Aspek Laboratorium

BCR Abl Kuantitatif & JAK2 V617F

 STEM
CELL
BASIC
OF
HEMATOPOIESIS
 Clonal hematopoietic stem cell disorder that result in
expansion and excessive production and
overaccumulation of erythrocytes, granulocytes, and
platelets in some combination in the bone marrow,
peripheral blood, and body tissues
 “myeloproliferative diseases”

 Express common clinical features, laboratory changes,

and pathogenetic similarities
In relation to myeloid neoplasms and acute leukemia, this revision has been
influenced by several factors including the following:

1. The discovery of recently identified molecular features has yielded new perspectives
regarding diagnostic and prognostic markers that provide novel insights for the
understanding of the pathobiology of these disorders.
2. Improved characterization and standardization of morphological features aiding in
the differentiation of disease groups, particularly of theBCR-ABL1 myeloproliferative
neoplasms (MPNs), has increased the reliability and reproducibility of di-agnoses.
3. A number of clinical-pathological studies have now validated the WHO postulate of
an integrated approach that includes hematologic, morphologic, cytogenetic, and
molecular genetic findings.

Arber D.A, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016; 127(20)
Arber D.A, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016; 127(20)

Arber D.A, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016; 127(20)
 Myeloproliferative Neoplasm Classification

Stem Cell Investig. 2016;3:5

Genetic
Mutation

National Cancer Institute

The type of disorder is often based on the predominant cell line that is
affected, but because blood counts are often abnormal in more than one
cell line, diagnoses based upon blood counts alone may be inaccurate

Four Main MPNs: Additional MPNs:

1. Chronic Myelogenous Leukemia (CML) 1. Systemic Mastocytosis
2. Polycythemia Vera (PV) 2. Hypereosinophilic Syndrome
3. Essential Thrombocytosis (ET) 3. Chronic Myelomonocytic Leukemia
4. Primary Myelofibrosis (PMF) 4. Chronic Neutrophilic Leukemia
5. Chronic Eosinophilic Leukemia
Polycythemia Essential
Thrombocythemia Myelofibrosis
Vera
(ET) (MF)
(PV)

Platelets Marrow Fibrosis

Red Cells

Hematopoietic
JAK2V617F mutation
stem cell (HSC)
 THE CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE DISORDERS

Clinical Hematology-Theory and Practices 6th Ed 2017

10
 JAK2V617F : phenotypes of disease

JAK2V617F

Transition between ET
phenotypes common with PV
latency period of decades

PMF
 JAK2 V617F in Myeloid Disease
One mutation, many phenotypes

Disease JAK2 V617F

Prevalence
PV 97%
ET 60%
PMF 60%
 Janus kinase 2 (JAK2), is a gene on the short
arm of chromosome 9 that encodes for a
cytoplasmic tyrosine kinase
 A mutation in the JAK2 gene leads to
constitutive tyrosine phosphorylation activity
that promotes hypersensitivity to cytokines /
growth factors and induces epo-
independant erythrocytosis.
P P
JAK2 JAK2
P P
Stat5 Stat5
P P

Stat5 Stat5
P P
X Gene Transcription
 P P
JAK2V617F JAK2V617F
P P
Stat5 Stat5
P P

Stat5 Stat5
P P
X Gene Transcription
Polycythemia Vera
 A neoplastic, clonal
overproduction of
erythrocytes,
granulocytes, and
platelets to some degree
(primary problem is too
many RBCs)
 The clonal neoplastic
transformation arises in a
pluripotential
hematopoietic stem cell
 RBCs are very sensitive to
erythropoietin for cell
growth
17
Kriteria Diagnostik

Polychytemia Vera

-mungkin tidak diperlukan pada kasus

dengan eritrositosis absolut yang
berkelanjutan :
- kadar hemoglobin 18,5 g/dL pada pria
(hematokrit, 55,5%) atau 16,5 g/dL
pada wanita (hematokrit, 49,5%)
- jika kriteria utama nomor 3 dan
kriteria minor ditemukan

Blood. 2016; 127(20)

Diagnosis PV : tiga kriteria mayor, atau 2 kriteria mayor yang

pertama dan kriteria minor
 PV ALGORITHM DIAGNOSIS

Leukemia. 2008; 22, 14–22

Essential Thrombocythemia
 Chronic non-reactive
thrombocythemia that
does not fit criteria for
other MPNs
 Headache
 Syncope
 Atypical chest pain
 Livedo reticularis
 Erythromelalgia (burning pain of the
hands or feet associated with
erythema and warmth)
 60% patients positive for
JAK2 V617F
 Kriteria Diagnostik Essential Thrombocythemia

