CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ORIGEN
DESCUBIERTA EN RUSIA EN EL
AO DE 1903 POR EL BOTNICO
MICHAEL TSWETT QUIEN SEPAR
PIGMENTOS DE PLANTAS EN
COLUMNAS DE XIDO DE CALCIO
UTILIZ EL TRMINO
CROMATOGRAFA (color-grfico)
DERIVADO DEL GRIEGO COLORCROMO Y ESCRITO-GRFICO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INTRODUCCION
LA HPLC O CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE HA TENIDO UNA
CRECIENTE DIFUSIN DESDE
COMIENZOS DE LA DCADA DEL
70.
LA CROMATOGRAFA REPRESENTA HOY UNA DE
LAS HERRAMIENTAS MAS EMPLEADAS EN EL
LABORATORIO ANALTICO MODERNO, YA SEA
ESTE DEDICADO A LA INVESTIGACIN BSICA O
APLICADA, LABORATORIOS DE INVESTIGACIONES
FARMACUTICAS, DE SNTESIS ORGNICAS.
CROMATOGRAFIA
DEFINICIN
SEGN IUPAC
LA CROMATOGRAFA ES UN
MTODO FSICO DE SEPARACIN
EN EL CUAL LOS COMPONENTES A
SER
SEPARADOS
SON
DISTRUIBUIDOS ENTRE DOS FASES
UNA DE ELLAS ES ESTACIONARIA,
MIENTRAS LA OTRA SE MUEVE EN
UNA DIRECCIN DEFINIDA.
LA FASE ESTACIONARIA PUEDE SER UN SLIDO,
UN LQUIDO RETENIDO SOBRE UN SLIDO Y
PUEDE ESTAR EXTENDIDA COMO UNA CAPA O
DISTRIBUIDA COMO UNA PELCULA, ETC. LA FASE
MVIL PUEDE SER LQUIDA O GASEOSA.
CROMATOGRAFIA
FASE MOVIL
MUESTRA
SEPARACIN
A+B+C
CROMATOGRFICA
FASE
ESTACIONARIA
SEPARACION
DE
COMPONENTES
MOVIMIENTO
DE LA FASE MOVIL
CROMATOGRAMA,
CONCENTRACION,
PERFIL DE BANDA
C
B
A
COMPONENTES
ELUIDOS
DETECTOR
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INSTRUMENTACION
BOMBA
AUTOMUESTREADOR/
INYECTOR
COLUMNA
RESERVORIOS
DETECTOR
GUARDA
COMPUTADORA
LA CROMATOGRAFA LQUIDA HA EXPERIMENTADO
EN LOS LTIMOS AOS UN NOTORIO AVANCE EN EL
DESARROLLO DE NUEVAS FASES ESTACIONARIAS, LO
QUE HA PERMITIDO AL ANALISTA ACCEDER A UN
NIVEL INSTRUMENTAL DE ALTA PRECISIN .
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
RESERVORIO DE LA FASE MOVIL
El RESERVORIO ES EL RECIPIENTE
QUE CONTIENE LA FASE MVIL.
RESERVORIOS DE
VIDRIO CERRADO
DE 1, 2 5 L.
PRESURIZADO CON
HELIO COMO
DEGASIFICADOR
PUEDE EMPLEARSE COMO
RESERVORIO DE FASE MVIL,
CUALQUIER FRASCO DE
LABORATORIO DE BUENA CALIDAD
(DE VIDRIO, O POLMERO
RESISTENTE), CON UNA TAPA
ADECUADA PARA PREVENIR EL
INGRESO DE PARTCULAS
AMBIENTALES AL SISTEMA.
LA CAPACIDAD DEL FRASCO DEPENDE,
LGICAMENTE, DEL CONSUMO ESPERADO: POCOS
MILMETROS EN EL MODO MICROBORE, 0.5 A 1
LITRO O MAS EN LOS MTODOS CONVENCIONALES
Y HASTA VARIOS LITROS EN CROMATOGRAFA
PREPARATIVA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FILTRADO DE FASE MOVIL
FILTRADO
SE PUEDE CONSIDERAR COMO PARTE DE
UN TRATAMIENTO PREVENTIVO PARA CUIDAR
EL ADECUADO FUNCIONAMIENTO DEL
EQUIPO DE HPLC
LAS PARTCULAS PRESENTES PUEDEN :
1.- BLOQUEAR LOS FILTROS Y TUBERAS
2.- ACELERAR EL DESGASTE DE SELLOS Y
ROTORES DEL INYECTOR
3.- AFECTAR EL NORMAL MOVIMIENTO DE
LAS VLVULAS DE ENTRADA Y DE SALIDA DE
LAS BOMBAS
TODAS LAS BOMBAS PARA HPLC DEBEN TENER
UN FILTRO EN LNEA DE 0.5-MM
Fase Mvil
Las fases mviles HPLC son usualmente una mezcla de uno o ms
solventes con las siguientes caractersticas:
Propiedades Fsicas Deseables
Alta pureza, bajo costo, transparencia UV, no corrosivo, baja
viscosidad, baja toxicidad, no inflamable, solubilidad de la
muestra
Resistencia
La resistencia est relacionada con la polaridad del solvente; agua
es un solvente fuerte en una fase normal pero dbil en una fase
reversa
La resistencia de solventes en una fase normal est caracterizada
por la escala de Hildebrand (Eo)
Selectividad
Depende del momento dipolar, dipolo inducido enlaces de
hidrgeno y caractersticas dispersivas de los solventes
Los solventes sern filtrados y desgasificarse antes de ser utilizados
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
COMPATIBILIDAD DE LA MEMBRANA CON LOS SOLVENTES
TIPO DE SOLVENTE
MEMBRANA
ACUOSO
ACUOSO/ORGANICO
ORGANICO
CELULOSA REGENERADA
ESTER DE CELULOSA
NR
NR
NITRATO DE CELULOSA
NR
CLORURO DE POLIVILIDENO
NYLON
POLITETRAFLUORETILENO
(PTFE)
NR
NR
TEFLON
NR
NR
R = RECOMENDABLE
NR = NO RECOMENDABLE
* = USAR COMO MAXIMO CON 30% DEL SOLVENTE ORGANICO
Solventes comunes para la Fase
Mvil HPLC
Solvente
n-Hexano
Fuerza del
Solvente (o)
0.01
bp
(oC)
69
Viscocidad
(cP)
0.31
UV cut off
(nm)
190
Indice de
Refraccin
1.37
Tolueno
0.29
78
0.59
285
1.49
Diclorometano
0.42
40
0.44
233
1.42
Tetrahidrofura
no
Acetonitrilo
0.57
66
0.55
212
1.41
0.65
82
0.30
190
1.34
2-Propanol
0.82
82
2.30
205
1.38
Metanol
0.95
65
0.54
205
1.33
Agua
Large
100
1.00
<190
1.33
Eo (la resistencia del solvente es definida por Hildebrand)
Modificadores Comunes de la Fase
Mvil
Buffers
Estabiliza el pH de la Fase Mvil en RPC o IEC
(Fosfato, acetato, citrato)
Acidificadores
Para suprimir la ionizacin de analitos acidificados en RPC
(cido fosfrico, cido actico)
Resistencia Inica
Para controlar la elusin de analitos inicos en IEC (i.e., NaCl)
Reactivos de par inico
Para la separacin de compuestos inicos en RPC (sulfonato de
hexano)
Modificadores Amino
Para reducir
la asimetra de analitos bsicos en RPC
(triethylamine)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DESGASIFICADO DE FASE MOVIL
DESGASIFICADO
DESGASIFICAR LA FASE MVIL ES
IMPORTANTE PARA LA EXACTITUD DEL
MEZCLADO DE SOLVENTES DE LA BOMBA
LOS GASES DISUELTOS EN LA FASE MVIL
PUEDEN PRODUCIR :
1.- LIBERACIN DE BURBUJAS EN EL CABEZAL
DE LA BOMBA
2.- LIBERACIN O FORMACIN DE BURBUJAS
EN LA CELDA DEL DETECTOR
3.- EL OXGENO DISUELTO
(EL VACO SE RECOMIENDA DEJARLO
ENCENDIDO DE 2-4 HORAS)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
DESGASIFICADOR POR VACIO SERIE 200
DESGASIFICACION EN LINEA
EXTRACCION DE GASES DISUELTOS
POR MEDIO DE MEBRANA PERMEABLE
Y BOMBA DE VACIO
DE 3 CANALES PARA BOMBA BINARIA
DE 5 CANALES PARA BOMBA
CUATERNARIA
LINEA EXTRA PARA DESGASIFICAR
SOLVENTE DE LAVADO DE
AUTOMUESTREADOR
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
TUBERIAS
LA FASE MVIL EMPLEADA EN HPLC
DEBE CIRCULAR POR TUBERAS QUE
CONECTAN LOS INSTRUMENTOS DEL
EQUIPO.
