UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALITICA INSTRUMENTAL

TEMA DE PRÁCTICA:

El espectrofotómetro, manejo, cuidados y calibración. Obtención

de espectros y su interpretación.

INTEGRANTES:

17040061 Carmen Rosa Huamán Motta

18040064 Karla Huamancaja Raymundo.
16040062 Raúl Antonio Jáuregui Rojas
15040009 Espinoza portuguez, Luis Alfredo
16040062 Cruz Palacios Eduardo Moises
17040065 Loarte Ticse Mishel Teresa

PROFESORA RESPONSABLE:

[Link]

HORARIO:
Martes (9:00am – 12:30pm)
Miercoles (10: 00am – 1:30 pm)

LIMA-PERÚ

2020
OBJETIVOS

➢ Conocer el uso, el manejo y cuidado del espectrofotómetro.

➢ Obtener las gráficas del espectro de absorción del azosulfamida.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Espectrofotómetro

El espectrofotómetro UV-visible es un equipo de uso fácil y las determinaciones que

en él se realizan son de tipo cuantitativo.
La técnica analítica utilizada es la espectrofotometría UV-visible que permite
determinar la concentración de un compuesto en solución.

Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez

que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración.
Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede
seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad
de luz absorbida por la misma.

El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para

absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la
eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las
condiciones del medio (ph, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo
que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y
caracterización de biomoléculas.1

Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina
un salto desde un estado energético basal, E1, a un estado de mayor energía (estado
excitado), E2, y solo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado.
Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del
resto de moléculas. Como consecuencia la absorción que a distintas longitudes de
onda presenta una molécula; esto es, su espectro de absorción que constituye una
señal de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera
energía absorbida hasta el estado energético fundamental.2

Ley de Beer Lambert

Se conoce también como ley de Beer o de Beer Lambert Bouguer e identifica la
relación existente entre la concentración de la muestra y la intensidad de la luz
transmitida a través de la misma. Con relación a la ley en mención. Hay implícitos dos
conceptos: transmitancia [T] y absorbancia [A]. 3
Transmitancia [T]
Es la fracción de la luz incidente que a una determinada longitud de onda pasa a
través de la muestra. Se define por la siguiente relación:

El porcentaje de transmitancia [%T] puede expresarse por la siguiente ecuación:

La concentración de moléculas absorbentes de luz en la muestra es proporcional a la

absorbancia [A] de la muestra. Matemáticamente se expresa así:

METODOLOGÍA
CÁLCULOS

● Para la preparación de diluciones, se llevó a cabo los siguientes cálculos:

5g → 100 mL
0.05g → 1 mL
● Convertimos a µm :
50000µm/mL

● 1 mL de esta concentración 50000µm/mL fue llevada a una fiola de 100mL ,

por lo tanto tendríamos lo siguiente:
50000µm/mL → 100 mL
500µm/mL → 1 mL
● Con esto se tendría la sustancia patrón de concentración 500µm/mL
● A partir de ella se realizarán las siguientes disoluciones, teniendo en cuenta
que estas soluciones deben ser calculadas de mayor concentración a menor
concentración.
● Para obtener una concentración de 100µm/mL debemos utilizar una
concentración 500µm/mL y hacer los siguientes cálculos:
C1V1=C2V2
500 µm/mLxV=100 µm/mLx100 mL
V=20 mL
● Para las concentraciones siguientes de X1, X2, X3, ...1.5 µm/mL se realizara
el calculo se manera similar al cálculo anterior.
RESULTADOS
Representación mediante gráfica de las lecturas del porcentaje de transmitancia (Y)
versus longitud de onda (X).
GRÁFICA Nº1(Anexo)

Donde:
Porcentaje de transmitancia (%T) será representada en el eje de las ordenadas(Y).
Longitud de onda (λ) será representada en el eje de las abscisas (X).

