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Vito Mennella Digital Instant Download
Author(s): Vito Mennella
ISBN(s): 9781071635063, 1071635077
Edition: 1st ed. 2024 Edition
File Details: PDF, 11.92 MB
Year: 2023
Language: english
Methods in
Molecular Biology 2725

Vito Mennella Editor

Cilia
Methods and Protocols
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was
the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.
 Cilia

Methods and Protocols

Edited by

Vito Mennella
Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences, University of Cambridge,
Cambridge, UK
Editor
Vito Mennella
Medical Research Council Toxicology
Unit, School of Biological Sciences
University of Cambridge
Cambridge, UK

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3506-3 ISBN 978-1-0716-3507-0 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3507-0
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Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.

Paper in this product is recyclable.

Preface

In this new volume of the Methods in Molecular Biology book series, we present step-by-
step protocols applied to cilia biology. Since the first cilia-focused Gordon Research Confer-
ence was held 20 years ago, the research area of cilia biology has witnessed an exponential
increase in activity. Cilia are organelles displayed on most human cells playing fundamental
roles in cellular function, tissue homeostasis, and development. As primary immotile cilia,
they sense and communicate with the environment through ciliary-localized membrane
receptors, and as motile cilia, they generate flow in specialized tissues – in the airways, for
example, where they drive mucociliary clearance and in the brain ventricles where they drive
cerebral spinal fluid movement. Recent studies suggest that this dichotomic distinction is
rather simplistic, with a variety of cilia types and functions identified in different tissues. This
book features several protocols for genomic, proteomics, imaging, and functional analysis
valuable for their wide applicability in different ciliated tissues to untangle this ciliary
complexity. This book focuses in particular on methods to study multiciliated cells, key
players in immune defense against pathogens, and in viral entry as evidenced by many recent
studies of SARS-CoV-2 infection in the airways. Altogether, we hope our book will provide
the reader with a valuable reference resource for both established and cutting-edge methods
to study cilia biology.

Cambridge, UK Vito Mennella

v
Contents

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

1 Combination of CRISPR-Cas9-RNP and Single-Cell RNAseq to Identify

Cell State-Specific FOXJ1 Functions in the Human Airway Epithelium . . . . . . . . 1
Laure-Emmanuelle Zaragosi, Alizé Gouleau, Margot Delin,
Kevin Lebrigand, Marie-Jeanne Arguel, Cedric Girard-Riboulleau,
Geraldine Rios, Elisa Redman, Magali Plaisant, Rainer Waldmann,
Virginie Magnone, Brice Marcet, Pascal Barbry, and Gilles Ponzio
2 SARS-CoV-2 Infection of Human Primary Nasal Multiciliated Epithelial
Cells Grown on Air-Liquid Interface Cultures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Maria Victoria Humbert, Christopher J. McCormick,
and Cosma Mirella Spalluto
3 A Chemically Inducible Organelle Rerouting Assay to Probe Primary Cilium
Assembly, Maintenance, and Disassembly in Cultured Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
F. Basak Turan, M. Erdem Ercan, and Elif Nur Firat-Karalar
4 Expansion Microscopy of Ciliary Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
Sohyeon Park and Xiaoyu Shi
5 Immunolabel-First-Expand-Later Expansion Microscopy Approach
Using Stable STED Dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
Dong Kong, Delgermaa Luvsanjav, and Jadranka Loncarek
6 Structural Analysis of Sperm Centrioles Using N-STORM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Abigail Royfman, Sushil Khanal, and Tomer Avidor-Reiss
7 A Novel Sandwich Method for Serial Block Face SEM Imaging of Airway
Multiciliated Epithelium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Nobuhiro Morone, Maria Guerra Martin, Patricia Goggin,
Kirk J. Czymmek, Vito Mennella, and Jaime Llodra Gonzalez
8 Airway Cells 3D Reconstruction via Manual and Machine-Learning
Aided Segmentation of Volume EM Datasets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Aaran Vijayakumaran, Analle Abuammar, Odara Medagedara,
Kedar Narayan, and Vito Mennella
9 Endogenous Tagging of Ciliary Genes in Human RPE1 Cells
for Live-Cell Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Stefanie Kuhns, Alice Dupont Juhl, Zeinab Anvarian,
Daniel Wüstner, Lotte B. Pedersen, and Jens S. Andersen
10 Live-Imaging Centriole Amplification in Mouse Brain Multiciliated Cells . . . . . . 167
Amélie-Rose Boudjema, Adel Al Jord, Anne-Iris Lemaı̂tre,
Marion Faucourt, Nathalie Delgehyr, Nathalie Spassky,
and Alice Meunier
11 Proximity Mapping of Ciliary Proteins by BioID. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Melissa Iazzi, Jonathan St-Germain, Saujanya Acharya,
Brian Raught, and Gagan D. Gupta
vii
viii Contents

