Cloutier, Soils and Crops Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food
Canada, 2560 Hochelaga Blvd, Sainte-Foy, QC, Canada G1V 2J3.
D. Cook, USDA-ARS, Natural Products Utilization Research Unit, University, MS 38677,
USA.
L.L.D. Cooper, Department of Crop and Soil Science, Oregon State University, Corvallis, OR
97331, USA.
J. Danyluk, Département des Sciences Biologiques, Université du Québec à Montréal, Case
Postale 8888, Succursale Centre-ville, Montréal, Québec, Canada H3C 3P8.

vii
viii Contributors

T. Filichkin, Department of Crop and Soil Science, College of Agriculture, Oregon State
University, Corvallis, OR 97331, USA.
C. Finn, US Department of Agriculture–Agricultural Research Service, Corvallis, OR 97330,
USA.
S.G. Fowler, MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, East
Lansing, MI 48824, USA.
E. Francia, Experimental Institute for Cereal Research – C.R.A., Section of Fiorenzuola,
I-29017 Fiorenzuola d’Arda, Italy.
S. Fujikawa, Department of Environmental Resources, Graduate School of Agriculture,
Hokkaido University, Sapporo 060–8589, Japan.
P.M. Hayes, Department of Crop and Soil Science, Oregon State University, Corvallis, OR
97331, USA.
A.G. Heyer, Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, D-14424 Potsdam,
Germany.
D.K. Hincha, Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, D-14424 Potsdam,
Germany.
M. Hundertmark, Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, D-14424
Potsdam, Germany.
V. Hurry, Umeå Plant Science Centre, Department of Plant Physiology, Umeå University,
S-901 87 Umeå, Sweden.
Z. Jeknić, Department of Horticulture, College of Agriculture, Oregon State University,
Corvallis, OR 97331, USA.
N.A. Kane, Département des Sciences Biologiques, Université du Québec à Montréal, Case
Postale 8888, Succursale Centre-ville, Montréal, Québec, Canada H3C 3P8.
I. Karsai, Agricultural Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences, H-2462
Martonvásár, Hungary.
Y. Kawamura, Cryobiosystem Research Centre, Iwate University, Morioka 020-8550, Japan.
K.L. Koster, Department of Biology, The University of South Dakota, Vermillion, SD 57069,
USA.
S. Laberge, Soils and Crops Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food
Canada, 2560 Hochelaga Blvd, Sainte-Foy, QC, Canada G1V 2J3.
D.A Laurie, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, UK.
L. Marquez-Cedillo, Department of Crop and Soil Science, College of Agriculture, Oregon
State University, Corvallis, OR 97331, USA.
R. Meng, Department of Horticulture, Oregon State University, Corvallis, Oregon 97331-
7304, USA.
R. Michaud, Soils and Crops Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food
Canada, 2560 Hochelaga Blvd, Sainte-Foy, QC, Canada G1V 2J3.
A. Minami, Cryobiosystem Research Centre, Faculty of Agriculture, Iwate University, Morioka
020-8550, Japan.
M. Nagao, Cryobiosystem Research Centre, Faculty of Agriculture, Iwate University, Morioka
020-8550, Japan.
C. Nakagawara, Cryobiosystem Research Centre, Iwate University, Morioka 020-8550, Japan.
E.T. Palva, Viikki Biocentre, Department of Biological and Environmental Sciences, Division
of Genetics, POB 56, FI-00014, Helsinki, Finland.
E.J. Park, Department of Horticulture, College of Agriculture, Oregon State University,
Corvallis, OR 97331, USA.
Contributors ix

N. Pecchioni, Facoltà di Agraria, Università di Modena e Reggio Emilia, I-42100 Reggio

Emilia, Italy.
M.T. Pino, Department of Horticulture, College of Agriculture, Oregon State University,
Corvallis, OR 97331, USA.
F. Sarhan, Département des Sciences Biologiques, Université du Québec à Montréal, Case
Postale 8888, Succursale Centre-ville, Montréal, Québec, Canada H3C 3P8.
H. Saruyama, Hokkaido Green-Bio Institute, Naganuma, Hokkaido 069-1301, Japan.
Y. Sato, National Agricultural Research Centre for Hokkaido Region, Hitsujigaoka 1,
Toyohira-ku, Sapporo 062-8555, Japan.
K. Shinozaki, Laboratory of Plant Molecular Biology, RIKEN Tsukuba Institute, Tsukuba,
Ibaraki 305-0074, Japan.
J.S. Skinner, Department of Horticulture, College of Agriculture, Oregon State University,
Corvallis, OR 97331, USA.
A.M. Stanca, Experimental Institute for Cereal Research – C.R.A., Section of Fiorenzuola,
I-29017 Fiorenzuola d’Arda, Italy.
E.J. Stockinger, Department of Horticulture and Crop Science, 1680 Madison Avenue, The
Ohio State University/OARDC, Wooster, OH 44691, USA.
P. Szu″cs, Agricultural Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences, H-2462
Martonvásár, Hungary.
D. Takezawa, Department of Regulation Biology, Faculty of Science, Saitama University,
Saitama 338-8570, Japan.
M.F. Thomashow, MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, East
Lansing, MI 48824, USA.
Y. Tominaga, Département des Sciences Biologiques, Université du Québec à Montréal,
Montréal, Québec, Canada H3C 3P8.
M. Uemura, Cryobiosystem Research Centre, Iwate University, Morioka 020-8550, Japan.
N. Ukaji, Department of Environmental Resources, Graduate School of Agriculture, Hokkaido
University, Sapporo 060-8589, Japan.
J.T. Vogel, MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing,
MI 48824, USA.
J. von Zitzewitz, Department of Crop and Soil Science, College of Agriculture, Oregon State
University, Corvallis, OR 97331, USA.
K. Yamaguchi-Shinozaki, Biological Resources Division, Japan International Research
Centre for Agricultural Sciences (JIRCAS), Tsukuba, Ibaraki 305-8686, Japan.
K. Yamane, Department of Environmental Resources, Graduate School of Agriculture,
Hokkaido University, Sapporo 060-8589, Japan.
E. Zuther, Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, D-14424 Potsdam,
Germany.
This page intentionally left blank
 Preface

We compiled this volume based on presentations at the 7th International Plant

Cold Hardiness Seminar (7th IPCHS) held at the Conference Hall of Hokkaido
University, Sapporo, Japan, from 10 to 15 July 2004. The overall goal of this sem-
inar was to present the latest research findings on plant freezing and chilling stress
from laboratories all around the world, and to provide a forum for exchange of
ideas among fellow researchers. The majority of presentations at the 7th IPCHS
centred on various aspects of molecular genetics and, in many cases, the utilization
of transgenic plants to further our understanding of plant cold hardiness at the
molecular level. It is hoped that this volume will provide a glimpse of current
advances in plant cold hardiness research.
We would like to thank the individual chapter authors for their cooperation in
preparing their manuscripts for publication. We also wish to thank the following for
their financial support of the 7th IPCHS: National Agricultural Research Centre for
Hokkaido Region; The Japanese Society for the Promotion of Sciences (JSPS);
Graduate School of Agriculture, Hokkaido University; Sapporo International
Communication Plaza Foundation; The Akiyama Foundation; Japan Plant Science
Foundation; Inoue Foundation for Science; Novartis Foundation Japan for the
Promotion of Science; The Kao Foundation for Arts and Sciences; The Kajima
Foundation; Amino Up Chemical Co., Ltd; Tanaka Co., Ltd; HOKUREN Federation
of Agricultural Cooperatives; JEOL Ltd; QIAGEN K.K.; TOMY SEIKO Co., Ltd;
and Kyokko Trading Co., Ltd. Our special thanks to Mrs Yasuko Uemura, Dr
Daisuke Takezawa and laboratory members of Woody Plant Biology, Graduate
School of Agriculture, Hokkaido University for their assistance in organizing this sem-
inar. Finally, we would like to thank Dr Jeffrey Skinner and Ms Lee Ann Julson for
their assistance in editing the manuscripts for publication in this volume.

Tony H.H. Chen

Matsuo Uemura
Seizo Fujikawa

xi
This page intentionally left blank
1 Global Analysis of Gene Networks
to Solve Complex Abiotic Stress
Responses
K. SHINOZAKI1,2,* AND K. YAMAGUCHI-SHINOZAKI3,4
1
Laboratory of Plant Molecular Biology, RIKEN Tsukuba Institute, Tsukuba,
Ibaraki 305-0074, Japan; 2Plant Functional Genomics Research Group,
RIKEN Genomic Sciences Centre, Yokohama, Kanagawa 230-0045, Japan;
3
Laboratory of Plant Molecular Physiology, Graduate School of Agricultural
and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japan;
4
Biological Resources Division, Japan International Research Centre for
Agricultural Sciences (JIRCAS), Tsukuba, Ibaraki 305-8686 Japan

Introduction

Environmental abiotic stresses, such as drought and cold stresses, have severe
effects on plant growth and crop production. Plants respond and adapt to these
abiotic stresses in order to survive unfavourable environmental conditions. Abiotic
stress induces various biochemical and physiological responses in plants (Bray
et al., 2000). Accumulation of various substances, such as sugars, sugar alcohols
and proline, is observed during these stresses in various plants. These molecules
are thought to function in osmotic adjustment. Plant hormone, abscisic acid
(ABA), is produced under stress conditions and plays important roles in response
to and tolerance against abiotic stress.
Many genes with various functions have been described that respond to
drought stress at transcriptional level (Thomashow, 1999; Shinozaki and
Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Zhu, 2002; Shinozaki et al., 2003). Their gene prod-
ucts function in stress tolerance and response. Stress-inducible genes have been
used to improve stress tolerance of plants by gene transfer. It is important to
analyse functions of stress-inducible genes not only for further understanding of
molecular mechanisms of stress tolerance and response of higher plants, but also
for improvement of stress tolerance of crops by gene manipulation.
Recently, transcriptome analyses using microrarray technology have revealed
that many genes are induced by abiotic stress to function in stress response and

*Corresponding author (e-mail: [email protected]; Fax: +81-29-836-9060)

©CAB International 2006. Cold Hardiness in Plants: Molecular Genetics, Cell Biology
and Physiology (eds T.H.H. Chen et al.) 1
2 K. Shinozaki and K. Yamaguchi-Shinozaki

tolerance (Shinozaki et al., 2003). These gene products are involved not only in
the protection of cells against stresses, but also in the regulation of gene expression
and the signal transduction pathways in abiotic stress response. Most of the stress-
inducible genes are also induced by ABA. Dehydration triggers the production of
ABA that induces various genes. The existence of ABA-independent as well as
ABA-dependent signal transduction cascades upstream of stress-inducible gene
expression has been described (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Zhu,
2002; Shinozaki et al., 2003). Cis- and trans-acting elements that function in ABA-
independent and ABA-responsive gene expression by drought stress have been
precisely determined. Various transcription factors function in stress-responsive
gene expression, which suggests complex regulatory mechanism of gene expression
in response to drought stress. Details of molecular mechanisms regulating genes to
stress still remain to be solved concerning signal transduction cascades. In this
chapter, molecular processes of drought and cold stress response and tolerance are
described. Functions of drought-inducible genes, regulation of their gene expres-
sion and signal transduction pathways in drought stress response and tolerance are
also discussed.

Identification of Drought- and Cold-inducible Genes

Many plant genes are induced by environmental stresses such as drought, low tem-
perature and high salinity (Thomashow, 1999; Shinozaki and Yamaguchi-
Shinozaki, 2000; Zhu, 2002; Shinozaki et al., 2003). Recently, expression profiles
of genes under drought, cold and high salinity stress conditions were analysed using
microrarray and GeneChip (Seki et al., 2001, 2002a,b; Fowler and Thomashow,
2002). We have identified 299 drought-inducible genes, 54 cold-inducible genes,
213 high salinity stress-inducible genes and 245 ABA-inducible genes using a
cDNA microarray containing c. 7000 independent Arabidopsis full-length cDNA
groups (Seki et al., 2001, 2002a,b). More than half of drought-inducible genes
overlap with high salinity- and ABA-inducible genes, which indicates the existence
of significant crosstalk among drought, high salinity and ABA responses. By con-
trast, only 10% of drought-inducible genes overlap with cold-inducible genes.
Among the stress-inducible genes, many transcription factor genes were found,
suggesting that various transcriptional regulatory mechanisms function in the
drought-, cold- or high salinity-stress signal transduction pathways.

Functions of Drought- and Cold-inducible Genes

Genes induced during drought and cold stress conditions encode proteins that
function not only in the protection of cells from stress, but also in the gene expres-
sion and signal transduction in stress response (Thomashow, 1999; Shinozaki and
Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Zhu, 2002; Shinozaki et al., 2003). These gene prod-
ucts are classified into two groups (Fig. 1.1). The first group includes proteins that
probably function in stress tolerance, such as chaperones, late embryogenesis
abundant (LEA) proteins, osmotin, antifreeze proteins, mRNA-binding proteins,
Global Analysis of Gene Networks 3

key enzymes for osmolytes biosynthesis, water channel proteins, sugar and proline
transporters, detoxification enzymes and various proteases. The second group con-
tains protein factors involved in further regulation of signal transduction and gene
expression that probably function in stress response, such as protein kinases, tran-
scription factors and enzymes in phospholipids metabolism. Existence of a variety
of stress-inducible genes suggests complex responses of plants to abiotic stress.

Multiple Regulatory Systems of Stress-inducible Gene Expression

Many drought- and cold-inducible genes are also induced by exogenous ABA
treatment, which indicates important roles of ABA in stress-responsive gene
expression. However, many stress-inducible genes are regulated by ABA-inde-
pendent processes. Cold-inducible genes are mainly induced by ABA-independent
processes whereas many cold-inducible genes are induced by ABA treatment.
Analysis of stress-inducible gene expression has revealed the existence of ABA-
independent, as well as ABA-dependent, transcriptional regulatory systems in
abiotic stress-inducible genes (Thomashow, 1999; Shinozaki and Yamaguchi-
Shinozaki, 2000; Zhu, 2002; Shinozaki et al., 2003). It has been shown that at
least four independent regulatory systems function in the activation of stress-
inducible genes under dehydration conditions (Fig. 1.2). Two of them are ABA-
dependent and the remaining two are ABA-independent.

Functional proteins Regulatory proteins

Water channel,
Transporters
Detoxification
enzymes Transcription factors

Protein kinases,
Protection factors Phosphatases,
of macromolecules Stress Phospholipid
(LEA proteins)
metabolism

Key enzymes for ABA biosynthesis

osmolyte biosynthesis
(proline, sugars) Chaperones,
Proteases

Fig. 1.1. Functions of drought and cold stress-inducible genes in stress tolerance and response.
Gene products are classified into two groups. The first group includes proteins that probably
function in stress tolerance (functional proteins), and the second group contains protein factors
involved in further regulation of signal transduction and gene expression that probably function
in stress response (regulatory proteins).
4 K. Shinozaki and K. Yamaguchi-Shinozaki

Drought Cold

Signal perception ICE1

NCED3 (bHLH)

ABA biosynthesis ABA-independent pathways

I II III IV
Transcription MYB2, MYC2 AREB/ NAC, DREB/
factors (MYB, MYC) ABF(bZIP) HD-ZIP CBF(AP2/ERF)

Cis-acting MYCR, RPS1

MYBRS, MYCRS ABRE DRE/CRT
elements
(YAACR, CANNTG) (ACGTGGC) (CATGTG, 14 bp) (G/ACCGAC)
Gene RD22 RD29B ERD1/ClipD RD29A/COR78
expression

Gene
function Stress response and stress tolerance

Fig. 1.2. Signal transduction pathways from the perception of drought and cold stress signals to
gene expression. At least four signal transduction pathways exist (I–IV): two are abscisic acid
(ABA)-dependent (I and II) and two are ABA-independent (III and IV). Protein biosynthesis is
required in one of the ABA-dependent pathways in which MYB an MYC transcription factors
are involved (I). In another ABA-dependent pathway, ABRE functions as an ABA-responsive
element and does not require protein biosynthesis (II). This is a major regulatory system in
ABA-dependent gene expression in which bZIP transcription factors function. In one of the
ABA-independent pathways, DRE/CRT is involved in the regulation of genes not only by
drought and salt, but also by cold stress (IV). In this pathway, AP2 transcription factors, named
DREB or CBF, are major transcription factors involved in this process. Another ABA-
independent pathway is controlled by drought and salt, but not by cold (III). In this process,
NAC and HD-ZIP transcription factors are involved in gene expression.

ABA-independent Gene Expression in Response to Drought and Cold

Stress
There are at least two ABA-independent regulatory systems in drought- and cold-
inducible gene expression. One of the ABA-independent pathways of drought
stress response overlaps with that of cold stress response (Fig. 1.2). A cis-acting elem-
ent including A/GCCGAC, named the dehydration responsive element (DRE)
and C-repeat (CRT), is essential for the regulation of many stress-inducible genes
under drought, low temperature and high salinity stress in an ABA-independent
pathway (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994). All the DRE/CRT-binding
proteins (DREBs and CBFs) contain a conserved DNA-binding motif (AP2/ERF
motif) (Stockinger et al., 1997; Liu et al., 1998). Two independent families of
DREB proteins, DREB1/CBF and DREB2, mainly function as trans-acting fac-
tors in two separate signal transduction pathways under low-temperature and
Global Analysis of Gene Networks 5

dehydration conditions, respectively (Liu et al., 1998). Overproduction of the

DREB1A and CBF1/DREB1B cDNAs driven by the 35S CaMV promoter in
transgenic plants significantly improved stress tolerance to drought and freezing
(Jaglo-Ottosen et al., 1998; Liu et al.,1998; Kasuga et al., 1999). Microarray analy-
sis identified many genes with various functions as DREB/CBF target genes,
which suggests overexpression of many genes function in drought stress tolerance
(Seki et al., 2001; Fowler and Thomashow, 2002; Maruyama et al., 2004).
Recently, a gene for ICE1 (inducer of CBF expression) that regulates expres-
sion of CBF/DREB1 in response to cold stress has been identified by map-based
cloning of a gene for Arabidopsis ice1 mutant that affect the expression of the
CBF3/DREB1A promoter::luciferase transgene (Chinnusamy et al., 2003). The
ICE1 gene encodes a MYC-type bHLH transcription factor that regulates the
expression of CBF3/DREB1A-regulated but not other CBF/DREB1-regulated
genes (Fig. 1.2). Improved freezing tolerance was obtained by overexpression of
ICE1 in transgenics, which also supports an important role of ICE1 in cold stress
response (Chinnusamy et al., 2003, Zarka et al., 2003).
In the ABA-independent pathways, there are several drought-inducible genes
that do not respond to either cold or ABA treatment, which suggests that there is
a specific pathway that functions in one of the dehydration stress responses
(Fig. 1.2). These genes include RD19 and RD21 that encode different cysteine
proteases, and ERD1 that encodes a ClipD protease regulatory subunit. Recently,
it was shown that NAC transcription factors function in the stress-inducible
expression of the ERD1/ClipD gene (Simpson et al., 2003; Tran et al., 2004).

