SPEKTROFOTOMETRI
Spektrofotometri UV/Vis
Spektrofotometri UV/Vis
adalah teknik analisis
spektroskopi yang memakai
sumber radiasi
elektromagnetik ultra violet
dekat (190 nm – 380 nm)
dan sinar tampak (380 nm –
780 nm) dengan
menggunakan instrumen
spetrofotometer.
Prinsip Spektrofotometri
Penentuan/pengukuran konsentrasi suatu
sampel berdasarkan interaksi sinar
monokromatis dan sampel. Banyaknya sinar yg
terabsorbsi berbanding lurus dg konsentrasi
sampel.
Klasifikasi metode analisis (Skoog, 1-2)
Table I. Physical Properties Employed for Analysis
Physical property Analytical methods based
measured on measurement of property
Mass Gravimetric
Volume Volumetric
Absorption of radiation Spectrophotometry (x-ray, UV, Vis,
IR); colorimetry; atomic abs, NMR
Emission of radiation Emission spectroscopy (x-ray, UV, Vis);
flame photometry, fluorescence (x-ray,
UV, Vis)
Scattering of radiationTurbidimetry, Raman spectroscopy
Electrical potential Potentiometry
Mass-to-charge ratio Mass spectrometry
Gravimetric dan volumetric procedures classical methodes of
analysis
The remainder of the list instrumental methods
5
Sifat spektra, aplikasi dan interaksi radiasi elektromagnetik
Wave Wavelength Frequenc
Energy Number V λ y
υ Type Type Type
Radiation spectroscopy Quantum Transition
Kcal/mol eV cm-1 cm Hz
9.4 x 107 4.9 x 106 3.3 x 1010 3 x 10-11 1021 Gamma
Gamma ray
ray Nuclear
emission
X-ray Electronic
9.4 x 103 4.9 x 102 3.3 x 106 3 x 10-7 1017 X-ray
absorption, (inner shell)
emission
Ultra
9.4 x 10 1
4.9 x 10 0
3.3 x 10 4
3 x 10 -5
10 15 violet UV absorption Electronic
Visible (outer shell)
9.4 x 10-1 4.9 x 10-2 3.3 x 102 3 x 10-3 1013 Infrared IR absorption Molecular
vibration Molecular
rotation
9.4 x 10-3 4.9 x 10-4 3.3 x 100 3 x 10-1 1011 Micro- Microwave
wave absorption
Magnetically
Nuclear induced spin
9.4 x 10-7 4.9 x 10-8 3.3 x 10-4 3 x 103 107 Radio magnetic states
resonance
Spektrum Elektromagnetik
Tipe Radiasi Frekuensi (Hz) Panjang
Gelombang
gamma-rays 1020-1024 <1 pm
X-rays 1017-1020 1 nm-1 pm
ultraviolet 1015-1017 400 nm-1 nm
visible 4-7.5x1014 750 nm-400 nm
near-infrared 1x1014-4x1014 2.5 µm-750 nm
infrared 1013-1014 25 µm-2.5 µm
microwaves 3x1011-1013 1 mm-25 µm
radio waves <3x1011 >1 mm
Dasar pengukuran Spektrofotometer
Hukum Lambert Beer – hubungan linear antara absorbansi
dengan konsentrasi zat yang diserap
A = abc
A : absorbance
“a” is molar absorptivity dalam L/[(mole)
(cm)]
“b” : panjang kuvet dalam cm
Diameter kuvet atau tempat sampel = jarak cahaya
yang melalui sampel yang diserap
“c” konsentrasi sampel dalam (mol/L)
Hubungan Transmitansi dan Absorbansi
Transmitansi :
T = I/Io
I : intensitas cahaya setelah melewati sampel
Io : intensitas cahaya awal
Hubungan Absorbansi dengan %T :
A = -logT = -log(I/ Io)
T= (I/Io) = 10-A
%T = (I/Io) x 100
A = -logT = log(1/T)
Contoh :
If %T = 95%, then A = log(100/95) = log(1/.95) = -log(.95)
A = 0.02227
UJI KUANTITATIF KAFEIN METODE
SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
Kafein yang telah
diencerkan kemudian
diukur absorbansinya
menggunakan
spektrofotometri UV-Vis.
Absorbansi dari tiap-tiap
sampel dibuat kurva
sehingga dapat ditentukan
persamaan (Y=mx+C)
untuk mencari
konsentrasi dari masing-
masing sampel.
Prosedur Pengukuran Sampel
1. Pembuatan Larutan Baku
Dibuat konsentrasi larutan KMnO4 1x10-5 M, 0.5x10-5 M,
0.25x10-5 M,
0.1x10-5 M, 0.05x10-5 M
2. Pembuatan Kurva Baku
a. Mengeset spektro pada mode quantity dan tetapkan panjang
gelombang
sesuai hasil sebelumnya
b. Melakukan pengukuran serapan (absorbansi) untuk masing-
masing larutan
baku, mencatat setiap harga serapan untuk tiap larutan
c. Membuat kurva standar antar konsentrasi (M) vs absorbansi (A),
menentukan persamaan garis dengan metode regresi linear
3. Penetapan Kadar Sampel
a. Memasukan larutan yang berupa larutan KMnO4 ke dalam kuvet
(bila sampel padatan, larutkan dahulu dengan aquades)
b. Mengukur serapan pada panjang gelombang maksimal, kisaran
absorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaklah antara 0.2
- 0.8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Bila
hasil di luar rentang tersebut, lakukan pengenceran (bila terlalu
besar harga serapan) atau pekatkan sampel (bila harga serapan
terlal kecil). Mencatat hasil yang diperoleh
c. Menghitung kadar sampel dengan memasukkan harga serapan
pada persamaan garis kurva standar baku
Prosedur Spektrofotometri
1.Pemilihan λ maks lurutan blnko.
2. Pembuatan larutan standar
3. Pembuatan grafik kalibrasi larutan standar
4. Penentuan konsentrasi sampel
A VS C DAN A VS C
Contoh soal:
Sebotol sikloheksana tercemar oleh benzena. Pada
260 nm, benzena mempunyai absorbtivitas molar
230, dan absorbtivitas molar sikloheksana adalah
nol. Spektrum sikloheksana ini menunjukkan suatu
absorbans sebesar 0,030 (b = 1,0 cm).
Berapakah konsentrasi benzena ?
Jawab: c = A/ε . b = 0,030/ 230 x 1,0 = 0,00013 M
SPEKTROFOTOMETER
Spektrofotometer
Sumber cahaya (Lampu) : memancarkan semua warna
cahaya (yaitu, cahaya putih).
Monokromator : memilih satu panjang gelombang dan
panjang gelombang yang dikirimkan melalui sampel.
Detektor : mendeteksi panjang gelombang cahaya
yang telah melewati sampel.
Amplifier : meningkatkan sinyal sehingga lebih mudah
untuk baca terhadap kebisingan latar belakang.
Aplikasi spektrofotometer UV
Protein
Amino Acids (aromatic)
Glucose Determination
Enzyme Activity (Hexokinase)
Aplikasi spektrofotometer visible
Niacin
Pyridoxine
Vitamin B12
Metal Determination (Fe)
Fat-quality Determination (TBA)
Enzyme Activity (glucose oxidase)
Struktur kimia dan absorpsi Visible
Larutan yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometer visible senyawa yang berwarna
Contoh : KMnO4
Apabila senyawa tersebut tidak berwarna, maka perlu
ditambahkan pengompleks yang dapat membentuk
warna
Contoh : analisis logam Pb