12 Affinity Purification of Intraflagellar Transport (IFT) Proteins in Mice

Using Endogenous Streptavidin/FLAG Tags . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
Tina Beyer, Tiago Martins, Jeshmi Jeyabalan Srikaran,
Marian Seda, Emma Peskett, Franziska Klose, Katrin Junger,
Philip L. Beales, Marius Ueffing, Karsten Boldt,
and Dagan Jenkins
13 Primary Human Nasal Epithelial Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
Mystica Terrance, Tarini Gunawardena, Hong Ouyang,
Julie Avolio, Wenming Duan, Sowmya Thanikachalam,
and Theo J. Moraes
14 BMI1 Transduction of Human Airway Epithelial Cells for Expansion
of Proliferation and Differentiation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Ruhina Maeshima, Amy I. Jacobs, Melis T. Dalbay,
and Stephen L. Hart
15 High-Speed Video Microscopy of Ependymal Cilia in Brain
Organotypic and Cell Culture Models . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
William J. Dawes, Oriane Grant, Sam C. Reitemeier,
Sarah Tetlow, Dani Lee, Robert A. Hirst,
and Christopher O’Callaghan
16 Measuring Biophysical Properties of Cilia Motility from Mammalian
Tissues via Quantitative Video Analysis Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
Erika Causa, Ricardo Fradique, and Pietro Cicuta
17 Mucociliary Transport Device Construction and Application
to Study Mucociliary Clearance. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Patrick R. Sears and Lawrence E. Ostrowski

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
Contributors

ANALLE ABUAMMAR • Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences,
University of Cambridge, Cambridge, UK
SAUJANYA ACHARYA • Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan
University, Toronto, ON, Canada
ADEL AL JORD • Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France,
CNRS 7241 INSERM U1050, PSL Research University, Paris, France
JENS S. ANDERSEN • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of
Southern Denmark, Odense M, Denmark
ZEINAB ANVARIAN • Department of Biology, University of Copenhagen, Copenhagen Ø,
Denmark
MARIE-JEANNE ARGUEL • Université Côte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
TOMER AVIDOR-REISS • Department of Biological Sciences, University of Toledo, Toledo, OH,
USA; Department of Urology, College of Medicine and Life Sciences, University of Toledo,
Toledo, OH, USA
JULIE AVOLIO • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick Children, Peter
Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
PASCAL BARBRY • Université Côte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
PHILIP L. BEALES • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College
London, London, UK
TINA BEYER • Institute for Ophthalmic Research, Center for Ophthalmology, University of
Tübingen, Tübingen, Germany
KARSTEN BOLDT • Institute for Ophthalmic Research, Center for Ophthalmology, University
of Tübingen, Tübingen, Germany
AMÉLIE-ROSE BOUDJEMA • Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure (IBENS),
CNRS, UMR 8197, INSERM, U1024, Paris Sciences et Lettres (PSL), Research
University, Paris, France
ERIKA CAUSA • Cavendish Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK
PIETRO CICUTA • Cavendish Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK
KIRK J. CZYMMEK • Donald Danforth Plant Science Center, Department of Biology, Saint
Louis University, Saint Louis, MO, USA
MELIS T. DALBAY • Cilia Disorder Section, Genetic and Genomic Medicine Department,
UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, London, UK
WILLIAM J. DAWES • Alder Hey Children’s Hospital, University of Liverpool and UCL Great
Ormond Street Hospital, London, UK
NATHALIE DELGEHYR • Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure (IBENS), CNRS,
UMR 8197, INSERM, U1024, Paris Sciences et Lettres (PSL), Research University, Paris,
France
MARGOT DELIN • Université Côte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
WENMING DUAN • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick Children, Peter
Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
M. ERDEM ERCAN • Department of Molecular Biology and Genetics, Koç University,
Istanbul, Turkey

ix
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parecía muy natural y lógico lo que hacía.
 IX