ABA-dependent Gene Expression in Response to Drought Stress

ABA is synthesized in response to drought and high salinity stress but not to cold
stress. Many stress-inducible genes are regulated by endogenous ABA accumulated
during drought and high salinity stress. Recently, genes involved in ABA biosyn-
thesis have been identified based on genetic and genomics analysis. Several genes
involved in ABA biosynthesis are induced by drought and high salinity but not by
cold stress (Zhu, 2002; Shinozaki et al., 2003). This indicates important roles of
ABA in drought stress responses. Among the genes involved in ABA biosynthesis,
an Arabidopsis gene for nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED3), a key
enzyme for ABA biosynthesis, is strongly induced by drought stress.
ABRE is a major cis-acting element in ABA-responsive gene expression
(Fig. 1.1). Two ABRE motifs are important cis-acting elements in ABA-responsive
expression of Arabidopsis RD29B gene (Uno et al., 2000). Basic leucine zipper
(bZIP) transcription factors, AREB/ABF, bind to ABRE and activate ABA-depend-
ent gene expression (Choi et al., 2000; Uno et al., 2000). The AREB/ABF proteins
need ABA-mediated signals for their activation, because of their reduced activity in
the ABA-deficient aba2 and ABA-insensitive abi1 mutants and their enhanced activ-
ity in the ABA-hypersensitive era1 mutant (Uno et al., 2000). This is probably due
to ABA-dependent phosphorylation of the AREB/ABF proteins. Overexpression of
ABF3 or AREB2/ABF4 caused ABA-hypersensitivity, reduced transpiration rate
and enhanced drought tolerance of the transgenics (Kang et al., 2002).
6 K. Shinozaki and K. Yamaguchi-Shinozaki

The induction of the drought-inducible RD22 gene is mediated by ABA and

requires protein biosynthesis for its ABA-dependent expression (Shinozaki et al.,
2003). A MYC transcription factor, RD22BP1 (AtMYC2), and a MYB transcrip-
tion factor, AtMYB2, were shown to bind cis-elements in the RD22 promoter and
cooperatively activate RD22 (Abe et al., 2003). These MYC and MYB proteins
are synthesized after the accumulation of endogenous ABA, which indicates their
role in a rather later stage of stress responses. Microarray analysis revealed target
genes of MYC/MYB overexpressing transgenics, such as alcohol dehydrogenase
and ABA- or jasmonic acid (JA)-inducible genes (Abe et al., 2003). Overexpression
of both AtMYC2 and AtMYB2 not only revealed ABA-hypersensitive phenotype,
but also improved osmotic-stress tolerance of the transgenic plants. Recently,
AtMYC2 has been identified as a JASMONATE-INSENSITIVE 1 involved in
jasmonate-regulated defense response (Lorenzo et al., 2004).
Other transcription factors with various DNA-binding domains, such as NAC,
HD-ZIP, Zn finger and so on, have been identified to function in ABA- and/or
stress-responsive gene expression (Shinozaki et al., 2003; Fujita et al., 2004;
Sakamoto et al., 2004).

Signal Perception and Signal Transduction in Drought Stress Response

Signal transduction pathways from the sensing of dehydration signals or osmotic

change to the expression of various genes, and the signalling molecules that func-
tion in stress signalling, have not been extensively studied in plants. Signal trans-
duction pathways in drought stress response have been studied based on the
knowledge in yeast and animal systems, as shown in Fig. 1.3 (Shinozaki and
Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Zhu, 2002; Shinozaki et al., 2003).
Two component systems function in sensing osmotic stress in bacteria and
yeasts. Plants, as well as cyanobacteria, contain many genes encoding sensor-
histidine kinases and response-regulator homologues, which suggests the involvement
of similar osmosensing mechanisms in higher plants. One of the histidine kinases,
ATHK1, is shown to function as osmosensor in Arabidopsis. Other sensing mech-
anisms may function during drought stress responses, such as mechanical sensors
of cytoskeletons and sensors of superoxides produced by stress. During stomata
closure, the level of cytoplasmic Ca2+ is increased, which suggests that Ca2+ func-
tions as a second messenger in the osmotic stress response. Phospholipids play
important roles in calcium signalling.
ABA plays important roles in drought stress responses. ABA is involved not
only in stomata closure, but also in induction of many genes. Several mutants in
ABA signalling have been identified and their genes encode protein phosphatases,
farnesyl transferase and several factors involved in mRNA processing and protein
degradation. These suggest that protein modification and mRNA processing are
involved in ABA signalling (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Zhu,
2002; Shinozaki et al., 2003).
Recently, ABA-activated SnRK2 protein kinase (OST1/SRK2E) was shown to
function in an ABA-signal transduction pathway in stomata closure (Mustilli et al.,
2002; Yoshida et al., 2002). SRK2E/OST1 is activated by ABA treatment and
Global Analysis of Gene Networks 7

Drought

Osmotic stress
Mechanical stress
Osmosensor
Signal perception Oxidative stress
Two-component system
(ATHK1)
Phospholipid
Ca2+ signalling (IP3, PA)
ABA
Signal transduction
Protein kinases: Protein kinases:
RPK1, SnRK2, etc. SnRK2, MAPK, etc.
Protein phosphatases Protein phosphatases

Gene expression Stress-inducible genes (RD, ERD, COR, etc.)

Fig. 1.3. Second messengers and protein factors involved in the signal perception and the
signal transduction in drought stress response. Two-component histidine kinase, ATHK1, is
thought to function as an osmosensor in plants. Calcium and phospholipids are the most
probable cellular second messengers of the drought stress signal. The phosphorylation process
functions in water stress and ABA signal transduction pathways. RPK1 functions in the early
process of ABA signalling. SnRK2 family protein kinases function in ABA and osmotic stress
signalling pathways. ABA plays important roles in the regulation of gene expression as well as
in physiological responses during water stress.

osmotic stress. SRK2E/OST1 is mainly expressed in guard cells. The ost1/srk2e

mutant showed wilty phenotype, which indicates an important role of
SRK2E/OST1 in ABA signalling in stomata closure. Recently, it was shown that
SnRK2C, another SnRK2, is also activated by osmotic stress and ABA treatment.
Overexpression of SRK2C improved drought stress tolerance (Umezawa et al.,
2004). SRK2C is mainly involved in osmotic stress signalling in root tissues.
More recently, it was shown that one of the receptor-like kinases, named
RPK1, functions in an early process of ABA signalling. RPK1 is a member of the
LRR-RLK family of Arabidopsis and its expression is upregulated by ABA
(Osakabe et al., 2005). We found that RPK1 is localized in plasma membranes.
The repression of RPK1 expression in Arabidopsis resulted in the decrease of sen-
sitivity to ABA in the various physiological events including germination, growth
rate and stomata closure. Many ABA-inducible genes are downregulated in these
RPK1 antisense transgenics and eliminate mutant plants, suggesting that RPK1 is
involved in the main ABA signalling pathway in Arabidopsis.
Various signalling molecules seem to be functioning in ABA signalling, such
as phospholipids and cyclic ADP ribose. MAP kinase cascades and calcium-
dependent protein kinases are suggested to be involved in drought stress response
8 K. Shinozaki and K. Yamaguchi-Shinozaki

and ABA signalling (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Zhu, 2002;

Shinozaki et al., 2003). Complex signalling cascades are thought to function in
molecular responses to drought stress. Molecular analysis of the signalling process
is in progress based on forward and reverse genetics.

Perspectives

Various stress-inducible genes have been identified by systematic analysis of gene

expression using microarray. However, functions of the gene products have not
been fully understood. In functional genomics, the reverse genetic approach, as well
as forward genetics, becomes more important in understanding complex molecular
processes in environmental stress responses. Efficient gene disruption methods, as
well as transgenic approaches using RNAi and overexpressors, will contribute to
the precise understanding of molecular networks in drought and cold stress
response and tolerance. Global analysis of gene expression and protein–protein inter-
action during signal transduction is necessary for this purpose. Metabolome analy-
sis is also important in understanding metabolites’ changes during stress conditions.

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Global Analysis of Gene Networks 9

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2 The CBF Cold Response Pathways
of Arabidopsis and Tomato
J.T. VOGEL,1 D. COOK,1,2 S.G. FOWLER1 AND
M.F. THOMASHOW1,3,*
1
MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, East
Lansing, MI 48824, USA; 2USDA-ARS, Natural Products Utilization Research
Unit, University, MS 38677, USA; 3Department of Crop and Soil Sciences,
Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA

Introduction

Plants must cope with a variety of abiotic stresses in the environment including
extremes in temperature, lack of water and flooding. In many regions of the Earth,
the ability to survive freezing temperatures is an essential trait. Many plants from
temperate regions, for instance, are able to sense low, non-freezing temperatures
and activate mechanisms that lead to an increase in freezing tolerance, a phe-
nomenon known as cold acclimation (Thomashow, 1999; Smallwood and Bowles,
2002). In contrast, plants from warm regions of the Earth, such as banana and
rice, are unable to cold acclimate and often suffer injury, and even death, upon
exposure to chilling temperatures between 0°C and 10°C (Thomashow and
Browse, 1999).
For decades, understanding the mechanisms of chilling and freezing tolerance
has been the major goal of investigators studying abiotic stress responses. A recent
important advance made with Arabidopsis has been the discovery of a stress
response pathway, the CBF cold response pathway that has a role in cold accli-
mation (Thomashow, 2001; Shinozaki et al., 2003). It has been established that
Arabidopsis encodes a small family of cold-responsive transcriptional activators
known either as CBF1, CBF2 and CBF3 (Stockinger et al., 1997; Gilmour et al.,
1998; Medina et al., 1999) or DREB1b, DREB1c and DREB1a (Liu et al., 1998;
Kasuga et al., 1999), respectively (the CBF designation will be used throughout this
chapter). The CBF transcription factors, which are members of the AP2/EREBP
family of DNA-binding proteins (Riechmann and Meyerowitz, 1998), recognize

*Corresponding author (e-mail: [email protected]; Fax: +1-517-353-9168)

©CAB International 2006. Cold Hardiness in Plants: Molecular Genetics, Cell Biology
and Physiology (eds T.H.H. Chen et al.) 11
12 J.T. Vogel et al.

the cold- and dehydration-responsive DNA regulatory element designated the

CRT (C-repeat)/DRE (dehydration-responsive element) (Baker et al., 1994;
Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994). CRT/DRE elements are present in
the promoters of many cold- and dehydration-responsive genes of Arabidopsis,
including those designated COR (cold-regulated) (Thomashow, 1999). The CBF1-3
genes are induced within 15 min of a plant’s exposure to low, non-freezing tem-
peratures followed at about 2 h by induction of a group of COR genes that con-
tain the CRT/DRE-regulatory element, i.e. the ‘CBF regulon’ (Gilmour et al.,
1998; Liu et al., 1998). Expression of the CBF regulon results in an increase in
freezing tolerance (Jaglo-Ottosen et al., 1998; Liu et al., 1998; Kasuga et al., 1999;
Gilmour et al., 2000; Gilmour et al., 2004) and appears to have a role in chilling
tolerance as well (Zhu et al., 2004). We are far from a complete understanding of
how the CBF regulon functions to enhance freezing and chilling tolerance.
However, it is clear that multiple mechanisms are involved, including the synthesis
of low-molecular weight cryoprotective molecules such as proline, sucrose and raf-
finose (Gilmour et al., 2000; Taji et al., 2002) and the synthesis of hydrophilic pro-
teins that have cryoprotective properties, such as COR15a (Artus et al., 1996;
Steponkus et al., 1998).
It is now clear that the CBF cold response pathway is not limited to
Arabidopsis. For example, it has been shown that Brassica napus, a crucifer like
Arabidopsis that increases in freezing tolerance in response to low temperature,
has COR genes that encode CBF proteins (Jaglo et al., 2001; Gao et al., 2002).
Moreover, constitutive overexpression of Arabidopsis CBF1, 2 or 3 in transgenic
B. napus plants has been shown to activate expression of homologues of
Arabidopsis COR genes that have CRT/DRE elements in their promoters and
result in an increase in freezing tolerance (Jaglo et al., 2001). Other plants that
can cold acclimate and are more distantly related to Arabidopsis than B. napus,
such as wheat and barley, have also been shown to have cold-inducible genes that
encode CBF proteins and have homologues of Arabidopsis COR genes that
include CRT/DRE elements in their promoters (Dunn et al., 1998; Vazquez-Tello
et al., 1998; Jaglo et al., 2001; Choi et al., 2002; Xue, 2002). Thus, although addi-
tional work needs to be done to detail their comparative compositions, CBF cold
response pathways appear to be conserved among plants that cold acclimate.
Moreover, CBF pathways are not limited to plants that cold acclimate. For
instance, cold-inducible genes that encode CBF proteins are found in chilling- and
freezing-sensitive plants such as tomato (Jaglo et al., 2001), rice (Dubouzet et al.,
2003) and maize (Qin et al., 2004). An important question that now needs to be
addressed is whether ‘deficiencies’ in the CBF cold response pathways of these
plants contribute to their chilling and freezing sensitivities.
In this chapter, we review recent experiments from our laboratory designed
for the further understanding of the CBF cold response pathways in Arabidopsis
and tomato. The studies with Arabidopsis focus on determining the extent to
which the CBF cold response pathway ‘configures’ the low-temperature transcrip-
tome and metabolome. The studies with tomato were designed to determine
whether it has a ‘complete’ CBF cold response pathway and whether differences
between the pathways in tomato and Arabidopsis might explain, in part, the cold-
sensitive phenotype of tomato.
CBF Cold Response Pathways 13

Research Findings

Role of the CBF cold response pathway in configuring the low-temperature

transcriptome of Arabidopsis

The CBF cold response pathway is not the only pathway activated at low temp-
erature. Transcriptome-profiling experiments sampling roughly one-third of the
Arabidopsis genome indicated that extensive changes in gene expression occurred
during cold acclimation and that the majority of COR genes could not be assigned
to the CBF regulon (Seki et al., 2001; Fowler and Thomashow, 2002; Kreps et al.,
2002; Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004). To further explore the extent to
which the CBF cold response pathway configures the low-temperature transcrip-
tome of Arabidopsis (ecotype Col-0), we first identified a core set of cold-respons-
ive transcripts (Vogel et al., 2005) using the Arabidopsis ATH1 GeneChip from
Affymetrix (Redman et al., 2004). This chip contains probe sets representing
23,423 genes (based on TAIR’s 1 July 2004 annotation). Profiling experiments
were performed on plants exposed to low temperature for 1 h, 24 h and 7 days
grown in duplicate using two different culture conditions (soil and solid media).
This resulted in the identification of 514 transcripts (2.5-fold cut-off, P ≤ 0.05) that
were cold-responsive in all four replicates (two per culture condition) (Vogel et al.,
2005). Of these, 302 were upregulated and 212 were downregulated in response
to low temperature. We designated these genes the ‘cold standard’ (COS) set of
cold-responsive genes. The COS gene set almost certainly does not include all
cold-responsive genes, as root tissue was not harvested from the soil-grown plants
and the selection criteria used were stringent. Identifying all COR genes, however,
was not the purpose of these experiments. Rather, it was to identify a set of genes
that we could be confident were cold-induced and would serve as a robust
resource to begin to decipher the low-temperature regulatory network of
Arabidopsis.
Once the COS gene set was identified, we moved on to determining which
of these genes were members of the CBF regulon. COS genes were assigned to
the CBF regulon if the levels of their corresponding transcripts increased or
decreased at least 2.5-fold in two independent transgenic Arabidopsis lines that
constitutively expressed CBF2 under control of the cauliflower mosaic virus
(CaMV) 35S promoter. Other transcript-profiling experiments using the ‘8K’
Affymetrix GeneChip had indicated that there were no obvious differences in
genes affected by constitutive overexpression of CBF1, 2 or 3 (Gilmour et al.,
2004). Thus, it was judged that CBF2 overexpression would probably capture
most, if not all, genes that belonged to the CBF regulon.
Of the 514 COS genes, 93 were assigned to the CBF regulon (Vogel et al.,
2005). Of these 93 CBF regulon COS genes, the large majority, 85 (91%), were
cold-induced. A scan of the promoters of these 85 genes indicated that 68 (80%)
had one or more CRT/DRE elements, (A/G)CCGAC, present within 1 kb
upstream of the start of the protein-coding sequence. Thus, these genes were likely
to be direct targets of CBF2. Those CBF2-regulated COS genes without
CRT/DRE elements were presumably regulated by other genes controlled by
CBF2. Bioinformatic analysis of the sequences 1 kb upstream of the 85 CBF
14 J.T. Vogel et al.

regulon COS genes also revealed enrichment for the sequence

(G/T)(A/G)CCGACNT(A/C), which may represent a larger consensus sequence
for the CRT/DRE element.
The 85 cold-induced COS genes that were assigned to the CBF regulon rep-
resented a diverse range of functions including roles in metabolism, transcription,
intercellular communication and signalling, transport, energy, protein processing,
cellular biogenesis and stress (Table 2.1). Further, a distinguishing characteristic of
this group of genes was that they comprised the majority of genes that were most
highly induced in response to low temperature (Fig. 2.1). Of the 25 COS genes
that were upregulated at least 15-fold at 24 h, 21 (84%) were members of the CBF
regulon; of those upregulated five- to tenfold, 32/66 (49%) were assigned to the
CBF regulon. Conversely, approximately 90% of the COS genes that were
induced less than fivefold were not assigned to the CBF regulon. Finally, an addi-
tional distinguishing feature of the CBF regulon COS genes was their enrichment
among genes that remained upregulated at 7 days. Of these 67 ‘long-term’ upreg-
ulated COS genes (≥ 2.5-fold increase at 7 days), 37 (55%) were members of the
CBF regulon.
Taken together, the results of the expression-profiling experiments indicate
that the CBF transcription factors have a prominent role in regulating the expres-
sion of those cold-responsive COS genes that are both highly induced and long-
term upregulated in response to low temperature. However, it is also clear that
additional cold-response pathways participate in configuring the low-temperature
transcriptome. This is indicated by the finding that the transcript levels for 183
(36%) of the total 514 COS genes showed no detectable change in either of the
CBF2 overexpressing transgenic lines profiled. Thus, it would appear that these
COR genes fall outside of the CBF regulon. While most of these genes are induced
less than fivefold in response to low temperature, 33 were induced more than five-
fold. Identifying the transcription factors that regulate the expression of these genes
is required to completely define the low-temperature regulatory network of
Arabidopsis and may reveal additional transcription factors with important roles
in cold acclimation.