DEBEN SER INERTES Y RESISTENTES A
ALTAS PRESIONES.
SON DE DOS TIPOS:
- TUBOS DE ACERO INOXIDABLE
- TUBOS DE TEFLN
LOS TUBOS DE ACERO SE UTILIZAN PARA CONECTAR
COMPONENTES SOMETIDOS A ALTAS PRESIONES Y
LOS TUBOS POLIMRICOS PARA CONECTAR
COMPONENTES DONDE LA PRESIN ES ATMOSFRICA
O LIGERAMENTE SUPERIOR
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
UNIONES
HPLC
1/16 FERRULES
1/16 TUERCA
LAS UNIONES PERMITEN
CONECTAR LAS TUBERIAS Y CON
ELLAS, LOS DISTINTOS
COMPONENTES DEL SISTEMA.
1/16 O.D. TUBOS
BASICAMENTE EXISTEN DOS
TIPOS DE UNIONES :
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
- UNIONES CONVENCIONALES
- UNIONES UNIVERSALES
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
UNIONES
HPLC
1/16 FERRULE
CARACTERISTICAS
1/16 NUT
1/16 O.D. TUBING
DEBEN DE SER INERTES A FASES
MOVILES Y MUESTRAS
DEBEN CERRAR HERMETICAMENTE
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
NO DEBEN CONTRIBUIR EN FORMA
NOTABLE AL ENSANCHAMIENTO DE
BANDA EXTRACOLUMNA POR LA
PRESENCIA DE VOLUMENES MUERTOS
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
UNIONES
HPLC
X
1
ESQUEMA
DE UNION
MACHO-HEMBRA
ESQUEMA
DE UNION
DE VOLUMEN
MUERTO CERO
ESQUEMA
DE UNIONES
CON DEFECTO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HORNO SERIES 200
HORNO CON CALENTAMIENTO
RANGO DE OPERACIN DE 30 A 90
GRADOS CENTGRADOS
DISPOSITIVO DE SEGURIDAD POR
SOBRE CALENTAMIENTO
CAPACIDAD HASTA 3 COLUMNAS DE
30 CM
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
BOMBA
PURGA
CON LA
JERINGA
PUERTA DE
ACCESO
LAS BOMBAS DE HPLC
IMPULSAN LA FASE MVIL
PROVENIENTE DEL
RESERVORIO DE SOLVENTE
HACIA EL INYECTOR Y DESDE
ALL HACIA LA COLUMNA.
SU CAUDAL DE TRABAJO
PUEDE SER MUY VARIABLE,
SEGN LA ESCALA DE TRABAJO
ESCOGIDA.
Bombas Reciprocantes
Esquema
Bomba Series 200
Esquema del Sistema de Doble Pistn en Serie de Llenado Positivo
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CARACTERISTICAS DE LAS BOMBAS
CAUDAL.- LOS EQUIPOS CONVENCIONALES TRABAJAN
CON CAUDALES DE 0.1 Y 10 mL/mL Y CON PRESIONES
HASTA 6200 psi.
RUIDO.- SE REFIERE A LAS PULSACIONES QUE
PRESENTA LAS BOMBAS DE TIPO RECIPROCANTE.
(MENOR DE 0.5 %).
DERIVA.- ES UN CAMBIO CONTINUO EN LA ENTREGA DE
SOLVENTE QUE SE PRODUCE EN INTERVALOS DE
TIEMPOS MUY LARGO. ESTO ES UNA CONSECUENCIA DE
LA PRECISIN Y EXACTITUD DEL FLUJO DEL SOLVENTE.
SISTEMAS DE CORTE.- PARA CUANDO LA PRESIN
SUPERE LOS VALORES LMITES DE PRESIN TANTO
SUPERIOR COMO INFERIOR PREESTABLECIDOS.
Bombas Series 200 :
Precisin Gradiente (anlisis de 30 runs)
Absorbancia
Peak
4
5
6
7
8
11
Compound
% Standard Deviation
No. of
ts
Area
Runs
Benzene
0.05
Toluene
0.05
Ethylbenzene
0.04
Isopropylbenzene0.05
t-butylbenzene 0.05
Dioctylphthalate 0.06
0.25
0.31
0.22
0.27
0.24
0.22
30
30
30
30
30
30
Tiempo (min)
Bombas Series 200
Comparacin de la mezcla de la
bomba y una premezcla de la fase
mvil
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INYECTORES
EL INYECTOR,
ES EL DISPOSITIVO
QUE PERMITE
INTRODUCIR LA
MUESTRA EN SOLUCIN,
SIN INTERRUMPIR
EL CAUDAL DE
SOLVENTE A TRAVS DEL
SISTEMA.
* EN LA VISTA EL INYECTOR
RHEODYNE 7725i CON LAZO
DE 6 uL
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
INYECTORES
CARACTERISTICAS :
DEBE SER FCIL DE OPERAR.
DEBE SER INERTE AL ATAQUE
QUMICO Y SOPORTAR ALTAS
PRESIONES.