LA CRUELDAD UNIVERSAL

Tenía Andrés un gran deseo de comentar filosóficamente las vidas de

los vecinos de la casa de Lulú. A sus amigos no le interesaban estos
comentarios y filosofías, y decidió, una mañana de un día de fiesta,
ir a ver a su tío Iturrioz.
Al principio de conocerle, Andrés no le trató a su tío hasta los
catorce o quince años. Iturrioz le pareció un hombre seco y egoísta,
que lo tomaba todo con indiferencia; luego, sin saber a punto fijo
hasta dónde llegaba su egoísmo y su sequedad, encontró que era
una de las pocas personas con quien se podía conversar acerca de
puntos transcendentales.
Iturrioz vivía en un quinto piso del barrio de Argüelles, en una casa
con una hermosa azotea.
Le asistía un criado, antiguo soldado de la época en que Iturrioz fué
médico militar.
Entre amo y criado habían arreglado la azotea, pintado las tejas con
alquitrán, sin duda para hacerlas impermeables y puesto unas
graderías donde estaban escalonados las cajas de madera y los
cubos llenos de tierra donde tenían sus plantas.
Aquella mañana en que se presentó Andrés en casa de Iturrioz, su
tío se estaba bañando y el criado le llevó a la azotea.
Se veía desde allí el Guadarrama entre dos casas altas; hacia el
Oeste, el tejado del cuartel de la Montaña ocultaba los cerros de la
Casa de Campo, y a un lado del cuartel se destacaba la torre de
Móstoles y la carretera de Extremadura, con unos molinos de viento
en sus inmediaciones. Más al Sur brillaban, al sol de una mañana de
abril, las manchas verdes de los cementerios de San Isidro y San
Justo, las dos torres de Getafe y la ermita del Cerrillo de los Ángeles.
Poco después salía Iturrioz a la azotea.
—¿Qué, te pasa algo?—le dijo a su sobrino al verle.
—Nada; venía a charlar un rato con usted.
—Muy bien, siéntate; yo voy a regar mis tiestos.
Iturrioz abrió la fuente que tenía en un ángulo de la terraza, llenó
una cuba y comenzó con un cacharro a echar agua en las plantas.
Andrés habló de la gente de la vecindad de Lulú, de las escenas del
hospital, como casos extraños, dignos de un comentario; de Manolo
el Chafandín, del tío Miserias, de don Cleto, de doña Virginia...
—¿Qué consecuencias puede sacarse de todas estas vidas?—
preguntó Andrés al final.
—Para mí la consecuencia es fácil—contestó Iturrioz con el bote de
agua en la mano—. Que la vida es una lucha constante, una cacería
cruel en que nos vamos devorando los unos a los otros. Plantas,
microbios, animales.
—Si yo también he pensado en eso—repuso Andrés—; pero voy
abandonando la idea. Primeramente el concepto de la lucha por la
vida llevada así a los animales, a las plantas y hasta los minerales,
como se hace muchas veces, no es más que un concepto
antropomórfico, después, ¿qué lucha por la vida es la de ese hombre
don Cleto, que se abstiene de combatir, o la de ese hermano Juan,
que da su dinero a los enfermos?
—Te contestaré por partes—repuso Iturrioz dejando el bote para
regar, porque estas discusiones le apasionaban—. Tú me dices, este
concepto de lucha es un concepto antropomórfico. Claro, llamamos a
todos los conflictos lucha, porque es la idea humana que más se
aproxima a esa relación que para nosotros produce un vencedor y
un vencido. Si no tuviéramos este concepto en el fondo, no
hablaríamos de lucha. La hiena que monda los huesos de un
cadáver, la araña que sorbe una mosca, no hace más ni menos que
el árbol bondadoso llevándose de la tierra el agua y las sales
necesarias para su vida. El espectador indiferente, como yo, ve a la
hiena, a la araña y al árbol, y se los explica. El hombre justiciero le
pega un tiro a la hiena, aplasta con la bota a la araña y se sienta a
la sombra del árbol, y cree que hace bien.
—Entonces ¿para usted no hay lucha, ni hay justicia?
—En un sentido absoluto, no; en un sentido relativo, sí. Todo lo que
vive tiene un proceso para apoderarse primero del espacio, ocupar
un lugar, luego para crecer y multiplicarse; este proceso de la
energía de un vivo contra los obstáculos del medio, es lo que
llamamos lucha. Respecto de la justicia, yo creo que lo justo en el
fondo es lo que nos conviene. Supón, en el ejemplo de antes, que la
hiena, en vez de ser muerta por el hombre, mata al hombre, que el
árbol cae sobre él y le aplasta, que la araña le hace una picadura
venenosa; pues nada de eso nos parece justo, porque no nos
conviene. A pesar de que en el fondo no haya más que esto, un
interés utilitario ¿quién duda que la idea de justicia y de equidad es
una tendencia que existe en nosotros? ¿Pero cómo la vamos a
realizar?
—Eso es lo que yo me pregunto ¿cómo realizarla?
—¿Hay que indignarse porque una araña mate a una mosca?—siguió
diciendo Iturrioz—. Bueno. Indignémonos. ¿Qué vamos a hacer?
¿Matarla? Matémosla. Eso no impedirá que sigan las arañas
comiéndose a las moscas. ¿Vamos a quitarle al hombre esos
instintos fieros que te repugnan? ¿Vamos a borrar esa sentencia del
poeta latino: Homo hominis lupus, el hombre es un lobo para el
hombre? Está bien. En cuatro o cinco mil años lo podremos
conseguir. El hombre ha hecho de un carnívoro como el chacal, un
omnívoro como el perro; pero se necesitan muchos siglos para eso.
No sé si habrás leído que Spallanzani había acostumbrado a una
paloma a comer carne y a un águila a comer y digerir el pan. Ahí
tienes el caso de esos grandes apóstoles religiosos y laicos; son