Role of the CBF cold response pathway in configuring the low-temperature

metabolome of Arabidopsis

It is well established that biochemical changes are associated with the process of
cold acclimation in plants (Levitt, 1980). This includes the accumulation of sugars
and amino acids such as sucrose and proline, which have been shown to have cry-
oprotective properties (Rudolph and Crowe, 1985; Strauss and Hauser, 1986).
Until recently, the analysis of the metabolic changes associated with cold acclim-
ation has been limited to targeted studies of individual metabolites. However, the
recent development of novel technologies to assess global metabolic changes
now makes a more comprehensive analysis possible (Fiehn et al., 2000). Using
these technologies in collaboration with Oliver Fiehn (Max Planck Institute for
Molecular Plant Physiology), an initial step to determine the global metabolic
changes that occur with cold acclimation in Arabidopsis was taken (Cook et al.,
Table 2.1. Cold-induced COS genes assigned to the CBF regulon.

CBF Cold Response Pathways

Average fold changeb A/GCCGACc

1 kb
Probe seta AGI Annotation Subrole CBF2 1h 24 h 7d upstream
Metabolism

265119_at AT1G62570 Flavin-containing monooxygenase Amino acid 12.2 −0.6 30.4 9.7 0
(similar to glutamate synthase)

251775_s_at AT3G55610 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate Amino acid 3.3 0.0 6.1 2.3 1

synthetase (P5CS2)

264511_at AT1G09350 Putative galactinol synthase Carbohydrate 346.5 −0.6 113.5 40.7 3

257876_at AT3G17130 Similar to invertase/pectin Carbohydrate 14.4 −0.7 9.4 2.5 1

methylesterase inhibitor

245998_at AT5G20830 Sucrose synthase I (SUS1) Carbohydrate 2.6 0.0 10.4 4.9 1

263789_at AT2G24560 Putative GDSL-motif lipase/hydrolase Lipid 258.5 1.2 23.5 4.1 2

245533_at AT4G15130 Putative phosphocholine Lipid 4.7 1.2 6.6 3.8 1

cytidylyltransferase (AtCCT2)

261048_at AT1G01420 Similar to UTP-glucose Secondary 6.3 0.6 4.8 2.8 1

glucosyltransferases

266532_at AT2G16890 Putative phenylpropenoid Secondary 2.6 2.0 14.5 7.9 0

glucosyltransferase

253879_s_at AT4G27570 UDP rhamnose-anthocyanidin- Secondary 4.5 0.6 7.3 2.5 0

3-glucoside rhamnosyltransferase

Transcription

260776_at AT1G14580 Zinc finger (C2H2 type) protein family mRNA synthesis 3.4 0.0 5.3 2.5 0

245807_at AT1G46768 AP2 domain transcription factor mRNA synthesis 5.3 −5.8 10.4 5.6 2
(RAP2.1)

15
(Continued)
Table 2.1. (continued)

16
Average fold changeb A/GCCGACc

1 kb
Probe seta AGI Annotation Subrole CBF2 1h 24 h 7d upstream
259971_at AT1G76580 Squamosa promoter binding protein- mRNA synthesis 3.3 0.6 4.5 1.9 1
related

266514_at AT2G47890 CONSTANS B-box zinc finger mRNA synthesis 3.6 0.0 5.5 2.7 1
family protein

251793_at AT3G55580 Regulator of chromosome mRNA synthesis 5.5 2.6 38.1 41.9 0
condensation RCC1 family

253722_at AT4G29190 Zinc finger (CCCH type) protein family mRNA synthesis 2.9 2.2 4.1 2.6 1

253219_at AT4G34990 MYB family transcription factor mRNA synthesis 3.1 −1.3 2.7 1.5 0
(MYB32)

245711_at AT5G04340 Putative C2H2 zinc finger mRNA synthesis 3.5 5.7 3.7 0.9 2
transcription factor

Intercellular communication and signal transduction

246922_at AT5G25110 Serine/threonine protein kinase-like Intracellular 11.5 0.5 91.1 47.9 0
signalling

246756_at AT5G27930 Protein phosphatase 2C (PP2C), Signal

putative transduction 3.7 0.0 2.9 1.7 0

Energy

264953_at AT1G77120 Alcohol dehydrogenase Fermentation 6.1 −0.7 11.8 2.9 1

253416_at AT4G33070 Pyruvate decarboxylase-1 (Pdc1) Fermentation 3.7 −0.9 22.6 7.1 1

J.T. Vogel et al.

Transport

247937_at AT5G57110 Ca2+-transporting ATPase (ACA8) Calcium 2.6 −0.2 7.6 3.6 1
transport
 CBF Cold Response Pathways
245427_at AT4G17550 Glycerol-3-phosphate Sugar transport 6.7 0.7 15.2 4.8 2
permease-like protein

260410_at AT1G69870 Putative proton-dependent Transport 3.7 0.8 7.3 2.8 1

oligopeptide transport (POT) protein

263574_at AT2G16990 Putative tetracycline transporter protein Transport 14.9 −1.2 3.3 1.9 2

266225_at AT2G28900 Putative membrane channel protein Transport 7.8 −0.1 6.1 3.5 2

250151_at AT5G14570 Similar to trans-membrane nitrate Transport 3.1 0.6 5.2 2.8 1
transporter protein

Protein processing and fate

262440_at AT1G47710 Serpin, putative Protein 3.8 −1.1 5.3 2.0 2

modification

251899_at AT3G54400 Aspartyl protease family Proteolysis 3.0 0.0 4.8 2.8 1

262644_at AT1G62710 Vacuolar cystein proteinase Targeting

(beta-VPE) and sorting 2.7 −0.1 8.9 5.2 0

Stress related

264787_at AT2G17840 ERD7 Ageing 3.6 0.8 9.4 3.2 1

263951_at AT2G35960 Putative Harpin-induced protein Defense 2.7 0.5 4.4 2.7 0

260556_at AT2G43620 Putative endochitinase Defense 40.4 1.5 12.0 9.3 1

253104_at AT4G36010 Thaumatin-like protein Defense 5.0 3.2 13.2 2.5 3

258893_at AT3G05660 Disease resistance protein Intracelluar 20.5 0.5 7.3 5.7 2
signalling

259426_at AT1G01470 LEA protein (LEA14) LEA/dehydrin 10.3 0.1 8.6 3.4 3

259570_at AT1G20440 Dehydrin (COR47) LEA/dehydrin 5.7 0.1 13.5 4.8 3

259516_at AT1G20450 Dehydrin (ERD10) LEA/dehydrin 8.6 1.6 15.3 6.9 2

17
(Continued)
Table 2.1. (continued)

18
Average fold changeb A/GCCGACc
1 kb
Probe seta AGI Annotation Subrole CBF2 1h 24 h 7d upstream
256310_at AT1G30360 Dehydrin (ERD4) LEA/dehydrin 2.6 1.1 2.8 0.7 1

263495_at AT2G42530 COR15b LEA/dehydrin 53.8 0.2 36.3 25.8 2

263497_at AT2G42540 COR15a LEA/dehydrin 484.8 0.0 115.9 87.8 2

252102_at AT3G50970 Dehydrin (Xero2) LEA/dehydrin 79.0 0.7 52.3 25.3 3

246481_s_at AT5G15960 KIN1 LEA/dehydrin 21.1 0.0 8.3 7.4 1

248337_at AT5G52310 COR78 LEA/dehydrin 57.7 0.8 51.3 24.1 4

262452_at AT1G11210 Expressed protein (COR35) Unknown 3.5 4.3 33.4 14.0 0

256114_at AT1G16850 Expressed protein (COR17) Unknown 380.4 0.4 218.0 60.8 3

259789_at AT1G29395 Similar to cold acclimation protein Unknown 20.0 −0.1 9.4 7.3 1
WCOR414 (WCOR414-TM1)

262050_at AT1G80130 Expressed protein (COR33.5) Unknown 6.1 0.6 24.1 26.3 1

265480_at AT2G15970 Similar to cold acclimation protein Unknown 4.0 −1.1 5.0 3.3 2
WCOR413 (WCOR413-PM1)

267261_at AT2G23120 Expressed protein (COR8.5) Unknown 8.6 1.4 6.2 3.4 1

254818_at AT4G12470 pEARLI 1-like protein Unknown 11.7 1.1 38.1 34.1 0

254805_at AT4G12480 pEARLI 1 Unknown 9.7 0.6 21.4 47.2 0

−0.1

J.T. Vogel et al.

254832_at AT4G12490 pEARLI 1-like protein Unknown 4.1 3.0 10.2 0

253627_at AT4G30650 Hydrophobic protein (LTI6A/RCI2A) Unknown 11.7 0.0 8.9 7.2 1

253595_at AT4G30830 Expressed protein (COR42) Unknown 66.3 0.8 91.6 40.9 2
 CBF Cold Response Pathways
Cellular biogenesis

259173_at AT3G03640 Beta-glucosidase (GLUC) Cell wall 3.2 0.4 4.2 1.8 2

258719_at AT3G09540 Putative pectate lyase Cell wall 4.5 −0.6 6.9 3.0 2

251229_at AT3G62740 Beta-glucosidase-like protein Cell wall 7.8 −0.2 12.1 12.2 1

254662_at AT4G18270 Glycosyltransferase family 4 Cell wall 2.6 0.0 2.9 1.6 1
(ATTRANS11)

252997_at AT4G38400 Expansin protein family (EXPL2) Cell wall 3.3 1.9 9.6 2.4 3

247478_at AT5G62360 Similar to pectinesterase Cell wall 3.9 1.4 8.3 2.0 1

Cellular organization

254085_at AT4G24960 Similar to abscisic acid-induced Vesicular 13.1 0.0 8.6 2.1 3
protein (HVA22D) trafficking

DNA replication and cell division

257237_at AT3G14890 DNA nick sensor, putative DNA synthesis 3.1 −1.1 7.6 2.8 2

Unknown role

260727_at AT1G48100 Glycoside hydrolase family 28 protein Unknown 16.2 0.6 15.8 3.3 0

262881_at AT1G64890 Expressed protein (integral Unknown 2.8 0.0 9.6 3.4 0
membrane/transporter family)

252956_at AT4G38580 Farnesylated protein (ATFP6) Unknown 3.2 1.1 10.0 4.5 2

250279_at AT5G13200 Like ABA-responsive protein Unknown 7.0 1.5 4.4 2.7 1

248467_at AT5G50800 Nodulin MtN3-like protein Unknown 3.1 −0.1 4.4 7.0 0

245749_at AT1G51090 Similar to proline-rich protein Unknown 56.5 1.3 29.3 4.4 2

251927_at AT3G53990 Universal stress protein Unknown 3.4 1.1 4.4 2.1 2
(USP) family protein
(Continued)

19
Table 2.1. (continued)

20
Average fold changeb A/GCCGACc

1 kb
Probe seta AGI Annotation Subrole CBF2 1h 24 h 7d upstream
262164_at AT1G78070 WD-40 repeat family protein Unknown 4.8 0.6 5.1 2.7 2

Unknown protein

264516_at AT1G10090 Expressed protein Unknown 3.1 −0.6 3.4 1.4 2

264458_at AT1G10410 Expressed protein Unknown 2.9 1.2 6.4 3.0 1

262496_at AT1G21790 Expressed protein Unknown 4.0 0.1 5.8 2.1 1

264989_at AT1G27200 Expressed protein Unknown 5.2 1.6 7.5 3.9 2

261566_at AT1G33230 Expressed protein Unknown 3.0 −0.1 4.0 2.2 1

245200_at AT1G67850 Expressed protein Unknown 3.7 1.1 3.7 2.8 0

260264_at AT1G68500 Expressed protein Unknown 14.8 1.2 17.8 3.2 1

263352_at AT2G22080 Expressed protein Unknown 2.9 0.6 4.3 1.8 1

251753_at AT3G55760 Expressed protein Unknown 9.9 −0.1 10.4 2.1 1

254850_at AT4G12000 Expressed protein Unknown 4.3 0.5 3.8 1.7 1

253425_at AT4G32190 Expressed protein Unknown 2.7 0.5 4.2 1.5 2

246125_at AT5G19875 Expressed protein Unknown 4.1 0.6 3.6 2.3 1

249750_at AT5G24570 Expressed protein Unknown 5.0 −0.1 3.8 2.5 1

For details on the experiments that generated these data, see Vogel et al. (2005).

J.T. Vogel et al.

a
AGI identifier numbers, annotations and subrole assignments for each probe set were derived from data provided by Affymetrix (http://www.affymetrix.com/),
TAIR (http://www.arabidopsis.org/), TIGR (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/) and MIPS (http://mips.gsf.de/proj/thal/db/index.html).
b
The average fold change values are given for the two CBF2 overexpressing lines (E2 and E24) profiled and the four replicates of cold-treated wild-type
Arabidopsis. Values in bold indicate times at which the transcript was labelled as cold-responsive; see Vogel et al. (2005) for the selection criteria.
c
The number of CRT/DRE elements present 1 kb upstream of the transcript listed was based on datasets available from TAIR using the TIGR 5.0 annotation.
CBF Cold Response Pathways 21

Fig. 2.1. A majority of the transcripts that exhibit the greatest fold increase in response to low
temperature are members of the CBF regulon. Cold-upregulated transcripts were ranked by
average fold change after 24 h at 4°C. Those that were assigned to the CBF regulon (CBF) are
coloured grey; those that were assigned as not being members of the CBF regulon (non-CBF)
are coloured light grey; and those that could not be assigned (not assigned) to either of these
classes are coloured black.

2004). A total of 434 low-molecular weight carbohydrates, amines, organic acids

and other polar molecules were monitored in the analysis. In addition, the role of
the CBF cold response pathway in configuring these changes was assessed by
analysing the changes that occurred in the metabolome of non-acclimated trans-
genic Arabidopsis plants that constitutively overexpressed CBF3.
The analysis indicated that cold acclimation in Arabidopsis (ecotype Ws-2) is
associated with extensive changes in the metabolome profile (Cook et al., 2004).
Using a rigorous statistical cut-off (P < 0.001), the results indicated that of the
434 metabolites monitored, 325 (75%) increased in cold-acclimated plants. The
increases observed varied from less than twofold to greater than 25-fold, with 114
(35%) increasing at least fivefold (Table 2.2). Of the metabolites that increased
with cold acclimation, 75 were identified and 250 were categorized according to
class (carbohydrate, amine, organic acid or other polar molecules). However, a
significant number, 116 (36%), were unidentified.
Several of the identified metabolites had previously been shown to increase in
Arabidopsis plants upon exposure to low temperature including the amino acid,
proline, and sugars such as glucose, fructose, inositol, galactinol, raffinose and
sucrose. However, the majority of the identified metabolites had not previously
been shown to increase in Arabidopsis. This includes trehalose, putrescine and
ascorbate, which have potential roles in cold tolerance. In addition, increases
observed in ornithine and citrulline, precursors to polyamine biosynthesis, suggest
22 J.T. Vogel et al.

Table 2.2. Number of metabolites that increase in Arabidopsis (ecotype Ws-2) with cold
acclimation.

Fold change in peak area in cold (P < 0.001)a Number of metabolites

≥ 25 26

≥ 5 to < 25 88

> 1 to < 5 211

Total 325
a
A total of 434 metabolites were monitored using GC-time-of-flight mass spectrometry, 325 of which
increased the indicated amounts in response to low temperature (14 days).

upregulation of the urea cycle; and increases in α-ketoglutarate, fumarate, malate

and citrate, precursors to amino acid biosynthesis, suggest upregulation of the
TCA cycle.
To explore the extent to which the low-temperature metabolome of
Arabidopsis is conditioned by the CBF cold response pathway, we compared the
metabolomes of non-acclimated and cold-acclimated wild-type Arabidopsis Ws-2
plants with the metabolome of non-acclimated transgenic Arabidopsis Ws-2 plants
overexpressing CBF3 (Cook et al., 2004). The results indicated that expression of
the CBF regulon brought about extensive changes in the metabolome that were
similar to those that occurred in response to low temperature. Of the 325 metabo-
lites that were identified as increasing in response to low temperature, 256 (79%)
were also found to increase in response to overexpression of CBF3 (P < 0.001).
Moreover, of the 114 metabolites that increased more than fivefold in response to
low temperature, 102 (90%) also increased in response to CBF3 overexpression.
These results suggested that the metabolome of non-acclimated CBF3-over-
expressing plants was similar to that of cold-acclimated plants. To test this further,
the levels of the 434 metabolites in the non-acclimated CBF3-overexpressing plants
were compared to those in non-acclimated and cold-acclimated Ws-2 plants and
the results were subjected to hierarchical clustering. The analysis indicated that the
metabolome of the non-acclimated CBF3-overexpressing plants more closely
resembled the metabolome of cold-acclimated wild-type plants than the
metabolome of non-acclimated wild-type plants.
Taken together, the results of the metabolite-profiling experiments indicated
that extensive changes occurred in the metabolome of Arabidopsis Ws-2 plants in
response to low temperature and that the CBF cold response pathway has a
prominent role in bringing about these changes.