DEBE SER PRECISO EN CUANTO A
LA CANTIDAD INTRODUCIDA EN EL
SISTEMA.
NO DEBE PROVOCAR DILUCIONES
IMPORTANTES DE LA SOLUCIN
INYECTADA.
EN CASOS ESPECIALES PUEDE REQUERIRSE QUE OPERE A
ALTAS TEMPERATURAS PARA LO CUAL PUEDE SER
NECESARIO QUE ALGUNOS DE SUS COMPONENTES SEAN DE
TITANIO O PTFE.
Automuestreador Series 200 para HPLC
Diseado para uso rudo y precisin en su
funcionamiento
Automuestreador no neumtico, con
acceso aleatorio de muestras
Alta precisin y flexibilidad
Bandeja estndar de 100-viales
Volumen de inyeccin de muestra: 0.1-2000
ml
Muestreo rpido (hasta 3 inyecciones/min)
DSR < 0.5% (3 -100 mL)
Linearidad 2 - 100 mL r2 > 0.999
Contaminacin cruzada<0.02%
Eleccin de jeringas y vlvulas Rheodyne
(7725, 8125, 9725)
Comunicacin integrada, dilucin en
serie, derivatizacin, y
micromuestreo
Operacin independiente o controlado
por Totalchrom
Referencia: J. Duggan, Amer. Lab., Feb.., 1996. (No. LC-304).
Automuestreador
Esquema
Sample
Needle
Assembly
Injector
Valve
Assembly
To Flush
Solvent
Sampling
Pump or
Syringe
Flush
Port
Sample Vials
in Tray
Automuestreador Series 200
bandejas de muestras
Mayor versatilidad en muestreo que cualquier
Automuestreador
Ofrece mayor capacidad de muestras: 225 viales
Charola para microplacas (96 pozos +24 )
Charola combinatoria (Dos de 96 pozos)(Nueva)
Charola con accesorio Peltier : (4 - 60oC) 100
viales
Combinatoria 2x96
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SISTEMAS DE GRADIENTES
LA HPLC ISOCRTICA ES CAPAZ DE SEPARAR UN
NUMERO LIMITADO DE PICOS, TPICAMENTE
10 12.
PARA SISTEMAS MS COMPLEJOS, O CUANDO
LA POLARIDAD DE LOS COMPONENTES A
SEPARAR ES MUY DIFERENTE, ES POSIBLE QUE
LA MODALIDAD ISOCRTICA NO SEA CAPAZ DE
RESOLVERLOS. EN ESTOS CASOS, EL ANALISTA
PUEDE OPTAR POR DOS ALTERNATIVAS:
- LA CORRIDA MULTIDIMENSIONAL O
- LA UTILIZACIN DE UN GRADIENTE
DE SOLVENTES.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SISTEMAS DE GRADIENTES
GRADIENTE DE SOLVENTES
ES COMPARABLE A LA PROGRAMACIN DE
TEMPERATURAS EN CROMATOGRAFA
GASEOSA. EN GC SE VARIA LA TEMPERATURA EN
FUNCIN DEL TIEMPO. EN HPLC SE VARIA LA
COMPOSICION DE LA FASE MVIL,
COMENZANDO LA ELUCIN CON UN SOLVENTE
DBIL Y AUMENTANDO PROGRESIVAMENTE LA
PROPORCIN DEL COMPONENTE FUERTE.
ESTA VARIACIN PUEDE SEGUIR UN PERFIL
LINEAL, CONCAVO, CONVEXO O UNA MEZCLA
DE ESTOS PERFILES EN UN MISMO
CROMATOGRAMA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SISTEMAS DE GRADIENTES
1
1 2
50% methanol / water
32% THF / water
4 5
3
10
1
20
min.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
3
6
10
10
20
20
min.
OPTIMIZACIN DE LA SEPARACIN DE UN
SISTEMA DE HPLC (METANOL/THF/AGUA)
25% THF /
17% methanol / water
2
min.
ALCOHOL BENCILICO
FENOL
3-FENILPROPANOL
2,4-DIMETILFENOL
BENCENO
DIETILFTALATO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DETECTORES
EL DETECTOR ES LA PARTE DEL
EQUIPO CROMATOGRFICO QUE
PERMITE VER Y UBICAR EN
TIEMPO Y ESPACIO LA POSICIN
DE CADA COMPONENTE DE UNA
MUESTRA A LA SALIDA DE LA
COLUMNA CROMATOGRFICA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DETECTORES
CARACTERISTICAS :
TENER UN AMPLIO RANGO DINMICO DE
RESPUESTA.
POSEER UNA RESPUESTA LINEAL.
NO CONTRIBUIR AL ENSANCHAMIENTO DE
BANDA EXTRACOLUMNAR.
RESPONDER A TODOS LOS SOLUTOS.
TENER LA SENSIBILIDAD APROPIADA.
POSEER UNA BUENA RELACION
SEAL/RUIDO.
NO DESTRUIR LA MUESTRA.
TENER UNA CONSTANTE DE TIEMPO
BAJA.
DETECTOR UV/Vis
Detector de Absorvancia UV/Vis
Esquema
Caractersticas
de un detector UV/VIS
Un detector UV/Vis consiste tpicamente de:
Una fuente de deuterio (190 - 600 nm)
Un monocromador que incluye una rejilla de difraccin movible
controlado por un motor paso a paso, para seleccionar cierta longitud
de onda atravez de una abertura (slit ) de salida hacia una celda de
flujo ( de 8 a 12 ul)
Dos fotodiodos miden las intensidades de los haces de luz de
muestra y referencia
El principio del detector de absorvancia es la Ley de Beer
Absorvancia = absorvitibidad molar x paso de luz x concentracin
A = e b c = - Log I / I0 ,,
I0 = Intensidad de luz inicial
Es el detector ms comn usado en HPLC deteccin en el orden de ng
Son importantes el ruido(noise)/deriva (drift) para la sensibilidad
DETECTOR DE
FLUORESCENCIA
Detector de Fluorescencia (FL)
Esquema
Un compuesto fluorescente
absorve un fotn (ej., p - p *
transicin electrnica) y emite un
foton a otra longitud de onda
ms larga
Los tipos de detectores de
fluorescencia son:
Filtro/filtro
Filtro/monocromador
Doble monocromador
Programable
Fluorecencia is 100-1000 veces
ms sensible que un detector de
absorvancia (pg de deteccion)
La emisin de fluorescencia es medida
En ngulo recto respecto a la luz incidente
Detector de Fluorescencia
Sensibilidad (pg-fg) y selectividad
Muy usado en aplicaciones de medio
ambiente, farmacutica, alimentos y
biomdica.