águilas que se alimentan de pan en vez de alimentarse de carnes
palpitantes, son lobos vegetarianos. Ahí tienes el caso del hermano
Juan...
—Ese no creo que sea un águila, ni un lobo.
—Será un mochuelo o una garduña; pero de instintos perturbados.
—Sí, es muy posible—repuso Andrés—; pero creo que nos hemos
desviado de la cuestión; no veo la consecuencia.
—La consecuencia, a la que yo iba era ésta, que ante la vida no hay
más que dos soluciones prácticas para el hombre sereno, o la
abstención y la contemplación indiferente de todo, o la acción
limitándose a un círculo pequeño. Es decir, que se puede tener el
quijotismo contra una anomalía; pero tenerlo contra una regla
general, es absurdo.
—De manera que, según usted, el que quiera hacer algo tiene que
restringir su acción justiciera a un medio pequeño.
—Claro, a un medio pequeño; tú puedes abarcar en tu
contemplación la casa, el pueblo, el país, la sociedad, el mundo,
todo lo vivo y todo lo muerto; pero si intentas realizar una acción, y
una acción justiciera, tendrás que restringirte hasta el punto de que
todo te vendrá ancho, quizá hasta la misma conciencia.
—Es lo que tiene de bueno la filosofía—dijo Andrés con amargura; le
convence a uno de que lo mejor es no hacer nada.
Iturrioz dió unas cuantas vueltas por la azotea y luego dijo:
—Es la única objeción que me puedes hacer; pero no es mía la
culpa.
—Ya lo sé.
—Ir a un sentido de justicia universal—prosiguió Iturrioz—es
perderse; adaptando el principio de Fritz Müller de que la
embriología de un animal reproduce su genealogía, o como dice
Haeckel, que la ontogenia es una recapitulación de la filogenia, se
puede decir que la psicología humana no es más que una síntesis de
la psicología animal. Así se encuentran en el hombre todas las
formas de la explotación y de la lucha: la del microbio, la del insecto,
la de la fiera... Ese usurero que tú me has descrito, el tío Miserias,
¡qué de avatares no tiene en la zoología! Ahí están los acinétidos
chupadores que absorben la substancia protoplasmática de otros
infusorios; ahí están todas las especies de aspergilos que viven
sobre las substancias en descomposición. Estas antipatías de gente
maleante ¿no están admirablemente representadas en ese
antagonismo irreductible del bacilo de pus azul con la bacteridia
carbuncosa?
—Sí es posible—murmuró Andrés.
—Y entre los insectos ¡qué de tíos Miserias!, ¡qué de Victorios!, ¡qué
de Manolos los Chafandines, no hay! Ahí tienes el ichneumon, que
mete sus huevos en una lombriz y la inyecta una substancia que
obra como el cloroformo; el sphex, que coge las arañas pequeñas,
las agarrota, las sujeta y envuelve en la tela y las echa vivas en las
celdas de sus larvas para que las vayan devorando; ahí están las
avispas, que hacen lo mismo, arrojando al spoliarium que sirve de
despensa para sus crías, los pequeños insectos, paralizados por un
lancetazo que les dan con el aguijón en los anglios motores; ahí está
el estafilino que se lanza a traición sobre otro individuo de su
especie, le sujeta, le hiere y le absorbe los jugos; ahí está el meloe,
que penetra subrepticiamente en los panales de las abejas, se
introduce en el alvéolo en donde la reina pone su larva, se atraca de
miel y luego se come a la larva; ahí está...
—Sí, sí, no siga usted más; la vida es una cacería horrible.
—La Naturaleza es lo que tiene; cuando trata de reventar a uno, lo
revienta a conciencia. La justicia es una ilusión humana; en el fondo
todo es destruir, todo es crear. Cazar, guerrear, digerir, respirar, son
formas de creación y de destrucción al mismo tiempo.
—Y entonces, ¿qué hacer?—murmuró Andrés—. ¿Ir a la
inconsciencia? ¿Digerir, guerrear, cazar, con la serenidad de un
salvaje?
—¿Crees tú en la serenidad del salvaje?—preguntó Iturrioz—. ¡Qué
ilusión! Eso también es una invención nuestra. El salvaje nunca ha
ido sereno.
—¿Es que no habrá plan ninguno para vivir con cierto decoro?—
preguntó Andrés.
—El que lo tiene es porque ha inventado uno para su uso. Yo hoy
creo que todo lo natural, que todo lo espontáneo es malo; que sólo
lo artificial, lo creado por el hombre, es bueno. Si pudiera viviría en
un club de Londres, no iría nunca al campo, sino a un parque;
bebería agua filtrada y respiraría aire esterilizado...
Andrés ya no quiso atender a Iturrioz, que comenzaba a fantasear
por entretenimiento. Se levantó y se apoyó en el barandado de la
azotea.
Sobre los tejados de la vecindad revoloteaban unas palomas; en un
canalón grande corrían y jugueteaban unos gatos.
Separados por una tapia alta había enfrente dos jardines: uno era de
un colegio de niñas, el otro de un convento de frailes.
El jardín del convento se hallaba rodeado por árboles frondosos; el
del colegio no tenía más que algunos macizos con hierbas y flores, y
era una cosa extraña que daba cierta impresión de algo alegórico,
ver al mismo tiempo jugar a las niñas corriendo y gritando, y a los
frailes que pasaban silenciosos en filas de cinco o seis dando la
vuelta al patio.
—Vida es lo uno y vida es lo otro—dijo Iturrioz filosóficamente
comenzando a regar sus plantas.
Andrés se fué a la calle.
—¿Qué hacer? ¿Qué dirección dar a la vida?—se preguntaba con
angustia. Y, la gente, las cosas, el sol, le parecían sin realidad ante el
problema planteado en su cerebro.
 TERCERA PARTE
Tristezas y dolores.

