IRENE CABALLERO GONZÁLEZ, IRENE FRANCO MORENO, MARÍA GONZÁLEZ CUERVA 

MÉTODOS INSTRUMENTALES CUANTITATIVOS 2º DE BIOQUÍMICA 

TEMA 7: ELECTROFORESIS 
ELECTROENFOQUE. INMUNOELECTROFORESIS 
 
ELECTROENFOQUE 
La  electroforesis  es  un  método  de  separación  de  moléculas  biológicas  que  se  basa  en  la  migración  de  las 
mismas según su carga en un campo eléctrico. 

El isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis empleada para separar moléculas cargadas.  

Fundamento: 

Es  una  variante  de  electroforesis  en  la  que  el  gel  (poliacrilamida)  posee  un  gradiente  de  pH  fijado  en  su 
estructura  sobre  el  que  se  desplazarán  moléculas,  incluyendo  en  su  preparación  moléculas  ionizables  con 
pK  diferentes.  Las  moléculas  ​anfotéricas​,  (como  aminoácidos), se separan en un medio en el que existe una 
diferencia  de  potencial  y  un  gradiente  de  ​pH  .  La  región  del  ánodo  es  ácida  y  la del cátodo  alcalina. Entre 
ambos  se  establece  un  gradiente  de  pH  tal  que  las  moléculas  que  tienen  que  separarse  tengan  su  ​punto 
isoeléctrico  dentro  del  rango.  Las  sustancias  que  inicialmente  están  en  regiones  de  pH  inferior  a  su punto 
isoeléctrico  estarán  cargadas  positivamente  y  migrarán  hacia  el  cátodo.  Mientras,  aquéllas  que  se 
encuentran  en  medios  con  pH  más  altos  que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migrarán hacia 
el  ánodo.  La  migración  las  conducirá  a una región donde el pH coincidirá con su punto isoeléctrico, tendrán 
una  carga  neta  nula  y  se detendrán. De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas 
donde coincide su punto isoeléctrico con el pH. 

 
Una  proteína  tiene  grupos  cargados  de  ambas  polaridades,  y  presenta  un  punto  isoeléctrico  (pI)  que 
corresponde  al  valor  de  pH  al  cuál  la  molécula  posee  carga  neta (z) igual a cero (zwitterion), y por lo tanto 
es inmóvil en un campo eléctrico. 
En  un  zwitterion  simple,  pI=  (pK1+  pK2)/2  ;  mientras que para un aminoácido de cadena lateral ácido-base, 
pI es el promedio de los pK entre la especie con carga+1 y -1. 
  

Se  establece  un  gradiente de pH en el gel de poliacrilamida, realizando una electroforesis de una mezcla de 

Al  aplicar  la  diferencia  de  potencial  las  proteínas  que  se  encuentran  en  regiones  de  pH  inferior  a  su  pI 
estarán  cargadas  positivamente,  y  migraran  hacia  el  cátodo;  mientras  que  aquellas  que  se  encuentran  en 
regiones de pH más altos que su pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. 
  

Ventajas: 

Un anfolito siempre se detiene en la zona en la que el pH coincide con su punto isoeléctrico.  

Gran poder de resolución. 

La  muestra  se  puede colocar en cualquier zona del medio de soporte, en la zona cercana al cátodo, al ánodo 

Aplicaciones: 

La  capacidad  del  IEF  de  separar  las  proteínas  en  bandas  se  usa  como  herramienta  analítica  y  preparativa. 
Por ejemplo para separar preparaciones proteicas homogéneas 

Otra  de  sus  aplicaciones  es  la  electroforesis  bidimensional,  que  consiste  en  la  separación  de  proteínas 
según su pI y su peso molecular (MW). 

 
INMUNOELECTROFORESIS 
La  inmunoelectroforesis  se  utiliza  en  laboratorios  para  separar  e  identificar  proteínas  en  base  a  su 
comportamiento  electroforético  y  a  sus  propiedades  inmunológicas.  Todas  las  variantes  de  la 
inmunoelectroforesis  requieren  anticuerpos  que  van  a  reaccionar  con  las  proteínas  que se desea separar o 
caracterizar.  Dichas  proteínas  son  antígenos,  que  cuando  se  inyectan  en  otro  animal,  (el  huésped), 
provocan  la  producción  de  anticuerpos  en  él..  La  interacción  entre  el  antígeno  y  su  anticuerpo,  que  es 
también  una  proteína,  es  fuerte  y  altamente  específica.  Si  se  mezclan  soluciones  de antígeno y anticuerpo 
en  diferentes  proporciones,  se  encuentra que a una razón específica, ​punto de equivalencia​, se maximiza 
la unión y se forma un precipitado de complejo antígeno-anticuerpo. 
En  laboratorio  clínico,  se  utiliza  en  el  examen  de  ciertas  anomalías  del  suero,  especialmente  aquellas  que 
implican  inmunoglobulinas,  proteína  de  orina,  líquido  cefalorraquídeo  o  fluidos  pleurales.  En  la 
investigación,  puede  usarse  para  monitorizar  purificaciones  de  antígenos  y/o  anticuerpos,  detectar 
impurezas, analizar antígenos solubles de tejidos y extractos microbianos. 