Aplicable a compuestos con fluorescencia
natural o analitos derivatizados (pre- o postcolumna) con reactivo derivatizante (OPA)
Aplicaciones para detector de
Fluorescencia
Ambiental
PAHs: fluorescencia natural, se requiere un detector de longitud
de onda programable
Carbamatos: derivatizacion post columna (OPA)
Biopharmaceutical, Clinical
Aminas, amino cidos: OPA, FMOC, Dansyl catecolaminas
Prostaglandinas, cidos grasos: N-ADM
Farmacutica: muchos compuestos tienen fluorescencia natural y
otros son etiquetados
Alimentos y vitaminas
Vitaminas A, D, E
Compuestos etiquetados, drogas y residuos de pesticidas
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DERIVATIZACION
OH
COOH
-H2O
OH
+ R-CH
NH2
Ninhidrina
O-
N
O
Producto Azul
- Aminocido
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DETECTOR DE INDICE DE REFRACCION SERIE 200
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DETECTORES GENERALES
DETECTOR DE INDICE DE REFRACCION :
MIDE LA DIFERENCIA DE INDICE DE
REFRACCIN ENTRE EL SOLVENTE PURO Y
EL SOLVENTE QUE CONTIENE LA MUESTRA .
ES UN DETECTOR UNIVERSAL
EXISTEN 3 TIPOS DE DETECTORES
DE INDICE DE REFRACCIN
FRESNEL
DEFLEXIN
INTERFEROMTRICO
Detector de Indice de Refraccion (RI)
Esquema de un detector IR por deflexion
El detector IR mide la diferencia en IR entre la celda de muestra y la celda de
referencia (contiene el eluyente puro)
El IR es universal, pero tienen una baja sensibilidad (0.01 -0.1 mg) en comparacin a
un detector de absorvancia
La deteccion IR es mayormente usada para componentes que tienen baja actividad
cromosfrica tal como azcares, trigliceridos, acidos organicos, y polmeros en GPC.
Require una bomba isocrtica libre de pulsaciones, solventes
desgasificados y horno para la columna.
DETECTOR DE
ARREGLO DE DIODOS
Series 200 DAD Sistema Optico de Haz Simple
con un solo arreglo de diodos de 512 pixels
Espejo
Lmpara de
Deuterio
Rejilla de
Difraccin
Slit
Fuente
Halgena
de
Espejo
Arreglo de
Diodos
Celda de
Flujo
Tungsteno
Espejo
Espejo
TurboScan200
TurboScan200
Almacena
Pureza de Pico
Relacin de Absorbancia
Mxima Longitud de Onda
Confirmacin Espectral Estndar
Confirmacin Espectral con Bibliotecas
Bsqueda de Picos en Bibliotecas
Archivo de resultados en Turbochrom para su
inclusin en los reportes
Crea Lista de componentes en Turbochrom
con picos identificados comparando con
Bibliotecas
Series 200 DAD Funcionamiento Espectral
UTM - Espectro de Benceno
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
SENSIBILIDAD vs LONGITUD DE ONDA
EL DETECTOR DE ARRANJO
EL DETECTOR DE ARRANJO
UNMSM - Facultad de Farmacia y
Bioqumica
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DISPLAY ALL 3 SPECTRA
EL PROBLEMA:
ES ESTE PICO
PURO?
NO!
NO ES
, PURO
a
c
SOLVENTE
GRADO DE
ADMISION UV
n-HEXANE
CARBONTETRACHLORIDE
BENZENO
CLOROFORMO
METHYLENE CHLORIDE
ACETONE
ACETONITRILE
MATANOL
AGUA
200
250
NANOMETROS
300
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
NOMENCLATURA Y CALCULO
CROMATOGRAMA
LINEA BASE
TIEMPO DE RETENCION (TR)
ANCHO DE PICOS
FACTOR DE CAPACIDAD (K)
FACTOR DE SEPARACION ()
RESOLUCION DE PICO (R)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
CROMATOGRAMA
SEGN IUPAC ES UN GRAFICO U OTRA
REPRESENTACION DE LA RESPUESTA DEL
DETECTOR,CONCENTRACION DEL EFLUENTE U
OTRA CANTIDAD USADA COMO MEDIDA DE LA
CONCENTRACION DEL EFLUENTE , VERSUS EL
VOLUMEN DEL EFLUENTE O TIEMPO
IDEALMENTE EL PICO TIENE DISTRIBUCION
NORMAL GAUSIANA.
EL CROMATOGRAMA COMIENZA EN EL
MOMENTO QUE LA SOLUCION EN ENSAYO ES
INYECTADA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
LINEA DE BASE
ES LA PORCION DEL CROMATOGRAMA DONDE
SOLO SE APRECIA LA ELUCION DE LA FASE
MOVIL, SIN SEAL DEBIDA AL SOLUTO
LINEA DE BASE
TIEMPO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
TIEMPO DE RETENCION (TR)
ES EL TIEMPO QUE UN SOLUTO PERMANECE EN
LA COLUMNA.
SE MIDE DESDE EL PUNTO DE INYECCION AL
MAXIMO DEL PICO.
ES CARACTERISTICO DEL SOLUTO PARA UNA
COLUMNA Y CONDICIONES DE OPERACIN
DADAS.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
TIEMPO MUERTO (TO, TM)
ES EL TIEMPO REQUERIDO PARA ELUIR UN
COMPONENTE NO RETENIDO.
ES EL TIEMPO QUE CUALQUIER COMPONENTE
ESTA EN LA FASE MOVIL.
SE UTILIZA PARA MEDIR EL VOLUMEN VACIO DE
LA COLUMNA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
TIEMPO DE RETENCION CORREGIDO (TR)
MIDE EL TIEMPO QUE EL COMPONENTE
REALMENTE ESTA EN LA FASE ESTACIONARIA.
Tr = tr - to
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
ANCHO EN LA BASE (Wb)
ES LA PORCION DE LA LINEA BASE
INTERSECTADA POR LAS TANGENTES A LOS
LADOS DEL PICO
ES NECESARIO PARA CALCULAR LA
RESOLUCION Y EL NUMERO DE PLATOS
TEORICOS.
SE PUEDE TOMAR EN VARIAS POSICIONES, LAS
MAS COMUNES A: 60,7%, 50%, Y EN LA BASE DEL
PICO.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
PLATO TEORICO (N)
ES UN EQUILIBRIO DEL SOLUTO ENTRE LA FASE
MOVIL Y ESTACIONARIA.
SE CALCULA CON :
tr
N = 16
2
tr
= 5.54
Wb
W1/2
DONDE : tr Y Wb o W1/2 DEBEN EXPRESARSE EN LAS
MISMAS UNIDADES - VOLUMEN, TIEMPO, DISTANCIA-,
YA QUE N ES ADIMENCIONAL.
UNA BUENA COLUMNA TIENE UN NUMERO ALTO DE
PLATOS TEORICOS
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
NUMERO DE PLATOS TEORICOS (N)
t
Pico de Soluto
no retenido
Wh
TIEMPO
N = 5.545 (1/Wh)2 BP or
N = 16 (1/Wb)2 USP
Wb
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
ALTURA EQUIVALENTE A UN PLATO TEORICO
(H, AEPT, HETP)
ES LA LONGITUD DE COLUMNA -L- REQUERIDA PARA
UN PLATO TEORICO.