Tabla de datos:

Espectro de absorción de azosulfamida

Absorbancia Longitud de onda
0.074 400
0.072 410
0.071 420
0.074 430
0.077 440
0.080 450
0.091 460
0.111 470
0.137 480
0.162 490
0.186 500
0.206 510
0.218 520
0.221 530
0.210 540
0.188 550
0.156 560
0.121 570
0.089 580
0.064 590
0.045 600
 Espectro de absorción de azosulfamida
0.25

0.2
Absorbancia

0.15

0.1

0.05

0
0 100 200 300 400 500 600 700
Longitud de onda

 Longitud de onda óptima: 530 mm

Curva de Ringbom

Concentración Absorbancia Transmitancia ABSORTANCIA

(Ug/ml) % = 100-%T
0.1 0.006 99.9 0.1
0.3 0.006 99.0 1
0.6 0.016 96.4 3.6
1.0 0.034 92.6 7.4
3.0 0.214 60.95 39.05
6.0 0.457 34.99 65.01
10 0.765 17.33 82.67
20 1.550 2.89 97.11
 Curva de Ringbom
120

100

80

ABSORTANCIA
60

40

20

0
100 10 1 0.1
CONCENTRACIÓN

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Durante la experiencia se empleó como reactivo un compuesto orgánico cromóforo

como la azosulfamida, cuyo solvente fue el agua. Al tratarse de un compuesto
coloreado, se trabajó con longitudes de onda que se encontraban dentro del rango de
la luz visible (450 – 600 nm). Esto concuerda con lo dicho por K.A. Connors “Las
mediciones se realizan con la cubeta de la muestra respecto a la cubeta del disolvente
con un espectrofotómetro tomando lecturas desde 450 a 600 nm (Esta etapa es
necesaria porque tal vez las dos cubetas no sean ópticamente iguales)”.5
De esta manera, se calculó el porcentaje de transmitancia a diferentes longitudes de
onda, obteniendo su valor mínimo a 530 nm con un porcentaje de transmitancia del
55%, este valor no es muy bueno ya que no responde a lo descrito por el Dr. Olsen
en donde “el error relativo es mínimo para la mayoría de instrumentos, si los valores
de transmitancia son de alrededor del 37%”.6
El analito utilizado debe ser diluido en un solvente que no interfiera en el análisis
espectrofotométrico y además debe cumplir con la ley de Beer, el cual nos menciona
que el analito se debe encontrar en concentraciones relativamente [Link] la
práctica se utilizó como solvente agua destilada y se usó una muestra a una
concentración mínima para así disminuir los posibles errores de medición.6
Se maniobró con cuidado la cubeta para no dejar huellas digitales esto porque como
nos dice Skoog “La transmitancia se debe medir de diluciones del analito que se
encuentran en cubetas transparentes”. 7
Según Skoog, para conseguir espectros complejos bien resueltos se requieren
anchura de rendija estrechas. En la práctica se usó una anchura de banda de 10
nm,se obtuvo los resultados y se graficó la curva espectral, con esta gráfica se
determinó la longitud de onda espectral la cual nos da un valor de 530 nm. Al usar
una anchura de banda que no es efectiva la pérdida progresiva de los detalles
espectrales es clara. Para estudios cualitativos tales pérdidas son de gran
importancia.7

CONCLUSIONES

➢ Se llegó a conocer el manejo y los cuidados que se deben de tener con el

espectrofotómetro de absorción UV-visible, el uso del espectrofotómetro nos
relaciona tanto concentración como transmitancia de una muestra de una
manera directamente proporcional lo cual nos facilita el encontrar la
concentración de las sustancias por medio de gráficas de linealidad.
➢ Se obtuvo las gráficas del espectro de absorción de la azosulfamida tanto de
la forma manual como de forma automática

APORTE BIBLIOGRÁFICO

CALIBRACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
En la calibración de un espectrofotómetro, el primer paso debe ser la limpieza y
alienación del sistema óptico, después se realiza la calibración de la longitud de onda,
y al final se verifica la respuesta de la absorbancia.
Los cristales de óxido de holmio son los marcos de referencia idóneos para calibrar
la longitud de onda, debido a que estas sustancias presentan espectros de absorción
de bandas finas. Este comportamiento se debe a que ambos cristales poseen poseen
pocos átomos y sus estructuras cristalinas limitan los grados de libertad , en
consecuencia la probabilidad de las transiciones disminuye.8

¿Qué cuidados se debe de tener para realizar una correcta lectura?