The CBF cold response pathway of tomato

As noted earlier, in contrast to Arabidopsis, tomato (Lycopersicon

esculentum/Solanum lycopersicum) is a chilling-sensitive plant that cannot cold
CBF Cold Response Pathways 23

acclimate. Given the role of the CBF cold response pathway in chilling and freez-
ing tolerance in Arabidopsis, it was of interest to determine whether tomato has a
CBF cold response pathway, and if so, whether ‘deficiencies’ in it might contribute
to the cold-sensitive phenotype of tomato. Towards this end, it should be asked
first whether tomato has functional CBF genes. It was found that tomato has three
genes encoding CBF-like proteins, LeCBF1–3, that, as in Arabidopsis, are located
in tandem array in the genome (Jaglo et al., 2001; Zhang et al., 2004). All three
tomato CBF proteins contain the CBF family ‘signature sequences’ flanking the
AP2/ERF domain (Jaglo et al., 2001), and alignments of the tomato and
Arabidopsis CBF1–3 proteins reveal additional highly conserved regions outside of
the AP2/ERF domain (Jaglo et al., 2001; Zhang et al., 2004). Overall, the amino
acid sequences of LeCBF1–3 are 70–84% identical to each other and 51–59%
identical to CBF1–3 proteins from Arabidopsis.
Expression analysis studies showed that in a similar manner to CBF1–3 in
Arabidopsis, transcripts for the tomato LeCBF1 gene accumulate rapidly (within
15 min) upon transferring tomato plants to low temperature and also after
mechanical agitation (Jaglo et al., 2001; Zhang et al., 2004). In contrast, neither
LeCBF2 nor LeCBF3 was induced in response to low temperature. They were,
however, responsive to mechanical agitation, indicating that these genes could still
be activated under certain conditions. None of the tomato CBF genes was upreg-
ulated in response to high salinity, drought or treatment with ABA.
To test whether the cold-responsive tomato gene, LeCBF1, encodes a func-
tional homologue of the Arabidopsis CBF proteins, transgenic Arabidopsis plants
that constitutively expressed LeCBF1 under the control of the CaMV 35S pro-
moter were created (Zhang et al., 2004). The transgenic plants exhibited stunted
growth and delayed flowering, a phenotype similar to that described when CBF
genes are overexpressed in Arabidopsis (Liu et al., 1998; Kasuga et al., 1999;
Gilmour et al., 2004). Furthermore, constitutive expression of LeCBF1 in trans-
genic Arabidopsis plants activated expression of COR genes and increased plant
freezing tolerance in the absence of a low-temperature stimulus (Zhang et al.,
2004). These results indicated that LeCBF1 encodes a functional homologue of the
Arabidopsis CBF1–3 genes.
The finding that tomato is able to activate expression of at least one func-
tional CBF gene in response to low temperature indicated that upstream compon-
ents of the CBF cold response pathway were functional in tomato. That is,
tomato could sense low temperature and activate expression of a CBF gene that
encoded a functional protein. The question then became whether downstream
components of the CBF cold response pathway were present and functional in
tomato. To determine whether the CBF regulon of tomato was similar to that of
Arabidopsis, transgenic tomato plants constitutively overexpressing either AtCBF3
or LeCBF1 under control of the CaMV 35S promoter were created and tested for
changes in gene expression and freezing tolerance.
The results indicated that tomato did have a CBF regulon, but that it was
much smaller than that of Arabidopsis. In particular, transcriptome analysis using
a cDNA microarray surveying approximately 25% of the tomato genome identi-
fied only three genes that were members of the tomato CBF regulon (i.e. were
induced by both low temperature and overexpression of AtCBF3 and LeCBF1).
24 J.T. Vogel et al.

Two of these genes encoded dehydrins (genes encoding dehydrins are also found
in the Arabidopsis CBF regulon) and the third encoded a putative proteinase
inhibitor. Limited sequence analysis of the promoter regions of the two dehydrin
genes indicated the presence of putative CRT/DRE elements. Further analysis
indicated that eight tomato genes that were likely homologues of Arabidopsis CBF
regulon genes were not responsive to CBF overexpression in tomato. Finally, con-
stitutive expression of AtCBF3 or LeCBF3 did not result in increased freezing tol-
erance in the transgenic tomato plants. A similar result was described by Hsieh
et al. (2002) for constitutive expression of AtCBF1 in tomato.
Taken together, the results obtained with tomato indicate that it has a com-
plete CBF cold response pathway; i.e. tomato can sense low temperature, activate
the expression of a CBF gene encoding a functional protein and has a CBF reg-
ulon that includes genes with putative functional CRT/DRE elements and encoding
dehydrin proteins. However, it also appears that the CBF regulon of tomato is
much smaller, and, consequently, is less functionally diverse than that of
Arabidopsis.

Concluding Remarks

A central goal of the studies described above was to determine the extent to which
the CBF cold response pathway ‘configures’ the low-temperature transcriptome
and metabolome of Arabidopsis. The results provide significant insights into this
issue. The expression-profiling experiments indicate that the CBF transcription
factors have a prominent role in regulating the expression of those cold-responsive
genes that are the most highly induced in response to low temperature and remain
upregulated for extended periods of time (7 days in these experiments). In addi-
tion, the metabolite-profiling experiments indicate that extensive changes occur in
the metabolome of Arabidopsis Ws-2 plants in response to low temperature, and
that the CBF cold response pathway has a prominent role in bringing about these
changes. In sum, the results provide additional evidence that the CBF cold
response pathway has a central role in the cold acclimation response in
Arabidopsis.
While it is evident that the CBF cold response pathway is a major player in
cold acclimation, it is also apparent that many cold-induced genes fall outside of
the CBF regulon. Key challenges now are to determine what transcription factors
control the expression of the ‘non-CBF regulon’ genes; to define the regulons con-
trolled by these transcription factors; and to determine whether these regulons
contribute significantly to cold tolerance. Towards these ends, Vogel et al. (2005)
identified a number of transcription factors that are expressed in parallel with the
CBF1–3 genes and demonstrated that one of these transcription factors, ZAT12,
a C2H2 zinc finger protein (Meissner and Michael, 1997), contributes to condi-
tioning the low-temperature transcriptome and freezing tolerance. Overexpression
of ZAT12 in transgenic Arabidopsis plants led to the assigning of 24 genes to the
ZAT12 regulon and demonstrates that expression of the ZAT12 regulon results in a
small, but detectible, increase in plant freezing tolerance (Vogel et al., 2005). Similarly,
Zhu et al. (2004) have identified a transcription factor, HOS9, a homeodomain
CBF Cold Response Pathways 25

protein, that appears to control expression of certain COR genes and to contribute
to freezing tolerance. Continued efforts along these lines should, over the next few
years, lead to the construction of a low-temperature ‘wiring diagram’ that includes
the identification of regulatory networks that function in Arabidopsis cold
acclimation.
In regard to the low-temperature metabolome studies, we would like to inte-
grate the metabolite data with the transcriptome results. At present, however, such
efforts are severely limited by the fact that, of the estimated 5000 primary and sec-
ondary metabolites present in an Arabidopsis leaf, only about 10% have been
identified (Bino et al., 2004). Indeed, of the 325 metabolites that we found
increased upon cold acclimation, only 75 (23%) were conclusively identified (Cook
et al., 2004). Similarly, efforts to integrate metabolome and transcriptome data are
limited by the fact that a large percentage (approximately one-third) of the iden-
tified transcripts are not yet assigned functions. It is also the case that the linking
of individual metabolites to particular transcripts or pathways is complicated by
the fact that individual metabolites can be members of multiple pathways and indi-
vidual enzymes can catalyse the synthesis of multiple metabolites. Despite these
limitations, we have learned that cold acclimation is associated with extensive
changes in the metabolome and that the CBF cold response pathway has a promi-
nent role in bringing about these changes. It is also the case that improved tech-
nologies and methods for metabolome analysis are intensively being developed as
well as bioinformatic approaches to integrate datasets (e.g. Scholz et al., 2004;
Thimm et al., 2004). This is an exciting area of research that should continue to
blossom in the coming years.
The second major goal of the research described here was to develop a bet-
ter understanding of the CBF cold response pathway of tomato. It was found
that tomato can sense low temperature and activate expression of a CBF gene
encoding a functional CBF protein. In addition, we found that expression of the
tomato CBF gene leads to induction of target genes that have putative functional
CRT/DRE elements, i.e. tomato has a CBF regulon. Thus, it can be concluded
that tomato has a ‘complete’ CBF cold response pathway. However, the results
also indicate that the CBF regulon of tomato is much smaller, and consequently
is less functionally diverse, than the Arabidopsis CBF regulon. Whereas the
Arabidopsis CBF regulon appears to include more than 100 genes (Fowler and
Thomashow, 2002; Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et al., 2005),
the CBF regulon of tomato may comprise only about 10–15 genes (three genes
were assigned to the tomato CBF regulon after surveying approximately 25% of
the genome). What could account for this large difference in regulon composi-
tion? One possibility is that tomato might have only a few genes with functional
CRT/DRE elements within their promoters. Alternatively, the differences in
CBF regulon composition might reflect differences in the protein factors required
for CBF to function. For instance, in Arabidopsis, the SFR6 gene is required for
CBF to activate expression of its target genes (Knight et al., 1999; Boyce et al.,
2003). Perhaps tomato encodes a weak allele of SFR6 or some other gene
required for full CBF activity, resulting in weak induction of most CBF target
genes. Distinguishing between these and other possibilities is a goal that is being
pursued.
26 J.T. Vogel et al.

Acknowledgements

Research conducted in the laboratory of M.F. Thomashow was made possible by

grants from the NSF Plant Genome Program (DBI 0110124), the DOE
(DEFG0291ER20021) and the Michigan Agricultural Experiment Station.
D. Cook was a recipient of an Alfred Toepfer award from the von Humboldt
Foundation. J.T. Vogel was a recipient of a US Department of Education
Graduate Assistantship in Areas of National Need (GAANN) fellowship.

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3 Barley Contains a Large CBF Gene
Family Associated with Quantitative
Cold-tolerance Traits
J.S. SKINNER,1,2,* J. VON ZITZEWITZ,2 L. MARQUEZ-CEDILLO,2
T. FILICHKIN,2 P. SZU″CS,3 K. AMUNDSEN,4 E.J. STOCKINGER,5
M.F. THOMASHOW,4 T.H.H. CHEN1 AND P.M. HAYES2
1
Department of Horticulture, College of Agriculture, Oregon State University,
Corvallis, OR 97331, USA; 2Department of Crop and Soil Science, College of
Agriculture, Oregon State University, Corvallis, OR 97331, USA; 3Agricultural
Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences, H-2462
Martonvásár, Hungary; 4Department of Crop and Soil Sciences, Michigan
State University, East Lansing, MI 48824, USA; 5Department of Horticulture
and Crop Science, The Ohio State University/OARDC, Wooster, OH 44691, USA

Introduction

Low-temperature tolerance within the Triticeae

Plants display a broad capacity range to survive cold and freezing conditions
(Thomashow, 1999). Most current work into the molecular basis of plant cold tol-
erance has been performed in the model non-crop plant Arabidopsis. Increasingly,
these observations are being tested in crop plants. The grasses, or Poaceae, con-
tain the economically most important crop plant family members, including all the
cereal crops utilized by humans. These include rice (Oryza sativa), maize (Zea
mays) and members of the Triticeae, which includes the important members
wheat (Triticum aestivum), barley (Hordeum vulgare) and rye (Secale cereale).
Within the cereals, a broad range of cold tolerance, from completely sensitive
to extreme cold hardy, is observed. At one extreme are the cereals of subtropical
origin such as rice and maize, which are sensitive to cold and will not survive
freezing temperatures. These characteristics make these systems of limited use for

*Corresponding author (e-mail: [email protected]; Fax: +1-541-737-3479)

©CAB International 2006. Cold Hardiness in Plants: Molecular Genetics, Cell Biology
30 and Physiology (eds T.H.H. Chen et al.)
Quantitative Cold-tolerance Traits in Barley 31

dissecting the molecular basis of freezing tolerance within the cereals. In contrast,
within the Triticeae, a wide range of phenotypic variation for cold tolerance
occurs, and is exemplified at the other extreme by rye, which can withstand tem-
peratures of −30°C when fully cold-acclimated (Thomashow, 1999). Our group
has been using barley as a model to study the mechanisms by which the Triticeae,
and cold-tolerant cereals in general, adapt to and survive cold and freezing
conditions.
Domesticated barley, Hordeum vulgare subsp. vulgare, is an economically
important crop model for the study and dissection of the molecular, genetic and
physiological components of Triticeae winter hardiness. Winter hardiness consists
of three major traits: low-temperature (LT) tolerance, vernalization (VRN)
response and photoperiod (PPD) sensitivity. The specific combination of these
three traits determines the growth habit of a genotype (below). Barley is a self-
pollinated diploid and abundant genetic variation for cold tolerance is found
within its primary gene pool. Relative to the cold-tolerant cereals, barley is unique
in the broad array of ever-expanding tools that are currently available for genetic
and molecular analysis (reviewed in Hayes et al., 2003), which include multiple
doubled haploid mapping populations, near isogenic lines, arrayed large insert
BAC clones (Yu et al., 2000), a large expressed sequence tag (EST) database, and
a 22K microarray gene chip (Close et al., 2004), among others.
The Triticeae form a homogeneous genetic system with a high degree of syn-
teny. Comparative genetics studies confirm that the genetic determinants of win-
ter hardiness appear to be conserved among members that possess this trait, and,
therefore, results from one species are frequently applicable to other members of
the cereal tribe (Dubcovsky et al., 1998; Mahfoozi et al., 2000). Furthermore, all
barley linkage maps are collinear and allow linkage map position alignments of
loci and quantitative trait locus (QTL) mapped in different populations, utilizing
the BIN map concept of Kleinhofs and Graner (2001). In barley, as in other mem-
bers of the Triticeae, genetic variation for growth habit occurs. QTL analysis tools
have revealed that a limited number of conserved genome regions are responsible
for the components of winter hardiness. A region is present on the long arm of
chromosome 5H where QTL for VRN response, LT tolerance and PPD sensitiv-
ity are co-localized in the Triticeae (Pan et al., 1994; Cattivelli et al., 2002);
this cluster was first observed in the Dicktoo × Morex (DM) barley population as
coincident LT tolerance and PPD sensitivity QTLs (Hayes et al., 1993). While
VRN, LT and PPD are interrelated (Limin and Fowler, 2002), these three trait
phenotypes occur in all possible combinations within the barley germplasm (Karsai
et al., 2001), suggesting the interrelationships of these traits may be attributable to
linkage rather than to pleiotropy.
Relative to the LT, VRN and PPD trait combinations, three winter hardiness
growth habit classes – winter, facultative and spring – are defined for the barley
germplasm (Karsai et al., 2001). Winter habits are VRN responsive, PPD sensitive
and the most LT tolerant. Higher LT-tolerance capacity is necessary in winter
habit genotypes so the plants can survive the prolonged LT exposure needed to
fulfil the VRN requirement. In contrast, spring habits lack a VRN response, are
insensitive to short-day PPD, and are the most sensitive to LT, and thus have a
growth habit that is essentially the inverse of the winter habit. Facultative habits
32 J.S. Skinner et al.

are PPD sensitive and can be as LT tolerant as winter varieties, but lack a VRN
requirement. The facultative growth habit may actually be a winter genotype sub-
class in which the Vrn-H2 candidate gene has been deleted (von Zitzewitz, 2004;
Karsai et al., 2005; Cooper et al., Chapter 5, this volume). In cereals, maximum
LT tolerance is achieved following cold acclimation, the process by which a plant
develops freezing tolerance when exposed to low, but non-freezing, temperatures
while still within the vegetative growth state (Hayes et al., 1997).