 
 
Procedimiento: 
En  la  inmunoelectroforesis,  las  proteínas  se  separan  por  primera  vez  mediante  electroforesis  en  gel  de 
agarosa  horizontal  sobre  la  base  de  sus  diferentes  relaciones  de  carga  a  masa.  El  gel  con  las  proteínas 
separadas  (antígenos) se retira del campo eléctrico y los anticuerpos para las proteínas son introducidos en 
canales  estrechos  paralelos  a  los  antígenos  separados.  Se  produce  la  difusión  de  ambos  anticuerpos 
antigénicos  y,  en  un  locus  particular,  se  alcanza  el  punto  de  equivalencia  dando  como  resultado  la 
precipitación. 
  
 
Se  utiliza  un  gel  de  ​agarosa  al  1%  con  un  grosor  cercano  al  milímetro,  y  un  ​pH  de  aproximadamente  8,6. 
Esto  sirve  para  la  electroforesis  y  para  la  reacción  con  los anticuerpos. Se prefiere la agarosa como matriz 
de  soporte  porque  tiene  un  tamaño  de  poro  mayor  que  otros  medios,  que  permiten  el  libre  paso  y 
separación  de  las  proteínas,  pero  es  lo  suficientemente  estrecho  como  para  impedir  el  paso  de  los 
complejos  antígeno-anticuerpo.  El  elevado  pH  se  utiliza  porque,  en  esas  condiciones,  los  anticuerpos  son 
prácticamente inmóviles. 
Los  complejos  de  inmunoprecipitación  pueden verse en el mismo gel de agarosa, pero requieren ser teñidos 
con  colorantes  para  proteínas  como  Azul-Coomassie.  La  electroforesis  en  gel  de  agarosa  permite  además 
que  las  proteínas  estén  en forma nativa, por lo que la inmunoelectroforesis permite la caracterización de la 
actividad enzimática y la unión a ligandos además de la separación electroforética. 
 
Tipos: 
Análisis  inmunoelectroforético:  Separación  de  las  proteínas  por  electroforesis,  tras  la  que  se  aplica, 
sobre  el  gel  de  agarosa,  el  suero  de  anticuerpos  sobre  las  proteínas  ya  separadas;  formándose  un 
precipitado para permitir que las proteínas se encuentren con sus anticuerpos específicos.  
La  ​inmunoelectroforesis  cruzada​,  las  proteínas,  tras  su  electroforesis  inicial,  no  se  incuban  con 
anticuerpos,  se someten a una segunda electroforesis en un gel que contiene los propios anticuerpos contra 
la  proteína  de  interés,  de  forma  que  es  ahora  cuando  se  forman  los  inmunoprecipitados.  Cada  precipitado 
tendrá  sus  propias  características  migratorias  y  cada  banda  corresponderá  a  un  antígeno  diferente  . 
Además  podremos  conocer  la  cantidad de proteína y anticuerpo específico en el gel, y se podrá realizar una 
cuantificación de los componentes.  
La  inmunoelectroforesis  en  cohete​.  Consiste  en  cargar  en  el  gel  de  forma  consecutiva  y  en 
perpendicular a la dirección del campo eléctrico, diluciones seriadas con progresivo aumento de la cantidad 
de  antígeno,  mientras  que  el  anticuerpo  se  encuentra  repartido  por  el gel. Esto dará lugar a un precipitado 
cada vez mayor que da un aspecto cónico de cohete.  
 
La  ​contrainmunoelectroforesis​,  aprovechamiento  de  la  distinta  movilidad  electroforética  de  los 
componentes implicados. Dado que las inmunoglobulinas migran al polo negativo y las proteínas, al positivo, 
se  colocan  de  forma  inversa  a  su  migración,  forzando  así  su  encuentro.  Así,  ambos  se  encontrarán  a  una 
distancia intermedia. 
La  ​Inmunoelectroforesis  de  afinidad​,  basada  en  los cambios del patrón electroforético de las proteínas 
debido a su interacción específica con sus ligandos. Se utiliza para estimar constantes de unión.