➔ Colocar el instrumento en un lugar en donde no esté sujeto a vibraciones, calor

excesivo, humedad o luz directa.
➔ Proteger el instrumento del polvo. Nunca tocar las superficies ópticas tales
como lentes y filtros. Seguir las instrucciones que da el fabricante para la
limpieza de tales componentes.
➔ Permitir que el instrumento se caliente antes de hacer algún procedimiento.
➔ Hacer un chequeo periódico (cada semana) del ajuste de la longitud de onda,
cuando se sospeche que ha variado, con el Tubo de Didimium.
 ➔ Verificar el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y cuando varíe
la longitud de onda.
➔ Asegurarse de que las cubetas estén limpias y libres de rayaduras y huellas
digitales. Esto debe hacerse cada vez que va a usarse.4

¿Cómo se compone un espectrofotómetro?

Para que un espectrofotómetro realice las funciones correctas es necesario que

cuente con aquellos componentes que lo ayudarán en su labor. Por lo tanto, un
espectrofotómetro se compone de:

Fuente de luz
La fuente de luz ilumina la muestra química o biológica, pero para que realice su
función debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad, direccionabilidad,
distribución de energía espectral continua y larga vida.
Las fuentes de luz que puede tener un espectrofotómetro son:

- Lámpara de wolframio (también llamado tungsteno)

- Lámpara de arco de xenón
- Lámpara de deuterio que es utilizada en los laboratorios atómicos
Monocromador
El monocromador de un espectrofotómetro aísla las radiaciones de longitud de onda
deseada, logrando obtener luz monocromática.

Un monocromador está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores

y el elemento de dispersión.

Colimador
El colimador es un lente que lleva el haz de luz entrante con una determinada longitud
de onda hacia un prisma, el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz
logrando que se redireccione hacia la rendija de salida.

Compartimiento de muestra
En el compartimento de muestra es donde se lleva a cabo la interacción R.E.M. con
la materia.

Detector
El detector se encarga de evidenciar una radiación para que posteriormente sea
estudiada y saber a qué tipo de respuesta se enfrentarán (fotones o calor).

Registrador
Convierte el fenómeno físico en números proporcionales al analito en cuestión.

Fotodetectores
Los fotodetectores de un espectrofotómetro perciben la señal en forma simultánea en
16 longitudes de onda y cubren al espectro visible, de esta manera se reduce el
tiempo de medida y minimiza las partes móviles del equipo.

Fig 5. Partes del espectrofotómetro

PREGUNTA N° – practica 1

1. Diferencias entre fotocolorímetro y un espectrofotómetro?

La colorimetría y fotocolorimetría no son en realidad técnicas distintas y la diferencia

estriba en el tipo de instrumental empleado, de forma que se denomina colorímetro a
aquellos aparatos en los que la longitud de onda con la que vamos a trabajar se
selecciona por medio de filtros ópticos; en los fotocolorímetros o espectrofotómetros
la longitud de onda se selecciona mediante dispositivos monocromadores además el
fotocolorímetro trabaja únicamente en el espectro de luz visible y selecciona una
longitud de onda determinada mediante filtros fijos mientras un espectrofotómetro es
capaz de trabajar, no solo con la luz visible sino que en otras regiones del espectro
electromagnético (ultravioleta e infrarroja).En espectrofotómetros se puede controlar
con selectores continuos de longitudes de onda, no así en fotocolorímetros de filtro,
ya que en estos no se pueden realizar espectros de barrido.

2. Explique las diferenciasentre los instrumentos de un solo haz y de doble

haz para las mediciones de absorbancia.