CBFs are key components of the plant low-temperature tolerance pathway

During the cold acclimation process, many changes occur at both the biochemical
and physiological levels in a plant (Thomashow, 1999). One major change is the
induction of a suite of LT-responsive genes termed cor (cold-regulated) genes. The
products of these cor genes are thought to collectively impart the necessary physio-
logical and biochemical alterations that increase a plant’s freezing tolerance
(Thomashow, 1999). Many of these cor genes contain a CRT (C-repeat) regula-
tory element having the core sequence motif, CCGAC, in their promoter. This
element has been shown to respond to the abiotic stresses of cold, drought and
salt exposure (Thomashow, 1999); this motif is also referred to as a DRE (dehy-
dration response element). One major advance in plant cold hardiness research
was the identification of the CBF (C-repeat binding factor) family of genes from
Arabidopsis (Stockinger et al., 1997; Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998). CBF
genes encode transcription factors that are members of the AP2/EREBP family of
DNA-binding proteins and specifically bind to the CRT element of cor gene pro-
moters in response to cold, inducing their expression (Stockinger et al., 1997;
Gilmour et al., 1998; Jaglo et al., 2001). CBFs are distinguished from other mem-
bers of the AP2/EREBP superfamily by the presence of CBF signature sequence
motifs flanking the AP2 domain (Jaglo et al., 2001). The Arabidopsis genome
encodes six CBF genes and ectopic expression of AtCBF1–4 in transgenic plants
results in activation of components of the CBF regulon, including cor genes that
harbour CRT elements within their promoters (Jaglo-Ottosen et al., 1998; Liu
et al., 1998; Gilmour et al., 2000; Jaglo et al., 2001; Haake et al., 2002). EST
database searches reveal that CBF-like genes are present in most dicot and mono-
cot EST collections (J.S. Skinner, unpublished results), implying the CBF response
pathway is widely distributed within higher plants.
CRT motifs are present in the regulatory regions of most barley cor genes for
which a promoter has been isolated; three CBF genes have been reported from
barley (Choi et al., 2002; Xue, 2002, 2003) to date. In Arabidopsis, AtCBF1–3 are
present as a tandem gene array (Gilmour et al., 1998) that is coincident with a
LT-tolerance QTL (Salinas, 2002), implying that genetic variation at CBF gene
loci could be a basis for genotypical differences in LT tolerance. Together, these
results suggest that CBF genes are involved in LT tolerance in barley, and could
be a basis for the differential genotypic LT capacities. Two important barley popu-
lations for mapping winter growth habit traits, including LT tolerance, were avail-
able at the initiation of this study and accordingly employed to maximize the
barley germplasm variation analysed. The DM population is a barley research
Discovering Diverse Content Through
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verbrauchen. Nächstdem kommt Bengalen und Malabar in Britisch-
Indien und Java und Sumatra in Holländisch-Indien. Gute Kassia ist
ein billigerer Ersatz des teuren, echten Ceylonzimts und wird häufig
unter dessen Namen in den Handel gebracht. Sie ist dicker und
kräftiger als Zimt, bricht kürzer, schmeckt beißender und ist ärmer
an Aroma. Diese Unterschiede verschwinden um so mehr, je feiner
die Kassia und je geringer der Zimt ist. Besonders in gemahlenem
Zustand wird Kassia sehr häufig als Zimt verkauft, oder kommt mit
Zimt vermischt als reiner Zimt in den Handel. Die K a s s i a b l ü t e n
haben einige Ähnlichkeit mit den Gewürznelken, sind nur etwas
kleiner. Sie stellen die in der Sonne getrockneten, ganz jungen
Früchte des besonders in Südjapan kultivierten Cinnamomum dulce
bald nach dem Verblühen der Blüten dar und werden gleicherweise
wie die Rinde als Arznei und Gewürze verwendet. Als Zimtnägelein
standen sie im Mittelalter hoch im Preise und wurden besonders zur
Herstellung des als Hippokras bezeichneten Würzweins benutzt. Die
Kultur und Ernte der Zimtkassia ist ganz analog derjenigen des
echten Zimts.
Die Kassia wird seit Urzeiten vom alten Kulturvolke der Chinesen
als geschätzte Arznei und Würze verwendet. Schon in einem auf den
chinesischen Kaiser Schen-nung ums Jahr 2800 v. Chr.
zurückgeführten Kräuterbuche wird sie unter dem Namen kwai
angeführt, der sich in China unverändert bis heute für Zimt erhalten
hat. Sie ist es auch, welche unter dem heute noch gebräuchlichen
Namen kasia neben dem echten Zimt schon im frühen Altertum auf
dem Seewege an die Küsten des Roten Meeres gebracht und von
dort aus an die Kulturvölker im Bereiche des östlichen
Mittelmeerbeckens weiter verhandelt wurde. In einem uralten, an
der Wand des Laboratoriums des Tempels von Edfu (18. Dynastie
1580–1350 v. Chr.) in Hieroglyphen eingemeißelten Rezept zu
heiligem Räucherwerk wird Zimt als kainamaa aufgeführt. Und als
die unternehmende Tochter und Erbin des ägyptischen Königs
Thutmosis I., Hatschepsut, die mit ihrem Halbbruder Thutmosis II.
verheiratet war und nach dessen Tode von 1516–1481 v. Chr.
selbständig über Ägypten herrschte, im 9. Jahre ihrer Regierung eine
Expedition von fünf Schiffen nach dem Lande Punt (Südarabien)
sandte, brachte diese außer Weihrauch, Gold und Elfenbein auch
Zimt in größerer Menge nach der Residenz Theben mit. Da nun im
Lande Punt kein Zimt wuchs, müssen ihn indische Handelsschiffe
dahin gebracht haben.
Zu Ende des zweiten vorchristlichen Jahrtausends war der Zimt
als kostbarer Handelsartikel Vorderasiens auch den Juden und den
Phönikiern unter dem Namen kinnamon bekannt. So lesen wir in
dem zur Zeit der israelitischen Könige, deren drei erste Saul (1055
bis 1033 v. Chr.), David (1033–993) und Salomo (993–953) waren,
verfaßten Pentateuch im 2. Mose 30, 22 u. f. welche Wertschätzung
dieses ferne Produkt Indiens bei den ältesten Juden besaß. Dort
heißt es: „Und der Herr (Jahve) redete mit Mose (am Sinai um 1280
v. Chr.) und sprach: Nimm zu dir die besten Spezereien 500 (Sekel)
und Zimt halb soviel, nämlich 250, und Kalmus auch 250, und Kassia
500 nach dem Sekel des Heiligtums und Öl vom Ölbaum 1 Hin, und
mache ein heiliges Salböl nach der Apothekerkunst und salbe damit
die Hütte des Stifts und die Lade des Zeugnisses, den Tisch mit all
seinem Geräte, den Leuchter mit seinem Geräte, den Räucheraltar,
den Brandopferaltar mit all seinem Geräte und das Handfaß mit
seinem Fuß; und sollst sie also weihen, daß sie das Allerheiligste
seien, denn wer sie anrühren will, der soll geweiht sein. Und sollst
mit den Kindern Israels reden und sprechen: Dieses Öl soll mir eine
heilige Salbe sein bei euren Nachkommen. Auf Menschen soll es
nicht gegossen werden, du sollst auch seinesgleichen nicht machen;
denn es ist heilig, darum soll’s euch heilig sein. Wer ein solches (Öl)
machet oder einem andern davon gibt, der soll von seinem Volk
ausgerottet werden.“
Dann findet sich der Zimt in der den Sprüchen Salomos
nachgeahmten „Weisheit Jesu, des Sohnes Sirach“, die ein gelehrter
jüdischer Priester von angesehener Lebensstellung ums Jahr 180
v. Chr. in Alexandrien in griechischer Sprache verfaßte, und in der im
Jahre 68 auf 69 n. Chr. in Ephesus ebenfalls griechisch abgefaßten
Offenbarung des Johannes erwähnt, und zwar in letzterer Schrift
dort, wo von den Waren die Rede ist, die die Kaufleute Babylons
verkaufen: Silber, Gold, Edelstein, Perlen, Seide, Purpur und
Scharlach, Zimt, Weihrauch, Thymian, Salben, Wein, Öl, Weizen,
Vieh usw.
Phönikische Kaufleute brachten den Zimt unter der von ihnen
dafür gebrauchten Bezeichnung kinnamon zu den Griechen und
müssen ihnen dabei recht abenteuerliche Geschichten über dessen
Herkunft und Gewinnung erzählt haben; denn gleich der erste
griechische Schriftsteller, der diese kostbare, als Gewürz und Arznei
gleich hochgeschätzte Droge erwähnt, der Vater der griechischen
Geschichtschreibung Herodot (484 bis 424 v. Chr.), der selbst
Ägypten, Syrien und Babylonien bereiste, schreibt über ihn: „Die
Araber sind nicht imstande anzugeben, in welchem Lande der Zimt
(kinnámōmon) wächst, doch vermuten einige, er wachse in den
Ländern, in denen Dionysos (der angeblich aus Indien stammende,
über Kleinasien nach Griechenland gekommene orientalische Gott
des Natursegens und der bei seinen Festen zum Ausdruck
kommenden ausgelassenen Lebensfreude) erzogen worden. Große
Vögel brächten die Späne herbei, welche die Phönikier kinnámōmon
nennen, welchen Namen wir von ihnen entlehnt haben. Die Vögel
trügen den Zimt in ihre an unzugängliche Felsen gebauten Nester.
Um ihn nun von da zu bekommen, legten die Araber große Stücke
Fleisch von krepierten Rindern, Eseln usw. unter die Felsen und
versteckten sich dann. Die Vögel trügen die Fleischstücke in ihre
Nester und überlüden sich so damit den Magen, daß sie
herunterstürzten, worauf der Zimt gesammelt und nach den anderen
Ländern hin verhandelt würde.“
Noch Aristoteles (384–322 v. Chr.), seit 343 Lehrer Alexanders
des Großen, — sein Vater Nikomachos war in Stagira in Makedonien
Leibarzt und Vertrauter des Königs Amyntas II. von Makedonien
gewesen — meldet uns solche zu seiner Zeit herum gebotene und
geglaubte Märchen, indem er in seiner Naturgeschichte sagt: „Das
Zimtvögelchen soll in den Gegenden, wo es heimisch ist, Zimt
zusammentragen und sein Nest daraus auf den Zweigen hoher
Bäume bauen. Die Bewohner des Landes sollen es von da mit
Pfeilen, deren Spitze von Blei ist, herabschießen und so den Zimt
gewinnen.“ Sein Schüler Theophrast (390–286 v. Chr.) weiß uns,
nachdem inzwischen Alexander der Große seinen Zug nach Indien
ausgeführt hatte, schon Positiveres über den Zimt, wie auch über
Kassia zu berichten. Er schreibt in seiner Pflanzengeschichte: „Über
Zimt (kinnámōmon) und Kassia (kasia) berichtet man folgendes:
Beide sollen Sträucher von unbedeutender Höhe, dabei dem
Keuschbaum (ágnos, Vitex agnus castus) ähnlich sein und viele
holzige Zweige haben. Wenn man den ganzen Zimtbaum fällt, so soll
man ihn in fünf Teile teilen. Die jungen Triebe sollen den besten Zimt
geben und man schneidet davon Stücke eine Spanne lang oder
wenig länger. Was darunter folgt gibt die zweite Sorte und wird
kürzer geschnitten; dann folgt die dritte und vierte Sorte. Die letzte
Sorte ist der Wurzel am nächsten und die schlechteste; denn da ist
wenig Rinde. Überhaupt wird nur die letztere gebraucht, nicht das
Holz. Deswegen sind eben die Zweige am besten; denn sie haben
die meiste Rinde.
Andere behaupten ebenfalls, es seien Sträucher, aber es gebe
eine weiße und schwarze Sorte. Es geht auch die Sage, daß sie in
Schluchten wachsen, worin viele Schlangen leben, deren Biß tödlich
ist. In diese Schluchten gehe man zum Sammeln des Zimts mit
geschützten Händen und Füßen. Das Gewonnene teile man in drei
Teile, bestimme den einen für den Sonnengott und entscheide durch
das Los, welchen er bekommen solle. Gehen die Leute fort, so soll
der dem Sonnengott zuteil gewordene Zimt sogleich verbrennen.
Das ist aber natürlich nur Fabel.
Von der Kassia sagt man, sie habe dickere Ruten, deren Rinde
man nicht abschälen könne. Deswegen verfahre man, da man auch
von ihr nur die Rinde will, folgendermaßen: Man schneidet die Ruten
in Stücke, welche zwei Finger lang oder etwas länger sind. Diese
näht man in eine frische, abgezogene Tierhaut; dann erzeugten sich
aus der Fäulnis der Haut und des Holzes Würmer, die das Holz
wegfräßen, die Rinde aber wegen ihres scharfen Geruches und ihrer
Bitterkeit nicht anrühren.“
 Um 50 v. Chr. berichtet uns der griechische Geschichtschreiber
Diodoros aus Sizilien in seinem Geschichtswerk: „In Arabien wachsen
Costus, Kassia, Zimt und andere Herrlichkeiten in solcher Menge,
daß man dort Dinge, die man bei uns nur sparsam auf die Altäre der
Götter legt, zum Heizen der Kochherde verwendet, und daß Dinge,
die man anderwärts nur in kleinen Proben sieht, dort als Streu für
die Leute gebraucht werden. Namentlich wächst in Arabien der
sogenannte Zimt, ein ausgezeichnet nützlicher Stoff, nebst Gummi
und wohlriechendem Terpentin in unermeßlichem Überfluß.“
Auch der 25 n. Chr. gestorbene griechische Geograph Strabon,
der weite Reisen durch das Römerreich machte, war noch im Wahn
befangen, daß das Glückliche Arabien, das doch nur den Zimt und
die anderen Gewürze von Indien her bezog, solchen selbst
hervorbringe. Er sagt in seinem Geographiebuch: „Im arabischen
Gewürzland soll Weihrauch und Myrrhe von Bäumen, Kassia aber
von Sträuchern gewonnen werden, die meiste Kassia jedoch, wie
manche behaupten, aus Indien. Es wächst in diesem Gewürzland
auch Zimt und Narde; den meisten Wein gewinnt man dort von
Palmen.“ Und an einer anderen Stelle schreibt er: „Daß der Nil zu
der Zeit schwelle, wo das oberhalb Ägyptens liegende Negerland von
Platzregen überschwemmt wird, hat man von Leuten erfahren, die
im Arabischen Meerbusen bis zum Zimtlande geschifft sind, oder von
solchen, die von den Ptolemäern auf die Elefantenjagd ausgesandt
wurden.“
Der um die Mitte des 1. Jahrhunderts n. Chr. lebende griechische
Arzt Dioskurides zählt verschiedene Sorten Zimt und deren
Eigenschaften auf und meint, die beste müsse eigentümlich
wohlriechen und scharf, fast beißend und erhitzend schmecken. Er
werde als Arznei, als Parfüm für Salben und sonst zu gar mancherlei
Zwecken gebraucht. Sein Zeitgenosse Plinius, der 79 n. Chr. beim
Vesuvausbruch umkam, war schon besser als seine griechischen
Vorgänger unterrichtet. Er schreibt in seiner Naturgeschichte: „Zimt
(cinnamomum) und Kassia (casia) trägt Arabien nicht. Übrigens
haben die alten Schriftsteller und namentlich Herodot über den Zimt
allerlei Fabeln berichtet, so z. B. daß er in der Heimat des Bacchus
von unzugänglichen Felsen und Bäumen aus dem Neste des Vogels
Phönix teils durch das Gewicht hineingetragenen Fleisches
herabgestürzt, teils mit Pfeilen herabgeschossen werde. Ferner
müsse man an den dortigen Sümpfen, um die Kassia zu gewinnen,
gegen die Krallen gräßlicher Fledermäuse und gegen geflügelte
Schlangen kämpfen. Das sind nun lauter Fabeln, durch die man den
Preis der Ware zu steigern suchte. Es schließt sich an die genannte
Sage noch eine zweite, daß nämlich durch die Hitze der südlichen
Sonne auf der ganzen Halbinsel ein unbeschreiblicher Wohlgeruch
erzeugt werde, in welchem sich die Würze und Balsamdüfte so vieler
Pflanzen vereinten, daß z. B. die Flotte Alexanders des Großen auf
hohem Meere die Nähe Arabiens zuerst durch den Geruch entdeckt
habe. Lauter Erdichtung! Denn Zimt und Kassia wachsen im Lande
derjenigen Neger, welche mit den Troglodyten verwandt sind. Die
Troglodyten kaufen den Zimt von ihren Nachbarn und verhandeln ihn
weithin übers Meer auf Flößen, welche weder durch Steuerruder
gelenkt, noch durch Ruder oder Segel in Bewegung gesetzt, ja nicht
einmal durch den Verstand der Menschen regiert werden, sondern
nur auf gut Glück drauflos fahren. Sie gehen übrigens Mitte Winters
in See, zur Zeit da vorzüglich Südostwinde wehen. Diese treiben sie
geradewegs durch die Meerbusen hin, und nach der Fahrt um das
Vorgebirge führt sie der Westsüdwest in den Hafen der Gebaniter,
welcher Ocilia heißt. So kaufen denn die Gebaniter vorzugsweise den
Zimt auf und sagen, die Zimtverkäufer kämen in fünf Jahren kaum
einmal und viele von ihnen verunglückten. Für den Zimt tauschen
die Troglodyten Glas- und Bronzewaren, Kleider, Spangen und
Geschmeide ein.
Der Zimtstrauch wird höchstens 2 Ellen, mindestens aber 1 Hand
hoch und sieht wie vertrocknet aus. So lange er grün ist, hat er
keinen Wohlgeruch; er hat Blätter wie der Dosten (origanum), steht
gerne trocken, wächst bei starkem Regen schlecht, verträgt den
Schnitt gut. Er wächst in Ebenen, aber zwischen dichtem
Dornengebüsch, so daß man ihm schwer beikommt. Die Ernte wird
nur vorgenommen, wenn ein Gott es erlaubt, welchen die
Eingeborenen Assabinus nennen, manche aber für den Jupiter
halten. Die Erlaubnis zur Ernte gibt der Gott nur gegen ein Opfer von
44 Rindern, Ziegen und Widdern. Vor Aufgang der Sonne und nach
deren Untergang darf nicht geschnitten werden. Der Priester des
Gottes teilt die Zweige mit einer Lanze, sondert den Anteil des
Gottes aus; das übrige verpackt der Kaufmann. Nach anderen
Angaben bekommt jener Gott ein Drittel, ein anderes die Sonne, ein
Drittel der Kaufmann. Über die drei Teile soll zweimal gelost werden;
der Anteil der Sonne soll von selbst in Flammen aufgehen. Am
höchsten im Preise stehen die Zweigenden, welche in Stücke von
Handlänge geschnitten sind; für geringer gelten die hinter jenen
stehenden, kürzer geschnittenen Stücke. Am wenigsten werden die
der Wurzel zunächst stehenden Teile geschätzt; denn sie haben am
wenigsten Rinde, und gerade in der Rinde liegt der Wert. Das Holz
des Zimtstrauchs wird verachtet, weil es scharf und nach Dosten
riecht. Man nennt es xylocinnamomum und bezahlt das Pfund mit 10
Denaren (6 Mark).
Manche unterscheiden eine hellere und eine dunklere Sorte von
Zimt. Früher gab man ersterer den Vorzug; jetzt gilt die dunkle und
sogar die gefleckte für besser. Am sichersten kann man den Zimt für
gut erklären, wenn er nicht rauh ist und wenn gegeneinander
geriebene Stücke nur langsam zerbröckeln. Weiche oder mit loser
Oberhaut überzogene Stücke achtet man gar nicht. Den Preis des
Zimts bestimmt einzig der König der Gebaniter. Das Pfund galt sonst
1000 Denare (600 Mark). Jetzt ist er um die Hälfte im Preise
gestiegen, weil die Barbaren, wie man erzählt, ganze Wälder
abgebrannt haben; aus welchem Grunde weiß man nicht sicher. Es
gibt auch Schriftsteller, welche behaupten, daß die Südwinde im
Zimtlande so heiß wehen, daß sie im Sommer die Wälder versengen.
Kaiser Vespasian (geb. 9 n. Chr., wurde 69 nach Othos Sturz von
seinen Legionen zum Kaiser ausgerufen, bestieg den Thron,
nachdem sein Legat Antonius Primus den Kaiser Vitellius gestürzt
hatte, schloß 71 den Janustempel, starb 79) ist der erste gewesen,
welcher in allen Tempeln des Kapitols und im Friedenstempel in Gold
gefaßte Zimtkränze aufhing. Ich habe auch eine sehr schwere
Wurzel des Zimtstrauches im Palatinischen Tempel gesehen, den
Augusta (dritte Gemahlin des Augustus, 38 v. Chr. von Tiberius
Claudius Nero geschieden, übte großen Einfluß auf Augustus aus,
sicherte ihrem Sohne Tiberius die Nachfolge durch Wegräumung
mehrerer Glieder des julischen Geschlechts, hieß eigentlich Livia
Drusilla, erhielt aber 14 n. Chr. im Todesjahre des Augustus den
Namen Julia Augusta, d. h. „die erhabene Julia“, starb 29) ihrem
Gemahl Augustus erbaut hat. Die Wurzel lag auf einer goldenen
Schale. Jahr für Jahr drangen Tropfen aus ihr hervor und
verhärteten, bis der Tempel von einer Feuersbrunst verzehrt wurde.“
Weiter berichtet Plinius:
„Auch die Kassia ist ein Strauch, der auf Ebenen neben dem
Zimte wächst, auf Bergen aber stärkere Triebe bildet. Die Schale ist
dünn, bildet keine eigentliche Rinde und wird um so höher
geschätzt, je zarter sie ist, was sich beim Zimt gerade umgekehrt
verhält. Der Strauch wird 3 Ellen hoch und hat 3 verschiedene
Farben. Schlägt er aus, so ist er einen Fuß hoch weiß, einen halben
Fuß höher rot, weiter hinauf dunkelfarbig. Dieser Teil wird am
höchsten geschätzt, der rote geringer, der weiße gar nicht. Am
wertvollsten ist die frische Kassia, welche einen sanften Geruch und
mehr einen brennenden, als allmählich erwärmenden und sanft
beißenden Geschmack hat, an Farbe purpurbraun, an Gewicht leicht
ist und kurze, nicht zerbrechliche Röhrchen bildet. Man nennt diese
Sorte mit einem ausländischen Namen lada, eine andere heißt von
ihrem balsamischen Geruch balsamodes; sie ist aber bitter, wird
mehr von Ärzten gebraucht, wie die dunkelfarbige zu Salben. Keine
andere Ware hat so verschiedene Preise. So kostet das Pfund bester
Kassia 50 Denare (30 Mark), geringere nur 5 Denare (3 Mark).“
Neben Zimt und Kassia hat übrigens schon das Altertum aus
Indien die wohlriechenden Blätter und wohl auch die Rinde einer von
uns als M u t t e r z i m t (Cassia tamala) bezeichneten Kassienart
bezogen, die als malabáthron bei den Griechen und Römern als
kostbares Parfüm sehr beliebt waren. Aus ihnen wurde auch eine viel
begehrte Salbe hergestellt, die an Beliebtheit fast die berühmte
indische Nardensalbe erreichte. Der griechische Schriftsteller
Arrianus, der im Jahre 136 unter Hadrian Präfekt von Kappadokien
war und unter Mark Aurel starb, sagt in seinem Bericht über die
Umschiffung des Roten Meeres, daß viele Schiffe nach dem am
Südwestufer Indiens gelegenen Handelsplatz Nelecynda fahren, weil
dort Pfeffer und malabáthron in Menge und besonderer Güte zu
haben seien.
Wie diese kostbaren Gewürze vom Persischen Golf nach
Babylonien gelangten, so wurden sie über das Rote Meer und
Alexandrien nach den Mittelmeerländern ausgeführt. Und als später
die Droge durch die Wirren der Völkerwanderung immer seltener
und unerschwinglicher wurde, bedienten sich besonders die Ärzte
ihrer als wertvolle Arznei. So ging durch sie das lateinische
cinnamomum ins mittelhochdeutsche cinment, weiter Zimmet und
schließlich das neuhochdeutsche Zimt über. Ein großer Teil der Ware
muß aber zu Beginn des Mittelalters aus China bezogen worden sein,
welche Tatsache allein uns den bei den Persern und Arabern
üblichen Ausdruck dar Chini (Holz von China) für Zimt und Kassia
erklärlich macht. Später nannten die Venezianer und Portugiesen
den Zimt wie jede aromatische Rinde canella, welcher Ausdruck
dann als canelle ins Französische überging.
Die Zimtwälder um Kolombo auf Ceylon werden erst im Jahre
1340 von dem 1302 in Tanger geborenen, bis China und Südasien
vorgedrungenen arabischen Reisenden Ibn Batuta erwähnt, der
1352 auch Timbuktu besuchte und 1377 in Fes starb. Im Jahre 1444
beschrieb der venezianische Kaufmann Nicolo Conto die Zimtbäume
der von ihm als Saillana bezeichneten Insel Ceylon, teilte aber nichts
über die Ausfuhr des Gewürzes mit. Erst der Portugiese Lorenzo da
Almeida, der im Hafen von Point de Galle Schiffe mit Zimt und
Elefanten verladen sah, berichtete darüber eingehend im Jahre
1505. Die Portugiesen, die sich an der Küste Ceylons niederließen,
legten zunächst auf diesen Handelsartikel keinen großen Wert,
wurden aber bald eines anderen belehrt. So unterschied bereits
1536 Garcia da Orta den Zimt von Ceylon von demjenigen der
Philippinen und Java; der erstere war damals 40mal teurer als die
letzteren, im Jahre 1644 aber nur noch 5mal teurer. Im Jahre 1546
erfahren wir aus einem Briefe des Florentiners Filippo Sassetti an
Franzesco I. di Medici, daß die Zweige regelmäßig alle drei Jahre
geschält würden. Zur Erlangung von Stockausschlägen wurden die
Bäume einfach gekappt. Dies und das Einsammeln der Rinde der
wilden Bestände, die vorzugsweise durch eine Drossel vermehrt
wurden, welche die reifen Beeren verzehrte und die unverdaulichen
Samen in noch völlig keimfähigem Zustande von sich gab, besorgten
Angehörige einer besonderen Kaste, die Chalias oder Zimtschäler.
 Tafel 75.