L
H=
N
DONDE : H y L SE EXPRESAN USUALMENTE EN mm.
UNA H PEQUEA SIGNIFICA MAS PLATOS POR UNIDAD
DE LONGITUD Y POR LO TANTO MAYOR EFICIENCIA.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
COEFICIENTE DE REPARTO (K)
ES UNA PROPIEDAD FISICA FUNDAMENTAL.
ES CARACTERISTICO DEL SOLUTO EN UNA FASE
ESTACIONARIA.
DEPENDE DE LA TEMPERATURA Y ES UNA MEDIDA DE
LAS INTERACCIONES SOLUTO-FASE ESTACIONARIA.
Conc. del soluto en f. estac.
K=
Conc. del soluto en f. movil
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
FACTOR DE CAPACIDAD, RAZON DE CAPACIDAD - kLA RAZN ENTRE LA MASA DE SOLUTO EN FASE
ESTACIONARIA Y LA MASA DE SOLUTO EN FASE
MVIL EN CONDICIONES DE EQUILIBRIO. ES LA
RELACION ENTRE EL TIEMPO QUE UN SOLUTO
PERMANECE EN LA FASE ESTACIONARIA Y LA FASE
MVIL.
tr
k =
to
ESTA RELACIONADA CON EL COEFICIENTE DE
REPARTO :
k = K /
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FACTOR DE CAPACIDAD, K
tR
tM
Picos de Soluto
no retenido
K =
tR -tM
tM
TIEMPO
tM = Tiempo de retencin del pico no retenido
tR = Tiempo de retencin del pico de inters
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
SELECTIVIDAD -( )O FACTOR DE SEPARACION
MIDE LAS DIFERENCIAS RELATIVAS EN LAS FUERZAS
DE INTERACCION DE DOS SOLUTOS CON LA FASE
ESTACIONARIA.
UN VALOR MAYOR DE SIGNIFICA UNA COLUMNA MAS
SELECTIVA Y POR LO TANTO UNA MEJOR RESOLUCION
tr2
tr1
k2
k1
k2
k1
( 1)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FACTOR DE SEPARACION (Retencin Relativa)
tB
tA
tM
KB
KA
KB
= Factor de capacidad para B
KA = Factor de capacidad para A
WbA
WbB
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DEFINICIONES Y RELACIONES BASICAS
RESOLUCION - R ES UNA MEDIDA CUANTITATIVA DEL GRADO DE
SEPARACION ENTRE DOS PICOS. UNA RESOLUCION
DE 1.5 ES UNA SEPARACION A LA LINEA BASE.
2 (tr2 - tr1)
R=
( Wb1 + Wb2)
DONDE LOS TIEMPOS DE RETENCION Y LOS ANCHOS
DE LOS PICOS SE EXPRESAN EN LAS MISMAS
UNIDADES.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
RESOLUCION DE PICO, R
tb
t
ta
Wh
TIEMPO
RS = 2
(tb- ta)
(Wa+Wb)
USP
(t - t )
RS = 1.18 b a
(Wha+
BP
Wa
Wb
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
FACTOR DE COLA, T
W
PICO
FRONTAL
COLA
DE PICO
W 0.05
f
0.05h
ALTURA MAXIMA
DE PICO
W = Ancho a 5% de la altura del Pico
f = Distancia entre el mximo y el borde de entrada del pico
T=
2f
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUALITATIVO
1
2
PERMITE LA IDENTIFICACION DE
UN COMPUESTO
0
min.
10
20
COMPARA EL TIEMPO DE
RETENCION DEL ANALITO
EN LA MUESTRA, CON
RESPECTO AL TIEMPO DE
RETENCION DEL ESTANDAR
CONFIRMACION CON OTRA
COLUMNA DE DIFERENTE
POLARIDAD
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
1
2
0
min.
10
20
SE OBTIENE CON EXACTITUD LA
CUANTIFICACION DE UN ANALITO
EN LA MUESTRA CON RESPECTO A
UN ESTANDAR DE CONCENTRACION
CONOCIDA.
SE PUEDE CALCULAR LA
CONCENTRACION CON DIFERENTES
METODOS :
NORMALIZACION INTERNA
ESTANDAR EXTERNO
ESTANDAR INTERNO
ESTANDAR AGREGADO
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
NORMALIZACION INTERNA :
1
2
Ai
Pi=
0
min.
10
100
Ai
20
DONDE :
Pi ES EL PORCENTAJE DEL COMPONENTE i EN
LA MEZCLA
Ai ES EL REA DEL COMPONENTE i, y
Ai ES LA SUMATORIA DE TODAS LAS REAS
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
ESTANDAR EXTERNO :
1
2
Am Cs
P=
0
min.
10
20
D100
As
DONDE :
P ES EL PORCENTAJE DEL ANALITO EN LA
MUESTRA
Am y As SON LAS AREAS DE LA MUESTRA Y
ESTANDAR
CS ES LA CONCENTRACION DEL ESTANDAR Y
D ES UN FACTOR DE DILUCION
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
ESTANDAR INTERNO :
1
2
Rm Cs
P=
0
min.
10
20
D100
Rs
DONDE :
P ES EL PORCENTAJE DEL ANALITO EN LA
MUESTRA
Rm y Rs SON LAS RELACIONES DE AREA DEL
ANALITO A ESTANDAR INTERNO EN LA
MUESTRA Y
D ES UN FACTOR DE DILUCION
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ANALISIS CUANTITATIVO
ESTANDAR AGREGADO :
1
2
Am Cs
P=
D100
Ams- Am
0
min.
10
20
DONDE :
P ES EL PORCENTAJE DEL ANALITO EN LA
MUESTRA
Am y As SON LAS AREAS DEL ANALITO EN LA
MUESTRA TAL CUAL Y LA MUESTRA A LA QUE
SE LE HA AGREGADO ESTANDAR
RESPECTIVAMENTE
Cs ES LA CONCENTRACION DEL ESTANDAR Y
D ES UN FACTOR DE DILUCION
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
PROBLEMAS INSTRUMENTALES
LA VIDA UTIL DE LAS COLUMNAS DEPENDEN DE
VARIOS FACTORES:
- TIPO Y NATURALEZA DE LAS MUESTRAS
- TIPO Y NATURALEZA DEL SOLVENTE
- TEMPERATURA DE TRABAJO
- ES NECESARIO DESTINAR UNA COLUMNA
PARA CADA TIPO DE MUESTRAS
A ANALIZAR.
- SE DEBE LLEVAR UN REGISTRO DE STAS.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
PROBLEMAS CON LAS COLUMNAS
LOS PROBLEMAS MAS FRECUENTES SON:
PROBLEMAS RELACIONADOS A LAS UNIONES
AUMENTO DE PRESION
PERDIDA DE EFICIENCIA
MODIFICACION DE LA RETENCION O LA
RESOLUCION DEL PICO.