Instrumentos con óptica de un solo haz:

Los instrumentos de simple haz son aquellos en los cuales el haz de luz sigue una
única trayectoria entre la fuente y el detector(Figura A). La banda de luz atraviesa la
muestra que se halla contenida en una celda, la luz transmitida por la muestra pasa
al detector originándose una corriente eléctrica que por medio de diferentes circuitos
permite observar una señal, ya sea el movimiento de una aguja o señal digital o un
registro gráfico.
Instrumentos de doble haz:
En los instrumentos de doble haz la luz proveniente de la fuente es dividida en dos
haces después de salir del monocromador mediante un sistema de espejos divisores
(Figura B). Esta división produce dos haces de luz, uno de ellos se dirige a la celda
de referencia, que contiene el blanco, y el otro haz se dirige hacia la celda de muestra.
Los dos haces de luz después de atravesar la celda de referencia y la de muestra
llegan a detectores separados para obtener la señal correspondiente.

Los sistemas de doble haz tienen la ventaja de que cualquier variación en la

intensidad de la fuente, la eficiencia de la red, la reflectividad de los espejos, la
fotosensibilidad del detector, etc., afecta simultáneamente a los dos haces. En
consecuencia, la relación de energía de los dos haces permanece siempre constante.
 3. pregunta 3-practica 1

Al trabajar con doble haz presenta importantes ventajas cuando el registro es

automático y tiende a minimizar los errores debidos a fluctuaciones en el voltaje,
intensidad de la fuente, respuesta del detector, ganancia del amplificador y otras
irregularidades.
En general los espectrofotómetros de haz sencillo son adecuados para análisis
cuantitativos simples o de mezclas sencillas, pero no son satisfactorios para
análisis cualitativos de sustancias que presentan curvas de absorción
complejas en una zona amplia del espectro.

4. Defina cada termino:

Exactitud fotométrica: Es el grado de concordancia entre la absorbancia real y la

absorbancia medida. El error cometido al leer una absorbancia respecto de una de
referencia se denomina entonces “inexactitud fotométrica”.
Ruido: Cualquier señal generada por el detector que no responde directamente a la
luz transmitida en la longitud de onda requerida.
Banda ancha: es la longitud, medida en Hz, de la extensión de frecuencias en la que
se concentra la mayor potencia de la señal. Se puede calcular a partir de una señal
temporal mediante el análisis de Fourier. Las frecuencias que se encuentran entre
esos límites se denominan también frecuencias efectivas.
Sistema dispersor: puede ser prisma, red o filtro de absorción o interferencias. Un
prisma dispersa la REM por el fenómeno de refracción. La REM cambia de dirección
al llegar al medio determinado. Este cambio de dirección se mide con el índice de
refracción, que puede ser absoluto o relativo.
5.- ¿Qué es el error absoluto de un espectrofotómetro?

Es la diferencia entre el valor de la medida y el valor tomado como exacto. Puede ser
positivo o negativo, según si la medida es superior al valor real o inferior (la resta sale
positiva o negativa).

Los errores indeterminados en la lectura de la transmitancia o absorbancia son

errores que potencialmente siempre están presentes y es necesario tenerlos en
cuenta. En ocasiones, pequeños errores en la lectura de la transmitancia o de la
absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la concentración cuando se opera
en los extremos de la escala. El error absoluto cometido en la determinación de la
concentración, para un cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al
ser pequeña la concentración, el error relativo puede ser grande.

6. Deduzca matemáticamente la fórmula: A= 2 – log %T. ¿Cuál es el rango de

valores de la transmitancia y la absorbancia?

La relación entre la transmitancia (T) y la absorbancia (A) sería:

A = log 1/T %T = T. 100 T = %T/100

A = - log T
A = - log ( T.100/100)
A = - log T% + 2
A = 2 – log T%

Los valores de transmitancia pueden ir de 0 a 1, cero si no pasa nada de luz y uno si

pasa toda la luz.
La absorbancia toma valores entre 0 e infinito. Obsérvese que la absorbancia
aumenta conforme disminuye la transmitancia.
8.- ¿Cómo se hace la limpieza de las cubetas de muestras luego de ser usadas
con una solución coloreada y grasa?