Diagnosis ET : 4 kriteria mayor atau 3 kriteria

mayor dan kriteria minor

Blood. 2016; 127(20)

 ET ALGORITHM DIAGNOSIS

Leukemia. 2008; 22, 14–22

Primary Myelofibrosis
 Megakaryocyte proliferation and
atypia, usually accompanied by
reticulin and/or collagen
deposition in the marrow

 Demonstration of a clonal marker

(eg, JAK2 or MPL)

 Leukoerythroblastosis on smear

 does not met criteria for other

MPN

 Splenomegaly

 Anemia
Kriteria Diagnostik…

Pre PMF

Overt PMF

Diagnosis PMF : 3 kriteria mayor dan paling sedikit 1 kriteria minor

Blood. 2016; 127(20)
 PM ALGORITHM DIAGNOSIS

Leukemia. 2008; 22, 14–22

 INFORMASI PEMERIKSAAN
MUTASI JAK2 V617F DI PRODIA
 Deteksi mutasi V617F pada gen JAK2

merupakan kriteria diagnosis mayor

untuk penyakit keganasan myeloproliferative
yang sering digunakan saat ini

MMM, Vol. 4 No. 4 Oktober 2015 : 1091-1099

 Metode ARMS - PCR

Deteksi Gel Electrophoresis

Sampel :
Whole blood (2 tabung @3cc)

Frekuensi kerja
1 x seminggu
72 jam (suhu ruang)
Stabilitas : 7 hari (2 – 8 oC)
 ARMS-PCR
Amplification refractory mutation system
polymerase chain reaction

merupakan metode deteksi SNP yang melibatkan PCR dan gel electrophoresis
menggunakan prinsip tetra-primer PCR dan teknik ARMS.

empat primer dalam primer allele-specific

satu reaksi PCR mengandung mismatch
pada akhir 3’
sepasang primer outer dan
sepasang primer inner meningkatkan sensitivitas

outer : non-allele spesific

inner : allele-specific
 Metode ARMS-PCR

Sensitivitas :
Mendeteksi sampai 0.54% mutan dalam wildtype
Menggunakan primer allele spesifik
Tidak ditemukan negatif palsu maupun positif palsu
 Guidelines (Bench, et al. 2012)

Terdapat 2 kriteria penting yang harus dipenuhi dalam

menentukan metode deteksi mutasi JAK2 V617F :
 Pertama, metode deteksi harus spesifik, yaitu tidak ada
negatif palsu atau background yang jelas sehingga hasil
negatif atau positif mutasi JAK2 V617F dapat segera
dibedakan.
 Kedua, metode deteksi harus cukup sensitif untuk dapat
mengidentifikasi alel mutan JAK2 V617F sampai dengan 1-
3% mutan dalam wildtype. Batas ini telah terbukti relevan
secara patogenesis dan membawa signifikansi klinis

British Journal of Haematology, 2013, 160, 25–34

Metode
Hasil
 Hasil
Hasil
Chronic Myeloid Leukemia
(CML)
 Clonal malignant myeloproliferative disorder
characterized by increased proliferation of the
granulocytic cell line without the loss of their
capacity to differentiate

 Results in increases in myeloid cells, erythroid cells

and platelets in peripheral blood and marked myeloid
hyperplasia in the bone marrow

 Originate in a single abnormal haemopoietic stem

cell
 Source Undetermined
Source Undetermined
 Source Undetermined

Source Undetermined
Sources Undetermined
 Stephen B. Marley and Myrtle Y. Gordon. Chronic myeloid
leukaemia: stem cell derived but progenitor cell driven
Clinical Science (2005) 109, (13*25)

Bcr-Abl expression alone is necessary and sufficient for the development of CML
  Chronic Phase ~ 85%  Accelerated Phase
and Blast crisis
 Common symptoms:
 fatigue
More aggressive disease
 weight loss/anorexia
with increased blasts and
 Early satiety
poorer prognosis
 asymptomatic in ~ 50%

 Common signs:
 palpable splenomegaly
 basophilia

Faderl et al. Ann Intern Med. 1999;131:207. Goldman. Curr Opin Hematol. 1997;4:277.
CML PHASES
 CML PHASES