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
PROBLEMAS CON LAS COLUMNAS
PROBLEMAS RELACIONADOS A LAS UNIONES
DESGASTE MECANICO
AJUSTE EXCESIVO O DEFICIENTE
CORTE DEFICIENTE DE LA TUBERIA
PRESENCIA DE SUCIEDAD O PARTICULAS
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
INCOMPATIBILIDAD
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
PROBLEMAS CON LAS COLUMNAS
AUMENTO DE LA PRESION
TAPONAMIENTO DE LOS FILTROS
CONTAMINACION QUIMICA DEL MATERIAL
DE RELLENO
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
- Antes de intentar la solucin de estos problemas
se debe verificar :
a) Si efectivamente existe alta presin en el
sistema
b) Si la alta presin se debe a la columna o
a otro componente del instrumento
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
PROBLEMAS CON LAS COLUMNAS
HPLC
PERDIDA DE LA EFICIENCIA
SISTEMA DE LAVADO DE COLUMNAS
L
A
V
A
D
O
A
C
T
I
V
A
C
I
O
N
SILICAGEL
FASE REVERSA
HEPTANO
50 ml.
Ac. ACETICO 2%
50 ml.
CLOROFORMO
50 ml.
AGUA
50 ml.
METANOL
50 ml.
METANOL
50 ml.
AGUA
50 ml.
CLOROFORMO
50 ml.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
HPLC
PROBLEMAS CON LAS COLUMNAS
MODIFICACION DE LA RETENCION
O RESOLUCION
PROBLEMAS EN EL FUNCIONAMIENTO DE LA BOMBA
DEFICIENCIAS EN LA PREPARACION DE LA FASE
MOVIL
CAMBIOS EN LA COMPOSICION DE LA FASE MOVIL
VARIACCIONES DE TEMPERATURA
C IENTIFICA
A NDINA S.A.
FALTA DE EQUILIBRIO DE LA FASE MOVIL
CAMBIOS EN LA SUPERFICIE ACTIVA DE LA COLUMNA
VARIABILIDAD EN LA COLUMNA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
PRECISION DE UN SISTEMA
FACTORES QUE AFECTAN LA PRECISION DE UN SISTEMA
DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA
PRECISION
FACTORES DE CONTROL
TIEMPO DE RETENCION
FLUJO DE LA BOMBA Y PRECISION
DE LA COMPOSICION
TEMPERATURA DE LA COLUMNA
COMPOSICION DE LA FASE MOVIL
AREA DEL PICO
AUTOMUESTREADOR : MODO DE
INYECCION
BOMBA : FLUJO, PULSACION
DETECTOR : RUIDO Y DRIFT,
RESPUESTA
SISTEMA DE DATOS : VELOCIDAD
DE MUESTREO, PARAMETROS DE
INTEGRACION
Validacion de Metodos: Guias de USP
Parametros Analiticos
Categoria I
Reproducibilidad
Precision
Limite de Deteccion
Limite de Cuantificacion
Selectividad
Rango
Linealidad
Robustez
Nota:
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Categoria I
Categoria II
Categoria III
Categoria II
Cuant.
Limit
Si
Si
No
Si
Si
Si
Si
Si
=
=
=
No
?
Si
No
Si
?
No
Si
Mayor Componente
Menor Componente
Rendimiento
Categoria III
Si
?
?
?
?
?
?
Si
Herramientas del Software para la
Validacion de Sistemas y Metodos
Precision
Editor grafico de metodos, Interactivo
Reproducibilidad
Resumen de picos
Limite de deteccion
System Suitability ( Calculo de S/N )
Especificidad
Rango lineal
Reporte de Abs. Max/Pureza de pico, TurboScan
System Suitability (Platos, Resolucion, factor de cola )
Calibracion Multi nivel, grafico de calibracion con
Robustez
Turbo Method Development para optimizacion de solv
Metodo Interactivo de Editaje de Graficas
Reporte resumen de Precision de
Area y tiempos de retencion
Iso-Propyl Benzene
File
Name
5ul003
5ul004
5ul005
5ul006
5ul007
5ul008
5ul009
5ul010
Averages
%RSD
Sample
Name
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
5 ul injection
Time
[min]
Anthracene
Area
[Vs]
Time
[min]
Area
[Vs]
0.84
0.82
0.84
0.84
0.84
0.84
0.83
0.84
1332838
1330947
1331692
1328473
1319670
1326515
1325539
1328437
1.03
1.03
1.02
1.02
1.02
1.02
1.02
1.02
1111930
1108623
1111280
1108039
1100541
1106971
1105507
1108216
0.84
0.12
1328014
0.32
1.02
0.18
1107639
0.32
Programa para Pruebas de Conformidad
(System Suitability Software)
Calcula los parametros del sistema(platos
teoricos,capacidad,asimetria,etc.) de acuerdo al
USP y la Farmacopea Britanica
Ejecucion automatica con cada inyeccion o para
multiples archivos
Ahorra criterios de prueba para cada producto
Almacenaje de los datos en el archivo de
resultados de cada muestra
Opciones del System Suitability
(incluyendo S/N)
Reporte Tipico de System
Suitability
Software Version
Date
Instrument
Instrument Method
Suitability Method File
Author
Column Length
Compliance
Alpha and Resln Calc.
Tailing Factor Calc.
Void Time
S/N Window Start
S/N Window End
S/N n Sigma
Result File
---------------[Link]
: 4.0<4J28>
: 10/21/95 10:05 PM
: Unknown
: test1
:
: BATCH
: 0.250 m
: USP
: Adjacent SUIT Components
: 5% Peak Height
: 0.000 min
: 0.000 min
: 2.000 min
:4
Sample Name
-------------------------------
Acquisition Date
-----------------------4/23/87 02:11 PM
Peak
Ret
Peak
Peak
N Tan
N Foley
Tail
PW
PW
PW
Name
Time
Area
Height [plates / M] [plates / M] Fact
k' Resln Alpha S/N Base
0.05
0.1
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------o,p-DDT
2.316
102725
10386
3550.61
3636.79 1.083
N/A N/A
N/A
4.67 18.655 20.517
18.976
p,p'-DDT
3.915 1090284
100059 10911.16
11661.62 0.996
N/A 5.237 1.691
45 17.991 21.290
18.667
Tailing Factor Criteria
o,p-DDT
p,p'-DDT
1.00 to
- Tailing Factor
- Tailing Factor
1.80
: Requirements for suitability were met.
: Requirements for suitability were NOT met.