(Copyright by F. O. Koch.)
Zimtbaum auf Ceylon.
 (Copyright by F. O. Koch.)
Das Schälen der Zimtrinde.
 Tafel 76.

Muskatnüsse.
(Nach Photographie von H. Schenck in „Karsten u. Schenck,
Vegetationsbilder“.)
 Gewürznelkenbäume (Caryophyllus aromaticus) auf
Zanzibar.
(Nach Photographie von Busse in „Karsten u. Schenck,
Vegetationsbilder.“)

Bis zur Ansiedelung der Portugiesen, die seit 1505 einen

regelmäßigen Verkehr mit der Insel unterhielten, war der Zimthandel
ein einträgliches Monopol der einheimischen Könige, deren
Geschlecht aus Nordindien stammte und seit 543 v. Chr. die
Singalesen beherrschte. Als die Portugiesen sich der Küste Ceylons
im Jahre 1580 bemächtigten, legten sie den Herrschern im Innern
einen Tribut von 125000 kg Zimt auf und versprachen ihnen dafür
die Hilfe Portugals. Bald aber machten sie sich so verhaßt, daß der
König von Kandy die Holländer gegen sie zu Hilfe rief. Diesen hatte
schon Philipp II. den Handel mit Lissabon untersagt; so versuchten
sie, sich den Zimt auf direktem Wege zu verschaffen. Im Jahre 1596
kamen die ersten wohlbewaffneten holländischen Handelsschiffe in
den Indischen Ozean und 1632 begann die Verdrängung der
Portugiesen von Ceylon, die 1658 eine vollständige und dauernde
war. Sofort erhoben die Holländer den Zimt zu ihrem
ausschließlichen Monopol. Die arme Kaste der Chalias oder
Zimtschäler wurde schwer bedrückt. Jedes Mitglied derselben mußte
vom 12. Jahre an einen Pingo, d. h. 28 kg Zimtrinde während einer
Ernte abliefern und im Laufe der Jahre stieg die Menge sogar auf
303 kg! Die Gegenleistung bestand in Befreiung von Steuern und
kleinen Rationen an Reis. Begreiflicherweise suchten die Chalias sich
dieser unwürdigen Behandlung durch Flucht in die Berge zu
entziehen. Dafür mußten die Zurückbleibenden um so anstrengender
arbeiten. Niemand sonst durfte Zimtbäume pflanzen oder Zimt
schälen. Jeder Grundbesitzer mußte es dem holländischen Beamten
melden, wenn er auf seinem Grund und Boden eine Zimtpflanze
entdeckt hatte. Verheimlichung wurde sehr strenge, unter
Umständen mit dem Tode bestraft. Die kleinsten Veruntreuungen
beim Einsammeln der Rinde brachten Täter wie Hehler unerbittlich
den Tod.
Ein Jahrhundert lang zogen die Holländer aus dem Zimtmonopol
einen reichen Gewinn, der manchmal 7 Millionen Mark im Jahre
überstieg. Die meisten Zimtbäume befanden sich auf dem Gebiete
des Königs von Kandy. Wenn dieser aber feindselig auftrat, sank die
Einnahme bedeutend und brachte nur etwa 1 Million Mark ein. Um
sich nun von den Launen dieses Herrschers unabhängig zu machen,
schlug ein Einnehmer des Distrikts Kolombo namens de Koke dem
holländischen Gouverneur Falk im Jahre 1765 vor, den Zimtbaum auf
eigenem Gebiete zu pflanzen. Anfangs wies der Große Rat in Batavia
diesen Vorschlag zurück; doch waren die Vorteile zu verlockend, so
daß man sich endlich zu einer Einwilligung verstand. Die Ausführung
war indessen nicht leicht. Die Häuptlinge behaupteten, daß
kultivierter Zimt minderwertig sei; auf ihr Betreiben hin widersetzten
sich dieser Neuerung auch die Eingeborenen. Schließlich drang die
holländische Regierung mit ihren Forderungen doch durch, aber die
Eingeborenen suchten den Kulturen insgeheim zu schaden, indem
sie dieselben mit heißem Wasser begossen oder anderweitig die
Pflänzlinge zu ruinieren suchten. Nur drakonische Strenge sicherte
das Unternehmen. So wurde jedes Zerstören von jungen Pflanzen
mit Abhauen der rechten Hand bestraft. Bald versuchten die
Holländer mit etwa 200000 kg Zimtrinde, die sie aus den eigenen
Kulturen gewannen, den gesamten europäischen Bedarf zu decken,
ohne Bezüge der Ernte aus dem Königreich Kandy im Innern der
Insel machen zu müssen. Dabei sorgten sie durch gewaltsame Mittel
dafür, daß die hohen Preise dieser Droge nicht etwa durch
Überproduktion herabgedrückt wurden. Vor allem beschränkten sie
die Kulturbäume auf eine bestimmte Anzahl und ließen in
gesegneten Jahren stets einen Teil der zu reichlichen Ernte ins Meer
werfen oder verbrennen. Auch im Mutterlande räumte man, um eine
Preisdrückerei zu verunmöglichen, im Übermaß sich ansammelnde
Vorräte durch Verbrennen hinweg; lieber sollte die Arbeit ganz
umsonst gewesen sein, als daß man sich selbst seinen
Volksgenossen gegenüber zu einer Verbilligung der Ware herabließ.
So berichtet der Franzose Beaumaré, er sei im Juni 1760
Augenzeuge davon gewesen, wie man beim Admiralitätsgebäude in
Amsterdam zwei Tage nacheinander — abgesehen von Muskatnuß —
für zusammen etwa 16 Millionen Livres Zimt verbrannt habe, was
einen köstlichen Wohlgeruch über das ganze Land verbreitete.
Im Kriege mit den Holländern besetzten die nach den Zimtgärten
jener lüsternen Engländer 1795 Ceylon, das ihnen 1802 im Frieden
von Amiens regelrecht abgetreten wurde. Sie fanden die
Zimtkulturen im blühendsten Zustande und nutzten sie als Erben der
alten Machthaber in derselben Weise wie jene aus. Die englisch-
ostindische Handelsgesellschaft übernahm das höchst einträgliche
Monopol und führte es im Sinne der Holländer weiter. Der erste
Gouverneur, North, erließ sogar eine Verordnung, durch welche nicht
nur Neuanlagen verboten wurden, sondern auch die bereits
bestehende Anzahl der Zimtgärten eine Einschränkung erfuhr. 1815
kam nach Beseitigung des bis dahin noch regierenden
Eingeborenenfürsten die ganze Insel unter die Administration der
englischen Krone, die das Zimtmonopol bis 1833 aufrechterhielt,
dann aber aufgeben mußte, da der Zimtbaum inzwischen durch die
Holländer auf Sumatra, Java und Borneo und durch die Franzosen
auf Isle de France (dem heutigen Mauritius), Bourbon und in
Cayenne angesiedelt worden war, ohne allerdings dort das
vorzügliche Produkt wie in Ceylon zu geben, das heute mit seiner
höchst aromatischen Rinde noch immer den Weltmarkt beherrscht.
Wenn nun auch die englische Regierung das Zimtmonopol
notgedrungen aufheben mußte, so belegte sie dafür den Zimt 1833
mit einem sehr hohen Zoll von 200 Prozent; erst im Jahre 1853
wurde dieser aufgehoben und der Zimtbaum und der Handel mit
dessen Rinde freigegeben, worauf sich die Zimtgärten auf der Insel
wieder vermehrten. Doch haben neuerdings andere Kulturen den
Zimt auf Ceylon zurückgedrängt, so daß China, das schon zu Anfang
des vorigen Jahrhunderts durch Anbau von Zimt und Kassia im
großen England scharfe Konkurrenz gemacht hatte, jetzt den
meisten Zimt liefert.
Erst in der Gegenwart ist diese Droge, die früher in der
Arzneikunde und feinen Küche eine sehr viel wichtigere Rolle spielte
als heute, billig und damit jedermann zugänglich geworden. Noch im
späten Mittelalter war dies nicht der Fall. Es sei hier nur an jene
mehrfach von Malern geschilderte Begebenheit erinnert, da Kaiser
Karl V., „in dessen Reich die Sonne nicht unterging,“ im Frühling
1530, von Italien zurückkehrend, den in den Grafenstand erhobenen
reichen Kaufherrn Jakob Fugger in Augsburg besuchte. Dieser
damals reichste Mann Deutschlands hatte dem trotz seines
gewaltigen Länderbesitzes und seiner reichen Einnahmen nur zu oft
in Geldnöten steckenden Kaiser gegen Schuldschein eine sehr
bedeutende Summe geliehen. Als dieser sich bei seinem Besuche
entschuldigte, daß er dem Kaufmanne das Geld noch nicht
zurückerstattet habe, fröstelte ihn und er begann über den
Unterschied des deutschen und italienischen Klimas zu sprechen. Da
brachte der reiche Jakob Fugger einige Bündel der überaus
kostbaren indischen Zimtrinde herbei, legte sie in den Kamin, des
Kaisers Schuldschein darauf und zündete das an. Das war in den
Augen der Zeitgenossen nicht nur ein fürstliches Geschenk, sondern
die größte Ehre, die er dem Kaiser erweisen konnte; denn damals
kostete ein Lot (15 g) Zimt etwa 10 Mark.

Bild 41.
Blütenzweig und Frucht eines weiblichen
Muskatnußbaums (Myristica fragrans).