DÍA DE NAVIDAD
Un día, ya en el último año de la carrera, antes de las Navidades, al
volver Andrés del hospital, le dijo Margarita que Luisito escupía
sangre. Al oirlo Andrés quedó frío como muerto. Fué a ver al niño,
apenas tenía fiebre, no le dolía el costado, respiraba con facilidad;
sólo un ligero tinte de rosa coloreaba una mejilla, mientras la otra
estaba pálida.
No se trataba de una enfermedad aguda. La idea de que el niño
estuviera tuberculoso le hizo temblar a Andrés. Luisito, con la
inconsciencia de la infancia, se dejaba reconocer y sonreía.
Andrés recogió un pañuelo manchado con sangre y lo llevó a que lo
analizasen al laboratorio. Pidió al médico de su sala que
recomendara el análisis.
Durante aquellos días vivió en una zozobra constante; el dictamen
del laboratorio fué tranquilizador: no se había podido encontrar el
bacilo de Koch en la sangre del pañuelo; sin embargo, esto no le
dejó a Hurtado completamente satisfecho.
El médico de la sala, a instancias de Andrés, fué a casa a reconocer
al enfermito. Encontró a la percusión cierta opacidad en el vértice
del pulmón derecho. Aquello podía no ser nada; pero unido a la
ligera hemoptisis, indicaba con muchas probabilidades una
tuberculosis incipiente.
El profesor y Andrés discutieron el tratamiento. Como el niño era
linfático, algo propenso a catarros, consideraron conveniente llevarlo
a un país templado, a orillas del Mediterráneo a ser posible; allí le
podrían someter a una alimentación intensa, darle baños de sol,
hacerle vivir al aire libre y dentro de la casa en una atmósfera
creosotada, rodearle de toda clase de condiciones para que pudiera
fortificarse y salir de la infancia.
La familia no comprendía la gravedad, y Andrés tuvo que insistir
para convencerles de que el estado del niño era peligroso.
El padre, don Pedro, tenía unos primos en Valencia, y estos primos,
solterones, poseían varias casas en pueblos próximos a la capital.
Se les escribió y contestaron rápidamente; todas las casas suyas
estaban alquiladas menos una de un pueblecito inmediato a
Valencia.
Andrés decidió ir a verla.
Margarita le advirtió que no había dinero en casa; no se había
cobrado aún la paga de Navidad.
—Pediré dinero en el hospital e iré en tercera—dijo Andrés.
—¡Con este frío! ¡Y el día de Nochebuena!
—No importa.
—Bueno, vete a casa de los tíos—le advirtió Margarita.
—No, ¿para qué?—contestó él—. Yo veo la casa del pueblo, y, si me
parece bien, os mando un telegrama diciendo: Contestadles que sí.
—Pero eso es una grosería. Si se enteran...
—¡Qué se van a enterar! Además, yo no quiero andar con
ceremonias y con tonterías; bajo en Valencia, voy al pueblo, os
mando el telegrama y me vuelvo en seguida.
No hubo manera de convencerle. Después de cenar tomó un coche y
se fué a la estación. Entró en un vagón de tercera.
La noche de diciembre estaba fría, cruel. El vaho se congelaba en los
cristales de las ventanillas y el viento helado se metía por entre las
rendijas de la portezuela.
Andrés se embozó en la capa hasta los ojos, se subió el cuello y se
metió las manos en los bolsillos del pantalón. Aquella idea de la
enfermedad de Luisito le turbaba.
La tuberculosis era una de esas enfermedades que le producía un
terror espantoso; constituía una obsesión para él. Meses antes se
había dicho que Roberto Koch había inventado un remedio eficaz
para la tuberculosis: la tuberculina.
Un profesor de San Carlos fué a Alemania y trajo la tuberculina.
Se hizo el ensayo con dos enfermos a quienes se les inyectó el
nuevo remedio. La reacción febril que les produjo hizo concebir al
principio algunas esperanzas; pero luego se vió que no sólo no
mejoraban, sino que su muerte se aceleraba.
Si el chico estaba realmente tuberculoso, no había salvación.
Con aquellos pensamientos desagradables, marchaba Andrés en el
vagón de tercera, medio adormecido.
Al amanecer se despertó, con las manos y los pies helados.
El tren marchaba por la llanura castellana y el alba apuntaba en el
horizonte.
En el vagón no iba más que un aldeano fuerte, de aspecto enérgico
y duro de manchego.
Este aldeano le dijo:
—Qué, ¿tiene usted frío, buen amigo?
—Sí, un poco.
—Tome usted mi manta.
—¿Y usted?
—Yo no la necesito. Ustedes, los señoritos, son muy delicados.
A pesar de las palabras rudas, Andrés le agradeció el obsequio en el
fondo del corazón.
Aclaraba el cielo, una franja roja bordeaba el campo.
Empezaba a cambiar el paísaje, y el suelo, antes llano, mostraba
colinas y árboles que iban pasando por delante de la ventanilla del
tren.
Pasada la Mancha, fría y yerma, comenzó a templar el aire. Cerca de