Calculo Automatico de Absorbancia
Maxima e Indice de Pureza
Pk #
Component
RT
Area
1
2
3
4
5
6
Comp A
Comp B
Comp C
Comp D
Comp E
Comp F
0.437
0.633
0.890
1.203
1.600
2.213
3016138
5049419
4342001
3550203
3209537
6287826
PEAK #
1
2
3
4
5
6
TIME
Wavelength MAX
PI
0.44
0.63
0.89
1.20
1.60
2.21
254nm
260nm
260nm
259nm
258nm
250nm
4.51
3.05
1.40
1.21
1.06
1.17
Height
1389.5432
1970.0206
1361.9135
904.0825
653.6164
954.6478
Grafica de Linearidad de
Tolueno: r = 0.9997
2
Agradece vuestra participacin
Columnas HPLC
Sistema de la Columna
Dimensin -Longitud (L) y dimetro interno (dc)
Caractersticas del empaquetamiento
Tipo - slica o polmero
Tamao de la partcula (dp)
Tamao de poro(dpore)
Grupo enlazado (determina el modo cromatogrfico)
Longitud de la columna (L)
La eficiencia de la columna (n) es proporcional a L
HETP = L/n
Se pueden acoplar columnas para obtener una mayor
longitud con alta eficiencia
La contrapresin es proporcional a L
Las longitudes ms comunes son de 10 - 25 cm
La cromatografa rpida se realiza con columnas de 3 - 10
cm empacadas con partculas de tamao pequeo (dp = 3
mm)
Dimetro de la Columna (dc)
La capacidad de la muestra es proporcional a (dc )2
La velocidad de flujo es proporcional a (dc )2
El lmite de deteccin es inversamente proporcional a
(dc )2
Tipo de Columna
i.d.
(mm)
Capacidad de
la muestra
(mg)
Velocidad
de Fluljo
(mL/min)
Semipreparativa
8-20
10-50
5-30
Analtica Estndar
4.6
Narrowbore
2.0
0.2
0.2
Microbore
1.0
0.05
0.05
Comparacin de Separaciones
Flexibilidad para optimizar la longitud de la
columna
3 cm
n= 2,500
10 cm
n= 7,000
22 cm
n= 15,000
n = plate count
Ecuacin Van Deemter
Efecto de dp y velocidad (F) sobre la eficiencia
de (HETP)
Relacin entre HETP con
la velocidad de flujo y dp
Pequeo dp producen
bajos HETP
La velocidad de flujo
ptima es mayor cuanto
ms pequeo sea dp
H=A+B/u+Cu
u: velocidad lineal
Tipos de Soporte
Tipos de Soporte
Slica (o alumina)
Polimrico: poliestireno -DVB,
politeres, polimetacrilatos
Propiedades importantes de los soportes
Fuerza mecnica y estabilidad qumica
Propiedades de la partcula y tamao de poro
Propiedades superficiales
Tipos de Soporte
Silica
Es el soporte predominante de LC con un excelente
rendimiento
Los grupos silanol (Si-OH, siempre presentes en las
superficies de slica) se encuentran tpicamente
enlazados con grupos silanos para modificar la
superficie
Sus lmites de pH se encuentran entre 2.5 - 8
Soportes de materiales polimricos
Se han introducido rpidamente con una alta eficiencia
Muy utilizada en bioseparaciones
Amplio mbito de pH (1-14), buena reproducibilidad y
ausencia de grupos silanol
Escogencia del tamao del poro
Dimetro molecular del analito
Se prefiere q diametro del poro sea 5 a 10 veces el
diametro del analito
La capacidad de enlace est relacionada con el rea
superficial accesible de los poros
Recomendaciones para escoger el tamao de poro
Max.P.M.
Dimetro de poro
2,000
60
10,000
80 - 100
60,000
300
500,000
1000
> 10,000
no poroso
Enlaces ms comunes
Fase Reversa
C18
Octadecyl
Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3
C8
Octyl
Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3
C4
Butyl
Si- CH2- CH2- CH2- CH3
Silica
Cyanopropyl
S i - OH
Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CN
CH2-
Fase Normal
Si
CN
Intercambio Inico
SP
CM
DEAE
SAX
Sulfo propyl
Si - CH2- CH2- CH2- SO3Carboxymethyl
Si-CH2-CO2Diethylaminoethyl
Si - CH2-CH2-NH+ (C2H5)2
Triethylaminopropyl
Si-CH2-CH2-CH-N+(C2H5)3
Gua para la seleccin de una fase
enlazada
C18
Fase enlazada ms utilizada, retiene muy bien y es muy estable
Las columnas C18 de diferentes vendedores tienen diferentes caractersticas de
selectividad y
C8
Se prefiere para fases mviles con bajo contenido de fase orgnica
C4
Se utiliza con frecuencia para separaciones de protenas (C18 se prefiere para
peptidos)
CN
Tanto para NP o RP; Utilizada para algunas aplicacioens especficas (ejm.
antidepressants)
Fenil
Para sepearaciones en RP de compuestos medianamente polares y bsicos,
selectividad nica para aromticos
Amino
Se utiliza para reemplazar la silica en separaciones por NP, anlisis de azcares
Ref.: Column Selection Guides, HPLC Supplies Catalog, Perkin-Elmer, L-1882, Norwalk, p.2-3
Materiales de Empaquetamiento
de
la
Columna
Tipo de Soporte
Silica (o alumina) o Polmeros (enlazados)
Grupos enlazados
C18, C8, C4, amino, ciano, fenil
dietilamina (DEAE), sulfonato, aminas cuaternarias
Tamao de la partcula (dp): 3-, 5-, 7-, 10- o 20 mm
La eficiencia es inversamente proporcional a dp
La presin de la columna es inversamente proporcional a
(dp)2
Tamao del poro (dpore) : 60 - 300
Amplios tamaos de poro (300 ) para la separacin de
biomolculas o polmeros
rea de Superficie: 90 - 400 m2/g
Gran rea de superficie maximiza las interacciones con los
grupos enlazados
Desarrollo de mtodos
El mejor desarrollo de mtodo es no desarrollar mtodos...
ms bien adoptar mtodos ya existentes
Sin embargo, consulte primero con sus colegas y luego refirase a
la literatura (USP, AOAC, ASTM, etc). Dse a la tarea de
desarrollar un mtodo slo cuando no exista alguno disponible:
Primeros pasos en el desarrollo de mtodos:
Recolecte toda la informacin posible para su muestra:
Defina el objetivo de la separacin
Recolecte y evale la informacin de la muestra
Considere la preparacin de la muestra y el instrumental
requerido
Desarrolle el mtodo HPLC
Defina el objetivo de la
separacin
Analizar todos componentes o componentes
seleccionados?
Anlisis cuantitativo? Con qu precisin?
Se requiere identificacin y confirmacin de pico?
El mtodo se usar para pocas muestras o para anlisis de
rutina?
Se requiere alguna extraccin o preparacin especial de la
muestra antes del anlisis por HPLC?
Ref.: L.R. Snyder, J. L. Glajch and J.J. Kirkland, Practical HPLC Method
Development, John Wiley & Sons, New York, 1988.
Resuma la informacin
importante acerca de la muestra
Nmero de componentes
Ambito de concentraciones de los analitos
Estructura Qumica
PM, (biopolmero?)