Viel mehr geschätzt als heute war im Mittelalter neben Pfeffer

und Zimt auch die M u s k a t n u ß, die von einem den Zimtbäumen
weitläufig verwandten, 10–15 m hohen, immergrünen, in allen
seinen Teilen stark aromatisch riechenden Baume (Myristica
fragrans) stammt. Er wuchs ursprünglich wild auf den Bandainseln in
den Molukken und einem Kranz darum gelegener kleiner Inseln.
Heute existiert er jedoch nur noch als Kulturform. Die sehr große
Krone sitzt auf einem bis 70 cm dicken Stamme, dessen schmutzig
olivengrüne Rinde und rötliches Mark einen Saft besitzen, der durch
Berührung mit der Luft rot wird. Es gibt von ihm männliche und
weibliche Bäume, die an den reich verästelten Zweigen bis 10 cm
lange, länglicheiförmige, dunkelgrüne, glatte, lederige, kurzgestielte
Blätter tragen und aus den Blattwinkeln die unscheinbaren Blüten
hervorbrechen lassen. Die männlichen Blüten bilden Rispchen mit
einfacher weißer Blütenhülle, während die gelblichen weiblichen
einzeln stehen und innerhalb der etwas kleineren, dreizähnigen Hülle
einen einfächerigen Fruchtknoten besitzen, der eine einzige
Samenanlage umschließt. Die äußerlich einigermaßen einem Pfirsich
ähnliche Frucht ist eine kugelige, zuerst grüne, dann leuchtend
ockergelbe, hängende Beere von 3–7,5 cm Durchmesser, deren
äußeres Fruchtfleisch sich bei der Vollreife spaltet und den
fleischigen, in längliche Lappen sich teilenden, karminroten
Samenmantel erblicken läßt, der den nußartigen Samen umschließt
und, getrocknet, wobei er allerdings seine schöne Farbe einbüßt und
goldgelb wird, als M a c i s oder M u s k a t b l ü t e in den Handel
gelangt. Der darunter liegende nußartige Samen besitzt unter einer
dünnen, harten, holzigen Schale einen Kern, der getrocknet die
bekannte Muskatnuß bildet, die außer einem ätherischen Öl, dem
Muskatnußöl, ein Fett, die Muskatnußbutter enthält, die ausgepreßt
werden kann. Die Muskatnuß zeigt auf ihrer Oberfläche die Furchen,
die von den Lappen des Samenmantels hervorgebracht werden, und
die marmorierte Zeichnung in ihrem Innern rührt davon her, daß das
Nährgewebe des Samens tief zerklüftet ist; und gerade in diesen
Klüften befindet sich in einer bräunlichen Substanz das aromatische
Muskatnußöl, nebst der Butter, die zusammen 33 Prozent ihres
Gewichtes ausmachen. Sie werden durch Pressen der erwärmten
Samen in Form einer bräunlichen, stark muskatnußartig riechenden
Masse gewonnen, die häufig in den Apotheken Verwendung findet.
Nächst einer gleichmäßigen, hohen Temperatur verlangt der
Muskatnußbaum viel Feuchtigkeit im Boden und in der Luft und eine
nährstoffreiche, lockere Erde, wie sie der durch Verwitterung von
trachytischer Lava und vulkanischem Sande entstandene
sandiglehmige, humusreiche Boden seiner Heimat aufweist. Er
verleugnet niemals seine Waldbaumnatur, indem er sein ganzes
Leben in der wasserdampfgeschwängerten Luft des Urwaldes, oder
wenigstens im Schatten von Nachbarbäumen stehen will. Auf den
Bandainseln gibt man ihm durchwegs den hohen gemeinen
Canarienbaum (Canarium commune) als schattenspendenden
Gesellschafter. Dieser ist auf den Molukken heimisch, seine
Fruchtkerne werden wie süße Mandeln gegessen und sein Harz dient
zur Herstellung von Fackeln. Der Muskatnußbaum wird in von
Bananen beschatteten Beeten, die sorgfältig von Unkraut und
Ungeziefer rein gehalten werden müssen, aus den Samen gezogen
und, wenn er 0,8–1,0 m hoch geworden ist, in Abständen von 6–8 m
an seinen bleibenden Standort versetzt, an welchem durch
vorheriges Pflanzen jener größeren Schattenbäume für die
Abhaltung allzu großen Sonnenbrandes gesorgt wurde. Dabei pflanzt
man auf 20 weibliche Bäume, die ja einzig Frucht tragen, einen
männlichen, der zu deren Befruchtung dient. Die weitere Pflege und
das Beschneiden des Baumes, das nicht allzu ausgiebig erfolgen
darf, da er sehr empfindlich gegen Verwundungen ist, geschieht
vollständig wie beim Kakaobaum. Bei guter Pflege wird der
Muskatnußbaum im achten Jahre tragbar, erreicht aber erst im 14.
bis 16. Jahre seine Vollkraft, die er ungefähr 30 Jahre lang bewahrt.
Dann geht er seiner Erschöpfung entgegen, deren rascherer oder
kürzerer Verlauf von der Behandlung abhängt. Wenn dieselbe
mustergültig ist, kann der Baum seine Tragfähigkeit auf 80 und
sogar 90 Jahre ausdehnen. Gut gehaltene Bäume liefern mit
Leichtigkeit 1500 bis 2000 Nüsse jährlich, doch rechnet man beim
Plantagenbau meist nicht mehr als 2,5 kg getrockneter Nüsse und
ein Viertel dieses Betrages für Macis.
Von der Blüte bis zur Reife der Früchte vergehen neun Monate.
Wenn nun auch das Blühen und Fruchttragen unabhängig von der
Jahreszeit beständig vor sich geht, so spricht man gleichwohl von
zwei bis drei Erntezeiten im Jahr, weil sich innerhalb derselben die
Reife am meisten häuft und man es nicht für lohnend hält,
unausgesetzt einzelne reife Früchte zu ernten. Daher läßt man,
soweit es angängig ist, die Früchte hängen, bis sie in Massen
abgenommen werden können. Dies geschieht, wenn die äußere
Schale berstet, im April (beste Qualität), Juli (größte Menge) und
November. Zur möglichsten Schonung der tragenden Zweige werden
die Früchte mittels langer Bambusstangen, an denen vorn ein
Körbchen nebst Haken befestigt ist, gepflückt und zunächst ihres
gelben Fruchtfleisches beraubt, was — weil die Hülle geborsten ist —
leicht mit den Händen ausgeführt werden kann. Dieses Fruchtfleisch
wird von den Eingeborenen gegessen und gelangt eingemacht auch
nach Europa; doch wird es in den Plantagen meist weggeworfen. Die
von der Macis umgebenen Nüsse werden in Tragkörben nach Hause
gebracht, daselbst der rote Samenmantel behutsam abgestreift, an
der Sonne getrocknet und dabei mehrfach mit den nackten Füßen
platt gestampft, bis er schließlich dünn und gelb erscheint. Die Kerne
dagegen werden ein bis zwei Monate lang in einem Trockenhaus, in
dessen Mitte ein offenes, rauchendes Feuer unterhalten wird, bei
schwacher Hitze getrocknet, indem man sie jeden zweiten oder
dritten Tag vermittelst platter Holzrechen umwendet. Wenn sie
soweit trocken sind, daß die Nuß in der Schale rasselt, wird letztere
mit einem Holzhammer aufgeschlagen und hernach die Muskatnüsse
ausgesiebt. Dann werden letztere mit den Händen sortiert, als
Schutz gegen Insektenfraß mit gepulvertem Kalk eingerieben und,
sorgfältig in Fässern verpackt, in den Handel gebracht. Früher
wurden sie von den Holländern extra eine Zeitlang in einem
Kalkwasserbad liegen gelassen, um in erster Linie ihre Keimfähigkeit
zu zerstören und dadurch eine Weiterverbreitung des Baumes zu
verhindern, was wegen des von ihnen ausgeübten Monopols sehr
wichtig war. Doch weiß man jetzt, daß diese Maßregel vollständig
überflüssig ist und das Trocknen der geschälten Nüsse allein schon
genügt, um ihre Keimkraft zu vernichten. Die kleinen und
schadhaften Muskatnüsse werden jetzt gleichfalls meist nach Europa
exportiert, um in Fabriken gemahlen und, in Säcke gefüllt und in
warmem Zustande einer kräftigen Pressung ausgesetzt, das
bräunliche, aromatisch riechende Fett abzugeben, das als
Muskatnußbutter in den Handel gelangt.
Die alten Griechen und Römer scheinen die Muskatnüsse nicht
gekannt zu haben. Eine angebliche Erwähnung durch den
griechischen, um die Mitte des 1. Jahrhunderts n. Chr. in Rom
lebenden Arzt Dioskurides ist unsicher. Die erste sichere Nachricht
von ihnen findet sich beim byzantinischen Arzte Aëtios um die Mitte
des 6. Jahrhunderts. Die Araber dagegen kannten sie im 9.
Jahrhundert sehr gut, und der gelehrte arabische Arzt Avicenna,
eigentlich Ibn Sina aus Bochara (980–1037), der Leibarzt mehrerer
Sultane, spricht von ihnen als einer gebräuchlichen indischen Droge.
Die später heilig gesprochene Äbtissin Hildegard im Kloster
Rupertsberg bei Bingen (1098–1197) berichtet, daß man zu ihrer
Zeit die Muskatnüsse als kostbares Gewürz benutzte und sogar
davon ins Bier rieb. Diese Sitte blieb das ganze Mittelalter hindurch
gebräuchlich. Der byzantinische Hofarzt Joannes Aktuarius in
Konstantinopel erwähnt die Muskatnuß zu Ende des 12.
Jahrhunderts als nux unguentaria, quam myristicam appellant, d. h.
die zur Bereitung von Salben benützte Nuß, welche man myristica
(griech. zum Salben gehörig) nennt. Das ganze Mittelalter hindurch
genoß man die Muskatnuß, den verschiedensten Speisen
beigemischt, als magenstärkendes Mittel. Vielfach diente sie auch zu
aromatischen Räucherungen, wie z. B. bei der Krönung Heinrichs VI.
im April 1191 in Rom, wo als solche Balsama neben Weihrauch und
Ambra auch die myristica genannt wird. Albertus Magnus (1193–
1280) schildert Muscata als einen sehr schönen, lorbeerblätterigen
Baum Indiens, dessen Blüte die Macis sein sollte. 1158 treffen wir
nuces muscatarum aus Alexandrien unter den Handelsartikeln der
Genuesen und 1180 befinden sich Muskatnüsse unter den in Akkon
im südlichen Syrien eingeführten indischen Spezereien. In einem
Festspiel zu Treviso 1214 warf man Muskatnüsse unter die Menge,
und 1228 wurde in Marseille auf die Einfuhr derselben und der Macis
bereits ein Zoll gelegt. Dieselbe Maßregel wurde 1380 von der Stadt
Brügge getroffen, in welcher die Einfuhr dieser Handelsware schon
ballenweise erfolgte.
 Vom 12. Jahrhundert an werden die nuces moschatae, d. h. nach
Moschus riechenden Nüsse, woraus unsere deutsche Bezeichnung
Muskatnüsse hervorging, in jeder abendländischen Aufzählung von
Heilmitteln und Gewürzen genannt; dabei findet sich vielfach die
Bemerkung, daß sie aus Indien eingeführt werden. Bald nach der
Entdeckung des Seeweges nach Ostindien um das Kap der Guten
Hoffnung durch den portugiesischen Schiffskapitän Vasco da Gama
1498 sahen auch schon die ersten Europäer, und zwar Portugiesen,
ums Jahr 1504 die ersten Muskatnußbäume auf den Bandainseln.
Dort trieben die einheimischen Fürsten einen schwunghaften Handel
mit den in den westlichen Kulturländern vielbegehrten
Muskatnüssen. Namentlich waren die Sultane von Ternate und Tidor,
zweier kleiner Inseln an der Westküste von Dschilolo in der
ostmalaiischen Inselwelt, wegen ihres durch den Handel mit jenen
Nüssen erworbenen großen Reichtums und ihrer dadurch bedingten
königlichen Prunkentfaltung berühmt. So gibt uns der englische
Seefahrer Sir Francis Drake (1540–1596), der bei einer Reise um die
Erde 1579, also bereits nach der Vertreibung der Portugiesen,
Ternate besuchte, eine eingehende Schilderung der dort entfalteten
Pracht. Er schreibt. „Über dem König wurde ein sehr kostbarer
Baldachin von getriebener Goldarbeit getragen, und zwölf
Lanzenträger waren seine Beschützer. Vom Gürtel bis auf den Boden
waren alle Kleider von Gold und prächtig verziert. In seinen Kopfputz
waren verschiedene über einen Zoll breite Ringe geflochtenen
Goldes eingewebt, was ihm ein fürstliches Aussehen gab und der
Form nach einer Krone glich. Um den Hals trug er eine Kette aus
gediegenem Gold mit sehr großen Gliedern, zweimal herumgelegt.
An seiner Linken blitzten ein Diamant, ein Smaragd, ein Rubin und
ein Türkis und an seiner Rechten in einem Ringe ein dicker
tadelloser Türkis und in einem anderen viele Diamanten von
geringerer Größe.“
Mit Waffengewalt setzten sich nun die Portugiesen zu Beginn des
16. Jahrhunderts auf den solch kostbares Gewürz hervorbringenden
Bandainseln fest und erhoben die Erzeugung und den Handel mit
dieser Droge zu ihrem Monopol. Fast ein Jahrhundert lang besaßen
sie es und übermittelten ausschließlich den Völkern des Abendlandes
die so geschätzten Muskatnüsse, Gewürznelken und den Zimt, was
ihnen reichen Gewinn brachte. Erst 1605 vertrieben sie die nach dem
blutigen Kampfe gegen die spanischen Habsburger als seefahrende
Nation erstarkten Holländer von den Gewürzinseln und erhoben den
Handel mit den obgenannten Gewürzen zu ihrem ausschließlichen
Monopol, das sie mit äußerster Strenge handhabten. Sie
beschränkten die Kultur des Muskatnußbaumes auf die Inseln Banda
und Amboina, deren Bevölkerung, soweit sie nicht geflüchtet war, zu
Sklaven gemacht und ihr Grundbesitz unter die holländischen
Ansiedler verteilt wurde. Diese mußten ihr ganzes Gelände mit
Muskatnußbäumen bepflanzen und die Ernten zu festgesetzten
Preisen an die Regierung, d. h. an die niederländisch-ostindische
Kompagnie verkaufen. Diese machte natürlich ausgezeichnete
Geschäfte und geriet erst in den 1790er Jahren, als das Monopol
durchbrochen war, in Bedrängnis, so daß der holländische Staat
selbst jene Gewürzinseln in Regie nahm.
Da nun aber die auf den Molukken zahlreich vorkommenden,
teilweise bunt gefiederten Tauben aus der Gattung Myristicivora, d.
h. Mußkatnußfresser, sich vorzugsweise von den Früchten des
Muskatnußbaums ernähren und dabei nicht selten die reife Frucht
mit dem für sie allein verdaulichen Fruchtfleisch verschlucken und
mit dem Kote die Nuß mit unverminderter Keimkraft wieder von sich
geben, so konnten sie es nicht verhindern, daß hin und wieder auf
benachbarten Inseln auf solche Weise verschleppte
Muskatnußbäume auftauchten. Wer nun von Eingeborenen das
Vorhandensein solcher Bäume auf unerlaubtem Gebiete
verheimlichte und durch den Verkauf der Nüsse das von der
holländischen Handelsgesellschaft für sich in Anspruch genommene
Gewürzmonopol zu durchbrechen versuchte, der wurde
erbarmungslos von den holländischen Beamten mit dem Tode
bestraft.
Um den Preis nicht zu drücken, sammelte man in Holland
ungeheure Vorräte der verschiedenen Gewürze in den
Vorratshäusern der holländisch-ostindischen Kompagnie an. Wurden
diese mit der Zeit zu groß, so verbrannte man lieber große Mengen
davon, als daß man sie billiger ans Volk abgab. So erzählt uns der
Holländer Valmont de Bornare, daß er Augenzeuge davon gewesen
sei, wie einmal in Amsterdam drei große Schuppen voll Muskatnüsse,
von denen jeder hingereicht hätte, mit seinem Inhalt eine Kirche zu
füllen, verbrannt wurden. Nach dem Brande habe das müßig
zuschauende Volk förmlich in der durch die große Hitze
ausgeschmolzenen Muskatnußbutter gewatet. Aber niemand durfte
bei schwerer Strafe eine Nuß oder einen Tropfen Öl nehmen. Der
Franzose Beaumaré sah noch am 10. Juni 1760 in Amsterdam in der
Nähe des Admiralitätsgebäudes für 8 Millionen Livres Muskatnüsse
verbrennen, und der Engländer Wilkocks erzählt, wie er durchgereist
sei, habe man just bei Middelburg in Zeeland solche Mengen
Gewürznelken, Zimt und Muskatnüsse verbrannt, daß die Luft viele
Meilen im Umkreise von dem aromatischen Dufte erfüllt gewesen
sei.
Von den Bandainseln brachten die Franzosen geheimerweise den
Muskatnußbaum zugleich mit dem Gewürznelkenbaum im Jahre
1770 nach Isle de France (dem heutigen Mauritius) und Bourbon
und 1773 nach Cayenne. Auf der erstgenannten Insel wurde dann
die vom französischen Statthalter Poivre eingeführte Kultur durch
den Deutschen Josef Huber bedeutend gehoben. Derselbe hatte
nämlich zuerst ermittelt, daß ein einziger männlicher
Muskatnußbaum zur Befruchtung von hundert weiblichen vollständig
ausreiche. Er ließ deshalb die überflüssigen männlichen Bäume
stutzen und Zweige von weiblichen Bäumen auf sie pfropfen, ein
Verfahren, an das die Holländer nie gedacht hatten. Im Jahre 1796
nahmen die Engländer den Holländern die für sie als praktische
Geschäftsleute so begehrenswerten Molukken ab und siedelten den
Baum auf dem damals ebenfalls von ihnen besetzten Sumatra und
1798 auch in Singapur, Penang und Bengalen an. Obschon sie jene
Inseln bald wieder ihren früheren Eigentümern zurückgeben mußten,
so war doch damit endgültig das so lange eifrig gehütete
holländische Monopol durchbrochen, so daß der Preis der
Muskatnüsse, von denen das Pfund 1790 noch 20 alte holländische
Gulden gekostet hatte, wie auch der übrigen indischen Gewürze nun
auf einen für jedermann erschwinglichen Preis sank. Infolge davon
wurde ihre bis dahin mehr auf die Apotheken beschränkte
Verwendung als Arznei eine allgemeine und fanden sie bald als
beliebtes Gewürz selbst der ärmeren Klasse Eingang. Welche große
Bedeutung noch vor kaum mehr als drei Menschenaltern wie den
übrigen indischen Gewürzen, so speziell der Muskatnuß
zugeschrieben wurde, beweist die Tatsache, daß der Arzt Paullini ein
876seitiges Buch über sie und ihre Wirkung auf den Menschen
schrieb.
Heute ist die übermäßig hohe Schätzung all dieser Gewürze auf
ein sehr bescheidenes Maß zurückgegangen. Der Muskatnuß- wie
der Gewürznelkenbaum dürfen zwar auf allen den Holländern
gehörenden Inseln angepflanzt werden, aber die Früchte dürfen nur
an die holländische Handelsgesellschaft zu einem bestimmten, sehr
niedrigen Preise verkauft werden. Dafür stellt die Regierung den
holländischen Pflanzern Sträflinge zur Verfügung, die den
Plantagenbau und die Ernte besorgen. Außer in ganz Holländisch-
Indien wird der Muskatnußbaum heute auch auf der Halbinsel von
Malakka, ebenso in beschränktem Maße in Südindien, auf Reunion,
in Brasilien, Guiana und Westindien kultiviert. Doch liefern heute
noch die Molukken die beste Sorte und bringen damit den
Holländern, die nach wie vor den Haupthandel mit diesem Gewürz in
Händen haben, viel Geld ein. Zwei Fünftel der gesamten
Weltproduktion stammen von den drei kleinen, insgesamt nur
44 qkm großen Inseln Groß-Banda, Neira und Ay, die Pflanzungen
von 3000–30000 Muskatnußbäumen aufweisen und jährlich von
etwa 400000 tragenden Bäumen durchschnittlich 600000 kg
Muskatnüsse und 150000 kg Macis nach Java bringen, von wo aus
sie mit noch weiteren 100000 kg dort erzeugter Muskatnüsse in den
Handel gelangen. England allein führt aus Malakka und Südindien
etwa 400000 kg Muskatnüsse und rund 40000 kg Macis aus. Europa
kauft vorzugsweise die Muskatnüsse, Nordamerika dagegen die
Macis, die dort höher geschätzt wird.
 In neuerer Zeit gelangen noch einige andere Arten von
Muskatnüssen als Ersatz der echten in den Handel. So wachsen in
den nördlichen Molukken, auf den Inseln Batjan, Tidor und
Halmahera, zwei der echten Muskatnuß sehr nahe verwandte Arten
(Myristica speciosa und succedanea) wild, deren Nüsse gleichfalls
gesammelt werden und billig in den Handel kommen. Diese werden
ebensowenig kultiviert als der O n i n - M u s k a t n u ß b a u m
(Myristica schefferi), der wild im westlichen, holländischen Teil von
Neu-Guinea wächst und sehr wohlriechende Früchte liefert.
Wichtiger als diese ist eine andere Muskatnußart, die in nicht
unbedeutenden Mengen mit dem Namen l a n g e oder P a p u a -
M u s k a t n u ß auf den Markt gebracht wird. Sie ist länger als die
gewöhnliche Muskatnuß und stammt vom silberblätterigen
Muskatnußbaum (Myristica argentea), einem ebenfalls im westlichen
holländischen Teil von Neu-Guinea wild wachsenden, dem gemeinen
Muskatnußbaum sehr nahe verwandten Baume. Dieser wird
ebenfalls nicht kultiviert, sondern in wildem Zustande abgeerntet,
weshalb es auch möglich ist, seine Früchte billig auf den Markt zu
bringen; doch stehen sie den echten Muskatnüssen an Qualität
durchaus nach. Leider hat man im deutschen Teile von Neu-Guinea,
wo ebenfalls mehrere wilde Muskatnußarten vorkommen, bisher
keine einzige dauernd aromatische und daher für den Handel
brauchbare Nuß gefunden.
Der Name Muskatnuß wird auch für die Früchte einiger Bäume
angewandt, die ganz anderen Pflanzengattungen angehören, so
namentlich für die K a l a b a s s e n - M u s k a t n u ß von Westafrika,
die die Frucht eines zur Familie der Anonazeen gehörenden Baumes,
Monodora myristica, eines entfernten Verwandten der echten
Muskatnußbäume, bildet und seit dem 18. Jahrhundert auch auf
Jamaika kultiviert wird, wohin sie durch westafrikanische
Negersklaven gelangte. Von Lorbeergewächsarten stammen die
b r a s i l i a n i s c h e, g u i a n i s c h e und m a d a g a s s i s c h e
M u s k a t n u ß, von Bäumen aus der Familie der Monimiazeen die
p e r u a n i s c h e und a u s t r a l i s c h e M u s k a t n u ß, von
Nadelhölzern endlich die nach Terpentin riechende
k a l i f o r n i s c h e und F l o r i d a m u s k a t n u ß. Diese teilweise in
Form und Struktur ihrer Früchte einige Ähnlichkeit mit der echten
Muskatnuß aufweisenden Früchte riechen wohl auch aromatisch,
sind aber im übrigen grundverschieden von jener, so daß sie nicht
mit ihr konkurrieren können.
 Bild 42. Blütenzweig eines Gewürznelkenbaums
(Caryophyllus aromaticus).