Játiba salió el sol, un sol amarillo, que se derramaba por el campo
entibiando el ambiente.
La tierra presentaba ya un aspecto distinto.
Apareció Alcira con los naranjos llenos de fruta, con el río Júcar
profundo, de lenta corriente. El sol iba elevándose en el cielo;
comenzaba a hacer calor; al pasar de la meseta castellana a la zona
mediterránea la naturaleza y la gente eran otras.
En las estaciones los hombres y las mujeres, vestidos con trajes
claros, hablaban a gritos, gesticulaban, corrían.
—Eh, tú, ché—se oía decir.
Ya se veían llanuras con arrozales y naranjos, barracas blancas con
el techado negro, alguna palmera que pasaba en la rapidez de la
marcha como tocando el cielo. Se vió espejear la Albufera, unas
estaciones antes de llegar a Valencia, y poco después Andrés
apareció en el raso de la plaza de San Francisco, delante de un solar
grande.
Andrés se acercó a un tartanero, le preguntó cuánto le cobraría por
llevarle al pueblecito, y, después de discusiones y de regateos,
quedaron de acuerdo en un duro por ir, esperar media hora y volver
a la estación.
Subió Andrés y la tartana cruzó varias calles de Valencia y tomó por
una carretera.
El carrito tenía por detrás una lona blanca y, al agitarse ésta por el
viento, se veía el camino lleno de claridad y de polvo; la luz cegaba.
En una media hora la tartana embocaba la primera calle del pueblo,
que aparecía con su torre y su cúpula brillante. A Andrés le pareció
la disposición de la aldea buena para lo que él deseaba; el campo de
los alrededores, no era de huerta, sino de tierras de secano medio
montañosas.
A la entrada del pueblo, a mano izquierda, se veía un castillejo y
varios grupos de enormes girasoles.
Tomó la tartana por la calle larga y ancha, continuación de la
carretera, hasta detenerse cerca de una explanada levantada sobre
el nivel de la calle.
El carrito se detuvo frente a una casa baja encalada, con su puerta
azul muy grande y tres ventanas muy chicas. Bajó Andrés; un cartel
pegado en la puerta indicaba que la llave la tenían en la casa de al
lado.
Se asomó al portal próximo y una vieja, con la tez curtida y negra
por el sol, le dió la llave, un pedazo de hierro que parecía un arma
de combate prehistórica.
Abrió Andrés el postigo, que chirrió agriamente sobre sus goznes, y
entró en un espacioso vestíbulo con una puerta en arco que daba
hacia el jardín.
La casa apenas tenía fondo; por el arco del vestíbulo se salía a una
galería ancha y hermosa con un emparrado y una verja de madera
pintada de verde. De la galería, extendida paralelamente a la
carretera, se bajaba por cuatro escalones al huerto, rodeado por un
camino que bordeaba sus tapias.
Este huerto, con varios árboles frutales desnudos de hojas, se
hallaba cruzado por dos avenidas que formaban una plazoleta
central y lo dividían en cuatro parcelas iguales. Los hierbajos y
jaramagos espesos cubrían la tierra y borraban los caminos.
Enfrente del arco del vestíbulo había un cenador formado por palos,
sobre el cual se sostenían las ramas de un rosal silvestre, cuyo
follaje, adornado por florecitas blancas, era tan tupido que no
dejaba pasar la luz del sol.
A la entrada de aquella pequeña glorieta, sobre pedestales de
ladrillo, había dos estatuas de yeso, Flora y Pomona. Andrés penetró
en el cenador. En la pared del fondo se veía un cuadro de azulejos
blancos y azules con figuras que representaban a Santo Tomás de
Villanueva vestido de obispo, con su báculo en la mano y un negro y
una negra arrodillados junto a él.
Luego Hurtado recorrió la casa; era lo que él deseaba; hizo un plano
de las habitaciones y del jardín y estuvo un momento descansando,
sentado en la escalera. Hacía tanto tiempo que no había visto
árboles, vegetación, que aquel huertecito abandonado, lleno de
hierbajos, le pareció un paraíso. Este día de Navidad tan espléndido,
tan luminoso, le llenó de paz y de melancolía.
Del pueblo, del campo, de la atmósfera transparente llegaba el
silencio, sólo interrumpido por el cacareo lejano de los gallos; los
moscones y las avispas brillaban al sol.
¡Con qué gusto se hubiera tendido en la tierra a mirar horas y horas
aquel cielo tan azul, tan puro!
Unos momentos después, una campana de son agudo comenzó a
tocar. Andrés entregó la llave en la casa próxima, despertó al
tartanero medio dormido en su tartana, y emprendió la vuelta.
En la estación de Valencia mandó un telegrama a su familia, compró
algo de comer y unas horas más tarde volvía para Madrid, embozado
en su capa, rendido, en otro coche de tercera.
 II