Se desecha la muestra posteriormente se usa agua destilada para enjuagar reiteradas

veces, finalmente se seca con papel tissue cuidadosamente, para evitar rayar la pared
por donde incidirá el haz de luz.

PRACTICA N2 PREGUNTAS.

1. De acuerdo a la estructura química del compuesto estudiado ubique el o

los grupos cromóforos, señale las transiciones electrónicas respectivas.

La estructura molecular de la Azosulfamida es la siguiente:

Como se puede apreciar tiene un grupo azo que actua como un grupo cromóforo
porque cuando el grupo azo está conjugado con dos anillos aromáticos, el compuesto
que lo contiene absorbe radiación electromagnética en el espectro visible, por lo que
presenta coloración y, además, ésta es intensa.
Por tratarse de un grupo cromóforo azo (N=N) su transición electrónica es n-π*

[Link] la energía y el número de ondas de la longitud de onda optima

obtenida.

h: constante de Planck
= c: velocidad de la luz
λ: longitud de onda

3,75 J

Calculando el número de onda

n=

= 2.666
3. De acuerdo con la curva de Ringbown, explique y fundamente ¿A qué se debe
la formación de mesetas inferior y superior?

Se fundamenta en la ley de Beer, donde a mayor concentración, mayor es la

absorbancia y menor la transmitancia. En la práctica, se trabajo con soluciones
diluidas y concentradas de azosulfamida donde él % T será menor y la absorbancia
hallada será mayor según la formula A= 100 - %T, esto originara que la curva de
Ringbown presente mesetas superiores, a diferencias de soluciones diluidas que
presentarán mesetas inferiores.

4. Investigue sobre los principales errores en la lectura de absorbancia

relacionados con la concentración. (Error relativo y error absolutoT).

- Error relativo: cualquier incertidumbre en la medida de la transmitancia produce una

incertidumbre en la medida de la absorbancia y por lo tanto, tambien en la medida de
la concentración de la muestra. La magnitud del error relativo en la concentración, por
la incertidumbre en la medida de la transmitancia puede deducirse de la ley de Beer
y se conoce como error relativo por unidad de error instrumental o error analitico por
unidad de error fotométrico y se designa por:

- Curva de Crawford: Con todos los datos obtenidos para la curva de Ringbom, se
calcula el error analítico por unidad de error fotométrico, y se construye la curva del
error para el sistema de interés, previa determinación experimental del error
fotométrico o instrumental. Si no se conoce D T, entonces solo se puede obtener (D
C/C)/D T.
- Errores de medida: Se produce cuando hay una gran cantidad de analito y, por lo
tanto, una gran absorbancia de radiación. Al detector llega muy poca potencia
radiante y se encuentra en la zona límite de detección, con lo que no responde bien
a pequeñas variaciones de absorbancia. El segundo se produce cuando hay muy
poco analito y, por tanto, muy poca absorbancia. Esto implica que casi toda la potencia
incidente atraviesa la disolución y llega al detector. Entonces, el detector
espectrométrico está en la zona de saturación y no detecta las pequeñas variaciones
en la absorción.
BIBLIOGRAFÍA

1. Harris, D. Análisis Químico Cuantitativo; 3° ed. Barcelona: Reverté; 2007. Pág. 407-
408.
2. Pino, F; Perez D. Análisis de elementos por espectrometría de absorción molecular
UV-visible; 1°ed. Córdova: Universidad de Sevilla; 1983. Pág.123.
3. Salud OPd. Manual de Mantenimiento para Equipo de Laboratorio Villamil JE,
editor. Washington, D. C; 2005.
4. Colombia EyLd. Equipos y Laboratorio de Colombia. [Online].; 2011 [cited 2018
agosto domingo 20. Available from:
[Link]
5. K.A. [Link] de análisis farmacéutico.1 ° ed. Barcelona: Reverté; 1981.
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[Link] [Link] de análisis instrumental. 5° Edición. CENGAGE Learning
Editores.México, D.F.2008. Pág:12-15,247-250.
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9. [Link] [Online].; 2011 [cited 2018 agosto domingo 20. Available from:
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