Polaridad, hidrofobicidad, carga
Solubilidad en agua, alcohol, eter, diclorometano y hexano
Acido, neutro, grupos funcionales bsicos, pKa /pKb /p I
Otras consideraciones
Cromforos, forma, estabilidad de la muestra, reactividd de los adsorbentes
Matriz de la muestra
Slida, lquida, tableta, extracto de planta, tejido, ...
Disolvente en que es soluble, volumen de muestra
Interferencias -- sales, lpidos, partculas, hidrocarburos
Ref.: L.R. Snyder, J. L. Glajch and J.J. Kirkland, Practical HPLC Method
Development, John Wiley & Sons, New York, 1988.
Preparacin de la muestra
Tcnicas comunes en la preparacin de la muestra
para separar los analitos de las matrices
Filtracin
Extraccin lquido-lquido
Extraccin en fase slida
Precipitacin
Centrifugacin
pH
deoverview
fuerzaof sample
inica
Ref.y/o
R. [Link]
Major, An
preparation, [Link] 9 (1991) 16.
GPC
Pasos en el desarrollo de mtodos
Seleccin del modo cromatogrfico
RPC, LSC, IEC, GPC
UV/Vis, Fluorescencia, RI, electroqumico,
conductividad, etc.
Seleccin de la columna y fase mvil
Obtener el primer cromatograma
Mejorar y optimizar la separacin
Resolucin, simetra de pico, robustez, etc.
Validacin del mtodo
Exactitud, precisin, sensibilidad, especificidad,
linealidad, etc.
Modos de trabajo en
Cromatografa Lquida
Fase Normal o Lquido-Slido (NP, LSC)
Separacin basada en adsorcin / desorcin del analito en una superficie polar
(slica)
Fase Reversa (RPC)
La separacin de los analitos est basada en el coeficiente de particin entre la
fase mvil y la fase estacionaria qumicamente enlazada
Intercambio de Iones (IEC)
La separacin est basada en el intercambio inico con los contraiones y las
interacciones con los iones enlazados en la fase estacionaria
Exclusin por Tamao (SEC or GPC)
La separacin est basada en el tamao molecular de los analitos y la accin de
filtro del empaque de la columna
Nota: Cromatografa de par inico es una tcnica especial de RPC para compuestos
ionizables
Pasos para la seleccin de
columna
Modos cromatogficos y mecanismos
Soporte
Tipos, tamao de partcula, forma, tamao de poro.
Fases enlazadas (Adsorbentes)
Tipos, enlace qumico (monomrico o polimrico),
recubrimiento
Configuracin de la columna - longitud, dimetro, formato
Otras consideraciones
Reproducibilidad de lote a lote
Actividad silanoflica
Tiempo de vida de la columna y precolumna
Seleccin de la columna
Muestra
Peso Molecular
Solubilidad
Modo de
Separacin
Particin Liquido-Liquido
Insoluble en Agua
Inico
PM<1000
Soluble en Agua
No Inico
Soluble en Agua
Inico
Muestra
Soluble en Agua
Fase Mvil
Tpica
CHCL3, EtOAc
Fase Normal
(no-polar)
Fase Normal (polar)
Adsorcin Lquido-Slido
Particin Liquido-Lquido
Fase Reversa
Intercambio Catinico
(Bsico)
Intercambio Aninico
(Acido)
Filtracin con Gel
n-C6H6, CHCl3
H2O/MeOH, H2O/CH3CC
Buffers (PO43-, BO2pH2-9 (modificadores
cidos, HOAc, HNO3
H2O, ROH
PM>1000
Insoluble en Agua
Exclusin por
efecto estrico
THF, CHCl3
Escoja las dimensiones de la
columna
Objetivo del anlisis
Resolucin
Columnas largas empacadas con partculas pequeas
Velocidad
Columnas pequeas + flujos altos & partculas muy
pequeas
Sensibilidad
Pequeo i.d. + baja velocidad de flujo
Capacidad
Largo i.d.
Economa
Columnas pequeas para alcanzar la adecuada separacin
Configuracin y dimensiones de
la columna
Longitud (L)
Eficiencia (n) es proporcional a L
Resolucin es proporcional a la raz cuadrada de L
La contrapresin es proporcional a L
Dimetro interno (dc)
Volumen de la columna (capacidad de muestra) es
proporcional a L p dc 2
Las categoras de columnas incluyen, preparativa,
analtica (convencional), Fast LC, narrowbore, microbore,
columnas capilares
Algunos Criterios para la Seleccin
La meta de la mayora de las separaciones de LC es
obtener una buena resolucin de la lnea base
para toda clase de analitos (Rs > 1.5)
Rs = (k/1+k)
( -1/ )
Ecuacin de resolucin
retencin
selectivitidad
(n)0.5
eficiencia
k deber estar entre 1 y 10
Un mejor valor de se obtiene seleccionando la
columna y la fase mvil que resuelvanResolucin
todos los
analitos crticos
n se incrementa usando columnas de alto
Capacidad
rendimiento o de una longitud razonable
Velocidad
Algunos Criterios para la Seleccin
En RP el k disminuye cuando aumenta el componente organico
(MeOH, AcN, THF)
En NP el k disminuye al aumentar el solvente polar
En IC el k disminuye al aumentar la concentracion del contraion (
buffer o sal agregada), o la proporcion del solvente organico. El pH de
la fase movil puede aumentar o disminuir k de acuerdo a las
caracteristicas acido-base del analito
Una variacion en el valor de se obtiene variando el componente
activo de la fase movil ( en RP MeoH por AcN o THF y en NP
cloroformo por cloruro de metileno o metil terc butil eter)
Una variacion en el valor de se obtiene modificando el valor de pH
de la fase movil o empleando aditivos ( reactivos de apareamiento o
acomplejantes)
Resolucin
Velocidad
Capacidad
Tiempo de vida til de la columna
El tiempo de uso tpico se encuentra entre 3 - 12 meses o 100
- 1,000 inyecciones (de la encuesta de 1994)
El tiempo de vida til lo determina:
La estructura de la columna, la estabilidad de la fase, el
procedimiento de empaque
Principales problemas de las columnas:
Taponeo, Asimetra de los picos, Coleteo de picos,
Prdida de Eficiencia o Retencin
La vida til se prolonga:
Con un mejor cuidado y mantenimiento
Regeneracin de la columna
Uso precolumnas y filtros en lnea (Scavenger)
Herramientas y Servicios P-E
Para la validacin de su HPLC
Todos los productos se fabrican bajo las normas ISO 9001
Todos los sistemas vienen con un certificado de conformidad, pureba
que se les practiva individualmente antes de ser empacados
Disponibilidad de procedimientos y documentos para
Instalacin, operacin y verificacin del desempeo
Installation Qualification/Operation Qualification (IQOQ) para cada mdulo de los
sistema
Guas de Validacin para Totalchrom
Software adicionales
System Suitability, Peak Summary, Interface Validation
Entrenamientos y Verificacin Instrumental (IPV) en los laboratorios
del cliente