VIDA INFANTIL

Al llegar a Madrid, Andrés le dió a su hermana Margarita

instrucciones de cómo debían instalarse en la casa. Unas semanas
después tomaron el tren, don Pedro, Margarita y Luisito.
Andrés y sus otros dos hermanos se quedaron en Madrid.
Andrés tenía que repasar las asignaturas de la licenciatura.
Para librarse de la obsesión de la enfermedad del niño, se puso a
estudiar como nunca lo había hecho.
Algunas veces iba a visitar a Lulú y le comunicaba sus temores.
—Si ese chico se pusiera bien—murmuraba.
—¿Le quiere usted mucho?—preguntaba Lulú.
—Sí, como si fuera mi hijo. Era yo ya grande cuando nació él,
figúrese usted.
Por Junio, Andrés se examinó del curso y de la licenciatura y salió
bien.
—¿Qué va usted a hacer?—le dijo Lulú.
—No sé; por ahora veré si se pone bien esa criatura; después ya
pensaré.
El viaje fué para Andrés distinto, y más agradable que en diciembre;
tenía dinero, y tomó un billete de primera. En la estación de Valencia
le esperaba el padre.
—¿Qué tal el chico?—le preguntó Andrés.
—Está mejor.
Dieron al mozo el talón del equipaje, y tomaron una tartana, que les
llevó rápidamente al pueblo.
Al ruido de la tartana salieron a la puerta Margarita, Luisito y una
criada vieja. El chico estaba bien; alguna que otra vez tenía una
ligera fiebre, pero se veía que mejoraba. La que había cambiado casi
por completo era Margarita; el aire y el sol le habían dado un
aspecto de salud que la embellecía.
Andrés vió el huerto, los perales, los albaricoqueros y los granados
llenos de hojas y de flores.
La primera noche Andrés no pudo dormir bien en la casa por el olor
a raíz desprendido de la tierra.
Al día siguiente Andrés, ayudado por Luisito, comenzó a arrancar y a
quemar todos los hierbajos del patio. Luego plantaron entre los dos
melones, calabazas, ajos, fuera o no fuera tiempo. De todas sus
plantaciones lo único que nació fueron los ajos. Estos, unidos a los
geranios y a los dompedros, daban un poco de verdura; lo demás
moría por el calor del sol y la falta de agua.
Andrés se pasaba horas y horas sacando cubos del pozo. Era
imposible tener un trozo de jardín verde. En seguida de regar, la
tierra se secaba, y las plantas se doblaban tristemente sobre su
tallo.
En cambio todo lo que estaba plantado anteriormente, las
pasionarias, las hiedras y las enredaderas, a pesar de la sequedad
del suelo, se extendían y daban hermosas flores; los racimos de la
parra se coloreaban, los granados se llenaban de flor roja y las
naranjas iban engordando en el arbusto.
Luisito llevaba una vida higiénica, dormía con la ventana abierta, en
un cuarto que Andrés, por las noches, regaba con creosota. Por la
mañana, al levantarse de la cama, tomaba una ducha fría en el
cenador de Flora y Pomona.
Al principio no le gustaba, pero luego se acostumbró.
Andrés había colgado del techo del cenador una regadera enorme, y
en el asa ató una cuerda que pasaba por una polea y terminaba en
una piedra sostenida en un banco. Dejando caer la piedra, la
regadera se inclinaba y echaba una lluvia de agua fría.
Por la mañana, Andrés y Luis iban a un pinar próximo al pueblo, y
estaban allí muchas veces hasta el mediodía; después del paseo
comían y se echaban a dormir.
Por la tarde tenían también sus entretenimientos: perseguir a las
lagartijas y salamandras, subir al peral, regar las plantas. El tejado
estaba casi levantado por los panales de las avispas; decidieron
declarar la guerra a estos temibles enemigos y quitarles los panales.
Fué una serie de escaramuzas que emocionaron a Luisito y le dieron
motivo para muchas charlas y comparaciones.
Por la tarde, cuando ya se ponía el sol, Andrés proseguía su lucha
contra la sequedad, sacando agua del pozo, que era muy profundo.
En medio de este calor sofocante, las abejas rezongaban, las avispas
iban a beber el agua del riego y las mariposas revoloteaban de flor
en flor. A veces aparecían manchas de hormigas con alas en la tierra
o costras de pulgones en las plantas.
Luisito tenía más tendencia a leer y a hablar que a jugar
violentamente. Esta inteligencia precoz le daba que pensar a Andrés.
No le dejaba que hojeara ningún libro, y le enviaba a que se
reuniera con los chicos de la calle.
Andrés, mientras tanto, sentado en el umbral de la puerta, con un
libro en la mano, veía pasar los carros por la calle cubierta de una
espesa capa de polvo. Los carreteros, tostados por el sol, con las
caras brillantes por el sudor, cantaban tendidos sobre pellejos de
aceite o de vino, y las mulas marchaban en fila medio dormidas.
Al anochecer pasaban unas muchachas, que trabajaban en una
fábrica, y saludaban a Andrés con un adiós un poco seco, sin mirarle
a la cara. Entre estas chicas había una que llamaban la Clavariesa,
muy guapa, muy perfilada; solía ir con un pañuelo de seda en la
mano agitándolo en el aire, y vestía con colores un poco chillones,
pero que hacían muy bien en aquel ambiente claro y luminoso.
Luisito, negro por el sol, hablando ya con el mismo acento
valenciano que los demás chicos, jugaba en la carretera.
No se hacía completamente montaraz y salvaje como hubiera
deseado Andrés, pero estaba sano y fuerte. Hablaba mucho.
Siempre andaba contando cuentos, que demostraban su imaginación
excitada.
—¿De dónde saca este chico esas cosas que cuenta?—preguntaba
Andrés a Margarita.
—No sé; las inventa él.
Luisito tenía un gato viejo que le seguía, y que decía que era un
brujo.
El chico caricaturizaba a la gente que iba a la casa.
Una vieja de Borbotó, un pueblo de al lado, era de las que mejor
imitaba. Esta vieja vendía huevos y verduras, y decía: ¡Ous, figues!
Otro hombre reluciente y gordo, con un pañuelo en la cabeza, que a
cada momento decía: ¿Sap?, era también de los modelos de Luisito.
Entre los chicos de la calle había algunos que le preocupaban
mucho. Uno de ellos era el Roch, el hijo del saludador, que vivía en
un barrio de cuevas próximo.
El Roch era un chiquillo audaz, pequeño, rubio, desmedrado, sin
dientes, con los ojos legañosos. Contaba cómo su padre hacía sus
misteriosas curas, lo mismo en las personas que en los caballos, y
hablaba de cómo había averiguado su poder curativo.
El Roch sabía muchos procedimientos y brujerías para curar las
insolaciones y conjurar los males de ojo que había oído en su casa.
El Roch ayudaba a vivir a la familia, andaba siempre correteando con
una cesta al brazo.
—Ves estos caracoles—le decía a Luisito—, pues con estos caracoles
y un poco de arroz comeremos todos en casa.
—¿Dónde los has cogido?—le preguntaba Luisito.
—En un sitio que yo sé—contestaba el Roch, que no quería
comunicar sus secretos.
También en las cuevas vivían otros dos merodeadores, de unos
catorce a quince años, amigos de Luisito: el Choriset y el Chitano.
El Choriset era un troglodita, con el espíritu de un hombre primitivo.
Su cabeza, su tipo, su expresión eran de un bereber.
Andrés solía hacerle preguntas acerca de su vida y de sus ideas.
—Yo, por un real, mataría a un hombre—solía decir el Choriset,
mostrando sus dientes blancos y brillantes.
—Pero te cogerían y te llevarían a presidio.
—¡Ca! Me metería en una cueva que hay cerca de la mía, y me
estaría allá.
—¿Y comer? ¿Cómo ibas a comer?
—Saldría de noche a comprar pan.
—Pero con un real, no te bastaría para muchos días.
—Mataría a otro hombre—replicaba el Choriset, riendo.
El Chitano no tenía más tendencia que el robo; siempre andaba
merodeando por ver si podía llevarse algo.
Andrés, por más que no tenía interés en hacer allí amistades, iba
conociendo a la gente.
La vida del pueblo era en muchas cosas absurda; las mujeres
paseaban separadas de los hombres, y esta separación de sexos
existía en casi todo.
A Margarita le molestaba que su hermano estuviese constantemente
en casa, y le incitaba a que saliera. Algunas tardes, Andrés solía ir al
café de la plaza, se enteraba de los conflictos que había en el pueblo
entre la música del Casino republicano y la del Casino carlista, y el
Mercaer, un obrero republicano, le explicaba de una manera
pintoresca lo que había sido la Revolución francesa y los tormentos
de la Inquisición.
 III