Clinical Hematology-Theory and Practices 6th Ed 2017

Peripheral smear of CML:
1) leukocytosis with a ‘left shift’
2) normocytic anemia
3) thrombocytosis in 50% of pts
4) absolute eosinophilia with a
normal % of Eosinofils
5) absolute and relative
increase in basophils
6) LAP score is low (not
frequently employed)
 Fluorescence in-situ hybridization Bcr- Ch 22
(FISH) in CML:
1) Allows for the diagnosis of CML
Abl – Ch 9
2) Does not require a bone marrow aspirate for
optimal results
3) Allows for the identification of potential
duplications of the Ph chromosome
4) Allows for the identification of the loss of the
der (9) chromsome
5) Allows for the identification of cryptic
translocations involving Bcr-Abl
Bcr-Abl Fusion

Source Undetermined
 Interphase Metaphase

Courtesy of Charles Sawyers, UCLA.

 Bcr-Abl
cDNA
Quantitative RT-PCR
for Bcr-Abl in CML

1) Allows for the diagnosis of CML Bcr

2) Does not require a bone marrow aspirate for Abl

optimal results

3) Can quantify the amount of disease

4) Allows for the identification of cryptic

translocations involving Bcr-Abl

5) Many primers sets only detect the p190 and/or the

p210 translocation and may miss the p230 or
alternative translocations

Source Undetermined
 Metode yang digunakan untuk
manajemen pasien CML

Tohami, et al. IMAJ 2012; 14: 501-50

 Tidak seperti beberapa kanker, penyebab Chronic Myeloid
Leukemia (CML) dan beberapa jenis leukemia lainnya dapat
dilacak dari satu abnormalitas kromosom yang spesifik.

Kromosom Philadelphia dapat diidentifikasi dgn

ekspresi fusi protein BCR-ABL.

Pemeriksaan Genetik Untuk konfirmasi

BCR-ABL KUALITATIF diagnosis CML

Untuk pemantauan
respon pengobatan
Pemeriksaan Genetik
pada CML BCR-ABL KUANTITATIF

Critical Reviews in Oncology/Hematology 79 (2011) 135–143

 Tirosin Kinase Inhibitors yang Tersedia untuk CML

Jabbour E. Chronic myeloid leukemia: First-line drug of choice. American Journal of Hematology. 2015;91(1):59-66.
 Kembalinya jumlah
darah ke nilai normal
 Reduksi dan eliminasi
kromosom Philadelphia
(Ph)
 Reduksi dan eliminasi
ekspresi gen BCR-ABL

Cortez, et al. Cancer. 2011 March 15; 117(6): 1113–1122. Press, The Oncologist 2010;15:744–749
Respon terhadap terapi dapat didefinisikan dengan : hematologic,
cytogenetic, dan molecular

Tohami, et al. IMAJ 2012; 14: 501-50

The Oncologist2016;21:626–633

57
 1. Deteksi Residu Penyakit

ASH Education Book December 8, 2012 vol. 2012 no. 1(105-110 )

 2. Korelasi yang baik antara hasil
sitogenetik sumsum tulang dan level
transkrip BCR-ABL dalam darah perifer

 BCR-ABL1 (IS) <10%

ekivalen dengan major
cytogenetic response

 BCR-ABL1 (IS) <1% ekivalen

dengan complete
cytogenetic response

Critical Reviews in Oncology/Hematology 79 (2011) 135–143

Singh et al., J Clin Exp Pathol 2012, 2:4
 3. Indikator Prognosis

Beberapa studi melaporkan pencapaian MMR setelah pengobatan dengan

imatinib berkaitan dengan remisi sitogenetik dengan durasi jangka panjang
dan rendahnya laju progresi penyakit.

Studi CML IV
Studi pada 1.303 pasien yg baru didiagnosis CML yang diobati dengan
imatinib
BCR-ABL >10% (IS) pada bulan ke-3 dan BCR-ABL >1% (IS) pada bulan ke-6
setelah pengobatan imatinib secara signifikan berkaitan dengan buruknya
OS dan PFS dalam 5 tahun

NCCN Guideline Chronic Myeloid Leukemia Version 1.2016

 4. Indikator Awal Ketidakpatuhan Terapi

 Ketidakpatuhan pada terapi meningkatkan risiko mutasi

 IRIS Study
a. Sebagian kecil pasien diketahui terdeteksi hilangnya respon
molekular (loss of molecular response) dan terjadi peningkatan level
transkrip BCR-ABL sampai 10 kali lipat.
b. Bukan merupakan kasus resistensi, tetapi pasien mengakui bahwa
tidak mengonsumsi obat selama 6 minggu