Als Fälschungsmittel der echten Macis gelangt von Bombay aus

der schön rote, aber durchaus nicht aromatische Samenmantel des
Malabarmuskatnußbaums (Myristica malabarica) häufig in den
Handel, während die vom silberblätterigen Muskatnußbaum Neu-
Guineas stammenden sogenannten Macisschalen zwar wohlriechend,
aber unansehnlich braun gefärbt sind und daher sehr niedrig im
Preise stehen.
Als letzte der vier von der Kulturwelt des Abendlandes während
der vergangenen Jahrhunderte übermäßig geschätzten und infolge
davon für die gesamte Handelspolitik jener Zeit höchst bedeutsamen
indischen Gewürze sind außer Pfeffer, Zimt und Muskatnüsse auch
noch die G e w ü r z n e l k e n zu nennen. Gleich dem Muskatnußbaum
ist auch der Gewürznelkenbaum (Caryophyllus aromaticus) ein 10–
12 m hoher, immergrüner Baum der Molukken aus der Familie der
Myrtengewächse. Sein 30–55 cm dicker Stamm mit glänzender,
glatter Rinde spaltet sich schon in 1,3–1,6 m Höhe in einige
gleichstarke Äste, die sich reich verzweigen und eine schöne,
kegelförmige Krone bilden. Doch läßt man den Baum in den
Pflanzungen meist nicht höher als 5 m werden, damit seine Blüten
leichter geerntet werden können. Die länglich ovalen, langgestielten
Blätter sind lederartig, mit zahlreichen kleinen Öldrüsen versehen,
und laufen spitz aus. Die in Trugdolden stehenden Blüten sind klein,
aber zahlreich, anfänglich grün, voll entwickelt jedoch karminrot.
Auch die Blütenknospen sind rot. Die Früchte sind 2 cm lange und
1 cm breite Beeren von dunkelroter bis dunkelvioletter Farbe, die
meist einen, seltener zwei länglichrundliche Samen umschließen.
Letztere kommen getrocknet unter der Bezeichnung
G e w ü r z n e l k e n m u t t e r in den Handel. Weit aromatischer als
sie sind jedoch die Blütenknospen, die, sobald sie sich hellrot zu
färben beginnen, geerntet werden und, getrocknet, die
Gewürznelken bilden. Sie bestehen aus einem etwa 1 cm langen,
zylindrischen Blütenkelch, der in vier etwas ausgebogenen Zipfeln
endet und als halbkugelige Bekrönung die an ihrer Spitze
verwachsenen, bei der Blüte als zusammenhängende Kappe
abgestoßenen vier Blumenblätter trägt. Nach ihrer nagelförmigen
Gestalt nannte man sie im Mittelalter (wie die Nelken) Nägelein,
woraus sich dann im Neuhochdeutschen die Bezeichnung Nelke
ausbildete. Sie enthalten ein als Nelkenöl bezeichnetes ätherisches
Öl, das zu allerlei pharmazeutischen Produkten und zum
Mikroskopieren gebraucht wird.
 Der Gewürznelkenbaum ist weniger wählerisch in bezug auf den
Boden und nimmt auch mit etwas weniger Luft- und
Bodenfeuchtigkeit vorlieb als der Muskatnußbaum. Auch genügt ihm
eine spärlichere Beschattung als jenem; in späterem Alter bedarf er
einer solchen überhaupt nicht mehr. Nur die jungen Pflänzchen
müssen vor zu ausgiebiger Sonnenbestrahlung geschützt werden,
wozu Bananen und Rizinusstauden dienen. Wie der Muskatnußbaum,
so verliert auch er rasch die Keimfähigkeit seines Samens. Daher
dürfen zur Aussaat nur ganz frische Samen verwendet werden. An
ihrem definitiven Standort werden die in Saatbeeten gewonnenen
jungen Bäume auf sehr fruchtbarem Boden 9, auf geringem Boden
dagegen 6 m auseinander gepflanzt. Der Boden muß namentlich
während der Erntezeit im September von Unkraut gesäubert werden.
Da die Nelkenbäume als Waldbäume nicht sehr widerstandsfähig
gegen heftige Winde sind, so pflanzt man am Rande der
Gewürznelkenplantagen und hin und wieder in Reihen quer durch
die Pflanzungen als Windbrecher Kokospalmen und Mangobäume,
die beide dieselben Ansprüche an Boden und Klima stellen wie die
Gewürznelkenbäume. Ihre erste Ernte geben die
Gewürznelkenbäume vom 5. Jahre an und tragen während 10 bis 15
Jahren, wobei man von jedem Baum einen jährlichen Ertrag von
2,5–5 kg getrockneter Nelken rechnen darf. Die Ernte beginnt,
sobald sich die Knospen voll entwickelt haben und sich hellrot zu
färben beginnen. Die auf leichten Bambusleitern vor dem
Aufbrechen mit der Hand gepflückten Blütenknospen werden, auf
Matten dünn ausgebreitet, an der Sonne, seltener auf engmaschigen
Bambushorden in einem Trockenhaus durch Einwirkung eines
schwachen, rauchenden Feuers getrocknet, wobei sie wiederholt
umgewendet werden. Dabei nehmen sie eine dunkelbraune Farbe
an. Schließlich werden sie gesiebt und gelangen, in Säcke oder
Kisten verpackt, in den Handel.
Dem alten Kulturvolke der Chinesen waren die Gewürznelken
schon im 3. Jahrhundert v. Chr. bekannt und dienten ihnen teilweise
als Kaumittel. In die Mittelmeerländer gelangten sie erst in der
römischen Kaiserzeit, und zwar ist Plinius der erste römische Autor,
der sie erwähnt. In einem Zolltarif Alexandriens im 2. Jahrhundert
n. Chr. werden sie angeführt und von Aëtios, Alexander Trallianus
und Paulus Aegineta, griechischen Ärzten des 6. und 7.
Jahrhunderts, erwähnt. Sie wurden damals durch malaiische Schiffer
nach der von den Griechen und Römern Taprobane genannten Insel
Ceylon gebracht und von dort durch indische Kauffahrteifahrer in die
Häfen des Roten Meeres verfrachtet, um dann von Alexandrien aus
als äußerst kostbare Arznei in den abendländischen Handel zu
gelangen.
Von Ceylon und dem Gewürznelkenhandel berichtet als erster
Abendländer, der uns einen Bericht über seine Reise dorthin
hinterließ, der griechisch-ägyptische Großkaufmann Kosmas
Indikopleustes (d. h. der Indienfahrer) aus Alexandrien — ein
Zeitgenosse des oströmischen Kaisers Justinianus I. (483–565) —,
der mit einem ebenfalls später Mönch gewordenen Genossen die
weite Reise machte. Er schreibt darüber: „Taprobane ist eine große
Insel im Ozean jenseits des Pfefferlandes (Malabarküste Indiens),
welche die Indier Sielediva (richtig Sihaladipa, d. h. Löweninsel,
später von den Persern und Arabern in Serendib verdorben), die
Hellenen (älteren Griechen) Taprobane nennen. Dort findet man den
Edelstein Hyakinthos (d. h. Saphir und Rubin). Diese große Insel,
sagen ihre Bewohner, habe 300 Gaudia (= 900 römische Meilen)
Länge und ebensoviel Breite. Zwei Könige beherrschen sie, welche
sich aber gegenseitig befehden. Einer hat das Land der Hyazinthen
(das zentrale Bergland) inne, der andere besitzt den übrigen Teil der
Insel, in welchem das emporion (der Handelsplatz) und der Hafen
liegen. Dort an dieser Insel sammeln sich viele Schiffe aus ganz
Indien und Äthiopien, weil sie in die Mitte der Länder gestellt ist und
gleichfalls viele Schiffe nach allen Weltrichtungen entsendet;
namentlich aus den dahinterliegenden Gewässern, so von Tzinitza
(China) und anderen Stapelplätzen bringen sie Metaxin (Seide), Aloë
(Aloëholz zum Räuchern), G e w ü r z n e l k e n und Tzandana
(Sandelholz) zum Austausch; auch noch andere Waren jener
Gegenden, die sie zu den Völkern des vorderen Meeres bringen,
nämlich nach Male (Mahe in Malabar), wo der Pfeffer wächst, und
nach Kalliana (bei Bombay), wo Erz gewonnen wird und Sesamholz
(?) und was Gewebe zur Kleidung gibt; denn auch diese Stadt ist ein
großer Handelsplatz. Auch mit Sind, wo es Moschus, Bibergeil und
Narden gibt, verkehrt diese Insel, ebenso mit Persien, dem
Glücklichen Arabien und Adule (Zeila in Massaua in der italienischen
Kolonie Erythräa am Roten Meer). Von diesen Handelsplätzen
tauscht sie wiederum Waren ein, welche sie nach dem hinteren
Indien führt, zugleich die Ausfuhr der eigenen Produkte besorgend.“
In Deutschland erwähnt die Gewürznelken zuerst die heilige
Hildegard, Äbtissin von Rupertsberg (1098–1179) als nelchin. Der
erste Europäer, der die Stammpflanze sah, war der venezianische
Reisende Marco Polo, der sie 1272 auf den Sundainseln wachsen
sah. Im Mittelalter besorgten die Araber den Zwischenhandel mit
den Indern und lieferten die Gewürznelken mit Zimt und Pfeffer den
Venezianern, die diese Gewürze ihrerseits wieder den Völkern
Europas vermittelten und reichen Gewinn aus diesem Handel zogen.
Erst als der Weg nach den Gewürzländern um Afrika herum von den
Portugiesen erschlossen war, rissen sie das höchst einträgliche
Gewürzmonopol an sich. Wie Spanien etwa 300 Jahre lang, bis zum
Beginn des vorigen Jahrhunderts, den Handel mit ihren reich mit
Pflanzenschätzen und teilweise auch Gold ausgestatteten
amerikanischen Kolonien für sich beanspruchte, taten es
gleicherweise ihre Konkurrenten, die Portugiesen, in Ostindien und
der malaiischen Inselwelt, die sie 1524 in Beschlag nahmen. Von
1529 an mußten alle aus Ostindien zurückkehrenden Schiffe ihre
Rückfracht ausschließlich in der Casa da India in Lissabon löschen
und mehr wie einmal ordnete der König, der sich den stolzen Titel
„Herr des indischen Handels“ beilegte — wie später sein Nachfolger,
die holländisch-ostindische Handelskompagnie — die Vernichtung
der kostbaren indischen Gewürze an, wenn deren Vorräte zu sehr
anschwollen und die Preise zu drücken drohten. Erst im Jahre 1599
sprengten die inzwischen in der Seefahrt erstarkten Holländer diese
von den Portugiesen ausgeübte Ozeansperre. Nach der Eroberung
der von den Portugiesen nicht mehr zu haltenden Molukken im Jahre
1621 übernahm die holländisch-ostindische Kompagnie das
Gewürzmonopol, das sie bis zum Jahre 1796 zu behaupten
vermochte. Während dieser ganzen Zeit bestimmte sie den Preis der
vielbegehrten Gewürze. Das äußerst gewinnbringende Monopol
wurde, so gut es ging, auch von den Engländern während deren
Okkupation von Holländisch-Indien in den Jahren 1796–1802 und
1810–1816 aufrechterhalten. Als dann die Gewürzinseln im
letztgenannten Jahre definitiv an Holland zurückfielen, nützte diesen
das, wie auch die Zwangskultur, bis 1873 theoretisch festgehaltene
Monopol für Gewürznelken und Muskatnuß nur noch wenig. Wie in
der Sage der Lindwurm seinen Schatz in der Höhle, so hüteten die
Holländer ihre von den zu Sklaven gemachten Eingeborenen
kultivierten Gewürznelkenbäume auf den Inseln Amboina und
Saparna, nachdem sie alle anderen als die von ihnen dort
beaufsichtigten Gewürznelkenbäume auf sämtlichen Inseln der
Molukken zerstört hatten. Auf ihren Streifzügen durch die
Nachbarinseln, die zu dem Zwecke unternommen wurden, um alle
aus durch Vögel oder Menschen verschleppten Samen
hervorgegangenen Gewürznelkenbäume zu vernichten, vollführten
die rohen von der holländisch-ostindischen Kompagnie dazu
angestellten Soldaten die unerhörtesten Grausamkeiten gegen die
armen Eingeborenen, die dem Baume fast abgöttische Verehrung
erwiesen. Sie nannten ihn einen König unter den Gewürzpflanzen
und führten Gewürznelken als wirksames Mittel gegen Zauberei bei
sich, was bis auf den heutigen Tag der Fall ist. Ja, Vornehme tragen
sie als auszeichnenden Schmuck in Unterlippe, Nase und Ohren.
Das so eifrig von den Holländern gehütete Gewürzmonopol erlitt
den ersten Stoß als es 1770 dem französischen Statthalter von Isle
de France (dem heutigen Mauritius) Poivre gelang, ungeachtet der
auf die Ausführung der Bäume gesetzten Todesstrafe durch eine auf
zwei kleinen Schiffen nach deren Erlangung ausgesandte Expedition
sich aus Samen kleine Pflänzchen des Gewürznelken- und
Muskatnußbaumes zu verschaffen. Die schlauen Franzosen
überlisteten die Holländer und vermochten auch mit ihren beiden
Schiffen der Verfolgung des ihnen nachgesandten Geschwaders zu
entgehen. Sie brachten den Gewürznelkenbaum zuerst nach Isle de
France, dann auf die Seychellen, Réunion und Bourbon, von wo er
1773 nach Cayenne und den übrigen westindischen Besitzungen
Frankreichs gelangte, wo er gleichfalls gut gedieh. Von der Insel Isle
de France, die die Engländer 1810 von den Franzosen eroberten, um
sie nach der Bezeichnung der vorher die Insel innehabenden
Holländer, die sie nach dem Statthalter der Niederlande Prinz Moritz
von Oranien (1567–1625) benannt hatten, wiederum Mauritius zu
heißen, verbrachten ihn die Engländer nach der Halbinsel Malakka
und den von ihnen vorübergehend besetzten Inseln Java und
Sumatra. Auch wurde er auf Sansibar und Pemba, wo die Kultur
1793 durch den Araber Harameh ben Saleh von Mauritius aus
eingeführt wurde, und an anderen Orten mit solch gutem Erfolge
verpflanzt, daß mit der Zeit die Gewürznelkenproduktion der
Molukken ganz in den Hintergrund gedrängt zu werden vermochte.
Gegenwärtig ist die wichtigste Bezugsquelle der Gewürznelken
Sansibar mit der Nachbarinsel Pemba, obgleich in den 1860er Jahren
ein gewaltiger Sturm — eine sonst dort verhältnismäßig selten zu
beobachtende Naturerscheinung — fast alle Gewürznelkenbäume
zerstörte und auch die Qualität der hier gewonnenen Gewürznelken
keineswegs als die beste gilt. Die feinste Sorte liefert immer noch
Amboina, deren Menge aber zu gering ist, als daß sie auf dem
Weltmarkte eine große Rolle zu spielen vermöchte.
Als N e l k e n z i m t (Cassia caryophyllata) werden nelkenartig
riechende Rinden verschiedener Bäume bezeichnet, so z. B. der
indischen Sizygium caryophyllatum, der westindischen Pimenta acris,
beides Myrtengewächsen, sowie des brasilianischen Dicypellium
caryophyllatum, eines dem Zimt näher verwandten Baumes aus der
Familie der Lorbeergewächse. Doch haben diese Rinden nur eine
lokale Bedeutung und gelangen kaum in den Welthandel. Dafür aber
liefert ein naher Verwandter des Gewürznelkenbaums das P i m e n t
(vom mittellateinischen pigmentum Farbstoff) oder den
N e l k e n p f e f f e r, dessen Geschmack und Geruch allerdings
weniger an Pfeffer als an Gewürznelken erinnert. Feinschmecker
wollen erkennen, daß das Piment den Geruch und Geschmack von
Gewürznelken, Pfeffer, Zimt, kurz von allen Gewürzen in sich
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