LA CASA ANTIGUA

Varias veces don Pedro fué y volvió de Madrid al pueblo. Luisito

parecía que estaba bien, no tenía tos ni fiebre; pero conservaba
aquella tendencia fantaseadora que le hacía divagar y discurrir de
una manera impropia de su edad.
—Yo creo que no es cosa de que sigáis aquí—dijo el padre.
—¿Por qué no?—preguntó Andrés.
—Margarita no puede vivir siempre metida en un rincón. A ti no te
importará; pero a ella sí.
—Que se vaya a Madrid por una temporada.
—¿Pero tú crees que Luis no está curado todavía?
—No sé; pero me parece mejor que siga aquí.
—Bueno; veremos a ver qué se hace.
Margarita explicó a su hermano que su padre decía que no tenían
medios para sostener así dos casas.
—No tiene medios para esto; pero sí para gastar en el Casino—
contestó Andrés.
—Eso a ti no te importa—contestó Margarita enfadada.
—Bueno; lo que voy a hacer yo es ver si me dan una plaza de
médico de pueblo y llevar al chico. Lo tendré unos años en el campo,
y luego que haga lo que quiera.
En esta incertidumbre, y sin saber si iban a quedarse o marcharse,
se presentó en la casa una señora de Valencia, prima también de
don Pedro. Esta señora era una de esas mujeres decididas y
mandonas que les gusta disponerlo todo. Doña Julia decidió que
Margarita, Andrés y Luisito fueran a pasar una temporada a casa de
los tíos. Ellos los recibirían muy a gusto. Don Pedro encontró la
solución muy práctica.
—¿Qué os parece?—preguntó a Margarita y a Andrés.
—A mí, lo que decidáis—contestó Margarita.
—A mí no me parece una buena solución—dijo Andrés.
—¿Por qué?
—Porque el chico no estará bien.
—Hombre, el clima es igual—repuso el padre.
—Sí; pero no es lo mismo vivir en el interior de una ciudad, entre
calles estrechas, a estar en el campo. Además, que esos señores
parientes nuestros, como solterones, tendrán una porción de
chinchorrerías y no les gustarán los chicos.
—No; eso no. Es gente amable, y tienen una casa bastante grande
para que haya libertad.
—Bueno. Entonces probaremos.
Un día fueron todos a ver a los parientes. A Andrés, sólo tener que
ponerse la camisa planchada, le dejó de un humor endiablado.
Los parientes vivían en un caserón viejo de la parte antigua de la
ciudad. Era una casa grande, pintada de azul, con cuatro balcones,
muy separados unos de otros, y ventanas cuadradas encima.
El portal era espacioso y comunicaba con un patio enlosado como
una plazoleta que tenía en medio un farol.
De este patio partía la escalera exterior, ancha, de piedra blanca,
que entraba en el edificio al llegar al primer piso, pasando por un
arco rebajado.
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