5. Deteksi Kekambuhan (Relapse)

• Tanda yang menunjukan hilangnya respon (kekambuhan hematologi

atau sitogenetik)
• Peningkatan 1 log level transkrip BCR-ABL dengan hilangnya MMR
ASH Education Book December 8, 2012 vol. 2012 no. 1(105-110 )
NCCN Guideline Chronic Myeloid Leukemia Version 1.2016
Annals of Oncology 23 (Supplemen 7): vii72-vii77,2012
a) Korelasi yang kuat antara hasil
a) Tidak bisa secara
yg diperoleh dari darah perifer keseluruhan menggantikan
dan sumsum tulang konvensional sitogenetik
b) Pengambilan ampel darah
memudahkan pemantauan yang
b) Tidak menyediakan
lebih sering dan reduksi
frekuensi biopsi invasif sumsum informasi mengenai
tulang morfologi sumsum tulang
c) Pemeriksaan darah tidak atau adanya abnormalitas
dibatasi oleh kebutuhan kromosom lainnya
kecukupan jumlah metafase.
d) Sangat reproducible, kombinasi
sensitivitas, presisi, dan rentang
dinamik yang luas memudahkan
kuantitasi yang dapat dipercaya British Journal of Haematology, 1999, 107, 587-599
 PEMERIKSAAN BCR-ABL KUALITATIF

Mendeteksi BCR-ABL mRNA

Target gen: gen BCR-ABL yang menyandikan onkoprotein
(p210 dan p190) yang terletak di sitoplasma

Kelebihan multiplex-PCR :
cepat, sensitif
memudahkan deteksi secara simultan dari dua atau
lebih gen pada reaksi yang sama
mengidentifikasi tipe transkrip, baik b3a2 dan b2a2,
atau e1a2
 Jenis fusi yang dideteksi:
Metode Pemeriksaan
Two Steps Reverse Transcription Multiplex
PCR

- Mayor BCR (b2a2 atau b3a2)

Jenis Sampel : - Minor BCR (e1a2)
Stabilitas Sampel :
1 jam (suhu ruang),
48 jam (2-8°C),
tidak boleh
Frekuensi kerja :
dibekukan
Whole Blood EDTA 1 x seminggu
Tahap Pemeriksaan BCR-ABL

Isolasi asam nukleat

Reverse transcription
RNA menjadi DNA

Amplifikasi DNA dengan prinsip

multiplex PCR

Deteksi menggunakan gel agarosa

Spesifisitas Primer pada PCR
• primer yang digunakan benar-benar hanya menempel di tempat yang kita
design (dalam hal ini fusi BCR-ABL)

Panjang Band pada Hasil Gel Elektroforesis

• memastikan panjang band yang didapatkan di gel elektrophoresis sesuai
dengan literatur
Validasi
• pada saat validasi, juga dipesan DNA sintetik dengan urutan DNA sesuai
dengan fusi BCR-ABL (b3a2, b2a2, dan e1a2) sebagai kontrol positif,
• untuk meyakinkan lagi, band hasil elektrophoresis bisa dipurifikasi, lalu
dilakukan sequencing.
CONTOH HASIL
CONTOH HASIL
PEMERIKSAAN BCR-ABL p210 KUANTITATIF

Mendeteksi nilai transkrip fusi BCR-ABL p210

Persyaratan :
Pasien sudah pernah melakukan pemeriksaan
BCR-ABL kualitatif dengan hasil fusi p210
 Jenis fusi yang dideteksi:
Metode Pemeriksaan
Real-Time reverse transcriptase quantitative
polymerase chain reaction (RT-qPCR)

p210 (b2a2 atau b3a2)

Jenis Sampel :
Stabilitas Sampel :
48 jam (2-8°C), Frekuensi kerja :
tidak boleh Senin – Sabtu
dibekukan
Whole Blood EDTA
RT-qPCR
Metode pemeriksaan paling sensitif
Mendeteksi 1 sel CML dalam > 100.000 sel normal

Hasil :
 Diekspresikan sebagai rasio jumlah transkrip BCR-ABL
terhadap jumlah transkrip gen kontrol
 Respon molekular dikuantifikasi dengan mengukur reduksi
transkrip BCR-ABL relatif terhadap baseline standar.
 Hasil diekspresikan berdasarkan International Scale
(BCR-ABLIS (%))
Cortez, et al. Cancer. 2011 March 15; 117(6): 1113–1122. NCCN
Guideline Chronic Myeloid Leukemia Version 1.2016
CONTOH HASIL
 TREATMENT

Hoffbrands Essential Haematology 7e 2016

TERIMA KASIH